JP6117508B2 - 培養基盤固定治具及びこれを用いた反重力培養方法 - Google Patents
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- Apparatus Associated With Microorganisms And Enzymes (AREA)
Description
円筒容器内に内接することにより固定される長尺形状部材であり、かつ、前記円筒容器内で培養基盤を一定の角度で保持する長尺形状部材を備える培養基盤固定治具であって、
前記長尺形状部材が、
前記培養基盤を保持する保持部と、
前記保持部と接続されている長尺形状の柄と、を備え、
前記保持部は、
前記培養基盤を把持する二枚のフレームと、
前記二枚のフレームと前記長尺形状の柄とを接続すると共に前記円筒容器内で前記培養基盤を一定の角度で保持するために前記二枚のフレームと前記長尺形状の柄との固定角度を調整する接続調整機構と、を有し、
前記保持部は、前記培養基盤が前記円筒容器の中心軸に対して傾斜する方向に沿って前記培養基盤を保持する、ことを特徴とする培養基盤固定治具である。
前記接続調整機構は、可塑性部材からなることを特徴とする本発明(1)の培養基盤固定治具である。
円筒容器内に内接することにより固定される長尺形状部材であり、かつ、前記円筒容器内で培養基盤を一定の角度で保持する長尺形状部材を備える培養基盤固定治具であって、
前記長尺形状部材が、長尺形状の板状部材であり、且つ
前記板状部材には前記培養基盤を挿入可能な空孔状の保持部が設けられており、
前記保持部は、前記培養基盤が前記円筒容器の中心軸に対して傾斜する方向に沿って前記培養基盤を保持する、ことを特徴とする培養基盤固定治具である。
前記空孔状の保持部が複数配列されている、本発明(3)の培養基盤固定治具である。
円筒容器内に内接することにより固定される長尺形状部材であり、かつ、前記円筒容器内で培養基盤を一定の角度で保持する長尺形状部材を備える培養基盤固定治具であって、前記円筒容器を載置可能である載置台を有する培養装置用であり、
前記長尺形状部材が、少なくとも2枚の長尺形状の板状部材からなり、
前記少なくとも2枚の板状部材間で培養基盤を挟み込み保持する保持部が設けられており、且つ、
前記培養装置は、前記円筒容器の中心軸を前記載置台の水平方向に対して傾斜させて前記円筒容器を前記載置台に載置可能である、ことを特徴とする培養基盤固定治具である。
前記円筒容器を載置可能である載置台を有する培養装置用であって、
前記培養装置は、前記円筒容器の中心軸を前記載置台の水平方向に対して傾斜させて前記円筒容器を前記載置台に載置可能である、本発明(1)〜(5)のいずれか一つの培養基盤固定治具である。
前記載置台の水平方向に対する前記円筒容器の中心軸の傾斜の角度は、前記載置台の水平方向に対して0〜80度である、本発明(5)又は(6)の培養基盤固定治具である。
本発明(1)〜(7)のいずれか一つの培養基盤固定治具を用いて、培養基盤に固定された細胞に対して、前記細胞の定着した足場から細胞方向へと重力を作用させる反重力刺激を与えて細胞を培養する反重力培養方法であって、
細胞の固定された前記培養基盤を前記培養基盤固定治具の前記長尺形状部材により固定して、円筒容器内に挿入して固定する工程と、
前記円筒容器を回転させて細胞を培養する工程と
を有する反重力培養方法である。
請求項1〜7のいずれか一つの培養基盤固定治具を用いて、培養基盤に固定された細胞に対して、前記細胞の定着した足場から細胞方向へと重力を作用させる反重力刺激を与えて細胞を培養する反重力培養方法であって、
細胞の固定された前記培養基盤を前記培養基盤固定治具の前記長尺形状部材により固定して、円筒容器内に挿入して固定する工程と、
前記円筒容器内に培養液を供給する工程と、
前記培養液内で前記培養基盤の足場を重力方向に対して上側に、前記培養基盤に固定した前記細胞を重力方向に対して下側に配置して細胞を培養する工程と、
を有する反重力培養方法である。
また、本発明(10)は、
前記細胞を培養する工程における前記円筒容器の回転速度が1〜100rpmである、本発明(8)の反重力培養方法である。
(第一形態の1に係る培養基盤固定治具)
図1は、円筒容器内に培養基盤を固定するために用いられる培養基盤固定治具の第一態様の1の概略構成図である。培養基盤固定治具3は、培養基盤を保持する保持部31と、前記保持部が固定されている長尺形状の柄33と、を有する。このようにして長尺状の柄33に保持部31を設けることによって、試験管内に培養基盤を挿入する際に作業しやすくなる。
図2は、円筒容器4内に培養基盤を固定するために用いられる培養基盤固定治具の第一態様の2に係る概略構成図である。第一形態の2の培養基盤固定治具3は、保持部31を複数有する。保持部31が前記柄の長尺方向に配列されている。このように複数の保持部31を配することにより、円筒容器内に複数の培養基盤を配置して同時に細胞培養を行うことができる。
図5は、円筒容器内に培養基盤を固定するために用いられる培養基盤固定治具の、第二態様の1の概略構成図である。第二形態の1の培養基盤固定治具(図5の右上に示された部材)は、空孔状保持部(図5の右上に示された部材に開けられた3個の方形状開口部)を有する板状の支持板型部材(板状部材)である。図6及び図7に示されるように、当該空孔に培養基盤(例えば小型シャーレ28)を挿入することで、板状部材350(培養基盤固定治具3)に培養基盤(例えば小型シャーレ28)を保持させ、更に当該板状部材350を円筒容器4に挿入することで、培養基盤(例えば小型シャーレ28)を円筒容器4内で一定の角度で固定出来る。これにより、一つの円筒容器内で、複数の培養基盤による細胞培養を同時に行うことが可能となる。尚、図5では、培養基盤固定治具が複数個所(本例では三箇所が例示)の空孔状保持部を有する例のみ示したが、これには限定されず、一箇所であってもよい。
図8は、円筒容器内に培養基盤を固定するために用いられる培養基盤固定治具の、第二態様の2に係る概略構成図である。第二態様の2は、第二態様の1と同様に、板状部材(図8に示された部材)に複数の培養基盤を保持させる態様であるが、複数の空孔状保持部(図8に示された部材に開けられた開口部)を隙間なく配列させ連通させることで、一つの空孔としている。このような空孔状保持部を設けた場合には、複数の空孔状保持部を、間隔を離して設けた場合と比較し、板状部材自体の強度はやや劣るが、決められた板状部材の長さ内でより多くの培養基盤を保持することが可能となる(図9及び10参照)。
図11は、円筒容器内に培養基盤を固定するために用いられる培養基盤固定治具の、第三態様に係る概略構成図である。第三形態に係る培養基盤固定治具3は、二枚の板状部材351及び352を有し、当該二枚の板状部材351及び352間に培養基盤を挟み固定することで、円筒容器4内で培養基盤を一定の角度で固定する。
本発明に係る細胞培養方法は、細胞に対して、前記細胞の定着した足場から細胞方向へと重力を作用させる反重力刺激を与えながら培養する反重力培養方法である。本発明者は、反重力刺激を細胞に対して与えることによって、細胞の増殖が促進されることを見出した。
従来の方法によれば、細胞懸濁液を多孔質の三次元培養基盤に滴下するなどして細胞を播種すると、細胞は基盤をすり抜けて、殆どすべてが底面にまで落下するので、三次元培養の大きな技術的障害になっていた。これに対して本発明に係る方法のように基盤を回転させることによって、すり抜けて落下した細胞が再度、基盤と接触し、当該基盤上に定着する機会が増加することになる。したがって、細胞基盤と、細胞とを回転させることによって、従来法では得られなかった高い効率で細胞を培養基盤にトラップさせ、これによって骨芽細胞等の足場依存性細胞を、三次元培養基盤に播種し定着することができるという効果を有する。
図12は、本発明に係る反重力培養装置1の概略斜視図であり、図13(a)は、当該反重力培養装置の概略平面図であり、図13(b)は、当該反重力培養装置の概略側面図である。
前述のように、図12等に示した反重力培養装置においては、筒状容器回転手段に設けられたロールの回転軸は、フレキシブルジョイントを介して、モータと接続している。その結果、枠体の傾斜を自由に設定することが可能となっている。しかし、そのような構成においては、フレキシブルジョイントに応力が集中し破損してしまう可能性があり、長時間放置の細胞培養において好ましくない場合もある。そこで当該問題の解決手段として、フレキシブルジョイントを排除した態様である反重力培養装置の変更例について詳述する。
上記の装置を用いる反重力培養方法の例を挙げて説明する。本発明に係る反重力培養方法の具体例として、容器を回転させる装置を用いて、当該容器内に細胞を播種して、当該容器を回転させて培養する方法が挙げられる。このように容器を回転させることにより細胞に対して反重力刺激を与えながら培養する。回転させる筒状容器内壁に、培養基盤を固定して回転させて、細胞に対する重力の方向を反転させつつ培養することが好適である。
反重力培養装置1及び第三形態に係る培養基盤固定治具3を用いて、細胞の培養を行なった。骨芽細胞MC3T3−E1を三次元培養基盤(ハイドロキシアパタイト被覆発泡ポリウレタン:多孔質培養基盤)にコラーゲン被覆した培養基盤に対して、50,000個ずつ播種して、培養基盤固定治具に保持された当該培養基盤および培養液5ml(イーグルの最小必須培地)を、試験管内に入れて、水平に対して25°傾けたロール上に載置して、4rpmの速度で回転させて、培養器中で培養試験を行なった。2日後、2週後、4週後の細胞数をミトコンドリアの酵素活性を測定する呈色反応(MTS測定法)を行い450nmで吸光度を測定することにより観察した。2週後に細胞数が顕著に増加した。その結果を図18の実線で示す。
対照実験である従来型の静置培養の結果を図18の点線で示す。上記の例1と、調製した骨芽細胞が播種された三次元培養基盤を96ウエルディッシュに載置して静置培養した以外は同様の条件で細胞培養試験を行なった。2日後、2週後、4週後の細胞数を呈色反応を行い450nmで吸光度を測定した結果、従来型の静置の細胞数は、時間と共に細胞は増殖するが、反重力装置で培養した場合と比較すると、2〜4週においては約2分の1に留まっている。
三次元培養基盤として、コラーゲンのみを被覆したポリウレタンを用いたこと以外は、例1と同様の方法で、例3に係る培養を行なった。また、回転を行なわなかったこと以外は、例3と同様の条件で、例4に係る培養を行った。これら例3及び例4に係る培養の結果を、1週後、2週後、3週後、6週後の細胞数にて観察し、図19に示す。いずれの時点でも反重力培養の例は、従来法で培養した比較例よりも高い細胞数を示した。
三次元培養基盤として、市販のチタンメッシュを用いたこと以外は、例1と同様の方法で、例5に係る培養を行なった。また、回転を行なわなかったこと以外は、例5と同様の条件で、例6に係る培養を行った。これら例5及び例6に係る培養の結果を、3日、2週後、3週後、4週後、5週後、7週後の細胞数にて観察し、図20に示す。いずれの時点でも反重力培養の例は、従来法で培養した比較例よりも高い細胞数を示した。とくに2週目から4週目にかけては、1.4〜1.6倍高い値を示した。
反重力培養装置1及び第一形態に係る培養基盤固定治具3を用いて、細胞の培養を行なった。二次元の平板培養基盤(内径13mm、深さ2mmのチタン製培養皿)の上に骨芽細胞MC3T3−E1を12.5万個ずつ播種して、4時間培養した。その後、例7においては、培養液(イーグルの最小必須培地)を、試験管内に入れて、皿を反転させて、培養皿を重力方向に対して上側に、細胞を重力方向下側に向けて配置して反重力刺激を与えながら48時間培養した。例8においては、培養液(イーグルの最小必須培地)を、試験管内に入れて、皿を反転させずに(4時間の培養と同じ向きで)重力の方向に垂直に配置して48時間培養した。48時間後の細胞数をミトコンドリアの酵素活性を測定する呈色反応(MTS測定法)を行い450nmで吸光度を測定することにより観察した。結果、反重力刺激を与えた例7においては、細胞数が顕著に増加した。その結果を図21で示す。
骨肉腫由来細胞(MG63)を皿1枚あたり3万個ずつ直径35mmのプラスチック製ディッシュに播種し、1晩、通法に従って培養・定着させた後、2群に分け、第一形態の培養基盤固定治具3に設置して、反重力培養装置1に導入し、細胞の培養を行った。その後、通法に従って1型コラーゲン及びF−アクチンの発現量を定量的に測定した。1型コラーゲンの発現量結果(例9及び例11)を図22に、F−アクチンの発現量結果(例10及び例12)を図23に各々示す。ここで、第1群(例9及び例10)においては、皿を反転させて、培養皿を重力方向に対して上側(天)に、細胞を重力方向下側に向けて配置して反重力刺激を与えながら、1週間培養している。他の1群(例11及び例12)においては、皿を反転させずに(定着した向きと同じ向きで)培養皿を重力方向に対して下側(地)に、細胞を重力方向上側に向けて配置し1週間培養している。結果、反重力下では、正重力下よりも、コラーゲンは2倍、アクチンは20倍の発現量となり、両マーカーとも顕著な差をもって明確に発現が増大した。以上のように、反重力装置の効果は明らかに実証された。尚、mRNAの定量は、Applied Biosystems StepOne(tm) /StepOnePlus(tm) リアルタイムPCRシステムにて解析した。すなわち、各群を1週間培養した後、通法に従い、RNAレーター(商標)(ライフテクノロジー社)試薬1mlを各皿に加え、全RNA抽出を回収した。それぞれの全RNAから逆転写酵素反応により鋳型DNAを合成し、TaqMan(r)Gene Expression Assaysを製造者のプロトコールに従ってRNA分析した。
骨芽細胞MC3T3−E1MC3T3−E1を、市販の3次元細胞基盤チタンウエブ・ディスク(H社i−Lex製TW、13×1.5mm)内に、細胞が培養皿上に落下しないようにチタン粗大金網の上で、3万ずつ播種し、細胞がチタンウエブ内に定着するのを待ってから(1晩静置)、先ず市販の24ウェル培養ディスク(Corning社製)に移し、通常の静置培養を行った(24枚を培養)。その後、一定時間培養を続けた後、2群に分け、反重力培養装置に導入した。すなわち、本装置の第3形態の培養基盤固定治具(粗いチタンメッシュ板2枚の間に挟みこむ方式)に、1装置あたり、5枚ずつ挟み込み、その1郡の5枚は反重力装置によって、1/4反復交互回転(1分間に30回、90度回転する毎に回転方向を反転)を加えつつ培養し(例14)、他の群の5枚は対照として、挟み込んだまま静置培養した(例13)。それぞれ1週間培養した。コラーゲン産生量は、培養終了後に個々のディスクを取り出して、5℃でペプシン限定消化し、コラーゲンを可溶化してからSilcol試薬によって発色させ、590nmで比色定量した。その結果を図24に示す。1週間培養において半回転した場合(図24中TWRと表示)、コラーゲン産生量が同装置内静置(図24中tube-TWSと表示)の3.2倍に上昇した。
11:筒状容器回転手段
12:回転減速手段
13:モータ
14:駆動電源
15:基板
16:フレキシブルジョイント
17:台座
111a〜c:ロール
1111:芯棒
112a〜c:回転軸
113:枠体
1131:保持部
114:固定手段
1141:板状体
1142:固定孔
1143:螺子
1144:ワッシャ
21:円筒容器
23:アルミキャップ
25:三次元培養基盤
26、28:平板培養皿
3:培養基盤固定治具
31:保持部
311、313:保持フレーム
315:要部材
33:長尺形状の柄
350〜352:板状部材
4:円筒容器
Claims (10)
- 円筒容器内に内接することにより固定される長尺形状部材であり、かつ、前記円筒容器内で培養基盤を一定の角度で保持する長尺形状部材を備える培養基盤固定治具であって、
前記長尺形状部材が、
前記培養基盤を保持する保持部と、
前記保持部と接続されている長尺形状の柄と、を備え、
前記保持部は、
前記培養基盤を把持する二枚のフレームと、
前記二枚のフレームと前記長尺形状の柄とを接続すると共に前記円筒容器内で前記培養基盤を一定の角度で保持するために前記二枚のフレームと前記長尺形状の柄との固定角度を調整する接続調整機構と、を有し、
前記保持部は、前記培養基盤が前記円筒容器の中心軸に対して傾斜する方向に沿って前記培養基盤を保持する、ことを特徴とする培養基盤固定治具。 - 前記接続調整機構は、可塑性部材からなることを特徴とする請求項1に記載の培養基盤固定治具。
- 円筒容器内に内接することにより固定される長尺形状部材であり、かつ、前記円筒容器内で培養基盤を一定の角度で保持する長尺形状部材を備える培養基盤固定治具であって、
前記長尺形状部材が、長尺形状の板状部材であり、且つ
前記板状部材には前記培養基盤を挿入可能な空孔状の保持部が設けられており、
前記保持部は、前記培養基盤が前記円筒容器の中心軸に対して傾斜する方向に沿って前記培養基盤を保持する、ことを特徴とする培養基盤固定治具。 - 前記空孔状の保持部が複数配列されている、請求項3記載の培養基盤固定治具。
- 円筒容器内に内接することにより固定される長尺形状部材であり、かつ、前記円筒容器内で培養基盤を一定の角度で保持する長尺形状部材を備える培養基盤固定治具であって、前記円筒容器を載置可能である載置台を有する培養装置用であり、
前記長尺形状部材が、少なくとも2枚の長尺形状の板状部材からなり、
前記少なくとも2枚の板状部材間で培養基盤を挟み込み保持する保持部が設けられており、且つ、
前記培養装置は、前記円筒容器の中心軸を前記載置台の水平方向に対して傾斜させて前記円筒容器を前記載置台に載置可能である、ことを特徴とする培養基盤固定治具。 - 前記円筒容器を載置可能である載置台を有する培養装置用であって、
前記培養装置は、前記円筒容器の中心軸を前記載置台の水平方向に対して傾斜させて前記円筒容器を前記載置台に載置可能である、請求項1〜5のいずれか一項記載の培養基盤固定治具。 - 前記載置台の水平方向に対する前記円筒容器の中心軸の傾斜の角度は、前記載置台の水平方向に対して0〜80度である、請求項5又は6記載の培養基盤固定治具。
- 請求項1〜7のいずれか一項記載の培養基盤固定治具を用いて、培養基盤に固定された細胞に対して、前記細胞の定着した足場から細胞方向へと重力を作用させる反重力刺激を与えて細胞を培養する反重力培養方法であって、
細胞の固定された前記培養基盤を前記培養基盤固定治具の前記長尺形状部材により固定して、円筒容器内に挿入して固定する工程と、
前記円筒容器を回転させて細胞を培養する工程と
を有する反重力培養方法。 - 請求項1〜7のいずれか一項記載の培養基盤固定治具を用いて、培養基盤に固定された細胞に対して、前記細胞の定着した足場から細胞方向へと重力を作用させる反重力刺激を与えて細胞を培養する反重力培養方法であって、
細胞の固定された前記培養基盤を前記培養基盤固定治具の前記長尺形状部材により固定して、円筒容器内に挿入して固定する工程と、
前記円筒容器内に培養液を供給する工程と、
前記培養液内で前記培養基盤の足場を重力方向に対して上側に、前記培養基盤に固定した前記細胞を重力方向に対して下側に配置して細胞を培養する工程と、
を有する反重力培養方法。 - 前記細胞を培養する工程における前記円筒容器の回転速度が1〜100rpmである、請求項8記載の反重力培養方法。
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