JP6154748B2 - 抗カルバミル化タンパク質抗体及び関節炎リスク - Google Patents
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Description
a)抗CarP及び/又は抗Ca−Fib抗体+、ACPA−試料、
b)抗CarP及び/又は抗Ca−Fib抗体+、ACPA+試料、
c)抗CarP及び/又は抗Ca−Fib抗体−、ACPA+、及び
d)抗CarP及び/又は抗Ca−Fib抗体−、ACPA−試料
[実施例1]
材料及び方法
抗原の生成
抗原源として、本発明者らはウシ胎仔血清(FCS)を使用した(Bodinco、バッチNo.212−192909)。これをカルバミル化し、シトルリン化し、又は無修飾源として使用した。
非修飾FCS及びCa−FCSを10ug/ml(pH9.6 0.1M炭酸塩−炭酸水素塩緩衝剤で希釈)で50ulをNuncイムノプレート(Thermo scientfic、cat No.430341)に4℃で終夜塗布した。0.05%tween(Sigma、cat No.27,434−8)(PT)を含むリン酸緩衝食塩水(PBS)で4回洗浄後、PBS/1%ウシ血清アルブミン(BSA)(sigma、cat No.A2153)100ulを37℃で1時間インキュベートすることによってプレートをブロックした。追加の洗浄後、血清を50ul中で1/50(PBS/0.05%tween/1%BSA緩衝剤(PTB)中)でFCSとCa−FCSの両方の被覆ウェルにインキュベートし、37℃で1時間インキュベートした。標準血清の(PTB希釈)段階希釈物をCa−FCS被覆ウェル上でインキュベートした。洗浄後、50ulの1/5000(PTB)希釈ウサギ抗ヒトIgG抗体(Dako、cat No.A0423)又は1/1000(PTB)希釈ウサギ抗ヒトIgA抗体(Dako、cat No.A0262)と一緒にウェルを37℃で1時間インキュベートすることによって結合ヒトIgG又はIgAを検出した。洗浄後、ウェルを50ulの1/2000(PTB)希釈ヤギ抗ウサギIgG HRP標識抗体(Dako、cat No.P0448)と一緒に37℃で1時間インキュベートした。最後の洗浄後、50ulの2,2’アジノ−ビス−(3−エチルベンゾ−チアゾール−6−スルホン酸)ジアンモニウム塩(ABTS)及びH2O2をインキュベートし、415nmにおける吸光度を標準ELISAリーダーによって測定して、HRP酵素活性を可視化した。
FCSとCa−FCSの両方を通常の10%ドデシル硫酸ナトリウム(SDS)−ポリアクリルアミドゲルに載せ、Hybond−C Extra膜(Amersham、Diegem、ベルギー)に移した。次いで、PBS/0.05%Tweenで洗浄後、ブロットをブロッキング緩衝剤(3%ELK Milk/PBS/0.05%Tween)中で室温で1時間インキュベートした。続いて、ブロットをブロッキング緩衝剤で1:500希釈された血清5mlと一緒に室温で1時間インキュベートした。PBS/0.05%Tweenで3回洗浄後、ブロッキング緩衝剤で1:50000希釈された西洋ワサビペルオキシダーゼ複合化ウサギ抗ヒトIgG(DAKO、Heverlee、ベルギー)3mlと一緒にブロットを室温で1時間インキュベートした。次に、ブロットを洗浄し、結合した抗体を増感化学発光(ECL;Amersham)によって可視化した。等しいタンパク質添加は、クーマシーブリリアントブルー(Bio−Rad、Veenendaal、オランダ)によって確認された。
分析された血清は、ライデン早期関節炎(Leiden Early Arthritis)クリニック(EAC)コホートに参加した患者に由来した。ライデンEACは、ライデン大学医療センターのリウマチ学研究部門(Department of Rheumatology of the Leiden University Medical Center)で1993年に開始された関節炎を最近発症した患者の初期コホート(症候持続時間<2年)である[15]。すべてのRA患者は、1年の経過観察(EACコホート)内に米国リウマチ学会(American College of Rheumatology)(以前は、American Rheumatism Association)1987年改訂のRA分類基準[16]を満たした。合計1007名の患者を分析し、そのうち582名はRAと診断され、425名はUAと診断され、そのうち151名は経過観察時にRAを発症した。これらの患者試料をやはりライデン地区由来の280名の健康な対照の試料と比較した。RA患者の血清/滑液ペアの追加セットを分析した。プロトコルは、関連する現地の倫理委員会によって認可され、全参加者はインフォームドコンセントを与えた。
ベースラインで酵素結合免疫吸着検定法(ELISA)(Immunoscan RA Mark 2;Eurodiagnostica、Arnhem、オランダ)によって収集された血清中の全IgG抗CCP2をACPAの尺度として測定した。25単位/mlを超える値の試料を製造者の指示に従って陽性とみなした。CCP2に対する抗体を有する個体をACPA陽性とみなした。
非修飾Fib及びCa−Fibを20μg/mlで50μl(pH9.0 PBS希釈)をNunc Maxisorpプレートに終夜塗布した。PBSTweenで洗浄後、pH9.0 PBS/2%BSA 200μlを4℃で2時間インキュベートすることによってプレートをブロックした。追加の洗浄後、RIA緩衝剤(10mM Tris pH7.6;350mM NaCl;1%TritonX;0.5%デオキシコール酸Na;0.1%SDS)(Sigma)で1/50希釈された血清50μlと一緒にウェルを氷上で3時間インキュベートした。それに続くインキュベーションはすべてRIA緩衝剤中で実施される。標準として、陽性血清プールの段階希釈を使用した。氷上で2時間インキュベートされたHRP標識ウサギ抗ヒトIgG抗体(DAKO)を使用してヒトIgGを検出した。最後の洗浄後、HRP酵素活性をABTSを使用して可視化した。本発明者らは、Fib及びCa−Fibの吸光度をaU/mLに変換した。本発明者らは、陽性応答のカットオフを健康な対照の特異的抗CarP反応性の平均+2×標準偏差として設定した。
ロジスティック回帰を用いた社会科学用統計パッケージ(Statistical Package for the Social Sciences)(SPSS)17.0を使用してデータを解析した。0.05未満のP値を統計的に有意とみなした。
[実施例2]
患者及び対照血清
分析された血清は、ライデン早期関節炎クリニック(EAC)コホートに参加した患者に由来した。ライデンEACは、ライデン大学医療センターのリウマチ学研究部門で1993年に開始された関節炎を最近発症した患者の初期コホート(症候持続時間<2年)である(42)。すべてのRA患者は、1年の経過観察内に米国リウマチ学会(以前は、American Rheumatism Association)1987年改訂のRA分類基準(43)を満たした。合計571名のRA患者が分析に含まれた。患者試料をやはりライデン地区に住んでいる305名の健康な対照の試料と比較した。プロトコルは現地の倫理委員会によって認可され、インフォームドコンセントが得られた。
手短に述べると、非修飾FCS及び修飾FCSをNunc Maxisorpプレート(Thermo scientific)上に終夜塗布した。洗浄及びブロッキング後、ウェルを血清と一緒にインキュベートした。結合ヒトIgG又はIgAをウサギ抗ヒトIgG又はIgA抗体(DAKO)を使用して検出した。続いて、HRP標識ヤギ抗ウサギIgG抗体(Dako)。最後の洗浄後、HRP酵素活性をABTSを使用して可視化した(44)。F(ab)2を含めて、FCS及びFibに基づくタンパク質修飾及びELISAアッセイのより詳細な説明は、オンライン(SI−材料及び方法(SI−materials and Methods))で利用可能である。本発明者らは、陽性応答のカットオフを健康な対照の特異的抗CarP反応性の平均+2×標準偏差として設定した。ACPAの検出及びウェスタンブロッティングの方法はオンライン(SI−材料及び方法)で利用可能である。
ストレプトアビジン(Invitrogen)を2μg/mlで100μlをNuncプレート上に4℃で終夜塗布した。洗浄後、アルギニン、シトルリン、ホモシトルリン又はリジンを含むFibペプチド(図8A)(45)を10μg/mlでPTB100μl中で室温で1時間インキュベートした。次に、これらの抗原に対して反応性である抗体の反応性を上述したように検出した。
抗CarP抗体とACPAが交差反応性抗体であるかどうか判定するために、本発明者らは阻害研究を実施した。ACPAと抗CarP抗体の両方に陽性である自己抗体陽性血清試料を、漸増濃度の非修飾FCS、Ca−FCS、Ci−FCS又はCCP1ペプチドのシトルリン若しくはアルギニン含有形態(46)と一緒にプレインキュベートした。室温(RT)でプレインキュベーション後、上述したように、Ca−FCS及びCi−FCSに対する反応性について試料を試験した。Ci−FibとCa−Fibの両方に陽性である血清及びF(ab’)2試料をFib、Ci−Fib及びCa−Fibと一緒に4℃で終夜プレインキュベートし、続いてFib ELISAで分析した(SI−材料及び方法)。
EACコホートにおいては、長軸方向で得られた手足のX線像を、シャープ/ファン デル ハイデ法に従って採点した(47)。採点及び分析は依然に詳述されている(24)。データを直接、又は反復測定分析を使用して各患者に対して得られた長軸方向のデータを最適に利用して、分析する(24)。より詳細な情報がオンライン(SI−材料及び方法)で利用可能である。
本発明者らはカルバミル化タンパク質に対する抗体がRA患者の血清中に存在するかどうか、又はどのタンパク質をそれらが認識するか知らなかったので、本発明者らは多様なセットのカルバミル化タンパク質の試験を開始して、できるだけ多くの抗CarP反応性を検出する可能性を最大にした。この目的のために、本発明者らは、カルバミル化された、シトルリン化された、又は未処理のままのウシ胎仔血清(FCS)(Bodinco)を使用した。カルバミル化FCS(Ca−FCS)を生成するために、FCSをH2Oで4mg/mlに希釈し、シアン酸カリウム(Sigma)を濃度1Mまで添加した。37℃で12時間インキュベーション後、試料をH2Oで徹底的に透析した。5mg/mlフィブリノーゲン(Fib)を0.5Mシアン酸カリウムと一緒に4℃で3日間インキュベートし、続いてPBSで徹底的に透析することによって、カルバミル化フィブリノーゲン(Ca−Fib)を作製した。0.1M Tris−HCl pH7.6、0.015M CaCl2及び40U PAD4(Sigma)を含む体積1mL中でFCS又はFib 10mgを37℃で24時間インキュベートすることによって、シトルリン化FCS(Ci−FCS)及びシトルリン化フィブリノーゲン(Ci−Fib)を作製した。本発明者らは、質量分析によってシトルリン及びホモシトルリン残基の存在を確認した。Fibの場合、本発明者らは、本発明者らが分析したタンパク質セグメント中に、広範なシトルリン化及び完全なカルバミル化を認めた。
非修飾FCS及び修飾FCSを10μg/mlで50μl(pH9.6 0.1M炭酸塩−炭酸水素塩緩衝剤希釈)(CB)をNunc Maxisorpプレート(Thermo scientific)上に終夜(ON)塗布した。0.05%tween(Sigma)(PT)を含むPBSで洗浄後、PBS/1%ウシ血清アルブミン(BSA)(Sigma)100μlを4℃で6時間インキュベートすることによってプレートをブロックした。追加の洗浄後、PBS/0.05%tween/1%BSA緩衝剤(PTB)で1/50希釈された血清50μlと一緒にウェルを氷上で終夜インキュベートした。それに続くインキュベーションはすべてPTB中で実施される。標準として、陽性血清プールの段階希釈を使用した。氷上で3.5時間インキュベートされたウサギ抗ヒトIgG抗体(DAKO)又はウサギ抗ヒトIgA抗体(Dako)を使用してヒトIgG又はIgAを検出した。洗浄後、ウェルを氷上でHRP標識ヤギ抗ウサギIgG抗体(Dako)と一緒に3.5時間インキュベートした。最後の洗浄後、HRP酵素活性を依然に記述されたようにABTSを使用して可視化した(25)。健康な対象(n=305)の血清を対照として使用した。本発明者らは、Ca−FCSとFCSの両方の吸光度をaU/mLに変換し、FCSのバックグラウンド信号(aU/mL)をCa−FCSの信号(aU/mL)から減算して、特異的抗CarP反応性を分析した(図7)。本発明者らは、陽性応答のカットオフを健康な対照の特異的抗CarP反応性の平均+2×標準偏差として設定した。
非修飾Fib Ci−Fib及びCa−Fibを20μg/mlで50μl(pH9.0 PBS希釈)をNunc Maxisorpプレートに終夜塗布した。PTで洗浄後、pH9.0 PBS/2%BSA 200μlを4℃で2時間インキュベートすることによってプレートをブロックした。追加の洗浄後、RIA緩衝剤(10mM Tris pH7.6;350mM NaCl;1%TritonX;0.5%デオキシコール酸Na;0.1%SDS)(Sigma)で1/50希釈された血清50μlと一緒にウェルを氷上で3時間インキュベートした。それに続くインキュベーションはすべてRIA緩衝剤中で実施される。標準として、陽性血清プールの段階希釈を使用した。氷上で2時間インキュベートされたHRP標識ウサギ抗ヒトIgG抗体(DAKO)を使用してヒトIgGを検出した。最後の洗浄後、HRP酵素活性をABTSを使用して可視化した。本発明者らは、214名のRA患者の血清及び54名の健康な対象の血清を対照として分析した。本発明者らは、Fib Ci−Fib及びCa−Fibの吸光度をaU/mLに変換した。本発明者らは、陽性反応のカットオフを健康な対照の特異的抗CarP反応性の平均+2×標準偏差として設定した。これらのアッセイを3回繰り返すと、同じデータを示した。
2つの抗CarP陽性及び2つの対照血清由来の全IgGをHiTrap(商標)タンパク質A HPカラム(GE healthcare)によって製造者によって提供されたカラムのプロトコルに従って単離した。F(ab’)2断片は、F(ab’)2調製キット(Thermo Scientific)を使用して製造者によって提供されたプロトコルに従って精製IgG試料から作製された。本発明者らは、完全IgG及びF(ab’)2の分子的性質をクーマシー染色SDS−pageゲルを使用して確認した。これらのF(ab’)2を上述したようにELISAに使用した。今回は、HRP標識ウサギ抗ヒトIgG、IgA、IgMカッパ、ラムダ抗体(抗軽鎖)(Dako)又はHRP標識ウサギ抗ヒトIgG(Dako)を使用した。
ACPAをCCP2 ELISA(Immunoscan RA Mark 2;Eurodiagnostica、Arnhem、オランダ)によって測定した。25単位/mlを超える値の試料を製造者の指示に従って陽性とみなした。少数のACPA陽性RA患者は抗CCP2反応性の範囲外にあることもあり、したがって、両方の用語を使用して、本発明者らの分析に使用されたものを明示することになる。
FCS、Ca−FCS及びCi−FCSを10%ドデシル硫酸ナトリウム(SDS)−ポリアクリルアミドゲルに載せ、Hybond−C Extra膜(Amersham)に移した。PTで洗浄後、ブロットをブロッキング緩衝剤(3%ELK Milk/PBS/0.05%Tween)中で室温で1時間インキュベートした。続いて、ブロットをブロッキング緩衝剤で1:500希釈された血清2.5mlと一緒に室温で1.5時間インキュベートした。血清は、ELISAで測定して、ACPA陽性抗CarP陰性又はACPA陰性抗CarP陽性であった。PTで3回洗浄後、ブロッキング緩衝剤で希釈されたHRP標識ウサギ抗ヒトIgG5mLと一緒にブロットを室温で1時間インキュベートした。次に、ブロットを洗浄し、結合した抗体を増感化学発光(Amersham)によって可視化した。
抗CarP抗体陽性とX線写真的進行の関連を前記社会科学用統計パッケージ(SPSS)17.0を使用して分析した。0.05未満のP値を統計的に有意とみなした。長軸方向のデータの多変量正規回帰分析を、放射線学的スコアを応答変数として用いて使用した。この方法は、反復測定を即座に分析し、これらの測定間の相関を利用して、より正確な標準誤差をもたらす。放射線学的スコアを対数変換して、正規分布を得た。経時的関節破壊率を、時間と抗CarPの相互作用によって試験した。時間の効果は、相互作用期間において線形であると想定した。時間の効果は、モデルにおける因子としても入力され、経時的平均応答プロファイルを与えた。処理の代理(proxy)として年齢、性別及び算入期間がすべての分析において補正変数として含まれた。別の分析においては、抗CarP抗体の効果を、抗CCP及びRFの効果に対して補正した。
結果
抗CarP抗体の検出
本発明者らは、インビトロで生成されたカルバミル化FCSで被覆されたプレートを使用して血清及び滑液から抗CarP抗体を検出する新規ELISAを作成した。本発明者らは、カルバミル化FCS(Ca−FCS)に対してIgGとIgAの両方の用量依存的結合を示し、未変性FCSに対して結合しない陽性血清のプールから標準を作製した(図1A)。ホモシトルリンとシトルリンは極めて類似した残基であるが互いに1原子異なるので、本発明者らは、抗CarP抗体が実際にACPAである可能性を除外したいと思った。これを除外する第1の試験として、本発明者らは、Ca−FCSに結合した抗CarP抗体がCa−FCS自体によってのみ阻害され得るが、シトルリン化FCS(Ci−FCS)、未変性FCSによっても、ACPAを検出するのに使用されるペプチドによっても阻害されず(図1B)、抗CarPが真に異なる反応性であることを示す阻害研究を実施した。ACPAとCCP2プレートの結合もCa−FCSの添加によって阻害されなかった(データ示さず)。
ライデン早期関節炎クリニック(EAC)から、本発明者らは、1987年選択基準に従ってUA又はRAに罹患した患者を使用した。さらに、本発明者らは、やはりライデン地域の健康な対照を使用した。本発明者らは、患者と対照における抗CarP抗体の存在を同時に測定した。OD値は、標準を使用して任意の単位/mLに計算された。本発明者らは、健康な人を使用して、健康な対照の平均+2×標準偏差で定義される陽性のカットオフを計算した。本発明者らは、試料がカットオフより高い力価を有し、FCSに比べてCa−FCS上で少なくとも0.1単位高い吸光度を有するときに、試料が陽性であるとみなした[17]。この手法を用いて、本発明者らは、RA患者の42%がIgG抗CarP抗体陽性であるのに対して、試験したRA患者由来の血清の54%がIgA抗CarP抗体陽性であることを確認した(図2)。対になった血清/滑液試料の分析によれば、抗CarP IgG及びIgAは、血清中のこれらの自己抗体に陽性である患者の滑液中にも見ることができる(データ示さず)。
次に、本発明者らは、抗CarP抗体がACPAとは無関係に生じるかどうか分析したいと思った。このために、本発明者らは、373名のRA患者のセットにおいて、ACPAと抗CarP抗体の関係を分析した。本発明者らのデータによれば、RA患者の14%及び23%はACPAを示さないが、それぞれ抗CarP IgG及びIgAを有する。同様に、RA患者の22%及び19%はACPAに対して陽性であるが、それぞれ抗CarP IgG及びIgAに対して陰性であった(図3)。ACPA陰性個体に注目して、本発明者らは、すべてのACPA陰性RA患者の約50%が抗CarP抗体に対して陽性であることを認めた。したがって、抗CarP抗体は、ACPAとは無関係に生じる。
ベースラインで未分化関節炎の診断を呈する患者は、寛解することがあり、別の形態の関節炎を発症することがあり、又はRAを発症することがある。臨床的に、それは、治療を必要とする患者と自然に寛解する患者を識別できることに関連する。したがって、本発明者らは、ベースラインでUAを有する425名の患者を抗CarP抗体の存在及びRAの発症について分析した(n=151)。本発明者らは、IgG抗CarP抗体に対して陽性であることが1987年基準によるRAの発症と統計学的に有意に関連しないことを認めた(p=0.11)。それに対して、IgA抗CarP抗体は、全体としてUA群における今後のRA発症と強く関連した(p=0.002)(図4)。この効果は、ACPA陰性個体において特に顕著であった(図4)。
最後に、本発明者らは、ベースラインで抗CarP抗体に対して陽性であるRA患者がその疾患の異なる臨床経過を有するかどうかを分析した。したがって、本発明者らは、関節損傷の程度を経時的に比較した。この分析においても、IgG抗CarP抗体に対して陽性であることは、放射線学的損傷と統計学的に有意に関連しなかった(p=0.43)。しかし、IgA抗CarP抗体は、関節のより重篤な損傷と強く関連し(p=0.002)(図5)、リウマチ因子(RF)又はACPAとは無関係な効果である。全体として、これらのデータは、抗CarP抗体がRA及び又はACPAの存在とは無関係により重篤な疾患経過と関連することを示している。
ここで、カルバミル化タンパク質を認識する自己抗体(抗CarP)の新規ファミリーについて記述する。これらの抗CarP抗体は、IgGとIgAの両方のアイソタイプで検出することができる。阻害研究とコホート研究の両方によれば、抗CarP抗体はACPAとは異なる。興味深いことに、抗CarP、特にIgAに対して陽性であることは、抗CarP IgAに対して陽性の個体はUAからRAに進行するリスクが高く、抗CarP IgA陽性RA患者は抗CarP IgA陰性RA患者よりも悪い成績を有するという臨床的意味を有する。
結果
抗CarP抗体とACPAは異なる抗体ファミリーである。
カルバミル化タンパク質に対する抗体(抗CarP抗体)を検出するために、本発明者らは、カルバミル化FCS(Ca−FCS)及び非修飾FCSを抗原として用いるELISAを開発した。40名のRA患者及び40名の対照の血清を分析して、本発明者らは、RA患者の血清が、IgG(図7A、B)とIgA(図7C、D)の両方の反応性を有する健康な対象から得られる血清に比べて、Ca−FCSと反応することを認めた。Ca−FCSに対するRA血清の高い反応性は、無修飾FCSに対する反応性を減算後に更に強調される(図7C、E)。シトルリン及びホモシトルリンは、2種類のかなり類似したアミノ酸であるので(図6)、本発明者らは、次に、ACPAが、ペプチド中でシトルリンと同じ位置にあるときのホモシトルリンも認識するかどうか判定したいと思った。この目的のために、本発明者らは、ACPAによって認識されることが知られているシトルリン化Fibペプチドを使用したELISAを実施した(23)。このペプチド骨格内で、シトルリン、アルギニン、ホモシトルリン又はリジン残基が更なる分析のために導入された。76個のRA血清のセットを分析して、本発明者らは、ACPAがシトルリン化ペプチドのみを認識し、アルギニン含有又はホモシトルリン含有ペプチドを認識しないことを認めた(図8A)。これらのデータは、ACPAが、同じペプチド骨格内に存在するシトルリンとホモシトルリンを識別できることを示す。次に、本発明者らは、翻訳後修飾タンパク質に結合する抗CarP抗体とACPAの交差反応性があるかどうか分析したいと思った。したがって、本発明者らは、シトルリン化とカルバミル化の両方の抗原に対して反応性である血清を使用して阻害研究を実施した。本発明者らは、Ca−FCS、シトルリン化FCS(Ci−FCS)、未変性FCSと一緒の、又はACPAを検出するのに使用されるシトルリン化ペプチド(CCP1)によって、プレインキュベーション後のCa−FCS被覆プレートに対する抗CarP抗体の結合を分析した。プレインキュベーション後、本発明者らは、Ca−FCSに結合した抗CarP抗体がCa−FCSによってのみ阻害され得るが、シトルリン化FCS(Ci−FCS)、未変性FCSによっても、ACPAを検出するのに使用されるペプチドによっても阻害されないことを認めた(図8B)。本発明者らは、逆阻害実験も実施して、同じプレインキュベーション手順に従ってCi−FCSで被覆されたプレートに対するACPAの結合を分析した。本発明者らは、Ci−FCSに結合したACPAが、Ci−FCS及びシトルリン化ペプチドによってのみ阻害され得るが、Ca−FCSでも、非修飾FCSでも、アルギニン形態のペプチドでも阻害されないことを認めた(図8C)。全体として、これらのデータは、抗CarP抗体とACPAが交差反応性ではなく、又は有限の交差反応性にすぎず、ホモシトルリン、それぞれシトルリン含有抗原に対して特異的であることを示す。上記観察はすべてELISAを使用してなされたので、本発明者らは、異なる技術を使用して本発明者らの知見を確認したいとも思った。このため、本発明者らは、還元ゲル上でFCS、Ca−FCS及びCi−FCSを使用してウエスタンブロット分析を実施し、続いてウエスタンブロット法を実施した。異なるブロットを、抗CarP陽性及びACPA陰性又は抗CarP陰性及びACPA陽性である個体の血清と一緒にインキュベートした。本発明者らは、抗CarP陽性試料の陽性染色をCi−FCSでもFCSでもなくCa−FCSのみで認めた(図8D)。それに対して、抗CarP陰性、ACPA陽性試料は、Ca−FCS及びFCSではなく、Ci−FCSと反応した(図8D)。抗CarP抗体の存在を確認するために、本発明者らは、これらの実験をより明確なタンパク質ヒトFibを標的抗原として使用して繰り返した。Fibは、PADによってシトルリン化され(Ci−Fib)、又はシアナートによってカルバミル化された(Ca−Fib)。非修飾形態(Fib)、Ci−Fib及びCa−FibをELISAにおける抗原として使用した。FCSの観察と同様に、本発明者らは、抗体とCi−Fib及びCa−Fibの有意な結合を認めたが、Fib被覆ウェルでは認められなかった(図9A)。これは、主として、RA血清に限定され、対照には限定されなかった(p=<0.0001)。交差反応性を分析するために、本発明者らは、上述したように阻害研究も実施した。ELISA分析によって、ACPA及び抗CarP抗体はほぼ非交差反応性であることが確認された。カルバミル化タンパク質に対する反応性が抗体の抗原結合部によって確実に媒介されるようにするために、本発明者らはF(ab’)2を作製した。予想どおりに、F(ab’)2は、陰性試料ではなく抗CarP IgG陽性試料から生成され、抗CarP反応性を示す(図9C、D)。完全抗体を使用して観察されるように、Ca−Fibに対するF(ab’)2反応性もCa−Fibによって特異的に阻害され得るが、Ci−Fibに対するF(ab’)2反応性はCi−Fibによってのみ特異的に阻害され得る(図9E)。
ACPAとは別個の自己抗体ファミリーとして抗CarP抗体の同定後、本発明者らは、RA患者及び対照の大集団においてこれらの抗CarP抗体の存在を定量化したいと思った。このため、本発明者らは、まず、抗CarP抗体陽性血清のプールを含む標準を作製した。この標準は、IgGとIgAの両方とカルバミル化FCS(Ca−FCS)の特異的用量依存的結合を示したが、無修飾FCSには結合しなかった(図10A、B)。この分析では、本発明者らは、できるだけ多くの抗CarP反応性を捕らえようとしてFCSに基づくアッセイを再度使用した。本発明者らは、方法のセクションに記載のように、305名の健康な個体の血清を使用して陽性のカットオフを設定した。この手法を使用して、本発明者らは、分析されたRA患者の血清の45%がIgG抗CarP抗体に対して陽性であることを認めた(図10C)。同様に、試験されたRA患者の血清の43%はIgA抗CarP抗体に対して陽性である(図10D)。
この研究で分析されたRA患者の群は、CCP2アッセイによって測定して、ACPA陽性とACPA陰性の両方の個体からなった。したがって、本発明者らは、次に、抗CarP抗体と抗CCP2抗体の関連性を分析した。抗CarP抗体及び抗CCP2抗体の存在は、RA集団全体を分析したときに限定された相関を示した(抗CarP IgGの場合、r2=0.27、p<0.001、又はIgAの場合、r2=0.15、p<0.001)。しかし、本発明者らは、抗CCP2抗体に対してのみ陽性であるかなりの数のRA患者、並びに抗CarP抗体に対してのみ陽性である患者群も特定した(図10E、F)。本発明者らは、抗CCP2陰性RA患者の約16%が抗CarP IgG抗体を示し、抗CCP2陰性RA患者の30%が抗CarP IgA陽性を示すことを認めた(図10G、H)。これらのデータは、抗CarP抗体の存在が抗CCP2抗体の出現率と重なるが、30%を超える抗CCP2陰性患者が抗CarP抗体を有するので、この重なりは絶対的なものではないことを示している。全体では、全抗CCP2陰性患者の35%超が抗CarP IgG又はIgA抗体を有する。
ACPAの存在は、放射線学的損傷によって測定して、より重篤な臨床的疾患経過に関連する。抗CarP抗体の存在がより重篤な疾患経過も予示するかどうか分析するために、本発明者らは、ライデンEACコホートに参加した抗CarP陽性と陰性患者の経時的関節損傷度を比較した。このコホートは、関節炎を最近発症した患者の初期コホートであり、手足のX線がすべてのRA患者で毎年撮影されて、シャープ−ファン デル ハイデ法によって放射線学的損傷が評価される(24)。本発明者らは、抗CarP IgGの存在がより重篤な疾患進行と強く関連することを認めた。抗CarP IgG陽性患者は、IgG陰性患者よりも7年間にわたって関節破壊が多く、ACPA及びRFの補正なしで(β=2.01、95%CI 1.68〜2.40、p=8.68×10−14)又は補正ありで(β=1.41、95%CI 1.13〜1.76、p=0.002)である(図13)。抗CarP IgAは、ACPA及びRFの補正なしで(β=1.21、95%CI 1.01〜1.45、p=0.041)抗CarP IgA陰性患者よりも7年間にわたりより多くの関節破壊に関連するが、補正後は関連がない(p=0.855)(図13)。上記分析は、抗CarP抗体が抗CCP2陰性、抗CCP2陽性又は両方のRAサブグループにおいて放射線学的進行を予測するかどうか示さないので、本発明者らは、次に、層別解析を実施した。重要なことには、この解析によって、抗CarP IgGの存在が抗CCP2陰性サブグループにおいてより重篤な関節損傷に関連することが判明した(β=1.86、95%CI 1.41〜2.66、p=1.8・10−5)(図11)。同様に、より多くの経時的関節損傷に対する類似の傾向が、IgA抗CarP抗体に対して陽性を示した抗CCP2陰性患者でも認められた(β=1.25、95%CI 0.98〜1.58、p=0.071)(図13)。それに対して、重篤な関節破壊によって既に特徴づけられた抗CCP2陽性サブグループにおいては、更なる増加は抗CarP抗体も有する個体において認められなかった(図13)。全体として、これらのデータは、ベースラインにおける抗CarP抗体の検出が、シャープ/ファン デル ハイデ法によって測定して、抗CCP2陰性RAにおけるより破壊的な疾患経過を予示することを示している。
カルバミル化タンパク質を認識する自己抗体である抗CarP抗体のファミリーは、RA患者の血清中に検出することができる。阻害研究とコホート研究の両方によれば、抗CarP抗体とACPAは、2つの異なる独立した自己抗体ファミリーであり、一方はカルバミル化タンパク質を認識し、他方はシトルリン化タンパク質を認識する。本発明者らのデータによれば、抗CarP抗体とACPAは、概して非交差反応性ではあるが、カルバミル化タンパク質接種後のウサギにおいて得られた最近のデータでも示されるように、本発明者らは、幾らかの交差反応性が集団レベルで存在することを排除しない(14)。興味深いことに、抗CarP抗体陽性は、抗CarP IgG陽性個体としての臨床成績に関係するが、抗CCP2抗体陰性は、抗CarP IgG陰性RA患者に比べてより破壊的な疾患経過を有する。
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表I フィブリノーゲンアルファのリジン含有ペプチド及びそのホモシトルリン含有対応物のリスト
フィブリノーゲンアルファのリジン フィブリノーゲンアルファのホモシトルリン含有ペプチド
含有ペプチド
1RVVERHQSACKDSDWPFCSDE 1RVVERHQSAChomocitDSDWPFCSDE
2PFCSDEDWNYKCPSGCRMKGL 2PFCSDEDWNYhomocitCPSGCRMhomocitGL
3NYKCPSGCRMKGLIDEVNQDF 3NYhomocitCPSGCRMhomocitGLIDEVNQDF
4VNQDFTNRINKLKNSLFEYQK 4VNQDFTNRINhomocitLhomocitNSLFEYQhomocit
5QDFTNRINKLKNSLFEYQKNN 5QDFTNRINhomocitLhomocitNSLFEYQhomocitNN
6KLKNSLFEYQKNNKDSHSLTT 6homocitLhomocitNSLFEYQhomocitNNhomocitDSHSLTT
7NSLFEYQKNNKDSHSLTTNIM 7NSLFEYQhomocitNNhomocitDSHSLTTNIM
8EDLRSRIEVLKRKVIEKVQHI 8EDLRSRIEVLhomocitRhomocitVIEhomocitVQHI
9LRSRIEVLKRKVIEKVQHIQL 9LRSRIEVLhomocitRhomocitVIEhomocitVQHIQL
10IEVLKRKVIEKVQHIQLLQKN 10IEVLhomocitRhomocitVIEhomocitVQHIQLLQhomocitN
11EKVQHIQLLQKNVRAQLVDMK 11EhomocitVQHIQLLQhomocitNVRAQLVDMhomocit
12KNVRAQLVDMKRLEVDIDIKI 12homocitNVRAQLVDMhomocitRLEVDIDIhomocitI
13MKRLEVDIDIKIRSCRGSCSR 13MhomocitRLEVDIDIhomocitIRSCRGSCSR
14SRALAREVDLKDYEDQQKQLE 14SRALAREVDLhomocitDYEDQQhomocitQLE
15VDLKDYEDQQKQLEQVIAKDL 15VDLhomocitDYEDQQhomocitQLEQVIAhomocitDL
16QQKQLEQVIAKDLLPSRDRQH 16QQhomocitQLEQVIAhomocitDLLPSRDRQH
17SRDRQHLPLIKMKPVPDLVPG 17SRDRQHLPLIhomocitMhomocitPVPDLVPG
18DRQHLPLIKMKPVPDLVPGNF 18DRQHLPLIhomocitMhomocitPVPDLVPGNF
19PVPDLVPGNFKSQLQKVPPEW 19PVPDLVPGNFhomocitSQLQhomocitVPPEW
20VPGNFKSQLQKVPPEWKALTD 20VPGNFhomocitSQLQhomocitVPPEWhomocitALTD
21SQLQKVPPEWKALTDMPQMRM 21SQLQhomocitVPPEWhomocitALTDMPQMRM
22SSGTGGTATWKPGSSGPGSTG 22SSGTGGTATWhomocitPGSSGPGSTG
23PGTRREYHTEKLVTSKGDKEL 23PGTRREYHTEhomocitLVTShomocitGDhomocitEL
24EYHTEKLVTSKGDKELRTGKE 24EYHTEhomocitLVTShomocitGDhomocitELRTGhomocitE
25TEKLVTSKGDKELRTGKEKVT 25TEhomocitLVTShomocitGDhomocitELRTGhomocitEhomocitVT
26SKGDKELRTGKEKVTSGSTTT 26ShomocitGDhomocitELRTGhomocitEhomocitVTSGSTTT
27GDKELRTGKEKVTSGSTTTTR 27GDhomocitELRTGhomocitEhomocitVTSGSTTTTR
28STTTTRRSCSKTVTKTVIGPD 28STTTTRRSCShomocitTVThomocitTVIGPD
29TRRSCSKTVTKTVIGPDGHKE 29TRRSCShomocitTVThomocitTVIGPDGHhomocitE
30TKTVIGPDGHKEVTKEVVTSE 30ThomocitTVIGPDGHhomocitEVThomocitEVVTSE
31IGPDGHKEVTKEVVTSEDGSD 31IGPDGHhomocitEVThomocitEVVTSEDGSD
32AAFFDTASTGKTFPGFFSPML 32AAFFDTASTGhomocitTFPGFFSPML
33GSESGIFTNTKESSSHHPGIA 33GSESGIFTNThomocitESSSHHPGIA
34PGIAEFPSRGKSSSYSKQFTS 34PGIAEFPSRGhomocitSSSYShomocitQFTS
35PSRGKSSSYSKQFTSSTSYNR 35PSRGhomocitSSSYShomocitQFTSSTSYNR
36YNRGDSTFESKSYKMADEAGS 36YNRGDSTFEShomocitSYhomocitMADEAGS
37GDSTFESKSYKMADEAGSEAD 37GDSTFEShomocitSYhomocitMADEAGSEAD
38EADHEGTHSTKRGHAKSRPVR 38EADHEGTHSThomocitRGHAhomocitSRPVR
39GTHSTKRGHAKSRPVRDCDDV 39GTHSThomocitRGHAhomocitSRPVRDCDDV
40SGTQSGIFNIKLPGSSKIFSV 40SGTQSGIFNIhomocitLPGSShomocitIFSV
41IFNIKLPGSSKIFSVYCDQET 41IFNIhomocitLPGSShomocitIFSVYCDQET
42LNFNRTWQDYKRGFGSLNDEG 42LNFNRTWQDYhomocitRGFGSLNDEG
43VRGIHTSPLGKPSLSP 43VRGIHTSPLGhomocitPSLSP
表II フィブリノーゲンベータのリジン含有ペプチド及びそのホモシトルリン含有対応物のリスト
フィブリノーゲンベータのリジン含有 フィブリノーゲンベータのホモシトルリン含有ペプチド
ペプチド
1MKRMVSWSFHKL 1MhomocitRMVSWSFHhomocitL
2MKRMVSWSFHKLKTMKHLLLL 2MhomocitRMVSWSFHhomocitLhomocitTMhomocitHLLLL
3RMVSWSFHKLKTMKHLLLLLL 3RMVSWSFHhomocitLhomocitTMhomocitHLLLLLL
4SWSFHKLKTMKHLLLLLLCVF 4SWSFHhomocitLhomocitTMhomocitHLLLLLLCVF
5LLLLLCVFLVKSQGVNDNEEG 5LLLLLCVFLVhomocitSQGVNDNEEG
6FSARGHRPLDKKREEAPSLRP 6FSARGHRPLDhomocithomocitREEAPSLRP
7SARGHRPLDKKREEAPSLRPA 7SARGHRPLDhomocithomocitREEAPSLRPA
8SGGGYRARPAKAAATQKKVER 8SGGGYRARPAhomocitAAATQhomocithomocitVER
9ARPAKAAATQKKVERKAPDAG 9ARPAhomocitAAATQhomocithomocitVERhomocitAPDAG
10RPAKAAATQKKVERKAPDAGG 10RPAhomocitAAATQhomocithomocitVERhomocitAPDAGG
11AAATQKKVERKAPDAGGCLHA 11AAATQhomocithomocitVERhomocitAPDAGGCLHA
12SSSFQYMYLLKDLWQKRQKQV 12SSSFQYMYLLhomocitDLWQhomocitRQhomocitQV
13YMYLLKDLWQKRQKQVKDNEN 13YMYLLhomocitDLWQhomocitRQhomocitQVhomocitDNEN
14LLKDLWQKRQKQVKDNENVVN 14LLhomocitDLWQhomocitRQhomocitQVhomocitDNENVVN
15DLWQKRQKQVKDNENVVNEYS 15DLWQhomocitRQhomocitQVhomocitDNENVVNEYS
20PVVSCEEIIRKGGETSEMYLI 20PVVSCEEIIRhomocitGGETSEMYLI
21MYLIQPDSSVKPYRVYCDMNT 21MYLIQPDSSVhomocitPYRVYCDMNT
22VDFGRKWDPYKQGFGNVATNT 22VDFGRhomocitWDPYhomocitQGFGNVATNT
23FGNVATNTDGKNYCGLPGEYW 23FGNVATNTDGhomocitNYCGLPGEYW
24LPGEYWLGNDKISQLTRMGPT 24LPGEYWLGNDhomocitISQLTRMGPT
25TELLIEMEDWKGDKVKAHYGG 25TELLIEMEDWhomocitGDhomocitVhomocitAHYGG
26LIEMEDWKGDKVKAHYGGFTV 26LIEMEDWhomocitGDhomocitVhomocitAHYGGFTV
27EMEDWKGDKVKAHYGGFTVQN 27EMEDWhomocitGDhomocitVhomocitAHYGGFTVQN
28GGFTVQNEANKYQISVNKYRG 28GGFTVQNEANhomocitYQISVNhomocitYRG
29EANKYQISVNKYRGTAGNALM 29EANhomocitYQISVNhomocitYRGTAGNALM
30NDGWLTSDPRKQCSKEDGGGW 30NDGWLTSDPRhomocitQCShomocitEDGGGW
31LTSDPRKQCSKEDGGGWWYNR 31LTSDPRhomocitQCShomocitEDGGGWWYNR
32WGGQYTWDMAKHGTDDGVVWM 32WGGQYTWDMAhomocitHGTDDGVVWM
33TDDGVVWMNWKGSWYSMRKMS 33TDDGVVWMNWhomocitGSWYSMRhomocitMS
34NWKGSWYSMRKMSMKIRPFFQ 34NWhomocitGSWYSMRhomocitMSMhomocitIRPFFQ
35SWYSMRKMSMKIRPFFPQQ 35SWYSMRhomocitMSMhomocitIRPFFPQQ
表III フィブリノーゲンガンマのリジン含有ペプチド及びそのホモシトルリン含有対応物のリスト
フィブリノーゲンガンマのリジン含有フィブリノーゲンガンマのホモシトルリン含有ペプチド
ペプチド
1IADFLSTYQTKVDKDLQSLED 1IADFLSTYQThomocitVDhomocitDLQSLED
2FLSTYQTKVDKDLQSLEDILH 2FLSTYQThomocitVDhomocitDLQSLEDILH
3LEDILHQVENKTSEVKQLIKA 3LEDILHQVENhomocitTSEVhomocitQLIhomocitA
4HQVENKTSEVKQLIKAIQLTY 4HQVENhomocitTSEVhomocitQLIhomocitAIQLTY
5NKTSEVKQLIKAIQLTYNPDE 5NhomocitTSEVhomocitQLIhomocitAIQLTYNPDE
6QLTYNPDESSKPNMIDAATLK 6QLTYNPDESShomocitPNMIDAATLhomocit
7KPNMIDAATLKSRKMLEEIMK 7homocitPNMIDAATLhomocitSRhomocitMLEEIMhomocit
8MIDAATLKSRKMLEEIMKYEA 8MIDAATLhomocitSRhomocitMLEEIMhomocitYEA
9KSRKMLEEIMKYEASILTHDS 9homocitSRhomocitMLEEIMhomocitYEASILTHDS
10LQEIYNSNNQKIVNLKEKVAQ 10LQEIYNSNNQhomocitIVNLhomocitEhomocitVAQ
11NSNNQKIVNLKEKVAQLEAQC 11NSNNQhomocitIVNLhomocitEhomocitVAQLEAQC
12NNQKIVNLKEKVAQLEAQCQE 12NNQhomocitIVNLhomocitEhomocitVAQLEAQCQE
13QLEAQCQEPCKDTVQIHDITG 13QLEAQCQEPChomocitDTVQIHDITG
14DTVQIHDITGKDCQDIANKGA 14DTVQIHDITGhomocitDCQDIANhomocitGA
15TGKDCQDIANKGAKQSGLYFI 15TGhomocitDCQDIANhomocitGAhomocitQSGLYFI
16DCQDIANKGAKQSGLYFIKPL 16DCQDIANhomocitGAhomocitQSGLYFIhomocitPL
17GAKQSGLYFIKPLKANQQFLV 17GAhomocitQSGLYFIhomocitPLhomocitANQQFLV
18GSGNGWTVFQKRLDGSVDFKK 18GSGNGWTVFQhomocitRLDGSVDFhomocithomocit
19QKRLDGSVDFKKNWIQYKEGF 19QhomocitRLDGSVDFhomocithomocitNWIQYhomocitEGF
20KRLDGSVDFKKNWIQYKEGFG 20homocitRLDGSVDFhomocithomocitNWIQYhomocitEGFG
21VDFKKNWIQYKEGFGHLSPTG 21VDFhomocithomocitNWIQYhomocitEGFGHLSPTG
22GTTEFWLGNEKIHLISTQSAI 22GTTEFWLGNEhomocitIHLISTQSAI
23RTSTADYAMFKVGPEADKYRL 23RTSTADYAMFhomocitVGPEADhomocitYRL
24AMFKVGPEADKYRLTYAYFAG 24AMFhomocitVGPEADhomocitYRLTYAYFAG
25GFDFGDDPSDKFFTSHNGMQF 25GFDFGDDPSDhomocitFFTSHNGMQF
26QFSTWDNDNDKFEGNCAEQDG 26QFSTWDNDNDhomocitFEGNCAEQDG
27EQDGSGWWMNKCHAGHLNGVY 27EQDGSGWWMNhomocitCHAGHLNGVY
28GVYYQGGTYSKASTPNGYDNG 28GVYYQGGTYShomocitASTPNGYDNG
29YDNGIIWATWKTRWYSMKKTT 29YDNGIIWATWhomocitTRWYSMhomocithomocitTT
30ATWKTRWYSMKKTTMKIIPFN 30ATWhomocitTRWYSMhomocithomocitTTMhomocitIIPFN
31TWKTRWYSMKKTTMKIIPFNR 31TWhomocitTRWYSMhomocithomocitTTMhomocitIIPFNR
32RWYSMKKTTMKIIPFNRLTIG 32RWYSMhomocithomocitTTMhomocitIIPFNRLTIG
Claims (20)
- ある形態の関節炎に罹患した、または、罹患するリスクのある、個体を分類するのを補助する方法であって、
前記方法は、
前記個体の体液を含む試料が抗カルバミル化タンパク質(抗CarP)抗体を含むかどうかを判定することを含み、
前記方法は、
前記試料を(a)カルバミル化ウシ胎仔血清(Ca−FCS)、または、(b)カルバミル化フィブリノーゲン(Ca−Fib)、または、それから誘導されるペプチドと接触することを含むことを特徴とする、方法。 - 関節炎の発症の予後を前記関節炎に罹患した個体に提供するのを補助する方法であって、
前記方法は、
(a)カルバミル化ウシ胎仔血清(Ca−FCS)、または、(b)カルバミル化フィブリノーゲン、または、それから誘導されたペプチドと接触させることにより、前記個体の体液を含む試料が抗カルバミル化タンパク質(抗CarP)抗体を含むかどうかを判定することを含むことを特徴とする、方法。 - ある形態の関節炎に罹患した、または、罹患するリスクのある、個体を分類するのを補助する方法であって、
前記方法は、
前記個体の体液を含む試料が抗CarP抗体を含むかどうかを判定することを含み、
前記試料は、
抗シトルリン化タンパク質抗体(ACPA)に対して陰性であることを特徴とする、方法。 - 前記試料を、Ca−FCSと接触させることを含むことを特徴とする、請求項1から請求項3のいずれか一項に記載の方法。
- 前記試料を、Ca−Fib、または、それから誘導されるペプチドと接触させることを含むことを特徴とする、請求項1から請求項3のいずれか一項に記載の方法。
- 前記体液は、血清試料、または、滑液試料であることを特徴とする、請求項1から請求項5のいずれか一項に記載の方法。
- 前記抗CarP抗体は、IgサブタイプIgAまたはIgサブタイプIgGであることを特徴とする、請求項1から請求項6のいずれか一項に記載の方法。
- 前記個体が関節炎に罹患するリスクがあるかどうかを判定するのを補助することを特徴とする、請求項1、請求項3から請求項7のいずれか一項に記載の方法であって、
前記体液試料が得られた時点で前記個体が関節炎に罹患していないことを特徴とする、方法。 - 前記関節炎は、
リウマチ様関節炎、若年性関節炎、乾せん性関節炎、骨関節炎、リウマチ性多発筋痛、強直性脊椎炎、反応性関節炎、痛風、偽痛風、自己免疫性関節炎、全身性エリテマトーデス、多発性筋炎、線維筋痛、ライム病、未分化関節炎、非リウマチ性関節炎、または、脊椎関節症を含むことを特徴とする、請求項1から請求項8のいずれか一項に記載の方法。 - 前記関節炎は、リウマチ様関節炎、若年性関節炎、または、未分化関節炎であることを特徴とする、請求項9に記載の方法。
- さらに、前記個体の関節炎分類指標として更なる因子を決定することを含む、請求項1から請求項10のいずれか一項に記載の方法。
- 前記更なる因子は、ACPA、リウマチ因子、C反応性タンパク質、および/または、赤血球沈降速度からなることを特徴とする、請求項11に記載の方法。
- 関節炎のマーカーとしての個体の体液中の抗CarP抗体の検出キットであって、
(a)カルバミル化ウシ胎仔血清(Ca−FCS)、または、(b)カルバミル化フィブリノーゲン(Ca−Fib)、または、それから誘導されるペプチドを含むことを特徴とする、キット。 - カルバミル化ウシ胎仔血清(Ca−FCS)を含むことを特徴とする、請求項13に記載のキット。
- カルバミル化フィブリノーゲン(Ca−Fib)、または、それから誘導されるペプチドを含むことを特徴とする、請求項13に記載のキット。
- 前記カルバミル化フィブリノーゲン(Ca−Fib)、または、それから誘導されるペプチドは、表1、表2、表3に示されたペプチドから選択されることを特徴とする請求項15に記載のキット。
- 前記カルバミル化ウシ胎仔血清(Ca−FCS)、または、前記カルバミル化フィブリノーゲン(Ca−Fib)は、インビトロにおいてカルバミル化されることを特徴とする、請求項13から請求項16のいずれか一項に記載のキット。
- 抗ヒト免疫グロブリン抗体を更に含むことを特徴とする、請求項13から請求項17のいずれか一項に記載のキット。
- 前記抗ヒト免疫グロブリン抗体は、抗ヒトIgG、または、抗ヒトIgA、または、これらの組み合わせを含むことを特徴とする、請求項18に記載のキット。
- シトルリン化タンパク質、または、ペプチドを含むことを特徴とする、請求項13から請求項19のいずれか一項に記載のキット。
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