JP6091412B2 - 標的核酸を精製するための方法 - Google Patents
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Description
本発明は、単離された核酸におけるタンパク質汚染が著しく低減されることにより、単離された標的核酸に高純度をもたらす、少なくとも1種の標的核酸をサンプルから精製するための方法を提供する。
a)サンプルを、少なくとも1種のタンパク質分解化合物と共にインキュベートするステップと、
b)標的核酸を固相に結合するステップと、
c)標的核酸を固相から溶出するステップと、
d)溶出された標的核酸を、少なくとも1種のタンパク質分解化合物と共にインキュベートするステップと、
e)標的核酸を再び固相に結合するステップと、
f)必要に応じて必要に応じて、結合した標的核酸を固相から溶出するステップと
を含む。
a)カオトロピック剤の存在下、サンプルを少なくとも40℃に加熱することによって、サンプルを、少なくとも1種のタンパク質分解酵素と共にインキュベートするステップと、
−DNAを第1の固相に結合することによって、DNAの少なくとも一部を除去し、前記第1の固相に結合したDNAを、RNAを含む残りのサンプルから分離するステップと、
b)RNAを第2の固相に結合するステップであって、少なくとも1種のカオトロピック剤および濃度≧30%v/vのアルコールがこの結合ステップb)中に使用されるステップと、
−前記第2の固相に結合したRNAを洗浄するための、少なくとも1つの洗浄ステップを行うステップと、
c)前記第2の固相からRNAを溶出するステップと、
d)カオトロピック剤の存在下、サンプルを少なくとも40℃に加熱することによって、溶出されたRNAを、少なくとも1種のタンパク質分解酵素と共にインキュベートするステップと、
e)RNAを再び固相に結合するステップであって、少なくとも1種のカオトロピック剤および濃度≧30%v/vのアルコールがこの結合ステップe)中に使用されるステップと、
−固相に結合したRNAを洗浄するための、少なくとも1つの洗浄ステップを行うステップと、
f)必要に応じて、結合した標的核酸を固相から溶出するステップと
を含む。
驚くべきことに、第2のタンパク質分解ステップを、標的核酸が固相に結合しそして固相から溶出された後、該核酸が固相に再結合する前に行うことは、単離された核酸におけるタンパク質汚染を低減させるのに、非常に効率的であることが見出された。
a)サンプルを、少なくとも1種のタンパク質分解化合物と共にインキュベートするステップと、
b)標的核酸を固相に結合するステップと、
c)標的核酸を固相から溶出するステップと、
d)溶出された標的核酸を、少なくとも1種のタンパク質分解化合物と共にインキュベートするステップと、
e)標的核酸を再び固相に結合するステップと、
f)必要に応じて、結合した標的核酸を固相から溶出するステップと
を含む。
a)一般式
Y+R1R2R3R4X−
(式中、Yは窒素またはリン、好ましくは窒素を表し、
R1R2R3およびR4は独立して、分岐状または非分岐状のC1〜C20アルキル基、C6〜C20アリール基、および/またはC6〜C26アラルキル基を表し、
X−は、無機または有機の一塩基酸または多塩基酸の陰イオンを表す)
の陽イオン化合物と、
b)少なくとも1種のプロトン供与体であって、プロトン供与体が好ましくは50mMを超えて飽和に至る濃度で組成物中に存在し、プロトン供与体が、好ましくは飽和脂肪族モノカルボン酸、不飽和アルケニルカルボン酸、飽和および/もしくは不飽和脂肪族C2〜C6ジカルボン酸、脂肪族ヒドロキシルジカルボン酸および脂肪族ヒドロキシルトリカルボン酸、脂肪族ケトカルボン酸、アミノ酸、または無機酸、またはそれらの塩からなる群から、それ自体でまたは組み合わせて選択されるプロトン供与体と
を含む。
a)カオトロピック剤の存在下、サンプルを少なくとも40℃に加熱することによって、サンプルを、少なくとも1種のタンパク質分解酵素と共にインキュベートするステップと、
−DNAを第1の固相に結合することによって、DNAの少なくとも一部を除去し、前記第1の固相に結合したDNAを、RNAを含む残りのサンプルから分離するステップと、
b)RNAを第2の固相に結合するステップであって、少なくとも1種のカオトロピック剤および濃度≧30%v/vのアルコールがこの結合ステップb)中に使用されるステップと、
−前記第2の固相に結合したRNAを洗浄するための、少なくとも1つの洗浄ステップを行うステップと、
c)前記第2の固相からRNAを溶出するステップと、
d)カオトロピック剤の存在下、サンプルを少なくとも40℃に加熱することによって、溶出されたRNAを、少なくとも1種のタンパク質分解酵素と共にインキュベートするステップと、
e)RNAを再び固相に結合するステップであって、少なくとも1種のカオトロピック剤および濃度≧30%v/vのアルコールがこの結合ステップe)中に使用されるステップと、
−固相に結合したRNAを洗浄するための、少なくとも1つの洗浄ステップを行うステップと、
f)必要に応じて、結合した標的核酸を固相から溶出するステップと
を含む。
全RNAを、安定化溶液を含むPAXgene Blood RNAチューブ中の、12名の異なるドナーから得た全血(2.5ml)から、3つ組みで、単離した。適切な安定化溶液についても既に記述されている。安定化サンプルを含むPAXgene Blood RNAチューブ(PreAnalytiX)を、市販のキットQIAsymphony PAXgene Blood RNA Kit(PreAnalytiX)についての指示マニュアル、miRNAなどの低分子RNA種も単離するためのその改訂版、または本発明による方法に従ってさらに処理した。
a)QIAsymphony PAXgene Blood RNA(PreAnalytiX)
詳細なプロトコルは、該当するハンドブックに記載されている。したがって、それぞれのプロトコルについては、本明細書では手短にしか記述しない:
1.PAXgene Blood RNAチューブを、10分間、3000〜5000×gで、スイングアウトローターを使用して遠心分離した。
2.遠心分離後、上清をデカンテーションにより除去した。上清を廃棄し、ペレットを、ステップ3での再懸濁用に取っておいた。
3.チューブ当たり300μlのBuffer BR1を添加した。チューブを閉鎖し、ペレットをボルテックスによって完全に再懸濁した。マルチチューブボルテックスミキサーを、30秒間全速で、再懸濁するために使用し、それぞれペレットが完全に再懸濁するまで行った。
4.クロージャーを除去し、廃棄した。
5.ロボットシステムQIAsymphony SPを、さらなる処理に使用した。PAXgene Blood RNA単離のために必要とされる試薬カートリッジ、および消耗品を、「試薬および消耗品」の引出し(drawer)に投入した。さらに、必要とされる溶出ラックを、「溶出液」の引出しに投入した。
6.ステップ4からのサンプルを、適切なサンプルキャリアに配置し、「サンプル」の引出しに投入した。その後サンプルを、該当するプログラムでQIAsymphonyにより処理した。手短に言うと、ロボットシステムQIAsymphonyは、溶解緩衝液BR2、プロテイナーゼK、およびMagAttractビーズを添加することによって、プローブを処理した。最初にDNAをビーズに結合し、除去した。その後、さらなる磁性ビーズを、結合緩衝液QSB1に加えて添加した。その後、複合体を、緩衝液QSB1および緩衝液BR4で前洗浄した。
7.サンプルを、緩衝液BR5で先に溶出し、残りのDNAを消化した。RNAは、緩衝液QSB2を添加することにより再結合した。その後、さらなる洗浄ステップを行い、複合体を乾燥し、RNAを溶出した。
b)miRNAなどの低分子RNAを含むために改訂されたQIAsymphonyプロトコル
miRNAなどの低分子RNAも単離するための、改訂されたQIAsymphony PAXgene Bloodプロトコルを、QIAsymphonyロボットシステムで行った。手短に言うと、下記のステップを行った:
1.PAXgene Blood RNAチューブを10分間、3,000から6,000rpmで遠心分離した。ペレットを、酢酸アンモニウムを含む緩衝液(300μl)を添加しボルテックスによって再懸濁した。適切な緩衝液は、緩衝液BR1(QIAGEN)である。
2.さらなる溶解剤、好ましくはProteinase K(40μl)と、3M超のカオトロピック塩、好ましくはGITCを含む溶解緩衝液(230μl)とを添加した。適切な緩衝液は緩衝液BR2(QIAGEN)である。その後、サンプルを10分間、56℃、100rpmでインキュベートした。
3.MagAttractビーズ(QIAGEN)を添加して、DNAをシリカ粒子に結合させて一緒に除去した。
4.RNAを結合するため、追加のMagAttractビーズを添加し(60μl)、80%のイソプロパノール(またはエタノール)、それぞれ0.6Mの過塩素酸ナトリウム、トリフルオロ酢酸ナトリウム、またはトリクロロ酢酸ナトリウム、およびTrisを含む、本発明による結合緩衝液1500μlを添加した。
5.2つの洗浄ステップを行った。第1の洗浄ステップは、イソプロパノール、GTC、および界面活性剤を含む緩衝液を用いて行い、第2の洗浄ステップは、エタノールおよびTrisを含む洗浄緩衝液を用いて行った。
6.その後、溶出緩衝液(例えば、BR5、QIAGEN)250μlでRNAを先に溶出し、DNase消化を行った(225μlの緩衝液RDD(QIAGEN)および25μlのDNase I原液(QIAGEN))。
7.RNAをビーズに再結合するため、同じ結合緩衝液(上記参照)1400μlを添加した。この第2の結合ステップは、低分子RNAの良好な収量を確実にする。
8.その後、4回の追加の洗浄ステップを行った。
9.全RNAを、適切な溶出緩衝液(BR5、QIAGEN)を使用することにより溶出した。水またはTris緩衝液など、その他の一般的な溶出緩衝液も使用することができる。
c)本発明による方法
本発明による方法も、QIAsymphonyロボットシステムで行った。方法は、b)で記述された方法に該当するが、追加のプロテイナーゼK消化を、DNase消化後に行った。手短に言うと、下記のステップを行った:
1.PAXgene Blood RNAチューブを、10分間、3,000から6,000rpmで遠心分離した。ペレットを、酢酸アンモニウムを含む緩衝液(300μl)を添加しボルテックスによって再懸濁した。適切な緩衝液は、緩衝液BR1(QIAGEN)である。
2.さらなる溶解剤、好ましくはProteinase K(20μl)と、3M超のカオトロピック塩、好ましくはGITCを含む溶解緩衝液(230μl)とを添加した。適切な緩衝液は、緩衝液BR2(QIAGEN)である。その後、サンプルを10分間、56℃、100rpmでインキュベートした。
3.MagAttractビーズ(QIAGEN)を添加して、DNAをシリカ粒子に結合させて一緒に除去した。
4.RNAを結合するため、追加のMagAttractビーズを添加し、80%のイソプロパノール(またはエタノール)、それぞれ0.6Mの過塩素酸ナトリウム、トリフルオロ酢酸ナトリウム、またはトリクロロ酢酸ナトリウム、およびTrisを含む、本発明による結合緩衝液1500μlを添加した。
5.2回の洗浄ステップを行った。第1の洗浄ステップは、イソプロパノール、GTC、および界面活性剤を含む緩衝液を用いて行い、第2の洗浄ステップは、エタノールおよびTrisを含む洗浄緩衝液を用いて行った。
6.その後RNAを、溶出緩衝液(例えば、BR5、QIAGEN)250μlを用いて先に溶出し、DNase消化を行った(225μlの緩衝液RDD(QIAGEN)および25μlのDNase I原液(QIAGEN))。
7.次いで第2のプロテイナーゼK消化ステップを行った。この目的のため、20μlのプロテイナーゼKと、3M超のカオトロピック塩、好ましくはGITCを含む溶解緩衝液(200μl)とを添加し(適切な緩衝液はBR2、QIAGENである)、サンプルを5分間、56℃、100rpmでインキュベートした。
8.RNAをビーズに再結合するため、本発明による同じ結合緩衝液(上記参照)1400μlを添加した。この第2の結合ステップは、低分子RNAの良好な収量を確実にする。
9.その後、4回の追加の洗浄ステップを行った。この目的のため、洗浄緩衝液QSB1、AW1、およびBR4(全てQIAGEN)を使用することができる。
9.全RNAを、適切な溶出緩衝液(BR5、QIAGEN)を使用することにより溶出した。水またはTris緩衝液など、その他の一般的な溶出緩衝液も使用することができる。
2.結果
結果を、図1から7に示す。
本発明は、例えば、以下を提供する。
(項目1)
少なくとも1種の標的核酸をサンプルから精製するための方法であって、少なくとも、a)該サンプルを、少なくとも1種のタンパク質分解化合物と共にインキュベートするステップと、
b)該標的核酸を固相に結合するステップと、
c)該標的核酸を該固相から溶出するステップと、
d)溶出された該標的核酸を、少なくとも1種のタンパク質分解化合物と共にインキュベートするステップと、
e)該標的核酸を再び固相に結合するステップと、
f)必要に応じて、結合した該標的核酸を該固相から溶出するステップと
を含む方法。
(項目2)
ステップa)および/またはステップd)での前記インキュベーションが、
a)加熱、
b)揺動、
c)塩の存在、
d)カオトロピック剤の存在、
e)6から9の間のpH値、および/または
f)少なくとも3分間のインキュベーション時間
の1つまたは複数を含む条件下で行われる、項目1に記載の方法。
(項目3)
前記少なくとも1種のタンパク質分解化合物がタンパク質分解酵素である、項目1または2に記載の方法。
(項目4)
ステップb)および/またはステップe)での結合が、
a)結合が、少なくとも1種のカオトロピック剤の存在下で行われ、
b)結合が、アルコールの存在下で行われ、
c)結合が、界面活性剤の存在下で行われ、
d)結合が、タンパク質と前記固相との結合を促進させる条件下で行われ、そして/または
e)結合が、低分子核酸、特に低分子RNA種の結合を促進させる条件下で行われる
という特徴の1つまたは複数を有する条件下で行われる、項目1から3の一項またはそれより多くの項に記載の方法。
(項目5)
ステップb)および/またはステップe)での結合が、
a)10%v/vから90%v/v、15%v/vから90%v/v、20%v/vから80%v/v、30%v/vから80%v/v、40%v/vから80%v/v、40%v/vから70%、40%v/vから65%からなる群から選択されるアルコール濃度が使用され、
b)0.05Mから飽和限界まで、0.1Mから4M、および1Mから4Mからなる群から選択される、1種もしくは複数のカオトロピック剤の濃度が使用され、そして/またはc)少なくとも30%v/vのアルコール濃度、および少なくとも1種のカオトロピック剤が、低分子RNAを含めたRNAを前記固相に結合するために使用される
という特徴の1つまたは複数を有する結合条件下で行われる、項目4に記載の方法。
(項目6)
1つまたは複数の洗浄ステップが、ステップb)とc)の間、および/またはステップe)の後に行われる、項目1から5の一項またはそれより多くの項に記載の方法。
(項目7)
洗浄に使用される溶液が、少なくとも1種のカオトロピック剤、少なくとも1種のアルコール、少なくとも1種の界面活性剤、および/または少なくとも1種の緩衝成分を含む、項目6に記載の方法。
(項目8)
前記サンプルが、少なくとも1種の非標的核酸および少なくとも1種の標的核酸を含み、好ましくは該非標的核酸がDNAであり、該標的核酸がRNAである、項目1から7の一項またはそれより多くの項に記載の方法。
(項目9)
非標的核酸を除去するための中間ステップが、ステップa)の後およびステップb)の前に行われる、項目8に記載の方法。
(項目10)
酵素処理が、残りの非標的核酸を分解するためにステップd)の前に行われる、項目8または9に記載の方法。
(項目11)
前記サンプルを核酸安定化組成物と混合し、該安定化組成物が、
a)一般式
Y + R 1 R 2 R 3 R 4 X −
(式中、Yは窒素またはリン、好ましくは窒素を表し、
R 1 R 2 R 3 およびR 4 は独立して、分岐状または非分岐状のC 1 〜C 20 アルキル基、C 6 〜C 20 アリール基、および/またはC 6 〜C 26 アラルキル基を表し、
X − は、無機または有機の一塩基酸または多塩基酸の陰イオンを表す)
の陽イオン化合物と、
b)少なくとも1種のプロトン供与体と
を含む、項目1から10の一項またはそれより多くの項に記載の方法。
(項目12)
少なくとも、
a)カオトロピック剤の存在下、前記サンプルを少なくとも40℃に加熱することによって、該サンプルを、少なくとも1種のタンパク質分解酵素と共にインキュベートするステップと、
−DNAを第1の固相に結合することによって、該DNAの少なくとも一部を除去し、該第1の固相に結合した該DNAを、前記RNAを含む残りの該サンプルから分離するステップと、
b)該RNAを第2の固相に結合するステップであって、少なくとも1種のカオトロピック剤および濃度≧30%v/vのアルコールがこの結合ステップb)中に使用されるステップと、
−該第2の固相に結合した該RNAを洗浄するための、少なくとも1つの洗浄ステップを行うステップと、
c)該第2の固相から該RNAを溶出するステップと、
d)カオトロピック剤の存在下、該サンプルを少なくとも40℃に加熱することによって、溶出された該RNAを、少なくとも1種のタンパク質分解酵素と共にインキュベートするステップと、
e)該RNAを再び固相に結合するステップであって、少なくとも1種のカオトロピック剤および濃度≧30%v/vのアルコールがこの結合ステップe)中に使用されるステップと、
−該固相に結合した該RNAを洗浄するための、少なくとも1つの洗浄ステップを行うステップと、
f)必要に応じて、結合した前記標的核酸を該固相から溶出するステップと
を含む、少なくともRNAおよびDNAを含むサンプルからRNAを精製するための、項目1から11の一項またはそれより多くの項に記載の方法。
(項目13)
低分子RNAを含む全RNAが標的核酸として単離され、単離された該核酸の95%の純度が1.8から2.2の間となる、項目1から12の一項またはそれより多くの項に記載の方法。
(項目14)
前記サンプルが、体液、血液、血液産物、組織、および骨髄から選択される生物学的サンプルである、項目1から13のいずれか一項に記載の方法。
(項目15)
核酸を結合することが可能な前記固相が、シリカ、磁性シリカ粒子、珪藻土、ガラス、アルキルシリカ、ケイ酸アルミニウム、ボロシリケート、ニトロセルロース、ヒドロキシアパタイト(ヒドロキシルアパタイトとも呼ばれる)、金属酸化物、ポリマー支持体、膜、および磁性粒子を含みまたはそれらからなる固相からなる群から選択される、項目1から14のいずれか一項に記載の方法。
Claims (14)
- 少なくとも1種の標的核酸をサンプルから精製するための方法であって、少なくとも、a)該サンプルを、少なくとも1種のタンパク質分解化合物と共にインキュベートするステップと、
b)該標的核酸を固相に結合するステップと、
c)該標的核酸を該固相から溶出するステップと、
d)溶出された該標的核酸を、少なくとも1種のタンパク質分解化合物と共にインキュベートするステップと、
e)該標的核酸を再び固相に結合するステップと、
f)必要に応じて、結合した該標的核酸を該固相から溶出するステップと
を含み、ここで、
該少なくとも1種のタンパク質分解化合物が、タンパク質分解酵素を含み;
該サンプルが、体液、血液、血液産物、組織および骨髄から選択される生物学的サンプルであり;
核酸を結合することが可能な該固相が、シリカ、磁性シリカ粒子、珪藻土、ガラス、アルキルシリカ、ケイ酸アルミニウム、ボロシリケート、ニトロセルロース、ヒドロキシアパタイト(ヒドロキシルアパタイトとも呼ばれる)、金属酸化物、ポリマー支持体、膜、および磁性粒子を含みまたはそれらからなる固相からなる群から選択され;
ステップa)および/またはステップe)での結合が、:
a)結合が、タンパク質と該固相との結合を促進させる条件下で行われ、および
b)結合が、低分子核酸の結合を促進させる条件下で行われる
という特徴を有する条件下で行われる、方法。 - ステップa)および/またはステップd)での前記インキュベーションが、
a)加熱、
b)揺動、
c)塩の存在、
d)カオトロピック剤の存在、
e)6から9の間のpH値、および/または
f)少なくとも3分間のインキュベーション時間
の1つまたは複数を含む条件下で行われる、請求項1に記載の方法。 - ステップb)および/またはステップe)での結合が、
a)結合が、少なくとも1種のカオトロピック剤の存在下で行われ、
b)結合が、アルコールの存在下で行われ、そして/または
c)結合が、界面活性剤の存在下で行われる
という特徴の1つまたは複数を有する条件下で行われる、請求項1から2のいずれか一項に記載の方法。 - 低分子核酸の結合を促進させる条件下で行われる結合が、低分子RNA種の結合を促進させる条件下で行われる、請求項3に記載の方法。
- ステップb)および/またはステップe)での結合が、
a)10%v/vから90%v/v、15%v/vから90%v/v、20%v/vから80%v/v、30%v/vから80%v/v、40%v/vから80%v/v、40%v/vから70%、40%v/vから65%からなる群から選択されるアルコール濃度が使用され、
b)0.05Mから飽和限界まで、0.1Mから4M、および1Mから4Mからなる群から選択される、1種もしくは複数のカオトロピック剤の濃度が使用され、そして/またはc)少なくとも30%v/vのアルコール濃度、および少なくとも1種のカオトロピック剤が、低分子RNAを含めたRNAを前記固相に結合するために使用される
という特徴の1つまたは複数を有する結合条件下で行われる、請求項3または4に記載の方法。 - 1つまたは複数の洗浄ステップが、ステップb)とc)の間、および/またはステップe)の後に行われる、請求項1から5のいずれか一項に記載の方法。
- 洗浄に使用される溶液が、少なくとも1種のカオトロピック剤、少なくとも1種のアルコール、少なくとも1種の界面活性剤、および/または少なくとも1種の緩衝成分を含む、請求項6に記載の方法。
- 前記サンプルが、少なくとも1種の非標的核酸および少なくとも1種の標的核酸を含む、請求項1から7のいずれか一項に記載の方法。
- 前記非標的核酸がDNAであり、前記標的核酸がRNAである、請求項8に記載の方法。
- 非標的核酸を除去するための中間ステップが、ステップa)の後およびステップb)の前に行われる、請求項8または9に記載の方法。
- 酵素処理が、残りの非標的核酸を分解するためにステップd)の前に行われる、請求項8から10のいずれか一項に記載の方法。
- 前記サンプルを核酸安定化組成物と混合し、該安定化組成物が、
a)一般式
Y+R1R2R3R4X−
(式中、Yは窒素またはリンを表し、
R1R2R3およびR4は独立して、分岐状または非分岐状のC1〜C20アルキル基、C6〜C20アリール基、および/またはC6〜C26アラルキル基を表し、
X−は、無機または有機の一塩基酸または多塩基酸の陰イオンを表す)
の陽イオン化合物と、
b)少なくとも1種のプロトン供与体と
を含む、請求項1から11のいずれか一項に記載の方法。 - 少なくとも、
a)カオトロピック剤の存在下、前記サンプルを少なくとも40℃に加熱することによって、該サンプルを、少なくとも1種のタンパク質分解酵素と共にインキュベートするステップと、
−DNAを第1の固相に結合することによって、該DNAの少なくとも一部を除去し、該第1の固相に結合した該DNAを、前記RNAを含む残りの該サンプルから分離するステップと、
b)該RNAを第2の固相に結合するステップであって、少なくとも1種のカオトロピック剤および濃度≧30%v/vのアルコールがこの結合ステップb)中に使用されるステップと、
−該第2の固相に結合した該RNAを洗浄するための、少なくとも1つの洗浄ステップを行うステップと、
c)該第2の固相から該RNAを溶出するステップと、
d)カオトロピック剤の存在下、該サンプルを少なくとも40℃に加熱することによって、溶出された該RNAを、少なくとも1種のタンパク質分解酵素と共にインキュベートするステップと、
e)該RNAを再び固相に結合するステップであって、少なくとも1種のカオトロピック剤および濃度≧30%v/vのアルコールがこの結合ステップe)中に使用されるステップと、
−該固相に結合した該RNAを洗浄するための、少なくとも1つの洗浄ステップを行うステップと、
f)必要に応じて、結合した前記標的核酸を該固相から溶出するステップと
を含む、少なくともRNAおよびDNAを含むサンプルからRNAを精製するための、請求項1から12のいずれか一項に記載の方法。 - 低分子RNAを含む全RNAが標的核酸として単離され、単離された該核酸の95%の純度が1.8から2.2の間となる、請求項1から13のいずれか一項に記載の方法。
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