JP6006234B2 - オーキシン除草剤の分子構造における部分的な差異によるオーキシン除草剤に対するｄｈｔを使用可能な植物の向上された耐性 - Google Patents

Description

優先権主張
本出願は、２０１１年１月７日に出願された、「INCREASED TOLERANCE OF DHT-ENABLED PLANTS TO AUXINIC HERBICIDES RESULTING FROM MOIETY DIFFERENCES IN AUXINIC HERBICIDE MOLECULAR STRUCTURES」についての、米国仮特許出願第６１／４３０，６９３号の出願日の利益を主張する。

本発明は、抑制が要求される場所に、有効量の２，４−ＤＢを適用する工程を含む、オーキシン除草剤耐性の綿花作物を含む田畑において、望ましくない植物を抑制する方法に関する。

オーキシン除草剤耐性の綿花作物の田畑において、望ましくない植物を抑制するためのオーキシン除草剤の使用は、オーキシン除草剤耐性の綿花作物に対する一次的な傷害の原因となり、発育の遅延をもたらし得る。目に見える一時的な傷害には、葉下垂、葉巻および葉柄湾曲の組み合わせが含まれ得、共に上偏成長と呼ばれる。他の一時的な傷害は、適用後１０から１４日で見られ得、紐状葉（leaf strapping）、奇形および葉の上偏成長を含む。このような一時的で、初期の傷害は、綿花作物の熟成期間の望ましくない延長をもたらし、栽培者に更なる経費を負担させ、場合により全作物生産量を低下させ得る。

本発明は、オーキシン除草剤耐性の作物を含む田畑において、望ましくない植物を抑制するためのオーキシン除草剤の適用による、初期の除草剤傷害による初期遅延を含む作物傷害に関連する課題に取り組み、解決する。

本発明の目的は、抑制が要求される場所に、有効量の２，４−ＤＢを適用する工程を含む、オーキシン除草剤耐性の綿花作物を含む田畑において、望ましくない植物を抑制する方法である。

本発明の他の目的は、前記除草剤耐性の綿花作物に対する傷害を、酸当量の２，４−Ｄの適用と比較して低減する方法である。

本発明の更なる目的および利益は、下記の詳細な説明から当業者に容易に明らかになるであろう。詳細な説明において、本発明の実施形態は、本発明の実施において、熟慮された最良の形態を単に説明するものとして記載される。当然のことながら、本発明には、他の実施形態および異なる実施形態があり得る。そして、実施形態のいくつかの詳細は、いずれも本発明から逸脱することなく、各種の明らかな観点から変更され得る。したがって、記載は、本質的に例示と見なされ、制限的なものとは見なされない。

本発明について、以下に、より完全に記載される。実際、これらの発明は、多くの種々の形態において具体化されてもよく、本明細書で説明される実施形態に限定して解釈されるべきではない。むしろ、これらの実施形態は、この開示が適切な法的要求事項を満たすように提供される。同じ番号は、全体を通して同じ要素を意味する。

これらの発明が属する分野における当業者は、本明細書で説明される本発明についての多くの変形および他の実施形態が、上記に示された教示の利益を有することに想到するであろう。したがって、本発明は、開示された特定の実施形態には限定されず、変形および他の実施形態が、添付の特許請求の範囲の範囲内に含まれることを意図するものと理解される。本明細書において特定の用語が使用されるが、これらの用語は、一般的で記述的な意味においてのみ使用され、限定を目的としない。

本発明は、抑制が要求される場所に、有効量の２，４−ＤＢを適用する工程を含む、オーキシン除草剤耐性の綿花作物を含む田畑において、望ましくない植物を抑制する方法に関するものである。

特に断らない限り、本明細書で使用される「除草剤」の用語は、好ましくなく、望ましくない植物、例えば、限定されないが、有害または迷惑な雑草、広葉の植物、芝生およびスゲを妨害する、さもなければ枯らす分子もしくは分子の組み合わせを意味し、作物保護のために、このように使用される。「有効量」の表現は、望ましくない植物の生長を低減するための観察可能な所望の効果を生じさせるのに必要な除草剤の量を意味する。前記効果としては、植物壊死、植物死、生長阻害、繁殖阻害、増殖阻害および除去、破壊、さもなければ、好ましくなく、望ましくない植物の発生および活性を減少する効果があげられる。好ましくなく、望ましくない植物としては、除草剤耐性および除草剤抵抗性の雑草、例えば、グリホサート耐性およびグリホサート抵抗性の雑草があげられる。

「オーキシン除草剤」としては、アリールオキシアルカノアート化学構造、例えば、フェノキシアセテートオーキシン（例えば、２，４−ＤおよびＭＣＰＡ）、フェノキシブタノアートオーキシン（例えば、２，４−ＤＢおよびＭＣＰＢ）ならびにピリジルオキシアセテートオーキシン（例えば、フルロキシピルおよびトリクロピル）を有する除草剤があげられる。

多くのオーキシン除草剤耐性遺伝子が、本発明の植物に使用され得る。綿花植物は、形質転換されて、酵素であるアリールオキシアルカノアートジオキシゲナーゼ（ＡＡＤ）をコードする、任意のファミリーの耐性遺伝子（ＡＡＤと指定される）を含み得る。ついで、前記酵素は、植物体において、オーキシン除草剤を不活性化する。このような除草剤耐性は、ＡＡＤ−１遺伝子（スフィンゴビウム・ハービシドボランス（Sphingobium herbicidovorans）由来）、ＡＡＤ−１２（デルフチア・アシドボランス（Delftia acidovorans）由来）、ならびに、ＰＣＴ公開国際公開第２００５／１０７４３７号、同第２００７／０５３４８２号およびＰＣＴ公開米国特許出願公開第２０１０／０２５１４３２号明細書に開示のＡＡＤ−１３遺伝子により与えられ得る。

オーキシン除草剤、例えば、２，４−ＤＢを、雑草の抑制が要求される場所に従来の方法により適用する。「場所」は、土壌、種子および苗ならびに土着の植物を含むことを意図する。２，４−ＤＢが、直接的に植物に適用された場合、または、任意の生長段階における植物、または、種まき前もしくは発芽前における植物の場所に適用された場合、除草作用は、２，４−ＤＢにより示される。観察される効果は、抑制される植物種、植物の生長段階、希釈および散布液滴サイズの適用パラメータ、土壌成分の粒子サイズ、使用時の環境条件、使用される具体的な化合物、使用される具体的な補助剤およびキャリア、土壌の種類等、ならびに、適用される化学物質の量により決まる。これらの要因および他の要因を、当分野に公知なように調整して、目的とする除草作用を促進する。一般的に、雑草の抑制を最大のものとするために、比較的に未発達の望ましくない植物の発芽後に、２，４−ＤＢを適用するのが好ましい。

綿花（ワタ属種（Gossypium spp.））は、世界中で最も重要な織物繊維作物であり、世界中で最も重要な油糧種子作物の一つである。綿花植物は、ヒトの食品、家畜の飼料および工業用原料源を供給する。綿花種子は、食用油のために圧搾され、残りの綿実粉は、動物の飼料に使用される。綿花の工業的使用には、ろうそくの芯、より糸、紙およびたくさんの織物産物が含まれる。

ワタ属は、非常に広く、現在、５０種が含まれる。ワタ属の２種類の四倍体種が、綿ほこりと呼ばれる、繊維に紡績されることが可能な種子繊維を有する。これらの２種は、ゴシピウム・ヒルスツム（G. hirsutum）（アメリカ高地綿とも言う）およびゴシピウム・バルバデンセ（G. barbadense）（ピマワタとも言う）である。

綿花は、両性花を有する双子葉植物である。すなわち、綿花は、花粉生成器官である雄蕊（male）と、同じ花に受粉器官である別個の雌蕊（female）を有する。栽培された綿花の花は、３枚の三角形の苞葉に包まれており、一般に、スクエアとして公知のものを形成する。花は、５枚の花弁、雄蕊の房を有するずい柱、および花柱を含む筒を形成するものを有する開いた花冠を含む。複合雄蕊は、葯上に突出している柱頭を有する３つから５つの心皮からなる。子房は、３房から５房の鞘またはボウルに発達する。７つから９つの種子が、各房（lock or locule）内に整えられる。開花に先立つ日に、捻じれた花冠が、スクエアから現れる。開花日に、花冠が開き、花粉の飛散が起こる。開花の翌日に、花冠は赤色となり、その後に植物から落ちる。受粉は、開花の開始および柱頭上の花粉の飛散、または、昆虫による柱頭上の花粉の付着に伴って起こる。

「植物」に関しては、植物全体、植物器官（例えば、葉、茎、根等）、種子、植物細胞、珠芽、同じものの胚および子孫が意図される。植物細胞は、分化または未分化（例えば、カルス、浮遊培養細胞、プロトプラスト、葉細胞、根細胞、師管細胞および花粉）であり得る。

「遺伝子組み換え植物」もしくは「形質転換植物」もしくは「適切に形質転換された」植物、細胞または組織は、外因性核酸配列またはＤＮＡフラグメントが、植物細胞内に組み込まれた、または、統合された植物を意味する。「適切な形質転換」に関しては、植物に導入されたヌクレオチド構築物が、植物のゲノム内に統合し、その子孫に遺伝可能であることを意図する。

除草活性化合物である、４−（２，４−ジクロロフェノキシ）酪酸または２，４−ＤＢは、例えば、Tomlin, Clive (editor) (2009) 「The Pesticide Manual」, Fifteenth Edition, British Crop Protection Council (BCPC), pages 306-308に記載される。

本発明の除草混合物の調製に有用な適切な農業用補助剤およびキャリアは、当業者に周知である。

使用され得る液状のキャリアとしては、水、トルエン、キシレン、石油ナフサ、作物油、アセトン、メチルエチルケトン、シクロヘキサノン、トリクロロエチレン、ペルクロロエチレン、酢酸エチル、酢酸アミル、酢酸ブチル、プロピレングリコールモノメチルエーテルおよびジエチレングリコールモノメチルエーテル、メタノール、エタノール、イソプロパノール、アミルアルコール、エチレングリコール、プロピレングリコール、グリセリン等があげられる。水は、一般的に、濃縮物の希釈用に選択されるキャリアである。

適切な固体のキャリアとしては、タルク、パイロフィライトクレイ、シリカ、アパルジャイトクレイ、カオリンクレイ、珪藻土、チョーク、珪藻土、石灰、炭酸カルシウム、ベントナイトクレイ、フラー土、綿花種子外皮、小麦粉、大豆粉、軽石、木粉、クルミ殻粉、リグニン等があげられる。

通常、本発明の組成物には、１つ以上の界面活性剤が含まれるのが望ましい。このような界面活性剤は、固形の組成物および液状の組成物の両方、特に、適用前にキャリアにより希釈されるように設計されたものに、有利に使用される。界面活性剤の性質は、アニオン性、カチオン性または非イオン性であり得、乳化剤、湿潤剤、懸濁化剤として、または他の目的のために使用され得る。典型的な界面活性剤としては、アルキル硫酸塩、例えば、ラウリル硫酸ジエタノールアンモニウム；アルキルアリールスルホン酸塩、例えば、ドデシルベンゼンスルホン酸カルシウム；アルキルフェノール−アルキレンオキサイド付加物、例えば、ノニルフェノール−Ｃ_１８ エトキシレート；アルコール−アルキレンオキサイド付加物、例えば、トリデシルアルコール−Ｃ_１６ エトキシレート；石鹸、例えば、ステアリン酸ナトリウム；アルキルナフタレンスルホン酸塩、例えば、ジブチルナフラレンスルホン酸ナトリウム；スルホコハク酸塩のジアルキルエステル、例えば、ジ（２−エチルヘキシル）−スルホコハク酸ナトリウム；ソルビトールエステル、例えば、オレイン酸ソルビトール；四級アミン、例えば、ラウリルトリメチルアンモニウムクロライド；脂肪酸のポリエチレングリコールエステル、例えば、ステアリン酸ポリエチレングリコール；エチレンオキサイドとプロピレンオキサイドとのブロックコポリマー；ならびに、モノアルキルリン酸塩エステルおよびジアルキルリン酸塩エステルの塩があげられる。

農業用組成物に一般的に使用される他の補助剤としては、相溶化剤、消泡剤、金属イオン封鎖剤、中和剤およびバッファー、腐食防止剤、染料、付臭剤、展着剤、浸透補助、固着剤、分散剤、増粘剤、凝固点降下剤、抗菌剤等があげられる。組成物は、他の適合成分、例えば、他の除草剤、植物生長抑制剤、殺菌剤、殺虫剤等も含み得る。組成物は、液肥または、固体の微粒子肥料キャリア、例えば、硝酸アンモニウム、尿素等により製剤化され得る。

本発明の除草組成物における活性成分の濃度は、一般的に、約０．００１から約９８重量パーセントである。約０．０１から約９０重量パーセントの濃度が、頻繁に使用される。濃縮物として使用されるように設計された組成物において、活性成分は、一般的に、約５から約９８重量パーセント、好ましくは、約１０から約９０重量パーセントの濃度で存在する。このような組成物は、典型的には、不活性のキャリア、例えば、水により適用前に希釈される。通常雑草または雑草の場所に適用される、希釈された組成物は、一般的に、約０．０００１から約１重量パーセントの活性成分を含み、好ましくは、約０．００１から約０．０５重量パーセントで含む。

本発明の方法において、２，４−ＤＢ除草剤の適用は、作物の播種前、発芽前および発芽後において同様に行い得る。発芽前および／または発芽後初期の適用が、好ましい。「発芽前」は、地面からの作物植物の発芽前の期間中に、除草剤を適用することとして規定される。「発芽後」は、地面からの作物植物の発芽後の期間中に、除草剤を適用することとして規定され、作物植物の葉に、除草剤が接触する。好ましくは、２，４−ＤＢは、綿花作物の発芽後および綿花作物の栄養生長段階中に適用される。

本発明の除草化合物は、幅広い種類の望ましくない植物を抑制するために、頻繁に、１つ以上の他の除草剤と共に適用される。他の除草剤と共に使用される場合、現在請求される化合物は、他の除草剤と共に製剤化され、他の除草剤と共にタンク混合され、または、続けて、他の除草剤と共に適用され得る。本発明の化合物と共に使用され得る一部の除草剤としては、グリホサート、グルホシネート、パラコート、ＡＬＳ−阻害剤（例えば、スルホニル尿素、イミダゾリノン、トリアゾロピリミジンスルホンアミド等）、ＨＰＰＤ阻害剤（例えば、メソトリオン、イソキサフルトール等）、ＰＰＯ阻害剤（例えば、ピラフルフェン、ホメサフェン等）、ジカンバ、ブロモキシニル、アリールオキシアルカノアートおよびその他のものがあげられるが、これらの除草剤のいくつかは、これらの除草剤に対する選択性を有する作物を与えるために、遺伝子組み換え技術を必要とし得る。

本組成物は、従来の地上または航空機の散布器、噴霧器および散粒機の使用により、灌漑用水への付加により、ならびに、当業者に公知の他の従来の手段により、雑草または雑草の場所に適用され得る。

本発明の一態様において、有効量の２，４−ＤＢの適用により引き起こされる除草剤耐性の綿花作物に対する傷害は、有効量の２，４−Ｄの適用と比較して低減される。除草剤由来の傷害の低減は、作物におけるストレスを有利に低減する。これにより、場合によっては、作物の熟成期間を短縮し、または、栽培者の費用をも抑え、全作物生産量を増加する。

どのような理論にも拘束されることを意図していないが、２，４−ＤＢは、植物体でβ−酸化を受けるまでは、強固な除草剤ではないと仮定される。この更なる代謝工程および／または他の要因が、２，４−Ｄと比較して、２，４−ＤＢの適用に耐える、ＡＡＤ−形質転換植物の能力の向上をもたらす。この概念は、全てのＡＡＤ−形質転換作物に適用し得るが、２，４−Ｄに対するより低い耐性を有する、綿花を含むＡＡＤ−形質転換作物に適用した場合、特に有用である。

「傷害」に関しては、当業者により視覚的に評価されるように、（葉下垂、葉巻、葉柄湾曲を有する）上偏生長の葉の割合を意味する。２，４−Ｄと比較して、２，４−ＤＢ由来の低減した傷害は、これらの除草剤の適用後数分以内に観察され、その後長期間、例えば、適用後２時間から適用後３０日間（適用後３時間から適用後１９日間を含み、適用後６時間から適用後２４時間をさらに含む）、観察され続ける。

本発明は、遺伝子組み換えアリールオキシアルカノアート除草剤耐性の綿花作物も含む。前記綿花作物は、１つ以上の更なる除草剤耐性遺伝子を含む。前記更なる除草剤耐性遺伝子は、限定されないが、グリホサート、ＡＬＳ−（イミダゾリノン、スルホニル尿素）、アリールオキシアルカノアート、ＨＰＰＤ−、ＰＰＯ−およびグルホシネート抵抗性遺伝子を含む。より幅広く、より強力な雑草の抑制、および、除草剤抵抗性管理評価に適合する除草剤耐性植物を提供するためである。

約０．１から約２，２４０グラム酸当量／ヘクタール（ｇ ａｅ／ｈａ）の適用比率が、発芽後の作業において、一般的に使用され、好ましくは、１から約１，１２０ｇａｅ／ｈａで使用される。発芽前適用については、約１から約２，２４０ｇ ａｅ／ｈａの比率が、一般的に使用される。指定されたより高い比率により、一般的に、幅広い種類の望ましくない植物が非選択的に抑制される。より低い比率により、典型的に、選択的に抑制され、綿花作物の場所に使用され得る。本発明の実施形態において、発芽後作業についての２，４−ＤＢの好ましい適用比率は、少なくとも２８０ｇａｅ／ｈａであり、好ましくは約２８０ｇ ａｅ／ｈａから約２，２４０ｇ ａｅ／ｈａである。
（実施例）

下記実施例は、本発明のある好ましい実施形態を説明するために含まれる。これらの実施例を、特許請求の範囲を限定するものと解釈してはならない。下記実施例に開示される技術が、本発明の実用化のための好ましい態様を示すものとして使用される具体的な取り組みを示すことは、当業者に理解されるはずである。ただし、当業者は、本開示の観点において、発明の精神および範囲から逸脱することなく、類似または同様の結果が得られるのであれば、これらの具体的な実施形態に多くの変更がなされ得ることを理解すべきである。

ＡＡＤ−１遺伝子により形質転換された綿花植物（ＡＡＤ−１綿花）は、アリールオキシアルカノアートジオキシゲナーゼ（ＡＡＤ）タンパク質をコードする。これらの植物は、下記実施例に使用され、オーキシン除草剤、特に２，４−ＤＢおよび２，４−Ｄに対する耐性を示す。ＡＡＤ−１は、育種圃場における選択マーカーとしても使用され得る。植物号における除草剤耐性用のＡＡＤ−１遺伝子自身は、国際公開第２００５／１０７４３７に最初に開示された（米国特許第７，８３８，７３３号明細書を参照のこと。）。

２，４−ＤＢおよび２，４−Ｄは、ＡＡＤ−１綿花区画において、類似の雑草抑制を提供する。

ＡＡＤ−１綿花における雑草を抑制するための２，４−ＤＢおよび２，４−Ｄの有効性を比較する実験を、９か所の現場で行った。前記現場は、近接したＧｒｅｅｎｖｉｌｌｅ、ＭＳ（３か所）；Ｃｈｕｌａ、ＧＡ；Ｍａｃｏｎ Ｃｏｕｎｔｙ、ＧＡ；Ａｔｔａｐｕｌｇｕｓ、ＧＡ；Ｍｅｍｐｈｉｓ、ＴＮ；Ｎｅｗｐｏｒｔ、ＡＲおよびＦｒｅｓｎｏ、ＣＡに位置する。実験計画は、ランダムに選ばれた全てのブロックにおける処理区画を含む場所あたり、４回反復とした。各区画は、長さ６．１メートルの２列に、ＡＡＤ−１綿花植物を有する。単独の適用処理について、雑草および綿花植物を、５．１ｃｍから１５．２ｃｍの高さで対象とした。処理は、５６０、８４０および１１２０ｇ ａｅ／ｈａで区画に適用されるＢｕｔｙｒａｃ２００（２，４−ＤＢ）およびＷｅｅｄａｒ６４（２，４−Ｄ）からなる。枯れた植物または重大な除草剤関連傷害を示す植物の割合（０−１００％、０は非活性またはコントロールを示し、１００％は、対象植物の死を示す。）について、雑草種を、除草剤適用後３週間、週に１回、視覚的に評価した。

表１に、ＡＡＤ−１綿花の区画における２，４−ＤＢおよび２，４−Ｄの適用による雑草抑制の結果を示す。ほぼ全ての対象種および測定の各週間について、より高いレベルの抑制が、２，４−ＤＢおよび２，４−Ｄの適用比率の向上に伴って得られ、１１２０ｇ ａｅ／ｈａで最も高い抑制が得られた。したがって、有効性に基づいて、１１２０ｇ ａｅ／ｈａが、ＡＡＤ−１綿花における雑草を抑制するために試験した３つの比率のうち、好ましい適用比率である。１１２０ｇ ａｅ／ｈａにおいて、抑制は、枯れた雑草植物または著しく傷害を負った雑草植物の≦８０％、＞８０％または＞９０％のいずれかに分類される。

１１２０ｇ ａｅ／ｈａでの適用比率において、２，４−ＤＢおよび２，４−Ｄは、ヒユ属種（ＡＭＡＳＳ）を除いて、各雑草種を同等に抑制した。２，４−Ｄは、２，４−ＤＢが７７％の抑制であるのに対して、９２％と目に見えて上回った。ほとんどの種は、両除草剤により、＞８０％で抑制された。両除草剤による抑制が８０％未満であった種は、グリホサート抵抗性のオオホナガアオゲイトウ（Amaranthus palmeri）（ＡＭＡＰＡ ＧＬＹ−ｒｅｓ）、ムラサキヌスビトハギ（Desmodium tortuosum）（ＤＥＤＴＯ）およびクルマバザクロソウ（Mollugo verticillata）（ＭＯＬＶＥ）であった。

ＡＡＤ−１で形質転換された綿花植物は、２，４−Ｄと比較して２，４−ＤＢに対する向上された耐性を有する。

２，４−ＤＢおよび２，４−Ｄ除草剤化合物の効果に対するＡＡＤ−１綿花植物の耐性を評価するために、除草剤であるＢｕｔｙｒａｃ２００（２，４−ＤＢ）およびＷｅｅｄａｒ６４（２，４−Ｄ）を、２回の野外実験において、個々にＡＡＤ−１綿花植物に散布することにより適用した。

１回の実験を、４か所の現場、近接したＧｒｅｅｎｖｉｌｌｅ、ＭＳ；Ｂｒｉｎｓｏｎ、ＧＡ；Ｍｅｍｐｈｉｓ、ＴＮおよびＦｒｅｓｎｏ、ＣＡで行った。実験計画は、ランダムに選ばれた全てのブロックにおける処理区画を含む場所あたり、４回反復とした。各区画は、長さ６．１メートルの２列に、ＡＡＤ−１綿花植物を有する。単独の適用処理について、綿花植物を、５．１ｃｍから１０．２ｃｍの高さで対象とした。処理は、５６０、８４０、１１２０、１６８０および２２４０ｇ ａｅ／ｈａで適用されるＢｕｔｙｒａｃ２００（２，４−ＤＢ）ならびに、８４０および１１２０ｇ ａｅ／ｈａで適用されるＷｅｅｄａｒ６４（２，４−Ｄ）からなる。適用後１日で除草剤関連傷害を示す葉の割合について、ＡＡＤ−１綿花植物を、視覚的に評価した。

表２に、２，４−ＤＢまたは２，４−Ｄ由来のＡＡＤ−１綿花の傷害の結果を示す。８４０ｇ ａｅ／ｈａの適用比率で、２，４−ＤＢは、ＡＡＤ−１綿花に対して、２，４−Ｄで観察されたより低い（統計的に異なるわけではない）レベルの傷害をもたらす。ただし、１１２０ｇ ａｅ／ｈａの好ましい適用比率では、２，４−ＤＢは、適用後初日に、ＡＡＤ−１綿花に対して、２，４−Ｄで観察されたより有意に低い傷害をもたらした。２，４−Ｄ（１１２０ｇ ａｅ／ｈａ）と比較して２倍の適用比率（２２４０ｇ ａｅ／ｈａ）の２，４−ＤＢでも、ＡＡＤ−１綿花の２，４−ＤＢ由来の傷害は、２，４−Ｄ由来より有意に低かった

他の実験を、Ｔｉｆｔｏｎ、Ｇｅｏｒｇｉａに近い、Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ ｏｆ Ｇｅｏｒｇｉａ Ｐｏｎｄｅｒ Ｆａｒｍでの１か所の現場で行った。実験計画は、ランダムに選ばれた全てのブロックにおける区画で、３回反復とした。各区画は、長さ７．６メートルの１列に、ＡＡＤ−１綿花植物を有する。単独の適用処理について、綿花植物を、４８．３ｃｍ（６葉期）の高さで対象とした。処理は、２８０、５６０、１１２０および２２４０ｇ ａｅ／ｈａで適用されるＢｕｔｙｒａｃ２００（２，４−ＤＢ）ならびに、５６０および１１２０ｇ ａｅ／ｈａで適用されるＷｅｅｄａｒ６４（２，４−Ｄ）からなる。適用後０、１、２、１９および４５日での、除草剤関連傷害を示す葉の割合について、ＡＡＤ−１綿花植物を、視覚的に評価した。

表３に、２，４−ＤＢまたは２，４−Ｄ適用後の時間経過におけるＡＡＤ−１綿花植物の傷害の結果を示す。全適用比率において、ＡＡＤ−１綿花に対する最も高いレベルの傷害は、２，４−ＤＢおよび２，４−Ｄの両方について、除草剤適用の同じ日（０日目）に見られた。１１２０ｇ ａｅ／ｈａの好ましい適用比率では、２，４−ＤＢによりもたらされる傷害は、適用後０、１、２および１９日で、２，４−Ｄで観察されたより有意に低かった。適用後４５日において、ＡＡＤ−１綿花に対する傷害は、１１２０ｇ ａｅ／ｈａで適用される２，４−ＤＢと２，４−Ｄとの間では、有意差がなかった。２，４−Ｄ（１１２０ｇ ａｅ／ｈａ）と比較して２倍の適用比率（２２４０ｇ ａｅ／ｈａ）の２，４−ＤＢでも、ＡＡＤ−１綿花の２，４−ＤＢ由来の傷害は、適用後０、１および１９日で、２，４−Ｄ由来より有意に低かった

ＡＡＤ−１２で形質転換された綿花植物は、２，４−Ｄと比較して、２，４−ＤＢに対する適度に向上された耐性を有する。

２，４−ＤＢおよび２，４−Ｄ除草剤化合物の効果に対するＡＡＤ−１２綿花植物の耐性を評価するために、除草剤であるＤＢ Ｓｔｒａｉｇｈｔ（２，４−ＤＢ）およびＷｅｅｄａｒ６４（２，４−Ｄ）を、１か所の温室実験において、個々にＡＡＤ−１２綿花植物に散布することにより適用した。４種類の処理は、２種類の除草剤両方についての２種類の適用比率、１１２０および２２４０ｇ ａｅ／ｈａからなる。実験計画は、処理あたり単独のＡＡＤ−１２綿花植物の４回反復とした。植物をポットで成長させた。処理は、ランダム化させなかった。散布時に、植物は、３葉期から４葉期であった。適用後０、１、２、４および１２日で除草剤関連傷害を示す葉の割合について、散布されたＡＡＤ−１２綿花植物を、視覚的に評価した。

表４に、２，４−ＤＢまたは２，４−Ｄ由来のＡＡＤ−１２綿花植物に観察された平均傷害の結果を示す。適用後０日から４日（ＤＡＡ）で、２，４−ＤＢで処理された植物は、２，４−Ｄで処理された植物より、観察された葉の傷害が低い割合を示した。ただし、この実験において、２２４０ｇ ａｅ／ｈａのより高い適用比率での適用後２日および４日でのみ、観察された割合に、統計的に有意差があった。

ＡＡＤ−１３で形質転換された綿花植物
綿花細胞をＡＡＤ−１３で形質転換し、ＡＡＤ−１遺伝子またはＡＡＤ−１２遺伝子により提供される耐性と同様の、２，４−ＤＢおよび２，４−Ｄに対する耐性を有する綿花植物を産生し得る。

ＡＡＤ−１３で形質転換された綿花は、米国特許出願公開第２０１０／０２５１４３２号明細書［ＰＣＴ／ＵＳ０８／６３２１２（Ｌｉｒａら）］の実施例＃７に以前記載されたのと同様の技術を使用して、利用され得る。

これまでの記載において、多くの具体的な詳細、例えば、具体的な材料、構造、化学物質、工程等が、本発明をより理解するために説明されている。ただし、本発明は、具体的に説明される詳細に頼ることなく、実施され得る。他の例において、本発明を無用に分かりにくくしないために、周知の処理構造を詳細には記載していない。

本開示において、本発明の好ましい実施形態だけでなく、その多用途性についての少しの実施例も示し、記載している。本発明は、本明細書に表された本発明の概念の範囲内で、各種他の組み合わせおよび環境において使用可能であり、変更および変形が可能であると理解される。
以下に、本願の当初の特許請求の範囲に記載された発明を付記する。
［１］
抑制が要求される場所に、有効量の２，４−ＤＢを適用する工程を含む、
オーキシン除草剤耐性の綿花作物を含む田畑において、望ましくない植物を抑制する方法。
［２］
前記除草剤耐性の綿花作物に対する傷害が、酸当量の２，４−Ｄの適用と比較して低減される、［１］に記載の方法。
［３］
前記除草剤耐性の綿花作物に対する傷害が、適用後６時間で、当量の２，４−Ｄの適用と比較して低減される、［２］に記載の方法。
［４］
前記除草剤耐性の綿花作物に対する傷害が、適用後２４時間で、当量の２，４−Ｄの適用と比較して低減される、［２］に記載の方法。
［５］
前記オーキシン除草剤耐性の綿花作物が、アリールオキシアルカノアートオーキシン除草剤耐性の綿花作物である、［１］に記載の方法。
［６］
前記除草剤耐性の綿花作物に対する傷害が、適用後１９日までの任意の期間で、当量の２，４−Ｄの適用と比較して低減される、［２］に記載の方法。
［７］
前記アリールオキシアルカノアート除草剤耐性の綿花作物が、遺伝子組み換え綿花作物である、［１］に記載の方法。
［８］
前記遺伝子組み換えアリールオキシアルカノアート除草剤耐性の綿花作物が、さらに、少なくとも１つの更なる除草剤耐性遺伝子を含む、［７］に記載の方法。
［９］
前記アリールオキシアルカノアート除草剤耐性の綿花作物が、ＡＡＤ−１（アリールオキシアルカノアートジオキシゲナーゼ）をコードする遺伝子を含む、［１］に記載の方法。
［１０］
前記アリールオキシアルカノアート除草剤耐性の綿花作物が、ＡＡＤ−１２（アリールオキシアルカノアートジオキシゲナーゼ）をコードする遺伝子を含む、［１］に記載の方法。
［１１］
有効量の２，４−ＤＢが、少なくとも２８０グラム酸当量／ヘクタールである、［１］に記載の方法。
［１２］
有効量の２，４−ＤＢが、約２８０グラム酸当量／ヘクタールから約２，２４０グラム酸当量／ヘクタールである、［１］に記載の方法。
［１３］
２，４−ＤＢが、発芽後のオーキシン除草剤耐性の綿花作物に適用される、［１］に記載の方法。
［１４］
２，４−ＤＢが、オーキシン除草剤耐性の綿花作物の発芽後で、栄養生長期段階のオーキシン除草剤耐性の綿花作物に適用される、［１］に記載の方法。
［１５］
前記望ましくない植物が、グリホサート抵抗性の雑草を含む、［１］に記載の方法。
［１６］
前記抑制が要求される場所に、更なる除草剤を適用する工程を含む、［１］に記載の方法。

Claims (14)

1. 抑制が要求される場所に、除草有効量の２，４−ＤＢを適用する工程を含む、アリールオキシアルカノアートオーキシン除草剤耐性の綿花作物を含む田畑において、前記作物に対する上偏生長の除草傷害を制限しつつ望ましくない植物を抑制する方法であって、
   前記作物の除草剤耐性の綿花植物はアリールオキシアルカノアートジオキシゲナーゼ（ＡＡＤ）をコードする導入遺伝子を含む、方法。
2. 前記除草剤耐性の綿花作物に対する上偏生長の傷害が、酸当量の２，４−Ｄの適用と比較して低減される、請求項１に記載の方法。
3. 前記除草剤耐性の綿花作物に対する傷害が、２，４−ＤＢの適用後６時間で、酸当量の２，４−Ｄの適用後６時間での傷害と比較して低減される、請求項２に記載の方法。
4. 前記除草剤耐性の綿花作物に対する傷害が、２，４−ＤＢの適用後２４時間で、酸当量の２，４−Ｄの適用後２４時間での傷害と比較して低減される、請求項２に記載の方法。
5. 遺伝子組み換えアリールオキシアルカノアートオーキシン除草剤耐性の綿花作物が、少なくとも１つの更なる除草剤耐性遺伝子を含む、請求項１に記載の方法。
6. 前記アリールオキシアルカノアートオーキシン除草剤耐性の綿花作物の植物が、ＡＡＤ−１（アリールオキシアルカノアートジオキシゲナーゼ−１）をコードする遺伝子を含む、請求項１に記載の方法。
7. 前記アリールオキシアルカノアートオーキシン除草剤耐性の綿花作物の植物が、ＡＡＤ−１２（アリールオキシアルカノアートジオキシゲナーゼ−１２）をコードする遺伝子を含む、請求項１に記載の方法。
8. 有効量の２，４−ＤＢが、少なくとも２８０グラム酸当量／ヘクタールである、請求項１に記載の方法。
9. 有効量の２，４−ＤＢが、２８０グラム酸当量／ヘクタールから２，２４０グラム酸当量／ヘクタールである、請求項１に記載の方法。
10. ２，４−ＤＢが、発芽後のアリールオキシアルカノアートオーキシン除草剤耐性の綿花作物に適用される、請求項１に記載の方法。
11. ２，４−ＤＢが、アリールオキシアルカノアートオーキシン除草剤耐性の綿花作物の植物の発芽後で、栄養生長期段階のアリールオキシアルカノアートオーキシン除草剤耐性の綿花作物に適用される、請求項１に記載の方法。
12. 前記望ましくない植物が、グリホサート抵抗性の雑草を含む、請求項１に記載の方法。
13. 前記抑制が要求される場所に、更なる除草剤を適用する工程を含む、請求項１に記載の方法。
14. アリールオキシアルカノアートジオキシゲナーゼ−１（ＡＡＤ−１）またはアリールオキシアルカノアートジオキシゲナーゼ−１２（ＡＡＤ−１２）をコードする遺伝子を有する遺伝子組み換え綿花植物を含むアリールオキシアルカノアートオーキシン除草剤耐性の綿花作物を含む田畑において、前記作物に対する上偏生長の除草傷害を制限しつつ望ましくない植物を抑制する方法であって、
    前記除草剤耐性綿花植物に少なくとも１１２０グラム酸当量／ヘクタールの量の２，４−ＤＢを適用する工程を含む、方法。