JP6145881B2 - ラマン分光画像取得システムおよびラマン分光画像取得方法 - Google Patents

Description

本発明は、被検体に特有のピーク波長を有するラマン散乱光を測定するラマン顕微分光装置を備えたラマン分光画像取得システムおよびラマン分光画像取得方法に関するものである。

従来、被検体を構成する物質の同定などを行う方法としてラマン分光法が提案されている。ラマン分光法は、物質に単波長光を照射して得られる散乱光を分光して、ラマン散乱光のスペクトル（ラマンスペクトル）を得る方法であり、このスペクトルのピーク波長を解析することによって物質の同定などを行うことができる。

上述したラマン分光法としては、微弱なラマン散乱光を増強するため、局在プラズモン共鳴によって増強された光電場を利用した、いわゆる表面増強ラマン（SERS）と呼ばれる方法が知られている。
この方法は、金属体、特に表面にナノオーダの凹凸を有する金属体に物質を接触させた状態で光を照射すると、局在プラズモン共鳴による光電場増強が生じ、金属体表面に接触された試料のラマン散乱光の強度が増強されるという原理を利用したものである。被検体を担持する担体（基板）として、表面に金属凹凸構造を備えた基板を用いることにより表面増強ラマン分光法を実施することができる（特許文献１等）。

表面増強ラマン分光法を用いない場合にはラマン散乱光は非常に微弱であり、また、表面増強ラマン分光法を用いた場合であっても検体濃度が極端に薄い場合には増強してもなおラマン散乱光は非常に微弱であるため、イメージングにより得られる画像の解像度やコントラストが低く、検体の空間分布情報が十分に得られない。そのため、ラマン散乱光検出して得られる画像と別途に照明光が照射されて取得された試料の明視野像との比較を行うことで、詳細な空間分布情報の取得が行われている。例えば、特許文献２では、先に取得した明視野画像において、位置の基準となる基準点Ｐを設定し、分光画像取得前に基準点Ｐを基準として升目状にデータを取得する区画を設定し、分光画像と明視野画像とを空間的に対応づける方法が記載されている。

特開２０１２−０６３２９４号公報 特開２０１２−２０２７１７号公報

しかしながら、特許文献２の方法では、基準点Ｐの設定、分光画像取得の区画設定などの複雑の工程を経て明視野画像と分光画像との対比がなされており、簡易な方法とは言えない。

本発明は、上記事情に鑑み、ラマン分光画像と正確にかつ容易に重ね合わせることが可能な明視野像を取得することができるラマン分光画像取得システムおよびラマン分光画像取得方法を提供することを目的とする。

本発明のラマン分光画像取得システムは、被検体が載置される基板、励起光を出射する光源、被検体から発せられる光を分光し、励起光波長から被検体のラマン散乱光ピーク波長を含む所定波長範囲のスペクトルを測定する分光器、励起光を被検体に照射し、励起光の照射により被検体から発せられる光を分光器に導く共焦点光学系、被検体と分光器との間に配置され、分光器に入射する被検体から発せられる光のうち励起光波長の光量を分光器の飽和光量の８０％以下に調整する光量調整機構、および励起光を二次元走査する機構を備えた顕微分光装置と、
顕微分光装置により取得されたスペクトルに基づく画像を表示するモニタと、
顕微分光装置による励起光の二次元走査に伴い測定された各スペクトルの励起光波長のデータから被検体の明視野像を求め、ラマン散乱光ピーク波長のデータから被検体のラマン分光画像を求め、モニタに明視野像とラマン分光画像とを重ねて表示させる制御部とを備えてなることを特徴とする。

ここで、「励起光の照射によって被検体から生じた光」には、励起光の照射によって被検体から生じるラマン散乱光、レーリー散乱光等の散乱光に加え、励起光の被検体表面もしくは基板と被検体との境界での正反射光を含むものとする。
また、「分光器の飽和光量」とは、分光器内の光検出器の光電変換特性における入力光量（照度×蓄積時間）に対する出力信号の関係において、これ以上光量を増加しても出力量が飽和する光量をいう。

光量調整機構により、分光器に入射する被検体から発せられる光のうち励起光波長の光量を分光器の飽和光量の８０％以下に調整するのは、二次元画像取得前に一度行えばよく、励起光による二次元画像中に調整する必要はなく、一端調整した後は、分光器に入射する励起光波長の光量が分光器の飽和光量の８０％を超えても構わない。
なお、光量調整機構は、励起光波長の光の出力信号（シグナルＳ）が、分光器のノイズＮに対しＳ／Ｎが１００以上となるように励起光波長の光量を調整するものであることが望ましい。分光器のノイズＮは分光器自体、顕微鏡構成、被検体、環境等の状態により変動するため、測定毎に変化し得るものであるが、各システムにおいて、ラマン分光画像取得前にＳ／Ｎ測定を行えばよい。

基板を励起光およびラマン散乱光に対して透明なものとし、光学系を励起光を基板の裏面に向けて照射するものとし、分光器が基板の裏面側から放射された被検体から発せられる光を分光測定するものとすることができる。

光量調整機構にバンドパスフィルタを備え、バンドパスフィルタの、被検体から発せられる光が分光器に向かう光軸に対する傾きを変化させて、励起光波長の光量を調整してもよい。

光量調整機構が検光子を備え、検光子を励起光の偏光方向に対し回転させることで、励起光波長の光量を調整してもよい。

「偏光方向に対し回転させる」とは、直線偏光の励起光の偏光振動の方向と検光子の透過軸とのなす角度を変化させることを意味する。

光量調整機構に複数枚のシャープカットフィルタまたは複数枚のバンドパスフィルタを備え、シャープカットフィルタまたはバンドパスフィルタの枚数を変えることで、励起光波長の光量を調整してもよい。

基板が表面に金属の微細凹凸構造を備えてなる光電場増強デバイスであることが好ましい。

制御部が、光量調整機構を制御して、励起光波長の光量を調整するものとすることができる。

本発明のラマン分光画像取得方法は、被検体に対して励起光を照射し、励起光の照射により被検体から発せられる光を分光器により分光測定し、分光器に入射する被検体から発せられる光のうち励起光波長の光量初期値が、分光器の飽和光量の８０％以下となるように分光器に入射する光の励起光波長の光量を調整し、
分光器に入射する励起光波長の光量を調整した状態で、励起光の照射位置を二次元走査させて、励起光の二次元走査に伴い測定される各スペクトルの励起光波長のデータから被検体の明視野像を求め、ラマン散乱光ピーク波長のデータから被検体のラマン分光画像を求め、
モニタに明視野像とラマン分光画像とを重ねて表示させることを特徴とする。

本発明のラマン分光画像取得装置および方法によれば、分光器に入射する被検体から発せられる光のうち励起光波長の光量を、分光器の飽和光量の８０％以下に調整し、分光器に入射する励起光波長の光量を調整した状態で、励起光の照射位置を二次元走査させて、励起光の二次元走査に伴い測定される各スペクトルの励起光波長のデータから被検体の明視野像を求め、ラマン散乱光ピーク波長のデータから被検体のラマン分光画像を求めており、明視野像をラマン光と同一測定点からの信号をラマン光と同時に検出している励起光波長のデータから求めているため、モニタに明視野像とラマン分光画像を容易に重ねて表示することができる。

励起光の照射を受け、ラマン散乱光と同一測定点から発生られる励起光の戻り光は、ラマン光などと比べ桁違いに強く、通常はこの戻り光が分光器（の光検出器）に入射しないように励起光カットフィルタ等により減光されるが、本発明では、分光器に入射する光のうち励起光波長の光量を分光器の飽和光量の８０％以下に調整した上で、二次元走査して画像を取得するので、分光器の光検出器を飽和させることなく、かつ試料の鮮明な明視野像を得ることができる。

本発明のラマン分光画像取得システムの第１の実施形態の概略構成を示す図 図２に示す構成のシステムの分光器および従来システムの分光器により検出されたスペクトルを示すグラフ 本発明のラマン分光画像取得システムの第２の実施形態の概略構成を示す図 図３に示すラマン散乱光測定装置に備えられた光電場増強基板を示す斜視図 図４に示した光電場増強基板の側面の一部Ｖの拡大図 図３に示す構成のシステムにおいて分光器に入射する励起光波長の調整前後に分光器により検出されたスペクトルを示すグラフ 本発明のラマン分光画像取得システムの第３の実施形態の概略構成を示す図 本発明のラマン分光画像取得システムの第４の実施形態の概略構成を示す図

以下、本発明のラマン分光画像取得システムおよびラマン分光画像取得方法の第１の実施形態について、図面を参照しながら詳細に説明する。図１は、本実施形態のラマン分光画像取得システム１の概略構成を示すブロック図である。
本実施形態のラマン分光画像取得システム１は、図１に示すように、被検体Ｓが載置される基板１０、励起光Ｌ_０を出射する光源１１、被検体Ｓから発せられる光を分光し、励起光波長から被検体Ｓのラマン散乱光ピーク波長を含む所定波長範囲のスペクトルを測定する分光器１２、励起光Ｌ_０を被検体Ｓに照射し、励起光Ｌ_０の照射により被検体Ｓから発せられる光を分光器１２に導く共焦点光学系１３、被検体Ｓと分光器１２との間に配置され、分光器１２に入射する被検体Ｓから発せられる光のうち励起光波長の光量を分光器１２の飽和光量の８０％以下に調整する光量調整機構１４、および励起光Ｌ_０を二次元走査する機構１５を備えた顕微分光装置２と、顕微分光装置２により取得されたスペクトルに基づく画像を表示するモニタ３と、顕微分光装置２による励起光Ｌ_０の二次元走査に伴い測定された各スペクトルの励起光波長のデータから被検体の明視野像を求め、ラマン散乱光ピーク波長のデータから被検体Ｓのラマン分光画像を求め、モニタ３に明視野像とラマン分光画像とを重ねて表示させる制御部４とを備えている。

まず、基板１０、光源１１、分光器１２、共焦点光学系１３、光量調整機構１４、および励起光Ｌ_０を二次元走査する機構１５を備えた顕微分光装置２の各要素について説明する。

基板１０は、本例では励起光を基板１０裏面から入射させて被検体Ｓに照射し、被検体Ｓから発せられる光を基板１０裏面から検出するため、励起光からラマン散乱光を含む所定波長範囲の光に対して透明である。ここで透明とは、入射する光の５０％以上を透過するものとする。
なお、基板１０の表面側から励起光を照射し、散乱光を検出する構成の顕微鏡であれば、基板は必ずしも透明である必要はない。

光源１１は、単波長の励起光Ｌ_０を射出する光源であれよい。ここでは、光源１１は、８５ｎｍの励起光を射出するファイバーカップルＤＦＢ（分布帰還型）半導体レーザであり、射出された励起光Ｌ_０は光ファイバ２１を通り、その先端２１ａから出射されるよう構成されている。光ファイバ２１としては、例えば、コア直径５.５μｍの偏波保持シングルモードファイバを用いる。

分光器１２は、被検体から発せられた光を分光する回折格子と、該分光されたスペクトルを検出するためのマルチチャネルＣＣＤ等からなる検出器とを含んでいる。なお、検出器は微弱なラマン光を精度よく検出するため冷却機構が搭載されていることが好ましい。分光器１２は、励起光波長から被検体Ｓのラマン散乱光ピーク波長を含む所定波長範囲のスペクトルを測定可能に構成されていれば、どのような構成であっても構わない。本構成においては、光ファイバ２９により導光された光を分光してスペクトル測定を行うよう構成されている。

共焦点光学系１３は、励起光Ｌ_０を被検体Ｓに照射し、励起光Ｌ_０の照射により被検体Ｓから発せられる光を分光器１２に導くための光学系であり、複数の光学部材から構成される。本実施形態においては、光源１１から射出され光ファイバ２１の先端２１ａから出射された励起光Ｌ_０をコリメートする非球面レンズ２２と、アイソレータ２３と、スペクトル先鋭化のためのバンドパスフィルタ２４と、励起光波長以下の光を反射し、それより長波の光を透過する特性を有するダイクロイックミラー２５と、誘電体ミラー２６と、被検体の所定位置に焦点を絞って励起光を照射すると共に、被検体から発せられる光を検出するための対物レンズ２７と、集光レンズ２８と、集光レンズ２８により集光された光を分光器に導光する光ファイバ２９を備えている。集光レンズ２８は、対物レンズ２７を経てミラー２６で反射され、ダイクロイックミラー２５を透過し、さらに光量調整機構１４を透過した光を光ファイバ２９の先端に集光するものであり、光ファイバ２９のコア端面２９ａが共焦点系のアパーチャとして機能する。

光量調整機構１４は、被検体Ｓと分光器１２との間、ここでは上述の共焦点光学系１３内に配置され、分光器１２に入射する被検体Ｓから発せられる光のうち励起光波長の光量を分光器１２の飽和光量の８０％以下の所定値に調整するものである。また、光量調整機構は、励起光波長の光の出力信号（シグナルＳ）が、分光器のノイズＮに対しＳ／Ｎが１００以上となるように励起光波長の光量を調整するものとする。Ｓ／Ｎが１００以上であれば、鮮明な明視野像を得ることが可能である。分光器に入射する励起光波長の光量は飽和光量の１０％以上とすることが好ましく、さらには４０％以上、６０％以下の所定値であることがより好ましい。特には飽和光量の半分程度とすることが好ましい。

本実施形態においては、励起光波長の光量を大幅に減衰させ、励起光波長より長波長側のラマン散乱光波長（ストークス光）を透過するロングパスフィルタ３１（バンドパスフィルタの一種である。）と、このフィルタ３１を支持すると共にフィルタ３１の光軸に対する傾きを変化させるフィルタ駆動部３２とを備えている。フィルタ駆動部３２は、フィルタ３１の光入射面に光軸が垂直となる状態からその光入射面と光軸とのなす角度が小さくなる方向（図中Ｒ_１方向）にフィルタ３１の傾きを変化させるものである。ロングパスフィルタ３１の傾きを変化させることによりラマン散乱光波長の透過量をほとんど変化させることなく、励起光波長の光量の透過量を変化させることができる。ロングパスフィルタ３１としては、傾きを変化させることによる波数１００ｃｍ^−１以上の波長における透過量の変化量がラマン散乱ピークにおいて最大透過光量の２０％以内に抑えられるものを用いることが好ましい。

励起光Ｌ_０を二次元走査する機構１５は、励起光Ｌ_０を所定範囲で二次元走査できる構成であれば特に限定されるものではないが、本実施形態においては、基板１０を保持するとともに、Ｘ方向およびＹ方向（紙面奥行き方向）に基板１０を移動させる移動ステージ（ＸＹステージ）１５より構成されている。

顕微分光装置２においては、ファイバーカップルＤＦＢ半導体レーザ１１からの７８５ｎｍの励起光Ｌ_０を焦点距離１０ｍｍの非球面レンズ２２を用いてコリメートする。コリメートされた励起光Ｌ_０はアイソレータ２３を通過した後に、さらにスペクトル先鋭化のためのバンドパスフィルタ２４を通過する。ダイクロイックミラー２５および誘電体ミラー２６によって対物レンズ２７に導かれ、ガラス基板１０上の被検体（サンプル）Ｓに集光される。ガラス基板１０は二次元走査機構を構成するＸＹステージ１５上に固定されている。被検体Ｓからのラマン光および励起光の戻り光は対物レンズ２７によってコレクトされ、誘電体ミラー２６によりダイクロイックミラー２５に導かれる。ダイクロイックミラー２５は励起波長以下の光を反射し、それより長波の光を透過する特性を有するため、ラマン光（ストークス光）はダイクロイックミラー２５を低ロスで透過するが、励起光の戻り光のほとんどが光源１１側に反射される。ここで、励起光の戻り光とは、励起光の照射により被検体Ｓから発せられる光のうちの励起光波長の光を総称するものであり、レーリー散乱および励起光の正反射光を含むものである。ダイクロイックミラー２５において励起光は多くが反射されるが、ダイクロイックミラー２５を透過した励起光でさえ、ラマン散乱光に対し桁違いに大きな光量となっている。

ダイクロイックミラー２５を透過した光は、励起光波長の光量を調整する光量調整機構のロングパスフィルタ３１を通過する。駆動部３２により、分光器１２で検出される励起光波長の光量が分光器１２の検出器の飽和光量の８０％以下の所定値となるように二次元走査前にロングパスフィルタ３１の傾きが調整され、ロングパスフィルタ３１を透過したラマン光および励起光の戻り光は焦点距離９０ｍｍの集光レンズ２８によって、コア直径５０μｍのマルチモードファイバ２９に結像される。マルチモードファイバ２９は分光器１２に接続されており、ファイバ２９を通ってきたラマン散乱光および励起光の戻り光を含む光が、分光器１２によって、分光されてスペクトル測定がなされる。

上記の顕微分光装置２のデータからラマン分光画像を取得して表示するモニタ３と制御部４は、例えば、パーソナルコンピュータにより構成される。分光器１２とＸＹステージ１５は、コンピュータ内のハードディスク等にインストールされたプログラムに基づいて、制御部４により駆動制御されており、ＸＹステージ１５により励起光を被検体Ｓの所望の位置に移動した後、ラマン光と励起光の戻り光を含む所定の波長範囲のスペクトルを分光器１２によって取得する。制御部４では、顕微分光装置２による励起光Ｌ_０を被検体Ｓの所望の範囲内を二次元走査させ、励起光の二次元走査に伴い測定された各スペクトルの励起光波長（波数：０ｃｍ^−１）のデータから被検体Ｓの明視野像を求め、ラマン散乱光の特定のピーク波長のデータから被検体Ｓのラマン分光画像を求め、モニタ３に明視野像とラマン分光画像とを重ねて表示させる。ここで、重ねて表示とは、明視野像とラマン分光画像とを位置合わせした状態で同時に表示することを意味する。

次に、本ラマン分光画像取得システム１による分光画像取得方法について説明する。

ラマン分光画像取得を開始する前に、まず、分光器１２により受光される光の励起光波長の光量調整を行う。被検体Ｓを基板１０上に載置した状態で、被検体Ｓの任意の位置に対して励起光Ｌ_０を照射する。ここでは、二次元画像を取得するため、被検体Ｓと基板１０との界面に焦点位置がくるように調整して励起光Ｌ_０を照射する。このとき、励起光波長の光量（シグナルＳ）が、分光器１２のノイズＮに対しＳ／Ｎが１００以上となるように調整し、かつ飽和信号値の８０％以下の所定値、例えば５０％となるように光量調整機構１４のフィルタ駆動部３２によりフィルタ３１を回転させて励起光波長の分光器１２への入射光量を調整する。入射光量の調整は、自動で行っても手動で行ってもよい。すなわち、制御部４が検出器における飽和光量と受光光量とを比較しつつ駆動部３２によるフィルタ３１の回転量を調整するように構成されていてもよいし、分光器１２により測定されるスペクトルをモニタ３に表示させ、駆動部３２によるフィルタ３１の回転量を操作者が調整するようにしてもよい。

上記のような分光器１２への励起光波長の光量調整は、基本的に、被検体毎および／または励起光出力、共焦点光学系等の調整後、ラマン分光画像取得前に１度行えばよく、二次元走査中には行う必要はない。

分光器に入射する励起光波長の光量を初期状態で上述の通り、飽和信号値の８０％以下の所定値に調整した状態で、励起光Ｌ_０を被検体Ｓの所望の範囲に二次元走査させて、各箇所において励起光波長から所定のラマン散乱ピーク波長を含む波長範囲のスペクトルを測定する。分光器に入射する励起光波長の光量は、二次元走査中に変動する可能性があるが、その変動は概ね２０％未満であるため、分光器の検出器の飽和光量に達することなく、
測定が可能である。この二次元走査に伴い測定されるスペクトルの励起光波長のデータから被検体の明視野像を求め、ラマン散乱光ピーク波長のデータから被検体のラマン分光画像を求め、モニタ３に明視野像とラマン分光画像とを重ねて表示させる。

上記実施形態のラマン分光画像取得システムおよび方法によれば、明視野像は、ラマン光と同一測定点からの励起光の戻り光のデータに基づいて取得するので、モニタ上に明視野像とラマン分光画像を容易に重ねて表示することができる。

励起光の照射を受け、ラマン散乱光と同一測定点から発生られる励起光の戻り光は、ラマン光などと比べ桁違いに強く、通常はこの戻り光が分光器（の光検出器）に入射しないように励起光カットフィルタ等により減光されるが、本発明では、分光器に入射する光のうち励起光波長の光量を分光器の飽和光量の８０％以下に調整するので、分光器の光検出器を飽和させることなく、かつ試料（被検体）の鮮明な明視野像を得ることができる。

ラマン散乱光の検出と同時に共焦点用のアパーチャを通過させ、分光器で励起光波長を検出しているので、従来の顕微分光装置に検出部や別途の照明光を追加することなく、高分解能かつ高コントラストな明視野像を得ることができる。光量調整をせず分光器に励起光波長が入射してしまうと、励起光波長の戻り光はラマン光に比較して非常に大きいため、にラマンスペクトル上に励起光によるバックグラウンドが重なり、ラマン信号のＳ／Ｎが大きく低下し、また、励起光波長を受光する受光素子の出力信号が飽和する。そのため、従来は、分光器に入射する前に、励起光カットフィルタによって励起光のみを大幅に減少させている。本発明は、検出器に入射する励起光波長の光量を検出器の飽和光量の８０％以下に調整することにより、さらに、励起光波長の光量（シグナルＳ）が、分光器１２のノイズＮに対しＳ／Ｎが１００以上となるように調整することにより、検出器を飽和させることなく、バックグラウンドの上昇を抑制すると共に、位置情報を正確に示す程度の高いコントラストの明視野像を得ることができる。

図２に、被検体Ｓとしてシリコンを用いてロングパスフィルタ３１を回転させた前後でのスペクトルを示す。図２中のインセットのスペクトルは、縦軸に示す信号強度を拡大して示したものである。グラフ濃い実線Ａで示されているのがロングパスフィルタ３１を光軸に対して垂直に配置した場合であり、薄い実線Ｂで示されているのがロングパスフィルタ３１の光軸に対する傾きを調整して飽和光量の５０％程度に調整した場合である。

回転前後で、８１６ｎｍのシリコンラマンピーク強度の変化はほとんどないのに対し、７８５ｎｍの励起光波長の信号強度が大きく変化していることがわかる。すなわち、ロングパスフィルタ３１を光軸に対して垂直に配置した場合には、励起光波長がほとんどカットされて励起光波長の光量が非常に小さいのに対し、ロングパスフィルタ３１の傾きを調整した後は、十分に大きな励起光波長の信号が得られている。
このようなＳ／Ｎの良い励起光波長の信号を得ることができれば、励起光波長のデータから被検体の明視野像としてＳ／Ｎの良い画像を得ることができる。

次に、本発明のラマン分光画像取得システムおよび方法の第２の実施形態について説明する。図３は本実施形態のラマン分光画像取得システム５の概略構成を示すブロック図である。上述した第１の実施形態のラマン分光画像取得システム１と第２の実施形態のラマン分光画像取得システム５とは、顕微分光装置２の基板と光量調整機構の構成が異なる。

第１の実施形態においては、ガラス基板１０が用いられているが、第２の実施形態においては、光電場増強基板５０が用いられている。また、第１の実施形態においては、光量調整機構として、ロングパスフィルタとその光軸に対する傾きを変化させる駆動部とを備えるものとしたが、図３に示すように、第２の実施形態においては光量調整機構４０が、検光子４１と検光子４１を光軸に対して回転駆動する回転駆動部４２を備えた構成である。

まず、光電場増強基板５０について説明する。図４は、光電場増強基板５０を示す斜視図であり、図５は、図４に示した光電場増強基板５０の側面の一部Ｖの拡大図である。
光電場増強基板５０は、図４および図５に示すように、ガラスなどからなる透明基板５１と、透明基板５１の表面に形成された微細凹凸構造５２と、微細凹凸構造５２の表面に形成された金属膜５３とからなるものである。

本実施形態における微細凹凸構造５２は、ベーマイトから形成されるものである。微細凹凸構造５２は、その表面に金属膜５３を形成した場合の金属微細凹凸構造の凸部の深さの平均およびピッチの平均が、励起光Ｌ_０の波長より短くなるように形成されるものであるが、金属微細凹凸構造の表面に局在プラズモンを生じさせうるものであればよい。特に、微細凹凸構造５２は、凸部頂点から隣接する凹部の底部までの深さの平均が２００ｎｍ以下、凹部を隔てた最隣接凸部の頂点同士のピッチの平均が２００ｎｍ以下であることが望ましい。

金属膜５３は、微細凹凸構造５２の表面に沿って形成されるものであり、これにより上述した金属微細凹凸構造が形成される。そして、光電場増強基板５０は、この金属微細凹凸構造によって局在プラズモン共鳴による光電増強効果を得ることができるものである。
具体的には、光電場増強基板５０は、金属膜５３が形成された微細凹凸構造５２（金属微細凹凸構造）への励起光Ｌ_０の照射によって局在プラズモン共鳴が誘起され、この局在プラズモン共鳴により金属膜５３の表面に増強された光電場を生じさせるものである。

金属膜５３は、励起光Ｌ_０の照射を受けて局在プラズモンを生じうる金属からなるものであればよいが、例えば、Ａｕ、Ａｇ、Ｃｕ、Ａｌ、Ｐｔ、およびこれらを主成分とする合金からなる群より選択される少なくとも１種の金属からなるものである。特には、ＡｕあるいはＡｇが好ましい。
金属膜５３の膜厚は、金属膜５３が微細凹凸構造５２の表面に形成された場合に、金属微細凹凸構造として励起光Ｌ_０の照射を受けて局在プラズモンを生じうる凹凸形状を維持することができる程度の厚みであれば特に制限はないが、１０ｎｍ〜１００ｎｍであることが好ましい。

次に本実施形態の励起光波長の光量調整機構４０について説明する。光量調整機構４０は、既述の通り、検光子４１と検光子４１を光軸に対して回転駆動する（光軸を中心にＲ_２方向に回転させる）駆動部４２を備えた構成である。

励起光Ｌ_０はレーザ光であり直線偏光であるので、戻り光のうち少なくとも正反射光は直線偏光である。直線偏光の振動方向と検光子４１の透過軸とが一致したとき、直線偏光は検光子４１をほぼ透過し、検光子４１の透過軸の、直線偏光の振動方向となす角度を大きくするにつれ透過光量は小さくなり、直線偏光の振動方向と検光子の透過軸とが直交するとき、直線偏光はほぼ遮断されて透過しなくなる。すなわち、検光子の透過軸の、直線偏光の振動方向となす角度を変化させることにより、検光子を透過する直線偏光の光量を調整することができる。光軸に対して面が垂直となるように配置された検光子４１をその光軸に対して回転させることは、直線偏光の振動方向と検光子の透過軸とのなす角度を変化させていることに等しい。

本実施形態においては検光子４１を光軸中心に回転させることにより励起光波長の光量を分光器の光検出器（ＣＣＤ）の飽和光量の８０％以下の所定値となるように調整する。分光器に入射する励起光波長の光量は飽和光量の１０％以上、より好ましくは４０％以上、６０％以下の所定値となるように調整する。最も好ましいのは飽和光量の半分程度である。

上記以外の構成および画像取得方法は第１の実施形態のシステムおよび方法と同様であり、同様の効果を得ることができる。

図６に、被検体ＳとしてＲ６Ｇを用いて回転駆動部４２により検光子４１を回転させる前後のスペクトルを示す。図６中のインセットのスペクトルは、縦軸に示す信号強度を拡大して示したものである。濃い実線Ａで示されているのが回転前であり、薄い実線Ｂで示されているのが回転後である。回転前とは、検光子４１の透過軸を、励起光の直線偏光光と振動方向を一致させた状態、すなわち励起光波長の直線偏光光が全透過した場合であり、本例では、分光器の飽和光量の９０％程度であった。また、回転後は、分光器の飽和光量の４０％程度としている。

回転前後で、Ｒ６Ｇのラマンピーク強度（図中８６４ｎｍ、８７０ｎｍ近傍に矢印で示すピークはラマンピークの例示である。）に大きな変化がないのに対し、励起光波長である７８５ｎｍの信号強度が大きく変化していることがわかる。ここでは検光子４１は、励起光波長の信号強度が検出器の飽和光量の４０％程度となるように調整しているが、飽和光量の１０〜８０％程度の所定値となるように調整すればよい。ラマン分光画像としては、７８５〜９３０ｎｍのいずれかのラマンピークの信号強度をラマン分光画像に用いることができ、いずれのピーク波長のデータを用いるかは適宜選択すればよい。

次に、本発明のラマン分光画像取得システムおよび方法の第３の実施形態について説明する。図７は本実施形態のラマン分光画像取得システム７の概略構成を示すブロック図である。上述した第２の実施形態のラマン分光画像取得システム５と第３の実施形態のラマン分光画像取得システム６とは、顕微分光装置２の光量調整機構の構成が異なる。

第２の実施形態においては光量調整機構４０が、検光子４１と検光子４１を光軸に対して回転駆動する駆動部４２を備えた構成であるが、図７に示すように、第３の実施形態においては、光量調整機構６０が、複数のバンドパスフィルタ６１ａ、６１ｂ、６１ｃを備え、そのバンドパスフィルタ６１ａ、６１ｂ、６１ｃの光軸上から抜き差しすることにより光軸上に配置するフィルタ数を変化させ、励起光波長の光量を調整するよう構成されている。バンドパスフィルタ６１ａ、６１ｂ、６１ｃとしては、励起光波長よりも長波長側の少なくともラマン散乱ピーク波長を含む所定の波長域の波長を透過させ、それ以外の波長に対する透過率が低いフィルタを用いる。光路上のバンドパスフィルタ数が増えるほど、励起光波長の光の透過率をより小さくすることができる。すなわち、本実施形態においては、被検体Ｓから発せられる光の分光器１２に至る光路上におけるフィルタの数を増減させることにより分光器１２に入射する励起光波長の光量を増減させ、分光器の光検出器（ＣＣＤ）の飽和光量の８０％以下の所定値となるように調整する。分光器に入射する励起光波長の光量は飽和光量の１０％以上、より好ましくは４０％以上、６０％以下の所定値となるように調整する。最も好ましいのは飽和光量の半分程度である。第１、第２の実施形態と比較すると、回転駆動が不要であるため、構成が簡単になるが、フィルタの数の増減では光量を連続的に調整はできず、光量調整は不連続なものとなる。

上記以外の構成および画像取得方法は第２の実施形態のシステムおよび方法と同様であり、同様の効果を得ることができる。

なお、バンドパスフィルタに代えて、シャープカットフィルタを複数枚備え、シャープカットフィルタの数を変化させてもよい。なお、シャープカットフィルタとしては、励起光波長以下を急峻に遮断し長波長側のみを通すものを用いればよい。シャープカットフィルタを用いてもバンドパスフィルタを用いた場合と同様に光路上におけるフィルタ数を変化させることにより励起光波長の光量を変化させることができる。

また、単数もしくは複数のバンドパスフィルタと、単数もしくは複数のシャープカットフィルタを備え、組合せや数を変化させることによって光量を調整するよう構成してもよい。

以上の第１〜第３の実施形態のラマン分光画像取得システムにおいては、励起光の戻り光の分光器への入射光量を調整する光量調整機構を備え、二次元画像の測定前に予めに分光器への励起光波長の入射光量を分光器の光検出器の飽和光量の８０％以下、また、励起光波長の光の出力信号（シグナルＳ）が、分光器のノイズＮに対しＳ／Ｎが１００以上となるように、好ましくは分光器の光検出器の飽和光量の１０％以上、より好ましくは４０％以上６０％以下に調整しておくことにより、その後の二次元走査によりラマン分光画像を取得する際に、同時に被検体の明視野画像を取得することができ、両画像を容易に、かつ精度よく重ねて表示することができる。励起光波長の光量を分光器の光検出器の飽和光量の８０％以下に調整しておけば、二次元走査の間に励起光波長の受光量に２０％程度の変動が生じても光検出器を飽和させることなく信号取得を行うことができる。励起光波長の光の出力信号が分光器のノイズＮに対してＳ／Ｎが１００以上であれば、励起光波長の光量が１％程度の変動であっても検出可能であるため、十分に鮮明な明視野画像を取得することができる。

上記第１から第３の実施形態において、二次元走査を行う機構としては、基板１０、５０を保持するとともに、Ｘ方向およびＹ方向（紙面奥行き方向）に基板１０を移動させる移動ステージ１５に限るものではなく、基板１０は固定した状態とし、たとえば２軸式ガルバノミラー（ガルバノスキャナ）などを用いることによって被検体Ｓ上を励起光Ｌ_０によって二次元状に走査するようにしてもよい。

図８は、本発明の第４の実施形態のラマン分光画像取得システム８の概略構成を示すブロック図である。本実施形態のシステム８は、第１の実施形態のシステム１とは励起光を二次元走査させる機構が異なる。本実施形態のシステム８は、第１の実施形態のシステム１において、励起光Ｌ_０を二次元走査させる機構としてのＸＹステージ１５に代えて、ガルバノミラーを備えた二次元走査機構７０と基板１０を支持する基板支持台７５とを備えたものである。本実施形態において二次元走査機構７０は、基板面においてＸＹ方向に励起光を走査するための２軸式ガルバノミラー７１および走査系の光学レンズ対７２を備えてなる。光源１１から射出され光ファイバ２１の先端２１ａから出射された励起光Ｌ_０は、非球面レンズ２２、アイソレータ２３およびバンドパスフィルタ２４を果てガルバノミラー７１に入射し、ガルバノミラー７１により反射され、レンズ対７２を経てダイクロイックミラー２５、誘電体ミラー２６、対物レンズ２７を経て被検体Ｓに照射される。他の構成は図１に示した第１の実施形態の構成と同様であり、作用効果も同様である。

上記第１から第４の実施形態においては、共焦点光学系１３を基板１０、５０の裏面側に配置し、基板１０、５０の裏面側から励起光Ｌ_０を照射する構成であるが、これに限らず、共焦点光学系１３を、基板１０、５０の表面側（被検体配置面側）に配置し、基板１０の表面側から励起光Ｌ_０を照射する構成としてもよい。なお、光電場増強基板５０の金属微細凹凸構造に対しては、表裏のいずれから励起光Ｌ_０が入射されても同様に局在プラズモン共鳴を誘起することができ、光電場増強効果を得ることができる。
しかしながら、裏面照射であれば、二次元走査の際の励起光照射深さ（焦点位置）を変化させる必要がないため、より好ましい。なお、光電場増強基板の表面は微細凹凸構造を有しているが、数百ｎｍオーダーであり、コンフォーカル（共焦点）の大きさは１μｍ程度であるから、微細凹凸に沿った共焦点位置の調整は特に必要ない。

また、上記第２および第３の実施形態においては、光電場増強基板５０の微細凹凸構造５２は、ベーマイトにより構成されるものとしたが、ベーマイト以外の透明な材料により構成されていてもよい。例えば、アルミニウム基体に対して、陽極酸化処理を施してその上層部に多数の微細孔を有する陽極酸化アルミナを作製し、陽極酸化されていないアルミニウム部分を除去した陽極酸化アルミナ層を微細凹凸構造５２とし、これを透明基板５１上に固定してもよい。

また、微細凹凸構造は透明基板と異なる材料により構成されたもののみならず、透明基板の表面を加工することにより基板と同一の材料により構成されていてもよい。例えば、ガラス基板の表面をリソグラフィーとドライエッチング処理することにより、表面に微細凹凸構造を形成したものを用いてもよい。

１、５、６、８ ラマン分光画像取得システム
２ 顕微分光装置
３ モニタ
４ 制御部
１０ 基板
１４、４０、６０ 光量調整機構
３１ バンドパスフィルタ
３２ フィルタ駆動部
４１ 検光子
４２ 回転駆動部
５０ 光電場増強基板
５１ 透明基板
５２ 微細凹凸構造
５３ 金属膜
６１ａ、６１ｂ、６１ｃ バンドパスフィルタ
Ｌ_０ 励起光
Ｓ 被検体

Claims (8)

1. 被検体が載置される基板、励起光を出射する光源、前記被検体から発せられる光を分光し、前記励起光波長から前記被検体のラマン散乱光ピーク波長を含む所定波長範囲のスペクトルを測定する１つの分光器、前記励起光を前記被検体に照射し、該励起光の照射により前記被検体から発せられる光を前記分光器に導く共焦点光学系、前記被検体と前記分光器との間に配置され、前記被検体から発せられる光のうち前記励起光波長の光量を前記分光器の飽和光量の８０％以下、かつ、前記励起光波長の前記光量をＳ、前記分光器のノイズをＮとしたとき、Ｓ／Ｎが１００以上となるように調整する光量調整機構、および前記励起光を二次元走査する機構を備えた顕微分光装置と、
   該顕微分光装置により取得されたスペクトルに基づく画像を表示するモニタと、
   前記顕微分光装置による前記励起光の二次元走査に伴い前記分光器により測定された各スペクトルの前記励起光波長のデータから前記被検体の明視野像を求め、前記分光器により測定された各スペクトルの前記ラマン散乱光ピーク波長のデータから前記被検体のラマン分光画像を求め、前記モニタに前記明視野像と前記ラマン分光画像とを重ねて表示させる制御部とを備えてなるラマン分光画像取得システム。
2. 前記基板が前記励起光および前記ラマン散乱光に対して透明であり、
   前記光学系が前記励起光を前記基板の裏面に向けて照射するものであり、
   前記分光器が前記基板の裏面側から放射された前記被検体から発せられる光を分光測定するものである請求項１記載のラマン分光画像取得システム。
3. 前記光量調整機構がバンドパスフィルタを備え、該バンドパスフィルタの、前記被検体から発せられる光が分光器に向かう光軸に対する傾きを変化させて、前記励起光波長の光量を調整する請求項１または２記載のラマン分光画像取得システム。
4. 前記光量調整機構が検光子を備え、該検光子を前記励起光の偏光方向に対し回転させることで、前記励起光波長の光量を調整する請求項１または２記載のラマン分光画像取得システム。
5. 前記光量調整機構が複数枚のシャープカットフィルタまたは複数枚のバンドパスフィルタを備え、該シャープカットフィルタまたはバンドパスフィルタの枚数を変えることで、前記励起光波長の光量を調整する請求項１または２記載のラマン分光画像取得システム。
6. 前記基板が表面に金属の微細凹凸構造を備えてなる光電場増強デバイスである請求項１から５いずれか１項記載のラマン分光画像取得システム。
7. 前記制御部が、前記光量調整機構を制御して、前記励起光波長の光量を調整するものである請求項１から６いずれか１項記載のラマン分光画像取得システム。
8. ラマン分光画像取得方法において、
   被検体に対して励起光を照射し、該励起光の照射により前記被検体から生じた光を１つの分光器により分光測定し、該分光器に入射する前記光のうち励起光波長の光量が該分光器の飽和光量の８０％以下、かつ、前記励起光波長の前記光量をＳ、前記分光器のノイズをＮとしたとき、Ｓ／Ｎが１００以上となるように前記分光器に入射する前記光の前記励起光波長の光量を調整し、
   前記分光器に入射する前記励起光波長の光量を調整した状態で、前記励起光の照射位置を二次元走査させて、該励起光の二次元走査に伴い前記分光器により測定された各スペクトルの前記励起光波長のデータから前記被検体の明視野像を求め、前記分光器により測定された各スペクトルの前記ラマン散乱光ピーク波長のデータから前記被検体のラマン分光画像を求め、
   前記モニタに前記明視野像と前記ラマン分光画像とを重ねて表示させることを特徴とするラマン分光画像取得方法。