ES2953096T3

ES2953096T3 - Glicanos ligados a Fab como biomarcadores para la transición desde una "fase de riesgo" previa a la enfermedad a la artritis reumatoide; AAV o síndrome de Sjögren

Info

Publication number: ES2953096T3
Application number: ES17817263T
Authority: ES
Inventors: Thomas Huizinga; Reinaldus Toes; Leendert Trouw; Hans Scherer
Original assignee: Leids Universitair Medisch Centrum LUMC
Current assignee: Leids Universitair Medisch Centrum LUMC
Priority date: 2016-11-25
Filing date: 2017-11-24
Publication date: 2023-11-08
Anticipated expiration: 2037-11-24
Also published as: AU2017366183A1; EP3545306A1; WO2018097724A1; EP3545306B1; JP2022177100A; JP2019537017A; US20190317092A1; CA3045001A1

Abstract

La invención proporciona medios y métodos para determinar si un individuo que no tiene artritis reumatoide, VAA o síndrome de Sjogren en el momento del muestreo está en riesgo de desarrollar dicha enfermedad, el método comprende determinar si una muestra que contiene anticuerpos de dicho individuo comprende un autoanticuerpo. asociado con dicha enfermedad que comprende una glicosilación ligada a N en una o más posiciones en una porción Fab del anticuerpo, comprendiendo además el método determinar el riesgo del individuo de desarrollar dicha enfermedad. La enfermedad es preferentemente artritis reumatoide. (Traducción automática con Google Translate, sin valor legal)

Description

DESCRIPCIÓN

Glicanos ligados a Fab como biomarcadores para la transición desde una “fase de riesgo” previa a la enfermedad a la artritis reumatoide; AAV o síndrome de Sjogren

La invención se relaciona con el campo de las enfermedades autoinmunitarias, en particular en el campo de la artritis reumatoide. También se refiere a métodos para monitorizar individuos para el desarrollo de dicha enfermedad autoinmunitaria o el tratamiento de enfermedades autoinmunitarias, preferiblemente artritis (reumatoide).

Las IgG son glicoproteínas que contienen un sitio de glicosilación conservado ubicado en Asn297 presente en la porción Fc. Desde un punto de vista estructural, estos glicanos Fc sirven como andamiaje interno y son cruciales para mantener la conformación de la cola Fc de la molécula de IgG. La glicosilación de Fc puede modular la interacción con los receptores F^cy(FcyR) y puede participar en otras funciones efectoras, ya que las glicoformas específicas pueden activar las rutas del complemento (mediadas por C1q y MBL) y/o modular la unión de FcyR. Por ejemplo, los residuos de fucosa central pueden influir en la unión de IgG a FcyRIIIa y la falta de fucosa central es responsable de la citotoxicidad celular dependiente de anticuerpos potenciada. Asimismo, el bajo contenido de residuos de ácido siálico y galactosa en los Fcglicanos confiere importantes propiedades proinflamatorias a las IgG, ya que favorece la unión de las IgG a los FcyR activadores.

Además de los N-glicanos ligados a Fc, -15-25 % de las moléculas de IgG en el suero humano contienen glicanos ligados a N presentes en la región Fab. Los Fab-glicanos también pueden modular la función celular y se han implicado en la aparición de linfomas tales como el linfoma folicular, el linfoma difuso de células B grandes y las células B del linfoma de Burkitt, presumiblemente a través de la provisión de un entrecruzamiento aberrante del receptor de células B glicosiladas con Fab a través del glicano a lectinas.

Recientemente se han encontrado en pacientes con artritis reumatoide (RA) anticuerpos que se pueden unir a modificaciones postraduccionales (AMPA), tales como antígenos de proteína citrulinados (ACPA), antígenos de proteína homocitrulinados (anti-CarP) y antígenos de proteína de lisina acetilada (AAPA). Dichos anticuerpos se han implicado en la patogénesis de la enfermedad. La formación del aducto de malondialdehído-acetaldehído (aducto MAA) es otra modificación postraduccional que aumenta en la RA. La modificación da como resultado respuestas de anticuerpos que están asociadas con ACPA (Thiele et al 2015: Artritis Rheumatol Vol 67(3): 645-655: doi 10.1002/art.38969). Diversas modificaciones postraduccionales que están implicadas en el desarrollo de enfermedades autoinmunitarias tales como la RA (revisado en Trouw et al (2017; Nature Reviews Rheumatology doi: 10.1058/nrrheum.2017.15). Recientemente, los inventores de la presente invención hicieron la intrigante observación de que el ACPA aislado de pacientes con RA está extensamente glicosilado con Fab. Los ACPA son altamente específicos para la RA y su presencia se asocia con la gravedad de la enfermedad y predice el desarrollo de RA en sujetos en riesgo (Scott 2010; Willemze, A., et al. “New biomarkers in rheumatoid arthritis.” Neth J Med 70.9 (2012): 392-9) Aunque se desconoce si los Fab-glicanos sobre las moléculas de IgG pueden mediar funciones específicas en las respuestas inmunitarias normales, se han obtenido pruebas que respaldan la idea de que su presencia puede influir en el reconocimiento de epítopos, así como en la vida media de los anticuerpos in vivo (Goletz 2012; Co 1993; Leibiger 1999)

Para someterse a la glicosilación ligada a N, las proteínas deben tener una secuencia de consenso de glicosilación ligada a N (normalmente N-X-S/T, donde X^P; en el presente documento N = asparagina; S = serina; T = treonina; P = prolina y X es cualquier aminoácido, pero no prolina. S/T en la fórmula significa una S o una T en esa posición; a veces hay una C (cisteína) en la posición de S/T). Es importante destacar que los inventores demostraron previamente que los sitios de consenso de glicosilación ligados a N en ACPA-IgG no estaban codificados en la línea germinal, sino que se introdujeron durante la hipermutación somática (Rombouts 2015).

En la presente invención, los inventores identificaron la estructura de los glicanos ligados a N en el dominio Fab de autoanticuerpos asociados con la artritis reumatoide, el síndrome de Sjogren y AAV tales como anticuerpos AMPA tales como ACPA, anti-CarP, anticuerpos anti-aducto de MAA y anticuerpos AAPA en la artritis reumatoide. Los inventores también observaron que las moléculas ACPA-IgG de individuos positivos para ACPA que aún no han mostrado signos clínicos de artritis, es decir, “ individuos en riesgo”, exhiben un grado más bajo de glicosilación de Fab en comparación con ACPA-IgG en pacientes con RA establecida. Por lo tanto, la aparición de glicanos Fab ACPA y/o el grado de glicosilación de Fab ACPA marca la transición de la fase preclínica al inicio de la artritis clínicamente manifiesta. Como tal, la detección de glicanos ACPA Fab mediante bioensayos apropiados se puede utilizar para identificar esta transición y guiar las estrategias de tratamiento para la prevención o el retraso de la aparición de la enfermedad. Lo mismo ocurre con los autoanticuerpos asociados con el síndrome de Sjogren y AAV. Los autoanticuerpos de individuos positivos a autoanticuerpos que aún no han mostrado signos clínicos del síndrome de Sjogren y/o AAV, es decir, “ individuos en riesgo” de desarrollar dicha enfermedad, exhiben un menor grado de glicosilación de Fab en comparación con los autoanticuerpos en pacientes con síndrome de Sjogren y/o VAA establecido.

Resumen de la invención

La invención se define en las reivindicaciones adjuntas.

En una realización, se proporciona un método para determinar si un individuo que no tiene artritis reumatoide, en el momento de la toma de muestras, está en riesgo de desarrollar dicha enfermedad, el método comprende determinar si una muestra que contiene anticuerpos de dicho individuo comprende un autoanticuerpo asociado con la RA. y determinar si el autoanticuerpo comprende una glicosilación ligada a N sobre una o más posiciones en una porción Fab del autoanticuerpo, además el método comprende determinar el riesgo del individuo de desarrollar RA sobre la base de dichas determinaciones.

También se describe un método para analizar una muestra que contiene anticuerpos de un individuo, el método comprende determinar si dicha muestra comprende un autoanticuerpo asociado con artritis reumatoide, síndrome de Sjogren o AAV que comprende una glicosilación ligada a N sobre una o más posiciones en una porción Fab del anticuerpo, el método se caracteriza porque la muestra es una muestra de un individuo que no tiene síntomas de artritis reumatoide, síntomas de síndrome de Sjogren o síntomas de VAA en el momento de la toma de muestra.

También se describe, pero no forma parte de la invención, un método para prevenir o retrasar el desarrollo de un síntoma de artritis reumatoide, un síntoma del síndrome de Sjogren o un síntoma de VAA en un individuo, el método comprende

- determinar si una muestra de dicho individuo contiene un autoanticuerpo asociado con dicha enfermedad;

- y determinar si el anticuerpo tiene una porción Fab glicosilada ligada a N;

- en el que la muestra es una muestra que contiene anticuerpos del individuo y el individuo no tenía artritis reumatoide, síndrome de Sjogren y AAV en el momento de la toma de muestra; y

- tratar al individuo con un medicamento para dicha enfermedad antes o al inicio del individuo que presenta dicha enfermedad.

También se describe un método para monitorizar a un individuo con riesgo de desarrollar artritis reumatoide, síndrome de Sjogren o AAV, el método comprende monitorizar la presencia y/o la aparición de un autoanticuerpo asociado con dicha enfermedad en muestras periódicas que contienen anticuerpos de un individuo, el método caracterizado porque el método comprende además determinar si un autoanticuerpo detectado asociado con dicha enfermedad comprende un glicano ligado a N sobre una o más posiciones en una porción Fab del anticuerpo.

También se proporciona un método para monitorizar a un individuo en riesgo de desarrollar RA, en el que el método comprende monitorizar la presencia de un autoanticuerpo asociado con RA en una muestra que contiene anticuerpos de dicho individuo y/o monitorizar el aumento de dicho autoanticuerpo en muestras que contienen anticuerpos tomadas periódicamente de dicho individuo, y determinar si dicho autoanticuerpo comprende una glicosilación ligada a N sobre una o más posiciones en una porción Fab de dicho autoanticuerpo.

También se describe un medicamento para la artritis reumatoide, síndrome de Sjogren o AAV para uso en un método de tratamiento de un individuo en riesgo de desarrollar una o más de dichas enfermedades en el que se determina que el individuo está en riesgo mediante la detección de un autoanticuerpo asociado con dicha enfermedad cuyo anticuerpo comprende glicosilación ligada a N sobre una o más posiciones en una porción Fab del anticuerpo en una muestra que contiene anticuerpos de dicho individuo. En una realización el individuo no tiene dicha enfermedad al momento de administrar el medicamento.

También se describe un método para determinar si una muestra que contiene anticuerpos comprende un anticuerpo antiproteína modificada (AMPA), preferiblemente una citrulina, una homocitrulina y/o un AMPA que se une a la lisina acetilada, el método comprende

- poner en contacto los anticuerpos de la muestra con un péptido o proteína que comprende un epítopo de proteína modificado, preferiblemente que comprende una citrulina, homocitrulina o lisina acetilada;

- poner en contacto los anticuerpos de la muestra con una molécula que se puede unir a un glicano ligado a N sobre una porción Fab de un anticuerpo; y

- determinar si un anticuerpo con un glicano ligado a N sobre una porción Fab del anticuerpo se ha unido al epítopo de proteína modificado en el péptido o proteína, en el que el epítopo de proteína modificado comprende preferiblemente citrulina, una homocitrulina o una lisina acetilada.

Se describe adicionalmente un kit de partes útiles en la detección de un anticuerpo AMPA, preferiblemente un ACPA, un anti-CarP y/o AAPA en una muestra, el kit que comprende un péptido o proteína que comprende un péptido o proteína con un epítopo modificado traduccionalmente, preferiblemente un epítopo de lisina citrulinada, homocitrulinada y/o acetilada y una molécula que se puede unir a un glicano ligado a N sobre una porción Fab de un anticuerpo.

Además se proporciona un kit de partes para detectar un autoanticuerpo asociado con la artritis reumatoide, tal como un AMPA en una muestra, el kit comprende un péptido o proteína que comprende una modificación postraduccional, en la que dicho péptido o proteína se puede unir a dicho autoanticuerpo y una molécula que se puede unir a un glicano ligado a N sobre una porción Fab de un anticuerpo; en el que la molécula de unión a glicano comprende lectina de unión al ácido siálico.

En una realización también se proporciona un método para analizar una muestra que contiene anticuerpos de un individuo, el método comprende determinar si dicha muestra comprende un anticuerpo AMPa , preferiblemente un anticuerpo ACPA, un anticuerpo anti-CarP y/o un anticuerpo AAPA; y cuyo anticuerpo comprende un glicano ligado a N sobre una o más posiciones en una porción Fab del anticuerpo, el método se caracteriza porque la muestra es una muestra de un individuo que no presenta signos o síntomas de artritis reumatoide en el momento de la toma de muestra.

También se describe un método para determinar si un individuo que no tiene artritis reumatoide en el momento de la toma de muestras está en riesgo de desarrollar artritis reumatoide, el método comprende determinar si una muestra que contiene anticuerpos de dicho individuo comprende un anticuerpo anti-proteína modificada (AMPA), preferiblemente un anticuerpo ACPA, un anticuerpo o anti-CarP y/o un anticuerpo AAPA; y determinar si el anticuerpo comprende un glicano ligado a N sobre una o más posiciones en una porción Fab del anticuerpo, además el método comprende determinar el riesgo del individuo de desarrollar dicha artritis sobre la base de dichas determinaciones.

El individuo que no presenta artritis reumatoide al momento de la toma de muestra es preferiblemente un individuo positivo a un AMPA, preferiblemente un ACPA; un anti-CarP y/o un AAPA, preferiblemente con artralgia (quejas/dolor en las articulaciones) sin signos de inflamación articular o artritis detectables clínica y/o radiográficamente o un individuo asintomático y en el que la serología de ACPA, anti-CarP y/o o AAPA se detecta como un hallazgo accidental o como parte de una prueba de cribado. El individuo preferiblemente no tiene síntomas de artritis crónica.

Se describe adicionalmente, pero no forma parte de la invención, un método para tratar a un individuo por un síntoma de artritis reumatoide o el desarrollo del mismo, el método comprende

- determinar si una muestra contiene un AMPA, preferiblemente un ACPA, un anticuerpo anti-CarP y/o AAPA que tiene una porción Fab glicosilada ligada a N;

- en el que la muestra es una muestra que contiene anticuerpos del individuo y el individuo no tenía artritis reumatoide en el momento de la toma de muestra; y

- tratar al individuo, preferiblemente con un medicamento para la artritis reumatoide u otra intervención dirigida antes o al inicio del individuo que presenta un síntoma de artritis reumatoide. El tratamiento previene o al menos retrasa la aparición de artritis crónica y/o la aparición de un síntoma de artritis reumatoide. El tratamiento también puede reducir la gravedad de la artritis crónica y/o los síntomas de la artritis reumatoide.

También se describe, pero no forma parte de la invención, un método para tratar a un individuo por un síntoma de artritis reumatoide o el desarrollo del mismo, el método comprende

- determinar si una muestra contiene un anticuerpo AMPA, preferiblemente un AAPA, ACPA y/o anti-CarP;

- y determinar si el anticuerpo tiene una porción Fab glicosilada ligada a N;

- tratar al individuo con un medicamento para la artritis reumatoide antes o al inicio del individuo que presenta un síntoma de artritis reumatoide.

También se describe un método para monitorizar a un individuo con riesgo de desarrollar artritis, el método comprende monitorizar la presencia y/o el inicio de un AMPA, preferiblemente un ACPA, un anticuerpo anti-CarP y/o AAPA en muestras periódicas que contienen anticuerpos de dicho individuo, el método caracterizado porque el método comprende además determinar si un anticuerpo AMPA, preferiblemente ACPA, anti-CarP y/o AAPA detectado comprende un glicano ligado a N sobre una o más posiciones en una porción Fab del anticuerpo.

Se describe adicionalmente un medicamento, preferiblemente un medicamento para la artritis, para uso en un método de tratamiento de un individuo que comprende determinar la presencia de un anticuerpo AMPA, preferiblemente un AAPA, ACPA y/o anti-CarP, que comprende glicosilación ligada a N en un o más posiciones en una porción Fab del anticuerpo en una muestra que contiene anticuerpos del individuo, y tratar al individuo cuando se ha detectado un AMPA que comprende glicosilación ligada a N sobre una o más posiciones en una porción Fab del anticuerpo.

Además se describe un método para determinar si un individuo comprende un autoanticuerpo asociado con artritis reumatoide, síndrome de Sjogren o AAV con un glicano ligado a N sobre una porción Fab del anticuerpo, el método comprende

- poner en contacto una muestra que contiene células B de dicho individuo con un péptido o proteína que se puede unir a dicho autoanticuerpo;

- separar las células B unidas a dicho péptido o proteína de las células B no unidas; y

- secuenciar el ácido nucleico que codifica la región variable de una cadena pesada o una parte de la misma y/o la región variable de una cadena ligera o una parte de la misma de un anticuerpo o receptor de células B de dichas células B unidas; y

- determinar si la secuencia de ácidos nucleicos codifica una secuencia de aminoácidos consenso de glicosilación ligada a N.

Además se describe un método para determinar si un individuo comprende un anticuerpo anti-proteína modificada (AMPA) con un glicano ligado a N sobre una porción Fab del anticuerpo, el método comprende

- poner en contacto una muestra que contiene células B de dicho individuo con un péptido o proteína que comprende un epítopo de proteína modificado;

- determinar si la secuencia de ácidos nucleicos determinada codifica una secuencia de aminoácidos consenso de glicosilación ligada a N.

La parte de la región variable puede ser cualquier parte, tal como, pero no se limita a, una región de marco, tal como FR1, FR2, FR3 o FR4. La parte también puede ser una región determinante de complementariedad (CDR) tal como CDR1, CDR2 o CDR3. La parte de la región variable de cadena pesada es preferiblemente una CDR de dicha región variable, preferiblemente la CDR1, preferiblemente CDR1 y CDR2, preferiblemente todas las CDR. La parte de la región variable de cadena ligera es preferiblemente una CDR de dicha región variable, preferiblemente la CDRl, preferiblemente CDR1 y CDR2, preferiblemente todas las CDR.

Breve descripción de los dibujos

Figura 1: Perfil típico de glicanos encontrados en IgG total (arriba) y ACPA IgG (abajo). Se aislaron IgG o ACPA de los mismos pacientes. Los glicanos se liberaron y analizaron por HPLC. Los fragmentos ACPA F(ab) contienen glicanos ligados a N bi-antenarios que están altamente sialilados (diamantes púrpuras: = ácido siálico).

Figura 2: (A) Se analizaron muestras de suero de pacientes con ACPA+ RA y sus parientes sanos de primer grado de ACPA+ (parientes sanos) para determinar la presencia de glicanos F(ab) sobre ACPA. La frecuencia de F(ab)-glicanos sobre ACPA es notablemente más baja en ACPA derivados de donantes sanos en comparación con ACPA de pacientes con RA. Figura (B) Valor predictivo del porcentaje de glicosilación Fab de ACPA-IgG antes del diagnóstico de RA: 26 familiares de primer grado sanos positivos a ACPA de pacientes con RA fueron seguidos a lo largo del tiempo. Cada círculo representa la mediana de la glicosilación de Fab ACPAde un individuo que se sigue hasta el inicio de la enfermedad de artritis reumatoide (RA; círculos negros) o se sigue durante un período de tiempo similar sin desarrollo de RA(HC; control sano; círculo blanco). De estos 26 individuos seguidos, el 46 % desarrolló RA con el tiempo. El porcentaje de glicosilación Fab de IgG general es 15-25 %. La glicosilación de IgG-Fab >55 % se considera “anormal”. Los individuos sanos que desarrollaron RA al final del período de estudio demostraron porcentajes más altos de glicosilación de Fab antes del diagnóstico de RAen comparación con los individuos que no desarrollaron RA.

Figura 3: Enfoque A (método 2) SNA, una lectina que se une específicamente a los ácidos siálicos ligados a alfa2,6 que se encuentran sobre las estructuras Fab-glicano se une a ACPA purificado del suero de pacientes con RA. (A) Método para capturar primero ACPA con perlas recubiertas de CCP2 del suero de pacientes con ^rA positivos a ACPA y negativos a ACPA (izquierda). A continuación, la elución positiva a ACPA se agregó a una placa ELISA recubierta con IgG anti humana. En la siguiente etapa, se agregó SNA biotinilado al ACPA-IgG unido para analizar los niveles de glicosilación Fab de ACPA (derecha). Como control de la cantidad de ACPA que estaba presente en cada pocillo, se realizó un ELISA de IgG total (datos no mostrados). (B) La relación ACPA-Fab glicosilado/ACPA-IgG total (para conocer los métodos, véase la Figura 3A) demostró una gran cantidad de glicanos ligados a Fab sobre ACPA de pacientes positivos a ACPA, mientras que la elución recubierta de CCP de pacientes negativos a ACPA no demostró unión SNA. (C) Para demostrar que SNA en nuestro ELISA, como se representa en la figura 3A (derecha), se une específicamente a los anticuerpos glicosilados con Fab, utilizamos IVIg disponible comercialmente (Sanquin). Incubamos IgIV con microperlas recubiertas con SNA y agregamos el flujo continuo (FT1) o las eluciones 1 (E1; eluida con PBS y lactosa) o elución 2 (E2; eluida con lactosa en ácido acético que se supone que contiene anticuerpos glicosilados en Fab sobre una placa ELISA recubierta con anti-IgG humana. Los niveles de glicosilación de Fab sobre IgG se determinaron mediante la unión de SNA a las diferentes fracciones (método ELISA representado en la Figura 3A, a la derecha). De hecho, la unión de SNA fue mayor a la fracción que contenía anticuerpos glicosilados con Fab. Un análisis HPLC adicional con las fracciones confirmó nuestro hallazgo.

Figura 4: A) Enfoque B (método 3): primero capturar anticuerpos sialilados y luego la detección de enriquecimiento de ACPA. Metodología para evaluar la glicosilación de ACPA-IgG Fab utilizando proteína G y, posteriormente, perlas de agarosa SNA. El panel de la derecha muestra el enriquecimiento de ACPA glicosilado con Fab en un conjunto de muestras de suero de pacientes con RA positivos a ACPA.

(B) Los anticuerpos ACPA y anti-CarP se capturan por SNA. Se aisló IgG del suero de pacientes con RA positivos a anticuerpos ACPA y anti-CarP mediante perlas prot G. Mediante perlas de agarosa SNA, los anticuerpos IgG que se unen a SNA se aislaron y dieron como resultado una fracción que se une a SNA (eluido) y otra que no se une a SNA (flujo continuo) (panel izquierdo de la figura 4A. La fracción de SNA+ (panel izquierdo de eluato de la figura 4A) o la fracción negativa de SNA (flujo a través del panel izquierdo de la figura 4A) se agregaron a una placa ELISA recubierta con CCP2 (izquierda; para detectar ACPA) o FCS carbamilado (derecha; para detectar anticuerpos anti-CarP) y se analizó la unión de IgG. De hecho, la fracción de SNA+ contenía autoanticuerpos ACPA y anti-CarP, lo que sugiere que la glicosilación de Fab está elevada en los anticuerpos ACPA y anti-CarP en comparación con la IgG general.

Figura 5: Desplazamiento de tamaño de los anticuerpos ACPA y anti-proteínas carbamiladas con respecto a los anticuerpos normales, es decir, no dirigidos hacia (homo-)proteínas citrulinadas (en este caso anti-toxoide tetánico).

Figura 6: Secuencia de aminoácidos del fibrinógeno alfa.

Figura 7: Secuencia de aminoácidos del fibrinógeno beta.

Figura 8: Secuencia de aminoácidos del fibrinógeno gamma.

Figura 9: Esquema de la purificación y análisis de la glicosilación de ACPA-IgG e IgG. 1). Los anticuerpos ACPA se purificaron mediante cromatografía de afinidad sobre CCP2 (péptido cíclico citrulinado (CCP Cit) o el control de arginina (CCP-Arg) seguido de captura de Proteína G y Proteína A para obtener ACPA IgG1,2,4 así como IgG no específica de citrulina1,2,4 (agotada de ACPA). 2) Se generaron fragmentos (ACPA)-IgG F(ab')₂al digerir anticuerpos purificados con Ides. La parte Fc resultante se purificó utilizando anticuerpos anti-Fc, mientras que los fragmentos F(ab')₂se aislaron utilizando anticuerpos anti-dominio CH1. 3) Los N-glicanos de anticuerpos y fragmentos se marcaron con ácido 2-aminobenzoico (2A^a) y se analizaron mediante UHPLC y MALDI-TOF-MS, mientras que los glucopéptidos se analizaron mediante LC-^mS.

Figura 10: La glicosilación de cadenas pesadas (HC) y cadenas ligeras (LC) derivadas de ACPA-IgG e IgG aisladas de pacientes con RA. A) SDS-PAGE de ACPA-IgG e IgG bajo condiciones reductoras. En comparación con NCS-IgG que exhibe una HC y una LC, ACPA-IgG mostró múltiples bandas HC (HCl a HC3) y LC (LC a ^lC2) debido a ^-glicosilación ligada.(13) B) Cromatogramas UHPLC de los N glicanos extraídos de las diferentes bandas electroforéticas.

Figura 11: ACPA-IgG está diferencialmente glicosilado en la Fc en comparación con la glicosilación Fab. Espectros MALDI-TOF de los fragmentos A) Fc y B) F(ab')₂de ACPA-IgG purificados de un donante representativo.

Figura 12: Los patrones de glicosilación ligados a Fab difieren entre ACPA-IgG e IgG no específica de citrulina aislada de pacientes con RA. A) Cromatogramas de UHPLC de glicanos ACPA-IgG e IgG F(ab')₂de un paciente con RA representativo. B) Diferencias en los rasgos derivados de glicano de la glicosilación ACPA-IgG e IgG Fab representados en la abundancia relativa de galactosilación, sialilación, fucosilación.

Figura 13: Las ACPA-IgG están altamente glicosiladas con Fab en comparación con las IgG no específicas de citrulina. A) Espectros MALDI-TOF-MS de ACPA-IgG e IgG B) Comparación de los niveles de glicosilación de ACPA-IgG e IgG Fab derivados de datos de UHPLC y LC-MS. C) Comparación de la glicosilación Fab de ACPA-IgG o IgG no específica de citrulina del fluido sinovial (n=3) y plasma (n=6).

Figura 14: Secuencias de aminoácidos de regiones VH o VL que comprenden uno o más sitio(s) de consenso de glicosilación ligados a N expuestos que están resaltados y subrayados.

Figura 15: Elisa con varios antígenos y preparaciones de anticuerpos.

Figura 16: la albúmina humana es sensible a modificaciones postraduccionales tales como la citrulinación y carbamilación. La Figura representa la secuencia del código de acceso Q56G89 de la proteína albúmina humana de la base de datos Uniprot.

Figura 17: la alfa-1-antitripsina humana es sensible a modificaciones postraduccionales tales como la carbamilación. La figura muestra la secuencia del código de acceso AAB59375.1 de la alfa-1-antitripsina humana en la base de datos del NCBI.

Figura 18: Desplazamiento de tamaño como resultado de la N-glicosilación de un autoanticuerpo Fab. Los autoanticuerpos son anticuerpos PR3-ANCA que están correlacionados con AAV. Se representan fracciones de fraccionamiento del tamaño de HPLC de anticuerpos IgG y PR3-ANCA totales de un paciente (Panel A) y otro paciente (Panel B). Los autoanticuerpos están implicados en cuerpos (ANCA) asociados a vasculitis (AAV).

Figura 19: Localización de sitios de N-glicosilación en secuencias BCR ACPA en comparación con sitios en secuencias BCR obtenidas de individuos sanos. (A) Cadena pesada de IgG (B) Cadena ligera de kappa Ig (C) Cadena ligera de Ig lambda.

Figura 20: CD22 como alternativa para SNA para detectar glicanos ACPA Fab.

Los fragmentos F(ab')₂de ACPA-IgG e IgG aislados de pacientes con RAse cargaron en cantidades iguales sobre gel (figura de la izquierda). A continuación, se realizó una SDS-PAGE en la que se cargaron fragmentos ACPA-IgG e IgG F(ab')₂y después se transfirieron a una membrana. Después de esto, la membrana se incubó con CD22-Fc y luego se tiñó con Fc antihumano marcado (figura de la derecha). Solo se mostró reactividad para ACPA-IgG y la reactividad desapareció cuando se retiró el ácido siálico con sialidasa.

Figura 21: Correlación entre la glicosilación de ACPA-Fab y el desarrollo de RA.

Análisis de la glicosilación de ACPA-IgG Fab en familiares de primer grado (FDR) de la población indígena norteamericana ACPA+ que desarrollaron RA (FDR RA) con el tiempo y en ACPA FDR que no desarrollaron RA (FDR HC) hasta el momento. A) Los individuos con RA FDR tienen una mayor glicosilación Fab de ACPA-IgG mientras que los FDR HC mantienen niveles normales de glicosilación Fab de ACPA-IgG. B) La glicosilación Fab de ACPA-IgG ya es alta antes del inicio de la enfermedad. C) Mientras que la glicosilación Fab de ACPA-IgG de FDR HC se mantiene baja con el tiempo.

Figura 22: Análisis de espectrometría de masas y UHPLC de alta gama de ACPA-IgG purificada.

Figura 23: La IVIG se fraccionó utilizando la configuración detallada en la figura 4, seguida de un análisis UPLC (gráfico superior) de las moléculas de IgG totales y de los fragmentos Fab de IgG (gráfico inferior). Los datos muestran que la purificación de SNA se enriqueció en moléculas de IgG que contenían fragmentos Fab altamente sialilados (líneas superiores en los gráficos), mientras que estos estaban ausentes en la fracción de flujo continuo de SNA (líneas inferiores en los gráficos). Cabe destacar que IVIG contiene -15 % de moléculas de IgG glicosiladas con Fab (líneas centrales en los gráficos).

Figura 24: Identificación de glicanos triantenarios en ACPA-IgG utilizando UHPLC, LC-MS y MALDI-TOF-MS-MS. A) Cromatograma UHPLC de los glicanos de ACPA-IgG liberados y marcados con 2AA donde un pico de glicano se eluía después del pico de glicano GP24 ya informado. Al recolectar la GPx, se realizó LC-MS para investigar las masas presentes en esta fracción pico. Se determinó que el pico correspondía a un glicano con una masa de N5H6F1S2. B) conformación de la estructura con MALDI-TOF-MS-MS. La masa 2812.792 se corresponde con la masa de glicano de N5H6F1S2 y por fragmentación se confirmó un glicano triantenario con dos ácidos siálicos ligados a2.6.

Descripción detallada de la invención

El individuo es preferiblemente un individuo humano.

Una enfermedad autoinmunitaria es una afección que surge de una respuesta inmunitaria anormal a una parte normal del cuerpo. Las enfermedades autoinmunitarias pueden afectar casi cualquier parte del cuerpo, que incluye el corazón, cerebro, nervios, músculos, piel, ojos, articulaciones, pulmones, riñones, glándulas, el tubo digestivo y vasos sanguíneos. Hay al menos 80 tipos de enfermedades autoinmunitarias. Casi cualquier parte del cuerpo puede estar involucrada. Los síntomas comunes incluyen fiebre baja y sensación de cansancio. A menudo, los síntomas van y vienen.

Algunas enfermedades autoinmunitarias, tales como el lupus eritematoso sistémico, son hereditarias y ciertos casos se pueden desencadenar por infecciones u otros factores ambientales. Algunas enfermedades comunes que generalmente se consideran autoinmunitarias incluyen la enfermedad celíaca, diabetes mellitus tipo 1, enfermedad de Graves, enfermedad inflamatoria intestinal, esclerosis múltiple, psoriasis, artritis reumatoide y lupus eritematoso sistémico.

El tratamiento depende del tipo y la gravedad de la afección. A menudo se utilizan fármacos antiinflamatorios no esteroides (NSAID) e inmunosupresores. Ocasionalmente también se puede utilizar inmunoglobulina intravenosa. Si bien el tratamiento generalmente mejora los síntomas, por lo general no cura la enfermedad.

En una realización se proporciona como se define en la reivindicación 1. También se proporciona un método como se define en la reivindicación 2.

El riesgo del individuo de desarrollar dicha RA es alto cuando se detecta el autoanticuerpo que está asociado con dicha RA y dicho anticuerpo comprende una glicosilación ligada a N sobre una o más posiciones en una porción Fab del autoanticuerpo. El riesgo es mayor cuando una fracción mayor del autoanticuerpo comprende una glicosilación ligada a N sobre una o más posiciones en una porción Fab.

En una realización, se proporciona un método en el que el método comprende determinar si dicha muestra comprende un autoanticuerpo que está asociado con una enfermedad autoinmunitaria particular y cuyo autoanticuerpo comprende una glicosilación ligada a N sobre una o más posiciones en una porción Fab del anticuerpo, el método se caracteriza porque la muestra es una muestra de un individuo que no presenta síntomas de RAal momento de la toma de muestra.

También se describe, pero no forma parte de la invención, un método para tratar a un individuo por un síntoma de enfermedad autoinmunitaria particular o el desarrollo de la misma, el método comprende

- determinar si una muestra contiene un autoanticuerpo que está asociado con dicha enfermedad autoinmunitaria particular; y

- determinar si el anticuerpo tiene una porción Fab glicosilada ligada a N;

- en el que la muestra es una muestra que contiene anticuerpos del individuo y el individuo no tenía dicha enfermedad autoinmunitaria en el momento de la toma de muestra; y

- tratar al individuo con un medicamento para el tratamiento de dicha enfermedad autoinmunitaria particular antes o al inicio del individuo que presenta un síntoma de dicha enfermedad autoinmunitaria particular.

También se describe un medicamento para uso en un método de tratamiento de un individuo que comprende determinar la presencia de un autoanticuerpo asociado con una enfermedad autoinmunitaria particular y que comprende la glicosilación ligada a N sobre una o más posiciones en una porción Fab del anticuerpo en una muestra que contiene anticuerpos del individuo, y tratar al individuo cuando se ha detectado un autoanticuerpo asociado con dicha enfermedad autoinmunitaria particular que comprende glicosilación ligada a N sobre una o más posiciones en una porción Fab del anticuerpo.

Un autoanticuerpo es un anticuerpo que se dirige contra una o más de las propias proteínas del individuo (se dirige contra un autoantígeno). Los autoanticuerpos se pueden dirigir contra varios autoantígenos diferentes. Se dice que un autoanticuerpo está asociado con una enfermedad autoinmunitaria si la frecuencia con la que se detectan autoanticuerpos con la especificidad indicada en individuos que padecen dicha enfermedad autoinmunitaria es significativamente mayor que en la población normal/sana. En el síndrome de Sjogren, el autoanticuerpo normalmente es un anticuerpo SS-Ao SS-B (también conocido como anti-Ro/La). La vasculitis asociada a anticuerpos anticitoplasma de neutrófilos (ANCA) es un grupo de enfermedades autoinmunitarias caracterizadas por la infiltración anormal de neutrófilos, la acumulación de leucocitoclasis no depurada en los tejidos perivasculares y la necrosis fibrinoide de las paredes de los vasos. Los pacientes con AAV exhiben con frecuencia insuficiencia renal rápidamente progresiva causada por glomerulonefritis semilunar. Se ha demostrado que la mieloperoxidasa (MPO) y la proteinasa 3 (PR3) son dos antígenos ANCA principales. Los autoanticuerpos en AAV normalmente se dirigen contra una o ambas de dichas proteínas. El autoanticuerpo de proteína de membrana lisosomal-2 (LAMP-2) representa un subtipo adicional de ANCA. En la RA, el autoanticuerpo normalmente es un AMPA o factor reumatoide.

El síndrome de Sjogren es una enfermedad autoinmunitaria a largo plazo en la que se ven afectadas las glándulas productoras de humedad del cuerpo. Esto resulta principalmente en el desarrollo de una boca seca y ojos secos. Otros síntomas pueden incluir piel seca, tos crónica, sequedad vaginal, entumecimiento en brazos y piernas, fatiga, dolores musculares y articulares y disfunción tiroidea. Aquellos afectados tienen un mayor riesgo (5 %) de linfoma. El diagnóstico del síndrome de Sjogren se realiza mediante la combinación de síntomas clínicos, resultados de mediciones que prueban la función glandular, biopsia de glándulas productoras de humedad y análisis de sangre en busca de anticuerpos específicos. En la biopsia, normalmente hay linfocitos dentro de las glándulas.

La vasculitis es un grupo de trastornos que destruyen los vasos sanguíneos por inflamación. Tanto las arterias como las venas se ven afectadas. La linfangitis a veces se considera un tipo de vasculitis. La vasculitis es causada principalmente por la migración de leucocitos y el daño resultante. La vasculitis asociada a ANCA es un subtipo de vasculitis asociada con autoanticuerpos contra antígenos derivados de granulocitos neutrófilos. Dichos anticuerpos anticitoplasma de neutrófilos también se denominan ANCA.

La artritis es una de las formas más comunes de enfermedad autoinmunitaria. Hay más de 100 formas diferentes de artritis. La forma más común es la osteoartritis (enfermedad degenerativa de las articulaciones). La osteoartritis tiene una variedad de causas, aunque tampoco hay causas fácilmente identificables. Estos últimos a menudo se conocen colectivamente como osteoartritis relacionada con la edad. Otras formas de artritis son, por ejemplo, artritis reumatoide, artritis psoriásica y enfermedades autoinmunitarias relacionadas.

Una de las principales quejas de las personas que tienen artritis es el dolor en las articulaciones. El dolor es a menudo una constante y puede estar localizado en la articulación afectada. El dolor de la artritis a menudo es el resultado del daño que se induce a la articulación o el resultado de la inflamación que ocurre dentro y alrededor de la articulación. Otras quejas son el dolor como resultado de las distensiones musculares causadas por movimientos enérgicos contra las articulaciones rígidas y dolorosas y fatiga. La artritis reumatoide es una enfermedad debilitante y progresiva si no se trata. Los síntomas de la enfermedad y los tratamientos para la RA se detallan en Scott et al 2010 The lancet 376, páginas 1094-1108, La presente invención se refiere a esta publicación en particular para la descripción de los síntomas de la RA y los medicamentos para la RA. Aunque la revisión es extensa, los síntomas y medicamentos descritos no se leer como limitantes. A continuación, se proporciona una lista resumida no limitativa de síntomas. La artritis reumatoide afecta las articulaciones. La artritis de las articulaciones implica la inflamación de la membrana sinovial. Las articulaciones se hinchan, se vuelven sensibles y calientes, y la rigidez limita su movimiento. Las más comúnmente involucradas son las articulaciones pequeñas de las manos, los pies, pero también pueden estar involucradas las articulaciones más grandes como el hombro y la rodilla y la columna cervical. La RA normalmente se manifiesta con signos de inflamación, con las articulaciones afectadas hinchadas, calientes, dolorosas y rígidas, particularmente temprano en la mañana al despertar o después de una inactividad prolongada. El aumento de la rigidez temprano en la mañana normalmente es una característica destacada de la enfermedad y, por lo general, dura más de una hora. A medida que avanza la patología, la actividad inflamatoria conduce a la inmovilización del tendón, la erosión y la destrucción de la superficie articular. Esto afecta el rango de movimiento y conduce a la deformidad. El nódulo reumatoide, que a veces se encuentra en la piel, es la característica no articular más común. Ocurren en una gran minoría de los pacientes. Es un tipo de reacción inflamatoria conocida por los patólogos como “granuloma necrosante”.

Los anticuerpos de proteína anticitrulinada (ACPA) son autoanticuerpos (anticuerpos contra las proteínas propias de un individuo). Los anticuerpos están dirigidos contra péptidos y/o proteínas citrulinadas. Están presentes en la mayoría de los pacientes con artritis reumatoide. Clínicamente, los péptidos citrulinados cíclicos (CCP) se utilizan con frecuencia para detectar estos anticuerpos en el suero o el plasma de los pacientes.

La citrulinación o deiminación es la conversión del aminoácido arginina de una proteína en el aminoácido citrulina. Las enzimas denominadas peptidilarginina deiminasas (PAD) reemplazan el grupo cetimina primario (=NH) por un grupo cetona (=O). La citrulinación realiza una función en individuos normales. Sin embargo, el sistema inmunitario puede atacar las proteínas citrulinadas, lo que ocurre específicamente en la artritis reumatoide.

La citrulina no es uno de los 20 aminoácidos estándar codificados por el ADN en el código genético. En cambio, es el resultado de una modificación postraduccional. La citrulinación es distinta de la formación del aminoácido libre citrulina como parte del ciclo de la urea o como subproducto de las enzimas de la familia de la sintasa de óxido nítrico.

La arginina está cargada positivamente a un pH neutro, mientras que la citrulina no está cargada. En la reacción de arginina a citrulina, uno de los átomos de nitrógeno terminales de la cadena lateral de arginina se reemplaza por oxígeno. El cambio de carga aumenta la hidrofobicidad de la proteína, lo que lleva a cambios en el plegamiento de la proteína. Por lo tanto, la citrulinación puede cambiar la estructura y función de las proteínas. La fibrina y el fibrinógeno pueden ser sitios favorecidos para la desiminación de arginina dentro de las articulaciones reumatoides.

Las pruebas para la presencia de ACPA-IgG son tan sensibles como el factor reumatoideo IgM para el diagnóstico de la RA. Dichos ACPA son detectables antes del inicio de la enfermedad clínica. Actualmente, las pruebas ACPA se incorporan de forma rutinaria en el esquema de diagnóstico para la RA. Sin embargo, considerando que dichos anticuerpos pueden estar presentes durante años antes del desarrollo de la enfermedad, no son concluyentes por sí mismos.

La homocitrulina es un grupo metileno más largo que la citrulina, pero de estructura similar. El metabolito se genera a partir de un residuo de lisina. Se considera que la mayor parte de la carbamilación durante la inflamación tiene lugar cuando los neutrófilos liberan la enzima MPO. Los autoanticuerpos contra péptidos y proteínas homocitrulinados (anti-CarP) están asociados con la RA. Los anticuerpos anti-CarP también se pueden detectar en individuos presintomáticos mucho antes de que se desarrollen los síntomas (Shi et al, Ann Rheum Dis. 2014 Apr;73(4):780-3.)

La citrulinación y la carbamilación son ejemplos de modificaciones postraduccionales de proteínas contra las que los individuos pueden producir autoanticuerpos. La acetilación de lisina es otra modificación postraduccional a la que los individuos pueden producir autoanticuerpos (Juarez, et al., 2015. Annals of the rheumatic diseases: annrheumdis-2014). La acetilación ocurre como una modificación postraduccional de una proteína, por ejemplo, histonas, p53 y tubulinas. Entre estas proteínas, las proteínas de la cromatina y las enzimas metabólicas están muy representadas. La acetilación a veces también se denomina modificación de cotraducción. En la presente invención se denomina modificación postraduccional. Las proteínas se pueden acetilar sobre residuos de lisina. Se considera que la acetilación de lisina tiene una función reguladora en al menos algunos tipos de proteínas. La acetilación de lisina modifica el extremo de la cadena lateral de lisina. Donde la cadena lateral de lisina termina en -NH₂, una lisina acetilada termina en NH=O-CH3.

Otros tipos de modificaciones postraduccionales incluyen, pero no se limitan a, fosforilación, mutilación, ubiquitinación, glicosilación y/o sumoilación. En la presente invención, la modificación postraduccional que detectan los autoanticuerpos normalmente no es una glicosilación. Las modificaciones postraduccionales preferidas son la citrulinación, homocitrulación y acetilación de lisina. Un péptido o proteína con una modificación postraduccional también se denomina como un péptido o proteína modificada, o péptido o proteína que comprende un epítopo modificado. Un anticuerpo que se une específicamente a un epítopo que comprende una modificación postraduccional se denomina como anticuerpo antiproteína modificada (AMPA). El AMPA se une al péptido o proteína solo cuando comprende la modificación postraduccional. Dicho epítopo modificado también se denomina epítopo de proteína modificada. Un AMPA es un anticuerpo que se puede unir a un epítopo modificado postraduccionalmente en un péptido o proteína. El AMPA normalmente no es un anticuerpo que se una a un epítopo glicosilado. El AMPA es preferiblemente un anticuerpo que se une a un epítopo que comprende una citrulina, una homocitrulina y/o una lisina acetilada. En los últimos años, se ha hecho evidente que la autoinmunidad en la RA se dirige a las proteínas citrulinadas y se extiende a otras modificaciones de proteínas, tales como la homocitrulación de proteínas, también conocida como carbamilación, y acetilación (Shi et al Proc. Natl Acad Sci 2011: 108:17372-17377; Juarez et la 2016 Ann. Rheum. Dis 75:1099-1107). En otro aspecto, AMPA es un anticuerpo que se une a un aducto de MAA sobre una proteína. Los epítopos preferidos a los que se puede unir AMPA son epítopos que comprenden una citrulina, una homocitrulina, un residuo de lisina acetilada y/o un aducto de malondialdehído-acetaldehído. Los epítopos preferidos a los que se puede unir AMPA son epítopos que comprenden un residuo de citrulina, homocitrulina y/o lisina acetilada. El epítopo modificado postraduccionalmente en un péptido o proteína puede ser un péptido o proteína normal que se genera y posteriormente se modifica. El epítopo modificado postraduccionalmente también se puede introducir directamente en el péptido o la proteína durante la síntesis artificial del péptido o, si se desea, de la proteína, utilizando un aminoácido artificial que comprende la cadena lateral deseada.

En la presente invención se encontró que la detección de un AMPA, con glicosilación ligada a N sobre una o más posiciones en la porción Fab del anticuerpo se correlacionaba bien con el inicio de la artritis reumatoide. El AMPA es preferiblemente un anticuerpo que se puede unir a un epítopo de lisina citrulinada, homocitrulinada y/o acetilada en un péptido o proteína. El anticuerpo es preferiblemente un anticuerpo ACPA, anti-CarP y/o AAPA. Se sabe que la presencia de anticuerpos AAPA, ACPA o anti-CarP es indicativa de riesgo de desarrollar la enfermedad. Sin embargo, dichos anticuerpos y, en particular, los anticuerpos AAPA, ACPA y anti-CarP pueden estar presentes generalmente durante años antes del desarrollo de la RA. Por otro lado, la glicosilación ligada a N sobre una o más posiciones en la porción Fab de dichos anticuerpos predice con mayor precisión el inicio de la enfermedad y el desarrollo de los síntomas. El momento en que aparece en suero un AMPA que comprende glicosilación ligada a N sobre una o más posiciones en la porción Fab es indicativo de la aparición de síntomas y desarrollo de la enfermedad. El mismo fenómeno se detectó en personas con riesgo de desarrollar el síndrome de Sjogren o AAV. El conocimiento de la inminencia de la aparición de los síntomas es ventajoso como tratamiento temprano del síndrome de Sjogren, VAA o síntomas de la RA con, por ejemplo, fármacos antirreumáticos modificadores de la enfermedad (DMAR,Ds) en el caso de la RA ha demostrado ser beneficioso para el paciente. También, es probable que el tratamiento presintomático sea beneficioso para el individuo a largo plazo. Los síntomas de la RA al menos se pueden retrasar y/o la gravedad de los síntomas puede mejorarse en comparación con aquellos de los pacientes que no fueron tratados o recibieron tratamiento después del inicio de los síntomas de la RA. También es posible que el tratamiento previo a la enfermedad antes de la aparición de anticuerpos glicosilados con Fab que se pueden unir a un epítopo modificado postraduccionalmente en un péptido o proteína, tal como los anticuerpos AAPA, ACPA y/o anti-CarP, podría prevenir el desarrollo de RA.

La glicosilación ligada a N es una modificación postraduccional que puede ocurrir en ciertos motivos de aminoácidos en una proteína. Los primeros anticuerpos ACPA y anti-CarP que aparecen en la sangre normalmente no tienen glicanos en la porción Fab del anticuerpo y carecen de una secuencia de consenso adecuada. Los N-glicanos se adhieren a una asparagina que se debe ubicar en una secuencia de consenso específica en la estructura primaria (Asn-X-Ser; Asn-X-Thr o, en raras ocasiones, Asn-X-Cys; X puede no ser prolina). El Asn debe estar ubicado sobre la superficie del anticuerpo y el Asn debe encontrarse en el lado luminal del retículo endoplásmico para que se inicie la glicosilación ligada a N. Los motivos que cumplen estos criterios a menudo solo aparecen tras la maduración del anticuerpo por medio de hipermutación somática.

La presente invención proporciona un método para determinar si un individuo comprende un anticuerpo que comprende una glicosilación ligada a N sobre una porción Fab del anticuerpo, el método comprende amplificar moléculas de ácido nucleico que codifican un anticuerpo VH y/o VL o una porción del mismo en una muestra que comprende células B de dicho individuo y determina si una molécula de ácido nucleico amplificada codifica una secuencia de aminoácidos que es un sitio de consenso de glicosilación ligado a N. La estructura tridimensional de las porciones Fab de un anticuerpo es bien conocida. También se sabe qué parte de los aminoácidos en una porción Fab de un anticuerpo están expuestos y, por lo tanto, accesibles (expuestos al exterior de la molécula) a la modificación ligada a N postraduccional. En una realización preferida de un método como se describe, se determina si una molécula de ácido nucleico amplificada comprende una secuencia que codifica un sitio de consenso accesible para la glicosilación ligada a N. En una realización preferida, las células B son células B que comprenden un receptor de células B (BCR) que se puede unir a un epítopo modificado postraduccionalmente en un péptido o proteína. La presencia de dicho BCR indica que el individuo comprende un AMPA. Dichas células B se pueden purificar a partir de una población de células B sobre la base de la capacidad de unión a proteínas modificada de la célula B. Por ejemplo, por medio de perlas que tienen un epítopo de proteína modificado sobre su superficie. Los inventores han encontrado que los sitios de consenso accesibles para la glicosilación ligada a N no se distribuyen al azar sobre la región VH o VL. Dichos sitios de consenso se pueden agrupar en una región marco, tal como FR1, FR2, FR3 o FR4, tanto en la cadena pesada como en la cadena ligera. La parte también puede ser una región determinante de complementariedad (CDR) tal como CDR1, CDR2 o CDR3. En algunas realizaciones, los sitios de consenso se agrupan alrededor de las regiones CDR, más a menudo en o alrededor de la región CDR1 o la región CDR3 del VH o VL, normalmente en o alrededor de la región CDR1. Por lo tanto, se prefiere que se determine la secuencia de al menos VH CDR1, preferiblemente VH CDR1 y VL CDR1; preferiblemente se determina al menos además que incluye determinar la VH CDR3, preferiblemente la VH CDR3 y la VL CDR3; preferiblemente se determina al menos la secuencia VH, preferiblemente se determina tanto la secuencia VH como la VL. En una realización, la invención proporciona un método para determinar si un individuo comprende un AMPA que comprende una glicosilación ligada a N sobre una porción Fab del anticuerpo; el método comprende recolectar células B con receptores de células B que comprenden un AMPA de dicho individuo; amplificar las moléculas de ácido nucleico que codifican la VH y/o VL o una porción de la misma de dicho AMPA y determinar si una molécula de ácido nucleico amplificada codifica una secuencia de aminoácidos que es una secuencia consenso de glicosilación ligada a N. Dicha porción VH y/o VL es preferiblemente una secuencia codificante de CDR, preferiblemente una secuencia codificante de CDR1 y/o CDR3. Para ejemplos de la secuenciación de receptores de células B de células B que expresan anticuerpos IgG anti-proteína citrulinada, se hace referencia a o Vergoesen et al (2017) Ann Rheum Dis. Doi: 10.1136/annrheumdis-2017-212052

La detección de un AMPA, preferiblemente un anticuerpo AAPA, ACPA o anti-CarP con glicosilación ligada a N sobre una o más posiciones en la porción Fab del anticuerpo es normalmente predictiva para el individuo que desarrolla artritis reumatoide poco después de la recolección de la muestra. La detección de la “conversión inmunológica”, es decir, la aparición de AMPA que comprende un glicano ligado a N sobre una porción Fab del anticuerpo, se realiza preferiblemente lo antes posible, preferiblemente durante el tiempo suficiente para poder iniciar un tratamiento eficaz (e idealmente preventivo). La detección de un AMPA con un glicano ligado a N sobre una porción Fab del anticuerpo es normalmente predictiva de que el individuo desarrolle artritis reumatoide dentro de un marco de tiempo limitado desde la recolección de la muestra del individuo.

En un aspecto, la invención proporciona un nuevo método para determinar la glicosilación ligada a N sobre una porción Fab de un AMPA. El método comprende poner en contacto anticuerpos de una muestra con una proteína o péptido que comprende un epítopo que comprende una modificación postraduccional; poner en contacto los anticuerpos de la muestra con una molécula que se puede unir a un glicano ligado a N sobre una porción Fab de un anticuerpo; y determinar si un anticuerpo con un glicano ligado a N sobre una porción Fab del anticuerpo se ha unido al epítopo que comprende la modificación postraduccional en la proteína/péptido.

Un epítopo que comprende una modificación postraduccional (denominado en el presente documento con el término “epítopo de proteína modificado”) es preferiblemente un epítopo citrulinado; un epítopo homocitrulinado y/o un epítopo de lisina acetilado. Los anticuerpos contra estos epítopos se denominan como ACPA, anti-CarP y AAPA, respectivamente. En algunas realizaciones, la modificación postraduccional es un aducto MAA o AA. El malondialdehído (MDA) y su producto de descomposición, el acetaldehído (AA), son aldehídos altamente reactivos y, en conjunto, se ha demostrado que modifican las proteínas para producir un aducto de proteína MDA-AA, denominado malondialdehído-acetaldehído (aducto de MAA). Los aductos de MAA son altamente inmunogénicos.

En la naturaleza, la modificación se puede introducir en el péptido o proteína después de la síntesis del péptido o proteína, o durante la síntesis. En este último caso la modificación se introduce en la parte de la proteína que ya ha sido sintetizada por el ribosoma. En el laboratorio es posible introducir la modificación también al incorporar una versión modificada del aminoácido en la cadena de aminoácidos naciente. En el laboratorio, se prefiere que el péptido o proteína se sintetice en presencia de un aminoácido artificial que comprende la modificación, que luego se incorpora a la cadena de péptido o proteína naciente.

La muestra es normalmente una muestra de sangre, preferiblemente una muestra de suero o plasma. Dichas muestras son normalmente muestras que contienen anticuerpos. Otras muestras que contienen anticuerpos son, por ejemplo, fluido sinovial y esputo. Para fines de secuenciación, se prefiere que la muestra contenga células que produzcan el anticuerpo. En dichas realizaciones, se prefiere que la muestra sea una muestra que comprenda células B. Las células B positivas para el receptor de células B contienen anticuerpos que se excretan y/o que están presentes como parte del receptor de células B sobre la superficie celular de la célula B. El receptor de células B o BCR es una proteína receptora transmembrana ubicada sobre la superficie externa de las células B. La fracción de unión del receptor está compuesta por un anticuerpo unido a la membrana que, como todos los anticuerpos, tiene un sitio de unión al antígeno único y determinado al azar. Las muestras que contienen anticuerpos que tienen células positivas a BCR se pueden utilizar, por ejemplo, para secuenciar la región variable del BCR expresado o el anticuerpo expresado, por ejemplo, para determinar si el dominio variable comprende una secuencia consenso para la glicosilación ligada a N. La muestra que contiene células B es, por ejemplo, fluido sinovial. Los anticuerpos IgG se encuentran en todos los fluidos corporales. Son el isotipo más utilizado para la determinación de anticuerpos AAPA, ACPA y anti-CarP y forman una fuente adecuada para determinar la glicosilación de una porción Fab. La muestra se puede utilizar directamente en un método de detección como se describe en el presente documento, o los anticuerpos se pueden purificar de la muestra y luego utilizar en el método. La muestra es preferiblemente una muestra de un individuo que no tiene RA en el momento de la toma de muestra. Preferiblemente, el individuo no expresa un síntoma de clasificación de RA, en particular artritis, en el momento de la toma de muestras.

Hay varios métodos disponibles para determinar si una muestra contiene un anticuerpo ACPA o anti-CarP La mayoría de los métodos utilizan una proteína o un péptido que comprende un epítopo citrulinado u homocitrulinado. El péptido es normalmente un péptido de entre 6 y 50 aminoácidos. Preferiblemente, dicho péptido es un péptido de entre 12 y 30 aminoácidos, más preferiblemente de entre 18 y 22 aminoácidos, lo más preferiblemente de aproximadamente 21 aminoácidos. Los rangos mencionados incluyen el número mencionado, es decir, un rango de entre 12 y 30 aminoácidos incluye péptidos de 12 y 30 aminoácidos, respectivamente. El péptido puede ser o no un péptido cíclico dependiendo de la sensibilidad y/o especificidad del péptido lineal comparable. Los péptidos circulares se pueden generar en cualquier composición molecular para generar la naturaleza cíclica. Una proteína normalmente comprende 30 o más aminoácidos. Normalmente 50 o más aminoácidos. En las figuras se representan ejemplos de proteínas que se pueden utilizar en un método de la invención, es decir, fibrinógeno alfa (Figura 6), fibrinógeno beta (Figura 7) o fibrinógeno gamma (Figura 8), albúmina humana (Figura 16) y alfa -1 -antitripsina humana (Figura 17). Los péptidos particularmente preferidos son los péptidos CCP1 y CCP2, preferiblemente CCP2. Un kit de la invención comprende preferiblemente un péptido CCP1 y/o CCP2.

En una realización preferida, un péptido o proteína para uso en un método de la invención es (parte de) una proteína humana que se sabe que está sujeta a modificación postraduccional tal como citrulinación, homocitrulación y/o acetilación en pacientes con RA. En una realización preferida, el péptido es un péptido derivado de fibrinógeno humano. El péptido preferiblemente comprende un aminoácido contiguo de entre 12 y 30 aminoácidos, más preferiblemente de entre 18 y 22 aminoácidos, lo más preferiblemente de aproximadamente 21 aminoácidos presentes en la secuencia de aminoácidos de cualquiera de fibrinógeno alfa (Figura 6), fibrinógeno beta (Figura 7) o fibrinógeno gamma (Figura 8). En otra realización preferida, el péptido es un péptido derivado de albúmina humana (Figura 16) o alfa-1-antitripsina humana (Figura 17). El péptido o proteína comprende un epítopo con una modificación postraduccional. El epítopo es preferiblemente un epítopo en el que al menos una lisina (anti-CarP o AAPA) o arginina (ACPA) presente en una proteína no modificada es ahora una citrulina, una lisina acetilada o una homocitrulina. La lisina, citrulina u homocitrulina acetilada se puede introducir mediante la acetilación u (homo)-citrulinación apropiada de un péptido. Más adecuadamente, el péptido se sintetiza con la lisina, citrulina u homocitrulina acetilada en la posición correcta.

El péptido, la proteína o la molécula que se puede unir a un glicano ligado a N sobre una porción Fab de un anticuerpo se acopla normalmente a una superficie. La superficie es normalmente una superficie sólida. La superficie sólida puede ser una superficie plana como la que normalmente se presenta en una placa. También puede ser una estructura tridimensional como una perla. La superficie sólida también puede ser matriz de gel. Una superficie sólida a la que se pueden unir los anticuerpos facilita la separación de material específico y material no específico. Se puede utilizar cualquier método para acoplar péptidos y/o proteínas en forma carbamilada, citrulinada o nativa a la superficie. Los ejemplos no limitantes son el recubrimiento directo o el recubrimiento con biotina-estreptavidina. Otros métodos para acoplar péptidos o proteínas a una superficie están disponibles para el experto en la materia.

Hay varias moléculas disponibles que se pueden unir a un glicano ligado a N sobre una porción Fab de un anticuerpo. Se pueden encontrar ejemplos de proteínas naturales que se pueden unir a los glicanos en la página de inicio de Functional Glycomics (http://www.functionalglycomics.org/glycomics/molecule/jsp/gbμMolecule-home.jsp). Las SIGLEC (lectinas de tipo inmunoglobulina que se unen al ácido siálico) son una familia de proteínas de la superficie celular que se unen al ácido siálico. Se encuentran principalmente sobre la superficie de las células inmunitarias y son un subconjunto de las lectinas de tipo I. Hay 14 Siglecs de mamíferos diferentes, que proporcionan una matriz de funciones diferentes. La familia se numeró anteriormente SIGLEC1, SIGLEC2, ... SIGLEC14. En la actualidad, se ha cambiado el nombre de muchos SIGLEC. CD22 o grupo de diferenciación-22, también se conoce como SIGLEC2. Se encuentra sobre la superficie de las células B maduras y, en menor medida, sobre algunas células B inmaduras. En términos generales, la CD22 es una molécula reguladora que previene la sobreactivación del sistema inmunitario y el desarrollo de enfermedades autoinmunitarias. De interés en la presente invención es el hecho de que CD22 es una proteína transmembrana de unión a azúcar, que se une específicamente al ácido siálico con un dominio de inmunoglobulina (Ig) ubicado en su terminal N. La Figura 20 muestra las características específicas de unión a Fab modificado con N-glicano de una molécula de CD22-Fc en la que al menos el dominio de unión al ácido siálico está ligado físicamente a una cola de Fc. Una parte que se une al ácido siálico de un SIGLEC normalmente contiene la parte extracelular del respectivo SIGLEC. Los híbridos Fc pueden, por ejemplo, fabricarse fácilmente. Un SIGLEC preferido es CD22. Los anticuerpos son otra fuente de moléculas que se pueden unir a los glicanos ligados a N. Las lectinas son moléculas preferidas. La mayoría de las lectinas se pueden producir fácilmente y, de hecho, muchas están disponibles comercialmente. El anticuerpo o la lectina es preferiblemente un anticuerpo que se une al ácido siálico o una lectina que se une al ácido siálico, preferiblemente una lectina que se une al ácido siálico. Se presenta una descripción de varios miembros de la familia de ácido siálico de monosacáridos, su diversidad estructural y su ligamiento con la cadena de glicanos subyacente. en Varki A, Cummings RD, Esko JD, et al., editors. (2009) Essentials of Glycobiology chapter 14. 2nd edition. Cold Spring Harbor (NY): Cold Spring Harbor Laboratory Press. El capítulo también describe varias lectinas que se unen al ácido siálico y su especificidad. En la presente invención se ha encontrado que la aglutinina de Sambucus nigra (SNA) y la aglutinina de Maackia amurensis (MAA) son particularmente adecuadas para distinguir los glicanos ligados a N de la porción Fc de los glicanos ligados a N de la porción Fab. La lectina que se une al ácido siálico que se puede unir a un glicano ligado a N sobre una porción Fab de un anticuerpo, por lo tanto, comprende preferiblemente SNA o MAA, preferiblemente SNA (Stadlmann et al., 2010. Journal of Clinical Immunology. 30(S1):15-9) En aras de la claridad, la aglutinina de maackia amurensis se abrevia como MAA, mientras que el aducto de MAA representa el aducto de malondialdehído-acetaldehído sobre las proteínas.

En una realización preferida, la etapa de poner en contacto los anticuerpos de la muestra con un péptido o proteína que comprende un epítopo con una modificación postraduccional, tal como un epítopo de lisina acetilada o un epítopo citrulinado u homocitrulinado, se realiza con un péptido o proteína que es acoplado a una superficie. La fracción unida a péptido/proteína se lava preferiblemente para eliminar el material no unido. La fracción unida a péptido/proteína que contiene los anticuerpos preferiblemente AAPA, ACPA y/o anti-CarP, si los hay, se recoge y se pone en contacto con una molécula que se puede unir a un glicano ligado a N sobre una porción Fab de un anticuerpo. Posteriormente, se puede determinar si la muestra contenía anticuerpos ACPA y/o anti-CarP con glicanos ligados a N sobre una porción Fab de la misma. Esto se puede hacer de varias maneras. Preferiblemente, esto se hace poniendo en contacto la muestra que contiene la molécula con una molécula que se une a anticuerpos humanos, preferiblemente IgG humana. La molécula no unida se lava posteriormente y la molécula unida, si la hay, se puede detectar con un marcador. Preferiblemente, la molécula comprende el marcador. Si se detecta un marcador, se determina que un anticuerpo con un glicano ligado a N sobre una porción Fab del anticuerpo se ha unido al epítopo citrulinado (ACPA) o a un epítopo homocitrulinado (anti-CarP) en el péptido, y que, por tanto, la muestra contenía ACPA y/o anti-CarP con glicano ligado a N sobre una porción Fab de la misma.

En otra realización preferida, el método para determinar si una muestra que contiene anticuerpos comprende un AMPA, preferiblemente un anticuerpo que se puede unir a un epítopo de lisina acetilada, un epítopo citrulinado u homocitrulinado en un péptido, comprende

poner en contacto los anticuerpos de la muestra con una molécula que se puede unir a un glicano ligado a N sobre una porción Fab de un anticuerpo y recolectar los anticuerpos unidos, y

poner en contacto los anticuerpos recolectados, si los hay, con un péptido o proteína que comprende un epítopo modificado postraduccionalmente, preferiblemente un epítopo de lisina acetilado, un epítopo citrulinado u homocitrulinado. En una realización preferida, los anticuerpos de la muestra se separan primero de otro material de la muestra y se recolectan al poner en contacto la muestra con una molécula que se une a anticuerpos humanos. De esta forma, no se introducen en el método otras moléculas que puedan comprender glicanos ligados a N. Posteriormente, se puede determinar si la muestra contenía anticuerpos AMPA, preferiblemente AAPA, ACPA y/o anti-CarP con glicano ligado a N sobre una porción Fab de la misma. Esto se puede hacer de varias maneras. Preferiblemente esto se hace mediante un método que comprende un Elisa específico para AMPA, preferiblemente específico para AAPA, ACPA y/o anti-CarP. Los anticuerpos de la muestra preferiblemente se ponen en contacto con un péptido/proteína que comprende una lisina acetilada, un epítopo citrulinado u homocitrulinado. El péptido/proteína preferiblemente se acopla a una superficie. Los anticuerpos unidos se detectan posteriormente por medio de una molécula que se puede unir a anticuerpos humanos, preferiblemente IgG. La molécula comprende preferiblemente un marcador.

En una realización preferida, los anticuerpos de la muestra se separan primero de otro material de la muestra y se recolectan al poner en contacto la muestra con una molécula que se une a anticuerpos humanos. De esta forma, otras moléculas que pueden comprender glicanos ligados a N no entran en el procedimiento.

Se describe además un método para determinar si una muestra de anticuerpo de un individuo comprende un AMPA, preferiblemente un anticuerpo AAPA, un ACPA y/o un anti-CarP que tiene glicano ligado a N sobre una porción Fab, el método se caracteriza porque glicano ligado a N sobre una porción Fab se detecta utilizando una molécula que se puede unir a los glicanos ligados a N sobre una porción Fab de un anticuerpo, preferiblemente una molécula de unión de ácido siálico, preferiblemente SNA o MAA.

La etapa de detectar un glicano ligado a N sobre una porción Fab del anticuerpo se puede realizar ventajosamente al poner en contacto el anticuerpo o una porción Fab del mismo con una molécula que se une específicamente al ácido siálico como se indica en el presente documento. Esto facilita el análisis de alto rendimiento de muestras que contienen anticuerpos. También se puede realizar espectrometría de masas sobre preparaciones de glicano obtenidas a partir de preparaciones de anticuerpos purificados. Como se indica en varias figuras de la presente solicitud, la espectrometría de masas de dichas preparaciones produce espectros que divulgan la estructura de los glicanos obtenidos del anticuerpo. Los glicanos que contienen ácido siálico se pueden discriminar fácilmente en dichos espectros. El autoanticuerpo o fragmento de unión a antígeno del mismo se puede purificar a partir de otros anticuerpos en una preparación, por ejemplo, al permitir la unión a antígeno específico recubierto sobre perlas seguido de uno o más lavados para eliminar el anticuerpo no unido. Los glicanos ligados a N se pueden recolectar a partir de dichas perlas o anticuerpos eluidos (fragmentos) mediante escisión enzimática como se demuestra en los ejemplos. Los glicanos recolectados se pueden identificar posteriormente mediante espectrometría de masas. Donde la espectrometría de masas solía ser una tarea que requería mucho tiempo, ahora se está optimizando y agilizando rápidamente para que se vuelva útil para aplicaciones de rendimiento medio a alto. Ejemplos de sistemas de espectrometría de masas adecuados son los sistemas comercializados por Waters, por ejemplo, bajo el nombre comercial kit Glycoworks RapiFluor-MS N-Glycan.

La molécula que se puede unir a un anticuerpo humano puede ser un anticuerpo, por ejemplo, un anticuerpo IgG antihumano de cabra. Otras moléculas son la proteína A y la proteína G. La proteína A es una proteína de superficie de 42 kDa que se encuentra originalmente en la pared celular de la bacteria Staphylococcus aureus. La proteína G es una proteína de unión a inmunoglobulina expresada en las bacterias estreptocócicas del grupo C y G de manera muy similar a la proteína A, pero con diferentes especificidades de unión.

La invención comprende además un kit de partes para la detección de un autoanticuerpo asociado a la RAen una muestra,

en el que el kit comprende un péptido o proteína que comprende una modificación postraduccional, en el que dicho péptido o proteína es capaz de unirse a dicho autoanticuerpo;

en el que el kit comprende además una molécula de unión a glicano capaz de unirse a un glicano ligado a N sobre una porción Fab de un anticuerpo; en el que la molécula de unión a glicano comprende lectina de unión al ácido siálico.

El kit comprende preferiblemente un péptido que comprende un epítopo con una modificación postraduccional, preferiblemente un epítopo de lisina acetilada, un epítopo citrulinado u homocitrulinado y una molécula que se puede unir a un glicano ligado a N sobre una porción Fab de un anticuerpo. El péptido o la molécula que se puede unir a un glicano ligado a N está preferiblemente ligado a una superficie. Preferiblemente, el kit comprende además una molécula que se puede unir a un anticuerpo humano. La molécula que se puede unir a un glicano ligado a N sobre una porción Fab de un anticuerpo es preferiblemente una lectina que se une al ácido siálico, preferiblemente SNA o MAA, preferiblemente SNA. La molécula comprende preferiblemente un marcador.

La muestra de anticuerpo es preferiblemente una muestra de un individuo. Preferiblemente de un individuo que no tiene RA. En una realización preferida, la muestra es una muestra de un individuo del cual una muestra anterior dio positivo en la presencia de un autoanticuerpo asociado con dicha enfermedad, tal como un anticuerpo AMPA, preferiblemente un AAPA, ACPA y /o anti-CarP y en el que el anticuerpo no comprendía un glicano ligado a N sobre una porción Fab del anticuerpo. Se considera que un autoanticuerpo tal como un AMPA está desprovisto de (o negativo para) glicano ligado a N sobre una porción Fab del anticuerpo cuando el 10% o menos del autoanticuerpo comprende un glicano ligado a N sobre una porción Fab del mismo. Así, en un aspecto, el 10 % o menos del autoanticuerpo, preferiblemente un AMPA, en la muestra anterior comprende un glicano ligado a N sobre una porción Fab del mismo.

La invención proporciona además un método para monitorizara un individuo con riesgo de desarrollar artritis reumatoide, el método comprende monitorizar la presencia de un autoanticuerpo asociado con dicha enfermedad tal como un AMPA, preferiblemente un anticuerpo AAPA, ACPA y/o anti-CarP en muestras que contienen anticuerpos periódicos de dicho individuo, caracterizado el método porque el método comprende además determinar si los anticuerpos detectados comprenden una glicosilación ligada a N sobre una o más posiciones en una porción Fab del anticuerpo. Los métodos de la invención son particularmente adecuados para cribar una población de individuos para la conversión de una “fase de riesgo” anterior a la enfermedad en una fase de enfermedad. Con este fin, la muestra que se prueba en un método de la invención es preferiblemente una muestra de un individuo que se ha probado previamente para la RA. Los anticuerpos son preferiblemente anticuerpos AAPA, ACPA y/o anti-CarP.

Tras la detección de AMPA, preferiblemente un anticuerpo AAPA, ACPA y/o anti-CarP, con un glicano ligado a N sobre una porción Fab de un anticuerpo, el individuo se puede tratar para la artritis, preferiblemente artritis reumatoide, preferiblemente con un medicamento para la artritis, preferiblemente un medicamento para la artritis reumatoide. Como se mencionó anteriormente, el tratamiento temprano es beneficioso para los pacientes. También el tratamiento presintomático es beneficioso para las personas con riesgo de desarrollar RA. Los tratamientos son costosos y, por lo general, no carecen por completo de efectos secundarios o del potencial de los mismos. Es preferible iniciar el tratamiento presintomático lo antes posible, es decir, cuando se esperan síntomas de RA, pero al menos cuando los síntomas son inminentes.

Una persona siempre puede atraer una enfermedad. Se dice que una persona está en riesgo utilizando un método como se describe en el presente documento si esa persona tiene un mayor riesgo que la población normal. Por ejemplo, una persona que no tiene RA pero que tiene AMPA tiene un mayor riesgo de desarrollar ^rA. Cuando se prueba a una persona de este tipo con un método como se describe en el presente documento y se descubre que tiene un AMPA con un glicano ligado a N sobre una porción Fab del mismo, esa persona tiene un mayor riesgo de desarrollar RA en comparación con la población de individuos positivos a AMPA y negativos a RAcomo un todo. Una persona tiene un AMPA con un glicano ligado a N sobre una porción Fab del mismo si más del 10% de los anticuerpos AMPA en una muestra que contiene anticuerpos de dicho individuo tiene un glicano ligado a N sobre una porción Fab del mismo, preferiblemente más del 20 %, preferiblemente más del 30 %, preferiblemente más del 50 %, preferiblemente más del 55 % de los anticuerpos AMPA en una muestra que contiene anticuerpos de dicho individuo tiene un glicano ligado a N sobre una porción Fab del mismo.

La RAes una enfermedad para la que están disponibles muchos medicamentos diferentes. Un medicamento preferido es un Fármaco Antirreumático Modificador de la Enfermedad (DMARD). DMAR,Ds es una categoría de medicamentos no relacionados definidos por su uso en la artritis reumatoide para retrasar la progresión de la enfermedad. El término a menudo se clasifica como DMAR,D sintético (sDMARD, convencional o dirigido) o DMAR,D biológico y se utiliza en contraste con los medicamentos antiinflamatorios no esteroides (que se refiere a los agentes que tratan la inflamación, pero no la causa subyacente) y esteroides (que mitigan la respuesta inmunitaria, pero son insuficientes para ralentizar la progresión de la enfermedad). El metotrexato es un sDMARD preferido. Otros DMAR,D preferidos son abatacept; adalimumab; tocilizumab; azatioprina; cloroquina e hidroxicloroquina; etanercept golimumab; infliximab; leflunomida; metotrexato; rituximab y sulfasalazina. Además, los inhibidores de molécula pequeña, tales como el tofacitinib, representan una nueva clase de inhibidores de la cinasa que están disponibles en algunos países. El DMARD puede ser un anticuerpo monoclonal que se puede unir al factor de necrosis tumoral alfa (TNF-a). El medicamento para la artritis reumatoide también puede ser una combinación de dos o más medicamentos en los que uno o más de la combinación es un DMARD.

La porción de unión a antígeno (Fab) comprende una región sobre un anticuerpo que se une a antígenos, el llamado dominio variable. Preferiblemente comprende además un dominio constante que está asociado con el dominio variable en un anticuerpo (en conjunto denominados a menudo como un fragmento Fab). La porción Fab está compuesta por una parte de la cadena pesada y una parte de la cadena ligera del anticuerpo. Los fragmentos Fc y Fab se pueden generar en el laboratorio. La enzima papaína se puede utilizar para escindir un monómero de inmunoglobulina en dos fragmentos Fab y un fragmento Fc. La enzima pepsina se escinde por debajo de la región bisagra, por lo que se forma un fragmento F(ab')₂y un fragmento pFc'. Recientemente, se ha comercializado otra enzima para la generación de F(ab')₂. La enzima IdeS (enzima degradante de inmunoglobulina de Streptococcus pyogenes, nombre comercial FabRICATOR) escinde la IgG de una manera específica de secuencia a pH neutro.

Muchos de los métodos se pueden realizar con una porción Fab o un fragmento Fab en parte o todo el método, en lugar de un anticuerpo completo. Por lo tanto, dichos métodos también se proporcionan en la presente invención. Esto es normalmente claro para el experto.

Los anticuerpos se purifican cuando se separan de otros anticuerpos en la muestra. Los anticuerpos purificados normalmente se separan de otros anticuerpos sobre la base de una o más características. Como resultado, los anticuerpos purificados comparten una o más características utilizadas para la separación. Los anticuerpos purificados no tienen que contener un solo tipo de anticuerpo. En el caso de los anticuerpos AMPA, es perfectamente posible que todos los anticuerpos purificados se unan a CCP2 (por ejemplo) pero, no obstante, tengan diferentes dominios variables. De manera similar, los anticuerpos que se purifican sobre la base de la unión a una molécula que se une a un glicano ligado a N sobre una porción Fab del anticuerpo pueden tener diferentes glicanos ligados a la porción fab, siempre que todos los anticuerpos así purificados se unan a la molécula. Un método es un método para purificar un anticuerpo si separa los anticuerpos de una muestra en fracciones en las que al menos una fracción tiene un porcentaje de anticuerpo purificado en relación con todos los anticuerpos en la fracción que es mayor que el porcentaje en la muestra antes de la purificación. En otras palabras, los anticuerpos purificados no tienen que ser esencialmente puros. Normalmente, sin embargo, se prefiere que una muestra purificada comprenda al menos el 70 %, más preferiblemente al menos el 80 %, preferiblemente al menos el 90 % y más preferiblemente al menos el 95 % del tipo purificado en relación con todos los anticuerpos en la muestra.

La determinación del riesgo de que un individuo desarrolle RA en un período de tiempo determinado se realiza al determinar que el individuo tiene un AMPA, preferiblemente un anticuerpo AAPA, ACPA y/o anti-CarP que comprende glicosilación ligada a N sobre una o más posiciones sobre una porción Fab de la misma. La identificación de dichos anticuerpos indica el aumento del riesgo del paciente de desarrollar RAen el período de tiempo indicado. El nivel al que se detectan dichos anticuerpos es una medida del tiempo real hasta el desarrollo de los síntomas de la RA. Un nivel alto indica que se espera el inicio de la enfermedad. Los niveles se determinan preferiblemente en relación con la cantidad total de anticuerpos en la muestra. Preferiblemente, se determinan en relación con el total de AAPA, ACPA y/o anti-CarP en la muestra.

También se describe, pero no forma parte de la invención, un método para purificar anticuerpos para la medición de anticuerpos que comprenden glicano ligado a N sobre una porción Fab del mismo que comprende

proporcionar una muestra de anticuerpos;

poner en contacto dicha muestra con una superficie sólida que comprende un péptido o proteína que comprende un epítopo de proteína modificado;

eliminar el anticuerpo no unido y eluir el anticuerpo unido de dicha superficie sólida; incubar el anticuerpo eluido con una superficie sólida que comprende una molécula que se puede unir a un glicano ligado a N sobre una porción Fab de un anticuerpo;

eliminar moléculas no unidas; y

determinar si un anticuerpo se ha unido a dicha superficie sólida,

en el que un anticuerpo unido indica la presencia de un glicano ligado a N sobre una porción Fab de un anticuerpo en dicha muestra. No es necesario purificar anticuerpos completos. El anticuerpo en la muestra se puede fragmentar en fragmentos de porción Fab y Fc, por ejemplo, y posteriormente se purifican estos fragmentos de porción fab.

También se describe, pero no forma parte de la invención, un método para purificar anticuerpos para la medición de anticuerpos que tienen un glicano ligado a N sobre una porción Fab que comprende

proporcionar una muestra de anticuerpos;

eliminar el anticuerpo no unido;

incubar dicha superficie sólida con una molécula que se puede unir a un glicano ligado a N sobre una porción Fab de un anticuerpo;

eliminar moléculas no unidas; y

determinar si una molécula se ha unido a dicha superficie sólida,

en el que una molécula unida indica la presencia de un glicano ligado a N sobre una porción Fab de un anticuerpo en dicha muestra.

proporcionar una muestra de anticuerpos;

eliminar el anticuerpo no unido;

incubar el anticuerpo unido con una enzima que separa el glicano de dicho anticuerpo; recolectar glicanos; y determinar si los glicanos recolectados comprenden un glicano específico de la porción Fab;

el método se caracteriza porque la muestra es una muestra de anticuerpos de un individuo con riesgo de desarrollar RA, síndrome de Sjogren o a Av .

También se describe, pero no forma parte de la invención, un método para purificar anticuerpos con glicosilación ligada a N sobre una porción Fab del anticuerpo, el método comprende

proporcionar una muestra de anticuerpos;

incubar dicha muestra con una superficie sólida que comprende una molécula que se puede unir a un glicano ligado a N sobre una porción Fab de un anticuerpo;

lavar dicha superficie sólida y recolectar el anticuerpo unido;

incubar el anticuerpo recolectado con un péptido o proteína que comprende un epítopo de proteína modificado; eliminar el anticuerpo no unido; y

determinar si dicho péptido o proteína se había unido al anticuerpo.

En ciertas realizaciones, la muestra comprende anticuerpos purificados. En tales casos, los anticuerpos normalmente se separaban de otras proteínas de la muestra por medio de un agente de unión que se une a los anticuerpos. Los agentes adecuados son la proteína A o la proteína G.

También se describe un método que comprende

proporcionar una muestra de anticuerpos;

eliminar el anticuerpo no unido;

eliminar moléculas no unidas; y

determinar si una molécula se ha unido a dicha superficie sólida.

La muestra es preferiblemente una muestra de anticuerpos de un individuo con riesgo de desarrollar RA, síndrome de Sjogren o AAV. Preferiblemente en el que la muestra es una muestra de anticuerpo de un individuo del cual una muestra de anticuerpo anterior dio positivo para un autoanticuerpo. Preferiblemente, el 10 % o menos del autoanticuerpo de dicha muestra de anticuerpo anterior comprende un glicano ligado a N sobre una porción Fab del mismo. Dicho autoanticuerpo es preferiblemente un AMPA. En ciertas realizaciones, los anticuerpos se escinden para producir fragmentos Fab y Fc.

El anticuerpo se puede eluir de una superficie sólida por varios medios. Normalmente, esto se logra al cambiar el pH y/o la concentración de sal del fluido circundante. El anticuerpo generalmente se absorbe, se une a un absorbente en una fase sólida o superficie sólida. La elución es el proceso de eliminar analitos del adsorbente al hacer pasar un solvente, llamado “eluyente”, más allá del complejo adsorbente/anticuerpo. A medida que las moléculas de solvente “eluyen” o viajan a través de la columna, pueden pasar por el complejo adsorbente/analito o pueden desplazar el analito al unirse al adsorbente en su lugar. Después de que las moléculas de solvente desplacen el analito, el analito se puede sacar de la columna para su análisis.

El anticuerpo no unido normalmente se elimina al lavar la fase sólida con un tampón. Los tampones adecuados son tampones que se utilizan para cargar el anticuerpo sobre la superficie sólida. La solución salina tamponada con fosfato es un tampón adecuado.

Las muestras periódicas que contienen anticuerpos de un individuo son muestras que se toman en diferentes momentos de la vida del individuo. El intervalo entre los puntos de tiempo puede variar. El tiempo entre muestras respectivas puede ser de un mes, dos meses, 6 meses, un año o incluso más. Los periodos de tiempo entre muestras pueden ser más largos cuando el autoanticuerpo es negativo para un glicano ligado a N sobre una porción Fab del mismo. Los períodos de tiempo entre muestras de una serie de muestras periódicas pueden variar y pueden ser muy cortos (días) o muy largos, más de un par de años, también de muestras periódicas de un individuo.

El momento de la toma de muestra es el día en que se ha recolectado una muestra de un individuo. La toma de una muestra puede ser parte de la reivindicación, pero normalmente no es parte de la reivindicación. La muestra proporcionada en los métodos a los que se hace referencia en las reivindicaciones normalmente es recolectada por una persona autorizada y posteriormente entregada para proporcionarla para un método como se describe en el presente documento.

Con el propósito de claridad y una descripción concisa, las características se describen en el presente documento como parte de la misma o de realizaciones separadas, sin embargo, se apreciará que el alcance de la invención puede incluir realizaciones que tienen combinaciones de todas o algunas de las características descritas.

También se describe un método para determinar si un anticuerpo comprende un glicano ligado a N, el método comprende purificar AMPA a partir de una muestra que contiene anticuerpos y detectar si dicho AMPA comprende un H5N4S2; H5N5F1S1, H5N4F1S2; H5N5S2; H5N5F1S2 y/o H6N5F1S2 glicano de la tabla 1. En una realización preferida, el método comprende además determinar si el glicano está presente sobre una porción FAB del anticuerpo cuando se han detectado uno o más de dichos glicanos.

Tabla 1: Nomenclatura de glicanos encontrados en ACPA-IgG e IgG. G2S2, G2FS1B, G2FS2, G2S2B, G2FS2B se consideran Fab-glicanos porque estas estructuras de glicano son altamente expresadas por fragmentos Fab de ACPA-IgG e IgG, mientras que estas estructuras son bajas o no se expresan sobre fragmentos Fc.

Ejemplos

Ejemplo 1

Material y métodos

Muestras de pacientes

Para los experimentos para comparar la glicosilación de ACPA con la glicosilación de IgG total, se recolectaron muestras de plasma (n = 6 ) y fluido sinovial (n = 3) de 9 pacientes con RA positivos a ACPA en la clínica ambulatoria del departamento de reumatología de LUMC. Todos los pacientes con RA cumplieron con los criterios revisados del American College of Rheumatology de 1987 para la clasificación de la RA.

Para los experimentos para comparar los glicanos ACPA-Fab de ACPA derivados de pacientes con RA positivos a ACPA y sus familiares sanos positivos a ACPA, se recolectaron muestras de suero de 53 pacientes con RA positivos a ACPA y sus familiares de primer grado positivos aACPA no afectados en clínicas de reumatología en Canadá. La prevalencia de la RA es considerablemente más alta en estas comunidades que en la población caucásica general, y los ACPA están presentes con mayor frecuencia en los familiares sanos de los pacientes [1, 2]. Los pacientes con RA cumplieron con los criterios revisados del American College of Rheumatology de 1987 para la clasificación de la RA.

Purificación de anticuerpos

ACPA-IgG e IgG de las muestras recolectadas en Leiden se purificaron mediante cromatografía líquida rápida de proteínas (ÁKTA, GE Healthcare) como se describió anteriormente [3]. Brevemente, las muestras se cargaron sobre una columna de CCP2-arginina-HiTrap-estreptavidina biotinilada (GE Healthcare) seguida de una columna de CCP2-citrulina-HiTrapestreptavidina biotinilada conectada en serie. Las fracciones de flujo continuo (FT) y eluidas con ACPA se cargaron adicionalmente sobre una columna de proteína G HiTrap y, posteriormente, sobre una columna de proteína A HiTrap (ambas de GE Healthcare). Las fracciones purificadas de IgG agotada en ACPA (IgG de control) y de ACPA-IgG se concentraron y desalinizaron mediante cromatografía de exclusión por tamaños.

ACPA-IgG se purificó a partir de muestras canadienses utilizando un sistema de microperlas. Brevemente, se cargaron 25 ul de plasma o suero en perlas de neutravidina que se acoplaron a un péptido CC(cit)P biotinilado. Las muestras se incubaron durante 2 horas y el ACPA se eluyó con ácido fórmico y se neutralizó a un pH de 7.5. Las fracciones eluidas con ACPA se cargaron adicionalmente en perlas de Prot G para terminar con ACPA-IgG.

Análisis estructural

El análisis estructural para comparar ACPA con IgG general se realizó sobre fragmentos F(ab)₂o Fc de las ACPA-IgG e IgG aisladas. Los fragmentos F(ab)₂y Fc se generaron mediante digestión de anticuerpos con IdeS (FabRICATOR; Genovis) y se purificaron mediante perlas de afinidad IgG-Fc/CH1 CaptureSelect (Thermo Fisher). N-glicanos de los fragmentos F(ab)₂y Fc de (ACPA)-IgG se liberaron en solución utilizando PNGasa F. Los glicanos se marcaron con ácido 2-aminobenzoico (2-AA), se purificaron mediante extracción en fase sólida de cromatografía de interacción hidrófila, (HILIC-SPE) y se caracterizaron por espectrometría de masas de tiempo de vuelo de desorción/ionización láser asistida por matriz (MALDI-TOF-MS) y cromatografía líquida de ultra alta resolución (UHPLC).

Para los experimentos para comparar los glicanos ACPA-Fab de ACPA derivados de pacientes con RA positivos a ACPA y sus parientes sanos, se realizó un análisis estructural sobre el ACPA-IgG aislado. Los N-glicanos de ACPA-IgG se liberaron en solución utilizando PNGasa. Además, los glicanos se marcaron con ácido 2-aminobenzoico (2-AA), se purificaron mediante extracción en fase sólida por cromatografía de interacción hidrófila (HILIC-SPE) y se caracterizaron mediante cromatografía líquida de ultra alta resolución (UHPLC).

Datos y análisis estadístico

Los datos de UHPLC se analizaron con Chromeleon 7. El software calcula el área bajo la curva de los cromatogramas. Los picos de glicano y los rasgos derivados de la glicosilación se definieron como se describió anteriormente. [4] Se calculó el porcentaje de galactosilación, sialilación, fucosilación y la frecuencia de bisección de residuos de N-acetilglucosamina de IgG. Además, el porcentaje de glicosilación de Fab se calcula con la siguiente fórmula: (suma de GP19 hasta GP24)/(suma de GP1 hasta GP14)*100 %. El análisis estadístico se realizó utilizando GraphPad Prism 6. Se aplicó una prueba de Wilcoxon no paramétrica pareada con un límite de significancia en p<0.05.

Resultados

Recientemente, descubrimos que la ACPA-IgG obtenida de pacientes con RA exhibe un peso molecular 10-20 kDa más alto en comparación con la IgG no autorreactiva. Esta característica también distinguió a ACPA-IgG de los anticuerpos contra antígenos de recuerdo u otros autoanticuerpos específicos de enfermedades. El análisis estructural mostró que la presencia de glicanos ligados a N en los dominios (hiper) variables (dominios F (ab)) de ACPA es responsable de esta observación. La elucidación de los sitios precisos donde se encuentran los glicanos ligados a N reveló que la secuencia de consenso ligada a N requerida para la glicosilación ligada a N de proteínas no estaba codificada en la línea germinal, sino que se había introducido tras la hipermutación somática [5]. El análisis estructural de los glicanos Fab unidos a N presentes en ACPA mostró que la composición de los glicanos ligados a Fab diterta de la de los azúcares ligados a Fc y, lo que es más importante, que estos están altamente sialilados (Figura 1). Más aún, en base a la cuantificación, estimamos que más del 90 % de las moléculas de ACPA presentes en el suero albergan F(ab)-glicanos, un porcentaje que es aún mayor sobre ACPA en el fluido sinovial.

Sorprendentemente, nuestros datos preliminares muestran que la frecuencia de ACPA hiperglucosilado es considerablemente menor en los ACPA derivados de parientes positivos a ACPA sanos (Figura 2). Esto es intrigante ya que indica que el ACPA presente en individuos sanos aún no ha introducido los sitios de glicosilación ligados a N en las regiones variables de ACPA requeridas para la glicosilación.

Aunque la metodología descrita anteriormente se puede convertir en un ensayo de alto rendimiento, el ensayo actual para detectar la hiperglucosilación de ACPA F(ab) requiere mucho tiempo y requiere experiencia y espectrometría de masas de alta gama. Por lo tanto, sería preferible un método más accesible que se pueda utilizar en la rutina diaria. Se ha demostrado que la unión de anticuerpos a la lectina SNA (aglutinina de Sambuccus Nigra) está mediada principalmente por la glicosilación de F(ab) y que se requieren dos residuos siálicos para la unión a SNA. SNA solo se unirá a la parte Fc bajo condiciones reductoras (lo que abre la interfaz entre los dominios CH₂) [6-8]. Como la mayoría de los F(ab)-glicanos ACPA contienen dos residuos de ácido siálico, es muy probable que la unión de SNA de anticuerpos séricos de pacientes con RA enriquezca ACPA. Por lo tanto, un enfoque basado en la unión de SNA para detectar F(ab)-glicanos ACPA representa una estrategia prometedora para visualizar la presencia de estos glicanos sin necesidad de espectrometría de masas de gama alta. Por lo tanto, nos embarcamos en dos enfoques para establecer un método de alto rendimiento basado en la detección SNA. Estos enfoques tienen como objetivo desarrollar un protocolo estandarizado que permita la detección de F(ab)-glicanos ACPA de una manera de alto rendimiento.

En el primer enfoque (Figura 3), primero capturaremos ACPA utilizando microperlas recubiertas de CCP (panel izquierdo). Después de la elución de ACPA de estas perlas, visualizaremos la presencia de glicanos F(ab) utilizando SNA marcado (panel derecho). Como nuestros datos preliminares indican que los glicanos F(ab) no interactúan directamente con el antígeno y, por lo tanto, podrían ser accesibles para SNA, es concebible que la elución de ACPA de las perlas no sea necesaria y que SNA pueda unirse directamente a F(ab)-glicanos ACPA. Por lo tanto, también se probará esta posibilidad.

En el segundo enfoque (Figura 4, panel izquierdo), se tomará una estrategia inversa al inmovilizar primero IgG glicosilada con F(ab) (ACPA) sobre SNA, seguida de la detección de ACPA utilizando un CCP-ELISA. Nuestros datos preliminares indican que este enfoque es factible y se puede utilizar de manera de alto rendimiento (Figura 4, panel derecho). En la actualidad, este enfoque incluye el preaislamiento de IgG por proteína A para evitar la “sobrecarga” de SNA por otras moléculas presentes en el suero que transportan moléculas de ácido siálico. Nuestros datos preliminares sugieren que esto podría no ser necesario, una posibilidad que también se investigará en este contexto.

Ejemplo 2

material y métodos

Muestras de pacientes

Se recogieron muestras de plasma (n=6) y fluido sinovial (n=3) de nueve pacientes con RA positivos a ACPA en la clínica ambulatoria del departamento de reumatología del Centro Médico de la Universidad de Leiden. Todos los pacientes con RA cumplieron con los criterios revisados del American College of Rheumatology de 1987 para la clasificación de la RA y dieron su consentimiento informado por escrito [9]. El tratamiento incluía fármacos antirreumáticos modificadores de la enfermedad, agentes biológicos y glucocorticoides.

Productos químicos, solventes y enzimas utilizados

TFA, SDS, dihidrato de fosfato de hidrógeno disódico, HCl, glicina, p-mercaptoetanol, ácido acético y NaCl se adquirieron de Merck (Darmstadt, Alemania). El quince por ciento de hidróxido de sodio y sustituto de Nonidet P-40, hialuronidasa de testículos bovinos tipo IV, EDTA, ácido 2-aminobenzoico, complejo de 2-picolina borano, hidróxido de amonio, DMSO y ácido fórmico se obtuvieron de Sigma-Aldrich (St Louis, EE. UU.). Tris se adquirió de Roche (Indiana, EE. UU.) y el tampón Laemmli se obtuvo de Bio-Rad (California, EE. UU.). El péptido: N-glicosidasa F (PNGase F) se adquirió de Roche Diagnostics (Mannheim, Alemania), el ácido 2,5-dihidroxibenzoico de Bruker Daltonics (Bremen, Alemania) y HPLC SupraGradiente ACN de Biosolve (Valkenswaard, Países Bajos). MQ (agua desionizada Milli-Q; R > 18.2 MQ cm-1; sistema Millipore Q-Gard 2, Millipore, Ámsterdam, Países Bajos) se utilizó en todo momento. La matriz de afinidad anti-IgG Fc CaptureSelect y la matriz de afinidad anti-CH1 se compraron a Life Technologies (Leiden, Países Bajos). Una columna de centrifugación vacía con tapón de rosca cerrado, tapón insertado y filtro grande de 10 um. Se proporcionó por MoBiTec (Goettingen, Alemania). El PBS se obtuvo de B. Braun (Meslungen Alemania) y la enzima IdeS (nombre comercial FabRICATOR) de Genovis (Lund, Suecia). Los péptidos CCP2 arginina (control) y CCP2 citrulina fueron proporcionados amablemente por el Dr. J.W. Drifthout, Departamento del IHB, Centro Médico de la Universidad de Leiden (LUMC), Países Bajos.

Purificación de ACPA-IgG e IgG agotada en ACPA.

ACPA-IgG e IgG se purificaron mediante cromatografía líquida rápida de proteínas (ÁKTA, GE Healthcare) como se describió anteriormente [5]. Brevemente, las muestras se cargaron sobre una columna de estreptavidina CCP2-arginina-HiTrap126 biotinilada (GE Healthcare) seguida de una columna de estreptavidina CCP2-citrulina-HiTrap biotinilada conectada en serie. Las fracciones de flujo continuo (FT) y eluidas con ACPA se cargaron adicionalmente en una columna de proteína G HiTrap y, posteriormente, sobre una columna de proteína A HiTrap (ambas de GE Healthcare). A continuación, las IgG y ACPA-IgG purificadas de los isotipos 1, 2 y 4 se concentraron y desalinizaron mediante cromatografía de exclusión por tamaño (Columna ZebaSpin Desalinting, 7K MWCO, Pierce Thermo Scientific) de acuerdo con las instrucciones del fabricante.

Generación y purificación de fragmentos Fc y F(ab’)2

ACPA-IgG e IgG agotado en ACPA se escindieron específicamente en porciones Fc y F(ab')₂al utilizar la enzima IdeS estreptocócica recombinante. El protocolo del proveedor se ajustó para simplificar el procedimiento como se describió anteriormente [5]. Brevemente, para cada muestra, 30 pg de anticuerpos (ACPA)-IgG se secaron en un evaporador centrífugo y se digirieron al agregar 200 μl de tampón de digestión (fosfato de sodio 50 mM, NaCl 150 mM, EDTA 5 mM) que contenía 30 U de IdeS seguido de incubación 37 °C durante la noche. A continuación, la porción Fc se separó del F(ab')₂mediante cromatografía de afinidad sobre una matriz de afinidad Fc anti-IgG (suspensión de perlas) cargada en una columna de centrifugación con filtro de 10 μM. Los fragmentos Fc se eluyeron de perlas con ácido fórmico 100 mM y se neutralizaron con Tris 2 M. Para capturar el dominio F(ab')₂, la fracción FT resultante de la purificación de Fc se purificó en matriz de afinidad anti-IgG-CH1 utilizando un protocolo similar al de la matriz de afinidad anti-IgG Fc. Las fracciones de elución se neutralizaron con TRIS 2 M y se desalinizaron mediante cromatografía de exclusión por tamaño (Columnas Zeba Spin Desalinting, 7 kDa MWCO, Pierce Thermo Scientific). Después de la purificación, se analizó la pureza de 6 μg de las muestras de Fc y F(ab')₂purificadas mediante SDS-PAGE y se cuantificó mediante el reactivo de ensayo de proteínas de ácido bicinconínico (Pierce Thermo Scientific). Para el análisis de glicanos, las muestras se secaron mediante centrifugación al vacío.

Análisis estructural

El análisis estructural se realizó sobre la molécula total, fragmentos F(ab)₂o Fc del ACPA-IgG e IgG aislados de nueve pacientes con RA. Además, se realizó electroforesis en gel de poliacrilamida con dodecilsulfato de sodio (SDS-PAGE) de (ACPA)-IgG. Los N-glicanos forman una molécula total, F(ab)₂y el fragmento Fc de (ACPA)-IgG se liberaron en solución utilizando PNGasa F, mientras que los glicanos de cadena ligera y pesada (HC/LC) se obtuvieron después de la digestión en gel con PNGasa F. El marcado de los glicanos se realizó al mezclar las muestras (en 25 μL) con 12.5 μL de ácido 2-aminobenzoico (2-AA; 48 mg/ml) en DMSO con ácido acético glacial al 15 % y 12.5 μL de 2-picolina borano (107 mg/ml) en DMSO. La mezcla se incubó durante 2 horas a 65 °C, se enfrió a temperatura ambiente y se diluyó con ACN al 85 % antes de la purificación. Los glicanos marcados con 2-AA se purificaron mediante HILIC SPE utilizando puntas de algodón como se describió anteriormente con algunas modificaciones [10]. Brevemente, para cada muestra, se empacaron 500 μg de algodón en una punta de pipeta de 200 μl y se acondicionaron al pipeteartres veces 150 μl de MQ, seguido de 150 μl de ACN al 85 %, T^fA al 0.1 % y dos veces de 150 μl de ACN al 85 %. La muestra (en ACN al 85 %) se cargó al pipetear 25 veces en la mezcla de reacción. Las puntas se lavaron tres veces con, tres veces con 150 μl de ACN al 85 %, TFA al 0.1 % y dos veces con 150 μl de ACN al 85 %. Los glicanos marcados con 2-AA finalmente se eluyeron del algodón con 30 μl de MQ y se identificaron mediante MALDI-TOF-MS y UHPLC. Para el análisis MALDI-TOF-MS, 2 μL de muestra de glicano purificada por algodón HILIC SPE se mezclaron in situ con 1 μL de matriz de ácido 2,5-dihidroxibenzoico (20 mg/ml en ACN al 50 %, agua al 50 %) en una placa Bruker AnchorChip (anclaje de 800 μm; Bruker Daltonics, Bremen, Alemania) y se dejó secar a temperatura ambiente. La medición se realizó en modo negativo lineal en un UltrafleXtreme MALDI-TOF-MS (Bruker Daltonics) utilizando el software FlexControl 3.4 (Bruker Daltonics). Se utilizó un estándar de calibración de péptidos (Bruker Daltonics) para la calibración externa. Para cada espectro, se utilizó una ventana de masa de m/z de 1000 a 4000 y se acumularon un mínimo de 5000 disparos de láser. Con respecto al análisis UHPLC, se separaron 5 μL de solución de N-glicano purificada marcada con 2-AA y se analizaron mediante HILIC-UHPLC sobre un Dionex Ultimate 3000 (Thermo Fisher Scientific) equipado con una columna Acquity UHPLC BEH Glycan de 1.7 μm y 2.1 x 100 mm (Waters) y con un detector fluorescente. La separación se realizó a 60 °C con un caudal de 0.6 ml/min. Se utilizaron dos soluciones para la generación de gradientes, ACN como solución A y formiato de amonio 100 mM pH 4.4 (preparado como ácido fórmico tamponado a pH 4.4 con hidróxido de amonio) como solución B. La columna se equilibró con solución A al 85 % durante 0.5 min. A continuación, las muestras se cargaron en A 75 % y el exceso de reactivo fluorescente se eluyó de la columna lavando con A 47 al 85 % durante 10 min. El gradiente de separación comenzó en 75 % A y disminuyó linealmente hasta 63 % A en 30 min. Luego, la columna se enjuagó a un caudal de 0.4 ml/min con 40 % de A durante 4 min, seguido de 10 min con 85% de A para reequilibrar. Para la detección fluorescente, se utilizaron 330 nm para la excitación y la emisión se registró a 420 nm. Los cromatogramas resultantes se analizaron utilizando Chromeleon versión 7.1.2.1713 (Thermo Fisher Scientific). Finalmente, para analizar la glicosilación ligada a Fc de (ACPA)-IgG a nivel de glicopéptido, los anticuerpos se digirieron con tripsina y se analizaron mediante LC-MS como se describe [11].

Datos y análisis estadístico

Los datos de UHPLC se analizaron con Chromeleon 7; el programa calcula el área bajo la curva de los cromatogramas UHPLC. Los picos de glicanos y los rasgos derivados de la glicosilación se definieron como se describió anteriormente [4]. El porcentaje de galactosilación (G0 no galactosilada, G1 monogalactosilada y G2 digalactosilada), sialilación (N no sialilado, S1 monosialilado y S2 disialilado), fucosilación (F) y la frecuencia de bisección de N-acetilglucosamina (GlcNAc, B) Los residuos de IgG se calcularon como sigue: G0=GP1+GP2+GP4+^gP5+GP6, G1=GP7+GP8+GP9+GP10+GP11+GP16, G2=GP 12+GP 13+GP 14+GP 15+GP 17+GP 18+GP 19+GP21+GP22+GP23+GP24, N=GP1+GP2+GP4+GP5+GP6+GP7+GP8+GP9+GP10+GP11+GP12+GP13+GP14+GP1 5, S1=GP16+GP19, S2=GP21+GP24, F= GP1+GP4+GP6+GP8+GP9+GP10+GP11+GP14+GP15+GP16+GP18+GP19+GP23+GP 24 y B=GP6+GP10+GP11+GP13+GP15+GP19+GP22+GP24. El análisis de los rasgos de glicano de la LC-MS se describió previamente [11]. Para el procesamiento de los datos de LC-MS, la intensidad total de los primeros tres isótopos de cada estado de carga de analito observado se extrajo dentro de una ventana de ±0.06 Da alrededor de la masa teórica y ±20 s alrededor del tiempo de retención promedio extraído manualmente, como se describió anteriormente [12]. La identificación de glicanos por MALDI-TOF-MS se definió como se describió anteriormente [13]. El análisis estadístico se realizó con GraphPad Prism 6. Se aplicó una prueba de Wilcoxon no paramétrica pareada con un límite de significancia en p<0.05.

Resultados

Cuantificación de los N-glicanos expresados por IgG y ACPA-IgG.

Hemos demostrado que ACPA-IgG producido por pacientes con RAestá extensamente N glicosilado en la región variable en comparación con otros (auto)anticuerpos IgG [5]. En el presente documento, realizamos un análisis cuantitativo y cualitativo completo de la glicosilación de ACPA-IgG y sus fragmentos y lo comparamos con el de IgG no específica de citrulina (es decir, agotado ACPA, en lo sucesivo denominado IgG de control). Para ello se purificaron (ACPA)-IgG por cromatografía de afinidad y se analizaron sus glicanos por UHPLC, MALDI-TOF-MS y/o LC-MS de acuerdo con el esquema presentado en la Figura 9. Después de la purificación, se evaluó la pureza de (ACPA)-IgG mediante SDS-PAGE bajo condiciones reductoras (Figura 10A). Como era de esperar, el IgG de control se caracterizó por dos bandas electroforéticas correspondientes a las cadenas pesada y ligera (HC y LC), mientras que ACPA-IgG mostró varias bandas HC y LC con pesos moleculares más altos como se describió anteriormente (13). Los N-glicanos liberados de tanto el HC de IgG como el HCl de ACPA-IgG mostraron un perfil de glicano ligado a Fc típico en UHPLC (21, 25), mientras que los N-glicanos no se detectaron en la LC de IgG y la LC1 de ACPA-IgG (Figura 10B). A diferencia de, los N-glicanos liberados de LC2 de ACPA-IgG mostraron un perfil diferente, lo que indica la presencia de glicoformas diantenarias que estaban altamente sialiladas (Figura 10B). Asimismo, los perfiles de glicosilación derivados de HC2 y HC3 de ACPA-IgG mostraron la presencia de una mezcla de Fc-glicanos, pero también de glicanos adicionales que normalmente no están presentes en el dominio Fc (Figura 10B).

Los glicanos ligados a Fc y ligados a Fab de (auto)anticuerpos IgG exhiben patrones típicos de glicanos de anticuerpos.

Para determinar si el patrón de glicanos detectado en la banda HC adicional de ACPA-IgG, es decir, HC2 y HC3, refleja realmente la glicosilación de la región variable de IgG [14]. investigamos la N glicosilación de (ACPA)-IgG y sus fragmentos (Total/Fc/Fab) o glicopéptidos (solo para Fc) (Figura 9). Primero analizamos y comparamos la estructura de N-glicanos liberados de fragmentos Fc y F(ab')₂de ACPA-IgG e IgG de control (del mismo donante). El perfil de N glicosilación derivado de fragmentos (ACPA)-IgG Fc exhibió estructuras de N-glicano ligadas a FC que consistían en diantenarias, a menudo especies de tipo complejo fucosiladas en el núcleo con un número variable de residuos de galactosa antena (0 a 2) y ácido siálico (0 a 1) (Figura 11A). Parte de los N-glicanos ligados a Fc también contenían un GlcNAc bisectriz. Es de destacar que se observó una proporción relativamente alta de glicanos agalactosilados (G0) como se describió anteriormente [11]. Los N glicanos liberados de los fragmentos (ACPA)-IgG F(ab')₂consistían en glicoformas diantenarias altamente galactosiladas y sialiladas, que pueden portar GlcNAc bisectriz y/o una fucosa central (Figura 11B). Juntos, los resultados demuestran que las especies de N-glicanos adheridas a los fragmentos Fc y Fab del (auto)anticuerpo IgG difieren con una presencia sorprendente de especies de glicanos altamente sialilados en los glicanos liados al dominio Fab de ACPA-IgG.

El patrón de glicosilación ligado a Fab de ACPA-IgG difiere del patrón de IgG “convencional”.

Hemos demostrado que los N-glicanos ligados a Fc de ACPA-IgG aislados de pacientes presentan una reducción más pronunciada en el nivel de galactosilación y sialilación, pero un mayor grado de fucosilación central que los de otras moléculas de IgG [11, 15]. De acuerdo, los Fc-glicanos de IgG de ACP^apurificados en este estudio exhiben un nivel más bajo de sialilación (S 12 % [IQR9-16 %] para ACPA-IgG versus 16 % [ⁱQ^r13-17.5 %] para IgG de control) así como una mayor frecuencia de fucosilación central en comparación con la de IgG de control (F 99.3 % [IQR98.7-99.7 %] para ACPA-IgG versus 91.8 % de IgG [IQR90.3-99.7 %]). Además, sin embargo, nuestros datos revelaron diferencias importantes entre el perfil de N-glicano ligado a Fab de ACPA-IgG y el de la IgG de control (Figura 12). Especialmente, los N-glicanos ACPA-IgG Fab mostraron una alta frecuencia de especies di-galactosiladas (G2; 73 % [IQR69.5-80 %] para IgG versus 84 % [IQR74-87%] para ACPA-IgG) y di- sialilaron 259 especies (S2; 27% [IQR19-30 %] para IgG versus 44 % [IQR34-48.5 %] para ACPA-IgG), como también se ejemplifica por un aumento en la relación de ácido siálico por galactosa (SA/Gal; 36 %[IQR33-37 %] versus 30 %[IQR27-31.5 %] para ACPA-IgG e IgG). Además, encontramos niveles más altos de fucosa central y residuos de GlcNAc bisectriz en 7 de 9 muestras. En general, se observaron diferencias de glicanos más fuertes entre las estructuras de glicanos derivadas del dominio Fab de ACPA-IgG y la IgG de control que entre los glicanos de las porciones Fc.

ACPA-IgG exhibe un mayor nivel de glicosilación de Fab.

Cuantificamos la cantidad de glicosilación de Fab presente en ACPA-IgG e IgG agotada de ACPA. Para estimar el nivel de glicosilación de Fab, se liberaron glicanos de ACPA-IgG e IgG agotados en ACPA, caracterizados por MALDI-TOF-MS y su abundancia relativa se midió por UHPLC. Mientras que el perfil de glicano de IgG total estuvo dominado por ligado a Fc N-glicanos (G0F, G1F y G2F), el perfil de glicanos totales de ACPA-IgG exhibió una gran cantidad de N-glicanos ligados a Fab (G2FBS1, G2FS2 y G2FBS2) (Figura 13A). Es importante destacar que la identificación de varias de estas glicoformas específicas para el fragmento Fc o F(ab')₂, y la cuantificación de estas glicoformas liberadas de la molécula de anticuerpo completa, nos permitió determinar la frecuencia general de los glicanos Fab en ACPA-IgG o IgG agotado en ACPA (Figura 13B). Todas las muestras de ACPA-IgG (n=9) exhibieron una mayor frecuencia de glicosilación de Fab en comparación con el IgG de control. La mediana del nivel de glicosilación de Fab de IgG sin ACPA se estimó en 17 % [IQR12 %-26 %], con grandes diferencias entre los donantes. Por el contrario, la glicosilación mediana de Fab de ACPA-IgG alcanzó el 93% [IQR77-123 %]. Juntos, estos datos indican que la mediana de glicosilación Fab de ACPA-IgG es 5 veces mayor que la de IgG de control.

(ACPA)-IgG derivada de plasma y fluido sinovial muestra diferentes perfiles de glicosilación de Fab.

Demostramos que la ACPA-IgG derivada del fluido sinovial muestra un perfil de glicosilación de Fc más proinflamatorio que la ACPA-IgG purificada del suero [16]. Dada esta observación, planteamos la hipótesis de que también pueden ocurrir diferencias en las estructuras de glicanos ligados a Fab y/o los niveles de glicosilación de Fab de ACPA-IgG e IgG de control. En comparación con los glicanos ligados a Fab ACPA-IgG (n=6) en plasma, la composición de los glicanos Fab ACPA-IgG (n=3) derivados de SF exhibió una tendencia hacia niveles más bajos de galactosilación, sialilación y bisección de GlcNAc. Se observó una tendencia similar para el perfil de glicano de la IgG de control de SF en comparación con la IgG de plasma. Luego cuantificamos el nivel de glicosilación de Fab de plasma (ACPA)-IgG y sus contrapartes del SF. Como se muestra en la Figura 13C, se encontró un nivel significativamente mayor de glicosilación de Fab en ACPA IgG del SF en comparación con ACPA-IgG en plasma (138 % frente a 80 %). Cabe destacar que no se observó tal diferencia para el IgG de control (20 % frente a 20 %). Juntas, estas observaciones indican en términos cuantitativos que el nivel de glicosilación de Fab es incluso más pronunciado sobre ACPA-IgG de SF en comparación con ACPA-IgG de la sangre.

Ejemplo 3

Material y métodos

Determinación de la glicosilación ligada a N en la porción Fab de IgG para IgG de ACPA o antiCarP

Los péptidos de control de arginina o CCP2 biotinilados se conjugan con diferentes tetrámeros de estreptavidina marcados con fluorocromo. Mediante la clasificación de células activadas por fluorescencia (FACS) se clasifican las células B positivas para tetrámero. Con dos métodos diferentes, se determinan las secuencias del receptor de células B (BCR). El método general para aislar células B específicas de ACPA se describe en n Kerkman et al., June 2, 2015; Ann. Rheum. Dis 0:1-7; doi: 10.1136/annrheum dis-2014-207182.

Para el primer método, las células B individuales tetrámeras positivas se cultivan in vitro durante 10-12 días en medio IMDM con un cóctel de citoquinas sobre una capa de células L que expresan CD40L. Los sobrenadantes de estos cultivos se analizan en busca de anticuerpos con reactividad a CCP2 mediante ELISA. Además, los sobrenadantes positivos para CCP2 se criban en cuanto a la ausencia de reactividad frente al péptido de control. En consecuencia, de los cultivos de péptidos de control negativos reactivos para CCP2, el ARNm se aísla con TRIzol. Se sintetiza ADNc y se realiza una Transcripción Inversa de Anclaje de Secuencias de Inmunoglobulina y Amplificación por PCR Anidada (ARTISAN) para determinar finalmente la secuencia BCR con secuenciación de Sanger.

Para el segundo método, de diez a treinta células B positivas a tetrámero se clasifican directamente en tampón de lisis para obtener ARNm, seguido de la síntesis y preamplificación de ADNc de acuerdo con el protocolo SMARTSeq. Al igual que con el primer protocolo, los productos de inmunoglobulina se obtuvieron mediante PCR ARTISAN. En contraste con el primer método, los productos se secuenciaron sobre la plataforma PACBIO para la secuenciación de próxima generación.

Resultados

Anticuerpos ACPA de 82 % (23/28) de IgG, 0 % (0/3) IgM y 0 % (0/1) de IgA secuenciados con el método de clasificación de células individuales tenían un sitio de N-glicosilación en la porción Fab. Con el método de clasificación multicelular y secuenciación de próxima generación, anticuerpos ACPA de 94 % (17/18) de IgG, 40 % (2/5) de IgM y 100 % (9/9) de Iga tenían un sitio de N-glicosilación en la porción Fab. En comparación, el análisis de secuencias del repertorio BCR de células B totales obtenidas de donantes sanos indica que solo alrededor del 9 % de los anticuerpos contienen un sitio de N-glicosilación. A partir de estos datos, está claro que el porcentaje de ACPA con un sitio de N-glicosilación en la región Fab es significativamente mayor que el porcentaje en otras secuencias de individuos sanos.

Los datos de secuencia están respaldados por datos obtenidos anteriormente sobre el aumento del peso molecular por hiperglucosilación de ACPA-IgG en comparación con IgG total o antitetánica [5].

Ejemplo 4

ACPA puede reconocer y unirse a péptidos acetilados (lisina y omitina)

Material y métodos

Se determinó si los anticuerpos ACPA monoclonales y policlonales se pueden unir a un péptido de vimentina mutado con diferentes PTM. Se analizó la reactividad de ACPA E4 IgG1 [17] monoclonal proporcionada por el Dr. Rispens (Sanquin) para reactividad frente a los péptidos de vimentina modificados con PTM. El ACPA policlonal de pacientes con ^rA se purificó previamente mediante columnas de filtración en gel, ACPA purificado 2.93 y 2.77.

Para la detección de la reactividad hacia el péptido de vimentina modificado con PTM se utilizó un kit ELISA de Orgentec Diagnostica que consiste de microplacas recubiertas que contienen péptidos de vimentina modificados con PTM: HC52-Homocitrulina, P62-Arginina, P18-Citrulina, HC55-Lisina Acetilada, HC56-Lisina, Ornitina Acetilada y Ornitina. Los tampones fueron proporcionados por el kit ELISA de Orgentec Diagnostica y consisten en tampón diluyente de muestra, conjugado de IgG secundaria de referencia IgG anti-humana-HRP+, sustrato TMB y solución de parada. El ACPA purificado y el ACPA monoclonal se diluyeron en tampón diluyente de muestras de Orgentec Diagnostica hasta las concentraciones deseadas (30 ug/ml para ACPA purificado y ACPA E4 mAb) y se incubaron sobre la placa ELISA. La unión de ACPA se detectó mediante el conjugado de IgG-HRP anti-Humana y TMB. La densidad óptica se midió a 450 nm (referencia 600-690 nm).

Resultados

El ACPA E4 monoclonal es reactivo frente al péptido vimentina mutado con modificaciones postraduccionales de citrulina, lisina acetilada y ornitina acetilada. El ACPA policlonal de pacientes con RA2.93 es reactivo frente al péptido vimentina mutado con modificaciones postraduccionales de citrulina y ornitina acetilada. El ACPA 2.93 policlonal también alberga reactividad hacia la lisina acetilada y la homocitrulina, aunque en menor medida. El ACPA policlonal del paciente con RA 2.77 también se une al péptido vimentina mutado con modificaciones postraduccionales de ornitina acetilada, lisina acetilada, citrulina y, en menor medida, homocitrulina (Figura 15).

Conclusión

El ACPA E4 monoclonal y el ACPA policlonal obtenidos de pacientes con RA (2.93 y 2.77) son reactivos frente al péptido vimentina mutado con modificaciones postraduccionales de citrulina, lisina acetilada y ornitina acetilada. La unión a estos diferentes aminoácidos indica que ACPA podría tener reactividad cruzada con diferentes PTM.

Técnica citada

1. Peschken, C.A. and J.M. Esdaile, Rheumatic diseases in North America's indigenous peoples. Semin Arthritis Rheum, 1999. 28(6): p. 368-91.

2. Ioan-Facsinay, A., et al., Marked differences in fine specificity and isotype usage of the anti-citrullinatedprotein antibody in health and disease. Arthritis Rheum, 2008. 58(10): p. 3000-8.

3. Rombouts, Y., et al., Extensive glycosylation of ACPA-IgG variable domains modulates binding to citrullinated antigens in rheumatoid arthritis. Ann Rheum Dis, 2015.

4. Pucic, M., et al., High throughput isolation and glycosylation analysis of IgG-variability and heritability of the IgG glycome in three isolated human populations. Mol Cell Proteomics, 2011. 10(10): p. Mill 010090.

5. Rombouts, Y., et al., Extensive glycosylation of ACPA-IgG variable domains modulates binding to citrullinated antigens in rheumatoid arthritis. Ann Rheum Dis, 2016. 75(3): p. 578-85.6

6. Stadlmann, J., et al., A close look at human IgG sialylation and subclass distribution after lectin fractionation. Proteomics, 2009. 9(17): p. 4143-53.

7. Dalziel, M., I. McFarlane, and J.S. Axford, Lectin analysis of human immunoglobulin G N-glycan sialylation. Glycoconj J, 1999. 16(12): p. 801-7.

8. Guhr, T., et al., Enrichment of sialylated IgG by lectin fractionation does not enhance the efficacy of immunoglobulin G in a murine model of immune thrombocytopenia. PLoS One, 2011. 6(6): p. e21246.

9. Arnett, F.C., et al., The American Rheumatism Association 1987 revised criteria for the classification of rheumatoid arthritis. Arthritis Rheum, 1988. 31(3): p. 315-24.

10. Selman, M.H., et al., Cotton HILIC SPE microtips for microscale purification and enrichment of glycans and glycopeptides. Anal Chem, 2011. 83(7): p. 2492-9.

11. Rombouts, Y., et al., Anti-citrullinated protein antibodies acquire a pro-inflammatory Fc glycosylation phenotype prior to the onset of rheumatoid arthritis. Ann Rheum Dis, 2015. 74(1): p. 234-41.

12. Falck, D., et al., Glycoforms of Immunoglobulin G Based Biopharmaceuticals Are Differentially Cleaved by Trypsin Due to the Glycoform Influence on Higher-Order Structure. J Proteome Res, 2015. 14(9): p. 4019-28.

13. Ruhaak, L.R., et al., Glycan labeling strategies and their use in identification and quantification. Anal Bioanal Chem, 2010. 397(8): p. 3457-81.

14. Bondt, A., et al., Immunoglobulin G (IgG) Fab glycosylation analysis using a new mass spectrometric high-throughput profiling method reveals pregnancy-associated changes. Mol Cell Proteomics, 2014. 13(11): p. 3029-39.

15. Scherer, H.U., et al., Immunoglobulin 1 (IgG1) Fc-glycosylation profiling of anti-citrullinated peptide antibodies from human serum. Proteomics Clin Appl, 2009. 3(1): p. 106-15.

16. Scherer, H.U., et al., Glycan profiling of anti-citrullinated protein antibodies isolated from human serum and synovial fluid. Arthritis Rheum, 2010. 62(6): p. 1620-9.

17. van de Stadt, L.A., et al., Monoclonal anti-citrullinated protein antibodies selected on citrullinated fibrinogen have distinct targets with different cross-reactivity patterns. Rheumatology (Oxford), 2013. 52(4): p. 631-5.

Ejemplo 5

Material y métodos

Pacientes e individuos sanos

Se obtuvieron muestras de sangre periférica de pacientes positivos a ACPA con RA establecida. Los pacientes fueron reclutados de la clínica ambulatoria del Departamento de Reumatología del Centro Médico de la Universidad de Leiden (LUMC) y dieron su consentimiento informado por escrito. Las muestras de donantes sanos se obtuvieron del material sobrante recolectado para el trasplante alogénico de células madre y se secuenciaron como se describió anteriormente.1 Aislamiento y cultivo de células B específicas de antígeno

Las células B que expresan ACPA se aislaron de células mononucleares de sangre periférica (PBMC) como se describió anteriormente.2 Las células B específicas del toxoide tetánico (TT) se aislaron utilizando TT marcado directamente (Statens Serum Institute) preparado con el kit de Etiquetado AnaTagTM (ThermoFisher). Las células se clasificaron en grupos de 10 células o como células individuales como se describe.3 La muestra de un paciente se procesó siguiendo ambos métodos. La presencia de ACPA-IgG en los sobrenadantes de cultivo se evaluó mediante ELISA.2 Aislamiento de ARNm y procesamiento de ADNc

Las células clasificadas como grupos se lisaron directamente utilizando Tritón X-100 (Sigma) seguido de ARNm aislamiento. El ARNm de cultivos de células individuales se aisló utilizando TRIzol (Thermo Fisher). Después de cualquiera de los procedimientos de aislamiento, se sintetizó ADNc como se describe.4

PCR ARTISAN y secuenciación

Los transcritos de Ig se amplificaron utilizando la Transcripción Inversa de Anclaje de Secuencias de Inmunoglobulina y la Amplificación mediante p Cr Anidada (ARTISAN), con modificaciones.1 Los productos de PCR de las células agrupadas se secuenciaron sobre el sistema PacBio RSII (Pacific Biosciences, Menlo Park, CA, EE.UU.). Los productos de PCR obtenidos de cultivos de células individuales se secuenciaron con secuenciación de Sanger.5 Los datos de la secuencia se analizaron con Geneious R9.1.56 y herramientas IMGT (alta) V-QUEST7.

Resultados

Localización de sitios de N-glicosilación en secuencias ACPA BCR

Las secuencias BCR de células B específicas de citrulina muestran una frecuencia notable de sitios de N-glicosilación. Su independencia de la tasa SHM sugiere que los N-glicanos en la región variable confieren ventajas selectivas a las células B que expresan ACPA durante el desarrollo y/o la maduración. Para obtener más información sobre esta posibilidad, estudiamos la distribución de los sitios y comparamos el patrón con sitios de N-glicosilación identificados en repertorios de receptores de células B (BCR) de donantes sanos. Para las secuencias de ACPA-IgG, observamos un predominio de sitios en la región CDR1 y una ausencia relativa en las regiones CDR3 de ACPA-IgG. Estos resultados sugieren que el patrón de distribución del sitio de N-glicosilación de ACPA-IgG está sesgado lejos de la región CDR3 e indica una cierta preferencia por los glicanos en la región CDR1.8 Más específicamente, al evaluar en detalle los genes V de la cadena pesada de IgG, la cadena ligera kappa y la cadena ligera lambda, podemos ver el enriquecimiento de sitios en posiciones específicas en la secuencia BCR y la falta de sitios en otras posiciones. Considerando el gen V de la cadena pesada de IgG y la cadena ligera kappa, vemos un patrón similar, enriquecimiento de sitios en las posiciones 29 y 77 y una menor abundancia de sitios en varias posiciones en la región CDR3. En la cadena ligera lambda parece que faltan sitios en las posiciones 37, 51, 56, que están muy presentes en las secuencias BCR obtenidas de individuos sanos. (Figura 19)

Técnica citada (Ejemplo 5)

1 Koning, M. T. et al. ARTISAN PCR: rapid identification of full-length immunoglobulin rearrangements without primer binding bias. Br J Haematol, doi: 10.1111/bjh. 14180 (2016).

2 Kerkman, P. F. et al. Identification and characterisation of citrullinated antigen-specific B cells in peripheral blood of patients with rheumatoid arthritis. Ann Rheum Dis 75, 1170-1176, doi:10.1136/annrheumdis-2014-207182 (2016).

3 Lighaam, L. C. et al. Phenotypic differences between IgG4+ and IgG 1 B cells point to distinct regulation of the IgG4 response. J Allergy Clin Immunol 133, 267-270.e261-266, doi:10.1016/j.jaci.2013.07.044 (2014).

4 Trombetta, J. J. et al. Preparation of Single-Cell RNA-Seq Libraries for Next Generation Sequencing. Curr Protoc Mol Biol 107, 42221-17, doi: 10.1002/0471142727.mb0422s107 (2014).

5 Sanger, F. & Coulson, A. R. A rapid method for determining sequences in DNA by primed synthesis with DNA polymerase. Journal of molecular biology 94, 441-448 (1975).

6 Kearse, M. et al. Geneious Basic: an integrated and extendable desktop software platform for the organization and analysis of sequence data. Bioinformatics (Oxford, England) 28, 1647-1649, doi:10.1093/bioinformatics/bts199 (2012).

7 Alamyar, E., Duroux, P., Lefranc, M. P. & Giudicelli, V. IMGT((R)) tools for the nucleotide analysis of immunoglobulin (IG) and T cell receptor (TR) V-(D)-J repertoires, polymorphisms, and IG mutations: IMGT/V-QUEST and IMGT/HighV-QUEST for NGS. Methods in molecular biology (Clifton, N.J.) 882, 569-604, doi:10.1007/978-1-61779-842-9_32 (2012).

8 Vergroesen, R. D. et al. B-cell receptor sequencing of anti-citrullinated protein antibody (ACPA) IgG-expressing B cells indicates a selective advantage for the introduction of N-glycosylation sites during somatic hypermutation. Annals of the rheumatic diseases, doi:10.1136/annrheumdis-2017-212052 (2017).

Ejemplo 6

Métodos para la detección de glicanos ACPA-Fab

Método 1:

Utilizamos análisis de espectrometría de masas y UHPLC de alta gama de ACPA-IgG purificada (Figura 22).

Se aisló ACPA-IgG con el ensayo de microperlas CCP2 como se describió anteriormente1. Brevemente, acoplamos el péptido biotinilado con CCP2 a perlas de neutravidina al incubar las perlas con péptido durante 1 hora a temperatura ambiente (T.Amb.) mientras se agitaba a 850 rpm. Después de la incubación, las perlas se lavaron con PBS para eliminar los péptidos desacoplados. Luego se colocaron 25 ul de la suspensión de perlas (25 % de perlas por ml) en una placa de filtro orochem. A continuación, se cargaron 25-75 ul de suero/plasma y se agregó PBS hasta un volumen final de 200 ul por pocillo y se incubó durante 2 horas a T.Amb. mientras se agitaba a 600 rpm. Después de recolectar el Flujo continuo al girar la placa a 500 g 1 min, las perlas se lavaron nuevamente con PBS 3 veces al girar la placa a 500 g 1 min. El ACPA se eluyó con 2 x 100 ul de ácido fórmico (FA) 100 mM y se neutralizó con Tris 2 M hasta un pH de 7. La elución de ACPA se purificó adicionalmente al utilizar una técnica similar a la descrita anteriormente, pero en lugar de perlas de CCP2, se utilizaron 20 ul de perlas de prot G en suspensión al 50 %. La elución de ACPA se incubó durante 1 hora a T.Amb. a 900 rpm y se eluyó de nuevo en 100 ul de ácido fórmico 100 mM. Las eluciones, que ahora contenían ACPA-IgG, se secaron utilizando un Speedvac. Los glicanos se liberaron mediante la resolbilización del ACPA-IgG seco en 10 ul de SDS al 2 % y 5 ul de PBS y se desnaturalizaron durante 30 min a 60 °C. Luego se agregaron 10 ul de solución de PNGaseF (1:1 NP-40 al 1%/5^xPB^sque contenía 0.5U de PNGaseF) y se incubó durante la noche a 37 °C. Al día siguiente, se agregaron 12.5 ul de tampón 2-PB y 12.5 ul de marcador 2AA y se incubó durante 2 horas a 60 °C para marcar los glicanos liberados.23. Los glicanos marcados con 2-AA se purificaron mediante HILIC SPE utilizando puntas de algodón como se describió anteriormente con algunas modificaciones4. Brevemente, para cada muestra, se empacaron 500 ug de algodón en una punta de pipeta de 200 ul y se acondicionaron al pipetear tres veces 150 ul de MQ, seguido de 150 ul de ACN al 85 %, TFA al 0.1 % y dos veces 150 ul de ACN al 85 %. La muestra (en ACN al 85 %) se cargó al pipetear 25 veces en la mezcla de reacción. Las puntas se lavaron tres veces, tres veces con 150 ul de ACN al 85 % y TFA al 0.1 % y dos veces con 150 ul de ACN al 85 %. Los glicanos marcados con 2-AA se eluyeron finalmente del algodón con 30 ul de MQ y se identificaron mediante MALDI-TOF-MS y/o UHPLC.

El protocolo descrito en el Método 1 lleva mucho tiempo y requiere experiencia y análisis de UHPLC de alto nivel. Por lo tanto, es preferible un método más accesible para su uso en la rutina diaria. Los métodos 2 y 3 son preferibles, sin embargo, se requieren experimentos de optimización. La lectina SNA (aglutinina de Sambuccus Nigra) se une a los anticuerpos, principalmente si estos llevan dos residuos de ácido siálico en el dominio Fab.56 SNA se une a la cola Fc del anticuerpo solo bajo condiciones reductoras (lo que abre la interfaz entre los dominios CH₂)78. Los F(ab)-glicanos de ACPA contienen un alto grado de glicanos di-sialilados que están virtualmente ausentes de la cola de (ACPA-)IgG Fc. Por lo tanto, la unión de SNA a anticuerpos séricos de pacientes con RA para detectar F(ab)-glicanos ACPA representa una estrategia prometedora para visualizar la presencia de anticuerpos glicosilados. El método 2, así como el método 3, describen dos enfoques para establecer un método de alto rendimiento basado en la detección SNA.

Método 2:

Para el método 2 (figura 3), la ACPA se captura utilizando microperlas recubiertas de CCP2 (panel izquierdo) como se describió anteriormente. Para calcular la presencia de glicanos F(ab) en moléculas ACPA IgG se utilizan dos ELISA diferentes. El primer ELISA para visualizar ACPA sialilado por una lectina basada en SNA se representa en la figura 3, panel derecho. Para el segundo ELISA, para calcular la cantidad de ACPA IgG, se utiliza un kit de Bethyl (Human IgG ELISA Kit, E88-104). Para ambos ELISA, primero recubrimos las placas con 10 ug/ml de anticuerpo de captura IgG Fc anti-humano de cabra tratado con ácido peroico. Se incubó ácido peroico 200 mM durante 30 min a 4 °C para destruir el ácido siálico presente en el anticuerpo antihumano de cabra durante 1 hora a T.Amb. Las placas se lavaron 3x con tampón de tween al 0.05 % de PBS y luego se bloquearon con BSA-PBS al 1 % (de nuevo se trataron con PA20 mM durante la noche a 4 °C) durante 1 hora a temperatura ambiente. Después de lavar las placas, la elución de ACPA eluida (panel izquierdo de la Figura 3) se agregó a ambas placas y se incubó durante 1 hora a T.Amb. Después de la incubación y el lavado, una placa se incubó con 2 ug/ml de SNA biotinilado durante 1 hora a T.Amb. y la otra placa se incubó con IgG HRP antihumana de cabra durante 1 hora a T.Amb. Nuevamente después de la incubación se lavaron las placas. Posteriormente, se agregó ABTS a la placa previamente incubada con IgG HRP antihumana de cabra y se midió la absorbancia a 415 nm. A la placa previamente incubada con SNA, se le agregó Strep-HRP y se incubó durante 1 hora a T.Amb. Después de la incubación, se midió la absorbancia mediante un enfoque similar. Para el análisis de los resultados ambas placas contenían una curva estándar.

La unión de SNA por ug de ACPA-IgG se calculó al dividir la unión de SNA a ACPA-IgG en la placa 1 por los ug de ACPA-IgG capturados en la placa 2. Cuanto mayor sea la unión de SNA por ug de ACPA-IgG, mayor será la cantidad de glicosilación de Fab ACPA. Los resultados muestran claramente una relación de SNA a IgG potenciada en las muestras positivas a ACPA, visualizando el alto contenido glicosilado en Fab de ACPA.

Método 3:

Para el método 3, se utiliza una estrategia inversa. En primer lugar, la IgG total del suero o plasma se aísla mediante un enfoque similar al del ensayo de microperlas descrito anteriormente. A esto le sigue la inmovilización de IgG en SNA con perlas de agarosa SNA. Finalmente, ACPA-IgG se detecta utilizando un CCP ELISA sobre las fracciones de elución y flujo a través de SNA (figura 4). Debido a la gran cantidad de glicanos Fab di-sialilados presentes sobre ACPA-IgG, se espera un enriquecimiento de la reactividad de CCP en la fracción de elución de SNA. Este enfoque es factible para ACPA-IgG y se puede utilizar de manera de alto rendimiento, como se muestra en la figura 4 (panel derecho). Es importante destacar que confirmamos que las perlas de agarosa SNA realmente capturan IgG glicosilada con Fab en esta configuración, ya que el análisis UHPLC de las muestras de IVIG indica que claramente podríamos enriquecer las moléculas de IgG glicosiladas con Fab contenidas en IVIG en las fracciones de elución de SNA (figura 23). Por lo tanto, los datos representados en la figura 4 también muestran la viabilidad de este enfoque y visualizan la presencia de dominios Fab altamente glicosilados de ACPA. Cabe destacar que el preaislamiento de IgG por proteína G es importante para evitar la “sobrecarga” de perlas de SNA por otras moléculas presentes en el suero que transportan glicanos sialilados. Sin embargo, al ajustar la cantidad de carga de suero sobre las microperlas SNA, el método también se puede utilizar a la inversa.

Los métodos 2 y 3 muestran la solidez, la especificidad y la fiabilidad para detectar glicanos F(ab). Juntos, estos experimentos muestran que hemos establecido un sistema de ensayo que identifica de manera rápida y confiable los glicanos F(ab ACPA).

Técnica citada (Ejemplo 6)

1 Habets, K. L. et al. Anti-citrullinated protein antibodies contribute to platelet activation in rheumatoid arthritis. Arthritis research & therapy 17, 209, doi:10.1186/s13075-015-0665-7 (2015).

2 Hafkenscheid, L. et al. Structural Analysis of Variable Domain Glycosylation of Anti-Citrullinated Protein Antibodies in Rheumatoid Arthritis Reveals the Presence of Highly Sialylated Glycans. Molecular & cellular proteomics: MCP 16, 278 287, doi:10.1074/mcp.M116.062919 (2017).

3 Rombouts, Y. et al. Extensive glycosylation of ACPA-IgG variable domains modulates binding to citrullinated antigens in rheumatoid arthritis. Annals of the rheumatic diseases 75, 578-585, doi:10.1136/annrheumdis-2014-206598 (2015). 4 Selman, M. H. et al. Fc specific IgG glycosylation profiling by robust nano-reverse phase HPLC-MS using a sheathflow ESI sprayer interface. Journal of proteomics 75, 1318-1329, doi:10.1016/j.jprot.2011.11.003 (2012).

5 Kasermann, F. et al. Analysis and functional consequences of increased Fabsialylation of intravenous immunoglobulin (IVIG) after lectin fractionation. PLoS One 7, e37243, doi:10.1371/journal.pone.0037243 (2012).

6 Guhr, T. et al. Enrichment of sialylated IgG by lectin fractionation does not enhance the efficacy of immunoglobulin G in a murine model of immune thrombocytopenia. PLoS One 6, e21246, doi:10.1371/journal.pone.0021246 (2011).

7 Stadlmann, J. et al. A close look at human IgG sialylation and subclass distribution after lectin fractionation. Proteomics 9, 4143-4153, doi: 10.1002/pmic. 200800931 (2009).

8 Dalziel, M., McFarlane, I. & Axford, J. S. Lectin analysis of human immunoglobulin G N-glycan sialylation. Glycoconj J 16, 801-807 (1999).

Claims

REIVINDICACIONES

1. Un método para determinar si un individuo que no tiene artritis reumatoide (RA) en el momento de la toma de muestras tiene riesgo de desarrollar RA, en el que el método comprende

determinar si una muestra que contiene anticuerpos de dicho individuo comprende un autoanticuerpo asociado con RA; y determinar si dicho autoanticuerpo comprende una glicosilación ligada a N sobre una o más posiciones en una porción Fab de dicho autoanticuerpo; y

determinar el riesgo de dicho individuo de desarrollar RA sobre la base de dicha determinación.

2. Un método de monitorización de un individuo en riesgo de desarrollar RA,

en el que el método comprende monitorizar la presencia de un autoanticuerpo asociado con RA en una muestra que contiene anticuerpos de dicho individuo y/o monitorizar el aumento de dicho autoanticuerpo en muestras que contienen anticuerpos tomadas periódicamente de dicho individuo, y

determinar si dicho autoanticuerpo comprende una glicosilación ligada a N sobre una o más posiciones en una porción Fab de dicho autoanticuerpo.

3. El método de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 2, en el que dicho autoanticuerpo es un anticuerpo anti-proteína modificada (AMPA) capaz de unirse a un péptido o proteína que tiene una modificación postraduccional.

4. El método de la reivindicación 3, en el que dicho péptido o proteína se selecciona de antígenos de proteína citrulinados (ACPA), antígenos de proteína homocitrulinados y antígenos de proteína de lisina acetilada (AAPA).

5. El método de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4, en el que la etapa de determinar si dicho autoanticuerpo comprende una glicosilación ligada a N sobre una o más posiciones en una porción Fab de dicho autoanticuerpo comprende poner en contacto dicho autoanticuerpo con una molécula de unión a glicano que comprende una lectina y determinar la unión de la molécula de unión a glicano a dicho autoanticuerpo.

6. El método de la reivindicación 5, en el que la molécula de unión a glicano comprende una lectina que se une al ácido siálico o la parte de dicha lectina que se une al ácido siálico.

7. El método de la reivindicación 6, en el que la lectina que se une al ácido siálico es un miembro de la familia de lectinas de tipo inmunoglobulina que se unen al ácido siálico (SIGLEC).

8. El método de la reivindicación 6, en el que la lectina que se une al ácido siálico es aglutinina de Sambucus nigra (SNA), aglutinina de Maackia amurensis (MAA) o CD22.

9. El método de la reivindicación 1 o 2,

en el que la muestra que contiene anticuerpos comprende células B de dicho individuo,

en el que la etapa de determinar si dicho autoanticuerpo comprende una glicosilación ligada a N sobre una o más posiciones en una porción Fab de dicho autoanticuerpo comprende:

poner en contacto la muestra que contiene el anticuerpo con un péptido o proteína que tiene una modificación postraduccional;

separar las células B unidas a dicho péptido o proteína de las células B no unidas;

secuenciar el ácido nucleico que codifica al menos la región determinante de complementariedad 1 (CDR1) de la región variable de cadena pesada y/o la CDR1 de la región variable de cadena ligera de un receptor de células B de dichas células B unidas; y

determinar si la secuencia de ácidos nucleicos codifica una secuencia de aminoácidos consenso de glicosilación ligada a N.

10. El método de la reivindicación 9, que comprende secuenciar al menos las CDR de la región variable de cadena pesada y/o las CDR de la región variable de cadena ligera.

11. Un kit de partes para detectar un autoanticuerpo asociado con la RAen una muestra,

en el que el kit comprende además una molécula de unión a glicano capaz de unirse a un glicano ligado a N sobre una porción Fab de un anticuerpo; en el que la molécula de unión a glicano comprende lectina que se une al ácido siálico; y en el que opcionalmente dicho péptido o proteína o la molécula de unión a glicano se liga a una superficie sólida.

12. El kit de la reivindicación 11, en el que el péptido o la proteína se selecciona de antígenos de proteína citrulinados (ACPA), antígenos de proteína homocitrulinados y antígenos de proteína de lisina acetilada (AAPA).

13. El kit de la reivindicación 11 o 12, en el que la lectina que se une al ácido siálico es aglutinina de Sambucus nigra (SNA) o aglutinina de Maackia amurensis (MAA).