JP6086347B2 - 共振型質量センサ - Google Patents
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Description
振動体は、好ましくは、被測定物質の分子認識手段を備えている。分子認識手段は、好ましくは、抗原−抗体反応を用いる。
振動体は、好ましくは、少なくとも一部に磁化可能な部材を含む。磁化可能な部材には、好ましくは、抗体又は抗原を固定化した磁気ビーズが磁気的に吸着される。
前記検出部は、好ましくは、発光素子と受光素子からなり、振動、変位、速度及び加速の何れかの検出手段を備える。
(第1の実施形態)
図1は、本発明の第1の実施形態に係る共振型質量センサ1の構成を示すブロック図である。
図1に示すように、本発明の共振型質量センサ1は、振動体2と、振動体2を励起する励起用の振動子3と、励起用の振動子3を駆動する電源4と、振動体2の振動を検出する検出部5と、を含んで構成されている。本発明の共振型質量センサ1の振動体2は、振動子3上に載置される。振動体2と振動子3は機械的に結合されておらず、かつ振動体2は何れの部材にも機械的に結合されていない、つまり、振動体2はどこにも固定化されていない構造を有している。
本発明の振動体2の振動モードについて説明する。
図2は、本発明の振動体2の形状を説明する斜視図である。
図2に示すように、本発明の振動体2は、例えば、長手方向の寸法である長さlと、幅wと、高さhと、断面の面積Aとを有する細長い柱状の梁からなる。本発明の振動体2は、圧電結晶等を用いることができる。圧電結晶としては、水晶、PZT等が挙げられる。本発明の振動体2に用いる振動モードは、梁の長手方向に対して垂直に振動する横振動モードであり、その共振周波数(fn)は下記(1)式で表される。横振動モードは、曲げ振動とも呼ぶ。
n:振動系のモード次数(図3参照)、
λn:両端自由の条件でλ1=4.730、λ2=7.583、λ3=10.996、
l:振動体2の長さ(cm)、
E:縦弾性係数 (水晶:9.72×1011) [g/cm・s2] 、
I:断面二次モーメント[cm4] 、
(:密度 (水晶:2.65)[g/cm3] 、
A:梁の断面積 [cm2]
本発明の振動体2における横振動モードのモード次数について説明する。
図3は、本発明の振動体2の両端自由の場合の横振動モードにおけるモード次数を説明する図であり、(a)は1次モード、(b)は2次モード、(c)は3次モードを示している。
図3に示すように、本発明の振動体2の両端自由の場合の横振動は定在波であり、1次モードの節の数は2、2次モード節の数は3、3次モード節の数は4である。
振動体2の材料を水晶とし、梁の長さが4mm、幅が0.4mm、高さが0.4mmのときの縦振動モードの1〜3次モードの共振周波数を上記(1)式を用いて計算した。計算結果を縦振動モード及びねじり振動と共に表1に纏めて示す。
図4は、本発明の第2の実施形態に係る共振型質量センサ10の構成を示すブロック図である。
図4に示すように、この第2の実施形態の共振型質量センサ10が、図1の共振型質量センサ1と異なるのは、振動体の表面に抗体等の分子認識素子16が固定化されて抗体固定化振動体12として構成されている点である。つまり、被測定物質の分子認識手段16を備えている。分子認識手段16としては、例えば抗体16aと抗原からなり、これにより抗原−抗体反応で特定の分子を捕捉する。図示の場合、抗体16a等の分子認識素子16は、振動体12表面の自由端などの振幅が大きい位置に固定されている。分子認識手段16となる抗体及び/又は抗原が振動体12の表面に固定化されてもよい。
振動体12に抗体16aを固定する方法について説明する。
振動体12の表面に金属薄膜を被覆し、この金属被膜上に分子層オーダーの分子膜をスパッタ法等により形成し、この分子膜に抗体16aを修飾することにより振動体12に抗体16aを固定することができる。金属薄膜としては、密着層と密着層上に形成される白金(Pt)膜を用いることができる。密着層は、TiやCr等が挙げられる。分子層オーダーの分子膜としては、自己組織化単分子膜(以下、SAM膜と呼ぶ。)を用いることができる。
抗体16aの固定化方法の一例を説明する。
梁状の振動体12の一面には、チタン(Ti)と白金(Pt、500Å)を、スパッタ法により成膜する。白金表面に抗体16aを固定化するには、SAM膜を形成し、SAM膜に抗体16aを修飾する。SAM膜と抗体16aの結合にはアミンカップリング法を用いた。また、余計なタンパクが付着して測定に影響が無いように、エタノールアミン水溶液でのブロッキングと、ウシ血清アルブミン(Bolvine Serum albumin、以下BSAと呼ぶ。)水溶液でのブロッキングも施した。
(1)有機物の除去:電極の表面をピラニア溶液に15分間浸漬し、有機物を除去する。
(2)保管方法:蒸留水で洗浄した直後、窒素ガスで乾燥させ、SAM膜形成まで蒸留水に浸漬させ保管する。この保管は、1時間以内とした。
(3)SAM膜の形成:エタノールで溶解した1mmol/L(10-3モル/リットル)の5-Carboxy-1-decanethiol(5−カルボキシ−1−デカンチオール)を滴下し、25℃の恒温槽内において1時間浸漬させる。
(4)未反応物の除去:エタノールで電極表面を洗浄し未反応物を除去する。
(5)活性化:蒸留水で洗浄後、NHS(N−ヒドロキシこはく酸イミド)水溶液,WSC(1−エチル−3−(3−ジメチルアミノプロピル)カルボジイミド)水溶液の混合溶液(1:1)を滴下し、25℃の恒温槽内において1時間浸漬させる。
(6)抗体16aの固定:リン酸緩衝生理食塩水(PBSと呼ぶ。)で洗浄後、PBSで希釈した抗体16aを滴下し、25℃の恒温槽内において30分間浸漬させる。
(7)不活性化:PBSで洗浄後、25℃の恒温槽内において20%エタノールアミン水溶液に1時間浸漬し、残った活性エステルを不活性化する。
(8)ブロッキング処理:蒸留水で洗浄後、1%BSA水溶液を滴下し、4℃で90分間浸漬する。
図5に示すように、共振型質量センサ10では、振動体12が液体又は気体の被測定サンプルに曝されると、被測定サンプルに含まれる特定の分子、例えば抗原16bが抗原−抗体反応のような免疫反応(イムノアッセイとも呼ばれている。)によって捕捉され、振動体12の質量が増加する。その結果、図6に示すように、振動体12の共振周波数が低下する。その変化割合から被測定サンプル中の特定の化学物質濃度を推定することができる。振動体12の共振周波数の変化は、図1の共振型質量センサ1と同様に検出部5により検知される。例えば、検出部5としてレーザー変位計などを用いた場合には、振動体12の共振周波数の変化を非接触で計測することができる。
尚、上記説明においては、梁状振動体12にSAM膜を形成して抗体16aを修飾したが、梁状振動体12に抗原16bを修飾してもよい。
図7は、本発明の第3の実施形態に係る共振型質量センサ20の構成を示すブロック図である。
図7に示す共振型質量センサ20が、図1の共振型質量センサ1と異なるのは、振動体22が磁性特性を有している点である。振動体22には、磁性を帯びた被測定サンプルを磁力により吸着して、磁性を帯びた被測定サンプルの質量を測定することができる。磁性を帯びた被測定サンプとしては、例えば、抗原16bを含むサンプル溶液と、抗体16aと磁気粒子、例えば磁気ビーズ26とからなる磁気ビーズ溶液と、を混合した磁性を帯びた被測定サンプル溶液を用いることができる(図11参照)。
図8は、強磁性振動体22の作製方法を示す図である。
図8に示すように、強磁性材料からなる振動体を所定の共振周波数が得られる形状に加工して強磁性振動体22を作製し、次に作製した強磁性振動体22を、永久磁石28や電磁石で磁化し、つまり、着磁することにより作製できる。
図9に示すように、この強磁性振動体23は、非磁性の振動体2に磁性薄膜29を被覆した構成を有している。非磁性の振動体2は、図1に示す振動体2と同様に、圧電結晶等を用いることができる。圧電結晶としては、水晶、PZT等が挙げられる。
図10は、図9の強磁性振動体23の作製方法を示す図である。
図10に示すように、強磁性振動体23は、以下の工程により作製される。
(1)非磁性材料からなる振動体2を所定の共振周波数が得られる形状に加工して非磁性振動体2を作製する。
(2)作製した非磁性振動体2に磁性薄膜29を形成する。磁性薄膜29は、圧電結晶等からなる非磁性振動体2上に、鉄(Fe),コバルト(Co),ニッケル(Ni)等やこれらの合金からなる強磁性体蒸着法やスパッタ法を用いて形成される。
(3)作製した強磁性振動体23を、永久磁石28や電磁石で磁化し、つまり、着磁することにより作製できる。
最初に抗原抗体反応を調べるために、上記の磁性を帯びた被測定サンプル溶液31を調製する(図11(a)参照)。磁性を帯びた被測定サンプル溶液31は、磁気ビーズ溶液32と、サンプル溶液33とからなる。磁気ビーズ溶液32には、抗体の16aを予め吸着させた磁気ビーズ26が含有されている。一方、サンプル溶液33には抗体被計測対象物である抗原16bが含有されている。磁気ビーズ溶液32とサンプル溶液33の適量をよく混合させ、磁性を帯びた被測定サンプル溶液31として調製する。
次に、磁性を帯びた被測定サンプル溶液31を振動体22上に滴下し、振動体22の表面に吸着させ、よく乾燥させ、磁性を帯びた被測定サンプルを振動体22に吸着する(図11(b)参照)。
振動体22に吸着した被測定サンプルの共振周波数変化を測定する(図11(c)参照)。さらに、予め、磁気ビーズ溶液32のみを振動体22又は同23に滴下し、よく乾燥させ、その際の共振周波数を測定しておく。次に、磁性を帯びた被測定サンプル溶液31を振動体22又は同23に滴下し、よく乾燥させ、その際の共振周波数の変化を算出することにより抗原16bの質量を測定することが可能となる。振動体22としては、図9に示す振動体23でもよい。以下の説明でも同様である。
以下、本発明を実施例により詳細に説明する。
最初に図1の振動体2の作製を行った。振動体2の材質をATカットの水晶板とし、横振動モードの1次モードの共振周波数が140〜160kHz程度となるように、0.4mm×0.4mm×5mmの寸法とした。ATカットの水晶板は、水晶のZ軸から35°15’傾けた面に平行にカットされた板である。図12は、作製した振動体2の外観を示す光学像である。
図13に示すように、共振型質量センサ1は、振動体2及び振動子3と、振動体2及び振動子3が載置されるXYZテーブル6と、振動子3を駆動する発振器4aと、検出部5と、観察部7と、を含んで構成されている。振動子3は、直径が20mmで、厚さが0.5mmの円板形状の圧電素子(NECトーキン(株)製、材質、N21)を使用した。検出部5は、レーザードップラー振動計5a(電子技研工業(株)、V100−S)とオシロスコープ5bとで構成されている。観察部7は、CCDカメラ7a((株)キーエンス製、VH−5000)とモニタ用のディスプレー7bとで構成されている。
共振型質量センサ1の基本特性を評価するために、共振周波数と負荷質量の関係を測定した。振動体2の端に板おもり(景山産業(株)製、厚さ0.1mm)を負荷として接着固定し、周波数特性を測定した。測定条件を纏めて表2に示す。
図14及び表3に示すように、負荷質量が無い場合の共振周波数は、142.5kHzであり、負荷質量の増大に伴って共振周波数が低下することが分かった。
ウシの血清から精製した蛋白質であるBSAを、振動体2に付着させ、そのときの共振周波数変化を測定した。
BSAをリン酸緩衝生理食塩水(PBS)で希釈し、BSA溶液とし、0.5%BSA溶液、3.0%BSA溶液、5.0%BSA溶液を調製した。BSA溶液の総蛋白分析には、総蛋白質量キット(Bio−Rad 社製、DCプロテインアッセイ)とマイクロプレートリーダー(Perkin Elmer Inc.社製、ARVO MX)を用いた。
図15は、BSAの付着工程を示す図である。図15に示すように、振動体2が試料台41上に載置され、次に、5μlのBSA溶液43を振動体2に滴下した。振動体2に滴下したBSA溶液43を、1時間放置して乾燥することにより、BSA44が振動体2に付着する。試料台41から振動体2を剥離することによりBSA44を付着した振動体2が得られる。
表4に示すように、PBS溶液を付着した場合の質量変化は0.03mgであり、周波数変化は、1.27kHzであった。
0.5%BSA溶液43を付着した場合の質量変化は0.04mgであり、共振周波数変化は、1.59kHzであった。
3.0%BSA溶液43を付着した場合の質量変化は0.07mgであり、共振周波数変化は、2.88kHzであった。
5.%BSA溶液43を付着した場合の質量変化は0.09mgであり、共振周波数変化は、3.42kHzであった。
図17に示すように、BSA溶液43を付着したときの質量感度が、おもり45を載置した場合よりも小さいのは、BSA溶液43が振動体2の全体面に付着し、この付着範囲が振動体2全体に広まったことから振動体2の振動時の断面二次モーメントが異なったためと考えられる。
次に、唾液に含まれる総蛋白の濃度測定について説明する。
唾液の採取は、以下のように行った。
(1)4名の被検者から、唾液を採取した。
(2)採取した唾液を遠心分離し、上澄み300μlを取り出した。
(3)総蛋白分析には、総蛋白質量キット(Bio−Rad社製、DCプロテインアッセイ)とマイクロプレートリーダー(Perkin Elmer Inc.社製、ARVO MX)を用いた。最も濃度の高い唾液を選択し、以下の実験に用いた。
図18は、別途測定しておいた総蛋白濃度とマイクロプレートリーダーの吸光度の関係を示す検量線である。
図18に示す相関関係を用いて、吸光度を総蛋白濃度に換算した。
(4)選択した唾液(サンプル溶液)は、遠心エバポレータを用いて濃縮し(37℃、15〜30分)、2倍濃縮、4倍濃縮のサンプル溶液を作った。
(6)図13に示す共振型質量センサ1を用いて、唾液を付着させた振動体2の共振スペクトルを、以下の条件においてスペクトラムアナライザで測定した。
印加電圧:7.07[V]
測定範囲:共振周波数の前後5[kHz]
(7)洗剤を用いて水晶からなる振動体2に付着しているサンプルを洗浄した。
(8)水晶からなる振動体2を乾燥させた。
(9)(1)〜(8)の手順を各サンプルで行った。
2,12,22,23:振動体
3:振動子
4:電源
4a:発振器
5:検出部
5a:レーザードップラー振動計
5b:オシロスコープ
6:XYZテーブル
7:観察部
7a:CCDカメラ
7b:モニタ用のディスプレー
8:スポンジ
12:抗体固定化振動体
16:分子認識素子
16a:抗体
16b:抗原
22,23:強磁性振動体
24:磁気粒子
26:磁気ビーズ
28:永久磁石
29:磁性薄膜
31:磁性を帯びた被測定サンプル溶液
32:磁気ビーズ溶液
33:サンプル溶液
41:試料台
43:BSA溶液
44:BSA
45:おもり
Claims (7)
- 振動子と、
上記振動子上に載置される振動体と、
上記振動体の共振周波数を検出する検出部と、
を備え、
上記振動体と上記振動子は機械的に結合されておらず、かつ、該振動体は何れの部材にも機械的に結合されていないことを特徴とする、共振型質量センサ。 - 前記振動体の振動は、定在波であることを特徴とする、請求項1に記載の共振型質量センサ。
- 前記振動体は、被測定物質の分子認識手段を備えていることを特徴とする、請求項1又は2の何れかに記載の共振型質量センサ。
- 前記分子認識手段は、抗原−抗体反応で特定の分子を捕捉することを特徴とする、請求項3に記載の共振型質量センサ。
- 前記振動体は、少なくとも一部に磁化可能な部材を含むことを特徴とする、請求項1〜3の何れかに記載の共振型質量センサ。
- 前記磁化可能な部材には、抗体及び/又は抗原を固定化した磁気ビーズが磁気的に吸着されることを特徴とする、請求項5に記載の共振型質量センサ。
- 前記検出部は、発光素子と受光素子からなり、周波数、変位、速度、及び加速度の何れかの検出手段を備えることを特徴とする、請求項1に記載の共振型質量センサ。
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