JP5991687B2 - 脱分化脂肪細胞の製造方法 - Google Patents
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この0.1w/v%というコラゲナーゼの濃度は、Rodbellが1964年に報告したものであり(非特許文献1、2)、現在に至るまで、この濃度のままコラゲナーゼを使用するのが一般的である。しかし、コラゲナーゼはトリプシンと同様に細胞への障害作用があるため、濃度が高いほど細胞に与える傷害が大きくなるという問題がある。
このような脱分化脂肪細胞を大量に製造するには、細胞に極力障害を与えない条件で、脂肪組織より成熟脂肪細胞を効率的に単離することが重要となる。そこで、本発明者らは本発明において、脱分化脂肪細胞を大量に製造するための、脂肪組織の処理にあたり最適なコラゲナーゼ濃度を検討した。
(1)次のAの工程を含む、脱分化脂肪細胞の製造方法。
A.脂肪組織を0.01w/v%より高く、かつ、0.1w/v%より低い濃度のコラゲナーゼで処理することにより、成熟脂肪細胞を単離する工程
(2)コラゲナーゼの濃度が0.02w/v%以上であり、かつ、0.05%以下である上記(1)に記載の製造方法。
(3)成熟脂肪細胞が60μm未満の大きさである上記(1)または(2)に記載の方法。
(4)さらに次のBの工程を含む、上記(1)〜(3)のいずれかに記載の脱分化脂肪細胞の製造方法。
B.上記Aの工程により単離された成熟脂肪細胞より、脱分化脂肪細胞を取得する工程
(5)上記(1)〜(4)のいずれかの方法によって製造された脱分化脂肪細胞を分化誘導する工程を含む、間葉系細胞の製造方法
(6)間葉系細胞が、骨芽細胞、筋芽細胞、心筋細胞、内皮細胞、軟骨細胞または脂肪細胞から選ばれるいずれかである上記(5)に記載の方法。
A.脂肪組織を0.01w/v%より高く、かつ、0.1w/v%より低い濃度のコラゲナーゼで処理することにより、成熟脂肪細胞を単離する工程
B.上記Aの工程により単離された成熟脂肪細胞より、脱分化脂肪細胞を取得する工程
この「脱分化脂肪細胞を取得する工程」には、単離された成熟脂肪細胞を天井培養法によって培養することが挙げられる。
これらの工程を行うにあたり、本発明者らの先願発明(特許第5055611号、特許第5055613号)を参照して行っても良い。
「間葉系細胞」には、骨芽細胞、筋芽細胞、心筋細胞、内皮細胞、軟骨細胞または脂肪細胞等が挙げられる。脱分化脂肪細胞を分化誘導する工程では、分化誘導する各細胞に合わせて分化誘導に有用な剤、方法等の従来知られているいずれの方法も用いることができる。
1)酵素
コラゲナーゼ(TypeII;C6885−1G,SIGMA)を使用した。
2)脂肪組織
顎変形症の手術の際に得られたヒト頬脂肪体から脂肪組織を得た。
脱分化脂肪細胞の製造方法(1)
工程A.脂肪組織から成熟脂肪細胞を単離する工程
ヒト頬粘膜下に位置する頬脂肪体より採取した脂肪組織5gを、コラゲナーゼ(TypeII;SIGMA)添加のNaHCO3含有ダルベッコ変法イーグル培地(DMEM;SIGMA)に入れ、コラゲナーゼ処理を行った。本発明において該培地におけるコラゲナーゼの濃度を0.02w/v%とし、比較として0.01w/v%、0.10w/v%または0.50w/v%の濃度としたものも作成した。
各濃度のコラゲナーゼ処理を行った後、ナイロンメッシュにて濾過し、細胞懸濁液を得た。得られた細胞懸濁液を1分間、700Gで遠心分離し、上層に分離される単胞性脂肪画分を新鮮な10%FBS添加DMEM培地に加え、1分間、700Gの遠心分離を3回繰り返すことで、単胞性脂肪細胞として成熟脂肪細胞を得た。
工程Aによって得られた単胞性脂肪細胞を組織培養フラスコ(Falcon,3107)に移し、20%FBS、1%ペニシリン/ストレプトマイシンを添加したDMEM培地でフラスコ内を完全に満たし、37℃、5%CO2、95%空気の気相に調節した炭酸ガス培養装置内にフラスコ底面が上となるように静置して7日間培養した。
培養4日後には大部分の細胞がフラスコ天井面にしっかりと接着し、大型の脂肪滴の周辺に種々の大きさの脂肪滴を有する多胞性脂肪細胞へと形態変化した。培養6日後には脂肪滴がさらに小さくなり、脂肪滴をまったく持たない線維芽細胞様の形態に変化する細胞が多数観察された。
培養7日後にフラスコ内の培地を20%FBS添加DMEM培地に交換し、細胞接着面が底面になるようにして炭酸ガス培養装置内で10日間培養を続けた。培地交換は4日毎に行った。脂肪滴を持たない細胞は活発に増殖し、培養10日後にはフラスコ内の細胞は線維芽細胞様の細胞のみとなり、コンフルエントに達した。
この線維芽細胞様の細胞は、活発な増殖能を有し、またDEX、INS、IBMX等の分化誘導剤により、脂肪滴を有する脂肪細胞に再分化する分化能を有することから、単胞性脂肪細胞由来の脱分化脂肪細胞として作出された。
その後、2回目の継代培養を行い、同様に細胞数を数えた(図1〜3、P2)後、さらに3回目の継代培養を行い、同様に細胞数を数えた(図1〜3、P3)。
脱分化脂肪細胞の製造方法(2)
1.成熟脂肪細胞数の比較
実施例1と同様の方法に、ヒトの頬脂肪体より採取した脂肪組織をコラゲナーゼ処理した。各濃度のコラゲナーゼ処理を1時間行った後、100μmのセルストレーナー(BD FALCON)を用いて細胞外基質成分を除去した後、濾過および低速遠心分離を行い、成熟脂肪細胞分画を得た。この各コラゲナーゼ濃度の浮遊細胞分画200μl中に含まれる細胞数をコールターカウンター:Coulter Counter(登録商標) Multisizer3(Beckman Coulter,Miami,FL,USA)を用いて測定し、採取された成熟脂肪細胞数を比較した。この測定は各濃度それぞれ3回行った。
上記1において低速遠心分離後に単離した浮遊細胞分画を、40μmのセルストレーナー(BD FALCON)で濾過し、得られた細胞分画を40μm未満の細胞分画とした。また、同じく100μmのセルストレーナーで濾過後、さらに40μmのセルストレーナーで40μm未満の細胞分画を排除して得た細胞分画を40μm以上100μm未満の細胞分画とした。
上記2.において分取した40μm未満の細胞分画または40μm以上100μm未満の細胞分画について、脂肪滴(トリグリセリド)に陽性を示すAdipored(Lonza,Walkerslive,MD,USA)および核に陽性を示すHoechst 33342(Sigma−Aldrich,5μg/ml)にて20分染色を行い、蛍光顕微鏡(KEYENCE)にて観察を行った。
その結果、図5に示されるように、40μm未満の細胞分画(図5、A)も40μm以上100μm未満の細胞分画(図5、B)のいずれもトリグリセリドおよび核が染色されたことから、成熟脂肪細胞であることが確認できた。
40μm未満の細胞分画または40μm以上100μm未満の細胞分画の成熟脂肪細胞を1フラスコあたり、1×104個ずつ播種し、天井培養を行った。天井培養開始後6日目の細胞数を測定した後、その後7日目にフラスコを反転し、10日目、14日目、18日目の脱分化脂肪細胞の数を測定した。
その結果、図6に示されるように、40μm未満の成熟脂肪細胞の方が40μm以上100μm未満の成熟脂肪細胞に比較して、天井培養開始6日目から有意に多く、脱分化脂肪細胞へ脱分化することが確認できた。
上記4.にて得られた40μm未満の成熟脂肪細胞または40μm以上100μm未満の成熟脂肪細胞から得られた脱分化脂肪細胞をそれぞれ継代培養し、1継代目の細胞を1×105個ずつ10cm dishに播種し、60%コンフルエントの細胞を回収した。これを5×105/tubeに分注した。
それぞれの脱分化脂肪細胞について、CD13(PE−CD13)、CD44(FITC−CD44)、CD45(FITC−CD45)、CD73(PE−CD73)、CD90(APC−CD90)、CD105(APC−CD105)、CD146(PE−CD146)、CD271(PE−CD271)、STRO−1(FITC−STRO1)(いずれもBD Biosciences,San Jose,CA,USA)で20分間反応させた。その後、反応後の細胞をPBSで洗浄し、フローサイトメーターにて陽性細胞の割合を計測した。
その結果、表1に示されるように、40μm未満の細胞分画から得られた脱分化脂肪細胞は40μm以上100μm未満の細胞分画から得られた脱分化脂肪細胞に対して間葉系幹細胞のマーカーであるCD146陽性細胞の割合が約1.5〜2倍多いことが確認できた。
間葉系細胞の製造方法
実施例2において得た40μm未満の細胞分画から得られた脱分化脂肪細胞と40μm以上100μm未満の細胞分画から得られた脱分化脂肪細胞を継代培養し、1継代目の細胞を1×104個ずつ12ウェルプレートに播種した、コンフルエントになったら、骨芽細胞誘導培地にて21日間誘導培養を行った。
分化誘導培地(DIFFERENTIATION−INDUCING CULTURE MEDIUM(図面においてIMまたはOsteogenic mediumと示す場合がある))の組成は増殖培地(Growth medium(図面においてGMと示す場合がある))[DMEM、10%(v/v) fetal bovine serum(FBS;13B103,Sigma−Aldrich),1% antibiotics]に100nM dexamethasone(Sigma-Aldrich),10mM b−glycerophosphate(Sigma-Aldrich),50mM L−ascorbic acid−2−phosphate(Sigma-Aldrich)を添加したものである。
この骨芽細胞誘導の評価は、アルカリフォスファターゼ活性、アリザリンレッドS染色、カルシウム定量試験にて行った。
誘導開始0、3、5、7、10、14日目の細胞を回収し、Pierce BCA protein Assay Reagent Kit(Thermo Scientific,Rockford,IL,USA)を用いてタンパク量を測定およびアルカリフォスファターゼ活性の測定を行った。
その結果、図7に示すように、40μm未満の細胞分画から得た脱分化脂肪細胞(図7、under 40μm IM)の方が、40μm以上100μm未満の細胞分画から得た脱分化脂肪細胞(図7、40−100μm IM)に比較して、誘導開始3、5、7日目に有意に高いアルカリフォスファターゼ活性を示した。
誘導開始0、7、14、21日目の細胞を10%中性ホルマリン緩衝液で固定し、アリザリンレッドS染色液 (Wako)を用いて10分染色を行った。
その結果、図8に示すように、40μm未満の細胞分画から得た脱分化脂肪細胞(図8、under 40μm Osteogenic medium)は40μm以上100μm未満の細胞分画から得た脱分化脂肪細胞(図8、40−100μm Osteogenic medium)に比較して、誘導開始7日目に有意に強いアリザリンレッドS染色を示した。
誘導開始0、7、14、21日目のカルシウム沈着量をCa−Eテストキットを用いて測定した。
その結果、図9に示すように、40μm未満の成熟脂肪細胞から得た脱分化脂肪細胞(図9、under 40μm IM)は、40μm以上100μm未満の成熟脂肪細胞から得た脱分化脂肪細胞(図9、40−100μm IM)に比較して、誘導開始7および21日目に有意に多いカルシウム沈着量を示した。なお、増殖培地にて培養した脱分化脂肪細胞(図9、under 40μm GMおよび40−100μm GM)は、いずれも誘導開始21日までカルシウムの沈着は見られなかった。
Claims (6)
- 次のAの工程及びBの工程を含む、脱分化脂肪細胞の製造方法。
A.脂肪組織を0.02〜0.05w/v%のコラゲナーゼで処理することにより、成熟脂肪細胞を単離する工程
B.上記Aの工程により単離された成熟脂肪細胞より、脱分化脂肪細胞を取得する工程 - 次のA、BおよびCの工程を含む、間葉系細胞の製造方法。
A.脂肪組織を0.02〜0.05w/v%のコラゲナーゼで処理することにより、成熟脂肪細胞を単離する工程
B.上記Aの工程により単離された成熟脂肪細胞より、脱分化脂肪細胞を取得する工程
C.上記Bの工程によって製造された脱分化脂肪細胞を分化誘導する工程 - 間葉系細胞が、骨芽細胞、筋芽細胞、心筋細胞、内皮細胞、軟骨細胞または脂肪細胞から選ばれるいずれかである請求項2に記載の方法。
- 次のAの工程及びBの工程を含む、脱分化脂肪細胞の製造方法。
A.脂肪組織を0.02〜0.05w/v%のコラゲナーゼで処理することにより、40μm未満の成熟脂肪細胞を単離する工程
B.上記Aの工程により単離された成熟脂肪細胞より、脱分化脂肪細胞を取得する工程 - 次のA、BおよびCの工程を含む、間葉系細胞の製造方法。
A.脂肪組織を0.02〜0.05w/v%のコラゲナーゼで処理することにより、40μm未満の成熟脂肪細胞を単離する工程
B.上記Aの工程により単離された成熟脂肪細胞より、脱分化脂肪細胞を取得する工程
C.上記Bの工程によって製造された脱分化脂肪細胞を分化誘導する工程 - 間葉系細胞が、骨芽細胞、筋芽細胞、心筋細胞、内皮細胞、軟骨細胞または脂肪細胞から選ばれるいずれかである請求項5に記載の方法。
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Cited By (3)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
JP2019103423A (ja) * | 2017-12-11 | 2019-06-27 | 学校法人日本大学 | 哺乳動物由来の脱分化脂肪細胞から神経細胞を製造する方法及び哺乳動物由来の脱分化脂肪細胞から神経細胞への分化誘導用キット |
WO2022014071A1 (ja) | 2020-07-17 | 2022-01-20 | 医療法人Yanaga CLinic | 成熟脂肪細胞含有組成物の製造方法 |
WO2023085219A1 (ja) * | 2021-11-11 | 2023-05-19 | 慶應義塾 | 脂肪組織由来間葉系幹細胞株を用いた変形性膝関節症の治療 |
Families Citing this family (3)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
CN105749347A (zh) * | 2016-02-24 | 2016-07-13 | 广州赛莱拉干细胞科技股份有限公司 | 一种美容填充物及其制备方法 |
JP7348612B2 (ja) | 2018-10-18 | 2023-09-21 | 学校法人日本大学 | 壊死性腸炎治療用組成物 |
WO2023190736A1 (ja) * | 2022-03-29 | 2023-10-05 | 学校法人日本大学 | ヒト脱分化脂肪細胞の製造方法及びヒト成熟脂肪細胞からヒト脱分化脂肪細胞を製造するための培地 |
Citations (9)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
JP2000157260A (ja) * | 1998-11-26 | 2000-06-13 | Toyobo Co Ltd | 初代前駆脂肪細胞の分化誘導方法及びその分化用培地 |
WO2008150001A1 (ja) * | 2007-06-08 | 2008-12-11 | Biomaster, Inc. | アディポクラスタ- |
WO2008153179A1 (ja) * | 2007-06-14 | 2008-12-18 | Akifumi Matsuyama | 脂肪組織由来多系統前駆細胞 |
JP2010124814A (ja) * | 2008-12-01 | 2010-06-10 | Olympus Corp | 細胞分離装置およびコラゲナーゼ除去方法 |
JP2011116715A (ja) * | 2009-12-04 | 2011-06-16 | Josai Univ | 幹細胞増殖用組成物 |
JP2013017434A (ja) * | 2011-07-12 | 2013-01-31 | Kanazawa Univ | 神経細胞とグリア細胞を共培養する方法 |
JP2013223504A (ja) * | 2010-11-09 | 2013-10-31 | Otsuka Pharmaceut Factory Inc | 細胞生存率低下抑制剤 |
JP2014509517A (ja) * | 2011-03-18 | 2014-04-21 | アンセルム(アンスチチュ ナショナル ドゥ ラ サンテ エ ドゥ ラ ルシェルシュ メディカル) | 軟骨細胞分化培地および細胞の軟骨細胞分化を誘導するための方法 |
JP2014511827A (ja) * | 2011-03-15 | 2014-05-19 | セル・アイディアズ・ピーティーワイ・リミテッド | 医薬組成物およびその局所使用 |
-
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Patent Citations (9)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
JP2000157260A (ja) * | 1998-11-26 | 2000-06-13 | Toyobo Co Ltd | 初代前駆脂肪細胞の分化誘導方法及びその分化用培地 |
WO2008150001A1 (ja) * | 2007-06-08 | 2008-12-11 | Biomaster, Inc. | アディポクラスタ- |
WO2008153179A1 (ja) * | 2007-06-14 | 2008-12-18 | Akifumi Matsuyama | 脂肪組織由来多系統前駆細胞 |
JP2010124814A (ja) * | 2008-12-01 | 2010-06-10 | Olympus Corp | 細胞分離装置およびコラゲナーゼ除去方法 |
JP2011116715A (ja) * | 2009-12-04 | 2011-06-16 | Josai Univ | 幹細胞増殖用組成物 |
JP2013223504A (ja) * | 2010-11-09 | 2013-10-31 | Otsuka Pharmaceut Factory Inc | 細胞生存率低下抑制剤 |
JP2014511827A (ja) * | 2011-03-15 | 2014-05-19 | セル・アイディアズ・ピーティーワイ・リミテッド | 医薬組成物およびその局所使用 |
JP2014509517A (ja) * | 2011-03-18 | 2014-04-21 | アンセルム(アンスチチュ ナショナル ドゥ ラ サンテ エ ドゥ ラ ルシェルシュ メディカル) | 軟骨細胞分化培地および細胞の軟骨細胞分化を誘導するための方法 |
JP2013017434A (ja) * | 2011-07-12 | 2013-01-31 | Kanazawa Univ | 神経細胞とグリア細胞を共培養する方法 |
Non-Patent Citations (3)
Title |
---|
JPN6015029630; 八木研他: '成熟脂肪細胞由来の前駆脂肪細胞株DFAT-D1の樹立' 肥満研究 Vol.11, No.3, 2005, p.92-94 * |
JPN6015029633; 鶴町仁奈他: 'ヒト頬脂肪体から脱分化脂肪細胞を獲得する酵素処理条件の検討' 再生医療 Vol.14, Suppl 2015, 201502, p.219 * |
JPN6015048730; KAJITA Kazuo et al.: 'Small proliferative adipocytes: identification of proliferative cells expressing adipocyte markers' Endocrine Journal Vol.60, No.8, 2013, p.931-939 * |
Cited By (4)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
JP2019103423A (ja) * | 2017-12-11 | 2019-06-27 | 学校法人日本大学 | 哺乳動物由来の脱分化脂肪細胞から神経細胞を製造する方法及び哺乳動物由来の脱分化脂肪細胞から神経細胞への分化誘導用キット |
JP7020667B2 (ja) | 2017-12-11 | 2022-02-16 | 学校法人日本大学 | 哺乳動物由来の脱分化脂肪細胞から神経細胞を製造する方法及び哺乳動物由来の脱分化脂肪細胞から神経細胞への分化誘導用キット |
WO2022014071A1 (ja) | 2020-07-17 | 2022-01-20 | 医療法人Yanaga CLinic | 成熟脂肪細胞含有組成物の製造方法 |
WO2023085219A1 (ja) * | 2021-11-11 | 2023-05-19 | 慶應義塾 | 脂肪組織由来間葉系幹細胞株を用いた変形性膝関節症の治療 |
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