JP5958861B2 - Incubator - Google Patents
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Description
本発明は、培養装置、及びその培養装置を含む培養装置システムに関する。 The present invention relates to a culture device and a culture device system including the culture device.
胚性幹細胞(ES細胞)や人工多能性幹細胞(iPS細胞)などの多能性幹細胞は生体のあらゆる組織・臓器の細胞へと分化し得ることから、近年、研究開発が盛んに行われている。これらの多能性幹細胞は、細胞治療の新たな細胞供給源となり得ることから、臨床応用への期待が高まっている。しかし、多能性幹細胞はあらゆる組織の細胞への分化能を有しているがため、未分化な状態を維持しつつ、大量に増幅培養させることが難しく、従来の培養法とは異なる培養法が必要である。多能性幹細胞の未分化状態を維持しつつ増幅培養させる方法として、胚様体(embryoid body:EB)と呼ばれる細胞凝集塊を形成させて培養する方法が知られている。これは、脊椎動物が受精後、卵割を繰り返して形成する胚を模倣するよう、細胞の塊を形成させる培養方法である。胚様体を形成させることにより、胚の発生を模倣し、各種の成長因子等を添加することで任意の細胞へと分化誘導することが可能となる。 Since pluripotent stem cells such as embryonic stem cells (ES cells) and induced pluripotent stem cells (iPS cells) can be differentiated into cells of any tissue or organ in the body, research and development have been actively conducted in recent years. Yes. Since these pluripotent stem cells can be a new cell source for cell therapy, expectations for clinical application are increasing. However, because pluripotent stem cells have the ability to differentiate into cells of any tissue, it is difficult to amplify and culture in large quantities while maintaining an undifferentiated state, and a culture method different from conventional culture methods is necessary. As a method for carrying out amplification culture while maintaining the undifferentiated state of pluripotent stem cells, a method is known in which a cell aggregate called an embryoid body (EB) is formed and cultured. This is a culture method in which a cell mass is formed so that a vertebrate mimics an embryo formed by repeated cleavage after fertilization. By forming an embryoid body, it is possible to mimic embryonic development and induce differentiation into any cell by adding various growth factors and the like.
ES細胞やiPS細胞を分化誘導するには、胚様体形成の過程を経る必要がある。胚様体の形成には様々な手法がある。例えば、低接着性の培養皿を用いる方法や、ハンギングドロップ法と呼ばれる培養皿の蓋に細胞を含む培養液を付着させる方法や、浮遊撹拌培養する方法などが挙げられる。浮遊撹拌による3次元培養は、工程の制御が可能で、且つ、スケールアップに適している。一方、特にヒト由来のES/iPS細胞は、シェアストレスに対して非常に敏感であるため、浮遊撹拌培養において低シェアストレスの撹拌手段が求められる。そのために、例えば、撹拌翼の翼面積を小さくする、撹拌時の翼の先端速度を抑える、などの手段がとられる。胚様体形成では、ES細胞やiPS細胞は未分化性を維持しながら胚様体内で増殖し、胚様体の比重が増すので、このような手段を画一的に採用すると、不均一な培養になり目的とする細胞を高収率で得られない。その主な原因として、培養槽内の液流が不均一な箇所に胚様体が凝集し、さらに比重が増すことにより浮遊撹拌自体が成り立たなくなることが挙げられる。 In order to induce differentiation of ES cells and iPS cells, it is necessary to go through the process of embryoid body formation. There are various methods for the formation of embryoid bodies. For example, a method using a low-adhesion culture dish, a method called a hanging drop method, a method of attaching a culture solution containing cells to the lid of a culture dish, a method of suspension stirring culture, and the like can be mentioned. The three-dimensional culture by floating agitation can control the process and is suitable for scale-up. On the other hand, since human-derived ES / iPS cells are particularly sensitive to shear stress, a means of stirring with low shear stress is required in suspension stirring culture. Therefore, for example, measures such as reducing the blade area of the stirring blade and suppressing the tip speed of the blade during stirring are taken. In embryoid body formation, ES cells and iPS cells proliferate in the embryoid body while maintaining undifferentiation, and the specific gravity of the embryoid body increases. The target cells cannot be obtained in high yield due to culture. The main cause is that the embryoid bodies aggregate at a location where the liquid flow in the culture tank is non-uniform, and the specific gravity increases, so that floating agitation itself does not hold.
また、粒径があまりにも大きくなった胚様体は、胚様体内部の細胞が虚血(低栄養、低酸素)状態に陥り細胞死を助長するし、培地中に添加した分化誘導因子の内部への均一な到達(拡散)にも支障を来す。不均一な粒径の細胞凝集塊が形成された場合には、任意の細胞へ分化させるに際し、添加する栄養、酸素、分化誘導因子等が細胞凝集塊内部に浸透させることができず、細胞生育と分化誘導を阻害してしまう。 In addition, embryoid bodies with a particle size that is too large, cells inside the embryoid body fall into an ischemic (hypotrophic, hypoxic) state and promote cell death. It also hinders uniform access (diffusion) to the inside. When cell aggregates with non-uniform particle sizes are formed, nutrients, oxygen, differentiation-inducing factors, etc. added during cell differentiation cannot penetrate into the cell aggregates, causing cell growth. And will inhibit differentiation induction.
液流の観点からの培養方法としては、従来、撹拌軸に対して一定の傾斜角度で取り付けられた複数枚の翼からなる撹拌翼を用いて撹拌軸に対して鉛直な流れを作り出す方法(軸流培養)や、培養槽底面に対して垂直に立てた数枚の大型パドルや先端が太くなったバルブ形状の撹拌軸を回転することにより水平方向(上からみるとドーナツ状)の流れをつくる方法(層流培養)などが一般的であった。軸流培養は、培養槽内全体を低回転で均一にかき回すために、多枚数の撹拌翼が必要となり、回転によるシェアストレスが増大する恐れがある。また、構造上軸直下に淀みが出来やすく、細胞の増殖に伴って比重が増した細胞凝集塊(胚様体など)が沈殿して均一な粒径の細胞凝集塊が得難いという問題もある。層流培養は、乱流を起こさない程度の回転速度に設定すれば極低シェアストレスの撹拌を実現しやすいが、ドーナツ状の液流の中心部は淀みが出来やすいという問題がある。 As a culture method from the viewpoint of liquid flow, conventionally, a method of creating a flow perpendicular to the stirring shaft using a stirring blade composed of a plurality of blades attached at a fixed inclination angle to the stirring shaft (shaft (Flow culture) and several large paddles standing vertically with respect to the bottom of the culture tank and rotating a valve-shaped stirring shaft with a thick tip to create a horizontal flow (when viewed from above, donut-shaped) The method (laminar flow culture) was common. In axial flow culture, a large number of stirring blades are required to uniformly stir the entire culture tank at a low rotation, which may increase the shear stress due to the rotation. In addition, there is a problem that it is easy to stagnate just below the axis due to the structure, and cell aggregates (embryoid bodies, etc.) having increased specific gravity with the growth of the cells precipitate and it is difficult to obtain cell aggregates of uniform particle size. In laminar flow culture, if the rotational speed is set so as not to cause turbulent flow, it is easy to achieve stirring with extremely low shear stress, but there is a problem that the central part of the donut-shaped liquid flow is likely to stagnate.
そこで、本願出願人は、細胞培養に際し、低シェアストレスで、かつ、培養槽内の液流の淀みのない、特に、底部中心近傍に淀みのない層流培養を可能とし、もって均一な粒径の細胞凝集塊(胚様体など)の集団を、簡便に、且つ、再現性良く得ることが可能な細胞培養装置を開発した(特願2012−131597号)。 Therefore, the applicant of the present application enables laminar flow culture with low shear stress and no stagnation of the liquid flow in the culture tank, particularly without stagnation in the vicinity of the center of the bottom in cell culture. Has developed a cell culture device that can easily and reproducibly obtain a population of cell aggregates (such as embryoid bodies) (Japanese Patent Application No. 2012-131597).
上述したような細胞培養装置によれば、培養槽内の液流を均一化することが可能となる。一方で、培養装置においては、最適な培養状態を保つために培養槽内の培養液中の溶存酸素(DO)、pH、温度、溶存炭酸ガス等の特性を計測するための計測器(計測手段)が備えられている。従来、培養槽内の培養液中の、上記したような特性の計測のために、例えば、溶存酸素の場合ではガルバニ電池式あるいはポーラログラフ式、pHの場合ではガラス複合電極等の棒状のセンサを直接培養槽内に挿入すること等が行われている。かかる手法に使用される従来の計測器には、例えば米国ハミルトン社から販売されている、電極式等の棒状のセンサで培養槽挿入型のものが知られている。 According to the cell culture apparatus as described above, the liquid flow in the culture tank can be made uniform. On the other hand, in the culture apparatus, a measuring instrument (measuring means) for measuring the characteristics of dissolved oxygen (DO), pH, temperature, dissolved carbon dioxide gas, etc. in the culture solution in the culture tank in order to maintain an optimal culture state. ) Is provided. Conventionally, in order to measure the above-described characteristics in a culture solution in a culture tank, for example, in the case of dissolved oxygen, a galvanic cell type or polarographic type is used, and in the case of pH, a rod-shaped sensor such as a glass composite electrode is directly used. Inserting into a culture tank is performed. As a conventional measuring instrument used for such a technique, a rod-type sensor such as an electrode type, which is sold by, for example, Hamilton of the United States, is known.
しかしながら、培養液量が数10mL乃至100mL程度の小容量の培養液中でヒトのiPS細胞等を培養するためには、このような従来の手法では、液量に対する各種センサによる排除体積(すなわち、センサが培養液中に没する部分の体積)が大きすぎるため、培養槽内における均一な撹拌を妨げてしまう虞がある。したがって、培養槽内における均一撹拌を実現するためには、培養槽および撹拌翼の形状の工夫だけでなく、各種センサを均一撹拌の妨げにならない程度にまで小型化することが必要である。 However, in order to cultivate human iPS cells and the like in a small volume of culture solution having a culture volume of several tens to 100 mL, in such a conventional method, an excluded volume (ie, Since the volume of the portion where the sensor is immersed in the culture solution is too large, there is a possibility that uniform stirring in the culture tank may be hindered. Therefore, in order to achieve uniform stirring in the culture tank, it is necessary not only to devise the shape of the culture tank and the stirring blade, but also to reduce the size of various sensors to the extent that they do not interfere with uniform stirring.
センサの小型化のためには、従来型の棒状のセンサの設計を見直すこと、光学式計測方法を導入すること等が考えられるが、センサ等の挿入による排除体積を最小にするためには後者の手法が望ましい。かかるセンサとしては、例えば独国プレセンス社から市販されているパッチ型(スポット)の蛍光プローブ(計測手段の一部、溶存酸素やpHに応じて蛍光特性が変化する性質をもつ発光物質(蛍光物質)が塗布等されたパッチ形状(パッチ型)(例えば、円形等の適宜形状の薄手小片)のもの)と、光ファイバーを介して蛍光プローブへ光を照射し且つ蛍光プローブからの蛍光を受光するための受発光部等を備えた計測器(計測手段の一部)とを別部品としたシステム(センサ)が知られている。このパッチ型の蛍光プローブは、透明なガラス板や樹脂の板、あるいは透明な樹脂フィルム等の表面に発光物質(蛍光物質)塗布する等の手法で構成されており、該蛍光プローブの板面やシート面が培養槽内の培養液中の液面より下に位置するように培養槽内壁に張り付けられている。そして、張り付け面の外側から透明な培養槽壁及び光ファイバーを介して光を照射すると、発光物質が励起して蛍光を発し、この蛍光を光ファイバーを介して培養槽外部に配置される計測器に送り、計測器によって蛍光の強度(位相角)を計測することで、溶存酸素濃度、pH、溶存炭酸ガス等の特性を計測することができるというものである。このシステムによれば、培養槽が透明であり且つ内部に蛍光プローブを張り付けることが可能な構造であれば上述したような従来型の棒状のセンサを培養槽へ挿入して保持するためのノズルまたはコネクタが不要である。 In order to reduce the size of the sensor, it may be possible to review the design of the conventional rod-shaped sensor, introduce an optical measurement method, etc. This method is desirable. As such a sensor, for example, a patch type (spot) fluorescent probe commercially available from Presense, Germany (a part of measuring means, a luminescent substance having a property that the fluorescent characteristic changes depending on dissolved oxygen and pH (fluorescent substance) ) Is applied to the fluorescent probe (patch type) (for example, a thin piece having an appropriate shape such as a circle), and the fluorescent probe is irradiated with light and received from the fluorescent probe. There is known a system (sensor) in which a measuring instrument (a part of measuring means) provided with a light emitting / receiving unit or the like is a separate component. This patch-type fluorescent probe is constituted by a technique such as applying a luminescent substance (fluorescent substance) to the surface of a transparent glass plate, a resin plate, or a transparent resin film. The sheet surface is attached to the inner wall of the culture tank so that the sheet surface is located below the liquid level in the culture liquid in the culture tank. When light is irradiated from the outside of the pasting surface through a transparent culture vessel wall and an optical fiber, the luminescent material is excited to emit fluorescence, and this fluorescence is sent to the measuring instrument arranged outside the culture vessel through the optical fiber. By measuring the intensity (phase angle) of fluorescence with a measuring instrument, it is possible to measure characteristics such as dissolved oxygen concentration, pH, and dissolved carbon dioxide gas. According to this system, a nozzle for inserting and holding a conventional rod-shaped sensor as described above into a culture tank as long as the culture tank is transparent and the fluorescent probe can be attached to the inside. Or a connector is unnecessary.
また、将来的な臨床応用が期待されているヒトiPS細胞の培養等においては、培養槽のシングルユース化(1回限りの使用)が必須となるが、シングルユースタイプの樹脂性培養槽は、培養槽の内壁面に予め蛍光プローブが張り付けられた状態で使用に供される。 In addition, in the culture of human iPS cells, for which future clinical application is expected, it is essential to use a single-use culture tank (one-time use). The fluorescent probe is attached to the inner wall surface of the culture tank in advance.
しかしながら、上述したようなパッチ型の蛍光プローブを用いる場合、使用者は培養槽の使用に際し蛍光ブローブを培養槽内に張り付けるか、あるいはあらかじめ蛍光ブローブが張り付けてある培養槽を使用する。いずれの場合でも張り付けた蛍光ブローブと光ファイバーの先端の位置関係が計測精度に影響するので、蛍光プローブを貼り付けた面の外側で、培養槽壁及び光ファイバーを介して蛍光を確実に受けるために光ファイバーの先端を蛍光プローブに対して適切な位置且つ適切な角度で配置しなければならない。すなわち、蛍光プローブの貼り付け面と光ファイバーの先端との距離は数mm以内で且つ培養槽外壁面での光の乱反射を防ぐために光ファイバーの先端面は培養槽外壁面に常に密着させるようにして装着するための治具を用意しなければならない。 However, when the patch-type fluorescent probe as described above is used, the user attaches a fluorescent probe to the culture vessel when using the culture vessel, or uses a culture vessel on which the fluorescent probe is attached in advance. In any case, the positional relationship between the attached fluorescent probe and the tip of the optical fiber affects the measurement accuracy, so an optical fiber is used to reliably receive the fluorescence through the culture vessel wall and the optical fiber outside the surface to which the fluorescent probe is attached. Must be placed at an appropriate position and at an appropriate angle with respect to the fluorescent probe. In other words, the distance between the fluorescent probe attachment surface and the tip of the optical fiber is within a few millimeters, and the tip of the optical fiber is always in close contact with the outer wall of the culture vessel in order to prevent irregular reflection of light on the outer wall of the culture vessel. A jig to do this must be prepared.
一方、このような単純な蛍光プローブは単回使用の使い捨てが可能であり、同じく使い捨ての培養槽と組み合わせて滅菌済状態で提供することにより、使用者の培養準備に要する時間を大幅に短縮することができる。ところが、蛍光ブローブには作製されてから初期の蛍光特性を維持できる期限、いわゆる使用期限が定められているため、蛍光ブローブがあらかじめ張り付けられた培養槽の使用期限は、蛍光プローブの使用期限に制約されてしまうという問題点がある。また、培養槽の使用中に蛍光ブローブのみを交換することは不可能である。 On the other hand, such a simple fluorescent probe can be used once and can be disposed of in a sterilized state in combination with a disposable culture tank, thereby greatly reducing the time required for user preparation for culture. be able to. However, because the fluorescent probe has a time limit for maintaining the initial fluorescence characteristics after it is manufactured, the so-called expiration date is set, so the expiration date of the culture vessel in which the fluorescent probe is attached in advance is limited by the expiration date of the fluorescent probe. There is a problem of being done. In addition, it is impossible to exchange only the fluorescent probe during use of the culture tank.
本発明は、上記問題点を解決するためになされたものであり、センサによる培養槽内の排除体積を最小限とするとともに、蛍光プロ−ブの交換が極めて容易であること、そして、蛍光プロ−ブと、該蛍光プロ−ブへ光を照射し且つ蛍光プロ−ブからの蛍光を受光する光ファイバーの先端との相対的な位置決めを容易に行うことができる培養装置、及び該培養装置を含む培養装置システムを提供することを目的とする。 The present invention has been made to solve the above-mentioned problems, minimizes the volume excluded in the culture vessel by the sensor, and makes it very easy to exchange the fluorescent probe. A culture apparatus capable of easily performing relative positioning between the probe and the tip of an optical fiber that irradiates light to the fluorescence probe and receives fluorescence from the fluorescence probe, and the culture apparatus An object is to provide a culture apparatus system.
上記課題を解決するために、本発明は、光ファイバーを介して、培養液の所定の特性を計測するための計測手段が取り外し可能に培養槽に接続される培養装置を提供する。この培養装置において、培養槽は、全体として略円筒形状を有しており、培養槽は、前記培養槽の側壁から半径方向外方へ延びる、全体として円筒形状のポートを備え、前記ポートは、該ポートの長手方向軸線が前記略円筒形状の培養槽の中心軸線に対して垂直になるように配設されており、前記培養装置は、計測手段の前記光ファイバーを着脱可能に受け入れる光ファイバー受け入れ部を有する、ポートに嵌合可能なセンサコネクタであって、円筒形状の先端側部と基端側部との2区画を有する全体として円筒形状を有しており、先端側部が外側の外筒部と前記外筒部より内側に配置される内筒部とを有する、センサコネクタを備えている。培養槽のポートは、培養槽の側壁側の内側端部と、内側端部とは反対側の外側端部と、センサコネクタを受け入れる通路を画成する内周面とを有し、ポートの外側端部に隣接する部分には、半径方向外側に向かって突出するねじ条が形成されており、ポートの内周面は、外側端部から内側端部に向かって先細りするように形成されており、センサコネクタの内筒部の外周面は、該内筒部の先端に向かって先細りするように形成されている。センサコネクタの外筒部の内周面には、ポートのねじ条とねじ係合可能なねじ条が形成されており、センサコネクタの内筒部の先端は先端壁部により閉じられている。先端壁部はセンサコネクタの中心軸線に対して垂直であり、先端壁部の外側面には、光ファイバーを介して照射された光により培養液の所定の特性に対応した蛍光を発光する蛍光物質を含む蛍光プローブが固着されており、前記センサコネクタの、前記内筒部及び前記外筒部より前記培養槽から遠い部分に、光ファイバーを前記センサコネクタ内に保持するためのストッパが設けられる。 In order to solve the above-described problems, the present invention provides a culture apparatus in which a measuring means for measuring a predetermined characteristic of a culture solution is detachably connected to a culture tank via an optical fiber. In this culture apparatus, the culture tank has a substantially cylindrical shape as a whole, the culture tank includes a generally cylindrical port extending radially outward from the side wall of the culture tank, The longitudinal axis of the port is arranged so as to be perpendicular to the central axis of the substantially cylindrical culture tank, and the culture device has an optical fiber receiving portion for removably receiving the optical fiber of the measuring means. A sensor connector that can be fitted to a port, and has a cylindrical shape as a whole, having two sections of a cylindrical tip side portion and a base end side portion, and the tip side portion is an outer outer cylinder portion And a sensor connector having an inner cylinder portion disposed inside the outer cylinder portion. The port of the culture tank has an inner end on the side wall side of the culture tank, an outer end opposite to the inner end, and an inner peripheral surface defining a passage for receiving the sensor connector. A thread projecting outward in the radial direction is formed in a portion adjacent to the end, and the inner peripheral surface of the port is formed so as to taper from the outer end toward the inner end. The outer peripheral surface of the inner cylindrical portion of the sensor connector is formed to taper toward the tip of the inner cylindrical portion. On the inner peripheral surface of the outer cylindrical portion of the sensor connector, a thread that can be screw-engaged with the thread of the port is formed, and the tip of the inner cylindrical portion of the sensor connector is closed by a tip wall portion. The tip wall is perpendicular to the center axis of the sensor connector, and on the outer surface of the tip wall is a fluorescent material that emits fluorescence corresponding to the predetermined characteristics of the culture solution by light irradiated through the optical fiber. A fluorescent probe is fixedly attached, and a stopper for holding the optical fiber in the sensor connector is provided in a portion of the sensor connector farther from the culture tank than the inner cylinder part and the outer cylinder part.
センサコネクタの前記内筒部の長さは、前記センサコネクタを前記ポートに取り付けたときに前記内筒部の前記先端壁部が前記培養槽の前記側壁の内面と面一となる長さとすることが好ましい。 The length of the inner cylinder part of the sensor connector is such that the tip wall part of the inner cylinder part is flush with the inner surface of the side wall of the culture tank when the sensor connector is attached to the port. Is preferred.
前記センサコネクタの先端壁部の外側面に固着される蛍光プローブはパッチ形状(パッチ型)であることが好ましい。 It is preferable that the fluorescent probe fixed to the outer surface of the tip wall portion of the sensor connector has a patch shape (patch type).
ポートを雌ルアーコネクタとして形成し、前記センサコネクタを雄ルアーコネクタとして形成してもよい。 The port may be formed as a female luer connector and the sensor connector may be formed as a male luer connector.
また、上述したような培養装置と、該培養装置の前記蛍光プローブに光ファイバーを介して光を照射し、該蛍光プローブより発光された蛍光を受け取るための受発光部を有する計測手段とを備える、培養装置システムを構成することも可能である。 Further, the culture apparatus as described above, and a measuring means having a light emitting and receiving unit for irradiating the fluorescent probe of the culture apparatus with light through an optical fiber and receiving fluorescence emitted from the fluorescent probe, It is also possible to configure a culture apparatus system.
以上の構成を備えた本発明によれば、先端壁部に蛍光プローブを貼り付けたセンサコネクタを培養槽のポートに取り付けたとき、センサコネクタの先端壁部の培養槽内壁面に対する位置が個人差なく常に実質的に画一となる構造であるため、蛍光プローブの培養槽内に対する排除体積を実質的になくすことが可能となる。 According to the present invention having the above-described configuration, when the sensor connector having the fluorescent probe attached to the tip wall portion is attached to the port of the culture tank, the position of the tip wall portion of the sensor connector relative to the inner wall surface of the culture tank varies depending on the individual. Since the structure is always substantially uniform, it is possible to substantially eliminate the excluded volume of the fluorescent probe in the culture tank.
また、センサコネクタの先端壁部と反対側に配置された光ファイバの導入口からセンサコネクタの内筒部の内部に光ファイバを突き当たるまで挿入したときの光ファイバの先端部は、センサコネクタの先端壁部の内壁面に正確に配置され、センサコネクタに設けられたストッパがセンサコネクタの先端部に貼り付けた蛍光プローブに対する光ファイバの先端部の位置を固定的に保持することが可能となる。 In addition, the tip of the optical fiber when inserted until the optical fiber hits the inner tube of the sensor connector from the optical fiber inlet disposed on the side opposite to the tip wall of the sensor connector is the tip of the sensor connector. It is possible to fix the position of the distal end portion of the optical fiber with respect to the fluorescent probe attached to the distal end portion of the sensor connector, with the stopper provided on the sensor connector accurately disposed on the inner wall surface of the wall portion.
更に、蛍光プローブをセンサコネクタごと培養槽から取り外し可能にしたことにより、蛍光プローブと培養槽とをそれぞれ個別に提供することを可能とし、使用期限が大きく異なる構成要素を個別に在庫管理することができるようになる。 Furthermore, since the fluorescent probe can be detached from the culture tank together with the sensor connector, it is possible to provide the fluorescent probe and the culture tank individually, and inventory management of components with greatly different expiration dates can be performed. become able to.
本発明を実施するための形態を、図面を参照しつつ、以下に説明する。 A mode for carrying out the present invention will be described below with reference to the drawings.
図1は、本実施形態に係るセンサコネクタが適用される培養装置1の培養槽10(蓋部は不図示)を示す図である。また、図2(A)は図1に示した培養槽の縦断面図であり、(B)は正面図であり、(C)は上面図である。図3は、図2に示した培養槽に撹拌手段、及びセンサコネクタを取り付けた状態の培養装置を示す縦断面図である。 FIG. 1 is a diagram showing a culture tank 10 (a lid portion is not shown) of a culture apparatus 1 to which a sensor connector according to this embodiment is applied. 2A is a longitudinal sectional view of the culture tank shown in FIG. 1, FIG. 2B is a front view, and FIG. 2C is a top view. FIG. 3 is a longitudinal sectional view showing the culture apparatus in a state where the agitation means and the sensor connector are attached to the culture tank shown in FIG.
本発明の培養装置1は、光ファイバーを介して培養液の所定の特性、例えば、溶存酸素、pH、温度、溶存炭酸ガス等を計測するための蛍光プローブ(計測手段の一部)、この蛍光プローブに光を照射し、蛍光プローブが発光した蛍光を受光する受発光部に連結される光バイバー(計測手段の一部)等が、取り外し可能(着脱自在)に培養槽10に接続されたものである。
The culture apparatus 1 of the present invention includes a fluorescent probe (a part of the measuring means) for measuring predetermined characteristics of a culture solution, for example, dissolved oxygen, pH, temperature, dissolved carbon dioxide gas, etc., via an optical fiber, and this fluorescent probe. A light viver (part of the measuring means) connected to the light emitting / receiving unit that receives the fluorescence emitted from the fluorescent probe and receives the fluorescence emitted from the fluorescent probe is detachably (detachably) connected to the
培養槽10は全体的に略円筒形状を有しており、培養槽10内には、培養槽10の底面17の中央から上下方向に立設され且つ培養槽10の底面に固着される支柱(撹拌軸)20と、支柱20に回転可能に取り付けられた撹拌手段30とが設けられる。支柱20は、その中心軸線14が培養槽10の中心軸線と同軸となるように配置される。
The
支柱20は、培養槽10内の底面17への固定部が下方向に拡径する円錐状に形成された円錐状部分22を有しており、培養液の回転による底部中心近傍の液流の淀みは、その部分が円錐状部分22で占められていることから生じる余地もなく、従って、細胞増殖に伴って比重が増大した細胞凝集塊の沈殿はない。支柱20は、培養槽10に固着されるのではなく、成形時に一体的に形成されてもよい。支柱20の上部分24には、撹拌手段30が回転可能に取り付けられる。支柱20において、円錐部分22の上部から上部分24までの部分の太さ等については特に制限はされないが、支柱20の強度を確保する観点から、下部を太くして上方向に徐々に縮径とするのが好ましい。
The
培養槽10は、その側壁11から半径方向外方へ突出するポート12を備える。ポート12は、その長手方向軸線13が培養槽10内の支柱20の中心を通る中心軸線14に対して垂直となるように、培養槽10の下方部分に設けられている。ポート12の内側端部12aは培養槽10の内壁面(側壁11の内壁面)と面一となるようになされている。また、ポート12の外側端部12bには2条のねじ条12cが設けられている。ポート12は、後述するセンサコネクタと嵌合(螺合)する雌ルアーコネクタとして構成されてもよい。ポート12の内周面12dは基端側(図2(A)における左側)に向かって先細りするテーパー形状に形成される。なお、ポート12のねじ条12c以外の外周面は、内周面12dと同様にしてテーパー形状に形成してもよく、同径に形成してもよい。
The
培養槽10にはまた、ポート12の上方に、培養槽10の側壁11から半径方向外側へ斜め上方へ突出するポート15が設けられ、さらに、培養槽10の、中心軸線14を中心にしてポート15から180度離れ且つポート15より上方の位置に、側壁11から半径方向外側へ斜め上方へ突出するポート16が設けられている。ポート13、15、16は、培養槽10の成形時に一体的に形成することができ、あるいは、別体として成形した後にポート13、15、16を培養槽10に固着することができる。
The
培養槽10には培養液が入れられる。従って、培養槽10および支柱20は、培養液成分に不活性で細胞毒性を有さず、且つ、滅菌(除染、除菌又は無菌ともいう。)処理に対して耐性を有する材料で形成されることが好ましく、例えばガラス、合成樹脂、ステンレス鋼などが挙げられる。培養槽10の内容量、形状などは培養液の量に応じて適宜決定される。培養槽10の内容量(全容量)としては特に限定されないが、例えば20ml乃至1000ml等が挙げられる。撹拌と通気の効率の観点から、培養槽10の形状は、所望量の培養液を投入した際に、培養槽内の直径と液深が1:1となり、内容量に対して培養液の所定量が半分程度なるように設計するのが好ましい。
A culture solution is placed in the
撹拌手段30は、培養液に不活性で、且つ、耐性を有する材料で形成されることが好ましく、例えば合成樹脂、ステンレス鋼などが挙げられる。撹拌翼34も、培養液に不活性で、且つ、耐性を有する板材で形成されることが好ましく、例えば薄板状の合成樹脂、ステンレス鋼(例えば1mm厚のSUS316)などが挙げられる。撹拌手段30の撹拌翼34は、その下端にテトラフルオロエチレン等で被覆の磁力体(永久磁石等)36を有している。この磁力体36は、撹拌翼34の先端下部を折り曲げ加工された部分によって固定され保持されることができる。
The stirring means 30 is preferably formed of a material that is inert to the culture medium and has resistance, and examples thereof include synthetic resins and stainless steel. The stirring
ここで、図3には左右2枚の撹拌翼34が示されているが、本発明はこれに限定されるものではない。撹拌翼34の数については、撹拌手段の回転数にもよるが、支柱20を中心に等間隔に備えるのが、撹拌時における撹拌翼34のバランスから好ましく、例えば2〜4枚が好適である。また、細胞培養時の撹拌手段の回転数については、特に制限されず、低シェアストレス、細胞凝集塊の沈殿の防止等が確保される回転数が適宜選択して採用されが、例えば、10〜80rpmが好ましい。
Here, although two right and left stirring
さらに、培養槽10の上方には、該壁面17から外側へ突出するねじ条18が設けられる。これは培養槽10に蓋部(不図示)をねじ固定するためのものである。
Further, a
図4(A)は、本発明のセンサコネクタの正面図であり、図4(B)は図4(A)のX−X線で切断した場合の断面図である。本発明において、センサコネクタは円筒形状の先端側部と基端側部との2区画からなる、全体として円筒形状に形成される。図4において、センサコネクタ40は、ルアーコネクタの雄ルアーコネクタであり、円筒形状の先端側部(図4における左側部)である大径部Aと基端側部(図4における右側部)である小径部Bとの2区画からなる、全体として段付き円筒形状に形成されている。なお、本発明においては、上記のごとく、段付きであってよく、段なしであっても、勿論よい。
4A is a front view of the sensor connector of the present invention, and FIG. 4B is a cross-sectional view taken along line XX of FIG. 4A. In the present invention, the sensor connector is formed in a cylindrical shape as a whole, which is composed of two sections of a cylindrical distal end side portion and a proximal end side portion. 4, the
センサコネクタ40の先端側部の大径部Aは、外筒部42と、内筒部44とを備えて構成されている。外筒部42と内筒部44は、大径部Aの基端側において内側底面42bにより接続されている。外筒部42は、その内面に、ポート12のねじ条12cと係合するねじ条42aを備えている。内筒部44の外周面44aは、先端側に向かって先細りするテーパー形状に形成されている。なお、内筒部44の内周面44bは、外周面44aと同様にしてテーパー形状に形成してもよく、同径に形成してもよい。内筒部44の外周面44aは、例えば雌ルアーコネクタと同様の機能を奏するポート12の内周面12dに当接する面である。内筒部44の外周面44aが先端側に向かって先細りするテーパー形状であるため、ポート12にセンサコネクタ40を嵌合させると、ポート12の内周面12dと内筒部44の外周面44aとが液密的に当接した状態で固定される。
The large-diameter portion A at the distal end side portion of the
内筒部44は、その長さ、すなわち外筒部42の内側底面42bから内筒部44の先端壁部48の外側面48aまでの長さが、センサコネクタ40を培養槽10のポート12に嵌合させたときに、外側面48aが培養槽10の内壁面と実質的に面一になるような長さとなるように形成される。なお、センサコネクタ40の内筒部44の長さは、後記する蛍光プローブの厚さをも考慮して設計してもよい。このように設計するのは、外側面48aが培養槽10の内壁面より突出しすぎると撹拌翼34の動きを妨げたり、撹拌に乱れが生じて均一な撹拌を妨げてしまう虞があり、また、培養槽の内壁面まで達しないと、培養液の流れに淀みが生じる可能性があるからである。
The length of the inner
センサコネクタ40の内筒部44内部には、光ファイバー46を挿入するための通路47が形成されており、通路47の先端側(図4における左側)は先端壁部48によって閉じられている。先端壁部48の外側面48aは、センサコネクタ40の中心軸線に対して垂直な方向に延び、この外側面48aには、光の照射により蛍光を発する蛍光プローブ49、例えば、パッチ型蛍光プローブ等が固着される。蛍光プローブの外側面48aへの固着方法については特に制限されないが、例えば、パッチを貼り付ける方法、蛍光物質を外側面48aに直接塗布したり焼付けたりする方法等がある。なお、パッチ型蛍光ブローブは、上記したごとく、パッチ形状のもので、例えば、円形等の適宜形状の薄手小片の蛍光プローブであり、このような形態とすることは取り扱いが容易となるので好ましい。また、蛍光プローブ49として、培養液内の溶存酸素濃度に応答する蛍光を発光する発光物質(蛍光物質)、例えば、金属ポルフィリン錯体等を含む蛍光プローブだけでなく、培養液のpH、温度、溶存炭酸ガス等に応答する発光物質を含む蛍光プローブを固着させたセンサコネクタを用意することも可能であり、従って、多種類のプローブから、使用者が必要に応じて蛍光プローブを選択し、所望の特性の計測を行うことが可能となる。蛍光プローブ49は、パッチ表面に蛍光物質を塗布したものでもよく、パッチ自体に含浸させたものでもよく、先端壁部48の外側面48aに直接塗布したもの等として構成されてもよい。なお、これらの特性を計測する各種蛍光プローブ49としては、公知のものが有効に用いられる。また、例えば、蛍光プローブ49がパッチ型の場合には、その厚さは通常約1mm未満と薄く、透明な接着剤(例えば、シリコン接着剤等)等で先端壁部48の外側面48aに固着される。センサコネクタ40は、光ファイバー46を介して短時間の発光と受光を交互に繰り返す公知の受発光部(不図示)により蛍光プローブ49への光の照射、蛍光プローブ49からの蛍光の受光ができるように、光透過性の材料で形成されることが好ましいが、この目的のためには、センサコネクタ40の少なくとも先端壁部48が光透過性の材料で形成されていればよい。先端壁部48の外側面48aと内側面48bとの間の距離(先端壁部48の厚さ)は、蛍光プローブ49と光ファイバーの先端部との間の距離であり、従って計測される蛍光の強度に影響を与えるため、できるだけ薄く、約1mm未満とすることが好ましい。
A
センサコネクタ40の基端側部の小径部Bは、光ファイバー46を受け入れる光ファイバー受け入れ部として構成されており、その内側の空洞部分には、光ファイバー46が容易に脱落しないように光ファイバー46をセンサコネクタ40内に保持することができるストッパ50が内嵌される。図4に示すように、ストッパ50は、ストッパ50の中心軸線がセンサコネクタ40の中心軸線と同軸となるように配置される。ストッパ50は、光ファイバー46が通る通路51を有し、また、ストッパ50の先端(図4における左側)には、ストッパ50の内方へ向かって且つストッパ50の先端側へ向かって角度をもって延びるリップ部52を備えている。リップ部52の先端は開口しており、その開口部分は挿入される光ファイバー46の外径より小さい内径を有する。小径部Bには複数(図4の例では2つ)の穴43が設けられており、穴43にはストッパ50の外周面上に形成される突起54が挿入され、ストッパ50がセンサコネクタ40から抜けないようにストッパ50を保持する。ストッパ50は、光ファイバー46をリップ部52において容易に移動しないように保持するために、弾性のある材料、例えばゴムにより形成されることが好ましい。
The small-diameter portion B on the proximal end side of the
また、センサコネクタ40の外面には、センサコネクタ40をポート12へ嵌合させるときに使用者がセンサコネクタを容易に回転させることができるようにする翼部45が複数(図4の例では2つ)設けられる。
Further, the outer surface of the
センサコネクタ40の材料については、前記のごとく、少なくとも先端壁部48が光透過性、且つ自家蛍光を有しない材料で形成されていれば特に制限されないが、例えば、合成樹脂(例示:、ポリカーボネート、ポリスチレン)等が好適なものとして挙げられる。
As described above, the material of the
図3に示したように、上記構成を有するセンサコネクタ40を回転させて、センサコネクタ40の最も深い位置で培養槽10のポート12がに取り付けられたとき、センサコネクタ40およびポート12は、センサコネクタ40の中心軸線とポート12の中心軸線とが同軸となるように互いに対して位置決めされる。このとき、センサコネクタ40の先端壁部48の外側面48aが培養槽10の内壁面と実質的に面一になる。従って、撹拌翼34の動きを妨げたり、培養液内の淀みを生じたりすることを抑制することが可能となる。そして、センサコネクタ40とポート12の上述したようなテーパー形状により、面と面とが互いに摩擦係合し、センサコネクタ40が培養槽10の内壁面から飛び出たり引っ込んだりしないように位置が固定される。位置が固定された状態では、上述したように蛍光プローブ49がセンサコネクタ40の中心軸線に対して垂直に形成されていることから、光ファイバー46も蛍光プローブ49に対して垂直となるように位置決めされている。従って、蛍光プローブ49と光ファイバー46との互いに対する位置及び角度関係を適切な状態とすることが容易となり、光ファイバー46及び蛍光プローブ49を培養槽10へ取り付ける際の作業も、従来と比較して非常に簡便なものとなる。また、センサコネクタ40に光ファイバー46を、該光ファイバー46の先端がセンサコネクタ40の通路47の底面(先端壁部48の内側面48b)に突き当たるまで挿入することにより、蛍光プローブ49と光ファイバー46の先端との距離は正確に保持され、再現性(すなわち、両者の距離や角度が常に適切に位置決めされること)が良好となる。また、上記テーパー形状により、センサコネクタ40はポート12に液密的に固定されるので、培養液のポート12からの漏出は防止される。
As shown in FIG. 3, by rotating the
なお、ポート12は、様々な寸法・形状の容器に取り付けることができ、例えば様々な容積の培養槽に共通のルアーテーパを有するポート12を備えることにより、同一のセンサコネクタ40を使用することができるので、大幅なコストダウンを図ることが可能となる。
In addition, the
また、既存の培養槽においては、培養液を培養槽の外部で循環するラインに共通の、ポート12と同様のルアーテーパーを有するポートを設けたフローセルを設けることにより、本発明のセンサコネクタ40を使用することが可能となる。
In addition, in the existing culture tank, the
さらに、上述したポート12と同様のルアーテーパーを公知の培養用バッグの適宜位置に取り付け、同様にしてセンサーコネクタ40を使用することもできる。
Furthermore, the same luer taper as that of the
さらにまた、上記したように、培養液内の溶存酸素濃度に応答する蛍光を発光する蛍光物質を含む蛍光プローブだけでなく、培養液のpH等に応答する蛍光物質を含む蛍光プローブを固着させたセンサコネクタを用意することも可能であり、従って、多種類の蛍光プローブから、使用者が必要に応じて蛍光プローブを選択し、所望の特性の計測を行うことが可能となる。勿論、上述した実施形態のようにポート12の個数は1つに限定されるものではなく、計測したい特性の数に応じて複数のポート12を設けるようにしてもよいことはいうまでもない。
Furthermore, as described above, not only a fluorescent probe containing a fluorescent substance that emits fluorescence in response to the dissolved oxygen concentration in the culture solution, but also a fluorescent probe containing a fluorescent substance that responds to the pH of the culture solution, etc. were fixed. It is also possible to prepare a sensor connector. Therefore, the user can select a fluorescent probe from various types of fluorescent probes as necessary, and perform measurement of desired characteristics. Needless to say, the number of
なお、本発明の培養装置は、使い捨てとすることもできる。 The culture apparatus of the present invention can be disposable.
10 培養槽
11 側壁
12 ポート
12a 内側端部
12b 外側端部
12c ねじ条
12d 内周面
40 センサコネクタ
A 大径部
B 小径部
42 外筒部
42a ねじ条
43 穴
44 内筒部
44a 外周面
44b 内周面
46 光バイバー
48 先端壁部
48a 外側面
48b 内側面
49 蛍光プローブ
50 ストッパ
51 通路
52 リップ部
54 突起
DESCRIPTION OF
Claims (5)
前記培養槽は、全体として略円筒形状を有しており、
前記培養槽は、前記培養槽の側壁から半径方向外方へ延びる、全体として円筒形状のポートを備え、前記ポートは、該ポートの長手方向軸線が前記略円筒形状の培養槽の中心軸線に対して垂直になるように配設されており、
前記培養装置は、前記計測器の前記光ファイバーを着脱可能に受け入れる光ファイバー受け入れ部を有する、前記ポートに嵌合可能なセンサコネクタであって、前記センサコネクタは、円筒形状の先端側部と基端側部との2区画を有する全体として円筒形状を有しており、前記先端側部は、外側の外筒部と、前記外筒部より内側に配置される内筒部とを有する、センサコネクタを備え、
前記ポートは、前記培養槽の側壁側の内側端部と、前記内側端部とは反対側の外側端部と、前記センサコネクタを受け入れる通路を画成する内周面とを有し、前記ポートの前記外側端部に隣接する部分には、半径方向外側に向かって突出するねじ条が形成されており、前記ポートの内周面は、前記外側端部から前記内側端部に向かって先細りするように形成されており、
前記センサコネクタの前記内筒部の外周面は、該内筒部の先端に向かって先細りするように形成されており、
前記センサコネクタの前記外筒部の内周面には、前記ポートのねじ条とねじ係合可能な、ねじ条が形成されており、
前記センサコネクタの前記内筒部の先端は先端壁部により閉じられており、前記先端壁部は前記センサコネクタの中心軸線に対して垂直であり、前記先端壁部の外側面には、前記光ファイバーを介して照射された光により培養液の所定の特性に対応した蛍光を発光する蛍光物質を含む蛍光プローブが固着されており、
前記センサコネクタの、前記内筒部及び前記外筒部より前記培養槽から遠い部分に、光ファイバーを前記センサコネクタ内に保持するためのストッパが設けられる
ことを特徴とする、培養装置。 A culture device in which a measuring means for measuring a predetermined characteristic of a culture solution is detachably connected to a culture tank via an optical fiber,
The culture tank has a substantially cylindrical shape as a whole,
The culture tank includes a generally cylindrical port extending radially outward from a side wall of the culture tank, and the port has a longitudinal axis of the port with respect to a central axis of the substantially cylindrical culture tank. Are arranged so as to be vertical,
The culture apparatus has a fiber optic receiving portion that removably receives the optical fiber of the measuring instrument, and is a sensor connector that can be fitted to the port. The sensor connector has a cylindrical distal end side and a proximal end side. A sensor connector having a cylindrical shape as a whole having two sections with a portion, wherein the tip side portion includes an outer cylindrical portion on the outside and an inner cylindrical portion disposed on the inner side of the outer cylindrical portion. Prepared,
The port has an inner end on the side wall side of the culture tank, an outer end opposite to the inner end, and an inner peripheral surface that defines a passage for receiving the sensor connector. A thread projecting outward in the radial direction is formed in a portion adjacent to the outer end of the port, and the inner peripheral surface of the port tapers from the outer end toward the inner end. Is formed as
The outer peripheral surface of the inner cylinder part of the sensor connector is formed to taper toward the tip of the inner cylinder part,
On the inner peripheral surface of the outer tube portion of the sensor connector, a thread that can be threadedly engaged with the thread of the port is formed,
The tip of the inner tube portion of the sensor connector is closed by a tip wall portion, the tip wall portion is perpendicular to the central axis of the sensor connector, and the optical fiber is disposed on the outer surface of the tip wall portion. A fluorescent probe containing a fluorescent substance that emits fluorescence corresponding to a predetermined characteristic of the culture solution by light irradiated through is fixed.
A culture apparatus, wherein a stopper for holding an optical fiber in the sensor connector is provided in a portion of the sensor connector farther from the culture tank than the inner cylinder part and the outer cylinder part.
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