JP6020314B2

JP6020314B2 - クロマトグラフ質量分析データ処理装置

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Publication number: JP6020314B2
Application number: JP2013078428A
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Inventors: 藤田　雄一郎; 雄一郎藤田; 梶原　茂樹; 茂樹梶原
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Filing date: 2013-04-04
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Description

本発明は、液体クロマトグラフやガスクロマトグラフ等のクロマトグラフと質量分析装置とを組み合わせたクロマトグラフ質量分析装置で得られた質量分析データを処理するクロマトグラフ質量分析データ処理装置に関する。

近年、クロマトグラフィと質量分析とを組み合わせたクロマトグラフ質量分析は、医療や医薬品、食品、環境など様々な分野において広く利用されている。クロマトグラフ質量分析で得られたデータの解析手法には種々のものがあるが、その一つとして、二つ又はそれ以上の複数のグループのデータ間の差異を調べる差異解析がある。差異解析の具体的な例としては、健常者には見られず癌患者でのみ見られる特異的なタンパク質（即ち、当該癌疾患のバイオマーカ）の発見を目的として、クロマトグラム及びマススペクトルにおいて、複数の健常者から採取した生体サンプルグループには存在せず、複数の癌患者から採取した生体サンプルグループには存在するピークを探索するような解析処理が挙げられる。

液体クロマトグラフ質量分析装置を用いて、上記差異解析を行う際の概略的な手順を述べる。
まず、被検者（健常者又は患者）から採取したサンプルに含まれる一つ又は複数のタンパク質を消化酵素によって複数のペプチドに分解し、ペプチド混合物を得る。次に、そのペプチド混合物を液体クロマトグラフに導入し、各ペプチドをそれぞれの保持時間（Retention Time）に応じて分離する。こうして保持時間に応じて分離されたペプチドが含まれる試料を質量分析装置により測定し、ペプチド由来のイオンの信号強度が反映されたデータを収集する。

図７はこうして得られる三次元クロマトグラムデータの概念図である。即ち、液体クロマトグラフ質量分析装置により収集されるデータは、或る時間、或る質量電荷比m/zにおける信号強度（イオン強度）を示すデータである。

或るペプチド由来のピークは、そのペプチドに対応する保持時間（ＲＴ）で且つそのペプチドに対応する質量電荷比m/zに現れる。即ち、或るペプチド由来のピークの出現位置は（ＲＴ，m/z）の座標、又はそれらを要素とする２次元べクトルで表される。したがって、そのペプチドが或るサンプルグループに存在するか否かを調べるには、そのペプチドに対応する（ＲＴ，m/z）にピークが存在するか否かを調べればよい。しかしながら、一般に、クロマトグラムデータの再現性（つまり時間方向の再現性）はマススペクトルデータの再現性（つまり質量電荷比方向の再現性）に比べて低いため、同じ物質由来のピークであっても、サンプルや分析条件等によって保持時間はずれてしまう。

そこで一般には、実際に複数のグループ間でのピークの差異を探索する前に、各グループ内でさらには各グループ間で、同一物質由来のマススペクトルピークが同じ保持時間の位置に来るように時間軸方向の補正が行われる。こうした補正の一つの方法が、測定時点それぞれにおけるマススペクトルの信号強度値の合計を時間軸方向にプロットして得られるトータルイオンクロマトグラム（ＴＩＣ＝Total Ion Chromatogram）を利用して補正を行う「ＴＩＣによるＲＴアライメント」である。
なお、以下の説明では、特に説明を付しない限り、「ＴＩＣによるＲＴアライメント」を単に「ＲＴアライメント」という。つまり、本明細書における「ＲＴアライメント」とは、基本的に「ＴＩＣによるＲＴアライメント」のことを指す。

液体クロマトグラフと質量分析装置とを組み合わせて使用する場合、エレクトロスプレイイオン化法（ＥＳＩ）や大気圧化学イオン化法（ＡＰＣＩ）といった大気圧イオン化法によるイオン源が利用されることが多い。一般に、こうした液体クロマトグラフ質量分析装置において得られるマススペクトルの再現性は高く、同じペプチドに対してはほぼ同じ信号強度を示すピークが得られる。そのため、ＴＩＣの波形形状の再現性も高く、同種の試料に対して得られた複数のＴＩＣの波形形状の類似性は高い。

そこで、こうしたＴＩＣの波形形状の類似性を利用し、ダイナミックプログラミング（ＤＰ）などの既知のアルゴリズムを用いたＲＴアライメントによって、「Treatment」として指定したサンプルのＴＩＣ波形が「Control」として指定したサンプルのＴＩＣ波形に極力近くなるように各クロマトグラムピークを時間軸方向に補正する。また、このとき分析者は、ダイナミックプログラミングの計算条件などのパラメータを様々に変化させ、補正後のTreatmentのＴＩＣ波形とControlのＴＩＣ波形とを目視で比較し、最も妥当な（つまり二つのＴＩＣ上のピークの位置や波形が時間的に最も近くなるような）パラメータを探索する。それによって、良好なＲＴアライメントが達成できる。

例えば非特許文献１には、相関係数を用いたダイナミックプログラミングによるＲＴアライメントが開示されている。この技術を用いて実際にＲＴアライメントを行った結果の一例を図８に示す。
図８（ａ）はControlとして指定したサンプルのＴＩＣ、図８（ｂ）はTreatmentとして指定したサンプルのＴＩＣである。そして、ＲＴアライメントを行った後の、ControlのＴＩＣと補正後のTreatmentのＴＩＣとをオーバーラップ表示させたグラフが図８（ｃ）である。また、図８（ｃ）の２５〜３５分付近の時間範囲を拡大したグラフが図８（ｄ）である。この図から、両ＴＩＣ波形のピークトップやピークボトムの位置、或いはピークの幅などがかなり良く一致していることが分かる。即ち、この場合には、ＲＴアライメントが精度良く行われているといえる。

ところが、本願発明者の検討によれば、上述したＲＴアライメントの手法は、ＥＳＩ等によるイオン源を用いた液体クロマトグラフ質量分析装置により取得された三次元クロマトグラムデータには適しているものの、マトリクス支援レーザ脱離イオン化（ＭＡＬＤＩ）法によるイオン源を用いた液体クロマトグラフ質量分析装置により取得された三次元クロマトグラムデータには適さないことが判明した。その理由は次のように推測される。

即ち、上述したダイナミックプログラミングなどによるＲＴアライメントは、アライメント対象である複数の（例えばControlとTreatmentとの）ＴＩＣの波形形状の類似性が或る程度高いことを前提とし、複数のＴＩＣの波形形状の一致性が低い箇所付近のピークの保持時間をずらすなどして類似性を高める処理を行うものである。しかしながら、ＭＡＬＤＩイオン源では、１回のレーザパルスの照射に対するイオン生成量のばらつきが大きく、また質量電荷比毎のイオン生成効率の再現性もあまり良好でない。そのため、ＭＡＬＤＩ質量分析装置により得られたマススペクトルでは各ピークの信号強度の再現性が低く、マススペクトル毎に全ての信号強度値を加算することで得られる、或る測定時点における全信号強度値の再現性も低い。その結果、異なるサンプル間でのＴＩＣ波形形状の類似性も乏しくなる。このように類似性が乏しいＴＩＣ同士では、たとえダイナミックプログラミングを実行することができたとしても保持時間を適切に補正することができない。

また、前述のように、ＲＴアライメントが成功したか否かは、図８（ｃ）、（ｄ）に示したようなＴＩＣのオーバーラップ表示を分析者が目視で確認して判断する。そのためには、保持時間を補正する前の段階で二つのＴＩＣ波形形状の類似性が或る程度高くなければならないが、上述したようにＭＡＬＤＩイオン源を用いた場合には、異なるサンプル間でのＴＩＣ波形形状の類似性が乏しい。そのため、オーバーラップ表示を行っても、ＲＴアライメントが正しく実行できたか否かの判断を分析者が目視で行うことは困難である。また、それ故に、ダイナミックプログラミングのためのパラメータの最適な調整も困難である。

青島健、田中聡、他７名、「疾病の診断、創薬研究に向けた３次元アライメントによるマーカー探索手法(AB3D)」、第５６回質量分析総合討論会講演要旨集、2008年、pp.520-521

本発明はこうした点に鑑みて成されたものであり、その主な目的は、例えばＭＡＬＤＩイオン源を用いた液体クロマトグラフ質量分析装置などで収集されたデータに基づいて作成されるＴＩＣでの保持時間の補正を的確に精度良く行うことができるクロマトグラフ質量分析データ処理装置を提供することである。

上記課題を解決するために成された本発明は、クロマトグラフ質量分析装置により収集されたデータを処理するデータ処理装置であって、複数の試料に対してそれぞれ得られたデータから求まる複数のクロマトグラムの保持時間のずれを補正するためのアライメント処理を行うデータ処理装置において、
a)全測定時間範囲内又は一部の測定時間範囲内の各測定時点毎に、当該測定時点に得られたデータに基づいて作成されるマススペクトルの信号強度をスケーリングするマススペクトルスケーリング処理部と、
b)前記マススペクトル毎に、前記マススペクトルスケーリング処理部によりスケーリングされた後の信号強度値を加算した全信号強度値を計算する全信号強度値算出部と、
c)複数の試料のそれぞれについて、前記全信号強度値算出部により算出された複数の全信号強度値からトータルイオンクロマトグラム（ＴＩＣ）を作成するクロマトグラム作成部と、
d)前記クロマトグラム作成部により作成された複数のクロマトグラムを用いてアライメント処理を実行するアライメント実行部と、
を備えることを特徴としている。

スペクトル解析等のデータ処理において、ピーク等のスケーリングは一般的に用いられる技術の一つではあるが、それは専ら、ピーク同士を比較するためにその前処理として行われたり、波形全体の傾向を比較するために行われたりする。それに対し、本発明に係るクロマトグラフ質量分析データ処理装置では、比較される複数の波形、具体的にはＴＩＣ波形に対しスケーリングを適用するのではなく、そうした波形を構成する各データ点を求めるための元の多数のデータ点で構成される波形、具体的にはマススペクトルに対してスケーリングを適用する。そして、一つのマススペクトルにおいてスケーリングによって値が修正された多数の信号強度値を加算することで、該マススペクトルに対応する一つの全信号強度値を算出する。

上述したように、例えばＭＡＬＤＩイオン源を用いた質量分析装置では、マススペクトルに現れるピーク信号強度の再現性が良好でなく、たとえ同一物質であっても、異なるマススペクトル上のピークの信号強度に比較的大きな差異が生じる。一つのマススペクトルに現れる信号強度値を加算して得られる全信号強度値は、マススペクトル上に現れる信号強度値が大きなピークの影響を受け易く、複数のサンプル間でのそうしたピークの信号強度値の極端な差異はＴＩＣの類似性を下げる大きな要因となる。一方で、そうした信号強度値の差異や変動もマススペクトルの特性であるといえるから、差異や変動を反映したスケーリングも必要である。

そこで、本発明に係るクロマトグラフ質量分析データ処理装置の一態様として、上記マススペクトルスケーリング処理部は、一つのマススペクトル内での信号強度値のばらつき（変動）の程度を、異なるマススペクトル間で等しくする又は少なくとも縮小させる第１のスケーリングと、マススペクトル毎の信号強度値の相対的なばらつきに応じた重み付けを行う第２のスケーリングと、を組み合わせた可変スケーリングを行う構成とすることができる。

上記第１のスケーリングは例えば、そのマススペクトル中の任意のピーク又は任意のデータ点の信号強度値を、該マススペクトル中のピーク（通常は複数のピーク）の信号強度値又は任意のデータ点の標準偏差で除する処理とすることができる。これは、複数のマススペクトル間での信号強度値のばらつきの程度を揃えることを意味する。また、上記第２のスケーリングは例えば、そのマススペクトル中の任意のピーク又は任意のデータ点の信号強度値を、そのマススペクトル中のピーク又は任意のデータ点の信号強度値から求まる変動係数（＝標準偏差／平均値）で除する、換言すれば変動係数の逆数を重みとして乗じる処理とすることができる。これは、一つのマススペクトルにおける信号強度値のばらつきに関するマススペクトル間の相対的な差異を反映させることを意味する。
また本発明に係るクロマトグラフ質量分析データ処理装置の別の態様として、上記マススペクトルスケーリング処理部は、一つのマススペクトル中のピークの信号強度の対数をとるスケーリングを行う構成としてもよい。

本発明に係るクロマトグラフ質量分析データ処理装置において、クロマトグラム作成部は、それぞれスケーリングされた信号強度値に基づいて算出された、それぞれ異なる測定時点に対する複数の全信号強度値から、所定の時間範囲のクロマトグラム、つまりＴＩＣを作成する。このＴＩＣは、差分解析等の対象である試料毎に作成される。そして、アライメント実行部は、上記クロマトグラム作成部により作成された複数のＴＩＣを用いてアライメント処理を実行し、同一物質に由来するクロマトグラムピークがほぼ同じ時間に現れるように保持時間のずれを補正する。なお、このときのアライメント処理の手法は特に限定されず、ダイナミックプログラミングなど、従来から用いられている種々の手法を用いることができる。

マススペクトルに対する上述したような特徴的なスケーリングによって、マススペクトル上で特に大きな信号強度を示すピークが全信号強度値に与える影響が小さくなり、それによってマススペクトルにおけるピーク強度の再現性の低さがＴＩＣに反映されにくくなる。その結果、アライメント処理の実行対象である複数の試料におけるＴＩＣの波形形状の類似性が高くなり、アライメント処理を適切に実行することができ、同一物質に対するピークの保持時間を揃えることが可能となる。また、アライメント処理の実行対象である複数の試料におけるＴＩＣ波形形状の類似性が高くなるために、分析者が目視でこの波形を確認しアライメント処理が正しく実行できたか否かを判断することも容易になる。さらに、ダイナミックプログラミングなどのアライメント処理を行うためのパラメータ調整も、分析者が目視でＴＩＣ波形を確認しながら容易に且つ的確に行うことが可能となる。

本発明に係るクロマトグラフ質量分析データ処理装置によれば、ＭＡＬＤＩイオン源を用いた液体クロマトグラフ質量分析装置で取得されたマススペクトルのように、ピーク強度の再現性が低い場合であっても、複数の試料についてそれぞれ互いに波形形状の類似性が高いＴＩＣを作成し、このＴＩＣを用いて同一物質由来のクロマトグラムピークが同一時間に出現するように適切なアライメント処理を行うことができる。また、複数の試料に対するＴＩＣの波形形状の類似性が高まるために、分析者の目視によるアライメント処理の成否の判断が可能になるとともに、アライメント処理のためのパラメータ調整も可能になり、その点でもＲＴアライメントの精度向上を図ることができる。そして、このようにＲＴアライメントの精度が向上することで、例えば複数の試料に対する差分解析の精度を向上させることができる。

本発明に係るクロマトグラフ質量分析データ処理装置を備えた液体クロマトグラフ質量分析システムの一実施例の概略構成図。本実施例の液体クロマトグラフ質量分析システムにおけるデータ処理部で実行されるＲＴアライメント処理の処理手順を示すフローチャート。マススペクトルに対するスケーリングを実施しないときの個々のＴＩＣ波形とそれをオーバーラップさせたグラフの一例を示す図。マススペクトルに対するスケーリングを実施したときの個々のＴＩＣ波形とそれをオーバーラップさせたグラフの一例を示す図。複数種類のタンパク質の混合物である試料に対する同定処理及び差異解析の結果の一例を示す図。本発明によるＲＴアライメント処理の効果を説明するための模式図。液体クロマトグラフ質量分析装置で得られる三次元クロマトグラムデータ及びＴＩＣの概念図。ＥＳＩイオン源を用いた液体クロマトグラフ質量分析装置で得られたデータに対するＲＴアライメント実行結果の一例を示す図。

以下、本発明に係るデータ処理装置を含む液体クロマトグラフ質量分析システムの一実施例について、添付図面を参照して説明する。
図１は本実施例の液体クロマトグラフ質量分析システムの概略構成図である。

図１において、液体クロマトグラフ部１は、図示しないものの、一定流量で流れる移動相中に試料溶液を導入するインジェクタと、試料に含まれる各種物質を時間方向に分離するカラムとを含み、そのカラムの出口から溶出する溶出液中には時間経過に伴って各種物質が順次現れる。スポッティング部２はこの溶出液を所定の時間間隔で以て分画し、分画した溶出液とマトリクスとを混合してＭＡＬＤＩ用のサンプルプレート上に滴下し、それぞれ分画試料を調製する。即ち、異なる分画試料は異なる時点でカラムから溶出した溶出液中の物質を含む。

質量分析部３は、ＭＡＬＤＩイオン源３１と、飛行時間（ＴＯＦ）型質量分離部３２と、検出器３３とを含む。ＭＡＬＤＩイオン源３１はサンプルプレート上の一つの分画試料に対しレーザ光を照射することで、該分画試料に含まれる物質をイオン化する。生成されたイオンはＴＯＦ型質量分離部３２に導入され、所定長さの飛行空間を飛行する間に質量電荷比に応じてイオンを分離する。検出器３３は質量電荷比に応じて分離された状態で到達するイオンを検出し、到達したイオンの量に応じた検出信号を出力する。検出器３３で得られた検出信号はアナログデジタル変換器（ＡＤＣ）４においてデジタルデータに変換され、データ処理部５に入力される。ＭＡＬＤＩイオン源３１においてサンプルプレートの位置は走査され、それにより、該プレート上に形成された多数の分画試料に対する質量分析が順次実行される。

データ処理部５は、三次元データ格納部５１、マススペクトルスケーリング計算部５２、全信号強度値計算部５３、修正ＴＩＣ作成部５４、ＲＴアライメント実行部５５、差異解析部５６などの機能ブロックを含む。上述したようにアナログデジタル変換器４を経てデータ処理部５に入力されるデータは、或る時点（例えばＭＡＬＤＩイオン源３１において分画試料にレーザ光が照射される時点）を基準とした飛行時間と信号強度（イオン強度）との関係を示す飛行時間スペクトルデータである。データ処理部５には、飛行時間と質量電荷比m/zとの関係を示す較正データが記憶されており、この較正データに基づいて、飛行時間は質量電荷比に換算され、質量電荷比と信号強度との関係を示すマススペクトルデータとして三次元データ格納部５１に格納される。

なお、データ処理部５の機能は、専用のハードウエアを用いて実現することも可能であるが、汎用のパーソナルコンピュータをハードウエア資源とし、該パーソナルコンピュータにインストールされた専用の処理ソフトウエアを実行することにより実現するのが一般的である。

本実施例の液体クロマトグラフ質量分析システムにおいては、液体クロマトグラフ部１から連続的に溶出する溶出液が所定時間毎に分画されてそれぞれ異なる分画試料となり、その分画試料毎に所定の質量電荷比範囲に亘るマススペクトルデータが得られる。したがって、一つの分画試料に対する一つのマススペクトルをその分画試料が得られた時系列の順序で並べてゆくと、図７に示したような三次元クロマトグラムデータが得られる。複数の試料に対する差異解析を行う場合には、試料毎にそれぞれ上述したようなクロマトグラフ質量分析を実行し、図７に示したような三次元クロマトグラムデータをそれぞれ取得する。

いま、ここでは、差異解析の対象である試料Ａ、試料Ｂという二つの試料についてそれぞれ三次元クロマトグラムデータが既に取得され、三次元データ格納部５１に格納されているものとする。データ処理部５では、これらデータに対して図２に示すフローチャートに従ってＲＴアライメント処理を実行することで同一物質に対するクロマトグラムピークの保持時間を揃え、その後に差異解析を実行する。

まずマススペクトルスケーリング計算部５２は処理対象の試料（例えば試料Ａ）を選択し（ステップＳ１）、三次元データ格納部５１に格納されているその試料に対する三次元クロマトグラムデータの中から、所定の測定時点における所定質量電荷比範囲に亘るマススペクトルデータを読み出す（ステップＳ２）。

次に、マススペクトルスケーリング計算部５２は、読み出されたマススペクトルデータにより得られるマススペクトル上で検出される各ピークの信号強度値（又は該マススペクトル上の各質量電荷比における信号強度値）に対し可変スケーリングを行い、その信号強度値を修正する（ステップＳ３）。全信号強度値計算部５３は一つのマススペクトルにおいて可変スケーリングによって修正された各ピークの信号強度値を加算することで、その一つの測定時点における全信号強度値を計算する（ステップＳ４）。

具体的に、この実施例では、次の(1)式に示す計算式に従って、可変スケーリング（上記ステップＳ３の処理）及び全信号強度値の計算（上記ステップＳ４の処理）を行う。
ＴＩＣ_RT=t＝Σ（Ｉｎｔ_i／Ｓ_RT=t）・（<Ｉｎｔ_RT=t>／Ｓ_RT=t） …(1)
ここで、Σはｉ＝１からＮまでの総和であり、ＴＩＣ_RT=tはＲＴ＝ｔにおける（測定時点がｔであるときの）全信号強度値（スケーリングによる修正値）、ＮはＲＴ＝ｔにおけるマススペクトル中のピークの数（又は全データの数）、ｉはＲＴ＝ｔにおけるマススペクトル中で付された連続的なピーク番号、Ｉｎｔ_iはｉ番目のピーク（又はデータ点）の信号強度値、Ｓ_RT=tはＲＴ＝ｔにおけるマススペクトルの各ピーク（又は各データ点）の信号強度値から求めた標準偏差、<Ｉｎｔ_RT=t>はＲＴ＝ｔにおけるマススペクトルの各ピーク（又はデータ点）の信号強度値の平均値、である。
上記(1)式の技術的な意味を説明する。

上述したように、ＭＡＬＤＩイオン源を用いた質量分析装置で得られるマススペクトルではピーク強度の再現性が低く、異なる試料の間でも、また同一試料に対する異なる測定時点の間でも、同一質量電荷比におけるピークの信号強度値の差異（変動）が大きい。ＴＩＣにはマススペクトル中で信号強度が大きなピークの影響が現れ易い。つまり、マススペクトル中に他のピークと比べて信号強度が極端に大きなピークが存在すると、信号強度が小さい他のピークの影響を覆い隠してしまう。そのため、こうした信号強度が相対的に大きなピークの信号強度の変動や差異が大きければ、サンプル間のＴＩＣ波形の類似性は低くなる。そこで、ピーク強度の再現性の低さを補ったＴＩＣを求めるには、マススペクトルの中で信号強度が大きなピークの影響を抑えるようなスケーリングを行う必要がある。一方、ピーク強度の差異や変動の大きさもそのマススペクトルの特性であることは確かであるから、マススペクトル間の特性の相違を出すには、マススペクトル毎のピーク強度の変動や差異の大きさに応じたスケーリングを行うことも必要である。

上記(1)式の右辺の総和（シグマ）内の第１項、（Ｉｎｔ_i／Ｓ_RT=t）は、各マススペクトル（ＲＴ＝ｔにおけるマススペクトル）において、ｉ番目のピークの信号強度値を、そのマススペクトルにおけるピーク強度の標準偏差で除す処理である。この項によって、各マススペクトルにおけるピーク強度のばらつき（つまりは標準偏差）がすべて等しく「１」になる。即ち、この第１のスケーリングによって、複数のマススペクトル間の差異や変動は等しくなる。一方、上記(1)式の右辺の総和内の第２項、（<Ｉｎｔ_RT=t>／Ｓ_RT=t）は、各マススペクトルにおけるピーク強度の平均値を標準偏差で除したものであり、これはＲＴ＝ｔにおけるマススペクトルに存在するピーク強度のばらつきによって上記第１項による結果を重み付けする第２のスケーリングである。なお、この第２項は、ＲＴ＝ｔにおけるマススペクトル中のピーク強度の変動係数の逆数を乗じる（変動係数で除する）処理である。

即ち、上記(1)式の右辺の総和内の演算は、各マススペクトル中のピーク強度のばらつき（変動や差異）の程度がマススペクトル間で一旦等しくなるようにスケーリングしたのち、さらに各マススペクトルにおけるピーク強度の平均値に対するピーク強度のばらつきの大きさに応じて再度スケーリングを行う、という二段階のスケーリングである。このような二段階のスケーリングによって、マススペクトル中で信号強度が大きなピークの影響を抑えつつも、スケーリング前に各マススペクトルが有する特性、つまりは本質的なピークの変動や差異は維持される。

上記(1)式の右辺の総和演算は、一つのマススペクトルの中でスケーリングされた各ピークの信号強度値を加算する処理であるから、マススペクトル中で検出される各ピークの信号強度値に対し(1)式の演算を行うことで、スケーリングされたマススペクトルに基づく全信号強度値が求まる。或る一つの測定時点におけるマススペクトルに対する一つの全信号強度値が求まると、全ての測定時点での処理が終了したか否かが判定され（ステップＳ５）、未処理の測定時点が残っている（ステップＳ５でＮｏである）場合には、ステップＳ２に戻り、未処理である一つの測定時点における所定質量電荷比範囲に亘るマススペクトルデータを読み出して、ステップＳ３〜Ｓ５の処理を繰り返す。

ステップＳ２〜Ｓ５の処理を繰り返すことで、或る一つの試料（例えば試料Ａ）に対する全測定時間範囲に亘る全信号強度値が得られると、ステップＳ５でＹｅｓと判定され、修正ＴＩＣ作成部５４が得られた全信号強度値を用いてＴＩＣを作成する（ステップＳ６）。特に明記しないが、これは通常のＴＩＣではなく、スケーリングされたマススペクトルに基づいて作成されるＴＩＣである。

次に、処理対象である全ての試料のＴＩＣを作成したか否かが判定され（ステップＳ７）、未処理の試料が残っている（ステップＳ７でＮｏである）場合には、ステップＳ１に戻り、未処理である試料に対しステップＳ２〜Ｓ７の処理を繰り返す。したがって、試料Ａに対するＴＩＣが作成されたあとに、引き続き、試料Ｂに対するＴＩＣが作成される。処理対象である全ての試料のＴＩＣが得られると、ステップＳ７からＳ８へと進み、ＲＴアライメント実行部５５は、得られたＴＩＣを用いてＲＴアライメント処理を実行する。

各試料のＴＩＣは上述したようなスケーリングが行われたマススペクトルに基づいて作成されたものであるため、同種の物質を含む異なる試料のＴＩＣの波形形状の類似度は高くなっている。そのため、例えばダイナミックプログラミングを用いたＲＴアライメントを実行したときに、アライメントが適切に行われ、同一物質に対するクロマトグラムピークの保持時間はほぼ揃うようになる。また、共通に含まれる物質が多い試料同士であれば、ＴＩＣ波形形状は類似しているので、分析者がＴＩＣ波形をモニタ（図１中には図示せず）の表示画面上で確認しながらＲＴアライメントが成功したか否かを容易に且つ的確に判断することが可能になり、さらにＲＴアライメント処理のパラメータの調整も可能になる。

以上のようにして二つの試料のＴＩＣを用いたＲＴアライメントが終了したならば、差異解析部５６は保持時間の補正を反映したデータに基づいた差異解析を実行し、例えば両方の試料に共通に存在するピークと、いずれか一方の試料にのみ存在するピークとを識別し、解析結果を出力する。

また、上記説明では二つの試料のＴＩＣを用いたＲＴアライメント処理について述べたが、三以上の複数の試料のＴＩＣを用いたＲＴアライメント処理でもよいことは明らかである。

また上記実施例の液体クロマトグラフ質量分析システムでは、(1)式に基づきマススペクトルに対し可変スケーリングを行っていたが、別の手法による可変スケーリングを用いることもできる。
具体的には、次の(2)式で示すようなlogスケーリングを用いることができる。
ＴＩＣ_RT=t＝ΣlogＩｎｔ_i …(2)
ここで、Σ、ＴＩＣ_RT=t 、Ｉｎｔ_iの定義は(1)式と同じである。即ち、この式では、マススペクトル上の各ピーク信号強度値の対数を求め、保持時間毎に再計算した全信号強度値を用いてＲＴアライメントを行うことになる。このようなlogスケーリングは、ピークの大小関係を維持し（つまり、どの保持時間のマススペクトルに信号強度が大きなピークがあるかがＴＩＣに反映される）つつ信号強度が大きなピークの影響を相対的に抑えるスケーリングであり、それによって、マススペクトル中に他のピークと比べて信号強度が極端に大きなピークが存在した場合でも、該ピークによって信号強度が小さい他のピークの影響が覆い隠されることを回避することができる。

次に、上述した本発明に特徴的なスケーリング（ここでは(1)式に基づくスケーリング）を含むＲＴアライメント処理の効果を確認するための実験結果と、差異解析の結果とを併せて説明する。ここで実験に用いた試料は次の二つのグループである。
（１）「４種混合タンパク質」グループ：４種類のタンパク質、即ち、エノラーゼ（Enolase）、アルコールデヒドロゲナーゼ（Alcohol Dehydrogenase）、フォスフォリラーゼｂ（Phosphorylase b）、及びウシヘモグロビン（Bovine Hemoglobin）、を混合し、それらタンパク質を消化酵素によってペプチドに分解した試料である。
（２）「４種混合タンパク質＋BSA」グループ：上記「４種混合タンパク質」グループで用いた４種類のタンパク質に、さらに別のタンパク質「ウシ血清アルブミン（Bovine Serum Albumin）」を加え、それらタンパク質を消化酵素によってペプチドに分解した試料である。なお、以下の説明では、ウシ血清アルブミンをBSAと略す。
これら二つのグループ間の差異解析を行い、「４種混合タンパク質」グループには存在せず「４種混合タンパク質＋BSA」グループに存在するピークがBSA又はそれ由来のペプチドのピークであると同定されれば、ＲＴアライメントが適切であって差異解析が正確に行われたと結論付けることができる。

図３（ａ）、（ｂ）は二つの試料に対するスケーリング無しのＴＩＣ、図３（ｃ）はそれらＴＩＣを用いてＲＴアライメントを実行した後の両ＴＩＣをオーバーラップ表示したグラフである。ここで使用した試料は「４種混合タンパク質＋BSA」グループに属する二つの試料であり、便宜上、一方を「Control」、他方を「Treatment」とみなした。ＲＴアライメントを実行する前の時点で、ControlのＴＩＣとTreatmentのＴＩＣとの波形形状の類似性が低いため、ＲＴアライメントを行ってもピークトップやピークボトム、ピーク幅などが一致せず、ＲＴアライメントが成功したか否かの判断は難しい。なお、このときのＲＴアライメントのパラメータは後述の図４におけるＲＴアライメントのパラメータと同じである。

図４（ａ）、（ｂ）は図３と同じ試料から得られたデータに上述した特徴的なスケーリングを適用した後に計算によって得られたＴＩＣ、図４（ｃ）はそれらＴＩＣを用いてＲＴアライメントを実行した後の両ＴＩＣをオーバーラップ表示したグラフである。図４（ａ）、（ｂ）を見れば（特に図３（ａ）、（ｂ）と比較すれば）分かるように、ＲＴアライメントを実行する前の時点で、ControlのＴＩＣとTreatmentのＴＩＣの波形形状の類似性がかなり高くなっている。また、ＲＴアライメントを行った後に、ピークトップやピークボトム、ピーク幅などがよく一致しているので、ＲＴアライメントが成功していると判断することができる。なお、この図４（ｃ）は、ＲＴアライメントのパラメータを調整し、ＲＴアライメントが最も成功していると分析者が目視で判断したときの結果である。

以上の実験結果から、本発明に係るクロマトグラフ質量分析データ処理装置によれば、マススペクトル中に観測されるピーク強度の再現性が低い場合であっても、ＴＩＣ波形からＲＴアライメントが成功したか否かの判断が可能になり、ＲＴアライメントの際のパラメータ調整も可能であることが確認できる。

図５は、図３、図４で行ったＲＴアライメント処理を他の試料にも適用し、同定処理や差異解析を行った結果を示す図である。この実験では、「４種混合タンパク質」グループに属する試料を５個、「４種混合タンパク質＋BSA」グループに属する試料を４個用いた。図５（ａ）はＲＴアライメントを全く行わずに同定処理及び差異解析を行った結果であり、図５（ｂ）はスケーリング無しでＲＴアライメントを実行した場合（つまりは従来の一般的なＲＴアライメントを実行した場合）の結果であり、図５（ｃ）は本発明を適用した場合（つまりは上述した特徴的なスケーリングを実施した後にＲＴアライメントを実行した場合）の結果である。

図５において、「RANK」及び「Score」は、タンパク質同定に頻用される米国マトリクスサイエンス社製のマスコット（Mascot）を用いたデータベース検索における検索結果で提示されるものである。この検索結果において、ENO1(2)_YEASTはエノラーゼに、ADH1_YEASTはアルコールデヒドロゲナーゼに、PYGM_RABITはフォスフォリラーゼｂに、HBA_BISBO/HBB_BOVINはウシヘモグロビン（試料に含まれるタンパク質はウシヘモグロビンであるが、「HBA_BISBO又はHBB_BOVINである」と同定された。両タンパク質を構成するペプチドが非常に似ており、区別できなかったことを意味する）に、ALBU_BOVIN（＝BSA）はウシ血清アルブミンに相当する。また、「同定されたピーク数」、及び「同定されたピーク数のうち、ｕ検定の結果ｐ＜０．０５であるピークの数」とは、それぞれ全ての試料（ここでは９個の試料）に対するマススペクトル上で「そのタンパク質由来のペプチドのピークである」と同定されたピークの数であり、それらにおいて（）内の数値は重複ピークを除いたピーク数である。ここでいう「重複ピーク」とは以下のような意味を持つ。

異なる試料から得られたＴＩＣについてＲＴアライメントを行わないと、同じ物質（ここではペプチド）由来のクロマトグラムピークであっても、試料毎に異なる時間にピークが観測されることが多い。図６（ａ）はその一例であり、質量電荷比m/zがβである同じ物質由来のピークが試料ＡではＲＴ＝α₁に、別の試料ＢではＲＴ＝α₂に、さらに別の試料ＣではＲＴ＝α₃にピークトップを持つ。このような場合、本来は同一ピークであるにも拘わらず、複数のピークとして誤って検出されることになる。そこで、このように本来は一つであるピークであるものの、複数のピークであるとして捉えられるピークを、ここでは「重複ピーク」と呼んでいる。図６（ａ）では、本来のピークは１個であるから、重複ピークが２個存在することになる。

これに対し、ＲＴアライメントが適切に行われれば、同じ物質由来のピークはいずれの試料のＴＩＣにおいても同じ時間に現れるように補正される。即ち、図６（ｂ）に示すように、同じ物質由来のピークのピークトップがいずれもＲＴ＝αに現れる。この場合には、重複ピークは存在しないことになる。このように、ＲＴアライメントが適切に行われた場合には、重複ピークが減少する又は無くなることが期待される。換言すれば、重複ピークの減少又は消滅が確認できれば、それはＲＴアライメントが適切に行われたことを意味する。

なお、厳密には、重複ピークがない状態とは、複数の試料間で同じ物質由来のピークのピークトップの時間が完全に重なっている（つまり図６（ｂ）でいえば全てのピークのピークトップの出現時間がαである）状態であるが、実際には、様々な誤差要因やばらつきによって、こうした状態を達成するのは困難である。そこで、ピークトップの出現時間について予め適度な許容範囲を定めておき、その許容範囲内に収まった場合には、重複ピークではないと判断するとよい。

また、ここでは、「４種混合タンパク質」グループに存在せず「４種混合タンパク質＋BSA」には存在するピークがあるか否かは、統計量であるｐ値で以て判断する。具体的には、そのピークの位置（ＲＴ，m/z)におけるピークの面積値（又は信号強度値等)をグループ間で比較した場合、ｐ値＜０．０５以下であるならば、グループ間に差異がある可能性が高いものと判断する。

この実験における差異解析の目的は、バイオマーカであるペプチドを特定する又はその候補を絞ることであるため、差異であると誤判定される又は本来の差異との区別がつかないペプチド由来のピークについての重複ピーク、の数は少ないほど好ましく、理想的には重複ピークはゼロであるとよい。もちろん、何らかの手法を用いて重複ピークの数を減らすことができたとしても、それによって、同定されるペプチドの数（つまり全同定ピーク数から重複ピークを除いたピーク数）が大きく減少しては意味がない。即ち、好ましいのは、全同定ピーク数から重複ピークを除いたピーク数をできるだけ減らすことなく、重複ピークの数を減らす又はゼロにすることである。また、共通のペプチド由来のピークであるにも拘わらず、両グループ間で「差がある」と誤判定されてしまうピーク数は少ないほど好ましく、理想的にはゼロであるとよい。

これらをまとめると、ＲＴアライメントが成功しているのであれば、図５に示した同定処理及び差異解析結果は次のようになることが期待される。
（Ａ）全てのタンパク質について重複ピーク数が減少する。つまり、「同定されたピーク数」の欄における括弧（）外のピーク数と括弧（）内のピーク数とが近くなる。
（Ｂ）「４種混合タンパク質＋BSA」グループのみに含まれるALBU_BOVIN（＝BSA）について、「同定されたピークの中でｕ検定の結果ｐ＜０．０５であるピークの数」の欄における重複ピーク数（括弧（）外のピーク数と括弧（）内のピーク数との差）が減少する。
（Ｃ）ALBU_BOVIN（＝BSA）について、「同定されたピーク数」と「同定されたピークの中でｕ検定の結果ｐ＜０．０５であるピークの数」とが近くなる又は等しくなる。即ち、同定されたピークの殆ど又は全部が、グループ間で「差がある」と判定される。
（Ｄ）ALBU_BOVIN（＝BSA）について、図５（ｃ）において同定されたペプチド数が図５（ａ）及び（ｂ）に比べて大きく減少しない。
（Ｅ）両グループに共通に存在するタンパク質（４種類）について、「同定されたピークの中でｕ検定の結果ｐ＜０．０５であるピークの数」が減少する。即ち、共通に存在するタンパク質が一方のみに存在すると誤判定されることが減る。

上記のような観点から、図５の結果をみると次のようにいえる。
いま、図５（ｂ）中の「同定されたピーク数」の欄をみると、「ALBU_BOVIN」（＝BSA）であると同定された全ピーク数は３２であるが、上述したような予め定めた許容範囲内で重複しているピークを除くとピーク数は２１である。これは、かなり多くの重複ピークが存在している、つまりは同一ペプチド由来のクロマトグラムピークが異なる保持時間の位置に出現していることを示している。また、図５（ａ）と（ｂ）とを比較するとそれほど大きな差はみられない。つまり、スケーリング無しのＲＴアライメントとＲＴアライメント無しとで結果の大きな違いは見られず、差異解析を行う上で、スケーリング無しのＲＴアライメントはあまり有効ではないと結論付けることができる。

これに対し、図５（ａ）と（ｃ）とを比較すると、５種類のタンパク質のいずれにおいても重複ピークの顕著な減少がみられる。つまり上記（Ａ）が実現されている。また、ALBU_BOVIN（＝BSA）由来の「同定されたピークの中でｕ検定の結果ｐ＜０．０５であるピークの数」における重複ピークの数は「１１」から「１」に激減しており、上記（Ｂ）も実現されている。また、ALBU_BOVIN（＝BSA）由来の「同定されたピーク数」と「同定されたピークの中でｕ検定の結果ｐ＜０．０５であるピークの数」とは等しく、（Ｃ）も実現されている。さらに、図５（ａ）では「6(4)」と比較的大きかったタンパク質「PYGM_RABIT」由来の「同定されたピークの中でｕ検定の結果ｐ＜０．０５であるピークの数」が、図５（ｃ）では「2(1)」と顕著に減少している。つまり上記（Ｅ）も実現されている。さらに、重複ピークを除くALBU_BOVIN（＝BSA）由来の「同定されたピーク数」は殆ど変化がなく、このピーク数はペプチド数に対応すると考えられるから、上記（Ｄ）も実現されている。

以上より、この実験例では、ＲＴアライメントが正しく実行できていると結論付けることができ、本発明における特徴的なスケーリングを含むＲＴアライメント処理の優位性が確認できる。
ここでは、タンパク質の混合物を試料としたが、上述したように、本発明に特有のＲＴアライメント処理はタンパク質やペプチドの特性や特異性を利用したものではないので、適用対象はタンパク質やペプチドに限るものではなく、任意の種類に試料に利用することができることは明らかである。

また、上記実施例は本発明の一例にすぎず、本発明の趣旨の範囲で適宜変形、修正、追加等を行っても本願特許請求の範囲に包含されることは当然である。

１…液体クロマトグラフ部
２…スポッティング部
３…質量分析部
３１…ＭＡＬＤＩイオン源
３２…ＴＯＦ型質量分離部
３３…検出器
４…アナログデジタル変換器
５…データ処理部
５１…三次元データ格納部
５２…マススペクトルスケーリング計算部
５３…全信号強度値計算部
５４…修正ＴＩＣ作成部
５５…ＲＴアライメント実行部
５６…差異解析部

Claims

クロマトグラフ質量分析装置により収集されたデータを処理するデータ処理装置であって、複数の試料に対してそれぞれ得られたデータから求まる複数のクロマトグラムの保持時間のずれを補正するためのアライメント処理を行うデータ処理装置において、
a)全測定時間範囲内又は一部の測定時間範囲内の各測定時点毎に、当該測定時点に得られたデータに基づいて作成されるマススペクトルの信号強度をスケーリングするマススペクトルスケーリング処理部と、
b)前記マススペクトル毎に、前記マススペクトルスケーリング処理部によりスケーリングされた後の信号強度値を加算した全信号強度値を計算する全信号強度値算出部と、
c)複数の試料のそれぞれについて、前記全信号強度値算出部により算出された複数の全信号強度値からトータルイオンクロマトグラムを作成するクロマトグラム作成部と、
d)前記クロマトグラム作成部により作成された複数のクロマトグラムを用いてアライメント処理を実行するアライメント実行部と、
を備えることを特徴とするクロマトグラフ質量分析データ処理装置。
請求項１に記載のクロマトグラフ質量分析データ処理装置であって、
前記マススペクトルスケーリング処理部は、一つのマススペクトル内での信号強度値のばらつきの程度を、異なるマススペクトル間で等しくする又は少なくとも縮小させる第１のスケーリングと、マススペクトル毎の信号強度値の相対的なばらつきに応じた重み付けを行う第２のスケーリングと、を組み合わせた可変スケーリングを行うことを特徴とするクロマトグラフ質量分析データ処理装置。
請求項２に記載のクロマトグラフ質量分析データ処理装置であって、
第１のスケーリングは、当該マススペクトル中のピークの信号強度の標準偏差で除する処理であり、第２のスケーリングは、当該マススペクトル中のピークの信号強度の平均値を前記標準偏差で除した値を乗じる処理であることを特徴とするクロマトグラフ質量分析データ処理装置。
請求項１に記載のクロマトグラフ質量分析データ処理装置であって、
前記マススペクトルスケーリング処理部は、一つのマススペクトル中のピークの信号強度の対数をとるスケーリングを行うことを特徴とするクロマトグラフ質量分析データ処理装置。