JP6138928B2 - 医薬に使用されるｎｏｔｃｈシグナル伝達経路及び分泌の阻害物質 - Google Patents

Description

本発明は、がん又は細胞老化に伴う老化現象等の分泌依存性疾患の治療用のｎｏｔｃｈシグナル伝達経路及び／又は分泌の阻害物質としての化学化合物、更にはその医薬組成物及び治療方法に関する。

Ｎｏｔｃｈは細胞分化、側方抑制及び組織恒常性に関与する遺伝子転写の重要な調節因子である。Ｎｏｔｃｈシグナル伝達では、Ｎｏｔｃｈ前駆体タンパク質がタンパク分解的切断によりトランスゴルジ網で活性化される。この切断により活性Ｎｏｔｃｈ受容体を含む２つの断片が生成し、この活性Ｎｏｔｃｈ受容体が続いて細胞膜（ＰＭ）へと移行する。Ｄｅｌｔａ／Ｓｅｒｒａｔｅ／Ｊａｇｇｅｄファミリーに由来するそのリガンドとの相互作用の後、活性Ｎｏｔｃｈ受容体は続いてＡＤＡＭ１７、最後にガンマ−セクレターゼによってプロセシングされ、Ｎｏｔｃｈ細胞内ドメイン（ＮＩＣＤ）が生成する。ＮＩＣＤは核に移行し、そこでＣＳＬファミリー（脊椎動物におけるＣＢＦ１（ＲＢＰ−Ｊ）、ショウジョウバエにおけるＳｕ（Ｈ）、カエノラブディティス・エレガンス（C. elegans）におけるＬａｇ−１）の転写因子を活性化する。ＮＩＣＤは幾つかのアンキリン反復と、ＣＳＬの活性化に不可欠なＮ末端ＲＡＭドメインとから構成される（概説については^１を参照されたい）。さらに、Ｎｏｔｃｈシグナル伝達経路の特徴的かつ重要な特質の１つは二次メッセンジャーの非依存性である。このため、核内のＮＩＣＤの量はプロセシングされるＮｏｔｃｈ受容体の量に比例する。

ＮＩＣＤをＰＭから放出させる最終切断段階はガンマ−セクレターゼによって媒介される。ガンマ−セクレターゼはプロテアーゼ活性を有するヘテロ多量体内在性膜タンパク質である^２。相互作用タンパク質及び潜在的調節タンパク質が示されているが^３〜６、ガンマ−セクレターゼの調節について一般に受け入れられる見解は殆どない。Ｎｏｔｃｈシグナル伝達は細胞外ドメインでのグリコシル化、Ｎｕｍｂのような阻害物質との相互作用、ＮＩＣＤのユビキチン化及びリン酸化からガンマ−セクレターゼ切断部位での僅かな変化までの幾つかの段階で微調整され得る（概説については^１を参照されたい）。微調整により受容体の輸送、リガンド結合親和性、受容体のエンドサイトーシス速度及びＮＩＣＤの安定性が調節され得る^１，７。Ｎｏｔｃｈシグナル伝達に関する豊富な情報にもかかわらず、その輸送及びシグナル伝達の調節は完全には理解されていない。

異常なＮｏｔｃｈシグナル伝達、例えば現在のＴ細胞系急性リンパ芽球性白血病（Ｔ−ＡＬＬ）の場合の治療的介入はリガンド結合及びガンマ−セクレターゼ切断のレベルで目指され／試験されているが、新規の戦略が大いに望まれている^８，９。

ブレフェルディンＡ（ＢＦＡ）、志賀毒素又はコレラ毒素のような天然化合物が、膜輸送の分子詳細をエキソサイトーシス経路又はエンドサイトーシス経路の様々な段階で調査する非常に有益な手段となっている^１０。同様に、ガンマ−セクレターゼ関連研究はＤＡＰＴ又はＬ６８５，４５８等のガンマ−セクレターゼ阻害物質（ＧＳＩ）の同定がなければこれほどの成功は収められなかった。これら及び他のＧＳＩはガンマ−セクレターゼの阻害だけでなく、その精製、ガンマ−セクレターゼ複合体における構造機能相関の解明及び基質ドッキング部位の同定にも非常に有益なものとなっている（１３）。

ハイコンテントスクリーニング（ＨＣＳ）とは、ユーザの介入がない又は僅かな細胞又は生物の表現型の自動画像収集プロセス及び画像分析アルゴリズムによるそれらの表現型のその後の自動分析を表し、全ゲノムＲＮＡｉ又は大規模化学化合物ライブラリー等のハイスループット用途を可能にするものである（概説については１４を参照されたい）。

様々な革新的なスクリーニング戦略が適用されているにもかかわらず、当該技術分野では医薬に適用されるｎｏｔｃｈシグナル伝達経路の更なる阻害物質を見出す必要がある。

Ｎｏｔｃｈシグナル伝達が様々ながんにおいて誤調節されているという発見に基づき、ＧＳＩががんの治療に適用されている。Ｎｏｔｃｈシグナル伝達経路は、がん形成に加えて発生段階における細胞運命を調節する分子機構の重要な構成要素である。Ｎｏｔｃｈ経路の異常活性化は腫瘍形成に寄与する。ヒトがんにおけるＮｏｔｃｈの重要な役割は、ヒトがんにおけるＮｏｔｃｈ遺伝子の活性化突然変異の存在及び増幅、並びにＮｏｔｃｈシグナル伝達経路の遺伝子が潜在的治療標的となり得ることの実証によって明らかになっている。Ｎｏｔｃｈ経路における主要な治療標的の１つはＮｏｔｃｈ受容体であり、γ−セクレターゼ阻害物質がＮｏｔｃｈ分子の発がん性（細胞内）ドメインの生成を防ぎ、Ｎｏｔｃｈ活性を抑制する。したがって、更なるｎｏｔｃｈ阻害物質が潜在的がん治療剤として求められている。

ガンマ−セクレターゼ阻害物質の有望な効果にもかかわらず、既知の阻害物質には患者の治療中及び治療後の重大な副作用が多い。主要な副作用は嘔気、下痢、嘔吐、体重減少及び／又は食欲不振等の胃腸毒性に関するものである。

したがって、本発明はＮｏｔｃｈ阻害物質としてこれまで同定されていない新規の化合物を提供する。さらに、本発明の化合物は分泌抑制機能を示し、膜輸送に関与し、小胞体出口前（pre-ER exit）の段階で分泌を阻害する。前臨床アッセイにおける本発明の化合物の投与の効果は、初期段階での分泌の撹乱に加えてｎｏｔｃｈ表現型を示す。この効果により、本明細書に開示される化合物を分泌又は分泌経路と関連する疾患の治療において投与することが可能となる。

かかる病態の一例は、細胞老化が起こると老化細胞がその増殖能を失い、炎症性サイトカインの分泌増加を示すという細胞老化に伴う老化現象であり、これは「細胞老化関連分泌現象（senescence associated secretory phenotype；ＳＡＳＰ）」としても知られている。

核ＤＮＡ損傷の蓄積は老化現象の分子的原因の１つである。したがって、多数のヒト組織においてＤＮＡ損傷の年齢に依存した蓄積が存在し、早期老化につながる遺伝的疾患はＤＮＡ損傷修復に関与する遺伝子の突然変異に起因することが多く、動物モデルによりＤＮＡ損傷蓄積が早期老化につながるという概念実証が得られた。細胞は細胞死（アポトーシス）、細胞周期停止（細胞老化）又は損傷細胞の自己消化（自食作用）の誘導により損傷細胞の組織恒常性への寄与を防ぐチェックポイントを活性化することによってＤＮＡ損傷に応答する。

老化細胞は増殖能を失い、炎症性サイトカインの分泌増加を示すが、これは「細胞老化関連分泌現象（ＳＡＳＰ）」としても知られている。ＳＡＳＰは隣接する非老化細胞に作用し、組織老化及びがん形成に影響を及ぼす可能性があることが示されている。ＳＡＳＰを阻害する方法又は手段は組織機能障害を遅らせ、健康寿命を延ばし得る。

分泌経路の構造及び組成におけるＳＡＳＰに起因する変化についてはほとんど知られていない。細胞老化はゴルジ体の分散、リソソーム量の増大、リソソームリポフスチン凝集の増大及びリソソーム酵素β−ガラクトシダーゼの発現増加のような分泌経路の形態変化と関連する。ＳＡＳＰと関連する分泌表現型を考えると、分泌の阻害物質はＳＡＳＰと関連する病気を治療する有望な手段となる。現在のところ、ＳＡＳＰ関連疾患の治療に効果的な治療アプローチは知られておらず、かかる障害の治療に適切な分泌阻害物質が必要とされている。

したがって、本発明の化合物は、がん又は老化現象等の分泌依存性疾患の治療用の化合物に所望される特性を示すＦＬＩ−０６及び構造的に類似した誘導体に関する。

構造的に類似した化合物は、これまで種々の生物学的効果との関連で又は種々の病状の治療のために開示されている。特許文献１は、ヘッジホッグシグナル伝達経路のアンタゴニストとして本発明の化合物と構造的に類似した化合物を開示している。しかしながら、特許文献１に開示される化合物は、分泌又はｎｏｔｃｈシグナル伝達阻害との関連で言及されておらず、更には異なる構造特性を示す。例えば、本発明の式ＩのＲ２のエステル位置は、対応位置でアルコキシメトキシエチル基を示す特許文献１の化合物とは異なる。

特許文献２は、ＲＡＳ特異的抗がん剤として本発明の化合物と構造的に類似した化合物を開示している。しかしながら、特許文献２に開示される化合物は、分泌又はｎｏｔｃｈシグナル伝達阻害との関連で言及されておらず、更には異なる構造特性を示す。例えば、本発明の式ＩのＲ２のエステル位置は、対応位置でアルコキシ基を示す特許文献２の化合物とは異なる。さらに、特許文献２の化合物はＲ６の代わりにフェニル置換基を示す。その上、特許文献２に開示される化合物は本発明の式Ｉの化合物と比較して異なる中心環構造を示す。

特許文献３は、アンドロゲン受容体陽性がん細胞の治療のための本発明の化合物と構造的に類似した化合物を開示している。しかしながら、特許文献３に開示される化合物は、分泌又はｎｏｔｃｈシグナル伝達阻害との関連で言及されておらず、更には異なる構造特性を示す。例えば、本発明の式ＩのＲ２のエステル位置はフェニルエチル基を示す特許文献３の化合物とは異なる。本発明の請求項に係る化合物と構造的類似性を示し、がん治療を意図する当該技術分野で開示される化合物のいずれも、２つのメチル基による７位のヘキサヒドロキノリン環の置換を示さないことに注目すべきである。

特許文献４も本発明の化合物と構造的に類似した化合物を開示している。特許文献４の化合物はアルツハイマー病の治療との関連でしか開示されず、分泌又はｎｏｔｃｈシグナル伝達阻害との関連では言及されていない。

国際公開第２００９／１０２８６４号 国際公開第２００８／１０３４７０号 国際公開第２０１１／０５０３５３号 国際公開第２００８／０７０８７５号

本発明の化合物は、自動顕微鏡法によるリガンド非依存性Ｎｏｔｃｈ−ＧＦＰレポーターの膜輸送及びプロセシングのモニタリングのために確立されたアッセイの生成物であった。１６６７１個の低分子化合物をスクリーニングし、関連候補を細胞アッセイ及びｉｎ ｖｉｔｒｏアッセイにより、またゼブラフィッシュをｉｎ ｖｉｖｏモデルとして用いて検証した。ＦＬＩ−０６はブレフェルディンＡ及びゴルジシドＡとは異なり、ゴルジ装置を撹乱することによって機能する。詳細な分析によりＦＬＩ−０６が小胞体出口前段階で分泌を阻害することが明らかとなり、ＦＬＩ−０６は分泌輸送をそのような初期段階で遮断する初めて同定された化合物である。本明細書で試験される本発明の更なる誘導体も分泌及び膜輸送の同様の撹乱を示す。選択された化合物の分子特性決定により、小胞体出口部位へのカーゴ動員を阻害する独特な特性を有する小胞体搬出の新規の阻害物質が同定された。

したがって、本発明は新規のタイプの分泌阻害物質であるＦＬＩ−０６及びその誘導体に基づく。他の分泌阻害物質とは対照的に、重大な小胞体ストレスは誘導されない。ＦＬＩ−０６及びその誘導体は、小胞体ストレス媒介アポトーシスを誘導することなく分泌を阻害又は低減する有用な薬剤である。

膜輸送及び分泌の撹乱並びにｎｏｔｃｈシグナル伝達阻害と、分泌依存性疾患の治療との組合せは当該技術分野において新規かつ自明でない発展である。この化合物、機構及び医学的使用の組合せは、既知のｎｏｔｃｈ阻害物質のいずれに関してもこれまで提案されていなかった。この組合せ（本発明の化合物に共通する）は従来技術に対して独自の貢献をなすものである。

従来技術に鑑みると、本発明の基礎をなす技術的課題は、医薬に使用される分泌の阻害によりｎｏｔｃｈシグナル伝達を阻害する化合物の提供、特に既知のｎｏｔｃｈ阻害物質よりも副作用の少ない薬学的に活性な化合物の提供である。

この課題は独立請求項の特徴によって解決される。本発明の好ましい実施の形態は従属請求項によって提供される。

したがって、本発明は、分泌依存性疾患の治療用の薬剤として使用されるｎｏｔｃｈシグナル伝達経路の阻害物質としての下記一般式Ｉに従う化合物に関する：
（式中、Ｒ１は
の１つであり、
ここで、ＸはＨ又はハロゲン、好ましくはＦ、Ｃｌ、Ｂｒ又はＩであり、ＹはＣＯＯＣＨ_３若しくはＣＦ３、又はＣＯＯＨであり、
Ｒ２はＣ_１〜Ｃ_８の直鎖若しくは分岐アルキル基、又はＣ_５〜Ｃ_８の炭素環構造、好ましくは、
の１つであり、
Ｒ３はＨ、又はＣ_１〜Ｃ_６の直鎖若しくは分岐アルキル基であり、
Ｒ４はＨ、又はＣ_１〜Ｃ_６の直鎖若しくは分岐アルキル基、好ましくは、
から選択される分岐アルキル基であり、
Ｒ５はＨ、又はＣ_１〜Ｃ_６の直鎖若しくは分岐アルキル基であり、
Ｒ４及びＲ５がＣ_３基により閉環して、基：
を有するＣ_６環構造を形成してもよく、
ここで、Ｒ６及び／又はＲ７はＨ、又はＣ_１〜Ｃ_６の直鎖若しくは分岐アルキル基であり、
置換基Ｒ１、Ｒ２、Ｒ４、Ｒ５の「Ｒ」は一般式Ｉの骨格を表す）。

本発明の好ましい実施の形態では、式Ｉの化合物は、下記一般式ＩＩを有することを更に特徴とする：
（式中、Ｒ１〜Ｒ３は式Ｉに規定される通りであり、Ｒ６及び／又はＲ７はＨ、又はＣ_１〜Ｃ_６の直鎖若しくは分岐アルキル基である）。

したがって、本発明は、下記一般式Ｉ及び／又はＩＩに関する：
（式中、Ｒ１は、
の１つであり、
ここで、ＸはＨ又はハロゲン、好ましくはＦ、Ｃｌ、Ｂｒ又はＩであり、ＹはＣＯＯＣＨ_３又はＣＦ３、ＣＯＯＨであり、
Ｒ２はＣ_１〜Ｃ_８の直鎖若しくは分岐アルキル基、又はＣ_５〜Ｃ_８の炭素環構造、好ましくは、
の１つであり、
Ｒ３はＨ、又はＣ_１〜Ｃ_６の直鎖若しくは分岐アルキル基であり、
Ｒ４はＨ、又はＣ_１〜Ｃ_６の直鎖若しくは分岐アルキル基、好ましくは、
から選択される分岐アルキル基であり、
Ｒ５はＨ、又はＣ_１〜Ｃ_６の直鎖若しくは分岐アルキル基であり、
Ｒ６、Ｒ７はＨ、又はＣ_１〜Ｃ_６の直鎖若しくは分岐アルキル基であり、
置換基Ｒ１、Ｒ２、Ｒ４の「Ｒ」は一般式Ｉ−ａ又はＩ−ｂの骨格を表す）。

好ましい実施の形態では、本発明の化合物は下記一般式ＩＩＩを有することを特徴とする：
（式中、Ｒ１はＨ、ＣＯＯＣＨ_３、ＣＯＯＨ、ＣＮ、ＮＯ_２、ＣＦ_３又はＮＨ_２であり、Ｒ２はＣ_１〜Ｃ_８、好ましくはＣ_２〜Ｃ_６の直鎖若しくは分岐アルキル基、又は好ましくはＣ_５、Ｃ_６、Ｃ_７若しくはＣ_８の炭素環構造である）。

本発明はさらにＲ２〜Ｒ７が式Ｉ、ＩＩ、又はＩＩＩに規定される通りであり、Ｒ１が、
である、式Ｉ、ＩＩ又はＩＩＩのいずれか１つに従う構造を有する化合物に関する。

本発明の特定の化合物は、分泌依存性疾患の治療用の薬剤として使用されるｎｏｔｃｈシグナル伝達経路の阻害物質としての下記ＦＬＩ−０６、ＦＬＩ−２４、ＦＬＩ−２５、ＦＬＩ−２６、ＦＬＩ−２７及び／又はＦＬＩ−２８からなる群から選択されるものに関する。

本発明の好ましい実施の形態では、分泌依存性疾患の治療への医学的使用は、分泌依存性疾患が、病因、発生機序、形態学的特徴及び／又は臨床症状が細胞分泌及び／又は分泌経路への依存、及び／又は（例えば健常被験体又は関連対照と比較して）正常値を超えるレベルの分泌化合物、好ましくはタンパク質の分泌レベルを特徴とする疾患から選択され、該疾患の治療における治療効果が細胞分泌の阻害によって生じると更に規定される。関連対照は疾患を示さない個体、又は病状に寄与しない若しくは僅かにしか寄与しないタンパク質若しくは他の物質の幾らかの分泌を示す個体に関するものであり得る。

本明細書に記載の化合物は分泌経路、特に小胞体及び／又はゴルジ装置を撹乱する。これは本明細書に開示される化合物に共通した有益な技術的効果であり、従来技術においてＮｏｔｃｈ経路阻害物質について示唆も開示もされていない驚くべき効果である。

したがって、本発明に包含される様々な医学的使用は、予期せぬ技術的効果に関する共通の機能的特徴によりまとめされる。分泌の撹乱において本明細書に記載のＦＬＩ−０６及びその誘導体が果たす役割は当該技術分野で開示も示唆もされていない。多数の疾患がその病因、発生機序、形態学的特徴及び／又は臨床症状に関して分泌に依存する。

かかる疾患としては、過剰に活性なｗｎｔシグナル伝達、分泌分子に依存する幾つかのがん（Herr et al., Trends in Mol. Med. 2012）、膠芽細胞腫（Formolo et al. 2011, J. Proteome Research）、様々なインターロイキンを分泌するがん及び炎症性疾患（McLaughlin et al. 2010, British J. of Pharmacology.）が挙げられるが、これらに限定されない。抗がん薬としての分泌の阻害は、例えばOhashi et al. JBC 2011に示唆されている。

当業者であれば、かかる分泌依存性疾患（diseases）を既存の方法に基づき、とりわけ本発明に鑑みて決定することが可能である。本発明の実験例は、ｉｎ ｖｉｖｏ又はｉｎ ｖｉｔｒｏで分泌をアッセイする多数の適切な方法を包含する。かかるアプローチは、かかる疾患の存在を決定するために例えば患者サンプルに適用することができる。

分泌依存性疾患は例えば、ＳＥＡＰアッセイに開示されるような酵素的に活性な分泌タンパク質の場合の酵素反応の検出、又はＥＬＩＳＡ若しくは当業者に既知の類似の方法による分泌タンパク質の測定によって特定することができる。

本発明の更なる実施の形態では、分泌又は分泌経路はサイトカイン分泌、ＴＮＦα分泌、ＩＬ−６分泌、ＩＬ−８分泌、ＩＬ−１０分泌、Ｗｎｔ分泌、マイクロＲＮＡ分泌、ＣＣＬ２分泌、小胞体輸送及び／又はゴルジ装置に関連する、それによって媒介される及び／又はそれを特徴とする。

膜輸送を阻害することの技術的効果は本発明の化合物の適用で顕著である。この特定の機構の知識は、適切な医薬投与に必要とされる要件（すなわち投与条件は好ましくは細胞への侵入を可能にするものとし、化合物を潜在的に脂質（又は有機溶媒）に可溶性であるように調製することができる）の洞察を与え、それにより治療対象の疾患の標的化に関する新規の情報を与えるものである。

一実施の形態では、膜輸送の阻害、又は好ましくは小胞体及び／又はゴルジ装置の撹乱による分泌経路の撹乱に関する情報は、本明細書に記載の分子の技術的効果及び／又は機構に関する情報なしには可能でなかった新規の患者集団の治療又は新規の投与計画をもたらし得る。

本発明の一態様はがんの分泌依存性疾患の治療に関する。したがって、本明細書に記載の化合物の医学的使用及び治療方法はがんの治療に関する。

本発明の一態様は細胞老化に伴う老化現象の分泌依存性疾患の治療に関する。したがって、本明細書に記載の化合物の医学的使用及び治療方法は、細胞老化に伴う老化現象及び関連の病気の治療に関する。

本発明の一実施の形態は、治療対象のがんが膜輸送、分泌又は分泌経路への依存を特徴とし、好ましくはｗｎｔ分泌、マイクロＲＮＡ分泌、ＣＣＬ２分泌、小胞体輸送及び／又はゴルジ装置に関連する及び／又はそれにより媒介されることを特徴とする。好ましい実施の形態では、分泌に依存するがんは慢性リンパ球性白血病（ＣＬＬ）、食道がん、神経膠腫、結腸がん又は乳がんから選択される。

一部のがんは分泌機構に依存することが知られている。例えば、分泌に依存するがんの非包括的なリストは、慢性リンパ球性白血病（ＣＬＬ）（小胞体輸送；Carew, J.S., et al. (2006), Targeting endoplasmic reticulum proteintransport: a novel strategy to kill malignant B cells and overcome fludarabineresistance in CLL. Blood 107, 222-231）、食道がん（ｗｎｔ分泌；Fu,L., et al. (2011), Wnt2 secreted by tumour fibroblasts promotes tumourprogression in oesophageal cancer by activation of the Wnt/beta-cateninsignalling pathway. Gut 60, 1635-1643）、神経膠腫（ｗｎｔ分泌；Augustin,I. et al. (2012), The Wnt secretion protein Evi/Gpr177 promotes gliomatumourigenesis. EMBO Molecular Medicine 4, 38-51）、結腸がん（ｗｎｔ分泌）、乳がん転移（マイクロＲＮＡ分泌；Breast Cancer-secreted MicroRNAs in the Pre-metastatic Niche, andCCL2 secretion; Loss of TGF-beta signaling in mammary fibroblasts enhances CCL2secretion to promote mammary tumor progression through macrophage dependent andindependent mechanisms Stacey L Hembruff, et al. Neoplasia 2010, Volume 12,Issue 5）に関する。本明細書に提示される化合物は、Ｎｏｔｃｈシグナル伝達に加えて初期段階で分泌経路を撹乱する驚くべき効果を示し、本発明はｎｏｔｃｈシグナル伝達撹乱、初期段階での分泌撹乱及びがん治療の新規の組合せに関する。

本発明の一実施の形態は、治療対象のがんがｎｏｔｃｈシグナル伝達経路の誤調節を特徴とすることを特徴とする。好ましいがんは血液がん、結腸直腸がん、子宮頸がん、膵臓がん、乳がん又は肺がんである。好ましい実施の形態では、血液がんはリンパ腫又は白血病である。好ましい実施の形態では、リンパ腫はＴ細胞リンパ腫、Ｂ細胞リンパ腫又はホジキンリンパ腫又はＣＬＬである（Rosati et al, Blood 2009 113:856-865）。

好ましい実施の形態では、本発明の化合物は、がんの治療における薬剤としての使用を意図するｎｏｔｃｈシグナル伝達経路の阻害物質であり、化合物はγ−セクレターゼを直接阻害しない。

好ましい実施の形態では、化合物は化合物による治療中に副作用が生じない、又は直接的なγ−セクレターゼ阻害物質による治療と比較して僅かにしか生じないことを特徴とする。ガンマ−セクレターゼ阻害物質はＮｏｔｃｈシグナル伝達阻害物質として既知であるが、様々な副作用に悩まされている。本発明の化合物がガンマ−セクレターゼ非依存性効果を示すことは驚くべき有益な効果であり、現在のｎｏｔｃｈ阻害物質のようにガンマ−セクレターゼを直接撹乱しないことから、医学的用途について治療中に生じる可能性がある副作用の本質的な減少による病態の改善をもたらす。これによる効果は嘔気、下痢、嘔吐、体重減少及び／又は食欲不振等の胃腸副作用が回避される又は低減することである。

今日まで、ガンマ−セクレターゼに直接影響を与えないｎｏｔｃｈシグナル伝達阻害物質は稀であった。ｎｏｔｃｈシグナル伝達を阻害するが、ガンマ−セクレターゼを直接阻害しないことが知られるこれら少数の分子はがん治療においては既知でなく、又は膜輸送の撹乱物質として、特に小胞体輸送若しくはゴルジ装置の撹乱物質として既知でない。したがって、これは新規かつ自明でない医学的効果である。分泌抑制効果と組み合わせた、非直接的又は間接的なガンマ−セクレターゼ活性の共通の特徴（すなわち、ｎｏｔｃｈシグナル伝達に対する効果はガンマ−セクレターゼに直接生じない）のために、本発明の化合物は、ＧＳＩと関連するこれらの副作用が本発明の化合物による治療中に顕著に低減するという好ましい利点をもたらす。

非ＧＳＩ化合物（非ガンマセクレターゼ阻害物質；ガンマセクレターゼ機能に直接影響を与えない化合物）、ｎｏｔｃｈシグナル伝達阻害及び分泌阻害の組合せは当該技術分野において新規かつ自明でない発展である。この化合物、機構及び医学的使用の組合せは、既知のｎｏｔｃｈ阻害物質のいずれに関してもこれまで提案されていなかった。したがって、この組合せ（本発明の化合物に共通する）は単一性を正当化する特徴であり、従来技術に対して独自の貢献をなすものである。

一実施の形態では、非ＧＳＩ効果に関する情報は、本明細書に記載の分子の技術的効果及び／又は機構に関する情報なしには可能でなかった新規の患者集団の治療又は新規の投与計画をもたらし得る。例えば、この場合、治療中にガンマ−セクレターゼ阻害物質に対して特に感受性が高い患者も直接的なガンマセクレターゼ阻害の回避によりｎｏｔｃｈ阻害ベースの治療の恩恵を享受することができる。

細胞老化に伴う老化現象及び関連の病気の治療に関して、好ましい実施の形態は細胞老化関連分泌現象（ＳＡＳＰ）の存在を特徴とする細胞老化に伴う老化現象に関する。

本発明の一実施の形態では、ＳＡＳＰは炎症性疾患である。本発明の更なる実施の形態では、このようなＳＡＳＰ炎症性疾患は炎症性サイトカイン、特にＩＬ−６及びＩＬ−８の分泌により誘導され得る。培養培地におけるＳＥＡＰ活性の測定又はサイトカイン、例えばＩＬ−６及び／又はＩＬ−８を検出するＥＬＩＳＡ試験の使用を、ＳＡＳＰ炎症性疾患の存在を決定するために適用することができる。

本発明は、本明細書に開示される化合物の１つ又は複数と、薬学的に許容可能な担体物質とを含む医薬組成物に関する。

したがって、本発明は、分泌依存性疾患、好ましくはがん又は細胞老化に伴う老化現象、より好ましくは血液がん、結腸直腸がん、子宮頸がん、膵臓がん、乳がん又は肺がん、慢性リンパ球性白血病（ＣＬＬ）、食道がん、神経膠腫又は結腸がん、より好ましくはＴ細胞リンパ腫、Ｂ細胞リンパ腫、ホジキンリンパ腫等のリンパ腫若しくは白血病、又は炎症性疾患を治療する方法であって、本明細書に記載の化合物の１つ又は（or）複数を含む有効量の医薬組成物を、治療を必要とする被験体に投与することを含む、方法にも関する。

本発明の別の態様は、更なる生物活性化合物の開発における誘導体化のリード構造としての本発明の化合物の１つ又は複数の使用に関する。更なる誘導体化により開発される本発明の化合物の明らかな誘導体は当業者には実現可能であり、本発明の範囲内である。

さらに、本発明はｎｏｔｃｈシグナル伝達経路の阻害物質、分泌若しくは分泌経路の阻害物質、及び／又は膜輸送の阻害物質としての本明細書に記載の化合物のｉｎ ｖｉｔｒｏ使用にも関する。

好ましい実施の形態では、本明細書に記載の化合物は、化合物の分子量が１００ｇ／ｍｏｌ〜６００ｇ／ｍｏｌ、好ましくは３５０ｇ／ｍｏｌ〜５５０ｇ／ｍｏｌであり、分配係数がｌｏｇＰ≦６、好ましくは≧２〜≦６であり、最高で２つの水素架橋ドナー及び最高で８つの水素架橋アクセプタを有することを特徴とする。本明細書に記載のスクリーニングプロセスで同定された化合物は全て、リピンスキーの法則（いわゆるルールオブファイブ）に相当の程度まで適合することから、化合物を医薬品として非常に有用なものとする様々な共通の物理化学的特性を示す。これは、従来技術の観点からは予期されなかった化合物の医学的用途における重大な利点である。共通の構造的特徴の和は本発明の技術的課題、すなわち当該技術分野においてこれまで知られている及び／又は適用されている分子よりも副作用の少ない分泌依存性疾患の治療用のｎｏｔｃｈ阻害物質の提供に対して共通の解決策を与える機能的関係をもたらす。したがって、共通の物理化学的特徴は特徴の任意の和ではなく、化合物の良好なｉｎ ｖｉｖｏ適合性を有利に可能にし、特徴付ける請求項に係る化合物の共通のフィンガープリントである。

本発明は、分泌依存性疾患の治療用のｎｏｔｃｈシグナル伝達経路及び分泌の阻害物質としての化学化合物、更にはその医薬組成物及び治療方法に関する。「分泌依存性疾患」は分泌の阻害が治療効果をもたらす任意の疾患に関する。好ましくは、分泌依存性疾患は病因、発生機序、形態学的特徴及び／又は臨床症状が細胞分泌及び／又は分泌経路への依存を特徴とする疾患から選択され、該疾患の治療における治療効果は細胞分泌の阻害によって生じる。分泌又は分泌（secretory）経路は細胞分泌に関与する任意の生物学的シグナル伝達経路又は機構と理解することができ、好ましくは分泌又は分泌経路はＷｎｔ分泌、マイクロＲＮＡ分泌、ＣＣＬ２分泌、小胞体輸送及び／又はゴルジ装置に関連する、それによって媒介される及び／又はそれを特徴とする。

本発明はがん又はがん様障害、例えば細胞増殖性障害の治療用のｎｏｔｃｈシグナル伝達経路阻害のための化学化合物に関する。「がん」、「細胞増殖性障害」（"cell proliferative disorder" or "cellular proliferativedisorder"）という用語は区別なく使用され、罹患細胞の増殖能が非罹患細胞の正常増殖能とは異なる任意の障害を指す。細胞増殖性障害の一例は新生物形成である。悪性細胞は多段階プロセスの結果として発生する。「悪性」という用語は、もはや正常な細胞成長制御下にない腫瘍又は造血疾患を指す。本明細書で提示される「がん性細胞」という用語は、本明細書で提示されるがん性病態のいずれか１つに罹患した細胞を含む。「癌」という用語は周囲組織に浸潤し、転移を生じる傾向がある上皮細胞で構成される悪性新生物を指す。

本明細書に記載の細胞増殖性障害は新生物であり得る。かかる新生物は良性又は悪性である。「新生物」という用語は細胞の新たな異常成長、又は正常細胞よりも速く増殖する異常細胞の成長を指す。新生物は良性又は悪性であり得る非構造塊（腫瘍）を生じる。「良性」という用語は非がん性の腫瘍を指し、例えばその細胞は増殖しない又は周囲組織に侵入しない。

本発明は、細胞老化に伴う老化現象の治療用のｎｏｔｃｈシグナル伝達経路及び分泌の阻害物質としての化学化合物、更にはその医薬組成物及び治療方法に関する。「細胞老化に伴う老化現象」は、一般に「年を取ること」又は「老化現象」を意味する老化を指す。生物学的老化現象は、時間の経過とともに代謝を撹乱し、劣化及び死をもたらす分子構造及び細胞構造に対する累積変化のプロセスである。老化は生物全体のレベル（生物老化）及びその個別細胞のレベル（細胞老化）の両方で生じる。老化の治療は本発明の一態様であり、老化プロセスの減速、逆転及び／又は未然の阻害に関する。老化現象では、神経障害、糖尿病、変性性関節炎、更にはがん等の急性及び慢性病態が個体において発生するため、老化現象は加齢に伴う疾患が生じる基盤と称されている。したがって、本発明は老化現象を分泌阻害により減少させることによってこれらの疾患を予防する予防法に関する。

老化現象の基礎をなす分子経路は、生物学的老化プロセスでは大きな個体多様性が見られるために十分に理解されていない。これらの個体差は遺伝的に符号化され、環境的に調節される修復系が対抗する確率的損傷の蓄積によって生じると提唱される。分子レベルでは修復は酵素系によって働くが、細胞レベルでは組織恒常性を維持する複製及び分化によって働く。しかしながら、体細胞及び成体幹細胞の複製能は細胞老化によって制限され、最近の証拠から老化への対抗又は老化細胞の除去は、加齢に伴う病理の発現を遅らせることが示されている。したがって、本発明は加齢に伴う病状に加えて老化現象自体を治療する手段を提供する。

特に、本発明の化合物は細胞老化関連分泌現象（ＳＡＳＰ）に起因する炎症関連疾患の治療に適用することができる。ＳＡＳＰは文献に概説されており、該病態と関連する疾患は当業者に既知である（例えば、Davalos et al., Cancer Metastasis Rev. 2010 June; 29(2): 273–283を参照されたい）。幾つかの証拠から、腫瘍抑制機構が両刃の剣となり得ることが示唆されている。かかる機構は若年期のがんの発生を抑制するが、組織の構造、構成及び恒常性の変化ももたらし得る。これらの組織変化は、高齢期のがんを含む老化現象と関連する表現型及び病理を推進し得る。細胞老化は潜在的に発がん性の刺激によって誘導され得る。老化応答は多くの場合、ｐ５３タンパク質に支配されるものと、ｐＲＢ及びｐ１６ＩＮＫ４ａタンパク質に支配されるものとの２つの有力な腫瘍抑制経路に依存する。老化細胞はマウス及びヒトにおいて前悪性病変に見ることができ、マウスモデルでは老化応答は悪性進行を予防する。老化現象における役割と一致して、老化細胞は多くの齧歯動物、非ヒト霊長類及びヒト組織において加齢と共に蓄積する。さらに、老化細胞は変形性関節症及びアテローム性動脈硬化症等の変性障害、並びに良性前立腺過形成及び色素性母斑等の過剰増殖性病変を含む加齢に伴う病理の部位に見られる。細胞培養及びマウス異種移植研究により、老化細胞が組織の構造及び機能を撹乱し、がん進行を促進し得る因子を分泌するという考えが支持される。重要なことには、ＳＡＳＰは老化応答の有害な副作用の主要な原因であり得る。

細胞老化は、細胞間シグナル伝達に関与する４０倍を超える分泌レベルの著しい増加を伴う。ＳＡＳＰは、無検査のままである場合に有害となり得る炎症性刺激から期待されるパラクリン作用の多くを有する。ＳＡＳＰは可溶性因子及び不溶性因子の幾つかのファミリーを含む。これらの因子は、がんを含む複数の病理をもたらし得る様々な細胞表面受容体及び対応するシグナル伝達経路を活性化することによって周囲細胞に影響を及ぼす可能性がある。ＳＡＳＰ因子は全体的に以下の主要カテゴリーに分類することができる：可溶性シグナル伝達因子（インターロイキン、ケモカイン及び成長因子）、分泌性プロテアーゼ及び分泌不溶性成分。ＳＡＳＰプロテアーゼは、可溶型の膜結合受容体をもたらす膜関連タンパク質の脱落、シグナル伝達分子の切断／分解、及び細胞外基質の分解又はプロセシングという３つの主要な効果を有し得る。

「γ−セクレターゼ」及び「ガンマ−セクレターゼ」という用語は区別なく使用される。

本発明において、「治療」又は「療法」は概して所望の薬理的効果及び／又は生理的効果を得ることを意味する。効果は疾患及び／又は症状を完全若しくは部分的に予防する観点から予防的なものであっても、又は疾患及び／又は疾患の有害影響を部分的若しくは完全に治癒する観点から治療的なものであってもよい。本明細書において、「療法」は哺乳動物、特にヒトにおける疾患又は病態の任意の治療、例えば以下の治療（ａ）〜（ｃ）を含む：（ａ）患者における疾患、病態又は症状の発現の予防；（ｂ）病態の症状の阻害、すなわち症状の進行の予防；（ｃ）病態の症状の改善、すなわち疾患又は症状の軽減の誘導。

「医薬組成物」という用語は、本明細書に記載の薬剤と薬学的に許容可能な担体との組合せを指す。「薬学的に許容可能な」という表現は、ヒトに投与した場合に激しいアレルギー反応又は同様の有害反応を生じない分子的実体及び組成物を指す。本明細書で使用される場合、「担体」又は「担体物質」は任意及び全ての溶媒、分散媒、ビヒクル、コーティング、希釈剤、抗菌剤及び抗真菌剤、等張剤及び吸収遅延剤、緩衝剤、担体溶液、懸濁液、コロイド等を含む。医薬活性物質へのかかる媒体及び薬剤の使用は当該技術分野で既知である。追加の活性成分を組成物に組み込んでもよい。本発明の医薬組成物はその構成要素の薬学的に許容可能な塩を含み得る。活性成分を含有する医薬組成物は、例えば錠剤、トローチ、舐剤、水性若しくは油性懸濁液、分散性粉末若しくは顆粒、エマルション、硬カプセル若しくは軟カプセル、又はシロップ若しくはエリキシル剤のような経口使用に好適な形態であり得る。経口使用を意図した組成物は、医薬組成物及びかかる組成物の製造について当該技術分野で既知の任意の方法に従って調製することができる。錠剤は錠剤の製造に好適な非毒性の薬学的に許容可能な賦形剤と混合して活性成分を含有する。錠剤はコーティングされていなくても、又は胃腸管内での崩壊及び吸収を遅らせることにより、持続的作用をより長期にわたってもたらす既知の技法によってコーティングされていてもよい。

１日に体重１キログラム当たり約０．０１ｍｇ〜約５００ｍｇ程度の投与量レベルが指定の病態の治療に有用である。例えば、がんは１日に体重１キログラム当たり約０．０１ｍｇ〜５０ｍｇ（患者１人当たり１日に約０．５ｍｇ〜約３．５ｇ）の本発明の分子の投与によって効果的に治療することができる。担体材料と組み合わせて単回投与形態を作製することができる活性成分の量は、治療される宿主及び特定の投与方法に応じて異なる。例えば、ヒトの経口投与を意図した配合は組成物全体の約５％〜約９５％と様々である。投与単位形態は概して約１ｍｇ〜約５００ｍｇの活性成分を含有する。しかしながら、任意の特定の患者の特定の用量レベルは、用いられる特定の化合物の活性、年齢、体重、全身状態、性別、食生活、投与時間、投与経路、排泄率、薬物の組合せ及び療法を受ける特定の疾患の重症度を含む様々な因子によって決まることを理解されたい。本発明による化合物の投与有効量は特定の化合物、毒性及び阻害活性、治療される病態、並びに化合物を単独で投与するか又は他の治療剤とともに投与するかを含む因子に応じて異なる。典型的には、投与有効量は約０．０００１ｍｇ／ｋｇ〜１５００ｍｇ／ｋｇ、より好ましくは１ｍｇ／ｋｇ〜１０００ｍｇ／ｋｇ、より好ましくは約１ｍｇ／ｋｇ〜１５０ｍｇ／ｋｇ（体重）、最も好ましくは約５０ｍｇ／ｋｇ〜１００ｍｇ／ｋｇ（体重）の範囲である。本発明は、言及される病的状態を治療するプロセス又は方法にも関する。本発明の化合物は、好ましくは言及される障害に対して効果的な量で、かかる治療を必要とする温血動物、例えばヒトに予防的又は治療的に投与することができ、化合物は好ましくは医薬組成物の形態で使用される。

一態様では、本発明は、それを必要とする患者に対してがんを予防、治療及び／又は管理する方法であって、該方法が予防的に効果的な計画又は治療的に効果的な計画を行うことを含み、計画が患者に本発明の化合物又はその薬学的に許容可能な塩を投与することを含み、患者ががんと診断されており、該がんが血液がん、結腸直腸がん、子宮頸がん、膵臓がん、乳がん又は肺がんである、方法を提供する。幾つかの実施の形態では、本発明の化合物又はその薬学的に許容可能な塩の治療的に効果的な計画を行う前に、患者はがんの治療及び／又は管理のための療法を受けることができる。そのような療法の非制限的な例としては、化学療法、放射免疫療法、毒素療法、プロドラッグ活性化酵素療法、抗体療法、外科的療法、免疫療法、放射線療法、標的療法（すなわち、特定の標的又は経路、例えば、チロシンキナーゼ等を対象とした療法）、及びそれらの任意の組合せが挙げられる。幾つかの実施の形態では、患者は以前にがんの治療及び／又は管理のための療法を受けていない。特定の実施の形態では、血液がんはリンパ腫若しくは白血病、又はＴ細胞リンパ腫、Ｂ細胞リンパ腫若しくはホジキンリンパ腫である。

別の態様において、本発明は、患者の固形腫瘍を予防、治療、及び／又は管理する方法であって、該方法がそれを必要とする患者に、予防的に効果的な計画又は治療的に効果的な計画を行うことを含み、計画が患者に本発明の化合物又はその薬学的に許容可能な塩を投与することを含み、患者が固形腫瘍と診断されている、方法を提供する。この態様の特定の実施の形態において、固形腫瘍は、線維肉腫、粘液肉腫、脂肪肉腫、軟骨肉腫、骨原性肉腫、脊索腫、血管肉腫、内皮肉腫、リンパ管肉腫、リンパ管内皮肉腫、滑膜腫、中皮腫、ユーイング腫瘍、平滑筋肉腫、横紋筋肉腫、結腸がん、結腸直腸がん、腎臓がん、膵臓がん、骨がん、乳がん、卵巣がん、前立腺がん、食道がん、胃がん、口腔がん、鼻腔がん、咽頭がん、扁平上皮癌、基底細胞癌、腺癌、汗腺癌、脂腺癌、乳頭癌、乳頭腺癌、嚢胞腺癌、髄様癌、気管支原性癌、腎細胞癌、ヘパトーマ、胆管癌、絨毛癌、精上皮腫、胎児性癌、ウィルムス腫瘍、子宮頸がん、子宮がん、精巣がん、小細胞肺癌、膀胱癌、肺がん、上皮癌、神経膠腫、多形膠芽腫、星状細胞腫、髄芽腫、頭蓋咽頭腫、上衣腫、松果体腫、血管芽腫、聴神経腫、乏突起膠腫、髄膜腫、皮膚がん、黒色腫、神経芽腫、又は網膜芽腫である。

したがって、本発明は新規のタイプの分泌阻害物質であるＦＬＩ−０６及びその誘導体に基づく。他の分泌阻害物質とは対照的に、重大な小胞体ストレスは誘導されない。ＦＬＩ−０６及びその誘導体は、小胞体ストレス媒介アポトーシスを誘導することなく分泌を阻害又は低減する有用な薬剤である。ＳＡＳＰを妨げ、組織機能障害を遅らせ、健康寿命を延ばすこれらの化合物の効果を特定し（identify）、支持するために以下の分析が行われているか、又はＦＬＩ−０６及びその誘導体の更なる分析に適切である。

ＦＬＩ−０６はＥＣ_５０が２．３μＭの分泌阻害物質である。ナノモル範囲で作用する阻害物質を開発する現在の提案にまで拡張される初期構造活性相関（ＳＡＲ）研究を行った。ＦＬＩ−０６及び誘導体を、化学的に又は反復継代によって老化が誘導されるヒト線維芽細胞におけるその有効性について試験した。ＳＡＳＰの阻害は、ＩＬ−６及びＩＬ−８についてのＥＬＩＳＡ及び分泌型アルカリホスファターゼ（ＳＥＡＰ）の測定によって測定することができる（Gu, L. & Kitamura, M. Sensitive detection and monitoring ofsenescence-associated secretory phenotype by SASP-RAP assay. PLoS One 7,e52305, (2012)）。細胞毒性、増殖及び自食作用をアッセイすることができる。脳老化におけるＳＡＳＰの役割を研究するために、Ｋｌｏｔｈｏマウスのような老化モデルの脳切片において学習及び記憶の欠陥を逆行させることができるか否か、並びにＵＰＳの動態及びシナプスタンパク質の寿命が変化するか否かについて有望な化合物を分析することができる。有望な化合物はカエノラブディティス・エレガンスにおける寿命延長効果についても試験することができる。リード物質は脊椎動物試験における使用について更に最適化される。

本明細書に記載されるような新規のＳＡＳＰ阻害物質は、ＳＥＡＰを安定に発現する老化ヒト線維芽細胞を用いて更にアッセイ又はスクリーニングしてもよい。段階希釈及びＩＣ_５０決定を含む二次スクリーニングでヒットを検証することができる。非老化細胞及び老化細胞における全体的分泌に影響を及ぼすか否かについてヒットを試験することができる。有望なヒットを作用様式、特異性及び毒性について分析することができる。

さらに、全ゲノムｓｉＲＮＡスクリーニングを行い、老化、ＳＡＳＰ及び自食作用に関与する新規の標的を同定することができる。ゴルジ体（ＧａｌＴ、ゴルジ体は老化において拡大及び分散する）、リソソーム（Ｌａｍｐ１、リソソームは老化において数及びサイズが拡大する）及びオートファゴソーム（ＬＣ３、老化において数が増大する）の蛍光タンパク質タグ付きマーカーを安定に発現する多色ヒト線維芽細胞株を生成した。細胞の自動同定のために、核を遠赤色核染料Ｔｏ−Ｐｒｏ−３（Invitrogen）で標識することができる。３８４ウェルフォーマットでの化学的に誘導される老化多色細胞のトランスフェクション及びスクリーニングのために条件を最適化することができる。読み取りパラメータはゴルジ体の分散度、リソソームの数及びサイズ、オートファゴソームの数及びサイズを含み得る。全ゲノムｓｉＲＮＡライブラリー（Dharmacon）を更にスクリーニングし、３つのマーカーの表現型変化を分析することができる。ヒットは全レベルで老化分泌経路に影響を及ぼすヒット、１つ又は２つの読み取りパラメータのみに影響を及ぼすヒット、ゴルジ体又はリソソームに影響を及ぼし又は及ぼさず、自食作用に影響を及ぼすヒット等に分類することができる。二次スクリーニングで検証した候補を、例えばそれらが誘導する形態変化が実際にＳＡＳＰに影響を及ぼすか否か、それがＳＡＳＰ及び／又は老化の原因となる又は相関するか否か、疾患遺伝子が先の老化現象と関連するか否かについて詳細に試験することができる。

したがって、上記の実験方法を用いて、本明細書に開示される誘導体及び本明細書に開示される一般式に該当する関連化合物に関する更なる情報を与えることができる。さらに、老化及び本明細書に記載の化合物の作用機構に関与する付加的な化合物及び遺伝因子を、本明細書に記載の実験アプローチによって同定することができる。

本明細書で提示される図面は本発明の特定の実施形態の例を表すものであり、本発明の範囲を限定することを意図するものではない。図面は、１つ又は複数の非限定的な実施形態の技術支援を強化する可能な潜在的に好ましい実施形態の更なる説明を提供するものと考えるべきである。

Ｎｏｔｃｈ輸送／プロセシングの化学的干渉が自動顕微鏡法に適していることを示す図である。 一次化合物スクリーニングを説明する。 最終的なヒットリストから選択された化合物が独特の表現型を示すことを示す図である。 同上つづき。 ＮｏｔｃｈΔＥ−ＥＧＦＰ、ＡＰＰ及びＫｌｏｔｈｏの輸送及びプロセシングに対する化合物の効果を示す図である。 選択された化合物が内因性Ｎｏｔｃｈシグナル伝達を阻害することを示す図である。 ジヒドロピリジンＦＬＩ−０６がＢＦＡ又はＧＣＡとは異なる機構によってゴルジ体を撹乱することを示す図である。 同上つづき。 同上つづき。 ＦＬＩ−０６が小胞体出口部位へのカーゴの動員に影響を及ぼすことを示す図である。 ＦＬＩ−０６が小胞体シート形成を誘導することを示す図である。 ５０μＭのＦＬＩ−１４、ＦＬＩ−１５、ＦＬＩ−１９及びＦＬＩ−２０のＤＡＰＴ様表現型を示す図である。 化合物の効果が細胞型特異的でないことを示す図である。 Ｎｏｔｃｈ阻害物質の表現型が完全に可逆的であることを示す図である。 選択された化合物がゼブラフィッシュ胚においてｉｎ ｖｉｖｏで体節形成及び神経発生に影響を及ぼすことを示す図である。 ＦＬＩ−０６が微小管又はアクチンの解重合によってはゴルジ体を撹乱しないことを示す図である。 ＦＬＩ−０６が初期ゴルジ体及びＴＧＮの分散を引き起こすが、エンドソームの造管を引き起こさないことを示す図である。 ＦＬＩ−０６がＢＦＡとは異なった形で作用することを示す図である。 ＦＬＩ−０６がＧＰＩアンカー型可溶性タンパク質の輸送を阻害し、小胞体ストレスを引き起こさないことを示す図である。 小胞体出口阻害物質のみが小胞体管をシートに変換することを示す図である。 ＦＬＩ−０６が小胞体搬出を即座に遮断することを示す図である。 ＦＬＩ−０６が分泌型アルカリホスファターゼ（phosphatase）の分泌を阻害し、ＦＬＩ−０６ががん性Ｎｏｔｃｈ依存性Ｔ細胞を死滅させることを示す図である。 ＦＬＩ−０６の分子構造を示す図である。熱振動楕円体（Thermal Ellipsoids）は４０％確率レベルで示す。

図面の詳細な説明
図１：Ｎｏｔｃｈ輸送／プロセシングの化学的干渉は自動顕微鏡法に適している。膜結合レポーターＮｏｔｃｈΔＥ−ＥＧＦＰ（ａ）及びその細胞輸送（ｂ）のスキーム。ＮｏｔｃｈΔＥ−ＥＧＦＰは小胞体で合成され、ゴルジ体によって細胞膜（ＰＭ）へと輸送される。ＰＭではγ−セクレターゼ切断によりＮＩＣＤ−ＥＧＦＰが放出され、それが続いて核に移行する。ｃ）自動画像収集及び定量化のスキーム。固定ＨｅＬａ−ＮｏｔｃｈΔＥ−ＥＧＦＰ細胞をＤＡＰＩで染色し、自動顕微鏡法によって画像化した。核マスク及び核周辺の環を作成し、蛍光強度のｎｕｃ、ｅｎｕｃ及びｅｎｕｃ／ｎｕｃ比の決定に使用した。ｄ）ＨｅＬａ−ＮｏｔｃｈΔＥ−ＥＧＦＰ細胞をＤＡＰＴとともに又はＤＡＰＴなしでインキュベートし、固定し、蛍光顕微鏡法によって画像化した。ｅ）ＮｏｔｃｈΔＥ−ＥＧＦＰのＤＡＰＴ用量依存的ｅｎｕｃ蓄積の定量化、及びＤＡＰＴ処理後の核ＮＩＣＤ−ＥＧＦＰの時間依存的減少。ｆ，ｇ）ＨｅＬａ−ＮｏｔｃｈΔＥ−ＥＧＦＰ細胞を漸増量のモネンシンとともにインキュベートし、６時間後に固定し、自動顕微鏡法によって分析した。ｆ）ＤＭＳＯ又はモネンシン（５μＭ）で処理した細胞の画像例。ゴルジ体における累積蛍光を矢印で表す。ｇ）１００個を超える細胞±ＳＥの定量化。ｎｕｃ／ｅｎｕｃ比を示す。ｈ，ｉ）ＨｅＬａ−ＮｏｔｃｈΔＥ−ＥＧＦＰ細胞をＭＧ１３２（１μＭ）の存在下又は非存在下で１６時間インキュベートし、固定し、蛍光顕微鏡法のために処理した（ｈ）。ｉ）２５０個を超える細胞±ＳＥの核蛍光の定量化。全てのｙ軸が任意単位での蛍光強度を示す。スケールバー１０μｍ。ｊ）スクリーニングの概要。

図２：最終的なヒットリストから選択された化合物は独特の表現型を示す。Ｈｅｌａ ＮｏｔｃｈΔＥ−ＥＧＦＰ細胞を化合物（１０μＭ）とともに１８時間インキュベートし、固定し、蛍光顕微鏡法によって分析するか（ａ）、又は溶解し、ＳＤＳ−ＰＡＧＥによって分離し、ブロットし、ＧＦＰ及びＮＩＣＤに対する抗体でプロービングした（ｂ）。チューブリンをローディング対照とした。ｃ）（ｂ）に示す３、４回の実験によるＮｏｔｃｈΔＥ−ＥＧＦＰ蓄積及びＮＩＣＤ生成の定量化。ＳＤをｐ＜０．０５を表すアスタリスクとともに示す。矢印、細胞膜；スケールバー、１０μｍ。

図３：ＮｏｔｃｈΔＥ−ＥＧＦＰ、ＡＰＰ及びＫｌｏｔｈｏの輸送及びプロセシングに対する化合物の効果。ａ）ＡＰＰ_ｓｗｅ又はＫｌｏｔｈｏ（Ｋｌ）を安定に発現するＨＥＫ２９３を、ＤＡＰＴ又は化合物（１０μＭ）とともに１６時間インキュベートした。培地を回収し、細胞を溶解し、指定の抗体を用いたウエスタンブロット法によってともにアッセイした。ｍ、成熟；ｉｍ、未熟；ｓ、脱落した（shedded）細胞外ドメイン；ＣＴＦ、Ｃ末端断片。ｂ）ＨｅＬａ−ＮｏｔｃｈΔＥ−ＥＧＦＰ及びＡＰＰｓｗｅ細胞に由来する膜を単離し、ＤＡＰＴ又は指定の化合物の存在下でγ−セクレターゼｉｎ ｖｉｔｒｏアッセイに供した。ＮＩＣＤ及びＡＩＣＤを、ＡＰＰのＣ末端に対する抗体（上部）又はＮＩＣＤに特異的な抗体（下部）を用いたウエスタンブロット法によって検出した。ｃ）５回の独立実験による定量化。ＳＤをｐ＜０．０１を表すアスタリスクとともに示す。

図４：選択された化合物は内因性Ｎｏｔｃｈシグナル伝達を阻害する。ａ）Ｃ２Ｃ１２細胞にＮｏｔｃｈリガンドデルタ及びルシフェラーゼベースのＮｏｔｃｈ−レポーターをトランスフェクトした。細胞をＤＡＰＴ又は１０μＭの指定の化合物（ＦＬＩ−１５及びＦＬＩ−２０の場合は５０μＭ）とともにインキュベートし、１６時間後にルシフェラーゼアッセイを行った。ＤＭＳＯ処理細胞の値を０％阻害に設定し、ＤＡＰＴ処理細胞を１００％阻害に設定して、他の化合物をそれに関連付けた。ｂ）及びｃ）化合物（５０μＭ）を、絨毛膜を除去した（dechorionated）４ｈｐｆ段階のゼブラフィッシュ胚に添加し、効果を２４時間後に分析した。ｂ）ｎｇｎ１に特異的なプライマーを用いたｑＰＣＲ。ＤＭＳＯ対照における発現レベルと比較した相対遺伝子発現レベルの変化（倍数変化）を平均±ＳＤとして表し、アスタリスクはｐ＜０．０１を示す。各測定値を２つの独立サンプルから得た。各反応は三連で測定した。ｎｇｎ１の相対発現における変化を、２０ｈｐｆでのハウスキーピング遺伝子ｅｆ１ａの発現に対して標準化した。ｃ）ｎｇｎ１に特異的なリボプローブを用いたＩＳＨを、絨毛膜を除去した４ｈｐｆ段階のゼブラフィッシュ胚に対して行った。前部が左、背部が上である。体節領域の拡大図（小さなボックス）を示す。矢印はより大きなｎｇｎ１クラスター又はより強いｎｇｎ１染色を示す。ｓ、感覚ニューロン；ｉ、介在ニューロン；ｍ、運動ニューロン。

図５：ジヒドロピリジンＦＬＩ−０６は、ＢＦＡ又はＧＣＡとは異なる機構によってゴルジ体を撹乱する。ａ）構造活性相関については、ＦＬＩ−０６（１）及び誘導体（２〜７）をＨｅＬａ−ＮｏｔｃｈΔＥ−ＥＧＦＰ細胞でインキュベートし、ＥＣ_５０値を決定した。ｂ）ＨｅＬａ−ＮｏｔｃｈΔＥ−ＥＧＦＰ細胞を用いた化合物の試験の結果。ｃ）ｂ）に示す実験に従って試験した化合物に関する構造情報。ｄ）ＨｅＬａ細胞をＤＭＳＯ又はＦＬＩ−０６（１０μＭ）とともに１８時間インキュベートし、固定し、指定の抗体で染色し、蛍光顕微鏡法によって画像化した。ｅ）ＨｅＬａ細胞にＧＢＦ１−ＧＦＰをトランスフェクトし、翌日ＤＭＳＯ又はＦＬＩ−０６（１０μＭ）又はＢＦＡ（１０μｇ／ｍｌ）又はＧＣＡ（１０μＭ）とともに１０時間インキュベートし、固定し、蛍光顕微鏡法によって画像化した。スケールバー：１０μｍ。

図６：ＦＬＩ−０６は小胞体出口部位へのカーゴの動員に影響を及ぼす。ａ、ａ’、ｂ）ＨｅＬａ細胞にＶＳＶＧ−ＥＧＦＰを一過性にトランスフェクトし、４０℃で一晩インキュベートした。追跡の３０分前に、微小管を氷上でのインキュベーション及びノコダゾールでの処理によって解重合した。同時に、細胞をＤＭＳＯ（対照）又はＦＬＩ−０６（１０μＭ）とともにプレインキュベートした。次いで、細胞を３２℃で指定の時間にわたってノコダゾール及び化合物の存在下で追跡し、続いてＳｅｃ３１に対する抗体を用いた蛍光顕微鏡法のために固定し、処理した。ａ）選択時点での処理した及び非処理の細胞の概要。スケールバー１０μｍ。ａ’）拡大したａ）の選択領域；Ｖ、ＶＳＶＧ−ＥＧＦＰ；Ｓ、Ｓｅｃ３１；Ｍ、マージ。二重矢印、ＥＲＥＳ後コンパートメント内のＥＲＥＳの隣のＶＳＶＧ−ＥＧＦＰ；アローヘッド、ＶＳＶＧ−ＥＧＦＰ及びＳｅｃ３１で共染色したＥＲＥＳ；スケールバー３μｍ。ｂ）ａ）のようなｎ＝３の実験による関心領域（ＲＯＩ）におけるピクセル蛍光強度の分散（ＰＦＩ−Ｖａｒ）の定量化。各条件で少なくとも１０個のＲＯＩを測定した。エラーバーＳＥＭ。ｒ．ｕ．、相対単位。０時点での平均ＰＦＩ−Ｖａｒを１に設定し、他の値をそれに関連付けた。ｃ）ＨｅＬａ−ＮｏｔｃｈΔＥ−ＥＧＦＰ細胞を、ＦＬＩ−０６の不活性誘導体であるＦＬＩ−２５（図５を参照されたい）、又は指定される場合にＦＬＩ−０６で４時間前処理した。細胞を透過処理し、サイトゾル、ＡＴＰ再生系及び指定の化合物を用いた出芽反応を行った。反応の後、ＣＯＰＩＩ小胞を単離し、リボホリンＩ（小胞体マーカー）、ＥＲＧＩＣ−５３及びＳｅｃ２２ｂ（どちらのタンパク質もＣＯＰＩＩ小胞に組み込まれる）についてプロービングした。

図７：ＦＬＩ−０６は小胞体シート形成を誘導する。Ａ）ｐｒｌｓｓ−ＫＤＥＬ−ｍＲＦＰをトランスフェクトしたＣＯＳ細胞を１０μＭのＦＬＩ−０６とともに指定の時間にわたってインキュベートし、生細胞顕微鏡法によって画像化した。挿入図は囲み領域の拡大図である。Ｂ）Ａ）のように処理した細胞の画像を、小胞体管の大部分を失った細胞の割合についてスコアリングした。各時点で４０個〜６０個の細胞を計数した。データは平均比率、エラーバーＳＥＭ、ｎ＝３の独立実験を表す。

図８：５０μＭのＦＬＩ−１４、ＦＬＩ−１５、ＦＬＩ−１９及びＦＬＩ−２０のＤＡＰＴ様表現型。ＮｏｔｃｈΔＥ−ＥＧＦＰを安定に発現するＨｅＬａ細胞を、１μＭのＤＡＰＴ又は５０μＭの化合物とともに１６時間インキュベートし、固定し、免疫蛍光のために処理した。全ての条件で、細胞はＮｏｔｃｈΔＥ−ＥＧＦＰの強いＰＭ蓄積及び核ＮＩＣＤ−ＥＧＦＰの強い減少を示した。

図９：化合物の効果は細胞型特異的ではない。ＮｏｔｃｈΔＥ−ＥＧＦＰを安定に発現するＵ２ＯＳ細胞を指定の１０μＭの化合物とともに１８時間インキュベートし、固定し、蛍光顕微鏡法によって画像化した。ＦＬＩ−１４、ＦＬＩ−１５、ＦＬＩ−１９及びＦＬＩ−２０はＤＡＰＴと同様のＰＭ蓄積を引き起こし、ＦＬＩ−０６はレポーターでは小胞体蓄積、一部の細胞では凝集を引き起こし、全ての化合物の表現型が細胞型特異的でないことが示された。矢印、細胞膜；アローヘッド、小胞体。アスタリスクは、小胞体が崩壊して大きな凝集体となった細胞を示す。スケールバー、１０μｍ。

図１０：Ｎｏｔｃｈ阻害物質の表現型は完全に可逆的である。ＬａｂＴｅｋカバーガラスにプレーティングしたＨｅＬａ ＮｏｔｃｈΔＥ−ＥＧＦＰ細胞を、１０μＭの指定の化合物とともに１８時間インキュベートし、洗浄し、指定の時間にわたって細胞培養培地中でインキュベートした。細胞を生細胞顕微鏡法によって画像化した。ＮｏｔｃｈΔＥ−ＥＧＦＰの小胞体蓄積（ＦＬＩ−０６）又はＰＭ蓄積（ＦＬＩ−１４、ＦＬＩ−１５、ＦＬＩ−１９、ＦＬＩ−２０）は、１時間〜４時間のウォッシュアウト後に核内のＮＩＣＤ−ＥＧＦＰの正常蓄積にまで逆行し、化合物の効果の完全な可逆性が実証された。加えて、これらのデータでは化合物の重大な毒性は示されない。スケールバー、１０μｍ。

図１１：選択された化合物はゼブラフィッシュ胚においてｉｎ ｖｉｖｏで体節形成及び神経発生に影響を及ぼす。ａ）化合物の効果のスコアリングのために参照として使用したＤＡＰＴ処理によって誘導される典型的な代表的表現型の側面図。５０μＭのＤＡＰＴにより６ｈｐｆで処理した胚は体節形成の欠陥（軽度）、頭部及び体幹の奇形（重度）又は発生遅延（遅延）のいずれかを生じた。画像は２４ｈｐｆで撮影した。ｂ）ａ）における２０μＭ、５０μＭ及び１００μＭの指定の化合物で処理した胚の２４ｈｐｆでの表現型の累積相対頻度を示す円グラフ。ｃ）ｎｇｎ１に特異的なリボプローブを用いたＩＳＨを、絨毛膜を除去した４ｈｐｆ段階のゼブラフィッシュ胚に対して行った。前部が左、背部が上である。発生中の頭部の拡大図（ボックス）を示す。矢印はより大きなｎｇｎ１クラスター又はより強いｎｇｎ１染色を示す。ｔ、終脳；ｐ、視蓋前域（pretectum）；ｈ、後脳；ｄ、間脳；ｔｇ、被蓋；ｖｒｃ、腹側吻側クラスター。

図１２：ＦＬＩ−０６は微小管又はアクチンの解重合によってゴルジ体を撹乱しない。ＨｅＬａ細胞を１．５μｇ／ｍｌのノコダゾール（ａ）又は２μＭのサイトカラシンＤ（ｂ）又は１０μＭのＦＬＩ−０６とともに４時間インキュベートした。その後、細胞を固定し、チューブリンに対する抗体を用いる免疫蛍光顕微鏡法のために処理した。ａ）ノコダゾールは、間期細胞における微小管ネットワーク及び有糸分裂における有糸分裂紡錘体（アローヘッド）を撹乱したが、ＦＬＩ−０６は撹乱しなかった。ｂ）サイトカラシンＤはｆ−アクチンを解重合したが、ＦＬＩ−０６は解重合しなかった。スケールバー、１０μｍ。

図１３：ＦＬＩ−０６は初期ゴルジ体及びＴＧＮの分散を引き起こすが、エンドソームの造管を引き起こさない。Ｈｅｌａ細胞をＤＭＳＯ又は１０μＭのＦＬＩ−０６又は１μｇ／ｍｌのＢＦＡとともに１８時間インキュベートし、固定し、指定の抗体で染色し、蛍光顕微鏡法によって画像化した。エンドソームを、Ａｌｅｘａ５５５標識トランスフェリンを氷上で添加することによって可視化し、指定の化合物の存在下、３７℃で１５分間追跡した。矢印により造管しているエンドソームを示した。スケールバー１０μｍ。

図１４：ＦＬＩ−０６はＢＦＡとは異なった形で作用する。ａ）ＨｅＬａ細胞を指定の時間にわたって１μｇ／ｍｌのＢＦＡ又は１０μＭのＦＬＩ−０６とともにインキュベートし、固定し、βＣＯＰ及びジャイアンチン（giantin）に対する抗体を用いる免疫蛍光顕微鏡法のために処理した。ＢＦＡを用いるとβＣＯＰは１０分以内に急速にゴルジ体から解離するが、ＦＬＩ−０６では更に時間がかかる。ｂ）ＨｅＬａ細胞にｐｒｌｓｓ−ＫＤＥＬ−ｍＲＦＰ（小胞体）及びβ４ＧＡＬＴ−ＥＧＦＰ（ゴルジ体）をトランスフェクトし、指定の時間にわたって１μｇ／ｍｌのＢＦＡ又は１０μＭのＦＬＩ−０６とともにインキュベートし、固定し、免疫蛍光顕微鏡法のために処理した。ＢＦＡとは対照的に、ＦＬＩ−０６は小胞体及びゴルジ体の融合をもたらさない。３６０分でのゴルジ体マーカーの小胞体様染色は、恐らくは新たに合成されたタンパク質によるものである。ｃ）ＨｅＬａ細胞にＶＳＶＧ−ＥＧＦＰをトランスフェクトし、ＶＳＶＧ−ＥＧＦＰを小胞体内に維持するように期間中４０℃でインキュベートした。細胞を１０μｇ／ｍｌのシクロヘキシミド及びＤＭＳＯ、ＢＦＡ又は指定のＦＬＩ−０６により４０℃で４時間処理し、溶解し、ＳＤＳ ＰＡＧＥに供した。ＢＦＡとのインキュベーションは、ＳＤＳゲル中でのより低い移動度によって示されるように小胞体における過剰グリコシル化をもたらしたが（過剰グリコシル化（hyperglyc.））、ＦＬＩ−０６はもたらさなかった。この過剰グリコシル化により、ゴルジ体内在酵素がＢＦＡの場合は小胞体に再分布するが、ＦＬＩ−０６では再分布しないことが示唆される。

図１５：ＦＬＩ−０６はＧＰＩアンカー型可溶性タンパク質の輸送を阻害し、小胞体ストレスを引き起こさない。ａ）ＨｅＬａ細胞にＹＦＰ−ＧＰＩ（Patrik Kellerにより厚意提供）を一過性にトランスフェクトし、ＤＭＳＯ又は１μｇ／ｍｌのＢＦＡ又は１０μＭのＦＬＩ−０６とともに１８時間インキュベートした。その後、細胞を固定し、免疫蛍光顕微鏡法によって分析した。ＦＬＩ−０６及びＢＦＡはＹＦＰ−ＧＰＩの表面輸送を阻害する。ｂ）ＨｅＬａ細胞にＫｌｏｔｈｏの分泌型細胞外ドメイン（ＫｌｏｔｈｏＳ、Makoto Kuro-oにより厚意提供）をコードするプラスミドを一過性にトランスフェクトした。化合物とともに１８時間インキュベートした後、培地を回収し、細胞を溶解し、ともにＫｌｏｔｈｏ抗体を用いるウエスタンブロット法によって分析した。ローディング対照として、膜をアクチンについてプロービングした。ＢＦＡ及びＦＬＩ−０６はＫｌｏｔｈｏＳの分泌を阻害する。ｃ）Ｈｅｌａ細胞を指定の化合物とともにインキュベートし、６時間又は２４時間後に溶解し、ブロットし、ＢＩＰ又はローディング対照としてのアクチンについてプロービングした。ｄ）ルシフェラーゼベースの小胞体ストレス指標プラスミドｐ５ｘＡＴＦ６−ＧＬ３（Addgene＃１１９７６）及びウミシイタケ対照プラスミドをトランスフェクトしたＨｅｌａ細胞を指定の化合物とともにインキュベートし、指定の時間の後に溶解し、ルシフェラーゼ活性を決定した。２μｇ／ｍｌのツニカマイシン（Ｔｕｎ）及び５ｍＭのＤＴＴを陽性対照として使用した。どちらのアッセイにおいても、ＦＬＩ−０６は２４時間後に非常に軽度の小胞体ストレスしか引き起こさなかった。３回の独立実験の平均を示し、エラーバーは標準偏差を示す。

図１６：小胞体出口阻害物質のみが小胞体管をシートに変換する。ＬａｂＴｅｋ多室（chambered）カバースリップにプレーティングしたＣＯＳ細胞に、小胞体マーカーｐｒｌｓｓ−ＫＤＥＬ−ｍＲＦＰを一過性にトランスフェクトし、翌日１０μＭの指定の化合物とともに２時間インキュベートし、生細胞顕微鏡法によって画像化した。小胞体出口阻害物質（図５ａを参照されたい）ＦＬＩ−０６、３、４及び５のみが顕著な小胞体シート形成を示した。ＦＬＩ−０６＋ＣＨＸについては、細胞を４０μＭのシクロヘキシミド中で更にインキュベートした。ｎｉｆｅ、ニフェジピン；ｎｉｍｏ、ニモジピン。数字は図５ａにおけるナンバリングを示す。

図１７：ＦＬＩ−０６は小胞体搬出を即座に遮断する。ＨｅＬａ細胞にＶＳＶＧ−ＥＧＦＰを一過性にトランスフェクトし、４０℃で一晩インキュベートした。追跡の３０分前に、微小管を氷上でのインキュベーション及びノコダゾールでの処理によって解重合した。加えて、細胞をＤＭＳＯ（対照）若しくはＦＬＩ−０６とともに３０分間（ＦＬＩ−０６＋３０ ｍｉｎ ｐｒｅ）、若しくはＦＬＩ−０６とともに１０分間（＋１０ ｍｉｎ ｐｒｅ）プレインキュベートするか、又は単にＦＬＩ−０６を追跡培地に添加した（ＦＬＩ−０６ ｎｏ ｐｒｅ）。次いで、細胞を３２℃で指定の時間にわたってノコダゾール及びＦＬＩ−０６（対照を除く）の存在下で追跡し、続いて固定した。ピクセル蛍光強度の分散（ＰＦＩ−Ｖａｒ）の定量化を、１回の実験につき１つの条件当たり少なくとも１５個の細胞において関心領域（ＲＯＩ）で行った。ｎ＝３の独立実験、エラーバーＳＥＭ。ａ．ｕ．、任意単位。プレインキュベーションなしに単に追跡培地に添加した場合であっても、ＦＬＩ−０６はＶＳＶＧ−ＥＧＦＰの濃縮及びその後の小胞体搬出を阻害する。

図１８：ＦＬＩ−０６は分泌型アルカリホスファターゼの分泌を阻害し、ＦＬＩ−０６はがん性Ｎｏｔｃｈ依存性Ｔ細胞を死滅させる。ａ）分泌型アルカリホスファターゼ（ＳＥＡＰ）アッセイを行った。培地を回収し、ＳＥＡＰ分泌を測光法によって測定した。ＦＬＩ−０６インキュベーションにおけるＳＥＡＰの分泌の阻害を確認した。ｂ）ＤＮＤ−４１細胞は活性化Ｎｏｔｃｈ突然変異を有する（Weng et al, 2004, Science 306, 269）。細胞を指定量のＦＬＩ−０６又はＤＭＳＯ対照を含む懸濁液中で成長させ、成長をＦＡＣＳ分析によって決定した。培地濃度（１μＭ）のＦＬＩ−０６は増殖を阻害したが、高濃度（１０μＭ）のＦＬＩ−０６はがん細胞株を死滅させた。

図１９：ＦＬＩ−０６の分子構造。熱振動楕円体は４０％確率レベルで示す。

本明細書で提示される実施例は本発明の特定の実施形態の実用上の支援であり、本発明の範囲を限定することを意図するものではない。実施例は、１つ又は複数の非限定的な実施形態の関連の技術的作用を実証する可能な潜在的に好ましい実施形態の更なる説明を提供するものと考えるべきである。

顕微鏡ベースのハイコンテントスクリーニングの確立
Ｎｏｔｃｈ輸送／プロセシングに関与する新規の調節因子を同定するために、画像ベースのハイコンテントスクリーニングを設定した。この目的のために、ＥＧＦＰタグ付きの転写的に不活性なリガンド非依存性Ｎｏｔｃｈ１構築物を安定に発現するＨｅＬａ Ｋｙｏｔｏ細胞株を採用した（図１ａ、ＮｏｔｃｈΔＥ−ＥＧＦＰ^１５）。ＮｏｔｃｈΔＥ−ＥＧＦＰはＰＭでのγ−セクレターゼの直接基質であり、生理的条件下では核に移行するＮＩＣＤ−ＥＧＦＰへとタンパク分解的にプロセシングされ（スキームについては図１ｂを参照されたい）、定常状態で強い核ＥＧＦＰ染色を生じる^１５（図１ｄ）。ＧＳＩ ＤＡＰＴによりγ−セクレターゼを阻害すると、レポーターがＰＭに蓄積し、核蛍光が減少した（図１ｄ）。重要なことには、レポーターの細胞内局在化における変化は自動顕微鏡法による定量化に適している^１５。したがって、レポーター蛍光を核（ｎｕｃ）及び核周辺の環（ｅｎｕｃ）で決定し、ｅｎｕｃ／ｎｕｃ比を評価した（図１ｃに図式化）。その後、アッセイ設計を機能的に検証した。核外のレポーターのＤＡＰＴ誘導蓄積は濃度依存性であることが見出され、ＥＣ５０は０．６８±０．２μＭであった（１８時間インキュベーション、図１ｅ）。核内のＮＩＣＤ−ＥＧＦＰ蛍光は減少し、１μＭのＤＡＰＴでｔ_１／２は４．７±１．０時間、ｔ_９／１０は８．６±２．９時間であった（図１ｅ）。目視検査により細胞が常に生存可能であったことが示された。本発明者らは以前に、ＮＩＣＤの核内輸送におけるこれらの細胞欠陥を自動顕微鏡法によって定量化することできることを示した^１５。このアッセイはまた、分泌経路における輸送欠陥を確実に検出した。例えば、イオノフォアモネンシン^１６による用量依存的なゴルジ体での分泌経路を介したＮｏｔｃｈΔＥ−ＥＧＦＰの順行性輸送の遮断を、自動顕微鏡法により定量化することができた（図１ｆ、図１ｇ）。さらに、ＭＧ１３２によるプロテアソーム分解を阻害した際の核内のＮＩＣＤの蓄積を自動顕微鏡法により検出した（図１ｈ、図１ｉ）。総合すると、Ｎｏｔｃｈレポーターの輸送及びプロセシングにおける濃度及び時間依存的変化の確実な検出についてアッセイを検証した。

３８４ウェルプレート及び自動液体操作についてアッセイ条件を最適化した後、ＮｏｔｃｈΔＥ−ＥＧＦＰレポーター細胞株を、１６６７１個の化合物を含むＣｈｅｍＢｉｏＮｅｔライブラリーに対してスクリーニングした^１７（図１ｊに要約）。ｅｎｕｃ／ｎｕｃ比を計算し、上位３５２個の化合物を追跡実験において調査した。画像を表現型について目視検査し、細胞生存及びＥＣ_５０値を決定して、６８個の化合物の一次ヒットリストを得た。詳細な追跡研究のために７個の化合物を選択したが（表１）、そのいずれも以前に関連生物活性について注釈されていなかった。

表１：化合物スクリーニングによる上位７個のヒットリスト。３５２個の初期ヒットの画像を目視検査し、顕著な表現型及び無傷核を有する７個の化合物を選択した。ＥＣ_５０値を方法のセクションに記載のように決定した。

選択された化合物は独特の段階でＮｏｔｃｈ輸送／プロセシングを遮断する
ＨＣＳ画像の解像度は、ＮｏｔｃｈΔＥ／ＮＩＣＤの細胞内（subcellular）分布の詳細な分析には十分でなかった。したがって、レポーター細胞株をカバースリップ上にプレーティングし、最終ヒットリストの１０μＭの個々の化合物とともにインキュベートした。２４時間後に、ＮｏｔｃｈΔＥ−ＥＧＦＰ／ＮＩＣＤ−ＥＧＦＰの局在化を蛍光顕微鏡法によって決定した。上記で示したように、定常状態ではレポーター蛍光は核に局在し、ＤＡＰＴ処理後にＰＭに蓄積した（図２ａ）。ＦＬＩ−１４、ＦＬＩ−１５、ＦＬＩ−１９及びＦＬＩ−２０とのインキュベーションは、ＤＡＰＴと同様にＰＭ及び核周辺ゴルジ体様構造でのレポーターの蓄積を引き起こした（図２ａ）。核ＮＩＣＤ−ＥＧＦＰ蛍光はＤＡＰＴについて観察される程度まで減少せず、化合物がＤＡＰＴよりも効果的でないことが示唆された。実際に、核ＮＩＣＤ−ＥＧＦＰ蛍光及び付随するＰＭでの蓄積の大幅な低減が５０μＭのＦＬＩ−１４、ＦＬＩ−１５、ＦＬＩ−１９及びＦＬＩ−２０とのインキュベーション後に得られた（図８）。ＦＬＩ−０６処理は核蛍光及び細胞内膜での局在化の低減をもたらした。他の化合物は、この一次検証ではレポーター局在化を変化させなかった（図２ａ、ＦＬＩ−１３、ＦＬＩ−１６）。

次に、化合物で処理したＨｅＬａ ＮｏｔｃｈΔＥ−ＥＧＦＰ細胞の溶解物を、ＮｏｔｃｈΔＥ−ＥＧＦＰのプロセシングについてＥＧＦＰ及びＮＩＣＤに特異的な抗体を用いたウエスタンブロット法により分析した（図２ｂ、図２ｃ）。ＧＦＰ抗体では非切断レポーターＮｏｔｃｈΔＥ−ＥＧＦＰ及びγ−セクレターゼ生成物ＮＩＣＤ−ＥＧＦＰの両方が検出されたが、ＮＩＣＤ特異的抗体は切断型ＮＩＣＤ−ＥＧＦＰを特異的に検出した。ＦＬＩ−０６、ＦＬＩ−１４、ＦＬＩ−１５、ＦＬＩ−１９及びＦＬＩ−２０での細胞の処理はＮｏｔｃｈΔＥ−ＥＧＦＰの蓄積をもたらした。同時に、ＦＬＩ−０６、ＦＬＩ−１４、ＦＬＩ−１５及びＦＬＩ−２０はＮＩＣＤ−ＥＧＦＰ生成の減少をもたらした。ＦＬＩ−１３及びＦＬＩ−１６はＮｏｔｃｈΔＥ−ＥＧＦＰプロセシングに影響を与えなかった。観察された効果は、ＮｏｔｃｈΔＥ−ＥＧＦＰを安定に発現するＵ２ＯＳ細胞においても見られたため細胞型特異的ではなかった（図９）。成分のウォッシュアウト後の生細胞顕微鏡法によりＦＬＩ−０６、ＦＬＩ−１４、ＦＬＩ−１５、ＦＬＩ−１９及びＦＬＩ−２０の表現型が１時間〜４時間以内に完全に可逆的であることが示され、これは化合物が細胞内で急性毒性でないことも示す（図１０）。

４個の化合物がγ−セクレターゼ阻害物質である
ＰＭでのＮｏｔｃｈΔＥ−ＥＧＦＰの蓄積及び核内のＮＩＣＤ−ＥＧＦＰの減少により、ＦＬＩ−１４、ＦＬＩ−１５、ＦＬＩ−１９及びＦＬＩ−２０がγ−セクレターゼプロセシングに影響を及ぼすことが示唆された。γ−セクレターゼはＮｏｔｃｈに加えて多くの基質を有し、アミロイド前駆体タンパク質ＡＰＰが最も顕著である（概説については^２を参照されたい）。ＮｏｔｃｈΔＥ−ＥＧＦＰプロセシングに影響を及ぼす化合物がＡＰＰプロセシングにも影響を与えるか否かを試験するために、相当量のＡβを生じる突然変異型ＡＰＰであるＡＰＰ_Ｓｗｅを安定に発現するＨＥＫ２９３細胞を使用した^１８。細胞上清中のＡβはＦＬＩ−１５及びＦＬＩ−２０による処理後に僅かに減少したが、ＦＬＩ−０６及びＦＬＩ−１４による処理後にＧＳＩ ＤＡＰＴと同様に本質的に消失した（図３ａ）。同様に、γ−セクレターゼの直接基質であるＡＰＰ_ＣＴＦは、Ａβの効果と一致してＦＬＩ−１４、ＦＬＩ−１５及びＦＬＩ−２０処理細胞で蓄積した。ＦＬＩ−０６処理細胞では、Ａβ分泌の強い低減にもかかわらずＡＰＰ_ＣＴＦは蓄積せず、ＡＰＰがβ−セクレターゼにより切断されないことが示唆された。他の全ての化合物はＡＰＰ_ＣＴＦ又はＡβに対して効果を有しなかった。ＡＰＰ及びＡＰＰｓを分析したところ、ＡＰＰの脱落した細胞外ドメインがα−セクレターゼ及びβ−セクレターゼによりプロセシングされ^１９、ＦＬＩ−０６がＡＰＰのグリコシル化パターンを変化させ、ＡＰＰｓの脱落を止めるが、他の化合物ではそうではないことが観察された。ＦＬＩ−１６、ＦＬＩ−１９及びＦＬＩ−２０はＡＰＰｓ分泌を低減した（図３ａ）。

ＦＬＩ−０６が他の膜タンパク質に影響を及ぼすか否かを試験するために、ＡＰＰ及びＮｏｔｃｈのようにプロセシングされるＩ型タンパク質であるＫｌｏｔｈｏ^２０を分析した。ＦＬＩ−０６によるＫｌｏｔｈｏを安定に発現するＨＥＫ２９３細胞の処理は正常未熟型及び成熟型のＫｌｏｔｈｏとは異なる異常なグリコシル化を生じたが、他の化合物では生じなかった（図３ａ）。成熟複合グリコシル化後期ゴルジ形態のＫｌｏｔｈｏは大幅に減少し、ＦＬＩ−０６がＫｌｏｔｈｏの輸送に影響を及ぼすことが示唆された。同様に、α−セクレターゼ切断及びβ−セクレターゼ切断により生じる脱落したＫｌｏｔｈｏ_ｓをアッセイしたところ、ＦＬＩ−０６は培地中のＫｌｏｔｈｏ_ｓの大幅な減少をもたらしたが、他の化合物はもたらさず、ＦＬＩ−０６が細胞表面輸送を阻害することが示唆された（図３ａ）。これらのデータからＦＬＩ−１４、ＦＬＩ−１５、ＦＬＩ−１９及びＦＬＩ−２０はγ−セクレターゼに作用するが、ＦＬＩ−０６が恐らくは分泌経路における輸送を妨げることによって作用することが示唆された。γ−セクレターゼ活性を分析するために、単離膜を用いたｉｎ ｖｉｔｒｏアッセイを行った（図３ｂ、図３ｃ）。ＮＩＣＤ−ＥＧＦＰ及びＡＩＣＤ（ＡＰＰ細胞内ドメイン）の生成をアッセイした。どちらもｉｎ ｖｉｔｒｏでは３７℃で生成したが、４℃では生成せず、その生成はＤＡＰＴによって阻害された。試験した化合物の中で、ＦＬＩ−１５及びＦＬＩ−２０のみがＮＩＣＤ−ＥＧＦＰ及びＡＩＣＤ生成を明らかに低減し、それらが直接の非基質選択的γ−セクレターゼ阻害物質として作用することが示唆された。対照的に、ＦＬＩ−０６、ＦＬＩ−１４及びＦＬＩ−１９は単離膜においてγ−セクレターゼに影響を及ぼさなかった（図３ｂ、図３ｃ）。細胞アッセイで活性であることが示されなかったＦＬＩ−１３及びＦＬＩ−１６は、ｉｎ ｖｉｔｒｏでもγ−セクレターゼ活性に影響を及ぼさなかった。総合すると、これらのデータから（ｉ）ＦＬＩ−１５及びＦＬＩ−２０が細胞内及びｉｎ ｖｉｔｒｏでγ−セクレターゼを阻害すること、（ｉｉ）ＦＬＩ−１４及びＦＬＩ−１９が細胞内でＮｏｔｃｈ及びＡＰＰプロセシングを阻害するが、ｉｎ ｖｉｔｒｏでγ−セクレターゼを阻害しないこと、並びに（ｉｉｉ）ＦＬＩ−０６が分泌経路を介した全般的輸送に影響を及ぼすことが示唆された。

内因性Ｎｏｔｃｈシグナル伝達に対する化合物の効果
本発明者らは、ＮｏｔｃｈΔＥ−ＥＧＦＰ構築物を用いて得られた結果が内因性Ｎｏｔｃｈシグナル伝達と関連するか否かを試験しようとした。したがって、内因性Ｎｏｔｃｈを発現する筋発生の十分に確立されたモデルであるＣ２Ｃ１２細胞を使用した^{２１，２２}。Ｎｏｔｃｈリガンドデルタをトランスフェクトすることによって内因性Ｎｏｔｃｈシグナル伝達を刺激した後、Ｎｏｔｃｈ活性を化合物の存在下又は非存在下でＮｏｔｃｈレポーター^１５を用いたルシフェラーゼアッセイによって測定した（図４ａ）。ＦＬＩ−０６、ＦＬＩ−１４及びＦＬＩ−１６は強く、ＦＬＩ−１９は大幅に内因性Ｎｏｔｃｈシグナル伝達を１０μＭでＤＡＰＴと同様に阻害した。ＦＬＩ−１５及びＦＬＩ−２０は１０μＭではＮｏｔｃｈシグナル伝達に殆ど影響を及ぼさなかったが、５０μＭでは顕著に影響を及ぼした（図４ａ、５０μＭでの値のみを示す）。次に、選択された化合物がｉｎ ｖｉｖｏでＮｏｔｃｈシグナル伝達に影響を及ぼすか否かを試験した。この目的で、ゼブラフィッシュゼブラ・ダニオ（Danio rerio）を、初期発生プロセスの研究へのその多用途性のために、またＧＳＩで処理した場合に体節形成及び神経発生において独特のＮｏｔｃｈ表現型を示すことから使用した^{２３，２４}。化合物を、絨毛膜を除去した４ｈｐｆ段階のゼブラフィッシュ胚に添加し、効果を２４時間後に体節形成の形態検査により分析した。表現型を正常な体節、軽度の体節欠陥、強い体節欠陥及び発生遅延の４つのカテゴリーにランク付けた。全ての化合物がＤＡＰＴと同様に独特のＮｏｔｃｈ表現型を誘導した（図１１ａ、図１１ｂ）。付加的なパラメータとして、神経発生に関与するＮｏｔｃｈ依存性遺伝子を分析することにした。ゼブラフィッシュの一次神経発生は、Ｎｏｔｃｈ依存性側方抑制により負に調節されるプロセスである、前神経クラスター（Ｎｏｔｃｈ発現細胞）からの神経芽細胞の選択（Ｎｏｔｃｈにより抑制される）を含む^２５。したがって、神経特異化因子ニューロゲニン（ｎｇｎ１^２６）を発現する神経芽細胞は、例えばＤＡＰＴ処理によってＮｏｔｃｈシグナル伝達が損なわれた場合、より豊富となった^{２３，２７}。同量の胚から抽出したｍＲＮＡのｑＰＣＲ分析をｎｇｎ１発現について行った（図４ｂ）。ＤＡＰＴ、ＦＬＩ−０６、ＦＬＩ−１４、ＦＬＩ−１５及びＦＬＩ−２０による処理の後、ｎｇｎ１ ｍＲＮＡレベルは顕著に増大したが、ＦＬＩ−１６及びＦＬＩ−１９による処理はｎｇｎ１ ｍＲＮＡレベルでは顕著な変化を誘導しなかった。ｑＰＣＲによって得られたデータを確認するために、ｎｇｎ１特異的リボプローブを用いた全載ｉｎ ｓｉｔｕハイブリダイゼーション（ＩＳＨ）を行った（図４ｃ、図１１ｃ）。ＩＳＨにより、ＤＡＰＴ又はＦＬＩ−０６、ＦＬＩ−１４、ＦＬＩ−１５及びＦＬＩ−２０で処理した殆どの胚（７５％未満、１条件につきｎ＝１０〜１６）が脊髄に沿って、主に運動ニューロン層でＤＭＳＯ処理対照胚と比較して拡大した、より密なｎｇｎ１陽性細胞のクラスターを示すことが示された（図４ｃ）。同様に、ＤＡＰＴ並びにＦＬＩ−０６、ＦＬＩ−１４、ＦＬＩ−１５及びＦＬＩ−２０で処理した胚の発生中の脳におけるｎｇｎ１陽性細胞クラスターは、ＤＭＳＯ対照と比較して差別的に拡大した（図１１ｃ）。対照的に、ｎｇｎ１陽性クラスターのサイズはＦＬＩ−１６処理胚で減少し、ＦＬＩ−１９処理胚で増大したが、どちらもｑＰＣＲ分析では変化を誘導しなかった。総合すると、ＦＬＩ−０６、ＦＬＩ−１４、ＦＬＩ−１５、ＦＬＩ−１９及びＦＬＩ−２０はｉｎ ｖｉｔｒｏ及びｉｎ ｖｉｖｏで内因性Ｎｏｔｃｈシグナル伝達を阻害し、ＮｏｔｃｈΔＥ−ＥＧＦＰレポーターのデータを裏付けるものであった。

小分子ヒットの検証
上記の実験から、ジヒドロピリジンＦＬＩ−０６（１）が新規の作用様式を有する顕著なヒット化合物として浮上した。小分子の構造を確認するために、これを単独でｄｅ ｎｏｖｏ再合成し、再結晶化により精製し、Ｘ線結晶学により厳密に特性化した。この物質が初期スクリーニングヒットと同等に活性であることが見出された。２つの構造的に関連した１，４−ジヒドロピリジンである、臨床的に確立されたＣａ^２＋チャネル遮断薬ニフェジピン（nifedipine）（オルト−ＮＯ_２基；本発明の化学式には包含されない）及びニモジピン（nimodipine）（メタ−ＮＯ_２基；同様に本発明の化学式には包含されない）を同時に試験したところ、本アッセイシステムで完全に不活性であることが見出され、付随するＣａ^２＋シグナル伝達事象の変調が、観察される表現型の原因とはならないことが示された（図５ａ）。

次いで、化合物活性の特異性に関する洞察を得るため、また潜在的に代謝的に不安定な構造要素（ＮＯ_２基、ジヒドロピリジン環）が、観察される表現型を妨げないことを確実にするために、化合物取得及び専用合成の組合せを用いて予備ＳＡＲ研究を行った。ＮｏｔｃｈΔＥ−ＥＧＦＰ細胞におけるｅｎｕｃ／ｎｕｃ比を決定することによって活性を測定した（図５ａ）。本発明の式ＩによるＲ２位のより長い又は親油性の置換基が活性に好ましいが（Ｐｅｎｔ（３；ＦＬＩ−２７）、ｃＨｅｘ（１，５；ＦＬＩ−０６、ＦＬＩ−２５）及びｃＨｅｐｔ（４；ＦＬＩ−２８））、ｉｓｏ−ｐｒ基も所望の効果を示すことが見出された。化合物４（ＦＬＩ−２８）は化合物１の２倍の活性であった（ＦＬＩ−０６）。

４−ＮＯ_２基は、その代謝回転を不可能にしないため好ましい置換基であり、観察される表現型に重要であり得る。ペンダントケト基のＯ−アルキルオキシムへの変換も、完全に不活性な物質を生成した（化合物６；本発明の化学式に包含されない）。驚くべきことに、ＦＬＩ−０６はジヒドロピリジン骨格の既知の標的とは無関係の作用様式を有する細胞において非常に独特な効果を及ぼした。

既知の化合物が本発明による所望の機能的特性を示すか否かを評価するために、従来技術の幾つかの化合物を用いて更なる比較を行った。図５ｂに示されるように、特許文献１の化合物ＨＰＩ−１、特許文献２の化合物Ｃ３、Ｃ４及びＣ５、並びに特許文献４の化合物ＳＴ２１６０９３をＮｏｔｃｈΔＥ−ＥＧＦＰ細胞において試験した。化合物Ｅを陽性対照として準備した。

従来技術の化合物の具体的な構造を図５ｃに示す。化合物ＨＰＩ−１、Ｃ３、Ｃ４及びＣ５は本発明のアッセイを用いた場合に活性を示さない。しかしながら、化合物ＳＴ２１６０９３は所望の活性を示す。ＳＴ２１６０９３はこれまでアルツハイマー病の治療の点でしか開示されておらず、特許文献４には活性を欠くものとして開示されている。

ＦＬＩ−０６はＢＦＡとは異なった形でゴルジ装置の撹乱をもたらす
この段階では、ジヒドロピリジンＦＬＩ−０６の細胞活性をより詳細に、すなわち細胞内膜におけるＮｏｔｃｈΔＥ−ＥＧＦＰの異常な蓄積を調査することを目的とした（図２ａ）。ＡＰＰ及びＫｌｏｔｈｏの異常なグリコシル化パターン並びにその細胞外ドメイン脱落の減少（図３ａ）から、ＦＬＩ−０６が分泌経路に負に干渉することが示唆された。特筆すべきことに、小胞体（カルネキシン）及びゴルジ体（ジャイアンチン）のマーカーを用いたＨｅＬａ細胞の免疫蛍光分析から、ＦＬＩ−０６がゴルジ体の完全な撹乱を引き起こすが、小胞体は少なくともこの解像度で画像化した場合に殆ど影響を受けないようであることが明らかになった（図５ｄ）。ＦＬＩ−０６処理後のゴルジ体の錯乱は、ブレフェルディンＡ（ＢＦＡ^２９）又はゴルジシドＡ（ＧＣＡ^３０）と同様に、微小管の分解^２８又は初期分泌経路における膜輸送の干渉に起因し得る。

これらの代替物を区別するために、細胞をＦＬＩ−０６又は微小管解重合剤ノコダゾールとともにインキュベートし、蛍光顕微鏡法によって分析した（図１２ａ）。ノコダゾール処理後に微小管ネットワークはほぼ完全に崩壊し、有糸分裂紡錘体は分裂細胞に存在しなかったが、ＦＬＩ−０６処理細胞及び非処理細胞のいずれにおいても完全に無傷の微小管細胞骨格及び有糸分裂紡錘体が観察された。アクチンの重合及び分布は影響を受けないままであり、ＦＬＩ−０６が細胞骨格に作用しないことが示唆された（図１２ｂ）。ＢＦＡと同様に、ＦＬＩ−０６はサイトゾル全体でシス−ゴルジ体マーカーＧＭ１３０及びトランス−ゴルジ網（ＴＧＮ）マーカーＴＧＮ４６の分散を引き起こした（図１３）。ＦＬＩ−０６及びＢＦＡはどちらもトランスフェリン取り込みアッセイにおいてエンドサイトーシスに影響を及ぼさなかった。しかしながら、ＢＦＡとは対照的に、ＦＬＩ−０６はエンドソームの造管を引き起こさなかった（図１３）。ＢＦＡとの別の顕著な相違が、ＣＯＰＩ由来コートマー複合体の構成要素であるβＣＯＰの分散を評価した場合に観察された^３１。ＢＦＡ処理細胞ではゴルジ体様核近傍βＣＯＰ染色は１０分後に既に失われていたが、ＦＬＩ−０６処理細胞ではこれに３０分〜４０分かかった（図１４ａ）。ＢＦＡとは対照的に、ＦＬＩ−０６による処理は小胞体及びゴルジ体の融合をもたらさなかった（図１４ｂ）。また、ＢＦＡとは対照的に、ＦＬＩ−０６はゴルジ体内在酵素が小胞体に再分布しないという観察結果と一致して、ＶＳＶＧ−ＥＧＦＰの過剰グリコシル化を引き起こさなかった（図１４ｃ）。ＢＦＡは、分泌経路における様々な輸送段階に関与する幾つかのＡｒｆ−ＧＥＦを阻害することによって作用する^{３２，３３}。ゴルジシドＡ（ＧＣＡ）は、初期分泌経路に作用するＡｒｆ−ＧＥＦであるＧＢＦ１のみを阻害する^３０。ＦＬＩ−０６がＧＢＦ１に作用するか否かを試験するために、ＨｅＬａ細胞にＧＢＦ１−ＧＦＰをトランスフェクトし^３４、ＢＦＡ、ＧＣＡ及びＦＬＩ−０６でそれぞれ処理した（図５ｅ）。ＧＢＦ１−ＧＦＰは非処理細胞ではサイトゾル分布を示したが、ＢＦＡ処理細胞及びＧＣＡ処理細胞では断片化ゴルジ体に動員された。対照的に、ＦＬＩ−０６処理細胞ではＧＢＦ１−ＧＦＰは対照細胞の分布を示し、ＦＬＩ−０６がＧＢＦ１に作用せず、したがってＢＦＡ又はＧＣＡとは異なることが示唆された。小胞体内在シャペロンＢＩＰの上方調節及びＡＴＦ６ルシフェラーゼアッセイにより示されるように、ＢＦＡ及びＧＣＡが小胞体ストレスを引き起こすが、ＦＬＩ−０６は引き起こさないことにも注目した（図１５ｃ、図１５ｄ）。総合すると、これらのデータから、ＦＬＩ−０６に起因するゴルジ体の分散が微小管の解重合によって媒介されず、ＢＦＡ様機構とは異なることが示唆された。

ＦＬＩ−０６は小胞体出口部位へのカーゴ動員を阻害する
ＦＬＩ−０６処理細胞とＢＦＡ処理細胞又はＧＣＡ処理細胞との相違により、小胞体出口部位（ＥＲＥＳ）である初期分泌経路における最初の選別／出芽位置に対するＦＬＩ−０６の効果を分析することとなった。ＦＬＩ−０６は全体的に膜貫通分泌輸送（図３ａ）、分泌タンパク質及びＧＦＰアンカー型タンパク質（図１５ａ、図１５ｂ）に影響を及ぼす。したがって、分泌輸送の基本的なレポーターとしてＧＦＰタグ付き温度感受性ＶＳＶＧ−ｔｓＯ４５−突然変異体（ＶＳＶＧ−ＥＧＦＰ^３５）を選択した。ＶＳＶＧ−ＥＧＦＰは４０℃でミスフォールドし、小胞体に蓄積する。許容温度（３２℃）に移すと、ＶＳＶＧ−ＥＧＦＰの波が小胞体から搬出され、リアルタイムで追跡することができる^{３５，３６}。ＶＳＶＧ−ＥＧＦＰをＨｅＬａ細胞にトランスフェクトし、４０℃でインキュベートして小胞体に蓄積させ、ＦＬＩ−０６の存在下及び非存在下で３２℃に移すことによってＥＲＥＳへと放出させた（図６ａ）。ＥＲＥＳからの搬出を遅らせるために、微小管の解重合を誘導するが小胞体搬出を阻害しないノコダゾールとともに細胞を更にインキュベートした^３７。先述のように^３７、非処理細胞を許容温度に移すことでＶＳＶＧ−ＥＧＦＰがＥＲＥＳに蓄積し、ＥＲＥＳマーカーＳｅｃ３１ａとの共局在化によって可視化された（図６ａ、図６ａ’、３０分、アローヘッド）。８５分後には殆どのＶＳＶＧ−ＥＧＦＰが小胞体及びＥＲＥＳから離れ、Ｓｅｃ３１ａを欠くＥＲＥＳ後コンパートメントに蓄積した（図６ａ’、８５分、二重矢印）。際立って対照的に、ＦＬＩ−０６とインキュベートした細胞ではＶＳＶＧ−ＥＧＦＰは小胞体内に拡散分布したままであり、３０分後にＳｅｃ３１ａとの共局在化は殆ど観察されなかった。８５分後にはＶＳＶＧ−ＥＧＦＰの幾らかの弱い蓄積がＥＲＥＳに見られた（図６ａ、図６ａ’、８５分、アローヘッド）。Dukhovny et al.^３７に従うピクセル蛍光強度の分散の定量化により、対照細胞ではＶＳＶＧ−ＥＧＦＰが急速にＥＲＥＳに出入りするが、ＦＬＩ−０６処理細胞ではＥＲＥＳへの動員が大幅に低減するという観察結果が支持された（図６ｂ）。図６に示す細胞は、最大阻害を確実にするためにＦＬＩ−０６により４０℃で３０分間前処理した。ＦＬＩ−０６作用の速度に関して初期見解を得るために、ＶＳＶＧ−ＥＧＦＰをトランスフェクトした細胞を３２℃での追跡の前に３０分間若しくは１０分間前処理するか、又は単にＦＬＩ−０６を追跡培地に添加した。どちらの場合にも、小胞体搬出は３０分間のプレインキュベーションの場合と同程度に阻害され、ＦＬＩ−０６が小胞体搬出に即座に作用することが示された（図１６）。興味深いことに、ＶＳＶＧ−ＥＧＦＰ及び恐らくは他のカーゴは動員されず、Ｓｅｃ３１ａの斑点がＦＬＩ−０６処理後にも観察された（図６ａ）。ＶＳＶＧ−ＥＧＦＰに関する免疫蛍光データから、ＦＬＩ−０６がカーゴ動員等のＥＲＥＳ前段階に作用することが示唆された。したがって、これはＥＲＥＳからのＣＯＰＩＩ出芽に影響を及ぼすものではないとする。この仮説を試験するために、透過処理細胞を用いる十分に確立されたｉｎ ｖｉｔｒｏ出芽アッセイにおいて、ラット肝臓サイトゾル及びＡＴＰ再生系を採用した。このアッセイでは、ＥＲＧＩＣ−５３及びＳｅｃ２２ｂをＣＯＰＩＩ小胞に組み込まれるタンパク質のマーカーとし、リボホリンＩを小胞体内在タンパク質のマーカーとした^３８。このアッセイから、ＦＬＩ−０６がアッセイに直接添加した場合にＣＯＰＩＩ出芽反応を阻害せず（図６ｃ）、既知のＳａｒ１媒介小胞体搬出の阻害物質であるＨ８９^３９がＣＯＰＩＩ小胞の形成を完全に遮断することが実証された。対照的に、細胞をＦＬＩ−０６で４時間前処理した場合、ＣＯＰＩＩ小胞の出芽はＦＬＩ−０６の非存在下で僅かに阻害され、１００μＭのＦＬＩ−０６の存在下で強く阻害された。対照として、他の全ての細胞をＦＬＩ−０６の不活性誘導体であるＦＬＩ−２５で前処理した（図５ａを参照されたい）。出芽反応に添加した場合、ＦＬＩ−２５は１０μＭであっても１００μＭであってもｉｎ ｖｉｔｒｏでのＣＯＰＩＩ出芽反応に効果を有しなかった。要約すると、これらのデータから、ＦＬＩ−０６がＥＲＥＳ前段階、潜在的にはカーゴ動員の段階で小胞体搬出を阻害することが示唆される。ＦＬＩ−０６が分泌経路のこの初期段階に決定的に影響を及ぼす第１の小分子プローブとして確立される。

ＦＬＩ−０６は管状小胞体をシートへと変換する
固定細胞において捉えることが困難なＦＬＩ−０６インキュベーションの際の小胞体の形態変化に注目した。したがって、生細胞画像化を小胞体マーカーｐｒｌｓｓ−ＫＤＥＬ−ｍＲＦＰをトランスフェクトしたＣＯＳ細胞において行い（補足参照３）、ＦＬＩ−０６を１２０分間添加した（図７ａ）。１２０分後に、ほぼ全ての細胞が検出可能な小胞体管を有さなくなり、代わりに大きなシート様構造で満たされていた。シート形成は５分後〜１０分後に開始し、ｔ_１／２は約１４分であった（図７ｂ）。形態変化が小胞体出口の阻害に関連するか否かを試験するために、次の一連のＦＬＩ−０６誘導体を試験した。小胞体出口を阻害する誘導体であるＦＬＩ−０６、３、４及び５のみが管からシートへの表現型も誘起し、両方の効果が関連することが強く示唆された（図１７）。加えて、細胞をＦＬＩ−０６及びシクロヘキシミドとともにインキュベートすることで、シート形成が小胞体におけるカーゴ蓄積の結果でないことが実証される（図１７）。小胞体出口阻害はシート形成に先行するため、データからシート形成が小胞体出口遮断の原因でないことが示唆される。それどころか、小胞体シートは小胞体出口を阻害するＥＲＥＳにおいて始まり得る構造変化の指標である（indicative）。

ＦＬＩ−０６は分泌型アルカリホスファターゼの分泌を阻害する
分泌に対するＦＬＩ−０６の阻害効果を確認するために、ＨｅＬａ細胞に分泌型アルカリホスファターゼ（ＳＥＡＰ）をコードするプラスミドをトランスフェクトした。培地を回収し、ＳＥＡＰ分泌を測光法により測定したところ、ＦＬＩ−０６インキュベーション時のＳＥＡＰの分泌の阻害を確認することができた（図１８ａ）。

ＦＬＩ−０６はがん性Ｔ細胞を死滅させる
ＦＬＩ−０６が最終的にがん性疾患の治療に有用となるか否かを試験するために、過剰に活性なＮｏｔｃｈシグナル伝達を生じるＮｏｔｃｈヘテロ二量化ドメインを有するＤＮＤ−４１細胞（Weng et al, Science, 2004）をＦＬＩ−０６とともにインキュベートした。１０μＭのＦＬＩ−０６は４日後に全細胞死を引き起こしたが、１μＭのＦＬＩ−０６はＤＮＤ−４１細胞の増殖を阻害した（図１８ｂ）。

実験例の論考
生物学的プロセスを特異的に変調する低分子化合物の同定は、創薬の重要な段階を構成する。本発明者らは今回、Ｎｏｔｃｈ経路に影響を及ぼす新規の化合物を発見する自動顕微鏡法ベースのＨＣＳを開発し、適用した。Ｎｏｔｃｈシグナル伝達は多数の発生過程、分化決定に関与し、かかる重要な経路からすれば当然であるが、神経変性及びＴ−ＡＬＬのような多数の病的状態に関与する^９，４０。初期スクリーニングでは、Ｎｏｔｃｈシグナル伝達の輸送／プロセシングの局面に焦点を合わせることを目的とした。転写的に不活性なＥＧＦＰタグ付きレポーター構築物を使用した。このＮｏｔｃｈベースのレポーターの蛍光を核及び核周辺の環で定量化し、ヒット化合物を同定した。それらを一次スクリーニングライブラリーから抽出し、更に最適化していないことを強調する必要がある。それにもかかわらず、ＦＬＩ−０６、ＦＬＩ−１４、ＦＬＩ−１５、ＦＬＩ−２０及びあまり顕著ではないがＦＬＩ−１９は本実験の時間規模では急性毒性を示さず、Ｃ２Ｃ１２細胞におけるＣＳＬ依存性ルシフェラーゼ活性の減少、ゼブラフィッシュにおけるｉｎ ｖｉｖｏでの体節奇形及び神経発生表現型の誘発によって示されるように内因性Ｎｏｔｃｈシグナル伝達を明らかに低減した。

ＦＬＩ−０６が概して分泌を遮断し、ＧＳＩであるＦＬＩ−１４及びＦＬＩ−１９並びにＦＬＩ−１５及びＦＬＩ−２０がＮｏｔｃｈ及びＡＰＰプロセシングを阻害することが見出され、それらがＮｏｔｃｈに特異的でないことが示された。それにもかかわらず、ｉｎ ｖｉｖｏで観察される５つ全ての化合物の優性表現型がＮｏｔｃｈ表現型であり、将来の構造−機能分析が時間及び用量の最適化とともに、Ｎｏｔｃｈシグナル伝達をより特異的に妨げるプローブの開発を可能にするはずであることが示唆される。

同定された活性プローブはレポーターの輸送及びプロセシングの種々の段階に作用した（図１８に図式化）。４つの化合物がＰＭでＮｏｔｃｈレポーターの蓄積を引き起こし、γ−セクレターゼ自体、又はＮｏｔｃｈレポーターによるγ−セクレターゼの輸送／相互作用が阻害されることが示唆された。実際に、４つの化合物のうち２つ（ＦＬＩ−１５及びＦＬＩ−２０）が新規の本物のＧＳＩであることが分かったが、それらがγ−セクレターゼを直接阻害するか、又は間接的若しくはアロステリックに作用するかを検討しなければならない。ＧＳＩは恐らくアルツハイマー病の主要な薬物リードではないが^４１、Ｔ−ＡＬＬに対して有望な治療可能性を示す^４２。加えて、ＧＳＩはγ−セクレターゼの種々のサブユニット、例えばアロステリック相互作用部位及び基質結合部位^１３の特性化に役立つことが判明した。興味深いことに、ＦＬＩ−１４及びＦＬＩ−１９は、その適用がＰＭでのレポーターの蓄積及び内因性Ｎｏｔｃｈシグナル伝達に対する明らかな効果をもたらしたにもかかわらず、ｉｎ ｖｉｔｒｏアッセイに用いた濃度でγ−セクレターゼを阻害しなかった。潜在的には、これらの物質はγ−セクレターゼへの基質の動員、そのＰＭ及び／又はエンドソームへの標的化、又は活性γ−セクレターゼが存在する界面活性剤不溶性（detergent-resistant）膜ドメインへの基質若しくは酵素の標的化^４３に影響を及ぼす可能性がある。

その顕著な表現型、すなわち細胞内膜におけるＮｏｔｃｈΔＥ−ＥＧＦＰの蓄積のために、ジヒドロピリジンＦＬＩ−０６をより詳細に研究した。ニフェジピン等の関連１，４−ジヒドロピリジンは高血圧の治療のために薬物としてヒトに広く適用されており、一般にアンタゴニスト活性又はアゴニスト活性を有するＣａ^２＋チャネルモジュレーターとして認められているが^４４、本状況では不活性である。ジヒドロピリジンの他の生理的活性、最も注目すべきは抗アテローム性動脈硬化性、肝臓保護性、抗変異原性及び抗糖尿病性が調査されている^４５。これらの活性の一部は、幾つかのジヒドロピリジンが鉱質コルチコイド受容体に対して示すアンタゴニスト活性に関連し得る^{４６，４７}。これらの効果の程度はジヒドロピリジンの分子構造の僅かな変化に強く左右されることが知られているが^４８、ジヒドロピリジン骨格の細胞内輸送に対する特異的活性は完全に異例であった。ＢＦＡ及びＧＣＡ、又はＰＫＡ阻害物質Ｈ８９のようなプローブと同様、ＦＬＩ−０６による細胞の処理はゴルジ装置の撹乱をもたらした。しかしながら、本実験データからＦＬＩ−０６が異なる機構によって作用することが明らかに示された。ＦＬＩ−０６は、ＢＦＡ及びＧＣＡの標的であるＧＢＦ１のゴルジ体への動員に影響を及ぼさなかった。ＢＦＡとは対照的に、ＦＬＩ−０６の存在下ではゴルジ体は小胞体と融合せず、β−ＣＯＰ解離及びゴルジ体分散の動態はＦＬＩ−０６とＢＦＡとで異なっていた。Ｈ８９とは異なり、ＦＬＩ−０６はｉｎ ｖｉｔｒｏでＣＯＰＩＩ出芽を直接阻害しなかった。ＶＳＶＧ−ＥＧＦＰを用いた更なる研究から、ＦＬＩ−０６がカーゴのＥＲＥＳへの動員において非常に初期の段階で作用することが示唆された。

機構的には、ＥＲＥＳの形成及びカーゴ動員の開始はＳｅｃ１２によるＳａｒ１の動員から始まる。Ｓａｒ１はカーゴ受容体Ｓｅｃ２３／２４を引き続いて（in turn）動員する。最後に、Ｓｅｃ１３／３１が動員され、ＣＯＰＩＩ小胞の分裂が開始する（概説については^４９を参照されたい）。ｉｎ ｖｉｔｒｏ ＣＯＰＩＩ出芽アッセイでは、小胞形成の遮断を見るために細胞のプレインキュベーションが必要であった。この結果から、ＦＬＩ−０６が出芽反応において添加したサイトゾルにより供給される必須タンパク質に影響を及ぼさないことが示唆された。したがって、現段階ではＦＬＩ−０６がＳｅｃ１２若しくは他の現在未知の動員因子のレベル、又はＥＲＥＳの開始に必要とされる膜構造化事象に作用すると仮定される。ＶＳＶＧ−ＥＧＦＰ、ＮｏｔｃｈΔＥ−ＥＧＦＰ及び恐らくは他のカーゴはＥＲＥＳに蓄積せず、依然としてＳｅｃ３１標識ＥＲＥＳが存在し、カーゴ動員がＥＲＥＳへのＣＯＰＩＩ成分の動員に不可欠でないことが示唆される。特筆すべきことに、小胞体出口の阻害に続いて小胞体の完全な管からシートへの移行が起こった。小胞体構造における形態変化は、とりわけ小胞体−微小管結合の撹乱（Klopfenstein, 1998）、又は小胞体内の構造タンパク質の干渉（Shibata,2009；Voeltz, 2006）に起因し得る。微小管の解重合は分泌に影響を及ぼさない（Rogalski, 1984；Cole, 1996）。微小管の解重合又は小胞体−微小管相互作用タンパク質の干渉によって誘導されるシート形成は単独では小胞体出口を阻害せず（図７Ｃ）、明らかに分泌の遮断後に生じる。これはカーゴ蓄積の指標であるだけでなく、分泌を遮断するＦＬＩ−０６及びその誘導体のみによっても生じ、２つの効果が関連していることが強く示唆される。ＥＲＥＳは高度に湾曲した膜領域であり、ＦＬＩ−０６がＥＲＥＳにおいてカーゴ動員を阻害する幾らかの湾曲変化を引き起こすことが推測される。湾曲変化は続いて小胞体全体に広がり、シート形成が観察される。興味深いことに、この研究は改正中であるが、小分子分散（dispergo）が発見された（Lu, 2013）。分散は小胞体造管を誘導するが、ＦＬＩ−０６のようにＥＲＥＳへのカーゴの動員を阻害するようであるため、逆の効果を有する。これによりＥＲＥＳでの「正確な」膜湾曲が不可欠であり、いずれの方向のシフトも小胞体出口を撹乱することが示され得る。

小分子プローブＦＬＩ−０６（１）の活性を再合成及び集中構造変化（化合物２〜化合物５）により更に検証した。ＦＬＩ−０６の構造−機能相関に対するこれらの初期実験から、より大きな又は嵩高いアルキル残基により活性が増大することが示された。現段階では、ｐ−ＮＯ_２基が化合物活性に重要であるが、必須ではないようである。骨格の代謝変調（酸化又は還元）は、相当に狭い活性域及び活性の迅速な発現を考えると可能性が低いと考えられる。加えて、それぞれの誘導体は不活性であった。本明細書に記載の化学式に従う更なる化合物を合成し（化学合成に関する情報については下記を参照されたい）、実験分析が進行中である。

総合すると、ＦＬＩ−０６は分泌依存性疾患の治療に関する独特な化学物質である。本発明者らの知る限りにおいて、ＦＬＩ−０６は分泌経路においてこれほど初期に、ＥＲＥＳ前段階で作用する唯一の化合物である。加えて、付加的な利益として、ＦＬＩ−０６はＢＦＡ又はＧＣＡとは対照的に重大な小胞体ストレスを引き起こさず、医学的投与後の副作用の低減が示される。

本発明の実施例に適用した方法及び材料
ｃＤＮＡ及び抗体
本研究に使用した抗体及びｃＤＮＡを下記表に挙げる。

細胞株の維持及び安定に発現する細胞株の生成
細胞を、１０％ＦＢＳを添加したダルベッコ変法イーグル培地＋ＧｌｕｔａＭａｘ（Invitrogen）中で維持した。安定な株については、ＨｅＬａ Ｋｙｏｔｏ及びＵ２ＯＳ細胞に、Ｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ ２０００（Invitrogen）を用いて、ＮｏｔｃｈΔＥ−ＥＧＦＰをトランスフェクトし、ＦＡＣＳにより選別し、１００μｇ／ｍｌのＨｙｇｒｏｍｙｃｉｎ Ｂで選択した。単細胞クローンを採取し、適度かつ均一なＮＩＣＤ−ＥＧＦＰ核染色に基づいて選択した。次いで、１つのクローンを更なる使用のために選択した。

ＣｈｅｍＢｉｏＮｅｔ化合物スクリーニング
化合物スクリーニングは、ライプニッツ分子薬理学研究所（Leibniz−Institut fuerMolekulare Pharmakologie）（ＦＭＰ）（Berlin）でＧＦＰシグナルのｅｎｕｃ／ｎｕｃ比を測定する単回スクリーニングとして行われた。化合物を５１個のスクリーニングプレートに１０μＭで２４時間アプライし、画像収集及び分析のために処理した。個々のプレートのＺ’は０．４〜０．８の範囲であり（＝０．５３±０．１４）、良好なアッセイ条件が示され、２個のプレートのみがこの範囲を下回った。活性をｚ値正規化により評価し、１５０細胞未満のサンプルを更なる分析から除外した。ヒット検証のために、化合物をChemDivに発注するか又は化学合成により得た。更なる詳細については下記の方法を参照されたい。

ＥＣ_５０決定
試験化合物のＥＣ_５０値は、２００μＭ〜０．１μＭの範囲の段階希釈系列により算出した。細胞を９６ウェルプレートに１００μｌの培地中５０００細胞／ウェルの密度で播種した。翌日、それぞれの試験化合物を含有する１００μｌの培地を添加した。細胞を１６時間インキュベートし、固定し、自動顕微鏡法のために処理した。推定ガンマ−セクレターゼ阻害物質についてはｅｎｕｃ強度をＤＡＰＴ対照の値で除算し、輸送阻害物質についてはｌｏｇ２変換ｎｕｃ／ｅｎｕｃ比のＤＡＰＴ／ＤＭＳＯ対照に対して正規化した阻害率を算出した。相対活性値を「Ｒ」（http://www.r-project.org/）に読み込み、ＥＣ_５０推定値を「ｄｒｃ」パッケージにより４パラメータｌｏｇロジスティック適合を用いて算出した^５１。

薬物処理
特に指定のない限り、全ての薬物はSigma Aldrichから購入した。薬物は以下の濃度で使用した。ＢＦＡ、１μｇ／ｍｌ；ゴルジシドＡ（Calbiochem）、１０μＭ；ノコダゾール、１．５μｇ／ｍｌ；Ｈ８９、２５μＭ；ツニカマイシン、１０μｇ／ｍｌ；ＤＡＰＴ（Alexis Biochemicals）、１μＭ〜２μＭ

ｉｎ ｖｉｔｒｏ γ−セクレターゼアッセイ
ＡＩＣＤ形成をアッセイするために、Ｓｗｅｄｉｓｈ突然変異を有するＡＰＰを安定に発現するＨＥＫ２９３細胞の膜を単離し、Sastre et al.^５２に従って３７℃で４時間インキュベートした。ＮＩＣＤ形成をアッセイするために、ＨｅＬａ ＮｏｔｃｈΔＥ−ＥＧＦＰ細胞に由来する膜を、１０μＭのＤＡＰＴで一晩前処理したＨｅＬａ ＮｏｔｃｈΔＥ−ＥＧＦＰ細胞に由来する膜と混合し、基質を富化した。インキュベーション後に、サンプルを８％ＳＤＳ−ＰＡゲル（ＮＩＣＤ）又は１０％〜２０％Ｔｒｉｓ−トリシンゲル（ＡＩＣＤ）にロードし、ブロットし、切断Ｎｏｔｃｈ抗体又はＡＰＰ Ｃ末端に対する抗体６６８７を用いてプロービングした^５３。化学発光をＬＡＳ−４０００（Fuji）でＭｕｌｔｉＧａｕｇｅソフトウェアを用いて定量化した。

ＡＰＰ、Ｋｌｏｔｈｏ及びそれらの切断生成物の検出
ＡＰＰ、ＡＰＰｓ、ＡＰＰ_ＣＴＦ及びＡβの検出は、ＡＰＰ及びＡＰＰｓについては抗体２２Ｃ１１、ＡＰＰ_ＣＴＦについては６６８７、Ａβについては３５５２及び２Ｄ８を用いて先述のように行った^５４。ＫｌｏｔｈｏはBloch et al.^２０に記載のように検出した。化学発光をＬＡＳ−４０００（Fuji）でＭｕｌｔｉＧａｕｇｅソフトウェアを用いて定量化した。

ルシフェラーゼアッセイ
Ｃ２Ｃ１２における内因性Ｎｏｔｃｈシグナル伝達は、先述のように１２×ＣＳＬ−ルシフェラーゼレポーター及びトランスフェクトデルタを用いたルシフェラーゼアッセイによって決定した^１５。

ＶＳＶＧアッセイ
カバースリップにプレーティングしたＨｅＬａ細胞に、ＥＧＦＰタグを保有する温度感受性ＶＳＶＧ−ｔｓＯ４５突然変異体（プラスミドＶＳＶＧ３−ＧＦＰ^３５）を一過性にトランスフェクトした。２４時間後、細胞を２４時間４０℃に移し、ＶＳＶＧ−ＥＧＦＰを小胞体内に蓄積させた。追跡の前に、ノコダゾール（１μｇ／ｍｌ）及びＤＭＳＯ又はＢＦＡ（１μｇ／ｍｌ）又はＦＬＩ−０６（１０μＭ）を添加し、細胞を氷上で３０分間インキュベートして、微小管を解重合した。追跡のために、細胞を３２℃の水浴に移し、指定の時間後に固定し、Ｓｅｃ３１に対する抗体で染色し、ＥＲＥＳの局在化を検出した。０℃及び３２℃のインキュベーション中に、１０ｍＭのＨＥＰＥＳを添加した。

トランスフェリン取り込み
トランスフェリン取り込みアッセイのために、細胞を無血清培地中、３７℃で１時間飢餓状態にした。次いで、細胞を氷上に移し、培地を２５μｇ／ｍｌのＡｌｅｘａＦｌｕｏｒ５５５−トランスフェリンコンジュゲート（Molecular Probes）及び試験化合物を添加した無血清培地に交換した。氷上で１５分後に、細胞を、試験化合物を含有する予熱した血清添加培地とともにインキュベートし、３７℃でインキュベートした。

蛍光顕微鏡法
免疫蛍光染色は標準手順を用いて行った^５５。画像化は、ZeissのＡｘｉｏｖｅｒｔ２００又はＡｘｉｏ Ｉｍａｇｅｒで６３×１．４ＮＡの対物レンズ及びZeissのＡｘｉｏｖｉｓｉｏｎソフトウェアを用いて行った。生細胞画像化のために、細胞をＬａｂ−Ｔｅｋ多室カバーガラス（Thermo-Fisher）にプレーティングした。画像を集め、Ａｄｏｂｅ Ｐｈｏｔｏｓｈｏｐを用いて加工した。薄く染色した小胞体管／シートの表示については、ガンマ設定の非線形変化を使用した。

化合物の同一性
購入した化合物の同一性及び純度を薄層クロマトグラフィー及び質量分析によって検証した。化学的に合成した化合物を分光学的に特性化した。

ｉｎ ｖｉｔｒｏ出芽アッセイ
ｉｎ ｖｉｔｒｏでのＣＯＰＩＩ出芽は基本的にKim et al.^３８に記載のように行った。

ゼブラフィッシュ
ゼブラフィッシュ実験の詳細は下記に見ることができる。

統計分析

数値データの平均を、スチューデントｔ検定を用いて比較した。指定のようにｐ＜０．０５又はｐ＜０．０１の平均差を統計的に有為であるとみなした（^＊）。エラーバーは指定のように標準誤差（ＳＥＭ）又は標準偏差（ＳＤ）を表す。独立反復試験の回数も図面の説明文に示す。

ＣｈｅｍＢｉｏＮｅｔ化合物スクリーニング（表２も参照されたい）
化合物スクリーニングのために、３０００個の細胞を３８４ウェルプレート（Corning，Corning，NY）内のＤＭＥＭ＋１０％ＦＢＳ中にマルチディスペンサーを用いて事前播種した。翌日、化合物を１ｍＭストックライブラリーから０．５μｌで１ウェル当たり１０μＭの最終濃度まで添加した。対照を、５０μｌ中２μＭのＤＡＰＴ及び１％の最終ＤＭＳＯでマルチチャンネルピペットを用いて添加した。ピペット操作はＣａｌｉｐｅｒロボットを用いて行った。プレートレイアウトは各対照の１６ウェルを含んでいた。プレートを３７℃、９５％相対湿度、５％ＣＯ２で２４時間インキュベートした。インキュベーション後、細胞培養培地を吸引し、２５μｌの４％ホルマリンに２０分間置き換えた。固定の後、細胞をＰＢＳで１回洗浄し、核を５μＭのヘキストで２０分間染色した。更なる洗浄工程の後、細胞を２５μｌのＰＢＳで覆った。スクリーニングしたライブラリーを記載した（参照１７）。

ＨＣＳ画像取得及びデータ分析
画像をＡｒｒａｙＳｃａｎ ＶＴｉ自動顕微鏡（ThermoFisher）で取得し、同梱ソフトウェア一式のＣｏｍｐａｒｔｍｅｎｔａｌ Ａｎａｌｙｓｉｓ ＢｉｏＡｐｐｌｉｃａｔｉｏｎを用いて数値データを抽出した。化合物スクリーニング生データをＦＭＰで収集し、データ変換を標準手順に従って行った（参照１７並びに補足参照６及び７）。

市販のサンプルの同一性及び純度
化合物の純度は薄層クロマトグラフィー（ＴＬＣ）及び質量分析（ＭＳ）を用いて試験し、それにより更に同一性が確認された。シリカゲル６０ Ｆ２５４アルミニウムシート（Merck）を用いてＴＣＬ分析を行った。クロロホルム／メタノール混合物を溶離液として使用した。ＵＶ照射及びヨード染色により不純物は検出されなかった。ＭＳをＴＲＩＯ ２０００（Fisons）分光計でＥＩイオン化モードにて７０ｅＶで行った。

^＊ChemDivのエントリはＣ１５Ｈ１９ＣｌＮ４Ｏ５Ｓ３、ＭＷ＝４６６．０２を含み、正確な構造をＮＭＲにより決定した。

化合物合成
特に指定のない限り、市販の化合物は全て更に精製することなく提供時のまま使用した。反応をMerckの０．２ｍｍシリカプレート（６０、ＨＦ２５４）上でＴＬＣによってモニタリングした。１Ｈ ＮＭＲスペクトル及び１３Ｃ ＮＭＲスペクトルをBrukerのＡＶＡＮＣＥ ２５０又は４００分光計で記録し、化学シフトを残留溶媒シグナルに対して得る。融点をオープンキャピラリーで記録し、補正しない。質量スペクトルはFisonのＴＲＩＯ ２００又はＦＩＮＮＡＧＥＮ ＭＡＴ ＤＤＱ ７１０で得た。一般試験手法（補足参照８）に従って無水溶媒を得た。ベータ−ケトエステルを公開手法（補足参照９）に従って２，２，６−トリメチル−４Ｈ−１，３−ジオキシン−４−オン及びそれぞれのアルコールから得て、使用前に蒸留した。酢酸アンモニウムを精製し、昇華によって乾燥させた。

補助スキーム１． ジヒドロピリジンＦＬＩ−ｘｘ及び副生成物構造の一般的合成。ａ）Ｙｂ（ＯＴｆ）３、アセトニトリル、２０℃、１２時間〜１４時間。

補助スキーム２． ジヒドロピリジンＦＬＩ−０６の官能基化化学。

ジヒドロピリジン合成の代表的手順
Gestwickiの先例（補足参照１０）に大まかに従って、ジメドンＤ（７．１ｍｍｏｌ、１．０ｇ）、それぞれのβ−ケトエステルＡ（４ｍｍｏｌ）及びイッテルビウムトリフレート（０．３２ｍｍｏｌ、８ｍｏｌ％、０．２ｇ）を無水アセトニトリル（２５ｍＬ）に溶解し、窒素下で１０分間撹拌した。メタノール（１０ｍＬ）中の無水ＮＨ４ＯＡｃ Ｂ（５．６ｍｍｏｌ、０．３ｇ）の冷（４℃）溶液を導入した。１０分後に対応するアルデヒドＣ（４ｍｍｏｌ、１０ｍｌのアセトニトリルに溶解）を滴加した。帯黄色の混合物を室温で一晩撹拌した後、水（１００ｍＬ）に注ぎ入れ、１時間撹拌した。形成された沈殿を吸引により濾別するか、又は酢酸エチルで抽出した。

残りの材料を酢酸エチル／ヘキサンに溶解し、短いシリカカラムで濾過した。溶媒を除去し、残渣をアセトニトリルから再結晶化し、真空乾燥した。エナミノエステル（enamino ester）Ｅを個別に形成した場合に変換は概してより明らかであった（補足参照１１）。副生成物として、ジメドン及びアルデヒドの対称二重付加物が様々な量で観察され（補助スキーム１を参照されたい）、比較試験のために個別に単離した（下記を参照されたい）。

エチル４−（４’−ニトロフェニル）−２，７，７−トリメチル−５−オキソ−１，４，５，６，７，８−ヘキサヒドロキノリン−３−カルボキシレート。
淡黄色の結晶、収率：６１％、ｍ．ｐ．１８８℃、1H NMR (250 MHz, CDCl3): ae 8.09(d, J = 8.7 Hz, 2H), 7.49 (d, J = 8,7 Hz, 2H), 6.93 (br s, 1H),5.16 (s, 1H), 4.09 (q, J = 7.0Hz, 2H), 2.41 (s, 3H), 2.28-2.10 (m, 4H), 1.25 (t, J = 7,2 Hz, 3H), 1.09 (s, 3H), 0.91 (s, 3H); 13C NMR (62.5 MHz,CDCl3): ae 195.1, 166.7, 154.2, 146.2, 144.2, 128.9, 123.3,111.3, 105.1, 60.1, 50.5, 41.2, 37.2, 32.7, 29.3, 27.1, 19.5, 14.2; MS (EI): m/z (%) 384 (M+)(66), 355 (21), 262(100), 234 (81), 178 (29), 150 (17), 83 (9).

シクロヘキシル４−（４’−ニトロフェニル）−２，７，７−トリメチル−５−オキソ−１，４，５，６，７，８−ヘキサヒドロキノリン−３−カルボキシレート（１、「ＦＬＩ−０６」）。
淡黄色の結晶、収率：５１％、ｍ．ｐ．１９６℃、1HNMR (250 MHz, DMSO-d6): ae 8.09 (d, J = 8.8 Hz,2H), 7.51 (d, J = 8.8 Hz, 2H),5.94 (s, 1H); 5.16 (s, 1H), 4.69-4.69 (m, 1H), 2.42 (s, 3H), 2.33-2.16 (m, 4H),1.80-1.21 (m, 10H), 1.09 (s, 3H), 0.90 (s, 3H);
13C NMR ( 62.5 MHz,CDCl3): ae195.2, 166.2, 154.3, 148.3, 146.2, 144.0, 129.9,123.4, 111.2, 105.3, 72.5, 50.6, 41.2, 37.3, 32.7, 31.8, 31.5, 29.3, 27.1,25.3, 23.8, 23.6, 19.5; MS (EI): m/z (%)= 438 [M+](67); IR (ATR, [ cm-1]): 3198 (m), 3088 (w), 2937 (m), 1672 (s), 1600(s), 1482 (s), 1468 (m), 1340 (vs), 1433 (vs), 1171 (m), 1107 (s); Ｃ２５Ｈ３０Ｎ２Ｏ５において計算された分析結果：Ｃ ６８．４７、Ｈ ６．９０、Ｎ ６．３９；実測値 ６８．７、７．３、６．５。

シクロヘキシル４−（４’−シアノフェニル）−２，７，７−トリメチル−５−オキソ−１，４，５，６，７，８−ヘキサヒドロキノリン−３−カルボキシレート。
無色の結晶、収率：８８％、ｍ．ｐ．２３５℃、1H NMR (250 MHz, CDCl3): ae 7.52 (d, J = 8.3 Hz,2H), 7.45 (d, J = 8.3 Hz, 2H),5.75 (s, 1H), 5.10 (s, 1H), 4.99-5.12 (m, 1H), 2.42 (s, 3H), 2.32-2.27 (m, 4H),1.81-1.25 (m, 10H), 1.09 (s, 3H), 0.90 (s, 3H); 13C NMR (101 MHz, CDCl3,): ae 195.2, 166.2, 152.2, 147.9, 143.9, 131.8, 128.9, 111.4, 109.6, 105.4,72.4, 50.6, 41.2, 37.3, 32.7, 31.8, 31.4, 29.3, 27.1, 25.3, 23.7, 23.6, 19.6;MS (DEI): m/z (%) = 416(M+)(24), 334 (100), 317 (20), 278 (37), 260 (9); 蛍光（ＣＨ２Ｃｌ２）：λｍａｘ．：４３２ｎｍ；蛍光励起（ＣＨ２Ｃｌ２）：λｍａｘ．：３７１ｎｍ。

シクロヘキシル２，７，７−トリメチル−５−オキソ−４−（ピリジン−４−イル）−１，４，５，６，７，８−ヘキサヒドロキノリン−３−カルボキシレート。
淡黄色の結晶、収率：３３％、ｍ．ｐ．２３８℃、1HNMR (250 MHz, CDCl3): ae 8.44 ( d, J = 6.0 Hz, 2H), 7.28 (2H, J = 6.1 Hz, 2H), 6.32 (s; 1H), 5.07(s, 1H), 4.60-4.69 (m, 1H), 2.42 (s, 3H), 2.32-2.17 (m, 4H), 1.83-1.21 (m,10H), 1.08 (s, 3H), 0.90 (m, 3H); 13C NMR (101 MHz, CDCl3,): ae 195.2, 166.2, 155.4, 149.2, 148.5, 144.4, 123.4, 110.9, 104.8, 72.4,50.6, 41.1, 36.6, 32.7, 31.8, 31.4, 29.3, 27,0, 25.3, 23.7, 23.6, 19.4. MS (Micro-ESI): m/z (%) = 417 (M+Na)+ 395 (M+H)+ (54);ＨＲＭＳ：［Ｍ＋Ｈ］＋において計算された値 Ｃ２４Ｈ３１Ｎ２Ｏ３＝３９５．２３３４、実測値：３９５．２３２９。

シクロヘキシル４−（４’−チオアミドフェニル）−２，７，７−トリメチル−５−オキソ−１，４，５，６，７，８−ヘキサヒドロキノリン−３−カルボキシレート。
ニトリル７（１．２ｍｍｏｌ、０．５ｇ）を２５ｍｌのＤＭＳＯに溶解し、硫化アンモニウム溶液（６ｍｌ、４８％）を撹拌しながら添加した。淡緑色の混合物を１時間撹拌した。氷冷水を添加し（１００ｍＬ）、撹拌を３０分間続けた。粗生成物を濾過によって回収し、エタノール／水（２：１）からの再結晶化によって精製した。明るい黄色の針状結晶、収率：９２％、ｍ．ｐ．２３１℃〜２３５℃、1HNMR (250 MHz, DMSO-d6): ae 9.69 (s, 1H), 9.32 (s, 1H), 9.07 (s, 1H), 7.71 (d, J = 8.3 Hz; 2H), 7.17 (d, J = 8.3 Hz, 2H), 4.87 (s, 1H), 4.58(br s; 1H), 2.44-2.12 (m, 7H), 1.92- 1.24 (m, 10H), 0.99 (s, 3H), 0.82 (s, 3H);13C NMR (101 MHz, DMSO-d6): ae 200.4, 194.7, 166.5, 151.2, 150.2, 145.8, 137.5, 127.4, 127.4, 109.9,103.8, 71.4, 50.6; 36.5, 32.6, 31.7, 31.4, 29.5, 26.9, 25.4, 23.6; MS (EI): m/z (%) = 453 (M+) (18), 369 (9), 316(82), 234 (100), 190 (11), 83 (15).

シクロヘキシル２，７，７−トリメチル−４−（４’−ニトロフェニル）−５−オキソ−５，６，７，８−テトラヒドロキノリン−３−カルボキシレート（７）。
ジヒドロピリジン１（０．４３６ｍｇ、１ｍｍｏｌ）をジクロロメタン（５０ｍＬ）に溶解し、ＭｎＯ２（過剰、およそ１ｇ）を添加した。出発物質が完全に消費される（ＴＬＣ、ヘキサン／ＥｔＯＡｃ １：１）まで混合物を撹拌した。無機物質を濾別し、溶媒を蒸発させ、粗化合物をカラムクロマトグラフィー（ＳｉＯ２、溶媒ヘキサン／ＥｔＯＡｃ １：１）によって精製した。オフホワイトの固体、収率９０％、1H NMR (250 MHz, DMSO-d6):ae 8.26 (d, J= 8.5 Hz, 2H), 7.32 (d, J =8.7 Hz, 2H), 4.66-4.69 (m, 1H), 3.11 (s, 2H), 2.63 (s, 3H), 2.47 (s, 2H),1.58-1.20 (m, 10H), 1.12 (s, 6H); 13C NMR (101 MHz, DMSO-d6): ae 197.3,166.1, 163.1, 158.1, 147.3, 145.5, 145.2, 129.7, 129.2, 123.1, 122.6, 74.1,53.0, 46.9, 32.6, 20.9, 28.1, 26.8, 25.0; MS (EI): m/z (%) = 436 (M+)(37), 353 (32), 316 (100), 309 (7), 234 (91).

シクロヘキシル−４−（４’−アミノフェニル）−２，７，７−トリメチル−５−オキソ−１，４，５，６，７，８−ヘキサヒドロキノリン−３−カルボキシレート。
シュレンク管を窒素でパージし、ＭｅＯＨ（３０ｍｌ、無水、脱気）中のニトロアレーン１（０．４０８ｍｇ、１．００ｍｍｏｌ）の溶液、続いてＰｄ／Ｃ（炭担持５％、１０ｍｇ）を導入した。水素ガスを導入し（１ｂａｒ）、変換をＴＬＣ（ＥｔＯＡｃ／ＰＥ、１：１）によって追跡した。転換が完了した後（２時間）、混合物を濾過し、溶媒を蒸発させた。粗生成物をＮ２雰囲気下でのラジアルクロマトグラフィー（Ｃｈｒｏｍａｔｏｔｒｏｎ（商標））（ＣＨ２Ｃｌ２／ＭｅＯＨ ９９：１）によって精製した後、ＥｔＯＨ（１ｍＬ）に溶解し、シクロヘキサンでトリチュレートし、真空乾燥した。空気に感受性のオフホワイト色の粉末は、常温未満で保管しなければならない；収率９５％；1HNMR (250 MHz, DMSO-d6): ae 7.01 (d, J = 8.3 Hz,2H), 6.54 (d, J = 8.3 Hz, 2H),5,79 (br s, 1H), 4.93 (s, 1H), 4.69-4.66 (m, 1H), 2.36 (s, 3H), 2.27-2.17 (m,4H), 1.62-1.24 (m, 10H), 1.07 (s, 3H), 0.94 (s, 3H); 13C NMR (101 MHz, CDCl3): ae = 200.4, 194.7, 166.5, 151.2, 150.2, 145.8, 137.5, 127.4, 127.4, 109.9,103.8, 71.4, 50.6, 36.5, 32.6, 31.7, 31.4, 29.5, 26.9, 25.4, 23.6; MS (EI): m/z (%) = 408 (M+)(8), 406 (6), 390(8), 392 (5), 318 (5), 316 (100), 234 (92), 216 (25), 177 (16), 93 (97).

Ｅ−２−（（（３’−シクロヘキシルオキシカルボニル−４’’−ニトロフェニル−２’，７’，７’−トリメチル−１’，４’，５’，６’，７’，８’−ヘキサヒドロキノリン−５’−イリデン）アミノ）オキシ）酢酸（６）
水（５ｍＬ）中のＯ−（カルボキシメトキシメチル（carboxymethoxymethyl））ヒドロキシルアミンヘミ塩酸塩（hemihydrochloride）（２．０６ｍｍｏｌ、２２５ｍｇ、Aldrich）の溶液を、固体炭酸ナトリウムでｐＨ５に調整した。この溶液を真空で蒸発乾固し、残渣をメタノール（６ｍＬ）に懸濁した。

アセトニトリル（８ｍＬ）中のケトン１（０．５ｍｍｏｌ、２１９ｍｇ）の溶液に、オキシ塩化リン（５ｍｍｏｌ、５００μＬ）を窒素下、３０℃で添加し、３時間還流させた。橙色の反応混合物を真空（６ｍｂａｒ）、５０℃で蒸発させ、無臭となるまで乾燥させた（ＰＯＣｌ３）。暗黒色の残渣をアセトニトリル（６ｍＬ）に溶解し、新たに調製したメタノールＯ−（カルボキシメトキシメチル）ヒドロキシルアミン溶液（６ｍＬ、上記を参照されたい）を一度に添加した。混合物を加熱して５分間還流させた後、溶媒を全て蒸発させた。残渣を２０ｍＬの酢酸エチルに取り、水（２×１０ｍＬ）、ブライン（１×１０ｍＬ）で洗浄し、ＭｇＳＯ４で乾燥させ、蒸発乾固した。残渣を３ｍＬのメチルｔｅｒｔ−ブチルエーテル（ＭＴＢＥ）に溶解し、５℃で４日間保管した。結晶性生成物を濾過によって回収し、真空乾燥して、１４８ｍｇのオキシム１０を得た。濃縮時に１０の第２の生成物をＭＴＢＥ／ｎ−ヘキサンからの再結晶化によって得ることができた。
コハク色の結晶、収率：５８％、ｍ．ｐ．１２９℃〜１３３℃、1HNMR (250 MHz, CDCl3): ae 8.02 (d, J = 8.5 Hz, 2H), 7.43 (d, J = 8.5 Hz, 2H), 5.72 (s, 1H); 5.06(s, 1H), 4.70- 4.60 (m, 1H), 2.23 (dd, J= 4, 142.5 Hz, 2H), 2.28 (dd, J= 5.2, 16.7 Hz, 2H), 2.36 (s, 3H), 2.33-2.16 (m, 4H), 1.80-1.21 (m,10H), 1.06 (s, 3H), 0.85 (s, 3H); 13C NMR (CDCl3, 62.5 MHz): ae 173.8, 166.2, 155.9, 154.9, 146.0, 144.7, 137.2, 129.3, 122.8, 105.7,102.6, 72.9, 70.1, 40.7, 38.4, 36.2, 31.9, 31.7, 30.45, 29.5, 27.1, 25.4, 23.9,23.8, 20.1; ＥＳＩ ＨＲＭＳ：（Ｍ＋＋Ｈ＋）において計算された値：Ｃ２７Ｈ３４Ｎ３Ｏ７：５１２．２３９０、実測値：５１２．２３９０；Ｃ２７Ｈ３３Ｎ３Ｏ７ｘＭＴＢＥにおいて計算された分析結果：Ｃ ６４．０、Ｈ ７．６、Ｎ ７．０；実測値 Ｃ ６３．５、Ｈ ８．０、Ｎ ６．９。

ハンチュ型ジヒドロピリジン合成の典型的な副生成物
２，２’−（（４−ニトロフェニル）メチレン）ビス（３−ヒドロキシ−５，５−ジメチルシクロヘキサ−２−エノン）
ジヒドロピリジン合成の代表的手順により得た。完了後に粗混合物をＥｔＯＨ／Ｈ２Ｏから再結晶化した。最初の生成物（first crop）を再び再結晶化して、純粋な表題化合物を得た。オフホワイトの結晶、収率：３０％、1H NMR (250 MHz, CDCl3): ae =11.80 (s, 1H), 11.22 (br s, 1H) 8.15 (d, J = 8.8 Hz, 2H), 7.26 (d, J= 8.8 Hz, 2H), 5.55 (s, 1H), 2.54-2.29 (m, 8H), 1.24 (s, 6H), 1.12 (s,6H); 13C NMR (62.5 MHz, CDCl3): ae = 190.9, 189.6, 146.5,146.1, 127.6, 123.5, 114.9, 46.9, 46.4, 33.2, 31.5, 29.5, 27.4; MS (ESI): m/z (%) = 436.2 (M+Na)+;Ｃ２３Ｈ２７ＮＯ６において計算された分析結果：Ｃ ６６．８、Ｈ ６．６、Ｎ ３．４；実測値 Ｃ ６６．６、Ｈ ６．４、Ｎ ３．２。

２，２’−（（３−ニトロフェニル）メチレン）ビス（３−ヒドロキシ−５，５−ジメチルシクロヘキサ−２−エノン）
ジヒドロピリジン合成の代表的手順により得た。完了後に粗混合物をＥｔＯＨ／Ｈ２Ｏから再結晶化した。最初の生成物を再び再結晶化して、純粋な表題化合物を得た。淡黄色の結晶、収率：６１％、ｍ．ｐ．２０２℃、1H NMR (250 MHz, CDCl3): ae 11.8 (s, 1H), 11.3 (br s, 1H), 8.06 (m, 2H), 7.45 (m, 2H), 5.54 (s, 1H),2.54-2.29 (m, 8H), 1.28 (s, 6H), 1.12 (s, 6H); 13C NMR (62.5 MHz, CDCl3): ae 191.0, 189.6, 148.4, 140.7, 132.8, 129.1, 122.2, 121.0, 114.8, 46.0,46.4, 32.9, 31.4, 29.7, 27.3.

ＦＬＩ−０６の結晶構造分析データ
強度データをNoniusのＫａｐｐａ ＣＣＤ回折計でグラファイト単色化Ｍｏ−Ｋα線を用いて収集した。データをローレンツ効果及び分極効果について補正したが、吸収効果については補正しなかった（ＣＯＬＬＥＣＴ、データ補正ソフトウェア；Nonius B.V., The Netherlands (1998)）（補足参照１２）。構造を、直接法（ＳＨＥＬＸＳ）を用いて解明し（補足参照１３）、Ｆｏに対する完全行列最小二乗法（補足参照１３）で精密化した（ＳＨＥＬＸＬ−９７）。全ての水素原子を差フーリエ合成によって位置付け、等方的に精密化した。全ての非水素原子を異方的に精密化した。結晶学的データ並びに構造解及び精密化の詳細を表３にまとめる。ＸＰ（SIEMENS Analytical X-ray Instruments, Inc.）を構造表示に使用した。図１９も参照されたい。

ゼブラフィッシュ：胚を野生型ＴｕｅＡＢ系統の成体の自然産卵により得て、補足参照１４に従って飼育し、段階分けした。ＤＡＰＴ及び化合物をＥ３胚培地中５０μＭで絨毛膜が断裂しているが、完全には除去されていないゼブラフィッシュ胚に球体期（sphere stage）から分析段階まで参照２３に従って適用した。対照胚はＥ３胚培地に溶解した同じ濃度のＤＭＳＯで処理したモックとした。全ての胚を２４ウェルプレート（１ウェル当たり１０個〜１５個の胚；最終容量２ｍｌ）において２８℃で分析までインキュベートした後、氷冷緩衝４％パラホルムアルデヒドで一晩固定した。全載ｉｎ ｓｉｔｕハイブリダイゼーション（ＩＳＨ）を基本的に記載のように行った（補足参照１６）。ジゴキシゲニン標識アンチセンスリボプローブを、記載の線状化ベクターから生成した（参照２６）。ｑＲＴ−ＰＣＲ分析のために、全ＲＮＡを同様の表現型を示す５個のゼブラフィッシュ胚からＲＮｅａｓｙ Ｍｉｎｉ Ｋｉｔ（Qiagen）を用いて単離した。望ましくない又は有毒な効果を避けるために、軽度の体節欠陥を示すこれらの化合物で処理した胚をｑＰＣＲに選択した（図１１を参照されたい）。その後のｃＤＮＡ合成はＳｕｐｅｒＳｃｒｉｐｔ ＩＩＩ ＲＴ ｋｉｔ（Invitrogen）、ランダムヘキサマープライマー（Promega）及び鋳型として５００ｎｇの全ＲＮＡを用いて行った。ｃＤＮＡの定量リアルタイムＲＴ−ＰＣＲ分析を、ＳＹＢＲ ｇｒｅｅｎＥＲ ｑＰＣＲ ｓｕｐｅｒ ｍｉｘ ｆｏｒ ｉＣｙｃｌｅｒ（Invitrogen）を用いてｉＣｙｃｌｅｒデバイス（９６ウェルフォーマット；Biorad）で行った。全てのサンプルを三連で測定し、同じプレート内で測定した対応量のｅｆ１ａ ｃＤＮＡに対して正規化した。相対発現レベルは２−ΔΔＣＴ法を用いて算出した（補足参照１８）。画像化のために、胚をＥ３胚培地で２回洗浄し、Ｅ３胚培地中の０．０１６％トリカイン（ＭＳ−２２２、Sigma）溶液で処理した。次いで、画像化のために胚を３％メチルセルロースに包埋した。生存胚（２０ｈｐｆ〜２４ｈｐｆ）を、落射蛍光Ｓｔｅｒｅｏ Ｄｉｓｃｏｖｅｒｙ Ｖ８顕微鏡（Carl Zeiss）を用いて形態異常についてスコアリングした。ＡｘｉｏＶｉｓｉｏｎソフトウェア（Zeiss）を用いて画像を生成した。ＩＳＨの画像は７０％グリセロール／ＰＢＳＴでマウントした胚において撮影した。

表２． 小分子スクリーニングデータ

表３． 化合物ＦＬＩ−０６のＸ線構造決定の結晶データ及び精密化の詳細

参照
1.Kopan, R. & Ilagan, M. X. The canonical Notch signaling pathway: unfoldingthe activation mechanism. Cell 137, 216-233, (2009).
2.McCarthy, J. V., Twomey, C. & Wujek, P. Presenilin-dependent regulatedintramembrane proteolysis and gamma-secretase activity. Cell Mol Life Sci 66,1534-1555, (2009).
3.Chen, F. et al. TMP21 is a presenilin complex component that modulates gamma-secretasebut not epsilon-secretase activity. Nature 440, 1208-1212, (2006).
4.Thathiah, A. et al. The orphan G protein-coupled receptor 3 modulatesamyloid-beta peptide generation in neurons. Science 323, 946-951, (2009).
5.He, G. et al. Gamma-secretase activating protein is a therapeutic target forAlzheimer's disease. Nature 467, 95-98, (2010).
6.Mitsuishi, Y. et al. Human CRB2 inhibits gamma-secretase cleavage of amyloidprecursor protein by binding to the presenilin complex. The Journal ofbiological chemistry 285, 14920-14931, (2010).
7.Le Borgne, R. Regulation of Notch signalling by endocytosis and endosomalsorting. Current opinion in cell biology 18, 213-222, (2006).
8.Real, P. J. & Ferrando, A. A. NOTCH inhibition and glucocorticoid therapyin T-cell acute lymphoblastic leukemia. Leukemia 23, 1374-1377, (2009).
9.Koch, U. & Radtke, F. Notch in T-ALL: new players in a complex disease.Trends Immunol 32, 434-442, (2011).
10.von Kleist, L. & Haucke, V. At the Crossroads of Chemistry and Cell Biology:Inhibiting Membrane Traffic by Small Molecules. Traffic, (2011).
11.Dovey, H. F. et al. Functional g-secretase inhibitors reduce b-amyloid peptidelevels in brain. J Neurochem 76, 173-181., (2001).
12.Shearman, M. S. et al. L-685,458, an aspartyl protease transition state mimic,is a potent inhibitor of amyloid b-protein precursor g-secretase activity.Biochemistry 39, 8698-8704, (2000).
13.Wolfe, M. S. gamma-Secretase inhibitors and modulators for Alzheimer's disease.Journal of neurochemistry, (2011).
14.Zanella, F., Lorens, J. B. & Link, W. High content screening: seeing isbelieving. Trends Biotechnol 28, 237-245, (2010).
15.Huenniger, K. etal. Notch1 signaling is mediated by importins alpha 3, 4, and 7. Cell Mol LifeSci 67, 3187-3196, (2010).
16.Mollenhauer, H. H., Morre, D. J. & Rowe, L. D. Alteration of intracellulartraffic by monensin; mechanism, specificity and relationship to toxicity.Biochimica et biophysica acta 1031, 225-246, (1990).
17.Lisurek, M. et al. Design of chemical libraries with potentially bioactivemolecules applying a maximum common substructure concept. Mol Divers 14,401-408, (2010).
18.Citron, M. et al. Mutation of the b-amyloid precursor protein in familialAlzheimer's disease increases b-protein production. Nature 360, 672-674,(1992).
19.Haass, C. Take five-BACE and the gamma-secretase quartet conduct Alzheimer'samyloid beta-peptide generation. EMBO J. 23, 483-488, (2004).
20.Bloch, L. et al. Klotho is a substrate for alpha-, beta- and gamma-secretase.FEBS letters 583, 3221-3224, (2009).
21.Kopan, R., Nye, J. S. & Weintraub, H. The intracellular domain of mouseNotch: a constitutively activated repressor of myogenesis directed at the basichelix-loop-helix region of MyoD. Development 120, 2385-2396, (1994).
22.Dahlqvist, C. et al. Functional Notch signaling is required for BMP4-inducedinhibition of myogenic differentiation. Development 130, 6089-6099, (2003).
23.Geling, A., Steiner, H., Willem, M., Bally-Cuif, L. & Haass, C. A{gamma}-secretase inhibitor blocks Notch signaling in vivo and causes a severeneurogenic phenotype in zebrafish. EMBO Rep 3, 688-694., (2002).
24.Kitzmann, M. et al. Inhibition of Notch signaling induces myotube hypertrophyby recruiting a subpopulation of reserve cells. Journal of cellular physiology208, 538-548, (2006).
25.Blader, P. & Strahle, U. Zebrafish developmental genetics and centralnervous system development. Human molecular genetics 9, 945-951, (2000).
26.Blader, P., Fischer, N., Gradwohl, G., Guillemot, F. & Strahle, U. Theactivity of neurogenin1 is controlled by local cues in the zebrafish embryo.Development 124, 4557-4569, (1997).
27.Chung, P. C. et al. Zebrafish Her8a is activated by Su(H)-dependent Notchsignaling and is essential for the inhibition of neurogenesis. PloS one 6,e19394, (2011).
28.Pavelka, M. & Ellinger, A. Effect of colchicine on the Golgi complex of ratpancreatic acinar cells. The Journal of cell biology 97, 737-748, (1983).
29.Lippincott-Schwartz, J., Yuan, L. C., Bonifacino, J. S. & Klausner, R. D.Rapid redistribution of Golgi proteins into the ER in cells treated withBrefeldin A: Evidence for membrane cycling from Golgi to ER. Cell 56, 801-813,(1989).
30.Saenz, J. B. et al. Golgicide A reveals essential roles for GBF1 in Golgiassembly and function. Nat Chem Biol 5, 157-165, (2009).
31. Rothman, J. E. Mechanisms ofintracellular protein transport. Nature 372, 55-63, (1994).
32. Donaldson, J. G., Cassel, D.,Kahn, R. A. & Klausner, R. D. ADP-ribosylation factor, a small GTP-bindingprotein, is required for binding of the coatomer protein beta-COP to Golgimembranes. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United Statesof America 89, 6408-6412, (1992).
33. Helms, J. B. & Rothman, J. E.Inhibition by brefeldin A of a Golgi membrane enzyme that catalyses exchange ofguanine nucleotide bound to ARF. Nature 360, 352-354, (1992).
34. Szul, T. et al. Dissection ofmembrane dynamics of the ARF-guanine nucleotide exchange factor GBF1. Traffic6, 374-385, (2005).
35. Toomre, D., Keller, P., White,J., Olivo, J. C. & Simons, K. Dual-color visualization of trans-Golginetwork to plasma membrane traffic along microtubules in living cells. J CellSci, 21-33, (1999).
36. Presley, J. F. et al. ER-to-Golgitransport visualized in living cells. Nature 389, 81-85, (1997).
37. Dukhovny, A., Papadopulos, A.& Hirschberg, K. Quantitative live-cell analysis of microtubule-uncoupledcargo-protein sorting in the ER. Journal of cell science 121, 865-876, (2008).
38. Kim, J. et al. Biogenesis ofgamma-secretase early in the secretory pathway. The Journal of cell biology179, 951-963, (2007).
39. Lee, T. H. & Linstedt, A. D.Potential role for protein kinases in regulation of bidirectional endoplasmicreticulum-to-Golgi transport revealed by protein kinase inhibitor H89.Molecular biology of the cell 11, 2577-2590, (2000).
40. Lathia, J. D., Mattson, M. P.& Cheng, A. Notch: from neural development to neurological disorders. JNeurochem 107, 1471-1481, (2008).
41. Imbimbo, B. P. & Giardina, G.A. gamma-secretase inhibitors and modulators for the treatment of Alzheimer'sdisease: disappointments and hopes. Curr Top Med Chem 11, 1555-1570, (2011).
42. Groth, C. & Fortini, M. E.Therapeutic approaches to modulating Notch signaling: Current challenges andfuture prospects. Seminars in cell & developmental biology, (2012).
43. Vetrivel, K. S. et al. Spatialsegregation of gamma-secretase and substrates in distinct membrane domains. TheJournal of biological chemistry 280, 25892-25900, (2005).
44. Goldmann, S. & Stoltefuss, J.1,4-Dihydropyridines: Effects of Chirality and Conformation on the CalciumAntagonist and Calcium Agonist Activities. Angew. Chem. Int Ed. Engl. 30,1559-1578 30, 1559-1578, (1991).
45. Edraki, N., Mehdipour, A. R.,Khoshneviszadeh, M. & Miri, R. Dihydropyridines: evaluation of theircurrent and future pharmacological applications. Drug Discov Today 14,1058-1066, (2009).
46. Dietz, J. D. et al. A number ofmarketed dihydropyridine calcium channel blockers have mineralocorticoidreceptor antagonist activity. Hypertension 51, 742-748, (2008).
47. Fagart, J. et al. A new mode ofmineralocorticoid receptor antagonism by a potent and selective nonsteroidalmolecule. The Journal of biological chemistry 285, 29932-29940, (2010).
48. Meredith, P. A. & Elliott, H.L. Dihydropyridine calcium channel blockers: basic pharmacological similaritiesbut fundamental therapeutic differences. J Hypertens 22, 1641-1648, (2004).
49. Zanetti, G., Pahuja, K. B.,Studer, S., Shim, S. & Schekman, R. COPII and the regulation of proteinsorting in mammals. Nature cell biology 14, 20-28, (2012).
50. Schroeter, E. H., Kisslinger, J.A. & Kopan, R. Notch-1 signalling requires ligand-induced proteolyticrelease of intracellular domain. Nature 393, 382-386, (1998).
51. Ritz, C. & Streibig, J. C.Bioassay Analysis using R. J Statist Software 12, (2005).
52. Sastre, M. et al.Presenilin-dependent gamma-secretase processing of beta-amyloid precursorprotein at a site corresponding to the S3 cleavage of Notch. EMBO Rep 2,835-841, (2001).
53. Steiner, H. et al. Glycine 384 isrequired for presenilin-1 function and is conserved in polytopic bacterialaspartyl proteases. Nature Cell Biol 2, 848-851, (2000).
54. Steiner, H. et al. PEN-2 is anintegral component of the gamma-secretase complex required for coordinatedexpression of presenilin and nicastrin. J Biol Chem 277, 39062-39065., (2002).
55. Wacker, I. et al.Microtubule-dependent transport of secretory vesicles visualized in real timewith a GFP-tagged secretory protein. J Cell Sci 110, 1453-1463., (1997).

補足参照
1.Kato, Y. et al. Establishment of the anti-Klotho monoclonal antibodies anddetection of Klotho protein in kidneys. Biochem Biophys Res Commun 267, 597-602(2000).
2.Steiner, H. et al. PEN-2 is an integral component of the gamma-secretasecomplex required for coordinated expression of presenilin and nicastrin. J BiolChem 277, 39062-39065. (2002).
3.Snapp, E. L., Sharma, A., Lippincott-Schwartz, J. & Hegde, R. S. Monitoringchaperone engagement of substrates in the endoplasmic reticulum of live cells.Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America103, 6536-6541 (2006).
4.Wang, Y. et al. Activation of ATF6 and an ATF6 DNA binding site by theendoplasmic reticulum stress response. The Journal of biological chemistry 275,27013-27020 (2000).
6.Malo, N., Hanley, J. A., Cerquozzi, S., Pelletier, J. & Nadon, R.Statistical practice in high-throughput screening data analysis. Nat Biotechnol24, 167-175 (2006).
7.Zhang, J. H., Chung, T. D. & Oldenburg, K. R. A Simple StatisticalParameter for Use in Evaluation and Validation of High Throughput ScreeningAssays. J Biomol Screen 4, 67-73 (1999).
8.Amarego, W. L. F. & Chai, C. L. L. Purification of laboratory chemicals.6th Edition edn, (Butterworth-Heinemann, 2009).
9.Li, A. H., Moro, S., Melman, N., Ji, X. D. & Jacobson, K. A.Structure-activity relationships and molecular modeling of 3,5-diacyl-2,4-dialkylpyridine derivatives as selective A3 adenosine receptorantagonists. J Med Chem 41, 3186-3201 (1998).
10.Evans, C. G. & Gestwicki, J. E. Enantioselective organocatalytic Hantzschsynthesis of polyhydroquinolines. Org Lett 11, 2957-2959 (2009).
11.Davood, A., Nematollahi, A. R., Iman, M. & Shafiee, A. Synthesis anddocking studies of new 1,4-dihydropyridines containing 4-(5)-Chloro-2-ethyl-5-(4)-imidazolylsubstituent as novel calcium channel agonist. Arch Pharm Res 32, 481-487(2009).
12.Otwinowski, Z. & Minor, W. Processing of X-Ray Diffraction Data Collectedin Oscillation Mode. Methods in enzymology 276, 307-326 (1997).
13. Sheldrick, G. M. A short history ofSHELX. Acta Crystallogr A 64, 112-122 (2008).
14.Kimmel, C. B., Ballard, W. W., Kimmel, S. R., Ullmann, B. & Schilling, T.F. Stages of embryonic development of the zebrafish. Dev Dyn 203, 253-310(1995).
16.Thisse, C. & Thisse, B. High-resolution in situ hybridization towhole-mount zebrafish embryos. Nature protocols 3, 59-69 (2008).
18.Livak, K. J. & Schmittgen, T. D. Analysis of relative gene expression datausing real-time quantitative PCR and the 2(-Delta Delta C(T)) Method. Methods25, 402-408 (2001).

Claims (12)

1. ｎｏｔｃｈシグナル伝達経路の阻害剤として下記一般式ＩＩを有する化合物を含む、癌の処置用の薬剤：
   （式中、（式中、Ｒ１は、
   の１つであり、
   ここで、ＸはＨ又はＦ、Ｃｌ、Ｂｒ若しくはＩで代表されるハロゲンであり、ＹはＣＯＯＣＨ _３ であり、
   Ｒ２はＣ_１〜Ｃ_８の直鎖若しくは分岐アルキル基、又はＣ_５〜Ｃ_８の炭素環構造、又は
   の１つであり、
   Ｒ３はＨ、又はＣ_１〜Ｃ_６の直鎖若しくは分岐アルキル基であり、
   Ｒ６及び／又はＲ７はＨ、又はＣ_１〜Ｃ_６の直鎖若しくは分岐アルキル基である）。
2. ｎｏｔｃｈシグナル伝達経路の阻害剤として下記一般式ＩＩを有する化合物を含む、老化プロセスの減速、逆転 及び／又は未然の阻害用の薬剤：
   （式中、（式中、Ｒ１は、
   の１つであり、
   ここで、ＸはＨ又はＦ、Ｃｌ、Ｂｒ若しくはＩで代表されるハロゲンであり、ＹはＣＯＯＣＨ _３ であり、
   Ｒ２はＣ_１〜Ｃ_８の直鎖若しくは分岐アルキル基、又はＣ_５〜Ｃ_８の炭素環構造、又は
   の１つであり、
   Ｒ３はＨ、又はＣ_１〜Ｃ_６の直鎖若しくは分岐アルキル基であり、
   Ｒ６及び／又はＲ７はＨ、又はＣ_１〜Ｃ_６の直鎖若しくは分岐アルキル基である）。
3. ｎｏｔｃｈシグナル伝達経路の阻害剤として下記一般式ＩＩを有する化合物を含む、癌の予防用の薬剤：
   （式中、（式中、Ｒ１は、
   の１つであり、
   ここで、ＸはＨ又はＦ、Ｃｌ、Ｂｒ若しくはＩで代表されるハロゲンであり、ＹはＣＯＯＣＨ _３ であり、
   Ｒ２はＣ_１〜Ｃ_８の直鎖若しくは分岐アルキル基、又はＣ_５〜Ｃ_８の炭素環構造、又は
   の１つであり、
   Ｒ３はＨ、又はＣ_１〜Ｃ_６の直鎖若しくは分岐アルキル基であり、
   Ｒ６及び／又はＲ７はＨ、又はＣ_１〜Ｃ_６の直鎖若しくは分岐アルキル基である）。
4. ｎｏｔｃｈシグナル伝達経路の阻害剤として下記一般式ＩＩＩを有する化合物を含む、癌の処置用の薬剤：
   （式中、Ｒ１はＨ、ＣＯＯＣＨ_３、ＣＯＯＨ、若しくはＮＯ_２ であり、
   Ｒ２はＣ _１ 〜Ｃ _８ の直鎖若しくは分岐アルキル基、又は炭素環構造である）。
5. ｎｏｔｃｈシグナル伝達経路の阻害剤として下記一般式ＩＩＩを有する化合物を含む、老化プロセスの減速、逆転 及び／又は未然の阻害用の薬剤：
   （式中、Ｒ１はＨ、ＣＯＯＣＨ_３、ＣＯＯＨ、若しくはＮＯ_２ であり、
   Ｒ２はＣ _１ 〜Ｃ _８ の直鎖若しくは分岐アルキル基、又は炭素環構造である）。
6. ｎｏｔｃｈシグナル伝達経路の阻害剤として下記一般式ＩＩＩを有する化合物を含む、癌の予防用の薬剤：
   （式中、Ｒ１はＨ、ＣＯＯＣＨ_３、ＣＯＯＨ、若しくはＮＯ_２ であり、
   Ｒ２はＣ _１ 〜Ｃ _８ の直鎖若しくは分岐アルキル基、又は炭素環構造である）。
7. 以下の化合物グループから選択される癌の処置用の又は癌の予防用の又は老化プロセスの減速、逆転 及び／若しくは未然の阻害用のいづれか一の薬剤として使用される化合物：
   
8. 癌の処置のための請求項１若しくは４に記載の薬剤、又は請求項７に記載の化合物を含む癌の処置のための薬剤であって、そこにおいて癌が、慢性リンパ球性白血病（ＣＬＬ）、食道がん、神経膠腫、結腸がん、血液がん、大腸がん、子宮頸がん、膵臓がん、乳がん又は肺がんである、薬剤。
9. 血液がんが、リンパ腫又は白血病であり、該リンパ腫がＴ細胞リンパ腫、Ｂ細胞リンパ腫又はホジキンリンパ腫である、請求項８に記載の薬剤。
10. 請求項２若しくは５に記載の薬剤、又は請求項７に記載の化合物を含む薬剤であって、老化プロセスが細胞老化関連分泌現象（ＳＡＳＰ）によって特徴付けられ、ＳＡＳＰが炎症誘発性性サイトカイン、又はＩＬ−６及びＩＬ−８の分泌により特徴付けられる、老化プロセスの減速、逆転 及び／又は未然の阻害用の薬剤。
11. 請求項１〜６、８〜１０のいずれか一項に記載の薬剤の一つ若しくは複数又は請求項７に記載の化合物の１つ若しくは複数と、薬学的に許容可能な担体物質とを含む医薬組成物。
12. ｎｏｔｃｈシグナル伝達経路の阻害物質としての以下の一般式ＩＩ又は一般式ＩＩＩのいずれか一に記載の化合物のｉｎ ｖｉｔｒｏ使用；
    
    一般式ＩＩを有する化合物：
    （式中、（式中、Ｒ１は、
    の１つであり、
    ここで、ＸはＨ又はＦ、Ｃｌ、Ｂｒ若しくはＩで代表されるハロゲンであり、ＹはＣＯＯＣＨ _３ であり、
    Ｒ２はＣ_１〜Ｃ_８の直鎖若しくは分岐アルキル基、又はＣ_５〜Ｃ_８の炭素環構造、又は
    の１つであり、
    Ｒ３はＨ、又はＣ_１〜Ｃ_６の直鎖若しくは分岐アルキル基であり、
    Ｒ６及び／又はＲ７はＨ、又はＣ_１〜Ｃ_６の直鎖若しくは分岐アルキル基である）
    一般式ＩＩＩを有する化合物：
    （式中、Ｒ１はＨ、ＣＯＯＣＨ_３、ＣＯＯＨ、若しくはＮＯ_２ であり、
    Ｒ２はＣ _１ 〜Ｃ _８ の直鎖若しくは分岐アルキル基、又は炭素環構造である）