JP6141935B2

JP6141935B2 - 分子の解析と識別のための方法及び装置

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Publication number: JP6141935B2
Application number: JP2015196592A
Authority: JP
Inventors: ダニエルワイ−チョンソウ
Original assignee: ダニエルワイ−チョンソウ
Priority date: 2009-05-12
Filing date: 2015-10-02
Publication date: 2017-06-07
Anticipated expiration: 2030-05-12
Also published as: US8926904B2; JP2016047052A; WO2010132603A1; US9738927B2; HK1171783A1; EP3048445B1; CN105886391B; JP6381084B2; CN105886391A; CN102498201B; EP3048445A3; EP3048445A2; KR102070018B1; US20100292101A1; EP2430146A1; EP2430146B1; JP5820369B2; CN102498201A; JP2012526556A; US20150021183A1

Description

本出願は、２００９年５月１２日出願の米国仮特許出願第６１／１７７，５５３号の恩典を主張し、同仮出願をここに参考文献としてそっくりそのまま援用する。

本発明は、概括的には、分子を解析し識別することに関し、厳密には、リアルタイム式で持ち運びできるナノ孔ベース分子解析装置を提供することに関する。

核酸、デオキシリボ核酸（ＤＮＡ）、リボース核酸（ＲＮＡ）は、あらゆる有機生命体に存在し、固有の配列を有している。固有配列は、生来的にそれ自体が様々な生物剤に関して最も決定的な識別標示として役立つ。従って、ここでは広義にゲノム解析と呼ばれている核酸、ＤＮＡ、及び／又はＲＮＡの解析は、有機生命体の研究に非常に有用である。しかしながら、マイクロアレイ、ピロシーケンス法、合成による配列決定、連結反応による配列決定の様な、現在商業的に利用できる核酸配列決定技術は、様々な態様において極めて制限されている。例えば、これらの技術の幾つか又は全ては、リアルタイムの解析を遂行することができず、長時間のサンプル核酸増幅処置及びプロトコル（例えばポリメラーゼ連鎖反応など）を要し、一巡時間が長く（サンプル核酸の小断片を解析するのに約数日乃至数週間かかるのが典型的である）、運用面での費用が高く（中には高価な化学試薬を使用するものもある）、偽陽性誤差率が高く、持ち運びできない。

現在の核酸配列決定技術の以上の制限のために、この分野で働く人々、例えば医療専門家、保安職員、科学者などは、局限的に現場でゲノム解析を行うことができない。もっと正確にいえば、現場作業員らは、サンプルを収集して専門の研究所に輸送して解析してもらわねばならず、サンプルはその中に存在する核酸を識別するために数日間に亘って解析されるが、これには数週間かかることさえある。その様な長時間の冗漫なプロセスでは、今日のゲノム解析の必要性を満たすこと、特に英国での口蹄疫の流行やアジアでの重症急性呼吸器症候群（ＳＡＲＳ）の集団発生、それからメキシコ及び米国で最近あったＨ１Ｎ１インフルエンザ（一般にはブタインフルエンザとしても知られている）の集団発生の様な流行的集団発生時におけるゲノム解析の必要性を満たすことはほぼ望めない。現在の核酸配列決定技術を使用していては、当局が詳細な情報を得たうえでの迅速な決定を画策することが、不可能とはいえないまでも困難であり、安全及び経済的に甚大な影響を社会に及ぼしかねない。

上記の核酸配列決定技術の足りないところを解決するべく、科学者らは、様々なナノ孔ベース配列決定技術を開発した。最近では、オックスフォード大学のHagan Bayley教授と彼の協働者らが、生物ナノ孔実験でα‐ヘモリシンを使った９９．８％の精度のロングリードを実証した。確立された検出速度に基づくと、２５６ｘ２５６のナノ孔アレイは、概して、ヒトゲノム全体を約３０分以内で解析するのに十分である。これは、生物ナノ孔アレイを実現するのに成功できたなら、重大な転機をもたらす勝利となることであろう。しかしながら、生物ナノ孔の１つの欠点は、ナノ孔の形成に使用されるタンパク質及び酵素が比較的短命であり、典型的には数時間乃至数日の寿命であるということである。

固相ナノ孔は、その作製に生物試薬が関与していないため、より堅牢な生物ナノ孔代替物である。しかしながら、半導体産業で採用されている従来のリソグラフィー技術は、固相ナノ孔ベース配列決定技術が要求する２ｎｍ造形サイズを画定する能力がない。よって、全く異なる製作技法、例えば電子／イオンミリングを使用して、一度に１つずつ順次に複数のナノ孔が彫られている。しかしながら、これらの技法を、２５６ｘ２５６アレイを手ごろな費用で且つ妥当な生産時間で生産するべくスケール化することは無理である。

米国仮特許出願第６１／１７７，５５３号

分子の解析と識別を遂行するための装置及び方法を提示している。１つの実施形態では、持ち運びできる分子解析器は、サンプルを受け入れるサンプル入力／出力接続と、サンプルの解析を実質的にリアルタイムで遂行するナノ孔ベース配列決定チップと、解析の結果を出力する出力インターフェースを含んでいる。

本発明は添付図面の図に限定ではなしに一例として示されている。

ナノ孔ベース配列決定器及び関連のナノ孔ベース配列決定生物チップの１つの実施形態を示している。ナノ孔ベース核酸配列決定の検出及び解析中の分子の移送プロセスの１つの実施形態を示している。空の孔の背景信号と比較した核酸配列の対応する例示としての電気的読み出しを示している。ナノパントグラフィーでエッチングと堆積の両方に使用されるアインツェルレンズの１つの実施形態の側面図と上面図を示している。ナノ孔及び／又はナノ孔アレイを製作するための減法的な方法の１つの実施形態の一工程を示している。ナノ孔及び／又はナノ孔アレイを製作するための減法的な方法の前記１つの実施形態の一工程を示している。ナノ孔及び／又はナノ孔アレイを製作するための減法的な方法の前記１つの実施形態の一工程を示している。ナノ孔及び／又はナノ孔アレイを製作するための減法的な方法の前記１つの実施形態の一工程を示している。ナノ孔及び／又はナノ孔アレイを製作するための減法的な方法の前記１つの実施形態の一工程を示している。ナノ孔及び／又はナノ孔アレイを製作するための加法的な方法の１つの実施形態の一工程を示している。ナノ孔及び／又はナノ孔アレイを製作するための加法的な方法の前記１つの実施形態の一工程を示している。ナノ孔及び／又はナノ孔アレイを製作するための加法的な方法の前記１つの実施形態の一工程を示している。ナノ孔及び／又はナノ孔アレイを製作するための加法的な方法の前記１つの実施形態の一工程を示している。ナノ孔及び／又はナノ孔アレイを製作するための加法的な方法の前記１つの実施形態の一工程を示している。ナノ孔及び／又はナノ孔アレイを製作するための加法的な方法の前記１つの実施形態の一工程を示している。ナノ孔及び／又はナノ孔アレイを製作するための加法的な方法の前記１つの実施形態の一工程を示している。ナノ孔及び／又はナノ孔アレイを製作するための加法的な方法の前記１つの実施形態の一工程を示している。ナノ孔及び／又はナノ孔アレイを製作するための加法的な方法の前記１つの実施形態の一工程を示している。ナノリングの１つの実施形態とナノスリットの１つの実施形態を示している。測定室の下キャビティを形成するように貼り合わされたナノ孔アレイウェーハと集積回路ウェーハの１つの実施形態を示している。測定室の上キャビティを形成するように貼り合わされた上ウェーハと複合ウェーハの１つの実施形態を示している。ナノ孔ベース配列決定器と一体に作動可能な電圧バイアススキーム及び電流感知回路の１つの実施形態を示している。ナノ孔ベース配列決定器の１つの実施形態を示している。複式測定室の１つの実施形態を示している。ナノ孔ベース配列決定器の１つの実施形態の、サンプル取込口からマイクロ流体チャネル及びナノ流体チャネルに沿って測定室を通ってサンプル排出口に至るまでの選択された経路に沿った断面図を示している。埋め込み電極を備えた３層生物チップ構造の１つの実施形態を示している。ナノ孔検出のためのバイアス及び感知スキームの１つの実施形態を示している。平面電極実装の１つの実施形態を示している。平面電極実装における感知電極とナノスリットの１つの実施形態の上面図を示している。ナノ孔ベース配列決定器の１つの実施形態の高水準ハードウェアアーキテクチャを示している。ナノ孔ベース配列決定器の１つの実施形態におけるオペレーティングシステム及びゲノム解析ソフトウェアのためのソフトウェア及び関係のあるハードウェア構成要素の高水準アーキテクチャを示している。

次に続く説明では、本発明の実施形態が完全に理解されるようにするため、特定の構成要素、デバイス、及び方法などの例の様な、数多くの特定の詳細事項を述べている。しかしながら、当業者には、これらの特定の詳細事項は、本発明の実施形態を実践するうえで採用されなくてもよいことが自明であろう。また他に、本発明の実施形態がいたずらに曖昧になってしまうことを回避するために、よく知られている材料又は方法は詳細に説明していない場合もある。

核酸、アミノ酸、ペプチド、タンパク質、及びポリマーの様な分子や、カーボンナノチューブ、シリコンナノロッド、及び被覆／無被覆の金ナノ粒子の様なナノメートルサイズの粒子の解析と識別を遂行する装置及び方法の様々な実施形態を以下に説明する。以下の考察は、概念を説明するために、分子解析、即ちゲノム解析という１つの例に焦点を当てていることに留意されたい。当業者には、ここに開示されている技法は分子全般の解析及び識別に適用できることが容易に認識されるであろう。１つの実施形態では、ナノ孔ベース配列決定器は、持ち運びできるゲノム解析システムである。図１は、持ち運びできるナノ孔ベース配列決定器１１０及び関連のナノ孔ベース配列決定生物チップ１２０の１つの実施形態を示している。検出及び解析の間、被試験サンプル中の分子は、図２Ａに示されている様に、溶液の中で電気泳動的に操られてナノスケールの孔（ナノ孔とも呼称する）を通過させられる。幾つかの実施形態では、ナノ孔のサイズは約２ｎｍである。ナノ孔のサイズは、異なった実施形態では変えられてもよいことに留意されたい。例えば、幾つかの実施形態では、ナノ孔は固定の同一サイズである。幾つかの代わりの実施形態では、ナノ孔は異なったサイズである。また、ナノ孔の形状についても同様に、同一実施形態内又は異なった実施形態で、円形、楕円形、長形のスリットなどの様に変えられてもよい。ナノ孔内の限定された空間内の分子の相対サイズ及び移動速度によって、図２Ｂに表されている異なった振幅と持続期間の電流パルスの様な様々な電気特性が観測され、それらを利用して分子を識別することができる。その結果、被試験分子を破壊することなしに核酸配列の直接読み出しを実現することができる。換言すると、核酸配列を無傷に保ちながら核酸に測定を行うことができる。

ナノ孔アレイは幾つかの実施形態では約２ｎｍ孔のアレイを含んでいるものであって、その様なナノ孔アレイを根本的な制限なしに大量生産するのに多重製作技法が利用されてもよい。概念を説明するために、幾つかの例示となる製作技法の詳細事項を以下に詳しく論じる。当業者には、他の匹敵する製作技法又はそれらの技法の変型がナノ孔アレイを生産するように改造されてもよいことが理解されるであろう。マイクロ／ナノ流体チャネルのネットワークを組み込むことにより、ナノ孔ベース配列決定器は、かつてない速度で、人的介在なしに、正確にゲノムを解読することができる。

ゲノム解析の細かな形状因子や速度の他に、ナノ孔ベース配列決定器の幾つかの実施形態は次の様な追加の利点をもたらす。利点の１つは、生物剤中の何らかの突然変異に対する将来的な裏付けの容易作成である。これは、ナノ孔ベース配列決定が直接読み出し技法であり、それらの結果が被試験ゲノムの予備的知識を必要としないために可能になる。また、ナノ孔ベース配列決定器の幾つかの実施形態は、極限状況及び不浄環境で作動させることができ、というのも、ナノ孔はナノ孔ベース配列決定生物チップ内部に常時包囲された状態であり、解析プロセス全行程中に望まれない異物に曝されることがないため、ナノ孔については滅菌と清潔が常に保証されるからである。

手持ち式の持ち運びできるデバイスとして、ナノ孔ベース配列決定器の幾つかの実施形態は、多くの異なった産業及び科学における進歩を加速させることができる。例えば、商業並びに研究や開発において、ナノ孔ベース配列決定器の幾つかの実施形態は、基礎研究、薬理ゲノム学、細菌学的診断、病原体検出、農業、食品産業、バイオ燃料などで有用であろう。更なる例として、ナノ孔ベース配列決定器の幾つかの実施形態は、迅速なＤＮＡ科学捜査、上陸地生物スクリーニングなどで有用であろう。

ナノ孔ベース配列決定器のためのナノ孔アレイ
１９７０年代、コールター・カウンターの抵抗性パルス技法に基づき、DeBloisと同僚らは、粒子をそれらのサイズと電気泳動移動性によって特徴付ける場合の単一シングルサブミクロン直径孔の使用を実証することに成功した。その後、Deamerが、遺伝子配列決定のためにナノメートルサイズの孔を使用するという考えを提案した。彼と彼の同僚らは、一本鎖ＤＮＡ（ｓｓＤＮＡ）分子及び一本鎖ＲＮＡ分子を操って孔形成タンパク質を通過させ、このナノ孔を通るイオン電流に及ぼす効果によってそれら分子を検出できることを実証した。最近実証された速い配列決定速度を前提とすると、ナノ孔ベース配列決定の進展は、迅速なゲノム解析のための大型ナノ孔アレイを作り出すための安価な並行書き込み式製作プロセスがないせいで大きく阻まれる。従来のリソグラフィー法の多くや、電子ミリング、イオンミリング、及びシリコンエッチバックは、リアルタイムゲノム解析にとって必要とされるナノ孔アレイを製造するのに実行可能な手段ではない。最近になってようやく、ヒューストン大学のDonnellyと同僚らは、さほどの制限なしに２ｎｍナノ孔アレイを大量生産することのできるナノパントグラフィーの幾つかの実施形態を開発した。彼らのシミュレーション結果によれば、ナノパントグラフィーには、１ｎｍ程の小さいサイズのホール又はドットを画定する能力がある。マイクロ／ナノ流体工学の技術を取り入れることにより、ナノパントグラフィーは、リアルタイム又は近リアルタイムゲノム解析システムを実現する可能性を開く。

ナノパントグラフィーでは、幅の広い較正された単一エネルギーイオンビームが、導電性基板、例えばドープされたシリコン（Ｓｉ）ウェーハ上に製作されたサブミクロン直径の静電レンズ（図３に示されている様に、アインツェルレンズとも呼称される）のアレイに向かわされる。レンズ電極に適切な電圧を印加することにより、レンズに入射する「ビームレット」は、レンズの直径より１００倍も小さくなるスポットに合焦される。これは、現在の半導体加工で使用されているフォトリソグラフィー技術で取り扱うことのできる１００ｎｍのレンズで１ｎｍの造形を画定することができることを意味する。更に、それぞれのレンズは、各々のナノメートル造形を基板に書き込むため、ナノパントグラフィーは、合焦させた電子ビーム又はイオンビームの順次書き込みとはまったく異なる並行書き込みプロセスである。レンズアレイは基板の一部であるため、本方法は振動や熱膨張によって引き起こされる整列不良を実質的に免れる。ナノメートル造形のサイズは、事前に画定されるレンズのサイズによって制御することができ、それらレンズの直径は、同一であっても異なっていてもよく、即ち、同一又は異なったナノメートル造形のアレイを実質的に同時に加工することができるわけである。Ａｒ＋ビームをＣｌ₂ガスの存在下に用いて、直径１０ｎｍ、深さ１００ｎｍにエッチングされたＳｉホールが実証されている。エッチングは、イオンビームレットが合焦するように金属層に電圧を印加したホールだけに起こる。残りのホールは、上金属層に電圧が印加されず、ビームレットは合焦できず、電流密度は小さすぎて何らの感知され得るエッチングも生じさせない。

ナノパントグラフィーを用いる場合、ゲノム解析のためのナノ孔を製作するのに減法的方法と加法的方法の２つの方法がある。直接エッチング法の１つの実施形態をまず以下に論じ、それに続けて間接エッチング法の１つの実施形態を論じる。

Ａ．ナノ孔及び／又はナノ孔アレイを製作するための減法的方法の１つの実施形態
図４Ａ−図４Ｅは、ナノ孔及び／又はナノ孔アレイを製作するための減法的方法の１つの実施形態を示している。図４Ａを参照すると、窒化物４２０をＳｉ（１００）ウェーハ４１０上に堆積させている。図４Ｂでは、下側の導電材料４２２であるドープされたシリコン又は金属を堆積させ、これに続いて誘電体スペーサ４２４、そして上金属層４２６を堆積させている。次いで、多数のアインツェルレンズが画定される。図４Ｃを参照すると、導電材料４２２にナノパントグラフィーエッチングが施されてナノメートルホール４３０が画定されており、それらの孔が窒化物層４２０のナノ孔エッチングのためのハードマスクとして使用される。図４Ｄでは、アインツェルレンズが除去されている。次いで、ナノ孔４３０が保護のために酸化物４３５で被覆される。最終的に、図４Ｅでは、測定室の下キャビティ４４０が、化学的機械的研磨（ＣＭＰ）、リソグラフィー技法、及び水酸化カリウム（ＫＯＨ）エッチングによって、シリコン基板４１０の裏面に形成されている。次いで酸化物層４３５が除去されるとナノ孔４３０が露わになる。

Ｂ．ナノ孔及び／又はナノ孔アレイを製作するための加法的方法の１つの実施形態
図５Ａ−図５Ｉは、ナノ孔及び／又はナノ孔アレイを製作するための加法的方法の１つの実施形態を示している。図５Ａを参照すると、窒化物５２０をＳｉ（１００）ウェーハ５１０上に堆積させている。図５Ｂでは、下側の導電材料５２２であるドープされたシリコン又は金属、誘電体スペーサ５２４、そして上金属層５２６を堆積させている。次いで、複数のアインツェルレンズが画定される。図５Ｃでは、ナノロッド又はナノチューブ成長用のナノシード５３０を堆積させている。図５Ｄでは、ナノロッド又はナノチューブ５３５を成長させている。図５Ｅでは、酸化物層５４０を堆積させている。図５Ｆでは、ナノロッド又はナノチューブ５３５が除去されている。残った酸化物ナノメートルホール５５０が、導電層及び窒化物層のためのハードマスクとして使用される。図５Ｇでは、パターンが、酸化物層５４０から導電性層５２２に、次いで窒化物層５２０に転写されている。図５Ｈでは、アインツェルレンズが除去され、続いて酸化物層５４０が除去されている。ナノ孔が保護のために酸化物５５２で被覆される。最終的に、図５Ｉでは、測定室の下キャビティ５６０が、ＣＭＰ、リソグラフィー技法、及びＫＯＨエッチングによって、シリコン基板５１０の裏面に形成されている。次いで酸化物層５５２が除去されるとナノ孔５６５が露わになる。

図６は、本発明の幾つかの実施形態で使用できるナノスリットの１つの実施形態とナノリングの１つの実施形態を示している。細長いナノサイズのナノスリット６１０とナノリング６２０は、アインツェルレンズを用いた減法的方法の幾つかの実施形態（上述）によって画定することができ、図６に描かれている様に、それぞれに矩形と半円形の形状の開口部が得られる。当業者には、ここになされている開示に基づき、如何なる二次元形状であろうと同様のパターニング技法を使用して画定することができることが自明であろう。幾つかの実施形態では、プロセス全行程中、ウェーハステージは実質的に静止であるため、この非円形パターニング法は、ウェーハステージを傾ける従来式の方法が直面している主要な技術的課題のうち少なくとも３つを解消する。第１に、ウェーハステージを傾ける角度及び速度の精密制御の必要性がない。第２に、同法は、ウェーハを入射イオンビームに対して傾けることによって導入されてしまう線拡がり効果及び線幅不均一を概ね克服している。第３に、同法は、異なったパターン形状及びパターンサイズをほぼ同時に画定させることができる。

ナノ孔ベース配列決定生物チップ
減法的方法又は加法的方法の何れかを用いてナノ孔が形成された後、ナノ孔アレイウェーハ７５０は、図７に示されている様に、事前に製作されている集積回路７２０及びマイクロ流体チャネル７３０の上に貼り合わされることになる。これによって、測定室の下キャビティの形成が完了する。核酸サンプルは、所望に応じ、下ウェーハ側のマイクロ流体チャネルを通して生物チップから抽出される。

同様に、幾つかの実施形態では、集積回路８２０及び／又は流体チャネル８３０と一体の上ウェーハ８１０を、貼り合わされたナノ孔ウェーハ８４０及び下ウェーハ８５０を含んでいる複合ウェーハの上へ貼り合わせることによって、測定室の上キャビティが形成される。この３層ウェーハ構造８００が図８に示されている。電圧バイアススキーム９１０及び関連の電流感知回路９２０の１つの実施形態が図９に描かれている。デッドボリュームを最小限にした様な適切な流体Ｉ／Ｏ接続を備えて、次に３層複合ウェーハ８００は、ワイヤーボンディング又はベルグリッドワイヤーボンディングのための支持枠に搭載される。典型的なパッケージ化技法、例えばエポキシカプセル封入やセラミックパッケージ化を使用して、アッセンブリ全体を包囲し、ナノ孔ベース配列決定生物チップを形成することができる。代わりに、感知及びバイアスに関連する回路の様な集積回路は、ナノ孔ウェーハ８４０上に製作され、それが、集積回路を載せた別のウェーハではなくてブランク基板に貼り合わされてもよい。

また、幾つかの実施形態では、図１０Ａ及び図１１に示されている様に、上ウェーハ８１０側に埋め込まれている造形が更にもう２つあり、即ちマイクロ流体チャネル１０１０に沿ったサンプル案内電極１０１５と、測定室１０３０に通じるナノ流体チャネル１０１３である。ナノ孔ベース配列決定生物チップを通るサンプルの流れを更に説明するために、以下では１つの例を詳細に論じる。

緩衝剤取込口１０２５と緩衝剤排出口１０２７は、マイクロ流体チャネル１０１０とナノ流体チャネル１０１３と測定室１０３０のネットワークを、検出用のサンプル取込前に予め湿潤させ予め充填しておくためのものである。検出中、マイクロ流体チャネルの中の流体の流れは、オンチップ又はオフチップのマイクロポンプ及びマイクロ弁を使用して、緩衝剤の取込と排出の流量によって調節することができる。

１つの例では、一本鎖核酸分子のリン酸‐デオキシリボース主鎖には、それぞれの塩基セグメント毎に負電荷が帯電し、分子の５’末端には２つの負電荷が存在している。一連のサンプル案内電極１０１５に沿って、受け入れ溜め１０２０からサンプル取込口コネクタ１０２３を通って目的地の測定室１０３０まで正電圧が脈動することで、核酸分子が受け入れ溜め１０２０から抽出され、事前に指定されている測定室１０３０へ送達されることになる。同様に、下ウェーハにも、マイクロ流体チャネル１０１０に沿って、ナノ孔ベース配列決定生物チップから同様のやり方でサンプルを抽出するためのサンプル案内電極１０１７が埋め込まれている。

流体チャネルのネットワークに沿ったサンプル案内の同様のスキームを使用すれば、測定室１０４０の個数を２つ以上に拡張することができる。ツリー構造に配列されている測定室の一例が図１０Ｂに示されている。多数の独立した解析を遂行する能力の他に、幾つかの実施形態では、ＤＮＡ断片のサンプル受け入れ溜め１０２０から抽出されてくる順番がそれぞれの測定室に事前に割り当てられている。図１０Ｂに示されている様に、測定室１０４０は２桁の数字で標示されている。１桁目は枝番号を表し、２桁目は枝内での測定室の位置を表している。測定室１０４０の割り当て順は、単純に、昇順であってもよく、即ち、最も低い数字の室が最小に使用され、次は、その次に高い数字の室が使用されるというようにすることができる。このやり方では、枝内の測定室の全てが使用されてから、次の枝へ移ることになる。代わりにサンプルは、最も低い枝番号を最初に使用して、それぞれの枝の最も低い数字の室に割り当てられてもよく、即ち、現事例では１１、２１、３１、４１に割り当てられ、次に１２、２２、３２、４２に割り当てられ、以下同様に続く、というように割り当てられてもよい。この割り当て手法によれば、それぞれの枝の、中央マイクロ流体チャネルから最も離れた測定室が最初に割り当てられ、次に、それぞれの枝の次に離れた室が割り当てられることになる。この手法は、中央マイクロ流体チャネルのサンプル案内電極の電気信号の被測定信号に対する干渉を低減することができる。全部の測定が完了したら、ＤＮＡサンプル全体の配列が断片の抽出順に従って体系的に組み立てられる。このおかげで、ハイブリダイゼーションプロセスがサンプルの元の配列をランダム化し、正しい配列に繋ぎ合せるのに計算集約的で誤差を生じ易い検出後解析が必須である、マイクロアレイの様な、他の従来型の配列決定技術で必要とされる時間のかかる検出後解析が不要になる。また、断片の抽出順は記録されるので、断片を再度組み合わせて元のＤＮＡサンプルを形成することができる。他の従来の配列決定技術では、典型的に、元のサンプルは破壊され、将来的な使用に備えて回復させることはできない。

図１０Ａに戻って、上ウェーハと複合ウェーハのウェーハ貼り合わせによって形成されたナノ流体チャネル１０１３は、フィルタとして、サンプル流量制御器として、更には分子引張器としての機能を果たす。幾つかの実施形態では、ナノ流体チャネルは、上ウェーハ上の上電極をオンにしたりオフにしたりすることによってフィルタとしての機能を果たしており、マイクロ流体チャネルからサンプルを選択的に引き入れることを可能にする。幾つかの実施形態では、ナノ流体チャネルは、上電極と下電極の電圧を調節することによってサンプル流量制御器としての機能を果たしており、ナノ流体チャネルを通るサンプルの流量を制御することを可能にする。ナノ流体チャネル１０１３は、図１１に描かれている様に、一本鎖核酸分子１１０１がナノ流体チャネル１０１３を通過するときに天然の巻いた状態から引き伸ばされるので、分子引張器としての機能も果たしている。

幾つかの実施形態では、ナノ流体チャネルの速度制御性は、分子のより正確な解析が可能になるように活用される。図１２に示されている様に、感知電極１２０５がナノ孔１２２５に埋め込まれており、ナノ孔１２２５を通る分子の流れの制御においてはマイクロ／ナノチャネルネットワークの一体部分になっている。ナノ流体チャネルに加え、印加ＤＣ電圧は分子がナノ孔１２２５を通って移送されるときの分子の速度と方向を微調整するように設計されている。統計学的誤差を排除することによって分子識別の精度を高めるために、即ち偽陽性誤差率を低減できるように、上駆動電極１２３０及び下駆動電極１２３５それぞれと埋め込み感知電極１２０５とに印加されるＤＣバイアス電圧の大きさを交互に入れ替えることにより、被試験分子を引き出してナノ孔１２２５を通して何度も行来させて解析を繰り返すこともできる。

感知電極がナノ孔へ一体化されている幾つかの従来的な手法とは違い、ＤＮＡ中のそれぞれの塩基がナノ孔を通り抜けるには数ナノ秒しかかからないこともあり得る。その様な通過時間では何らかの意味のある測定をするには短すぎる。この短所の観点から、他の従来的な手法はナノ孔を通る分子の運動を減速させるように発展してきた。１つの従来的な手法は、余分の電極をナノ孔に埋め込むことにより、分子の速度を制御する電圧閉じ込めスキームを提案している。提案されている電圧閉じ込めスキームは、４つ又はそれ以上の導電電極を上下に積重し、それらの間に誘電性材料を挟むことによって導電電極同士を電気的に絶縁することが必要になるため、実装が難儀である。この多層フィルムに要求される２−３ｎｍのナノ孔を形成するとなると、アスペクト比が３０：１より大きくなり、これでは、現在の集積回路製作技術を用いて実現するのは不可能ではないにしても難しい。

図１３Ａに示されている様に、印加ＡＣ感知電圧１３１０が、分子がナノ孔１３２５を通って移送中に当該分子を取り調べるために用いられている。必然的に、分子を識別するのに様々な感知メカニズムを採用することができ、例えば、抵抗の変化、静電容量の変化、位相の変化、及び／又はトンネル電流を採用することができる。埋め込み感知電極１３０５と被試験分子が密に近接しているために、信号対ノイズ比が改善される。

上記の例示となるサンプル送達及びフィルタリングメカニズムは、ナノ孔測定室のアレイをどの様に実装することができるかを説明するための一例として供されている。当業者には、異なった実施形態では上記の送達及びフィルタリングメカニズムの変型が取り入れられてもよいことが認識されるであろう。また、例示されている方法を使用して、異なったサイズの孔のアレイを実現することもできる。α‐ヘモリシンの様なタンパク質の孔及び上述の固相ナノ孔のアレイと一体で、生物ナノ孔のアレイを実現することもできる。幾つかの実施形態では、上述の様に異なった導電層に置かれた積重式の電極の代わりに、両方の感知電極を同じ導電層の上へ設置することもできる。図１３Ｂは、この平面電極実装の１つの実施形態を示している。この平面電極実装では、両方の感知電極１３０７は、同じ導電層に設置されていて、それら感知電極１３０７の間にナノスリット１３２７が画定されている。感知電極１３０７とナノスリット１３２７の上面図が図１３Ｃに示されている。上述されている様に、ナノ孔とナノスリットはどちらもナノパントグラフィーを使用して画定することができる。

分子検出を実質的にリアルタイムで遂行する能力、単一分子検出を検出前サンプル増幅なしに遂行する能力、多重且つ実質的同時検出を実施する能力、多回通過検出を行う能力、サンプルを計算集約的検出解析なしに識別する能力、及び／又は検出後に将来的な使用に備えてサンプルを維持する能力は、幾つかの実施形態での低費用、高速、且つ正確なゲノム解析を提供する場合、例えば単一ヌクレオチド多形態を認知する場合には、正に不可欠である。

ナノ孔ベース配列決定器
ナノ孔ベース配列決定器は、持ち運びできるゲノム検出解析システムを提供している。幾つかの実施形態では、ナノ孔ベース配列決定器は、２大構成要素、即ち、ハードウェアとソフトウェアを含んでいる。高水準アーキテクチャ及びサブユニットの幾つかの実施形態を以下に論じる。

Ａ．ハードウェアシステム
幾つかの実施形態では、ナノ孔ベース配列決定器のハードウェアシステムは、２大ユニット、即ち、計算通信制御ユニット及びナノ孔ベース配列決定生物チップインターフェースユニットと、各種モジュールを含んでいる。高水準アーキテクチャの１つの実施形態が図１４に示されている。諸部分の詳細事項を以下に更に詳しく説明する。

Ｉ．計算通信制御ユニット
１つの実施形態では、ハードウェアシステム１４００は、ディスプレイデバイスを有する持ち運びできるコンピューティングシステム１４１０を含んでいる。これは、タブレット、ラップトップ、ネットブック、オールインワン型デスクトップコンピュータ、スマートフォン、携帯情報端末（ＰＤＡ）、又は何らかの手持ち式コンピューティングデバイスなど、を使用して実装されていてもよい。それは、オペレーティングシステム（ＯＳ）を稼働させ、データ解析ソフトウェアを実行し、データを記憶し、ナノ孔ベース配列決定生物チップの作動を制御し、ナノ孔ベース配列決定生物チップからデータを収集するための中枢ユニットである。

１つの実施形態では、ハードウェアシステム１４００は、更に、ネットワーク通信モジュール１４２０を含んでいる。ネットワーク通信モジュール１４２０は、WiFi、WiMAX、イーサネット、ブルートゥース、電話機能、衛星リンク、全地球測位システム（ＧＰＳ）などのうちの１つ又はそれ以上を含んでいる。ネットワーク通信モジュール１４２０は、データ共有化、プログラム更新、データ解析などのために中央のコンピューティングステムと通信したり、データを共有することができるように、そしてまたデータ解析を複数のコンピューティングデバイスで並行して実行させることができるように、他のコンピューティングデバイスと通信したり、データ共有化、プログラム更新などのために他のブルートゥース使用可能デバイス（例えばセルラー電話、プリンタなど）と通信したり、ＧＰＳ信号を送受信したりするための通信ハブとしての機能を果たしている。

１つの実施形態では、ハードウェアシステム１４００は、更に、入力デバイス１４３０を含んでいる。入力デバイス１４３０は、キーボード、タッチスクリーン、マウス、トラックボール、赤外線（ＩＲ）ポインティングデバイス、及び音声認識デバイスなどのうちの１つ又はそれ以上を含んでいてもよい。入力デバイス１４３０は、コマンドエントリとデータエントリのためのヒューマンインターフェースとしての機能を果たしている。

１つの実施形態では、ハードウェアシステム１４００は、更に、入力／出力（Ｉ／Ｏ）ポート１４４０を含んでおり、同ポートには、フラッシュメモリカードインターフェース、ＩＥＥＥ１３９４インターフェース、及びユニバーサルシリアルバス（ＵＳＢ）インターフェースなどを含めることができる。Ｉ／Ｏポート１４４０は、他の電子デバイスとのシリアルインターフェース、二次的なデータ記憶インターフェース、及びナノ孔ベース配列決定生物チップのための測定データＩ／Ｏとしての機能を果たしている。

II．ナノ孔ベース配列決定生物チップインターフェースユニット
幾つかの実施形態では、ナノ孔ベース配列決定（ｎＳｅｑ）生物チップインターフェースユニット１４５０は、ｎＳｅｑ電子モジュール１４６０、流体制御モジュール１４７０、化学薬品貯蔵及び流体Ｉ／Ｏ接続モジュール１４８０、及びｎＳｅｑ流体制御及びサンプルＩ／Ｏ接続モジュール１４９０に連結している。ｎＳｅｑ電子モジュール１４６０は、核酸分配モジュールを制御し、ナノ流体チャネルの流量を制御し、測定データを収集し、データを計算通信制御ユニットに出力する。

幾つかの実施形態では、流体制御モジュール１４７０は、化学薬品貯蔵部とｎＳｅｑ生物チップの間の流体流れを、緩衝剤取込口／排出口コネクタを介し、オンチップ／オフチップのマイクロポンプ及びマイクロ弁を使用して制御する。化学薬品貯蔵及び流体Ｉ／Ｏ接続モジュール１４８０は、必要に応じ化学薬品をｎＳｅｑ生物チップに供給することができ、化学薬品及び／又は生物廃棄物貯蔵部としての機能も果たすことができる。ｎＳｅｑ流体制御及びサンプルＩ／Ｏ接続モジュール１４９０は、ｎＳｅｑ生物チップ内の流体及びサンプルの流れを制御することの他に、ｎＳｅｑ生物チップのサンプル取込及び排出も制御することができる。例えば、図１０Ｂに戻って、測定室＃１１で検出を遂行したいと望んだ場合、枝＃１の緩衝剤排出口が開かれることになり、その間、他の全ての緩衝剤排出口は閉じられている。結果として、流体は、サンプル取込口から枝＃１に向かって流れ、マイクロ流体チャネルに沿ってサンプル案内電極と同期して協働し、サンプルを測定室＃１１に送達することになる。

Ｂ．ソフトウェアアーキテクチャ
図１５は、ナノ孔ベース配列決定器の１つの実施形態におけるオペレーティングシステム及びゲノム解析ソフトウェアのためのソフトウェア及び関係のあるハードウェア構成要素の高水準アーキテクチャを示している。示されているソフトウェアアーキテクチャ内の各種論理処理モジュールは、コンピュータ可読媒体に具現化されている命令を実行する処理デバイス（例えば図１４の持ち運びできるコンピューティングシステム１４１０など）により実装することができる。コンピュータ可読媒体には、コンピュータ（例えば、サーバ、パソコン、ネットワークデバイス、携帯情報端末、製造工具、１つ又はそれ以上のプロセッサのセットを備えた何らかのデバイスなど）がアクセスできる様式で情報を提供（即ち、記憶及び／又は送信）するあらゆるメカニズムが含まれる。例えば、コンピュータ可読媒体には、追記型／非追記型媒体（例えば、読取専用メモリ（ＲＯＭ）、ランダムアクセスメモリ（ＲＡＭ）、磁気ディスク記憶媒体、光学記憶媒体、フラッシュメモリデバイスなど）などが含まれる。

上述されている様に、計算通信制御ユニットにはオペレーティングシステム１５１０がインストールされている。オペレーティングシステム１５１０には、Windows、Linux、或いはコンピューティングデバイスにとって適したあらゆるオペレーティングシステムを含めることができる。計算通信制御ユニットにインストールされているオペレーティングシステム１５１０とは別に、ゲノム解析ソフトウェアは、更に、５つの処理モジュール、即ち、グラフィカルユーザーインターフェース（ＧＵＩ）１５２０、データビューア１５３０、ゲノムデータ解析部インターフェース１５４０、ゲノムデータ解析部１５５０、及びゲノムデータベース１５６０を含んでいる。オペレーティングシステム１５１０と上記処理モジュール１５２０−１５６０と他のハードウェア構成要素の間の対話の幾つかの実施形態を以下に図１５を参照しながら論じる。

幾つかの実施形態では、ゲノムデータ解析部インターフェース１５４０は、ゲノム解析ソフトウェアアーキテクチャ内でデータフロー制御ユニットの役目を務める。入力デバイスからコマンド及び／又は入力データを取得した後、オペレーティングシステム１５１０は、その情報をゲノムデータ解析部１５５０へゲノムデータ解析部インターフェース１５４０を通して送信する。するとゲノムデータ解析部１５５０はしかるべく活動する。適正なコマンド（例えば、GET、ADDなど）を用いて、ゲノムデータ解析部インターフェース１５４０はＩ／Ｏポート１５７０とゲノムデータベース１５６０の間のデータフローを制御して、データベース１５６０に記憶されているデータが送り出されたり更新されたりするようにする。同様に、解析部ソフトウェアは、Ｉ／Ｏポート１５７０及び／又は入力デバイス１５８０を介して定期的に更新されることになる。ゲノムデータ解析部インターフェース１５４０は、ｎＳｅｑ生物チップを監視するためにｎＳｅｑ生物チップインターフェース１５９０にも連結されている。ｎＳｅｑ生物チップの状態が監視され、解析部インターフェース１５４０を介してディスプレイユニット（例えば図１４の持ち運びできるコンピューティングシステム１４１０のディスプレイデバイスなど）に表示される。ゲノムデータ解析部インターフェース１５４０は、更に、ゲノムデータ解析部１５５０から結果を受け取り、それらをディスプレイユニットに表示する。

幾つかの実施形態では、ゲノムデータ解析部１５５０は、ゲノム解析ソフトウェアの主データ解析ユニットである。それは、ｎＳｅｑ生物チップから測定値を取得し、解析を遂行し、次いで結果をデータベース１５６０に記憶されているデータと比較して生物剤を識別する。解析結果は、ディスプレイユニットに表示され、将来的な参照に備えてデータベース１５６０に記憶される。

ゲノムデータベース１５６０は、既存の生物剤及び新たに発見された核酸配列を記憶するためのデータ収納庫である。データビューア１５３０は、その他のユニットのうちの一部又は全部からデータ及び情報を受け取り、それらをディスプレイデバイスに表示する、ソフトウェアルーチンを含んでいる。

以上、持ち運びできて且つリアルタイム式の分子解析と識別のための方法及び装置を説明してきた。これまでの説明から、本発明の諸態様は、少なくとも一部はソフトウェアに具現化され得ることが自明であろう。即ち、本技法は、コンピュータシステム内で、或いは他のデータ処理システム内で、それ自身のプロセッサがメモリに格納されている各一連の命令を実行すると、それに応えて実施されるようにしてもよい。様々な実施形態では、ハードワイヤード型回路構成をソフトウェア命令と組み合わせて使用し本発明を実装することができる。よって、本技法は、ハードウェア回路構成とソフトウェアの何らかの特定の組合せに限定されるものでもなければ、データ処理システムに実行させる命令の何らかの特定のソースに限定されるものでもない。加えて、本記述全体を通して、説明を簡潔化するために、様々な機能及び動作はソフトウェアコードによって遂行される或いは引き起こされるものとして記述されているかもしれない。しかしながら、当業者には、その様な表現が意味するものがプロセッサ又は制御器によるコードの実行の結果もたらされる関数であることが認識されるであろう。

本明細書全体を通して、「１つの実施形態」又は「或る実施形態」という言い方は、当該実施形態に関連付けて説明されている特定の特徴、構造、又は特性が、本発明の少なくとも１つの実施形態に含まれていることを意味するものと理解されたい。よって、強調しておくが、本明細書の様々な部分で「幾つかの実施形態」又は「１つの実施形態」或いは「或る代わりの実施形態」という言い方が２回又はそれ以上されていても、必ずしもどれもが同じ実施形態を指しているとは限らないものと理解されたい。また、特定の特徴、構造、又は特性は、本発明の１つ又はそれ以上の実施形態で適宜に組み合わされてもよい。また、本発明は幾つかの実施形態の観点から説明されているが、当業者には、本発明は説明されている実施形態に限定されないことが認識されるであろう。本発明の実施形態は、付随の特許請求の範囲の請求項の範囲内で修正や変更を加えて実践することもできる。従って明細書及び図面は、本発明に制限を課すものではなく説明を目的とするものと見なされるべきである。

１１０ナノ孔ベース配列決定器
１２０ナノ孔ベース配列決定生物チップ
４１０ウェーハ、シリコン基板
４２０窒化物
４２２導電材料
４２４誘電体スペーサ
４２６上金属層
４３０ナノメートルホール
４３５酸化物
４４０下キャビティ
５１０ウェーハ
５２０窒化物
５２２導電材料
５２４誘電体スペーサ
５２６上金属層
５３０ナノシード
５３５ナノロッド又はナノチューブ
５４０酸化物層
５５０酸化物ナノメートルホール
５６０下キャビティ
５６５ナノ孔
６１０ナノスリット
６２０ナノリング
７２０集積回路
７３０マイクロ流体チャネル
７５０ナノ孔アレイウェーハ
８００３層ウェーハ構造
８１０上ウェーハ
８２０集積回路
８３０流体チャネル
８４０ナノ孔ウェーハ
８５０下ウェーハ
９１０電圧バイアススキーム
９２０電流感知回路
１０１０マイクロ流体チャネル
１０１３ナノ流体チャネル
１０１５、１０１７サンプル案内電極
１０２０受け入れ溜め
１０２３サンプル取込口コネクタ
１０２５緩衝剤取込口
１０２７緩衝剤排出口
１０３０、１０４０測定室
１１０１一本鎖核酸分子
１２０５感知電極
１２２５ナノ孔
１２３０上駆動電極
１２３５下駆動電極
１３０５、１３０７感知電極
１３１０印加ＡＣ感知電圧
１３２５ナノ孔
１３２７ナノスリット
１４００ハードウェアシステム
１４１０持ち運びできるコンピューティングシステム
１４２０ネットワーク通信モジュール
１４３０入力デバイス
１４４０入力／出力（Ｉ／Ｏ）ポート
１４５０ナノ孔ベース配列決定（ｎＳｅｑ）生物チップインターフェースユニット
１４６０ｎＳｅｑ電子モジュール
１４７０流体制御モジュール
１４８０化学薬品貯蔵及び流体Ｉ／Ｏ接続モジュール
１４９０ｎＳｅｑ流体制御及びサンプルＩ／Ｏ接続モジュール
１５１０入力／出力（Ｉ／Ｏ）ポート
１５２０グラフィカルユーザーインターフェース（ＧＵＩ）
１５３０データビューア
１５４０ゲノムデータ解析部インターフェース
１５５０ゲノムデータ解析部
１５６０ゲノムデータベース
１５７０Ｉ／Ｏポート
１５８０入力デバイス
１５９０ｎＳｅｑ生物チップインターフェース

Claims

ナノスリットベース配列決定の方法であって、
ａ．持ち運びできる分子解析器への分子サンプルの入力に関連する測定データを、前記持ち運びできる分子解析器におけるナノスリットベース配列決定チップから受信するステップと、
ｂ．前記測定データの分析を実行し、前記サンプルにおける分子を識別するステップと、
を含み、
前記ナノスリットベース配列決定チップは、前記サンプルの分子の一又は二以上の電気特性を測定するように構成され、そして、少なくとも一組の埋め込み感知電極をそれぞれが含む複数のナノスリットを定義するナノスリットアレイウェーハを含み、前記埋め込み感知電極の各組が前記ナノスリットの反対側に位置する、方法。
前記ナノスリットベース配列決定チップは、前記測定データを、前記少なくとも一組の埋め込み感知電極を用いて、前記複数のナノスリットの少なくとも一つにおける抵抗の変化、静電容量の変化、位相の変化、又は、電流の変化を検出することによって得る、請求項１に記載の方法。
前記電流は、トンネル電流を含む、請求項２に記載の方法。
前記複数のナノスリットそれぞれは、１つ又はそれ以上のナノ流体チャネル及び１つ又はそれ以上のマイクロ流体チャネルと流体で伝達を行う、請求項１に記載の方法。
前記ナノスリットベース配列決定チップは、前記測定データを、前記少なくとも一組の埋め込み感知電極を用いて、電圧閉じ込めを行い、前記ナノスリットを介して前記分子の移送の速度を制御することによって得る、請求項１に記載の方法。
前記ナノスリットベース配列決定チップは、前記測定データを、前記少なくとも一組の埋め込み感知電極を用いて、交流電流を印加し、前記ナノスリットを介した前記分子の移送の間、電気信号を検出することによって得る、請求項１に記載の方法。
前記ナノスリットベース配列決定チップは、前記測定データを、前記複数のナノスルットの外部の電極を用いて、前記複数のナノスリットの少なくとも一つに電位を印加することによって得る、請求項１に記載の方法。
請求項１に記載の配列決定の方法を実行するための携帯型分子解析器であって、
ａ．サンプルを受けるよう構成されたサンプル取込口と、
ｂ．前記サンプルの１つ又はそれ以上の電気特性を測定するよう構成されたナノスリットベース配列決定チップであって、前記サンプル取込口と流体で伝達を行い、少なくとも一組の埋め込み感知電極をそれぞれが含む複数のナノスリットを定義するナノスリットアレイウェーハを含むナノスリットベース配列決定チップと、
を備え、
前記埋め込み感知電極の各組が前記ナノスリットの反対側に位置する、携帯型分子解析器。
前記複数のナノスリットそれぞれは、異なる材料で作成される複数の層を含む、請求項８に記載の携帯型分子解析器。
前記埋め込み感知電極の各組は、第１の電極及び第２の電極を有し、前記第１の電極及び前記第２の電極は、少なくとも一つの前記ナノスリットの長さに沿ってと同じ深さである、請求項８に記載の携帯型分子解析器。
前記複数の埋め込み感知電極は、少なくとも一つの前記ナノスリットの少なくとも二つの層に形成される、請求項８に記載の携帯型分子解析器。
前記複数の埋め込み感知電極は、少なくとも一つの前記ナノスリットにおける抵抗の変化、静電容量の変化、位相の変化、又は、電流の変化を検出するよう構成されている、請求項８に記載の携帯型分子解析器。
前記電流は、トンネル電流を含む、請求項１２に記載の携帯型分子解析器。
前記携帯型分子解析器は、前記複数のナノスリットの少なくとも一つの上で前記携帯型分子解析器に取り付けられた上電極と、少なくとも一つの前記ナノスリットの下で前記携帯型分子解析器に取り付けられた下電極とを備え、少なくとも一つの前記ナノスリットは、前記上電極と前記下電極との間の電気伝達のための経路を提供する、請求項８に記載の携帯型分子解析器。
前記下電極又は前記上電極は、集積回路と電気的に伝達を行う、請求項１４に記載の携帯型分子解析器。
前記集積回路は、電圧バイアススキーム又は電流感知回路を含む、請求項１５に記載の携帯型分子解析器。
前記ナノスリットベース配列決定チップは、１つ又はそれ以上のナノ流体チャネル及び１つ又はそれ以上のマイクロ流体チャネルと流体でそれぞれが伝達を行う複数のナノスリットを画定しているナノスリットアレイウェーハを備える、請求項８に記載の携帯型分子解析器。
前記１つ又はそれ以上のマイクロ流体チャネルは、前記１つ又はそれ以上のマイクロ流体チャネルに沿ってサンプルを導くよう構成された案内電極を備え、前記１つ又はそれ以上のナノ流体チャネルは、前記１つ又はそれ以上のナノ流体チャネルに沿ってサンプルを導くよう構成された案内電極を備えている、請求項１７に記載の携帯型分子解析器。