JP5947220B2 - プランタリシンを含むバイオマスを調製するための方法および医療分野におけるその使用 - Google Patents
プランタリシンを含むバイオマスを調製するための方法および医療分野におけるその使用 Download PDFInfo
- Publication number
- JP5947220B2 JP5947220B2 JP2012548540A JP2012548540A JP5947220B2 JP 5947220 B2 JP5947220 B2 JP 5947220B2 JP 2012548540 A JP2012548540 A JP 2012548540A JP 2012548540 A JP2012548540 A JP 2012548540A JP 5947220 B2 JP5947220 B2 JP 5947220B2
- Authority
- JP
- Japan
- Prior art keywords
- plantaricin
- lactobacillus
- dsm23214
- cells
- dsm23213
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Expired - Fee Related
Links
Images
Classifications
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides
- A61K38/16—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
- A61K38/164—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from bacteria
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K35/00—Medicinal preparations containing materials or reaction products thereof with undetermined constitution
- A61K35/66—Microorganisms or materials therefrom
- A61K35/74—Bacteria
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P1/00—Drugs for disorders of the alimentary tract or the digestive system
- A61P1/04—Drugs for disorders of the alimentary tract or the digestive system for ulcers, gastritis or reflux esophagitis, e.g. antacids, inhibitors of acid secretion, mucosal protectants
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P17/00—Drugs for dermatological disorders
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P17/00—Drugs for dermatological disorders
- A61P17/02—Drugs for dermatological disorders for treating wounds, ulcers, burns, scars, keloids, or the like
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P43/00—Drugs for specific purposes, not provided for in groups A61P1/00-A61P41/00
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
- C07K14/195—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from bacteria
- C07K14/335—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from bacteria from Lactobacillus (G)
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N1/00—Microorganisms, e.g. protozoa; Compositions thereof; Processes of propagating, maintaining or preserving microorganisms or compositions thereof; Processes of preparing or isolating a composition containing a microorganism; Culture media therefor
- C12N1/20—Bacteria; Culture media therefor
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N1/00—Microorganisms, e.g. protozoa; Compositions thereof; Processes of propagating, maintaining or preserving microorganisms or compositions thereof; Processes of preparing or isolating a composition containing a microorganism; Culture media therefor
- C12N1/20—Bacteria; Culture media therefor
- C12N1/205—Bacterial isolates
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12P—FERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
- C12P39/00—Processes involving microorganisms of different genera in the same process, simultaneously
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12R—INDEXING SCHEME ASSOCIATED WITH SUBCLASSES C12C - C12Q, RELATING TO MICROORGANISMS
- C12R2001/00—Microorganisms ; Processes using microorganisms
- C12R2001/01—Bacteria or Actinomycetales ; using bacteria or Actinomycetales
- C12R2001/225—Lactobacillus
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12R—INDEXING SCHEME ASSOCIATED WITH SUBCLASSES C12C - C12Q, RELATING TO MICROORGANISMS
- C12R2001/00—Microorganisms ; Processes using microorganisms
- C12R2001/01—Bacteria or Actinomycetales ; using bacteria or Actinomycetales
- C12R2001/225—Lactobacillus
- C12R2001/25—Lactobacillus plantarum
Landscapes
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- Zoology (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Wood Science & Technology (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- Pharmacology & Pharmacy (AREA)
- Public Health (AREA)
- Animal Behavior & Ethology (AREA)
- Veterinary Medicine (AREA)
- General Chemical & Material Sciences (AREA)
- General Engineering & Computer Science (AREA)
- Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Tropical Medicine & Parasitology (AREA)
- Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
- Biomedical Technology (AREA)
- Virology (AREA)
- Epidemiology (AREA)
- Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
- Gastroenterology & Hepatology (AREA)
- Mycology (AREA)
- Biophysics (AREA)
- Dermatology (AREA)
- Immunology (AREA)
- Medicines Containing Material From Animals Or Micro-Organisms (AREA)
- Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
- Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
- Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)
- Acyclic And Carbocyclic Compounds In Medicinal Compositions (AREA)
Description
9.0log ufc/mlの細胞密度での、30℃で24時間の乳酸菌培養物の増殖、洗浄、水中での懸濁、および培地(CDM、WFH、グレープマスト、乳清、果実および植物性産物の水性抽出物)の共接種(1〜4%)
↓
30〜37℃で18〜24時間の培養
↓
遠心分離による細胞の取り出し
↓
乾燥または凍結乾燥による上清の脱水
↓
皮膚ケア製品用途のための配合物の配合
a)ラクトバシラス・プランタルムDSM23213およびラクトバシラス・ロシアエDSM23214乳酸菌の培養増殖;
b)CDM、WFH、グレープマスト、乳清、または果実および植物性産物抽出物からなる群から選択される基質の、工程a)に記載の乳酸菌の水性懸濁液との共接種;
c)インキュベーション;ならびに場合により、
d)乳酸菌細胞を取り出すための培養ブロスの遠心分離。
プランタリシン型ペプチドフェロモンの合成および精製、ならびに表皮およびCaco-2細胞に対するその効果の試験
「天然サワードウ」から先に単離された、Collezione di Colture del Dipartimento di Protezione delle Piante e Microbiologia Applicata dell'Universita degli Studi di BariからのL.プランタルム DC400(DSM23213)およびL.ロシアエ DPPMA174(DSM)を、通常の成分に加えて5%のマルトースおよび10%のサワードウ水-最終pH5.6を含有する改良MRS培地(mMRS)中で、30℃で24時間増殖させた。
L.ロシアエ DPPMA174(DSM23214)の増殖動態学的データは、Gompertzの式を使用して処理し、引き続いて修正した(Zwieteringら、1990、「Modelling of bacterial growth curve」、Appl Environ Microbiol 56:1875〜1881)。細胞計数は、SDB培地上に30℃で48時間プレーティングすることによって実施した。細胞生存能ならびに損傷および/または死亡した細胞の数は、LIVE/DEAD bacLight Bacterial Viabilityキット(Molecular Probes, INc、Cambridge)によって求めた。
単一培養または共培養されたL.ロシアエ DPPMA174(DSM23214)由来の細胞質タンパク質の二次元電気泳動分析は、インモビリン(-ポリアクリルアミドシステム(De Angelisら、2005、Biochim. Biophys. Acta、1762:80〜93)を使用して実施した。各条件について4つのゲルを分析し、データを、Biniら(Biniら、1997、「Protein expression profiles in human breast ductal carcinoma and histologically normal tissue」、Electrophoresis、18:2831〜2841)による手順に従って標準化した。
再生ヒト表皮SkinEthic(登録商標)(再生ヒト表皮)は、多層ヒト表皮からの通常のケラチノサイトからなる。これは、空気-液体界面で、不活性な多孔質ポリカーボネート支持体上で、子ウシ血清を添加することなく、17日間既知組成培地(MCDM153)中でヒトケラチノサイトを培養して、完全に分化した表皮である。この増殖工程において、形態的な分析は、10を超える緻密な細胞層からなる多層状の生存可能な表皮および角質層を示す。再生ヒト表皮SkinEthic(登録商標)は、以前に記載されたプロトコール(Di Cagnoら、2009、「Synthesis of γ-amino butyric acid (GABA) by Lactobacillus plantarum DSMZ19463: functional grape must beverage and dermatological application」、Appl Biotechnol Microbiol DOI: 10.1007/s00253-009-23704)に従って使用した。
ヒトCaco-2/TC7細胞(TC7クローン)を、子ウシ血清(10%)、非必須アミノ酸(1%)、ゲンタマイシン/ストレプトマイシン(50μg/ml)、グルタミン(2mM)、および4-2-ヒドロキシエチル-1-ピペラジニル-エタンスルホン酸(1%)を添加したダルベッコ培地(DMEM)中で培養した(Di Cagnoら、2010、「Quorum sensing in sourdough Lactobacillus plantarum DC400: induction of plantaricin A (PlnA) under co-cultivation with other lactic acid bacteria and effect of PlnA on bacterial and Caco-2 cells」、Proteomics 近刊)。細胞生存能は、ニュートラルレッド色素を使用する吸収アッセイを用いて求めた(Ballsら、1987、「Approaches to validation alternative methods in toxicology」、In: Goldber A.M.(編)、N.Y. Academic Press、45〜58頁)。様々な配合物で24〜72時間処置した後、細胞をPBS緩衝液で洗浄し、ニュートラルレッド溶液(33mg/l)を用いて37℃で4時間インキュベートした。引き続いて、細胞をPBS緩衝液で再び洗浄し、溶解液(1%の酢酸を含有する水中、50%のエタノール)で処理した。プレートの読みは、Novapathプレートリーダー(Biorad、Hercules、CA)を使用して実施した。(Di Cagnoら、2010、「Quorum sensing in sourdough Lactobacillus plantarum DC400: induction of plantaricin A (PlnA) under co-cultivation conditions with other lactic acid bacteria and effect of PlnA on bacterial and Caco-2 cells」、Proteomics近刊).
(1)プランタリシン型ペプチドフェロモンの合成および精製
WFH培地培養中で18時間増殖させた後、L.プランタルム DC400(DSM23213)単一培養の細胞密度は、9.27±0.18log ufc/mlであった。μmaxおよびλ値は、それぞれ、約0.27log ufc/ml/時間、および3.77時間であった。乳酸菌の細胞密度は、9.0±0.05(L.ブレビスCR13)から9.43±0.31log ufc/ml(L.プランタルムDPPMA20)まで変化した。μmax値は、0.11±0.05(L.ペントサス12H5)から0.15±0.04log ufc/ml/時間(L.プランタルムDPPMA20)まで変化し、ならびにλ値は、0.37±0.07(P.ペントサセウス2XA3)から4.20±0.36時間(L.ロシアエ DPPMA174(DSM23214))まで変化した。単一培養と比較して、微生物を他の乳酸菌とともに共培養した場合、L.プランタルム DC400(DSM23213)の細胞密度は、著しく変化しなかった(P>0.05)(9.06±0.34 - 9.28±0.42log ufc/ml)。L.プランタルムDPPMA20、ラクトバシラス・パラリメンタリウス(Lactobacillus paralimentarius)8D、L.ペントサス12H5、ラクトバシラス・ロイテリ(Lactobacillus reuteri)、およびワイセラ・シバリア(Weissella cibaria)10XA16の細胞収率も、共培養条件によって調整されなかった。反対に、L.ロシアエ DPPMA174(DSM23214)およびP.ペントサセウス2XA3の細胞密度は、単一培養条件と比較して著しく減少する(P<0.05)(約8.08および8.39log cfu/ml)。一般に、L.プランタルム DC400(DSM23213)と共培養される場合、μmax値は、すべての乳酸菌で減少する。L.プランタルムDPPMA20を例外として、λ潜伏期もすべての乳酸菌で増大する。L.プランタルム DC400(DSM23213)共培養の結果として阻害を示した乳酸菌株(L.ロシアエ DPPMA174(DSM23214)およびP.ペントサセウス2XA)、ならびに共培養条件によって影響されなかったいくつかの株(L.プランタルムDPPMA20およびL.ペントサス12H5)を、引き続く実験で使用した。
L.ロシアエ DPPMA174(DSM23214)を、2.5μg/mlの精製された、または化学合成されたプランタリシンAを添加したWFH培地上で培養した。図3において、精製されたプランタリシンAの存在は、細胞数の顕著な減少、すなわち、9.18±0.26(単一培養条件下)から8.4±0.14log ufc/mlをもたらしたことが観察される。同様の結果が、化学合成されたプランタリシンAを使用して得られた。両方のこれらの場合において、L.プランタルム DC400(DSM23213)およびL.ロシアエ DPPMA174(DSM23214)共培養について見出されたものと同様の結果が観察された。培養が精製された、または化学合成されたプランタリシンAの存在下で実施された場合の損傷または死亡したL.ロシアエ DPPMA174(DSM23214)細胞数は、DPPMA174(DSM23214)単一培養より著しく(P<0.05)高かった(約8.80±0.14対6.08±0.22log細胞/ml)。
単一培養と比較して、L.プランタルム DC400(DSM2323)との共培養、または精製されたプランタリシンAの存在下で培養されたL.ロシアエ DPPMA174(DSM23214)の細胞質ゾル抽出物の二次元電気泳動分析は、それぞれ、51および27タンパク質の発現レベルの変動を示す。プランタリシンAの存在下で高発現したすべてのタンパク質は、共培養条件下でも高発現した。例として、図4は、単一培養、L.プランタルムDC440との共培養、および精製されたプランタリシンAの存在下での単一培養条件を指すゲルの一部を示す。より高発現したタンパク質のいくつかは、質量分析を使用して同定され、タンパク質生合成(セリル-tRNA合成酵素)、エネルギー代謝(グルコース-6-リン酸脱水素酵素、ホスホグリセレートムターゼ、アセトアルデヒド-CoA脱水素酵素、6-ホスホ-グルコネート脱水素酵素、およびβ-ホスホ-gluco-ムターゼ)、タンパク質およびアミノ酸の異化(ATP依存性ClpプロテイナーゼおよびRアミノペプチダーゼ)、環境ストレス応答(GroEL、GroES、S2、およびS5リボソームタンパク質)、ならびに酸化還元電位恒常性(NADHオキシダーゼ)に関与することが見出された。これらのタンパク質の大部分は、環境ストレス条件に対する応答および/または細胞コミュニケーション機構として、他の乳酸菌においても同定された(Di Cagnoら、2007、「Cell-cell communication in sourdough lactic acid bacteria: a protomic study in Lactobacillus sanfranciscensis CB1」、Proteomics 7:2430〜2446)。特に、グルコース-6-リン酸脱水素酵素は、大腸菌(Escherichia coli)細胞のプログラム死の機構におけるフラトリサイド(fratricide)ペンタペプチドの放出を触媒する(Kolodkin-Galら、2007、「A linear pentapeptide is a quorum-sensing factor required for mazef-mediated cell death in Escherichia coli」、Science 318:652〜655)。
2.5μg/mlのプランタリシンA濃度を伴うプランタルム DC400(DSM23213)およびL.ロシアエ DPPMA174(DSM23214)共培養からのバイオマス試料、ならびに2.5μg/mlの同じ濃度の共培養由来の精製されたプランタリシンAの両方を、SkinEthic(登録商標)モデルによる再生ヒト表皮の処置についてアッセイした。このモデルは、科学界によって広く使用され、認められている(Di Cagnoら、2009、「Synthesis of γ-amino butyric acid (GABA) by Lactobacillus plantarum DSMZ19463: functional grape must beverage and dermatological application」、Appl Biotechnol Microbiol DOI: 10.1007/S00253-009-23704)。24時間処置した後、TEER測定を実施した。このタイプの分析は、国際的な科学界によって広く認められており、角質層の完全性、および関門機能を参照として採用して組織腐食を評価する。特に、この評価を使用して、角質層レベルでの層状の緻密な構造の存在、タイトな完全な(integral)接合部、および表皮の厚さについての情報を得ることが可能である。これらの要因は、全体として効率的な関門機能を定義する。図5は、プランタリシン含有バイオマス、および対象の共培養由来の精製されたプランタリシンAの存在の両方において、TEER値の有意な増大(P<0.05)が起こり、したがって、皮膚レベルでのこの分子の保護活性を実証する。同じ結果が、化学合成されたプランタリシンAを使用して得られた。
Caco-2/TC7細胞の生存能を、ニュートラルレッド色素吸着能力として評価した。DMEM培地(陰性対照)と比較して、精製されたプランタリシンA(2.5g/ml)を用いた24〜72時間のインキュベーションは、Caco-2/TC7細胞の生存能を著しく増大させた(図6)。同じ結果を、化学合成されたプランタリシンAを使用して得た。プランタリシンAに使用した同じクロマトグラフィー条件によって溶出した、L.ロシアエ DPPMA174(DSM23214)単一培養で精製した画分に由来する試料を使用する処置によって、誘導はまったく観察されなかった。予期されたように、Caco-2/TC7細胞のγ-インターフェロン(IFN-γ)への曝露は、顕著な生存能減少をもたらした(P<0.05)(図7)。反対に、IFN-γの負の効果は、精製された、または化学合成されたプランタリシンAを用いた同時の処置の存在下で完全に排除される。精製されたプランタリシンAの添加は、Caco-2/TC7細胞についてのTEER値の顕著な増大(P<0.05)をもたらした(図8)。同じ結果が、Caco-2/TC7細胞を使用して観察された。DMEM培地と比較して、IFN-γの添加により、TEER値が著しく(P<0.05)低減した。しかし、精製された、または化学合成されたプランタリシンAの添加により、この場合も、負の効果が排除された。
本文の他の部分で上記に概略したように、プランタリシンAを合成するための生物工学的方法、および皮膚科学的分野におけるその使用を開発した。前記プロセスは:
a)mMRS培地上の純粋な培養液中でのL.プランタルム DC400(DSM23213)およびL.ロシアエ DPPMA174(DSM23214)の培養;
b)細胞収集、洗浄、WFH、CDM、グレープマスト、乳清、または培地としての養分利用可能性のために適切にインテグレートしている野菜もしくは果実の水性抽出物中での再懸濁;
c)30〜37℃、好ましくは30℃で、18〜24時間、好ましくは24時間の共培養インキュベーション;
d)遠心分離による細胞分離。プロセスの変形によれば、配合物は、乳酸菌細胞を含有することもできる;
e)乾燥または凍結乾燥プロセスによる配合物の脱水;
f)皮膚用配合物の生産
を含む。
創傷治癒における本発明によるバイオマスおよびプランタリシンAの効果についての試験
方法
培養したヒトケラチノサイトを、プランタリシンA(2.5μg/ml)またはプランタリシンA含有バイオマスとともに1時間インキュベートした。
試験は、損傷境界を越えて遊走し、したがって「外傷を治癒する」ケラチノサイトの能力を促進または促進しないかにおける処置効果が評価されるように、細胞単層の連続性の機械的な中断を実施する工程からなる。
図9において、創傷治癒アッセイの結果を報告する。細胞連続性の中断後に24時間インキュベートした後に、刺激されなかったケラチノサイト単層(対照)は、創傷の縁から及ぶいくつかの細胞を示す。しかし、細胞がヒアルロン酸で刺激される場合、細胞遊走は特に明らかである。この場合、実際に、外傷部のギャップは処置されなかった細胞(対照)より狭く、創傷治癒についての細胞遊走能力を立証している。
使用した表皮モデルは、Skinethic(登録商標)Laboratories、Nice(フランス)によって作製され、120μのバッチ平均厚さを有する、分化17日目からの0.5cm2の試料として使用される(角質層および生き生きした表皮(vital epidermis)).
経上皮電気抵抗(TEER)は、皮膚の関門機能性の直接の測定法である。これは、厚さおよび構造の両方から全体として生じる組織の抵抗を反映する。これは、タイトな接合部レベル、外側の物質の貫通を保護する2層脂質構造での細胞間接触の完全性を反映する。
プランタリシンA:皮膚の関門機能の維持および回復のためのその役割についての試験
この試験は、以下の目的が達成されるためのL.プランタルム DC400(DSM23213)およびL.ロシアエ DPPMA174(DSM23214)共培養によって得られるプランタリシンAの使用に基づく:
細胞培養
使用した細胞株は、1%のペニシリンおよびストレプトマイシンの存在下で、10%の子ウシ血清(FBS)、2mMのL-グルタミン、1%の非必須アミノ酸を添加したMEM(最小必須培地)培地中、5%のCO2の高湿度雰囲気中で、37℃でインキュベートした、滅菌したフラスコ内で培養したヒトNCTC2544ケラチノサイト細胞株(Perry, V.P.、Sanford, K.K.、Evans, V.J.、Hyatt, G.W.、Earle, W.R.、1957、「Establishment of clones of epithelial cells from human skin」、J Natl Cancer Inst、18 (5): 709〜717)である。細胞は、単層として培養プレート表面に接着してインビトロで増殖する。
方法の原理:
実験は第1にコンフルエントな細胞単層の成長を伴う。引き続いて、カットが実施され、生じた「ギャップ」を、細胞が徐々に移動して損傷を修復する際に顕微鏡を使用して観察する。
○ NCTC2544細胞を蒔き、37℃で5%のCO2とともに24時間培養する。
○ 24時間後に、細胞増殖に対する血清効果を回避するために完全成長培地を無血清培地と置き換え、細胞を、37℃、5%のCO2でさらに24時間インキュベートする。
○ 24時間後に、細胞単層を、200μlのピペットチップで穏やかにブラッシングし、約1mmの幅の水平の線の跡をつけることによって機械的に損傷させる。次いで単層を洗浄し、試験される物質を添加した後、37℃、5%のCO2で、72時間、プレートをインキュベートする。
○ 細胞運動性に対する物質の効果を、位相差倒立顕微鏡を使用して評価し、様々な適切に選択された分析時間で画像を得る。
○ 損傷治療は、画像処理ソフトウェア(Leica application Suite)を使用して、カットして0、4、8、12、24、48、72時間後に、カット部と2つの遊走前線との間のクリアな領域を測定して判定する。
○ 各実験のすべてのデータは、0、4、8、12、24、48、および72時間での測定についてExcelで統計的に処理する。
手順は、3つの基本的な工程からなる:
I. 細胞からのトータルRNAの抽出
II. cDNAにおけるレトロ転写
III. リアルタイムPCR
1%のペニシリンおよびストレプトマイシンの存在下で、10%の子ウシ血清(FBS)、2mMのL-グルタミン、1%の非必須アミノ酸を添加したMEM(最小必須培地)培地中、5%のCO2の高湿度雰囲気中で、37℃でインキュベートした、培養フラスコ内で維持された、不死化されたNCTC2544ヒトケラチノサイト細胞株を使用する。細胞株を、200μlのピペットチップを使用してこすり、様々な時間および濃度で処置する。
このプロセスは、「High Capacity cDNA Reverse Transcription Kit」(Applied Byosistem)を使用して抽出されたRNA試料の増幅を含む。
このプロセスは、特定のTaqman遺伝子アッセイ、および「TaqMan Universal PCR Master Mix with Amperase UNG 2X」キット(Applied Biosystem)を使用するcDNA増幅を含む。
創傷治癒
創傷治癒アッセイによる共培養由来プランタリシンのヒトNCTC2544ケラチノサイトの遊走を変更する能力を評価した。
Claims (12)
- プランタリシンA、K、もしくはN、またはこれらの混合物から選択される少なくとも1つのプランタリシン、ならびにラクトバシラス・プランタルム DSM23213およびラクトバシラス・ロシアエ DSM23214乳酸菌を含み、あるいはこれらからなるバイオマスの合成のための、あるいはプランタリシンA、K、もしくはN、またはこれらの混合物から選択される1つまたは複数のプランタリシンの調製のための生物工学的方法であって、以下の工程、すなわち:
a)ラクトバシラス・プランタルム DSM23213およびラクトバシラス・ロシアエDSM23214乳酸菌の培養増殖;
b)CDM、WFH、グレープマスト、乳清、果実産物抽出物、及び野菜産物抽出物からなる群から選択される基質の、工程a)に記載の乳酸菌の水性懸濁液との共接種;
c)インキュベーション;ならびに場合により、
d)乳酸菌細胞を取り出すための培養ブロスの遠心分離
を含み、またはこれらの工程からなる、方法。 - 工程a)からの懸濁液の細胞密度が、各乳酸菌種について9.0Log cfu/mlであり、これが、基質体積に対して1〜4%の範囲の百分率で基質に添加される、請求項1に記載の方法。
- インキュベーションが、30〜37℃の温度で、18〜24時間実施される、請求項1または2に記載の方法。
- 遠心分離が、4℃で、10,000×gで15分間実施される、請求項1から3のいずれか一項に記載の方法。
- 乾燥または凍結乾燥による、工程d)で得られた上清の脱水のための工程e)をさらに含む、請求項1から4のいずれか一項に記載の方法。
- プランタリシンA、K、もしくはN、またはこれらの混合物から選択される少なくとも1つのプランタリシン、ならびにラクトバシラス・プランタルム DSM23213およびラクトバシラス・ロシアエ DSM23214乳酸菌を含み、あるいはこれらからなる、バイオマス。
- 1つまたは複数の医薬として許容可能な賦形剤および/またはアジュバントと共に、活性成分として請求項6に記載のバイオマスを含み、またはこれらからなる医薬品組成物または美容組成物。
- 表皮または腸壁の関門機能を増大させるための薬物を調製するための、プランタリシンA、ラクトバシラス・プランタルム DSM23213およびラクトバシラス・ロシアエ DSM23214乳酸菌を含むかもしくはこれらからなる、バイオマス、または1つもしくは複数の医薬として許容可能な賦形剤および/もしくはアジュバントと共に、活性成分として前記バイオマスを含むかもしくはこれらからなる組成物の使用。
- 創傷治癒用の薬物を調製するための、プランタリシンA、ラクトバシラス・プランタルム DSM23213およびラクトバシラス・ロシアエ DSM23214乳酸菌を含むかもしくはこれらからなる、バイオマス、または1つもしくは複数の医薬として許容可能な賦形剤および/もしくはアジュバントと共に、活性成分として前記バイオマスを含むかもしくはこれらからなる組成物の使用。
- ラクトバシラス・プランタルム DSM23213もしくはラクトバシラス・ロシアエDSM23214乳酸菌、またはこれらの混合物。
- 表皮の関門機能を増大させるための薬物を調製するための、プランタリシンAの使用。
- 創傷治癒用の薬物を調製するための、プランタリシンAの使用。
Applications Claiming Priority (3)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
ITRM2010A000004A IT1399793B1 (it) | 2010-01-12 | 2010-01-12 | Procedimento di preparazione di una biomassa comprendente plantaricina e suoi usi in campo medico. |
ITRM2010A000004 | 2010-01-12 | ||
PCT/IT2011/000003 WO2011086589A1 (en) | 2010-01-12 | 2011-01-04 | Process for the preparation of a biomass comprising plantaricin and uses thereof in medical field |
Publications (3)
Publication Number | Publication Date |
---|---|
JP2013516981A JP2013516981A (ja) | 2013-05-16 |
JP2013516981A5 JP2013516981A5 (ja) | 2016-06-02 |
JP5947220B2 true JP5947220B2 (ja) | 2016-07-06 |
Family
ID=42238665
Family Applications (1)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
JP2012548540A Expired - Fee Related JP5947220B2 (ja) | 2010-01-12 | 2011-01-04 | プランタリシンを含むバイオマスを調製するための方法および医療分野におけるその使用 |
Country Status (11)
Country | Link |
---|---|
US (2) | US20130059790A1 (ja) |
EP (1) | EP2523673B1 (ja) |
JP (1) | JP5947220B2 (ja) |
CN (1) | CN102844039B (ja) |
BR (1) | BR112012017300A2 (ja) |
CA (1) | CA2785634A1 (ja) |
ES (1) | ES2631459T3 (ja) |
IT (1) | IT1399793B1 (ja) |
MX (1) | MX2012007970A (ja) |
RU (1) | RU2566999C2 (ja) |
WO (1) | WO2011086589A1 (ja) |
Families Citing this family (8)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
ITRM20110406A1 (it) | 2011-07-28 | 2013-01-29 | Giuliani Spa | Plantaricine e biomassa comprendente plantaricine per l?uso in campo cosmetico e medico. |
JP2013150599A (ja) * | 2011-12-27 | 2013-08-08 | Nihon Univ | 抗菌物質生産菌と発酵菌を共培養する発酵法 |
CN111163788A (zh) * | 2017-09-01 | 2020-05-15 | 好侍健康食品株式会社 | 用于促进透明质酸生成的组合物 |
TWI726429B (zh) * | 2019-09-27 | 2021-05-01 | 寶耕生技股份有限公司 | 用於皮膚傷口癒合之用途的大豆醱酵組合物 |
CN112940960B (zh) * | 2020-12-30 | 2022-02-08 | 北京工商大学 | 一株枯草芽孢杆菌bs-15及其制备方法和在诱导植物乳杆菌素ef合成中的应用 |
CN114478723B (zh) * | 2022-01-29 | 2024-04-02 | 南京农业大学 | 一种提高革兰氏阴性菌外膜通透性的抗菌肽 |
CN115191615B (zh) * | 2022-05-17 | 2023-08-15 | 浙江工商大学 | 一种具有肠道微生态调节功能的乳酸菌细菌素 |
CN116948921B (zh) * | 2023-09-19 | 2023-12-26 | 黑龙江省科学院微生物研究所 | 植物乳杆菌及其外泌体的应用 |
Family Cites Families (7)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
WO2005091933A2 (en) * | 2004-03-04 | 2005-10-06 | E-L Management Corporation | Skin treatment method with lactobacillus extract |
AU2005257033B2 (en) * | 2004-06-23 | 2011-05-12 | L'oreal | Method and compositions useful for preventing and/or treating sensitive and/or dry skin |
EP2050434B1 (en) * | 2006-08-10 | 2016-04-13 | House Wellness Foods Corporation | Moisturizing agent |
WO2008154518A2 (en) * | 2007-06-08 | 2008-12-18 | The University Of Chicago | Materials and methods for modulating protective pathways in epithelial cells |
CA2690267A1 (en) * | 2007-06-12 | 2008-12-18 | The University Of British Columbia | Small cationic antimicrobial peptides |
CN101353633B (zh) * | 2008-06-13 | 2011-12-28 | 浙江工商大学 | Lactobacillus plantarum ZJ316、产生的抗菌肽及其制备与应用 |
FR2954140A1 (fr) * | 2009-12-17 | 2011-06-24 | Oreal | Compositions cosmetiques ou dermatologiques a base de bacteriocines et de prebiotiques |
-
2010
- 2010-01-12 IT ITRM2010A000004A patent/IT1399793B1/it active
-
2011
- 2011-01-04 CN CN201180013649.1A patent/CN102844039B/zh not_active Expired - Fee Related
- 2011-01-04 US US13/521,695 patent/US20130059790A1/en not_active Abandoned
- 2011-01-04 RU RU2012134407/10A patent/RU2566999C2/ru not_active IP Right Cessation
- 2011-01-04 CA CA2785634A patent/CA2785634A1/en not_active Abandoned
- 2011-01-04 MX MX2012007970A patent/MX2012007970A/es active IP Right Grant
- 2011-01-04 EP EP11709193.4A patent/EP2523673B1/en active Active
- 2011-01-04 ES ES11709193.4T patent/ES2631459T3/es active Active
- 2011-01-04 BR BR112012017300A patent/BR112012017300A2/pt not_active Application Discontinuation
- 2011-01-04 WO PCT/IT2011/000003 patent/WO2011086589A1/en active Application Filing
- 2011-01-04 JP JP2012548540A patent/JP5947220B2/ja not_active Expired - Fee Related
-
2014
- 2014-05-13 US US14/276,909 patent/US20140348807A1/en not_active Abandoned
Also Published As
Publication number | Publication date |
---|---|
IT1399793B1 (it) | 2013-05-03 |
WO2011086589A1 (en) | 2011-07-21 |
ITRM20100004A1 (it) | 2011-07-13 |
RU2012134407A (ru) | 2014-02-20 |
JP2013516981A (ja) | 2013-05-16 |
BR112012017300A2 (pt) | 2016-11-22 |
MX2012007970A (es) | 2012-08-03 |
US20130059790A1 (en) | 2013-03-07 |
RU2566999C2 (ru) | 2015-10-27 |
CN102844039B (zh) | 2015-07-15 |
US20140348807A1 (en) | 2014-11-27 |
CA2785634A1 (en) | 2011-07-21 |
EP2523673A1 (en) | 2012-11-21 |
CN102844039A (zh) | 2012-12-26 |
WO2011086589A9 (en) | 2012-01-19 |
ES2631459T3 (es) | 2017-08-31 |
EP2523673B1 (en) | 2017-05-03 |
Similar Documents
Publication | Publication Date | Title |
---|---|---|
JP5947220B2 (ja) | プランタリシンを含むバイオマスを調製するための方法および医療分野におけるその使用 | |
Aguilar-Toalá et al. | Postbiotics: An evolving term within the functional foods field | |
Ren et al. | Polysaccharide of Hericium erinaceus attenuates colitis in C57BL/6 mice via regulation of oxidative stress, inflammation-related signaling pathways and modulating the composition of the gut microbiota | |
CN111511379A (zh) | 基于益生菌的组合物及其应用 | |
RU2672571C1 (ru) | Штамм lactobacillus gasseri и бактериальный препарат с гипохолестеринемической и противовоспалительной иммуномодулирующей активностями | |
CN108697743A (zh) | 用于治疗由痤疮丙酸杆菌引起的感染尤其是痤疮的乳酸菌的组合物 | |
EP2173855A1 (en) | Process for the preparation of gamma-ami no butyric acid (gaba) by the use of lactic acid bacteria (lab) on agro- and food-industry surplus | |
KR102294818B1 (ko) | 불가사리 추출물을 유효성분으로 포함하는 피부 재생 및 피부 보습용 조성물 | |
KR100889973B1 (ko) | 미세녹조류를 이용한 항산화, 주름개선, 항여드름ㆍ항염증및 미백효능을 가지는 기능성 추출물 및 그의 제조방법 | |
Espino et al. | Uncovering surface-exposed antigens of Lactobacillus rhamnosus by cell shaving proteomics and two-dimensional immunoblotting | |
Li et al. | Abietic acid ameliorates psoriasis-like inflammation and modulates gut microbiota in mice | |
He et al. | Acid tolerance response of Tetragenococcus halophilus: a combined physiological and proteomic analysis | |
JP6679202B2 (ja) | Iv型アレルギー用組成物 | |
Pangsomboon et al. | Further characterization of a bacteriocin produced by Lactobacillus paracasei HL32 | |
KR101917740B1 (ko) | 부레옥잠 추출물을 유효성분으로 함유하는 화장료 조성물 | |
JP7197204B2 (ja) | 新規のpediococcus pentosaceus ab160011菌株及びこれを含む組成物 | |
Kudo et al. | Immunomodulatory effects of extracellular glyceraldehyde 3-phosphate dehydrogenase of exopolysaccharide-producing Lactiplantibacillus plantarum JCM 1149 | |
ITRM20110330A1 (it) | Procedimento di preparazione di una biomassa comprendente plantaricina e suoi usi in campo medico. | |
TWI712415B (zh) | 含乳桿菌死菌培養物之局部組成物、醫藥組成物及其於促進傷口癒合及降低疤痕之用途 | |
Das et al. | Kimchi and sauerkraut lactic acid bacteria and human health | |
CN116444605A (zh) | 一种活性肽、活性肽组合物及其在制备具有抗衰老作用的产品中的应用 | |
CN116355812A (zh) | 罗伊氏乳杆菌(Limosilactobacillus reuteri)HCLR01及其在制备具有抗衰老作用的产品中的应用 | |
CN115678814A (zh) | 一种唾液乳杆菌及其应用 | |
CN116987142A (zh) | 含γ-氨基丁酸以及碱性益生菌活性肽的组合物及其在制备具有抗衰老作用的产品中的应用 | |
CN115747088A (zh) | 一株齐藤假丝酵母及其应用 |
Legal Events
Date | Code | Title | Description |
---|---|---|---|
A621 | Written request for application examination |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A621 Effective date: 20131115 |
|
A131 | Notification of reasons for refusal |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A131 Effective date: 20150126 |
|
A521 | Request for written amendment filed |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A523 Effective date: 20150414 |
|
A131 | Notification of reasons for refusal |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A131 Effective date: 20150601 |
|
A521 | Request for written amendment filed |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A523 Effective date: 20150608 |
|
A131 | Notification of reasons for refusal |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A131 Effective date: 20151005 |
|
A601 | Written request for extension of time |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A601 Effective date: 20160105 |
|
A601 | Written request for extension of time |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A601 Effective date: 20160204 |
|
A601 | Written request for extension of time |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A601 Effective date: 20160304 |
|
A524 | Written submission of copy of amendment under article 19 pct |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A524 Effective date: 20160405 |
|
TRDD | Decision of grant or rejection written | ||
A01 | Written decision to grant a patent or to grant a registration (utility model) |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A01 Effective date: 20160509 |
|
A61 | First payment of annual fees (during grant procedure) |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A61 Effective date: 20160602 |
|
R150 | Certificate of patent or registration of utility model |
Ref document number: 5947220 Country of ref document: JP Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R150 |
|
LAPS | Cancellation because of no payment of annual fees |