JP5956533B2 - 放射ターゲット薬物調製用キット及び放射ターゲット薬物の調製方法及び用途 - Google Patents
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Description
本発明は放射ターゲット薬物調製用キット及び放射ターゲット薬物の製造方法及び用途に係り、該放射性医薬品はリポソームに放射性核種を内包させたもので、腫瘍生長と進展を抑制し並びに転移を抑制でき、頭頸癌、肺癌、脳癌、及びその転移性疾病等の治療に用いられ得るものに関する。
既知の腫瘍細胞生長過程中、血管の新生により養分を供給して、それを急速に生長させる必要がある。しかし、腫瘍内の新生血管と正常組織は大きく異なり、腫瘍細胞の生長は、血管新生過程中に、血管発育不全を形成し、多くの孔を発生し、その大きさはミクロンレベルであり、この弛緩した構造は透過性を増加し得るため、薬物が容易にこの部分から腫瘍細胞間隙中にしみこみ、さらに腫瘍組織は正常な構造のリンパネットワークが欠乏しているため、薬物が一旦腫瘍細胞間隙に進入すると、正常なリンパ組織から分離させることは非常に難しく、このため、薬物の腫瘍細胞間隙での停留時間が延長され、これがすなわち、透過性亢進及び停滞効果（Enhanced Permeability and Retention(EPR)effect)とされる。この特性により、サイズが１００〜２００ｎｍのナノ薬物は相当に大きな発展の潜在力を有する。
リポソーム(liposome)は、１９６０年代に、英国科学者Alec Banglham により発見され、リポソーム構造は、リン脂質二重層とされ、その構成は細胞膜と同じであり、良好な生物的適合性を有し、且つ生物体内で分解可能である。リン脂質のリン酸端は親水性であり、脂質端は疎水性とされ、疎水性(hydrophobic)と親水性(hydrophilic)の薬品担体とされ得る。リポソームの粒径は数十ナノメータ（ｎｍ）から数十ミクロン（μｍ）の間にあり、リポソームが人体血管に進入するとき、正常組織の血管は、血管内皮細胞間隙が密着するため、リポソームが進入しにくい。腫瘍部位は腫瘍の血管新生の内皮細胞間隙が比較的大きいため、ＥＰＲ効果を形成し、これによりリポソームが腫瘍血管細胞間隙に進入しやすくなり、ゆえにリポソームが大量に腫瘍部位に累積し、その薬物治療効果をアップすることができる。これにより、もし治療用放射性核種をリポソーム中に被包すれば、すなわち、放射性核種が放出するβ粒子により癌治療効果を達成できる。現在、放射性同位元素でリポソーム上に標識する方法は、大まかに二種類の方式に分けられ、そのうち一種類の方法は、表面標識法(surface labeling)であり、現在、この方法が使用されることは比較的少なく、それは、放射性同位元素で表面にキレート剤を有するリポソームを標識する。もう一種類の方法は、アフターローディング(after loading)方式であり、すなわち最もよく使用されている方式であって、たとえば、Bao氏等は、レニウム188とレニウム186及びテクネチウム99mで標識したＢＭＥＤＡ（N,N‐ビス(2‐メルカプトエチル)‐N,N‐ジエチレンジアミン；N,N‐bis(2‐mercaptoethyl)‐N,N‐diethylenediamine ）をリポソーム内に内包させ、並びに正常ラットの放射診断造影剤或いは放射治療に使用する基礎研究がある（ 非特許文献１及び２、及び特許文献１）。
これらの方法の共通の特徴は以下のとおりである。すなわち、
（１）放射性同位元素は脂性キレート剤或いはイオノフォア(ionophore)を通してでなければリポソーム内に進入できず、これにより、この過程は、まず放射性同位元素でキレート剤を標識しなければならない。
（２）リポソームに進入した後、放射性同位元素はその他のキレート剤或いは緩衝液と反応しなければ、リポソーム内に安定して停留できない。
そして同様に以下の欠点も有する。
（１）使用するＢＭＥＤＡキレート剤は液体であり、該キレート剤は容易に酸化されるため、レニウム188とテクネチウム99mを標識するとき、標識効率が下がりやすい。
（２）内包効率が高くない（一般的な効率は６０−８０％）ため、余計に純化ステップが必要である。
（３）標識キットは長時間保存が難しく、毎回反応を行うたびに調製しなければならず、且つ全体的に標識過程が複雑であり、比較的時間がかかる。反応時間が増加し内包効率が高くなく純化の必要があるために時間が増加することで、放射性薬物の使用期限が短くなり且つ放射源等の原料が浪費され、時間に伴い減衰し放射活性が下がる放射性薬物（たとえばレニウム188核種は、その半減期が１６．９時間である）には不利であり、ゆえに、使用する放射性薬物の種類は制限され、薬物の生産或いは臨床の使用に不利である。
これらの方法の共通の特徴は以下のとおりである。すなわち、
（１）放射性同位元素は脂性キレート剤或いはイオノフォア(ionophore)を通してでなければリポソーム内に進入できず、これにより、この過程は、まず放射性同位元素でキレート剤を標識しなければならない。
（２）リポソームに進入した後、放射性同位元素はその他のキレート剤或いは緩衝液と反応しなければ、リポソーム内に安定して停留できない。
そして同様に以下の欠点も有する。
（１）使用するＢＭＥＤＡキレート剤は液体であり、該キレート剤は容易に酸化されるため、レニウム188とテクネチウム99mを標識するとき、標識効率が下がりやすい。
（２）内包効率が高くない（一般的な効率は６０−８０％）ため、余計に純化ステップが必要である。
（３）標識キットは長時間保存が難しく、毎回反応を行うたびに調製しなければならず、且つ全体的に標識過程が複雑であり、比較的時間がかかる。反応時間が増加し内包効率が高くなく純化の必要があるために時間が増加することで、放射性薬物の使用期限が短くなり且つ放射源等の原料が浪費され、時間に伴い減衰し放射活性が下がる放射性薬物（たとえばレニウム188核種は、その半減期が１６．９時間である）には不利であり、ゆえに、使用する放射性薬物の種類は制限され、薬物の生産或いは臨床の使用に不利である。
現在、リポソームで治療用放射核種、たとえば、レニウム188、レニウム186を内包したものを、多項目の癌たとえば、大腸直腸癌、頭頸癌、乳癌等の動物に対して応用した治療研究があり、たとえば、2010年にFrenchが、リポソームでレニウム186放射性核種を内包したものを、頭頸部鱗状細胞癌動物モデル（Head and Neck SCC Xenografts in Nude Rats)の治療に応用した治療効果評価（非特許文献３）がある。それによると、局部腫瘍部位に185MBqの186Re-リポソームで１４日間治療したところ、腫瘍サイズの平均は、87.7±20％（P<0.001）下がり、腫瘍部位平均輻射吸収剤量は、526.3±93.3 Gyであり、ただ186Re或いは186Re-BMEDA を投与したグループよりもはるかに高かった。且つ186Re-リポソームを投与した後にはいかなる毒性反応も見られなかった。このことから分かるように、186Re-リポソームは、頭頸癌を治療するのに有効であり且つその副作用は小さい。2012年、Philipsは、186Re-リポソームを神経膠芽腫（glioblastoma）の治療に使用する研究を行なった（非特許文献４）。それによると、局部腫瘍部位に、1850Gyの186Re-リポソームを投与して治療したとき、その平均生存時間は126日であり、対照グループは49日であった。且つ186Re-リポソーム投与の後に、いかなる毒性反応も見られなかった。このことは186Re-リポソームが神経膠芽腫治療に対して潜在的な効果を有していることを示す。但し、186Re-リポソームが頭頸癌、脳腫瘍等の治療に有効であることは示されたものの、これらの研究はいずれも局部腫瘍部位に対する投薬であって、186Re-リポソームはただ原発性癌の治療に応用されるだけで、転移性癌治療には応用できていない。このほか、レニウム186は担体型であり、原子炉より取得され、その取得は比較的容易でなく、その比活性は比較的低く、これに対して、レニウム188は無担体型であり、タングステン188ジェネレータより高い比活性のレニウム188を獲得でき、これにより、レニウム188放射性核種はレニウム186に較べて臨床上、より便利に使用できる。さらに、レニウム188の半減期は16.9時間でありレニウム186（半減期91時間）より短く、これにより、臨床使用上、レニウム188は比較的安全で且つ正常組織の被曝を減らすことができる。
文献名：J.Pharm.Sci (2003年) 第92刊,p.1893-1904
文献名：J.Nucl.Med (2003年),第44刊,p.1992-1999
文献名：J.Vasc Interv Radiol. 2010年;第21刊(8): p.1271-1279
文献名：Neuro-Oncology 2012年; 第14刊(4); p.416-425
上述の状況を鑑み、本発明は一種の、放射ターゲット薬物調製用キット及び放射ターゲット薬物の製造方法及び用途を提供することを目的とする。本発明はレニウム188（188Re）放射性核種を利用し、キレート剤BMEDAにより、レニウム188をリポソーム中に内包させて放射性ターゲット薬剤「188Re-リポソーム」に発展させ、それは、細網内皮系（ＲＥＳ）を回避し並びに循環中に比較的長時間停留し、このため、より良好な腫瘍ターゲット作用を有する。188Re-リポソームはナノリポソームとされ、血管透過性・滞留性亢進効果（ＥＰＲ）により、腫瘍に累積し、すなわち、いわゆる受動的ターゲッティング（passive targeting)を形成する。
本発明のキットは、
（１）瓶Ａであって、ＢＭＥＤＡ （N,N‐ビス(2‐メルカプトエチル)‐N,N‐ジエチレンジアミン；N,N‐bis(2‐mercaptoethyl)‐N,N‐diethylenediamine ）、グルコン酸ナトリウム（sodium gluconate）、塩化第一錫の結晶の混合物を入れた、上記瓶Ａ、
（２）瓶Ｂであって、レニウム188及び又はレニウム186放射性核種の水溶液を入れた、上記瓶Ｂ、
（３）瓶Ｃであって、リン脂質、コレステロール、DSPE-PEG2000 （1,2-ジステアロイル-sn-グリセロ-3-ホスホエタノールアミン-N-[メトキシ(ポリエチレングリコール)-2000]）の脂質成分 のリポソームを含み、そのうち、水溶液中のリン脂質濃度は13-14μmole/mLとされ、且つリン脂質：コレステロール：DSPE-PEG2000 の モル比は、30〜95：20〜45：3〜7.5であり、且つリン脂質は、たとえば、DSPC（ジステアロイルホスファチジルコリン）或いはHSPC（水素添加大豆リン脂質）を使用できる、上記瓶Ｃ、
以上を含む。
（１）瓶Ａであって、ＢＭＥＤＡ （N,N‐ビス(2‐メルカプトエチル)‐N,N‐ジエチレンジアミン；N,N‐bis(2‐mercaptoethyl)‐N,N‐diethylenediamine ）、グルコン酸ナトリウム（sodium gluconate）、塩化第一錫の結晶の混合物を入れた、上記瓶Ａ、
（２）瓶Ｂであって、レニウム188及び又はレニウム186放射性核種の水溶液を入れた、上記瓶Ｂ、
（３）瓶Ｃであって、リン脂質、コレステロール、DSPE-PEG2000 （1,2-ジステアロイル-sn-グリセロ-3-ホスホエタノールアミン-N-[メトキシ(ポリエチレングリコール)-2000]）の脂質成分 のリポソームを含み、そのうち、水溶液中のリン脂質濃度は13-14μmole/mLとされ、且つリン脂質：コレステロール：DSPE-PEG2000 の モル比は、30〜95：20〜45：3〜7.5であり、且つリン脂質は、たとえば、DSPC（ジステアロイルホスファチジルコリン）或いはHSPC（水素添加大豆リン脂質）を使用できる、上記瓶Ｃ、
以上を含む。
本発明のキット中、瓶Ａ中のＢＭＥＤＡ 、グルコン酸ナトリウム、塩化第一錫のモル比は、ＢＭＥＤＡ：グルコン酸ナトリウム：塩化第一錫＝10：2〜100：1〜40とされる。
本発明のキット中、瓶Ｂ中で使用されるレニウム188及び又はレニウム186放射性核種の比活性は、1mCi〜100mCi/mLとされる。
本発明のキット中、瓶Ａと瓶Ｃの体積比は1：1〜1：10とされる。
本発明のキット中、瓶Ｂ及び瓶Ｃの水溶液は、生理食塩水溶液とされ得る。
本発明はまた、一種の放射ターゲット薬物の製造方法を提供し、それは、本発明のキットを使用し、且つ以下のステップを含み、すなわち、
（１）瓶Ｂの溶液を吸い取り並びに瓶Ａ中に注入し且つ、適当な温度で適当な時間反応させるステップ、
（２）（１）のステップで瓶Ｂの溶液を混合した瓶Ａ中に、２N NaOHを注入して溶液のｐHを6−7に調整するステップ、
（３）さらに瓶Ｃの溶液を、（２）のステップを終えた瓶Ａ中に注入し、並びに適当な温度で適当な時間反応させ、放射ターゲット薬物「レニウム188及び又はレニウム186-リポソーム」を獲得するステップ。
（１）瓶Ｂの溶液を吸い取り並びに瓶Ａ中に注入し且つ、適当な温度で適当な時間反応させるステップ、
（２）（１）のステップで瓶Ｂの溶液を混合した瓶Ａ中に、２N NaOHを注入して溶液のｐHを6−7に調整するステップ、
（３）さらに瓶Ｃの溶液を、（２）のステップを終えた瓶Ａ中に注入し、並びに適当な温度で適当な時間反応させ、放射ターゲット薬物「レニウム188及び又はレニウム186-リポソーム」を獲得するステップ。
本発明の放射ターゲット薬物の製造方法によると、（１）のステップは4 ℃〜110℃の範囲の温度で、30〜75分間行われる。
本発明の放射ターゲット薬物の製造方法によると、（３）のステップは4 ℃〜80℃の範囲の温度で、15〜60分間行われる。
本発明の上述のキット及び方法により得られる放射ターゲット薬物は、放射性核種レニウム188により標識されており、それは一種の診断と治療機能を兼ね備えた放射性同位元素であり、その半減期は適度（16.9時間）であり、並びに155千電子ボルト(keV)γ線を発射でき核医学造影診断上の応用に適合し、同時に、その放出するβ能量は2.12百万電子ボルト(MeV)にも達し、核医学薬物癌治療上の応用に適合する。これにより、臨床上、癌患者は「レニウム188及び又はレニウム186-リポソーム」を二回注射し、まず、たとえば、３-14mCiの低剤量を以て診断し、腫瘍のサイズ及び位置を評価し、さらに14mCiの高剤量を投与し治療を行うことができ、これにより、「レニウム188及び又はレニウム186-リポソーム」は治療と診断造影の機能を兼ね備える。
本発明の上述のキット及び方法により得られる放射ターゲット薬物は頭頸癌、肺癌、脳癌、及びその転移性疾病に応用でき、それは腫瘍生長及び進展を抑制し並びに転移を抑制するのに用いられる。本発明の放射ターゲット薬物は、単独使用或いはその他の試薬及び癌治療薬と組み合わせて使用できる。本発明のキットの長所は、すなわち、（１）使用に便利であること、（２）操作が簡単であること、（３）純化が不要であること、（４）臨床使用に適合すること、及び、（５）放射治療と癌診断のダブルの機能を有すること、以上である。
以下に実施例を以て、さらに本発明を説明するが、これらの実施例は僅かに例示のために用いられるのであって、本発明の範囲を制限するためのものではない。
［実施例１］
BMEDA結晶小瓶の調製（瓶Ａ）
１．200μL酢酸を1800μLの生理食塩水に加え、10％酢酸溶液を形成し、それを均一に混合して使用に待機する。
２．148mgのグルコン酸ナトリウム（sodium gluconate）を計り取り、1000μLの、上述の１のステップの10％酢酸溶液に加え、0.68Mのグルコン酸ナトリウム溶液を調製する。
３．20mgの塩化第一錫(Stannous chloride)を計り取り、2.0mLの0.12N塩酸溶液中に加え、並びに透明になるまで溶解させ、その濃度を10mg/mLとなす。
４．35mgのBMEDAを5.0mLのガラス瓶中に計り取った後、順に、上述の２のステップの875μLのグルコン酸ナトリウム溶液、上述の３のステップの840μLの塩化第一錫溶液を加え、揺らして均一に混合する。
５．４のステップの溶液を、毎瓶152μLでガラス小瓶中に分装し、各一つのガラス小瓶中で、BMEDA/グルコン酸ナトリウム/塩化第一錫＝3.08mg/77.1μL/74.1μL（モル比は1：4：0.3 ）となるようにする。
６．５のステップですでに分装したガラス小瓶を冷凍乾燥させ、冷凍乾燥のプロセスは、先に冷凍し、初期乾燥し、二次乾燥し、その各ステップの条件は以下の表１に示されるとおりである。
BMEDA結晶小瓶の調製（瓶Ａ）
１．200μL酢酸を1800μLの生理食塩水に加え、10％酢酸溶液を形成し、それを均一に混合して使用に待機する。
２．148mgのグルコン酸ナトリウム（sodium gluconate）を計り取り、1000μLの、上述の１のステップの10％酢酸溶液に加え、0.68Mのグルコン酸ナトリウム溶液を調製する。
３．20mgの塩化第一錫(Stannous chloride)を計り取り、2.0mLの0.12N塩酸溶液中に加え、並びに透明になるまで溶解させ、その濃度を10mg/mLとなす。
４．35mgのBMEDAを5.0mLのガラス瓶中に計り取った後、順に、上述の２のステップの875μLのグルコン酸ナトリウム溶液、上述の３のステップの840μLの塩化第一錫溶液を加え、揺らして均一に混合する。
５．４のステップの溶液を、毎瓶152μLでガラス小瓶中に分装し、各一つのガラス小瓶中で、BMEDA/グルコン酸ナトリウム/塩化第一錫＝3.08mg/77.1μL/74.1μL（モル比は1：4：0.3 ）となるようにする。
６．５のステップですでに分装したガラス小瓶を冷凍乾燥させ、冷凍乾燥のプロセスは、先に冷凍し、初期乾燥し、二次乾燥し、その各ステップの条件は以下の表１に示されるとおりである。
７．冷凍乾燥プロセス完成の後、窒素ガス充填と瓶の自動シールを行ない、BMEDA、グルコン酸ナトリウム及び塩化第一錫を含む結晶混合物を獲得し、並びに＜−20℃下で保存する。
［実施例２］
リポソーム溶液小瓶調製（瓶Ｃ）
瓶Ｃの製作：DSPC（55.31g，70μmole）、コレステロール（18.04g, 46.66μmole）、DSPE-PEG2000（20.59g,7μmole）（モル比では、３：２：0.3）を、それぞれ250mLの丸底フラスコ内に計り取り、それぞれ８mLのクロロホルムを加え並びに均一に溶解させる。ロータリーエバポレータを使用して60℃の真空下でクロロホルムを完全に除去して、瓶壁上に脂質薄膜を形成することができる。減圧乾燥の後、さらに５mL 250mMの硫酸アンモニウム溶液（250mM （NH4)2SO4,ｐH 5.0, 530mOs）をすでに脂質薄膜を形成した丸底フラスコ内に加え、60℃の水浴中で振動させ揺らし、フラスコ壁上の脂質薄膜を全て硫酸アンモニウム溶液中に分散させることで、多層リポソーム(MLV)を得る。さらに、多層リポソーム懸濁液を、液体窒素及び60℃の水浴で反復した冷凍、解凍を６回行なう。その後、さらに高圧ろ膜押し出しシステム(Lipex Biomembrane,Vancouver,Canada)でろ過押圧を行ない単一脂二層リポソームを得る。この単一脂二層リポソーム懸濁液をSephadex G50ゲルろ過管に通し、並びに0.9％ NaClをを溶離液として、グラジエント溶離し、純化させる。カラムを通過したリポソーム懸濁液を収集する。nano-ZX(Malvern,UK)粒径分析機で測定したリポソーム平均粒径は80−120nmの正規分布とされる。Bartlett's Methodでリポソーム中のリン脂質濃度を測定する。方法は以下のとおりである。すなわち、試験管中で異なる濃度の標準溶液及び被測定リポソーム（各0.5mL）を調製した後、それぞれ400μLの10 N H2SO4を加え、乾浴槽で180−200℃下で、30分間作用させ、試験管を取り出し並びに室温下で冷却させる。その後、さらに各試験管中に、100μLの10％ H2O2を加え、並びに180−200℃下で、30分間作用させて溶液を透明とし、試験管を取り出し並びに室温下で冷却する。4.6mLのモリブデン酸アンモニウム（ammonium molybdate tetrahydrate）/0.25N H2SO4を加え、並びに振動し混合する。100μL 15％のアスコルビン酸を加え、並びに水浴（100℃）中で10分間加熱した後に、試験管を取り出し、室温下で冷却する。サンプルに対し、分光高度計(spectrophotometer)で波長830nm下でその吸光値を測定する。得られたデータを標準溶液が描く線形回帰曲線と対照し、得られたサンプルのリン含有量を計算する。計算されたリポソームリン脂質濃度は13−14μmole/mLであった。
リポソーム溶液小瓶調製（瓶Ｃ）
瓶Ｃの製作：DSPC（55.31g，70μmole）、コレステロール（18.04g, 46.66μmole）、DSPE-PEG2000（20.59g,7μmole）（モル比では、３：２：0.3）を、それぞれ250mLの丸底フラスコ内に計り取り、それぞれ８mLのクロロホルムを加え並びに均一に溶解させる。ロータリーエバポレータを使用して60℃の真空下でクロロホルムを完全に除去して、瓶壁上に脂質薄膜を形成することができる。減圧乾燥の後、さらに５mL 250mMの硫酸アンモニウム溶液（250mM （NH4)2SO4,ｐH 5.0, 530mOs）をすでに脂質薄膜を形成した丸底フラスコ内に加え、60℃の水浴中で振動させ揺らし、フラスコ壁上の脂質薄膜を全て硫酸アンモニウム溶液中に分散させることで、多層リポソーム(MLV)を得る。さらに、多層リポソーム懸濁液を、液体窒素及び60℃の水浴で反復した冷凍、解凍を６回行なう。その後、さらに高圧ろ膜押し出しシステム(Lipex Biomembrane,Vancouver,Canada)でろ過押圧を行ない単一脂二層リポソームを得る。この単一脂二層リポソーム懸濁液をSephadex G50ゲルろ過管に通し、並びに0.9％ NaClをを溶離液として、グラジエント溶離し、純化させる。カラムを通過したリポソーム懸濁液を収集する。nano-ZX(Malvern,UK)粒径分析機で測定したリポソーム平均粒径は80−120nmの正規分布とされる。Bartlett's Methodでリポソーム中のリン脂質濃度を測定する。方法は以下のとおりである。すなわち、試験管中で異なる濃度の標準溶液及び被測定リポソーム（各0.5mL）を調製した後、それぞれ400μLの10 N H2SO4を加え、乾浴槽で180−200℃下で、30分間作用させ、試験管を取り出し並びに室温下で冷却させる。その後、さらに各試験管中に、100μLの10％ H2O2を加え、並びに180−200℃下で、30分間作用させて溶液を透明とし、試験管を取り出し並びに室温下で冷却する。4.6mLのモリブデン酸アンモニウム（ammonium molybdate tetrahydrate）/0.25N H2SO4を加え、並びに振動し混合する。100μL 15％のアスコルビン酸を加え、並びに水浴（100℃）中で10分間加熱した後に、試験管を取り出し、室温下で冷却する。サンプルに対し、分光高度計(spectrophotometer)で波長830nm下でその吸光値を測定する。得られたデータを標準溶液が描く線形回帰曲線と対照し、得られたサンプルのリン含有量を計算する。計算されたリポソームリン脂質濃度は13−14μmole/mLであった。
［実施例３］
レニウム188-リポソームの調製
１．4.01mCi/mL、5.02mCi/mL、6.59mCi/mL及び9.03mCi/mLの放射性核種レニウム188を含有する生理食塩水溶液(瓶Ｂ）を、各瓶Ａの結晶小瓶中に加え、80℃の乾浴器中で、60分間反応させ、その標識反応は以下のとおりである。
配位子交換により、188Re-錯体を形成する
188ReＯ4 -＋ Ｓｎ4+ → 還元された188Re＋ Ｓｎ4+
還元された188Re ＋ グルコン酸ナトリウム → 188Re-グルコン酸ナトリウム
188Re-グルコン酸ナトリウム＋２BMEDA → 188Re(BMEDA)2＋グルコン酸ナトリウム
２．続いて、55μL ２N NaOH を上述の１のステップの瓶Ａ中に注入し、続いて以下のように製作される瓶Ｃの1.0mLの溶液を加え（瓶Ａ：瓶Ｃ溶液の反応体積比は１：１）、60℃の乾浴器中で30分間反応させる。反応完成後に、10分間静置し、その温度を室温に戻す。
３．最終反応後の瓶Ａ溶液に対して、内包効率測定を行う：予め20mL生理食塩水で平衡させたPD-10カラム（GE Healthcare，分子量或いは粒子サイズの差異を利用して分離を行うカラム）中に、最終的な瓶Ａの溶液100μLを加え、生理食塩水を溶離液としてカラムクロマトグラフィーを行ない、各試験管で500μLのPD-10カラムを流出した溶液を収集し、全部で20管溶液を収集してそれぞれ１−20の番号を付けた。
４．全ての試験管（番号1-20）を順に放射活性測定計(Capintec CRC-15R 放射活性測定計）中で活性測定を行ない、並びに記録した。
５．同様に、PD-10カラム（番号21）を放射活性測定計中に入れて放射活性を測定し、並びに記録した。
６．以下のように内包効率を計算した。すなわち、
４のステップの全ての試験管（番号1-20）と５のステップの試験管（番号21）について測定した活性合計を分母（総活性）とする。４のステップの番号5-10の試験管（反応後の溶液内は188Re-リポソームが最大粒子とされ、それは先にカラムより排出され、カラム自身に存在する溶液体積（2mL）を控除し、ゆえに、放射活性を有する188Re-リポソーム溶液は番号5-10の試験管に出現する）の活性合計を分子とし（すなわち188Re主ピーク活性）、以下の式で内包効率を算出する。
内包効率＝（188Re主ピーク活性）/（総活性）×100％
レニウム188-リポソームの調製
１．4.01mCi/mL、5.02mCi/mL、6.59mCi/mL及び9.03mCi/mLの放射性核種レニウム188を含有する生理食塩水溶液(瓶Ｂ）を、各瓶Ａの結晶小瓶中に加え、80℃の乾浴器中で、60分間反応させ、その標識反応は以下のとおりである。
配位子交換により、188Re-錯体を形成する
188ReＯ4 -＋ Ｓｎ4+ → 還元された188Re＋ Ｓｎ4+
還元された188Re ＋ グルコン酸ナトリウム → 188Re-グルコン酸ナトリウム
188Re-グルコン酸ナトリウム＋２BMEDA → 188Re(BMEDA)2＋グルコン酸ナトリウム
２．続いて、55μL ２N NaOH を上述の１のステップの瓶Ａ中に注入し、続いて以下のように製作される瓶Ｃの1.0mLの溶液を加え（瓶Ａ：瓶Ｃ溶液の反応体積比は１：１）、60℃の乾浴器中で30分間反応させる。反応完成後に、10分間静置し、その温度を室温に戻す。
３．最終反応後の瓶Ａ溶液に対して、内包効率測定を行う：予め20mL生理食塩水で平衡させたPD-10カラム（GE Healthcare，分子量或いは粒子サイズの差異を利用して分離を行うカラム）中に、最終的な瓶Ａの溶液100μLを加え、生理食塩水を溶離液としてカラムクロマトグラフィーを行ない、各試験管で500μLのPD-10カラムを流出した溶液を収集し、全部で20管溶液を収集してそれぞれ１−20の番号を付けた。
４．全ての試験管（番号1-20）を順に放射活性測定計(Capintec CRC-15R 放射活性測定計）中で活性測定を行ない、並びに記録した。
５．同様に、PD-10カラム（番号21）を放射活性測定計中に入れて放射活性を測定し、並びに記録した。
６．以下のように内包効率を計算した。すなわち、
４のステップの全ての試験管（番号1-20）と５のステップの試験管（番号21）について測定した活性合計を分母（総活性）とする。４のステップの番号5-10の試験管（反応後の溶液内は188Re-リポソームが最大粒子とされ、それは先にカラムより排出され、カラム自身に存在する溶液体積（2mL）を控除し、ゆえに、放射活性を有する188Re-リポソーム溶液は番号5-10の試験管に出現する）の活性合計を分子とし（すなわち188Re主ピーク活性）、以下の式で内包効率を算出する。
内包効率＝（188Re主ピーク活性）/（総活性）×100％
７．もし内包効率＞90％であれば、純化プロセスは行う必要がない。
［実施例４］
188Re-リポソームを頭頸癌（HNSCC)マウスモデルに用いた治療効果評価試験
FaDu-GLT細胞（106細胞が50μL無血清のRPMI-1640培養基に存在）をBALB/cヌードマウスの口腔底部の筋肉層に接種する。接種三週間後にマウスを殺し並びに肉眼で（図１（ａ）参照）及び生物発光造影(Bioluminescent image)（図１（ｂ）参照）で、マウス頭頸腫瘍生長のサイズ及び位置を観察した後、治療効果評価試験を行う。
FaDu-GLT腫瘍細胞を口腔接種したBALB/cヌードラットを、188Re-BMEDAと188Re-リポソームの二つのグループに分け、各グループ９頭のBALB/cヌードマウスに静脈注射方式で単一剤量640μCiの188Re-BMEDA、188Re-リポソームを投与する。そのうち、188Re-リポソーム投与グループのマウスの投薬後24時間及び48時間のSPECT/CT造影写真を図２に示す。図２から分かるように、188Re-リポソームは腫瘍部位に顕著に蓄積される。
且つ図３にはそれぞれ188Re-BMEDAと188Re-リポソームを投与後に、腫瘍部位の生物発光強度の結果を表示する。生物発光強度の測定は、投薬後に生体内成像システム（In Vivo Imaging System)50（IVIS,Perkin Elmer Inc.,Waltham,MA,USA)を利用して腫瘍部分の生物発光吸収強度を測定することで行われる。図３の腫瘍部位生物発光強度結果から分かるように、188Re-リポソームを投与後１５日内に腫瘍生物発光強度は下がり、生物発光強度は188Re-BMEDA対照グループとの比較においてもまた顕著な差異を有し（ｐ値＜0.05）、188Re-リポソームが頭頸癌細胞の生長を抑制できることを表示している。
188Re-リポソームを頭頸癌（HNSCC)マウスモデルに用いた治療効果評価試験
FaDu-GLT細胞（106細胞が50μL無血清のRPMI-1640培養基に存在）をBALB/cヌードマウスの口腔底部の筋肉層に接種する。接種三週間後にマウスを殺し並びに肉眼で（図１（ａ）参照）及び生物発光造影(Bioluminescent image)（図１（ｂ）参照）で、マウス頭頸腫瘍生長のサイズ及び位置を観察した後、治療効果評価試験を行う。
FaDu-GLT腫瘍細胞を口腔接種したBALB/cヌードラットを、188Re-BMEDAと188Re-リポソームの二つのグループに分け、各グループ９頭のBALB/cヌードマウスに静脈注射方式で単一剤量640μCiの188Re-BMEDA、188Re-リポソームを投与する。そのうち、188Re-リポソーム投与グループのマウスの投薬後24時間及び48時間のSPECT/CT造影写真を図２に示す。図２から分かるように、188Re-リポソームは腫瘍部位に顕著に蓄積される。
且つ図３にはそれぞれ188Re-BMEDAと188Re-リポソームを投与後に、腫瘍部位の生物発光強度の結果を表示する。生物発光強度の測定は、投薬後に生体内成像システム（In Vivo Imaging System)50（IVIS,Perkin Elmer Inc.,Waltham,MA,USA)を利用して腫瘍部分の生物発光吸収強度を測定することで行われる。図３の腫瘍部位生物発光強度結果から分かるように、188Re-リポソームを投与後１５日内に腫瘍生物発光強度は下がり、生物発光強度は188Re-BMEDA対照グループとの比較においてもまた顕著な差異を有し（ｐ値＜0.05）、188Re-リポソームが頭頸癌細胞の生長を抑制できることを表示している。
［実施例５］
188Re-リポソームの転移性癌患者に対する臨床試験
転移性頭頸癌患者に、約3mCiの単一剤量の静脈注射を以て、188Re-リポソームを投与し、188Re-リポソームを１、４、８、24、48、72時間注射した後に、それぞれ単一光子放射断層撮影（SPECT)を行ない、並びに24時間で、コンピュータ断層撮影(CT)を行う。患者の造影完成の後、医学画像分析ソフトVelocity AIで各時間点のSPECT画像と第24時間のCT画像の画像融合を行ない、188Re-リポソームの人体内正常器官と腫瘍における生物分布及び輻射剤量値を評価し、結果を図４に示した。
図４の結果から分かるように、２４時間SPECT/CT融合画像中（図４（ｂ））、患者左側鼻腔に一カ所顕著な吸収部位があることがはっきりと分かり、その部位とこの患者の試験前の約一カ月に、MRI造影（図４（ａ））で診断された腫瘍病巣部位は同じであり、188Re-リポソームが確実に、腫瘍病巣部分に累積することが実証された。このほか、図５は該患者が188Re-リポソームを投与される前（図５（ａ））と188Re-リポソームを投与された後（図５（ｂ））の腫瘍病巣部分鼻腔内視鏡画像であり、鼻腔内視鏡画像結果から、試験前約一カ月（図５（ａ））に、不平坦表面を有し血管分布が密集する腫瘍病巣が観察され、188Re-リポソームを約２カ月接種後の内視鏡画像（図５（ｂ））の腫瘍病巣部分はすでに結痂の状況を発生し、病巣部分はすでに顕著な復元状況を有する。
188Re-リポソームの転移性癌患者に対する臨床試験
転移性頭頸癌患者に、約3mCiの単一剤量の静脈注射を以て、188Re-リポソームを投与し、188Re-リポソームを１、４、８、24、48、72時間注射した後に、それぞれ単一光子放射断層撮影（SPECT)を行ない、並びに24時間で、コンピュータ断層撮影(CT)を行う。患者の造影完成の後、医学画像分析ソフトVelocity AIで各時間点のSPECT画像と第24時間のCT画像の画像融合を行ない、188Re-リポソームの人体内正常器官と腫瘍における生物分布及び輻射剤量値を評価し、結果を図４に示した。
図４の結果から分かるように、２４時間SPECT/CT融合画像中（図４（ｂ））、患者左側鼻腔に一カ所顕著な吸収部位があることがはっきりと分かり、その部位とこの患者の試験前の約一カ月に、MRI造影（図４（ａ））で診断された腫瘍病巣部位は同じであり、188Re-リポソームが確実に、腫瘍病巣部分に累積することが実証された。このほか、図５は該患者が188Re-リポソームを投与される前（図５（ａ））と188Re-リポソームを投与された後（図５（ｂ））の腫瘍病巣部分鼻腔内視鏡画像であり、鼻腔内視鏡画像結果から、試験前約一カ月（図５（ａ））に、不平坦表面を有し血管分布が密集する腫瘍病巣が観察され、188Re-リポソームを約２カ月接種後の内視鏡画像（図５（ｂ））の腫瘍病巣部分はすでに結痂の状況を発生し、病巣部分はすでに顕著な復元状況を有する。
［実施例６］
188Re-リポソームの非小細胞肺癌(NSCLC)マウスモデルに対する治療効果評価試験
106 H292-GLT細胞をMatrigel（商品名、Corning Life Sciences社より、Engelbreth-Holm-Swarm(EHS)マウス癌細胞が分泌するゼラチン蛋白質混合物より取得される）と混合し、直接BALB/cヌードマウス胸腔内に接種する。接種１６日にmicro CT（図６（a))及び生物発光造影（図６（ｂ））を行ない、マウス肺臓内腫瘍の大きさ及び位置を確認し、治療効果評価試験を行う。
H292-GLT腫瘍細胞を胸腔接種したBALB/cヌードマウスを、188Re-BMEDA、188Re-リポソームの二つのグループに分け、各グループそれぞれ９頭のBALB/cヌードマウスに静脈注射の方式で単一剤量640μCiの188Re-BMEDA、188Re-リポソームを投与する。
二組の老マウスを毎日観察し、並びにその生存率を記録する。毎日観察及び記録した老マウスが死亡するか或いは60日後になおも生存していれば、記録を停止する。平均生存時間の結果は表３に示し、188Re-BMEDAグループの平均生存時間は２６日で、188Re-リポソームグループでは４０日であり、両グループ間で比較した結果には顕著な差異があった（ｐ値＜0.05）。
且つ図７にはKaplan-Meier生存曲線結果が示され、この図から分かるように、188Re-リポソームを投与した老マウスを60日観察した後に、なおも10％が生存し、188Re-BMEDAを投与した老マウスは第40日には全て死亡した。
188Re-リポソームの非小細胞肺癌(NSCLC)マウスモデルに対する治療効果評価試験
106 H292-GLT細胞をMatrigel（商品名、Corning Life Sciences社より、Engelbreth-Holm-Swarm(EHS)マウス癌細胞が分泌するゼラチン蛋白質混合物より取得される）と混合し、直接BALB/cヌードマウス胸腔内に接種する。接種１６日にmicro CT（図６（a))及び生物発光造影（図６（ｂ））を行ない、マウス肺臓内腫瘍の大きさ及び位置を確認し、治療効果評価試験を行う。
H292-GLT腫瘍細胞を胸腔接種したBALB/cヌードマウスを、188Re-BMEDA、188Re-リポソームの二つのグループに分け、各グループそれぞれ９頭のBALB/cヌードマウスに静脈注射の方式で単一剤量640μCiの188Re-BMEDA、188Re-リポソームを投与する。
二組の老マウスを毎日観察し、並びにその生存率を記録する。毎日観察及び記録した老マウスが死亡するか或いは60日後になおも生存していれば、記録を停止する。平均生存時間の結果は表３に示し、188Re-BMEDAグループの平均生存時間は２６日で、188Re-リポソームグループでは４０日であり、両グループ間で比較した結果には顕著な差異があった（ｐ値＜0.05）。
且つ図７にはKaplan-Meier生存曲線結果が示され、この図から分かるように、188Re-リポソームを投与した老マウスを60日観察した後に、なおも10％が生存し、188Re-BMEDAを投与した老マウスは第40日には全て死亡した。
［実施例７］
188Re-リポソームの神経膠芽腫（ glioblastoma）ラットモデルにおける治療評価試験 12−13週の雄のラットにイソフルラン(isoflurane)及び硫酸アトロピン(atropine sulfate)（0.1mg/kg）を皮下注射し、ラットを麻酔し、その後、ラットを立体定位スタンド上に固定し、注意深くラット脳部に2mmの線形切り口を形成し、骨膜除去の後、高速ドリルで右脳の中線から側方3mmのところ、及び、人字縫合の前5mmのところ（3 mm lateral tomidline and 5mm anterior to lambda)に直径１mmの骨孔を開ける。立体定向計の補助の下、100μL Hamilton顕微注射器を利用し、27-1/2号針を骨孔に沿って所定位置に挿入し、3μL/５分の速度で、ゆっくりと10μLの、１×105 F98luc含有腫瘍細胞を注入した後、ゆっくりと顕微注射器を抜き取り、石ろうで骨孔を閉じ、一層ずつ切り口を縫合する。F98luc腫瘍細胞を接種したラットを、188Re-リポソーム、生理食塩水（対照グループ）の二つのグループに分け、毎グループ７頭とし、その治療プロセスは以下のとおりである。接種後７日に、静脈注射で生理食塩水と188Re-リポソーム（333 MBｑ/ 0.5mL；2.5μmoleリン脂質/0.5mL）を投与する。試験期間に、毎日体重測定と生存率観察を行なう。表４よりその平均生存時間の結果が分かり、188Re-リポソームグループは20.75日、対照グループはｐ−値18.75日であり、且つ対照グループに対して、188Re-リポソームグルップは10.67％の寿命を増加できた。（Ｐ＝０．００７）。
188Re-リポソームの神経膠芽腫（ glioblastoma）ラットモデルにおける治療評価試験 12−13週の雄のラットにイソフルラン(isoflurane)及び硫酸アトロピン(atropine sulfate)（0.1mg/kg）を皮下注射し、ラットを麻酔し、その後、ラットを立体定位スタンド上に固定し、注意深くラット脳部に2mmの線形切り口を形成し、骨膜除去の後、高速ドリルで右脳の中線から側方3mmのところ、及び、人字縫合の前5mmのところ（3 mm lateral tomidline and 5mm anterior to lambda)に直径１mmの骨孔を開ける。立体定向計の補助の下、100μL Hamilton顕微注射器を利用し、27-1/2号針を骨孔に沿って所定位置に挿入し、3μL/５分の速度で、ゆっくりと10μLの、１×105 F98luc含有腫瘍細胞を注入した後、ゆっくりと顕微注射器を抜き取り、石ろうで骨孔を閉じ、一層ずつ切り口を縫合する。F98luc腫瘍細胞を接種したラットを、188Re-リポソーム、生理食塩水（対照グループ）の二つのグループに分け、毎グループ７頭とし、その治療プロセスは以下のとおりである。接種後７日に、静脈注射で生理食塩水と188Re-リポソーム（333 MBｑ/ 0.5mL；2.5μmoleリン脂質/0.5mL）を投与する。試験期間に、毎日体重測定と生存率観察を行なう。表４よりその平均生存時間の結果が分かり、188Re-リポソームグループは20.75日、対照グループはｐ−値18.75日であり、且つ対照グループに対して、188Re-リポソームグルップは10.67％の寿命を増加できた。（Ｐ＝０．００７）。
上述のこれらの結果から分かるように、本発明のキットは、簡単なステップで188Re-リポソーム及び又は186Re-リポソームを製造でき、且つこの188Re-リポソーム及び又は186Re-リポソームは、頭頸癌、肺癌、脳癌、及びその転移性癌に治療効果があり、腫瘍生長及び進展を抑制し、並びに転移を抑制するのに用いられ得て、産業上の利用性を有している。
Claims (6)
- 放射ターゲット薬物調製用キットにおいて、
（１）瓶Ａであって、ＢＭＥＤＡ （N,N‐ビス(2‐メルカプトエチル)‐N,N‐ジエチレンジアミン；N,N‐bis(2‐mercaptoethyl)‐N,N‐diethylenediamine ）、グルコン酸ナトリウム（sodium gluconate）、塩化第一錫の結晶の混合物を入れた、上記瓶Ａ、
（２）瓶Ｂであって、188Re 及び又は186Re放射性核種の水溶液を入れた、上記瓶Ｂ、
（３）瓶Ｃであって、リン脂質、ポリエチレングリコール(PEG)、コレステロールを含む脂質成分のリポソームの水溶液を含み、そのうち水溶液中のリン脂質濃度は13-14μmole/mLとされ、且つリン脂質：コレステロール：ポリエチレングリコール(PEG)のモル比は、30〜95：20〜45：3〜7.5である、上記瓶Ｃ、
以上を含むことを特徴とする、放射ターゲット薬物調製用キット。 - 請求項１記載の放射ターゲット薬物調製用キットにおいて、そのうち、瓶ＡのBMEDA、グルコン酸ナトリウム及び塩化第一錫成分のモル比は、BMEDA：グルコン酸ナトリウム：塩化第一錫＝10：2〜100：1〜40とされることを特徴とする、放射ターゲット薬物調製用キット。
- 請求項１記載の放射ターゲット薬物調製用キットにおいて、そのうち、188Re 及び又は186Re放射性核種の比活性は、3mCi/mL〜100mCi/mLとされることを特徴とする、放射ターゲット薬物調製用キット。
- 請求項１記載の放射ターゲット薬物調製用キットにおいて、そのうち、瓶Ａと瓶Ｃの体積比は、1：1〜1：10とされることを特徴とする、放射ターゲット薬物調製用キット。
- 請求項１記載の放射ターゲット薬物調製用キットにおいて、そのうち、リン脂質は、DSPC（ジステアロイルホスファチジルコリン）或いはHSPC（水素添加大豆リン脂質）とされることを特徴とする、放射ターゲット薬物調製用キット。
- 請求項１乃至請求項５のいずれか記載の放射ターゲット薬物調製用キットを使用する放射ターゲット薬物の製造方法において、
（１）瓶Ｂの溶液を吸い取るステップ、
（２）瓶Ａ中に（１）のステップで吸い取った瓶Ｂの溶液を注入し並びに４℃〜110℃の間の温度で30〜75分間反応させるステップ、
（３）瓶Ａ中に、２N NaOHを注入して溶液のｐHを6−7に調整するステップ、
（４）さらに瓶Ｃの溶液を吸い取り、瓶Ａに注入し、並びに４℃〜80℃の間の温度で15〜60分間反応させて放射ターゲット薬物188Re 及び又は186Re-リポソームを獲得するステップ、
以上のステップを含む、放射ターゲット薬物の製造方法。
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