TWI399222B - 製作放射藥物與化學治療藥物組合式奈米標靶套組之醫藥用途 - Google Patents
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Description
由放射藥物與化學治療藥物組合而成雙功能與雙效奈米標靶套組(kit)。
微脂體(Liposome)被認為是被動標靶載運藥物的好劑型，它有以下幾項優點：
(1)放射性同位素與化療藥物包埋在微脂體內，會改變藥物的動力學，延長藥品在血液半衰期，而且這樣大小(~100 nm)的奈米微脂體透過強化滲透與滯留(enhanced permeability and retention,EPR)效用能穿過腫瘤新生血管壁較鬆散的癌细胞組織、，使包埋放射性同位素與抗癌藥物的奈米標靶微脂體能大量累積(10-100倍)在腫瘤部位，增進治療效果並降低對正常細胞傷害，此奈米微脂體屬於被動式標靶(passive targeting)。
(2)毒性高的藥物包裹在奈米標靶微脂體內，由於藥物之濃縮與局限釋藥可以減少不良的副作用。
(3)奈米標靶微脂體的脂質組成、顆粒大小、結構、製備的方法與包裹藥物的選擇性很大，能夠符合各種不同的情況，進行各種應用。
(4)奈米標靶微脂體是由磷脂質構成，其與細胞膜成分相同，在生物體內能被分解，所以不具毒性，而且不像蛋白質會引起免疫反應，所以能夠多次使用。
錸-188、錸-186為放射出β-射線，可做為標靶治療腫瘤放射性同位素，因它們同時含155KeV及139KeV γ-ray，故同時具備加馬造影診斷功能。它
的物理性質如下：
先前技術，Bao發表以186Re,99mTc標幟BMEDA，以及包埋在微脂體內探討放射診斷造影劑或放射治療在正常老鼠之基礎研究(Bao et al.J.Pharm.Sci(2003)92,1893-1904 and J.Nucl.Med(2003),44,1992-1999)。該項技術僅具單功能放射診斷或放射治療，缺少放射及化學治療雙功能與雙效技術。
本發明是由放射藥物與化學治療藥物組合而成雙功能與雙效奈米標靶套組(kit)，此套組有A、B、C參瓶藥物，A瓶其配方成分包括BMEDA,gluconate acetate,SnCl2等，B瓶其配方成分包括DSPC,cholesterol,DSPE-PEG,Doxorubicin或Daunorubicin或Vinolbine等，C瓶是188ReO4 -(或186ReO4 -)溶液。使用此奈米標靶套組方法，將C瓶放射同位素錸-188或錸-186液體，放入A瓶，此A瓶經過加熱反應後，瓶內液體轉移至B瓶，接著B瓶加熱後，則得到組合式雙功能與雙效放射診斷與治療及化學治療之奈米標靶微脂體藥物，可做為診斷與治療腫瘤或惡性腫瘤腹水之應用。本發明優點：(1)使用方便(2)操作簡單(3)具有放射診斷與治療雙功能(4)具放射及化學治療加成效果特性。
縮寫列表如下：
BMEDA：N,N-bis(2-mercaptoethyl)-N’,N’-diethylethylenediamine
DSPC：Distearoyl phosphatidylcholine
PEG：Polyethylene glycol
DSPE：Distearyl phosphatidylethanolamine
秤取5mg BMEDA置於A瓶中，加入0.5ml的0.17 mol/LGluconate-acetatate溶液，隨後灌入氮氣約1分鐘，隨即加入以0.01N HCl新鮮配製的SnCl2溶液120μL(10μg/mL)，灌入氮氣約1分鐘，以避免SnCl2氧化，乾燥後以塑膠軟塞及鋁蓋將瓶蓋密封。接著進行標幟效率品管分析，取A瓶與錸-188溶液置於80℃恆溫水浴槽內以200rpm震盪搖晃作用反應一小時，隨後取出並置於室溫自然冷卻，以radio-ITLC/SG(移動相為normal saline)分析標幟效率(labeling efficiency)，標幟效率達99±1.73%。(Rf：1,free 188Re；Rf：0,188Re-BMEDA)
分別秤取DSPC(70 μmole)/Cholesterol/DSPE-PEG2000(3：2：0.3莫耳比)於250 mL圓底燒瓶內，分別加入8毫升氯仿並使其均勻溶解。利用旋轉減壓濃縮儀於60℃下真空抽除有機溶液，待氯仿完全抽除後可於瓶壁上形成脂質薄膜。抽乾後，再加入5 mL 250 mM硫酸銨溶液(250 mM(NH4)2SO4,pH 5.0,530 mOs)至已形成脂質薄膜的圓底燒瓶內，於60℃水浴中震盪搖晃至瓶壁上脂質薄膜全部分散於硫酸銨溶液中，即可得到多層微脂體(MLV)。再將多層微脂體懸浮液以液態氮及60℃水浴進行反覆冷凍與解凍六次。之後，再以高壓濾膜擠出系統(Lipex Biomembrane,Vancouver,
Canada)進行過濾擠壓得到單一脂雙層微脂體。
接著進行doxorubicin包覆，每1μmole之磷脂質加入140μg之doxorubicin的比例將事先配製之doxorubicin stock(10 mg/mL)加入微脂體懸浮液中，並於60℃，100 rpm下反應30分鐘。反應完成後立刻至於冰水浴中將之冷卻。再將包覆doxorubicin之微脂體懸浮液通過Sephadex G50 gel filtration column並以0.9% NaCl為沖提液，藉以移除未被包覆之doxorubicin。收集通過column之微脂體懸浮液，再利用超高速離心機於150000xg下離心90分鐘，移除大部分上清液，留住少量上清液將沉澱之微脂體再均勻懸浮。以0.22μm filter過濾微脂體懸浮液，得到最後產品，裝入B瓶進行化學治療藥物品管分析：利用N4 Plus粒徑分析儀，測得微脂體平均粒徑為75-95nm之常態分佈。
(1)利用Spectrofluorometer(JASCO,FP6200)於激發光475nm和發射光580nm下測定，包覆doxorubicin之微脂體，其濃度為2mg/ml。
將C瓶放射性同位素錸-188溶液加入A瓶(BMEDA,SnCl2,Gluconate-acetate)，置於80℃恆溫水浴槽內震盪一小時，待冷卻後，將標幟完成的錸-188-BMEDA加入B瓶內(Lipo-DXR)，放入60℃水浴槽中反應30分鐘，完成錸-188-BMEDA包覆進入Lipo-DXR。
以3% isoflurane(in 100% oxygen)麻醉老鼠後，將G-25 Column純化後的錸-188-BMEDA-Liposome以尾靜脈注射(IV injection)方式打入老鼠體
內，分別於注射後1小時、4小時、24小時、48小時、72小時，以3% isoflurane(in 100% oxygen)麻醉老鼠，且造影期間仍持續以3% isoflurane(in 100% oxygen)麻醉老鼠；將老鼠四肢拉直固定於動物檯上，以利用低能量，高解析度的準值儀(collimator)進行micro-SPECT造影，能量視窗(energy window)設定為155±10% keV，影像大小設定為64 x 64，ROR：1.0 cm，FOV：1.37 cm。此外，為了進行後續的影像定量分析，因此於上述每個時間進行已知放射活度的錸-188-參考射源micro-SPECT/CT造影；影像分析結果以標準吸收值(standard uptake value；SUV)呈現。
圈取影像中腫瘤組織ROI(region of interest)的區域，依據參考射源，計算出每一克的腫瘤組織具有多少放射活度(μCi/g)，帶入下列公式計算腫瘤組織標準吸收值(SUV)：(measured activity concentration(μCi/g)/[Injected Dose(μCi)/body weight(g)]
由第一圖可看到錸-188-BMEDA-Liposome注射24小時後，右後腿腫瘤位置有明顯的吸收，直至72小時仍有明顯的影像；micro-SPECT影像定量分析結果顯示，在注射後24小時腫瘤組織的吸收量(Standardised tumor uptake value；SUV)高達2.81±0.36。
將2×105 cells/50 μl之C26大腸腫瘤細胞以皮下注射方式將腫瘤細胞接種於6週大BALB/c小鼠的右後腿，待生長約一週後，腫瘤大小約50 mm3~100mm3即可進行動物實驗。本實驗將動物隨機分成以下4組，每組八隻：錸-188-BMEDA/DXR-Liposome、錸-188-BMEDA-Liposome、DXR-Liposome及Normal Saline。其療程如下：
1.第一組：由尾靜脈注射錸-188-BMEDA/DXR-Liposome，內含500μCi放射活度及2mg/Kg的Doxorubicin(DXR)，共給藥三次，每次給藥劑量
均相同，第一次給藥後間隔三天再進行第二次給藥，於第二次給藥後七天再進行第三次給藥。
2.第二組：由尾靜脈注射給予500μCi放射活度的錸-188-BMEDA-Liposome，共給藥三次，每次給藥劑量均相同，第一次給藥後間隔三天再進行第二次給藥，於第二次給藥後七天再進行第三次給藥。
3.第三組：由尾靜脈注射給予DXR-Liposome，Doxorubicin濃度為2mg/Kg，共給藥三次，每次給藥劑量均相同，第一次給藥後間隔三天再進行第二次給藥，於第二次給藥後七天再進行第三次給藥。
4.第四組：由尾靜脈注射給予Normal Saline，共注射三次，第一次注射後間隔三天再進行第二次注射，於第二次給藥後七天再進行第三次注射。研究進行期間，每個禮拜以電子游標尺(digital caliper)進行兩次腫瘤量測，每日進行存活率紀錄。
由第二圖顯示(註：圖式數據代表平均正負值)，在注射後第27天，只注射Normal Saline為給予藥物治療的老鼠腫瘤體積急遽生長達2220.60±431.35 mm3，施予錸-188-BMEDA/DXR-Liposome治療的老鼠腫瘤體積最小(80.29±34.94 mm3)，其次依序為施予錸-188-BMEDA-Liposome治療的老鼠(298.14±157.25 mm3)及施予DXR-Liposome治療的老鼠(917.20±177.59 mm3)。由第三圖顯示，只注射Normal Saline為給予藥物治療的老鼠在注射後的第48天全數死亡；在注射後的第50天，施予錸-188-BMEDA/DXR-Liposome治療的老鼠其存活率最高，達87.5%，其次依序為施予錸-188-BMEDA/Liposome治療的老鼠(62.5%)及施予DXR-Liposome治療的老鼠(37.5%)。以上實驗結果展示了奈米標靶放射與化學組合式雙效藥物對腫瘤細胞治療之加成與有效性。
將C26 cell line(colon carcinoma)2 x 105 cells/500 μL PBS以腹腔注射方式，接種於六週齡的BALB/c mice。待腫瘤生長10天後，可見其腹部腫脹，表示腫瘤細胞在腹腔內擴散及腹水產生，取體重相近之BALB/c mice進行療效評估試驗。
將腹腔接種C26腫瘤細胞之BALB/c mice分為錸-188-BMEDA Liposome、Lipo-DXR、錸-188-BMEDA/DXR-Liposome及生理食鹽水(Normal Saline)四組，每組8~10隻BALB/c mice。錸-188-BMEDA Liposome組以腹腔注射方式給予200 μL(400~600 μCi)的錸-188-BMEDA-Liposome，Lipo-DXR組以腹腔注射方式給予200 μL(5 mg/kg的doxorubicin)的Lipo-DXR，錸-188-BMEDA/DXR-Liposome組以腹腔注射方式給予200 μL(400~600 μCi,5 mg/kg的doxorubicin)的錸-188-BMEDA/DXR-Liposome，生理食鹽水(Normal Saline)組以腹腔注射方式給予200 μL的生理食鹽水。這四組老鼠每日監控、紀錄其體重及存活率。每日監控及紀錄之老鼠死亡或直到120天後還存活，即停止繼續紀錄，並將存活之老鼠解剖觀察是否還有殘存的腫瘤小節(tumor nodules)。由下表可知其median survival time之錸-188-BMEDA-Liposome組為21天，Lipo-DXR組為18天，錸-188-BMEDA/DXR-Liposome組為27天，且與Normal saline組比較有顯著差異(P value<0.05)，Normal saline組為17.67天。
由第四圖可以看出施打放射治療與化學治療藥物(錸-188-BMEDA/DXR-Liposome)老鼠在120天後，還有10%存活，其他三組老鼠均死亡。此結果顯示了奈米標靶放射與化學組合式雙效藥物對惡性腫瘤腹水治療之加成與有效性。
第一圖係錸-188-BMEDA-Liposome注射24小時後之造影結果。
第二圖係腫瘤生長曲線結果。
第三圖係尾靜脈注射之腫瘤治療生存率結果。
第四圖係腹腔注射之腫瘤治療生存率結果。
Claims (6)
- 一種使用放射藥物與化學治療藥物組合而成雙功能雙效奈米標靶套組之醫藥用途，其中套組包含A、B、C三瓶藥物，A瓶裝入BMEDA、葡萄糖酸醋酸和氯化亞錫，B瓶裝入DSPC、膽固醇、DSPE-PEG和一化療藥物Doxorubicin或Daunorubicin或Vinolbine，C瓶裝入放射性核種溶液，該套組之使用方法包含步驟：(1)從C瓶取出放射性核種溶液，(2)將放射性核種溶液注入A瓶並在適當的溫度下反應，(3)從A瓶中移出標幟上放射性核種的BMEDA溶液，(4)將標幟上放射性核種的BMEDA溶液注入B瓶中並在適當的溫度下反應以獲得一組合性溶液。
- 依申請專利範圍第1項所述之醫藥用途，其中放射性核種溶液之放射性核種為188Re或186Re。
- 依申請專利範圍第1項所述之醫藥用途，其中步驟(2)及步驟(4)之適當的反應溫度在40℃~110℃之間。
- 依申請專利範圍第1項所述之醫藥用途，其中標幟上放射性核種的BMEDA溶液為188Re-BMEDA或186Re-BMEDA。
- 依申請專利範圍第1項所述之醫藥用途，其中組合性溶液為188Re-BMEDA/DXR-Liposome或186Re-BMEDA/DXR-Liposome。
- 依申請專利範圍第1項所述之醫藥用途，其中更包含步驟(5)將步驟(4)所得之組合溶液應用在腫瘤及惡性腫瘤腹水造影診斷與治療。
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Non-Patent Citations (3)
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|---|
| Bao A. et al., " Direct 99ｍTC labeling of pegylated liposomal doxorubicin (Doxil) for pharmacokinetic and non-invasive imaging studies " The Journal of Pharmacology and Experimental Therapeutics, 2004, vol.308(2), pp.419-425 * |
| Hong R.L. et al., " Direct comparison of liposomal doxorubicin with or without polyethylene glycol coating in C-26 tumor-bearing mice: Is surface coating with polyethylene glycol beneficial? " Clinical Cancer Research. 1999,vol.5, pp.3645-3652 * |
| Lee W.C. et al., "Therapeutic efficacy evaluation of 111in-VNB-liposome on human colorectal adenocarcinoma HT=29/luc mouse xenografts " Nuclear Instruments and Methods in Physics Research A . 2006,vol.569, pp.497-504 * |
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