JP5930613B2 - 微生物のdna情報に基づいたメタン発酵の運転管理 - Google Patents
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Description
[1]有機性廃棄物のメタン発酵系におけるメタン発酵効率をモニタリングする方法であって、下記のプライマーセット:
(a)配列番号1に示される塩基配列又はこれと実質的に同一の塩基配列からなるオリゴヌクレオチド;及び
(b)配列番号2に示される塩基配列又はこれと実質的に同一の塩基配列からなるオリゴヌクレオチド
を用いてポリメラーゼ連鎖反応(PCR)を行い、該メタン発酵系においてメタン発酵効率の低下に先駆けて増殖するか又は該低下と同時に増殖する真正細菌の16S rDNA量又は16S rRNA量を測定することを含むモニタリング方法。
[2]前記真正細菌が、配列番号3に示される塩基配列を含む16S rDNAを有する、上記[1]に記載のモニタリング方法。
[3]有機性廃棄物が、食品廃棄物、糞尿、動植物性残さ、古紙、及び汚泥からなる群から選択される、上記[1]又は[2]に記載のモニタリング方法。
[4]前記食品廃棄物がシロップ廃液である、上記[3]に記載のモニタリング方法。
[5]有機性廃棄物のメタン発酵系においてメタン発酵効率の低下に先駆けて増殖するか又は該低下の開始とともに増殖する真正細菌を検出又は定量するためのプライマーセットであって、ここで、該プライマーセットは、
(a)配列番号1に示される塩基配列又はこれと実質的に同一の塩基配列からなるオリゴヌクレオチド;及び
(b)配列番号2に示される塩基配列又はこれと実質的に同一の塩基配列からなるオリゴヌクレオチド
であるプライマーセット。
前述の通り、本発明は、有機性廃棄物のメタン発酵系におけるメタン発酵効率をモニタリングする方法であって、下記のプライマーセット:
(a)配列番号1に示される塩基配列又はこれと実質的に同一の塩基配列からなるオリゴヌクレオチド;及び
(b)配列番号2に示される塩基配列又はこれと実質的に同一の塩基配列からなるオリゴヌクレオチド
を用いてポリメラーゼ連鎖反応(PCR)を行い、該メタン発酵系においてメタン発酵効率の低下に先駆けて増殖するか又は該低下と同時に増殖する真正細菌の16S rDNA量又は16S rRNA量を測定することを含むモニタリング方法に関する。
本発明のモニタリング方法において標的とする真正細菌は、Anaerobic syntrophic bacterium NE23−3に近縁の真正細菌であって、固有の16S rRNA(又は16S rDNA)を有する。本発明者らは、メタン発酵中に有機物負荷を徐々に増大させていくと、ある量(「限界負荷量」という。)を超えた時点からメタン発酵効率の低下が見られ、この限界負荷量の前後からある種の真正細菌が増加することを見出し、メタン発酵中のこの真正細菌の16S rRNA(又は16S rDNA)(本明細書において、その部分塩基配列を「バンドB6」と呼ぶ。)量をリアルタイムPCRで測定することにより、メタン発酵効率のモニタリングに成功し、本発明を完成させた(後述する実施例4参照、図6)。なお、バンドB6の塩基配列を図1に示す(配列番号3)。
357f(フォワード):5’−CCTACGGGAGGCAGCAG−3’(配列番号5)(配列番号4のヌクレオチド324−340に対応)
517r(リバース):5’−ATTACCGCGGCTGCTGG−3’(配列番号6)(配列番号4のヌクレオチド518−502に対応)
を用いて、該核酸をポリメラーゼ連鎖反応(PCR)法により増幅する。上記プライマーセットIは、真正細菌を含む大部分の原核生物の16S rRNA遺伝子に結合するとされるユニバーサルプライマーであって、大腸菌の16S rRNA遺伝子の塩基配列を基準にすると、プライマー357f及び517rは、それぞれヌクレオチド341−357及び517−534に対応する。なお、上記プライマー357fには、GCクランプ(5’−CGCCCGCCGCGCGCGGCGGGCGGGGCGGGGGCACGGGGGG−3’)(配列番号7)が付加されている。また、核酸を増幅するための方法としては、PCR法(Saiki R.K.ら,Science,230,1350−1354(1985))に限定されず、当業者であれば、ライゲース連鎖反応(LCR)(Wu D.Y.ら,Genomics,4,560−569(1989))、及び転写に基づく増幅(Kwoh D.Y.ら,Proc.Natl.Acad.Sci.USA,86,1173−1177(1989))等の温度循環を必要とする反応、並びに鎖置換反応(SDA)(Walker G.T.ら,Proc.Natl.Acad.Sci.USA,89,392−396(1992); Walker G.T.ら,Nuc.Acids Res.,20,1691−1696(1992))等を用いることができることは容易に理解される。なお、本発明のモニタリング方法では、メタン発酵効率をリアルタイムで測定する必要性からPCR法を利用することが好ましい。PCR反応条件は、例えば、2本鎖DNAの熱変性を90〜98℃で5秒〜10分間行い、アニーリングを50〜70℃で10秒〜2分間行い、伸長反応を60〜75℃で10秒〜10分間行う。任意に、最終伸長反応を伸長反応と同じ温度で10秒〜15分間行う。熱変性−アニーリング−伸長反応のサイクルを5〜50回行う。
本発明によれば、有機性廃棄物のメタン発酵系におけるメタン発酵効率をモニタリングする方法が提供され、より具体的には、下記のプライマーセット:
(a)配列番号1に示される塩基配列又はこれと実質的に同一の塩基配列からなるオリゴヌクレオチド;及び
(b)配列番号2に示される塩基配列又はこれと実質的に同一の塩基配列からなるオリゴヌクレオチド
を用いてポリメラーゼ連鎖反応(PCR)を行い、該メタン発酵系においてメタン発酵効率の低下に先駆けて増殖するか又は該低下と同時に増殖する真正細菌の16S rDNA量又は16S rRNA量を測定することを含むモニタリング方法である。
GMP478F(フォワード):5’−CGGGTGCTAATATCATCTGCGC−3’(配列番号1)(配列番号3のヌクレオチド118−139に対応)
GMP575R(リバース):5’−ATCAAACCGCCTACACGCGC−3’(配列番号2)(配列番号3のヌクレオチド255−236に対応)
を設計し、メタン発酵効率のモニタリングに使用した。大腸菌の16S rRNA遺伝子の塩基配列を基準にすると、プライマーGMP478F及びGMP575Rは、それぞれヌクレオチド457−478及び575−594に対応する。本発明のモニタリング方法では、上記プライマーセットII以外に、各プライマーに実質的に同一な塩基配列からなるオリゴヌクレオチドを使用することができる。ここで、本明細書で使用するとき、語句「実質的に同一な塩基配列」とは、対応する上記プライマーの塩基配列と90%以上、95%以上、98%以上、若しくは99%以上の配列同一性を有する塩基配列、又は上記プライマーの塩基配列の塩基の2個又は1個が欠失、付加及び/又は置換されている塩基配列をいう。
以下、実施例により本発明をさらに詳細に説明するが、本発明はこれらの実施例に限定されない。
メタン発酵にはUASB法を使用し、原料の有機性廃棄物としては、共同出願人である山梨缶詰株式会社の工場において缶詰製造過程で排出される平均2.2トン/日のシロップ廃液を用いた。使用したシロップ廃液は、主成分がスクロースであり、糖度が15.2ブリックス、全有機炭素(TOC)濃度が約71g/Lであった。メタン発酵には、外寸法φ2500×H5000mmのUASB発酵槽を用いた。発酵液容積は20m3であった。実験開始時にビール工場のUASB発酵槽で形成されたグラニュール汚泥を15m3充填した。また、実験開始から2日間は馴致期間とし、シロップ廃液を供給せずに温度を40℃に維持した。実験開始から2日以降にシロップ廃液の供給を始めるが、シロップ廃液をそのままUASB発酵槽へ投入すると負荷が高すぎるため、調整槽において水で適宣希釈し、pHが7.5付近になるように苛性ソーダを用いて調整した。その後、温調槽で39℃まで昇温した後にUASB発酵槽に導いた。水で希釈したシロップ廃液の濃度を段階的に変化させたが、およそ4〜5ヶ月後にはシロップ廃液を等量の水で希釈し、TOC濃度が35.5g/Lとなるように負荷を増加させた(図4参照)。なお、145日目以降は再び負荷量を低下させた。また、運転開始49日以降にはメタン発酵を担う微生物の活性を高める目的で金属塩CoCl2、MgCl2、MnCl2、NiCl2をそれぞれ20gずつ(供給するシロップ廃液の1ppm程度に相当)を添加し、さらに、64日以降にはC/N比が15になるように調整槽にて尿素を添加した。ガス発生量は発酵槽上部に取り付けたガス出口の流量計(山武、気体用マスフローメーター、CMS0500)で計測し、pHは槽内のpHメータ(YOKOGAWA、pH100)で計測した。なお、発生するガスは、1日1回、テドラーバッグに捕集し、その中に含まれるメタンガス濃度をガスクロマトグラフ分析装置(ヤナコ、G−1011、カラム MS13X+MS5A)を用いて測定した。メタン発酵の設定温度を40℃とし、グラニュールを含む発酵液サンプルを発酵槽下部から1700mm、壁面から750mmのサンプリング口から所定の時間間隔で、約200mLを採取して、微生物叢の解析に用いた。
採取した発酵液サンプル中のグラニュールの約1gを滅菌したスパーテルですくい取り、30mLの滅菌水で洗浄してグラニュール表面に付着している微生物を除去した。その後、その0.3gを使用して、Isoil for Beads Beating kit(Nippon Gene Co.,Ltd.)によりDNAを抽出した。次に、グラニュールから抽出したDNAには、真正細菌及び古細菌に由来するDNAが含まれるが、真正細菌に由来するDNAを増幅させるために、前述のプライマーセットI(プライマー357fと517r)を用いた。増幅条件を以下の表1に示す。
真正細菌からバンドB6を検出するためにDGGE(変性剤濃度勾配ゲル電気泳動)法を用いた。DGGEにはThe Dcode Universal Mutation Detection system(Bio−Rad、Hercules、Calif.)を使用した。まず、グラニュールから抽出した真正細菌由来のDNAを増幅したPCR産物を変性剤の濃度勾配が30%から60%(変性剤100%では7Mの尿素と40%[wt/vol]のホルムアミドを含む)の厚さ0.8mmのポリアクリルアミドゲル(10%[wt/vol]アクリルアミドとビスアクリルアミドの割合は37.5:1)を用いて、1.0×Tris−acetate−EDTA(TAE)溶液中で60℃、200V、3.5時間の条件で電気泳動を行った。なお、電気泳動の後、200mLの1.0×TAE溶液と20μLのエチジウムブロマイド溶液を混合した溶液にゲルを浸し、30分間染色した後、紫外線下で可視化した。
M13 F(5’−GTAAAACGACGGCCAG−3’)(配列番号8)
M13 R(5’−CAGGAAACAGCTATGAC−3’)(配列番号9)
を用いてDNAを増幅し、その増幅産物について、さらにプライマーセットIを用いてPCRを行い、再度DGGEを行ってバンドの出現位置を確認した。なお、プライマーセットIIIを用いたPCR条件を以下の表3に示す。
一般に嫌気性菌は増殖が遅く、生成するコロニーも小さいので寒天平板上でのコロニーアピアランスによる識別が困難であることから、メタン発酵のような複数の微生物が共存する複合微生物の系で特定の微生物の濃度を選択的に定量するためには、その微生物に特徴的な遺伝子の配列を検出するリアルタイムPCR法を有効に使用することができる。そこで、バンドB6を特異的に検出するプライマーセットを設計し、これを用いてメタン発酵槽のグラニュール中の真正細菌に含まれるバンドB6を定量した。ここで使用するリアルタイムPCR法は、PCRによるDNAの増幅量をリアルタイムでモニタリングし、測定される蛍光強度の閾値と増幅曲線が交わるサイクル数(Ct値(Threshold Cycle))と、初期鋳型量、すなわち初期微生物濃度の間に直線関係があることを利用して、微生物濃度を定量する方法である。
バンドB6は、前述のプライマー357Fと517Rに含まれる塩基配列の情報からAnaerobic syntrophic bacterium NE23−3(Accession No.AB231802)に最も近縁であることが判明した。NE23−3株の塩基配列情報(図2)をもとにBioEdit v7.0.9 General Informationを用いて、NE23−3株とその他の微生物群における塩基配列の相同性を確認し、塩基配列の中で保存性の低い領域を検索して、特異性の高いプライマーをFastPCR(URL:http://www.primerdigital.com/fastpcr.html)の推奨結果を参考に設計した。なお、プライマーの設計時は、一般的にいわれている以下の条件を満たすように留意した。増幅サイズは80〜150塩基(増幅効率を100%にするため)、プライマー長さは17〜25塩基(長過ぎるとアニーリング効率が低下する)GC含量は40〜60%(45〜55%が望ましい)とし、偏りがないように、部分的にGC、ATリッチができないように注意する、T/C、A/Gが連続しないように注意する、プライマー内部での3 塩基以上の相補的配列を避ける、プライマー間での3塩基以上の相補的配列を避ける、プライマー3’末端が2塩基相補する配列を避ける。設計したプライマー(プライマーセットII)の塩基配列は前述の通りである。
設計したプライマーセットIIが目的菌に選択的であることをBioEdit v7.0.9 General Informationを用いて、プライマーの塩基配列と目的菌以外の微生物群の塩基配列とを比較することで確認するとともに、実際のメタン発酵グラニュールサンプルに設計したプライマー(プライマーセットII)を作用させて、増幅される複数のDNA断片の塩基配列がすべて同一であることを確かめた(データ示さず)。増幅されるDNA断片の塩基配列が同一であれば、設計したプライマーが類似の塩基配列を有する複数種類の微生物を検出する可能性は極めて小さくなる。まず、メタン発酵グラニュールサンプルにプライマーセットIIを加えてPCRによりDNA断片を増幅させた。なお、PCR条件を以下の表4に示す。
メタン発酵グラニュールサンプルを適宜希釈して、設計したプライマーの定量性を確認した。メタン発酵グラニュールサンプルは発酵開始125日目のものを用いた。リアルタイムPCR装置はSmart Cycler II(タカラバイオ株式会社)を用い、PCR反応液は、プライマーセットIIとSYBR Premix Ex Taq(タカラバイオ株式会社)を用いて、下記の表5のように調製した。
メタン発酵グラニュールサンプルからのDNA抽出物にリアルタイムPCR法を適用してバンドB6に対応する菌体濃度を測定した。用いたプライマーセットとPCR条件は、検量線を作成したときと同様とした。なお、菌体濃度はメタン発酵125日後の菌体濃度が最大になるときを1とした相対濃度で示した(図6参照)。
Claims (4)
- 食品廃棄物又は動植物残さのメタン発酵系におけるメタン発酵効率をモニタリングする方法であって、下記のプライマーセット:
(a)配列番号1に示される塩基配列又はこれと実質的に同一の塩基配列からなるオリゴヌクレオチド;及び
(b)配列番号2に示される塩基配列又はこれと実質的に同一の塩基配列からなるオリゴヌクレオチド
を用いてポリメラーゼ連鎖反応(PCR)を行い、該メタン発酵系においてメタン発酵効率の低下開始の3週間前から増殖するか又は該低下と同時に増殖する真正細菌の16S rDNA量又は16S rRNA量を測定することを含むモニタリング方法。 - 前記真正細菌が、配列番号3に示される塩基配列を含む16S rDNAを有する、請求項1に記載のモニタリング方法。
- 前記食品廃棄物がシロップ廃液である、請求項1又は2に記載のモニタリング方法。
- 食品廃棄物又は動植物残さのメタン発酵系においてメタン発酵効率の低下開始の3週間前から増殖するか又は該低下の開始とともに増殖する真正細菌を検出又は定量するためのプライマーセットであって、ここで、該プライマーセットは、
(a)配列番号1に示される塩基配列又はこれと実質的に同一の塩基配列からなるオリゴヌクレオチド;及び
(b)配列番号2に示される塩基配列又はこれと実質的に同一の塩基配列からなるオリゴヌクレオチド
であるプライマーセット。
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