JP6042887B2 - ポリクロイックミラーチェンジャー付き蛍光顕微鏡 - Google Patents

Description

本開示は、蛍光顕微鏡検査法に関し、詳細には蛍光顕微鏡に関する。

蛍光顕微鏡は、一般的には、別個に撮像することができるいくつかの異なる蛍光発光チャネルを励起するために、ポリクロイックチェンジャーに取り付けられた複数のポリクロイックミラーを使用する。しかしながら、複数のポリクロイックミラーのシステムの配列には依然として課題がある。具体的には、励起ビーム光路に配置された１つのポリクロイックミラーを別のポリクロイックミラーと取り替えることを、高度な位置合わせ精度及び再現性で実現することが困難である。さらに、複数のポリクロイックミラーの相互の位置合わせ（ｃｏ−ａｌｉｇｎｍｅｎｔ）は実現が非常に困難である。

これまでの手法は、ターレットシステムの傾斜面に装着されたポリクロイックミラーを使用することを含む。ターレットの各傾斜位置には、異なるポリクロイックミラーがある。従来のターレットには、ポリクロイックミラーの位置を互いに対して、並びにことに顕微鏡に対して割り出しする（ｉｎｄｅｘ）一般的に複数の部分が存在するので、再現性の問題がある。これにより、２つ以上のポリクロイックミラーを相互に位置合わせすることを正確に保証することがほとんど不可能になる。機械的調整制御を追加して、複数のポリクロイックミラーを相互に位置合わせするための必要な自由度を提供することができる。しかしながら、こうした追加の機械的調整制御は、顕微鏡のコスト及び複雑さを大幅に増大させるだけでなく、長期的な位置合わせの再現性をさらに低減させる。例えば、ポリクロイックミラーチェンジャーに調整機構と関連する部品を追加すると、時間とともに光学構成要素の位置が変わるという結果になる。こうした理由から、蛍光顕微鏡の製造者及び技術者は、ポリクロイックミラーを交換するための信頼できるシステムを探究し続けている。

米国特許第２００７０１７７２５７号

ポリクロイックミラーチェンジャーを備えた蛍光顕微鏡検査システムについて説明する。１つの態様では、ポリクロイックミラーチェンジャーは、ポリクロイックミラーアレイを含む。アレイは、平面を有するプレートと、プレートに形成されたいくつかの穴とを含む。アレイはまた、プレートの平面に取り付けられたポリクロイックミラーを含み、各ポリクロイックミラーが穴の１つを覆い、各ポリクロイックミラーの反射面はプレートの平面に隣接して、プレートの平面と位置合わせされるようになっている。各ポリクロイックミラーは、対応する穴を通して部分的に露出されて、チェンジャーに入力された励起光のビームの励起チャネルの異なるサブセットを反射する。ポリクロイックミラーアレイは、励起チャネルの異なるサブセットを選択して試料を照らすとき、平面が３つ以上の接触の運動学的点の上をスライドして、アレイが単一の運動面内で動かされるように、チェンジャーに装着することができる。

例示的顕微鏡検査機器の等角図である。 モジュラー撮像システムの例示的ポリクロイックミラーチェンジャーの等角図である。 ポリクロイックミラーチェンジャーの、図２に示すＡ−Ａ線に沿った断面図である。 ポリクロイックミラーの一次元アレイを有する例示的ポリクロイックミラーアレイの組立分解等角図である。 ポリクロイックミラーアレイのプレートの等角図である。 図４Ｂに示すＣ−Ｃ線に沿ったポリクロイックミラーアレイの断面図である。 ポリクロイックミラーアレイの支持体の側面図である。 図５に示す支持体及びポリクロイックミラーアレイの断面図である。 励起チャネル、並びにポリクロイックミラーアレイのポリクロイックミラーと関連する透過率及び反射率の例示的グラフである。 図４Ｃに示すポリクロイックミラーアレイの断面図である。 ポリクロイックミラーの二次元アレイを有するポリクロイックミラーアレイのプレートの等角図である。

図１は、例示的顕微鏡検査機器１００の略図を示す。機器１００は、対物レンズ１０２と、光源１０４と、検出器１０６と、ポリクロイックミラーチェンジャー１０８とを含む。光源１０８は、λⁱ _exで示されるＮ個の別個の単色励起波長から成る高強度の光のビーム１１０を生成することができ、ここでＮは整数、ｉは１からＮの範囲の整数の指数である。顕微鏡のスライド１１２に配置された試料は、試料台１１４によって支持される。試料の成分は、蛍光プローブで標識付けされる。各タイプのプローブは、試料の特定の成分に特に結合するように設計され、各タイプの蛍光色素分子が、特定のタイプのプローブと結合されて、試料がビーム１１０で照らされると、各蛍光色素分子が、電磁スペクトルの可視部及び近可視部において異なる発光波長λⁱ _emを有する光を放つようになる。言い換えれば、試料の各成分を、異なる関連波長で表示することができる。言い換えれば、Ｎ個の励起波長は、Ｎ個の異なるタイプの蛍光色素分子からの発光を励起する。図１は、可視スペクトルにおける波長の範囲に対する強度のグラフ１１６を含む。グラフ１１６の各曲線は、特定の波長を中心とする非常に狭い範囲の波長についての強度分布を表す。例えば、曲線１１８は、第１のタイプの蛍光色素分子を励起する励起波長λ¹ _exを中心とする狭い範囲の励起波長を表し、曲線１２０は、第１の蛍光色素分子によって発せられる発光波長λ¹ _emを中心とする狭い範囲の発光波長を表す。発光波長が、電磁スペクトルの可視部にあるとき、異なる色を有する試料の画像で成分を表示することができる。Ｎ個の励起波長は、「励起チャネル」と呼ばれ、Ｎ個のタイプの蛍光色素分子から発せられる光のＮ個の波長は、「発光チャネル」と呼ばれる。

図１の例に示すように、チェンジャー１０８はビーム１１０を受け取り、励起チャネルの１つ以上から構成されるサブセットを選択して、対物レンズ１０２を通過させて試料を照らすように操作される。対応する発光チャネルは、対物レンズによって集められ、チェンジャーによって検出器１０６に向けられる。例えば、チェンジャー１０８は、ビーム１１０中の励起チャネルの全セットから励起チャネルのサブセットλⁱ _ex，λ^j _ex，…λ^k _exを選択し、対物レンズ１０２を通過させて、試料を照らすように操作される。対応する蛍光色素分子は、発光チャネルλⁱ _em，λ^j _em，…λ^k _emで光を発し、これが対物レンズ１０２によって集められ、チェンジャー１０８によって検出器１０６に向けられる。検出器１０６は、光検出器アレイ、ＣＣＤカメラ又はＣＭＯＳカメラとすることができる。

図２は、ポリクロイックミラーチェンジャー２００の例示的実施の等角図を示す。チェンジャー２００は、第１の開口部２０４と、第１の開口部２０４の上に位置している第２の開口部２０６とを有するハウジング２０２を含む。光源によって生成される励起光２０８のビームが、第１の開口部２０４を通ってハウジング２０２に入り、ミラー２１０から励起チャネルセレクター２１４の開口部２１２に反射される。セレクター２１４は、ミラー２１６と、ミラー２１６の位置を固定するミラー支持体２１８とを含み、また第２の開口部２０６内に配置されたモーター２２０を含む。セレクター２１４は、対物レンズに入って試料台１０４に配置された試料を照らすビーム２２４として開口部２２２を通って出力される１つのチャネル又はチャネルのサブセットを選択する。

図３は、励起チャネルセレクター２１４の構成要素を示すポリクロイックミラーチェンジャー２００の、図２に示すＡ−Ａ線に沿った断面図を示す。図３に示すように、セレクター２１４は、一方の端部をモーター２２０に、反対側の端部を球面ロッドエンド３０４に取り付けられたシャフト３０２を含む。球面ロッドエンド３０４は、ヨーク３０６のＵ字形の端部に収まり、クレビスピン３０８によりヨーク３０６に取り付けられる。セレクター２１４はまた、ハウジング２０２に取り付けられた第１の支持体３１２と、第１の支持体３１２に取り付けられた第２の支持体３１４との間に位置しているポリクロイックミラーアレイ３１０を含む。ポリクロイックミラーアレイ３１０は、ヨーク３０６のＵ字形端部と反対側に取り付けられる。モーター２２０は、方向矢印３１６で示すように、一定の増分距離でシャフト３０２を前後に動かすステッピングモーター又は線形アクチュエータとすることができる。結果として、ポリクロイックミラーアレイ３１０もまた、第１の支持体３１２と第２の支持体３１４との間の開口（図示せず）内で同じ距離だけ動かされる。

図４Ａは、例示的ポリクロイックミラーアレイ３１０の組立分解等角図を示す。アレイ３１０は、スチール、カーバイド又は他の好適な耐摩耗材料から構成された、平らで、均一の厚さの、長方形のプレート４０２を含む。プレート４０２は、平面の第１の面４０４と、第１の面４０４に平行であって、反対側である平面の第２の面４０６とを有する。他の実施形態では、プレート４０２は、剛体材料から構成することができ、第１の面４０４は、セラミックコーティングのように、高度に磨かれた耐摩耗材料をコーティングする又は埋め込むことができる。図４Ａの例では、プレート４０２は、４つの規則的間隔の細長い穴４０８〜４１１と、第１の面から離して示す４つの対応するポリクロイックミラー４１２〜４１５の１次元の配列を含む。ミラー４１２〜４１５の反射面は、第１の面４０４に隣接し、第１の面４０４と位置合わせされる。図４Ｂは、４つのポリクロイックミラー４１２〜４１５を第１の面４０４に取り付けられてアレイ３１０を形成するプレート４０２の等角図を示す。ポリクロイックミラー４１２〜４１５は、反射面を第１の面４０４に向けて又は同一平面にして装着される。図４Ｂに示すように、ポリクロイックミラー４１２〜４１５のそれぞれが、穴４０８〜４１１の１つを覆う。図４Ｃは、図４Ｂに示すＣ−Ｃ線に沿ったアレイ３１０の断面図を示す。ポリクロイックミラー４１３の反射面４１８の外縁は、膠又はエポキシ樹脂のような接着剤を使用して第１の面４０４に取り付けられ、穴４０９から反射面４１８の残部を露出させる。各ポリクロイックミラーは、図７及び８に関連して以下にさらに詳細に説明するように、励起チャネルセレクター２１４に入力されるビーム２０８のチャネルの異なるサブセットを反射し、透過させる。

図５は、第１の支持体３１２及び第２の支持体３１４、並びに第２の支持体３１４に取り付けられたミラー支持体２１８の側面図を示す。第１の支持体３１２は、第１の支持体３１２を図３に示すようにハウジング２０２に取り付ける２つのねじ５０２及び５０４を含む。この側面図は、第１の支持体３１２及び第２の支持体３１４には、ポリクロイックミラーアレイ３１０が中に設置される開口部５０２を形成する対面するくぼみがあることを示す。半球体５０６〜５０８は、プレート４０２と接する運動学的球（ｋｉｎｅｍａｔｉｃ ｂａｌｌ）の露出部分を表す。運動学的球５０６及び５０７は、第１の支持体３１２のソケット（図示せず）内に一部埋め込まれ、第１の面４０４と接触している。言い換えれば、運動学的球５０６及び５０７は、ポリクロイックミラーの反射面が取り付けられるプレート４０２の同じ面４０４と接している。運動学的球５０８もまた、第１の支持体３１２内に埋め込まれ、プレート４０２の縁部と接している。第１の支持体３１２は、第１の面４０４と接し、球５０６又は球５０７の後方に位置している可能性がある１つ以上の他の運動学的球（図示せず）を含む。第２の支持体３１４は、プレート４０２を押して運動学的球５０６〜５０８と接触させる、あらかじめ装着されたスライディング要素５１０〜５１２を含む。要素５１０及び５１１は、第２の面４０６と接し、要素５１２はプレート４０２の縁部と接する。アレイ３１０がｘ方向に開口部５０２の中で前後に動かされるとき、アレイ３１０は開口部５０２内で滑らかに前後にスライドするので、運動学的球は静止している。破線５１４及び５１６のような破線は、ビーム２０８を遮られずに透過できるようにする第２の支持体３１４中の開口部を特定する。例えば、破線５１４及び５１６は、図２に示す開口部２１２を特定し、ビーム２０８はこの開口部２１２を通って、開口部２１２の上に配置されたアレイ３１０と相互に作用する。ポリクロイックミラーは、ビーム２０８の選択されたチャネルを反射して、開口部５１８を通り、ミラー支持体２１８のミラー２１６から反射されて、開口部２２２を通って、ビーム２２４として対物レンズに入る。

図６は、第１の支持体３１２及び第２の支持体３１４、並びにポリクロイックミラーアレイ３１０の断面図を示す。図６に示すように、運動学的球５０６及び５０８は、第１の支持体３１２の対応する受け口６０２及び６０４に位置している。またスライディング要素５１０〜５１２は、第２の支持体３１４の開口部に挿入されたホルダー６０５〜６０７のばね荷重受け口内に設置されている。例えば、要素５１１は、ホルダー６０６の受け口に位置しており、ばね６０８によって押し出される。第１の支持体３１２に設置された各運動学的球は、第２の支持体３１４に設置された対応するスライディング要素の反対側に位置していることに注意する。スライディング要素５１０〜５１２に対してばねが及ぼす力は、面４０４を運動学的球５０６〜５０８に押しつける。例えば、ばね荷重スライディング要素５１０及び５１１は、対応するばねによって第２の面４０６に押され、第２の面４０６が同様に、第１の面４０４を運動学的球５０６及び５０７に押しつける。結果として、アレイ３１０は、運動学的球５０６〜５０８及びスライディング要素５１０〜５１２によってｙｚ面の定位置に維持され、運動学的球５０６〜５０８は、対応する受け口に静止して配置され、プレート４００はスライディング要素５１０〜５１２と運動学的球５０６〜５０８との間をスライドすることができるので、アレイ３１０は、第１の支持体３１２と第２の支持体３１４との間でしっかりと定位置に維持され、ｘ方向に開口部５０２内で前後に動かすことができる。言い換えれば、プレート４０２の第１の面４０４が運動学的球５０６〜５０８の上をスライドするとき、ポリクロイックミラーの反射面は、スライディング運動全体を通して単一平面内に維持される。結果として、プレート４０２の繰返し動作後に、ポリクロイックミラー４１２〜４１５の相互の位置合わせを維持することができる。

多くの異なる成分で構成される試料が、図１に関して上述したモジュラー撮像システムの試料台に設置されたスライドに置かれる。試料の各タイプの成分は、特定の蛍光プローブで標識付けすることができる。言い換えれば、各タイプのプローブは、試料の特定の成分に特に結合するように設計され、異なるタイプの蛍光色素分子が、特定のタイプのプローブと結合される。上述のように、ビーム２０８は、いくつかの別個の、高強度の、実質的に単色の励起チャネルから成る。試料がビーム２０８によって照らされるとき、各チャネルによってあるタイプの蛍光色素分子が、電磁スペクトルの可視部に異なるチャネルを有する光を発するようになる。結果として、試料の各成分を、異なる関連チャネル又は色で表示することができる。蛍光色素分子から発せられる光の異なる波長は、「発光チャネル」と呼ばれる。図５に示すように、アレイ３１０の特定のポリクロイックミラーをスライドさせてビーム２０８の光路に入れることによって、試料の成分の異なるサブセットを照らすことができる。言い換えれば、アレイ３１０の各ポリクロイックミラーは、開口部２１２を通して励起チャネルセレクター２１４に入力されるビーム２０８の励起チャネルの異なるサブセットを反射する。励起チャネルの特定のサブセットは、ポリクロイックミラーアレイ３１０をスライドさせることによって選択され、ポリクロイックミラーが、励起チャネルの選択されたサブセットを、ミラー支持体２１８のミラー２１６に反射するようになる。

図７は、励起光のビームの励起チャネル並びにアレイ３１０のポリクロイックミラー４１２〜４１５と関連する透過率及び反射率の例示的グラフ７０１〜７０４を示す。各グラフは、横軸７０６のような、波長を表す横軸と、縦軸７０８のような、強度を表す第１の縦軸と、縦軸７１０のような、反射率及び透過率のパーセンテージを表す第２の縦軸とを含む。グラフ７０１〜７０４では、各ピークが、特定の励起チャネルを中心とする波長の非常に狭い範囲を表す。例えば、ピーク７１２は、励起チャネル
λ³ _ex
を中心とする。曲線７１４のような実線の曲線は、反射率を表し、曲線７１６のような破線の曲線は、透過率を表す。各ポリクロイックミラーは、励起チャネルのあるサブセットを反射すると同時に、他の励起チャネルを透過させるフィルタとして作用する。例えば、グラフ７０１〜７０４は、それぞれポリクロイックミラー４１２〜４１５の反射率及び透過率を表すことができる。グラフ７０１では、ミラー４１２は、チャネル
λ¹ _ex、λ⁴ _ex及びλ⁵ _exを反射し、チャネルλ² _ex及びλ³ _exを透過させる。グラフ７０２では、ミラー４１３は、チャネルλ³ _ex、λ⁴ _ex及びλ⁵ _exを反射し、チャネルλ¹ _ex及びλ² _exを透過させる。グラフ７０３では、ミラー４１４は、チャネルλ¹ _ex、λ³ _ex及びλ⁵ _exを反射し、チャネルλ² _ex及びλ⁴ _exを透過させる。グラフ７０４では、ミラー４１５は、チャネルλ¹ _ex及びλ⁵ _exを反射し、チャネルλ² _ex、λ³ _ex及びλ⁴ _exを透過させる。

図８は、図４Ｃに示すアレイ３１０の断面図を示す。ポリクロイックミラー４１３の反射面８０２は、第１の面４０４に取り付けられ、穴４０９を通して露出される。図８に示すように、ビーム２０８は、励起チャネルλ¹ _ex、λ² _ex、λ³ _ex、λ⁴ _ex及びλ⁵ _exから成り、穴４０９を通ってミラー４１３の反射面８０２に当たる。破線の方向矢印８０４は、透過された励起チャネルを表し、実線の方向矢印８０６は、反射された励起チャネルを表す。グラフ７０２に関して上述したように、励起チャネルλ³ _ex、λ⁴ _ex及びλ⁵ _exは、穴４０９を通過するビーム８０２として面４１８から反射され、励起チャネルλ¹ _ex及びλ² _exは、ビーム８０４としてミラー４１３を透過される。

前述の内容は、説明のために、本開示を完全に理解できるように特定の名称を使用した。しかしながら、本明細書に記載するシステム及び方法を実践するために特定の詳細は必要とされないことは、当業者には明らかであろう。特定の例の前述の内容は、例示及び説明のために提示している。例は、網羅的であること又は本開示を記載した精密な形に限定することを意図していない。例えば、ポリクロイックミラーアレイは、一連の４つのポリクロイックミラーに限定されない。アレイは、線形又は一次元の配列を用いて任意の数のポリクロイックミラーで構成することができる。さらに、ポリクロイックミラーアレイは、図９に示すように、二次元アレイのポリクロイックミラーで構成することができる。図９では、アレイ９００は、反射面をプレート９０４の第１の平面９０２に取り付けた２列のポリクロイックミラーから成る。ミラーの反射面は、図４に関して上述したように、対応する穴を通して露出される。他の実施形態では、アレイは、第１の面と第２の面が平行であることに限定されない。第１の面と第２の面は、平行ではない可能性があり、プレートは、均一の厚さではないことがある。他の実施形態では、第１の面は、上述のように高度に磨かれた平面である可能性があり、第２の面は高度に磨かれた平面ではない。さらに他の実施形態では、第１の面は、プレートに接着されるとき単一の運動面に対応する同じ平面内にあるようにポリクロイックミラーを支持するために第１の面の平面に２つ以上の支持部分を残しつつ、例えば機械加工又はエッチング加工によって、開口部の周囲のプレートの領域に１つ以上のくぼみを設けることができる。

明らかに、上記の教示に照らして多くの変更形態及び変形形態が考えられる。例は、本開示の原理及び実際の応用を最も良く説明するために示して記載しており、それによって当業者が、予想される特定の利用に適合する様々な変更形態とともに本開示及び様々な例を最も良く利用できるようにする。本開示の範囲は、添付の特許請求の範囲及びその均等物によって定義されるものとする。

２０８ ビーム
２１２ 開口部
２１６ ミラー
２１８ ミラー支持体
２２２ 開口部
２２４ ビーム
３１０ ポリクロイックミラーアレイ
３１２ 支持体
３１４ 支持体
４０２ プレート
４０４ 第１の面
４０６ 第２の面
４１２ ポリクロイックミラー
５０２ 開口部、ねじ
５０４ ねじ
５０６ 運動学的球
５０７ 運動学的球
５０８ 運動学的球
５１０ スライディング要素
５１１ スライディング要素
５１２ スライディング要素
５１４ 破線
５１６ 破線
５１８ 開口部

Claims (9)

1. 第１の支持体と、
   前記第１の支持体に取り付けられ、第１の開口部及び第２の開口部を有する第２の支持体と、
   第１平面と、前記第１平面の反対側に位置する第２平面と、前記第１平面から前記第２平面まで貫通する複数の穴とを有するプレートを含むとともに、前記第１の支持体と前記第２の支持体との間の単一の運動平面内で動かせるように前記プレートに取り付けられたポリクロイックミラーの平面配列を含むポリクロイックミラーアレイであって、各ポリクロイックミラーが、前記第１の開口部を通して励起チャネルを受け取り、前記第２の開口部を通して前記励起チャネルのサブセットを反射して、対物レンズを通して試料を照らす、ポリクロイックミラーアレイと、
   を含む、顕微鏡のポリクロイックミラーチェンジャー。
2. 各ポリクロイックミラーは、前記第１平面に取り付けられており、
   前記各ポリクロイックミラーは、前記複数の穴のうちの対応する穴を通して前記励起チャネルを受け取り、前記対応する穴を通して励起チャネルのサブセットを反射するように、前記穴を覆う、請求項１記載のポリクロイックミラーチェンジャー。
3. ポリクロイックミラーの前記平面配列が一次元又は二次元である、請求項１又は２記載のポリクロイックミラーチェンジャー。
4. 前記ポリクロイックミラーアレイに接続されたモーターを含み、
   前記モーターは、ポリクロイックミラーが前記励起チャネルと交差するように、前記ポリクロイックミラーアレイを前記単一の運動平面内で移動させる、請求項１乃至請求項３のいずれか１項記載のポリクロイックミラーチェンジャー。
5. ポリクロイックミラーの前記平面配列が前記単一の運動平面内にある、請求項１乃至請求項４のいずれか１項記載のポリクロイックミラーチェンジャー。
6. 前記第１の支持体が、前記単一の運動平面を形成するように前記第１の支持体の受け口に配置された少なくとも３つの運動学的球を含み、
   前記第２の支持体が、前記プレートの第１平面を前記運動学的球に押しつける少なくとも３つのスライディング要素を含む、請求項１乃至請求項５のいずれか１項記載のポリクロイックミラーチェンジャー。
7. 各ポリクロイックミラーが、前記励起チャネルの異なるサブセットを反射する、請求項１乃至請求項６のいずれか１項記載のポリクロイックミラーチェンジャー。
8. 前記第２の支持体に取り付けられたミラーであって、前記第２の開口部を通して出力される励起光の前記サブセットを受け取り、前記第２の支持体の第３の開口部を通して前記サブセットを前記対物レンズに反射するミラーを含む、請求項１乃至請求項７のいずれか１項記載のポリクロイックミラーチェンジャー。
9. ポリクロイックミラーの前記平面配列が前記単一の運動平面内にある、請求項１乃至請求項８のいずれか１項記載のポリクロイックミラーチェンジャー。