JP5927048B2

JP5927048B2 - Ｔｒｐｖ３活性化剤

Info

Publication number: JP5927048B2
Application number: JP2012129068A
Authority: JP
Inventors: 智大白井; 楠奥　比呂志; 比呂志楠奥; 堅太郎組橋
Original assignee: Kao Corp
Current assignee: Kao Corp
Priority date: 2011-06-09
Filing date: 2012-06-06
Publication date: 2016-05-25
Anticipated expiration: 2032-06-06
Also published as: JP2013014580A

Description

本発明は、ＴＲＰＶ３活性化剤及び温感剤に関する。

感覚は、外部から受けた刺激が電気信号に変換され、神経細胞を通じて脳に伝達されることで生じる。外部刺激を電子信号に変換するには、その外部刺激を感知する受容体の存在が必要である。かかる受容体のうち、温度感覚を感知する受容体としてカプサイシン受容体（ＴＲＰＶ１）が、１９９７年に同定された（非特許文献１）。ＴＲＰＶ１は、カプサイシンのほかに４３℃以上の熱刺激で活性化されることから、温度感覚の受容体であると予想されていた。更に、ＴＲＰＶ１欠損マウスが熱刺激に対して鈍い反応しか示さないことから、ＴＲＰＶ１が熱受容体として機能することが確認されている（非特許文献２）。

しかしながら、ＴＲＰＶ１の活性化温度である４３℃は生体に痛みを生じさせる温度であること、更に化学リガンドであるカプサイシンは温感物質であると同時に発痛物質であることから、ＴＲＰＶ１は痛みの受容体として機能すると考えられている（非特許文献３）。

ＴＲＰＶ３は、ＴＲＰＶ１と同じＴＲＰ（ＴｒａｎｓｉｅｎｔＲｅｃｅｐｔｏｒＰｏｔｅｎｔｉａｌ）ファミリーに属するイオンチャネルであり、２００２年に同定された温度受容体である（非特許文献４）。この受容体は活性化閾値が３０℃台であることから、痛みではなく温かい温度の受容体であると予想されている。更に、ＴＲＰＶ３欠損マウスを用いた解析から、ＴＲＰＶ３が皮膚での温度受容に関与することが確認されている（非特許文献５）。

ＴＲＰＶ３は、ヒノキの樹精の含有成分であるカンファーや、タイムやオレガノの含有成分であるチモールやカルバクロールなどの植物由来成分により活性化されることが知られている（非特許文献６）。

過去において、ＴＲＰＶ３を活性化する化合物の探索が行われ（非特許文献７）、カルバクロール等のテルペン類がＴＲＰＶ３活性化能を示すことが開示されている。しかしながら、そのＴＲＰＶ３活性化能は十分なものとはいえず、ＴＲＰＶ３を活性化する更なる物質の探索が求められている。

Ｎａｔｕｒｅ３８９，８１６−８２４，１９９７Ｓｃｉｅｎｃｅ２８８，３０６−３１３，２０００総研大ジャーナル１０，４０−４５，２００６Ｓｃｉｅｎｃｅ２９６，２０４６−２０４９，２００２Ｓｃｉｅｎｃｅ３０７，１４６８−１４７２，２００５ＢｒｉｔｉｓｈＪｏｕｒｎａｌｏｆｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｙ１５１，５３０−５４０，２００７Ｂｒｉｔｉｓｈ．Ｊ．Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．，１５１，５３０−５４０，２００７

本発明は、温感を付与できるＴＲＰＶ３活性化剤、及びそれを用いた温感付与方法の提供に関する。

本発明者らは、下記式で表される２−アルキルフェノール誘導体が、ＴＲＰＶ３を活性化する結果、その使用者に温感として感じさせる、すなわち温感を付与するための素材として有用であることを見出した。

すなわち本発明は、以下の（１）から（３）に係るものである。
（１）下記式（１）：

〔式中、Ｒは水素原子、炭素数１〜４のアルキル基又は炭素数２〜４のアルケニル基を示す〕
で表される２−アルキルフェノール誘導体を有効成分とするＴＲＰＶ３活性化剤。
（２）下記式（１）：

〔式中、Ｒは水素原子、炭素数１〜４のアルキル基又は炭素数２〜４のアルケニル基を示す〕
で表される２−アルキルフェノール誘導体を有効成分とする温感剤。
（３）下記式（１）：

〔式中、Ｒは水素原子、炭素数１〜４のアルキル基又は炭素数２〜４のアルケニル基を示す〕
で表される２−アルキルフェノール誘導体を用いることを特徴とする温感付与方法。

本発明の２−アルキルフェノール誘導体を、例えば化粧品、医薬品又は医薬部外品に配合することにより、それを使用者が服用、塗布した場合に、痛みを伴うことなく、安全かつ簡便に温感を感受しうる。

本発明のＴＲＰＶ３活性化とは、受容体であるＴＲＰＶ３を活性化すること、すなわちＴＲＰＶ３受容体に対してアゴニスト活性を示すことを云う。当該ＴＲＰＶ３受容体アゴニスト活性によりＴＲＰＶ３受容体が活性化され、それを使用者が温感として感受する。
したがって、本発明のＴＲＰＶ３活性化剤及び温感剤は、例えば化粧品、食品、医薬品又は医薬部外品等に配合されることにより、それを使用者が服用、塗布した場合に、痛みを伴うことなく温感を感受することができる。

本発明の式（１）で表される２−アルキルフェノール誘導体のうち、Ｒで示される炭素数１〜４のアルキル基としては、直鎖状又は分岐状の何れであってもよく、メチル基、エチル基、ｎ−プロピル基、イソプロピル基、ｎ−ブチル基、ｓｅｃ−ブチル基、イソブチル基、ｔｅｒｔ−ブチル基等が挙げられ、好ましくはメチル基又はエチル基である。

本発明の式（１）で表される２−アルキルフェノール誘導体のうち、Ｒで示される炭素数２〜４のアルケニル基としては、直鎖状又は分岐状の何れであってもよく、例えばビニル基、アリル基、２−ブテニル基、２−メチル−２−プロペニル基等が挙げられる。本発明における好適な２−アルキルフェノール誘導体としては、ｏ−ｔ−ブチルフェノール、２−ｔ−ブチル−ｐ−クレゾール、２−ｔ−ブチル−４−エチルフェノールが挙げられ、ＴＲＰＶ３活性の点から、２−ｔ−ブチル−ｐ−クレゾール又は２−ｔ−ブチル−４−エチルフェノールがより好ましい。

本発明の式（１）で表される２−アルキルフェノール誘導体は、公知の方法又はこれに準じる方法に従い化学合成することができる。例えば、２−ｔ−ブチル−ｐ−クレゾールはＬ．Ｌｕｃｉａら、Ｊ．Ｏｒｇ．Ｃｈｅｍ．，１９９９，６４，８８１２−８８１５の方法に従い合成でき、ｏ−ｔ−ブチルフェノールはＲ．Ｍ．Ｊｏｎｅｓら、Ｊ．Ｏｒｇ．Ｃｈｅｍ．，２００１，６６，３４３５−３４４１の方法に従い合成でき、２，４−ジ−ｔ−ブチルフェノールはＭ．Ｙａｍａｍｏｔｏら、特開平５−２９４８６５号の方法に従い合成でき、２−ｔ−ブチル−４−エチルフェノールはＡ．Ｔａｋｅｓｈｉｔａら、特開昭６３−１３０５４３号の方法に従い合成できる。

上記のようにして得られた２−アルキルフェノール誘導体は、更に必要に応じて再結晶法、カラムクロマトグラフィーなどの通常の精製手段を用いて精製することができる。

本発明に係る２−アルキルフェノール誘導体は、後記実施例に示すように、ＴＲＰＶ３活性化作用を有することから、使用者がそれらを適用した際に温感を感受することができる。すなわち、本発明のアルキルフェノール誘導体は、ＴＲＰＶ３活性化剤又は温感剤となり得、また、ＴＲＰＶ３活性化剤又は温感剤を製造するために使用することができる。

当該ＴＲＰＶ３活性化剤又は温感剤は、それ自体、ＴＲＰＶ３の活性化又は温感付与のための、医薬品、食品、化粧品、医薬品部外品等であってもよく、又は当該医薬品、食品、化粧品、医薬部外品等に配合して使用される素材又は製剤であってもよい。当該ＴＲＰＶ３活性化剤又は温感剤は、本発明のアルキルフェノール誘導体を単独で用いたものであってもよく、あるいは澱粉質、タンパク質、繊維質、糖質、脂質、脂肪酸、ビタミン、ミネラル、香料、着色料、甘味料、調味料、防腐剤、保存料、酸化防止剤などの、医薬品、医薬部外品、化粧品、食品に用いられる添加剤や賦形剤等と組み合わせた組成物であってもよい。またそれらの形態も特に限定されず、例えば溶液、懸濁液、シロップ、粉末、顆粒、粒子など、任意の形態に調製しうる。

ここで、医薬品及び医薬部外品の剤形は、錠剤、カプセル剤、顆粒剤、散剤、シロップ剤、静脈内注射、筋肉注射剤、坐剤、吸入剤、経皮吸収剤、点眼剤、点鼻剤、湿布剤、パップ剤、軟膏、ローション、クリーム、口腔用製剤（歯磨剤、液状歯磨剤、洗口液、歯肉マッサージクリーム、口腔用軟膏、うがい用錠剤、トローチ、のど飴等）等の何れでもよく、投与形態も、経口投与（内用）、非経口投与（外用、注射）の何れであってもよい。

食品としては、キャンディ、ガム、タブレット、カプセル、各種飲料等の何れであってもよい。

化粧品としては、皮膚外用剤、洗浄剤、メイクアップ化粧料、頭皮頭髪用化粧料、入浴剤等の何れであってもよく、それらは使用方法に応じて、ローション、乳液、ゲル、クリーム、軟膏剤、粉末、顆粒等の種々の剤型で提供できる。

上記医薬品、食品、化粧品、医薬部外品に本発明のＴＲＰＶ３活性化剤又は温感剤を配合して用いる場合の製剤中の配合量は、十分な温感付与効果を有する限り特に限定されないが、内用製剤（経口医薬品、食品、口腔用組成物等）では０．０１ｐｐｍ以上、好ましくは１ｐｐｍ以上、そして５０００００ｐｐｍ以下、好ましくは１０００００ｐｐｍ以下とするのがよい。また、外用製剤（非経口医薬品、化粧料等）では０．０１質量％以上、好ましくは０．１質量％以上、そして２０質量％以下、好ましくは１０質量％以下とするのがよい。

本発明の２−アルキルフェノール誘導体を用いて温感を付与する方法は、当該化合物をヒト（使用者）に適用（服用・塗布）することによりＴＲＰＶ３受容体が活性化され、それにより使用者が温感を感受することを特徴とする。当該温感付与方法は、２−アルキルフェノール誘導体によって使用者が温感を感受しうる態様であれば特に限定されず、例えば当該化合物又は温感剤を直接適用する形態であってもよく、あるいは他の医薬品、化粧品、食品又は医薬部外品等に含有させた形で適用する形態であってもよい。

上述した実施形態に関し、本発明においては以下の態様が開示される。
＜１＞下記式（１）：

〔式中、Ｒは水素原子、炭素数１〜４のアルキル基又は炭素数２〜４のアルケニル基を示す〕
で表される２−アルキルフェノール誘導体を有効成分とするＴＲＰＶ３活性化剤。
＜２＞下記式（１）：

〔式中、Ｒは水素原子、炭素数１〜４のアルキル基又は炭素数２〜４のアルケニル基を示す〕
で表される２−アルキルフェノール誘導体を有効成分とする温感剤。
＜３＞下記式（１）：

〔式中、Ｒは水素原子、炭素数１〜４のアルキル基又は炭素数２〜４のアルケニル基を示す〕
で表される２−アルキルフェノール誘導体を用いることを特徴とする温感付与方法。
＜４＞＜１＞のＴＲＰＶ３活性化剤又は＜２＞の温感剤を含む内用製剤であって、アルキルフェノール誘導体を１ｐｐｍ以上１０００００ｐｐｍ以下含有する製剤。
＜５＞＜１＞のＴＲＰＶ３活性化剤又は＜２＞の温感剤を含む外用製剤であって、アルキルフェノール誘導体を０．１質量％以上１０質量％以下含有する製剤。

実施例１：試験サンプル調製例
２−ｔ−ブチル−ｐ−クレゾール：
２−ｔ−ブチル−ｐ−クレゾール（東京化成工業株式会社製、Ｂ０９１０）をエタノールに溶解させ、供試サンプルとした。

ｏ−ｔ−ブチルフェノール：
ｏ−ｔ−ブチルフェノール（和光純薬工業株式会社製、０２１−０４５５２）をエタノールに溶解させ、供試サンプルとした。

２，４−ジ−ｔ−ブチルフェノール：
２，４−ジ−ｔ−ブチルフェノール（東京化成工業株式会社製、Ｄ０２２９）をエタノールに溶解させ、供試サンプルとした。

２−ｔ−ブチル−４−エチルフェノール：
２−ｔ−ブチル−４−エチルフェノール（東京化成工業株式会社製、Ｂ１８１０）をエタノールに溶解させ、供試サンプルとした。

実施例２：ＴＲＰＶ３活性の評価
（１）ヒトＴＲＰＶ３安定発現株の作製：
ヒトＴＲＰＶ３安定発現ＨＥＫ２９３細胞株を作製するため、ヒトＴＲＰＶ３遺伝子のクローニングを行った。全長ヒトＴＲＰＶ３遺伝子は、ヒト表皮角化細胞（クラボウ社製）より抽出した全ＲＮＡを鋳型とし、ＲＴ−ＰＣＲ法を用いて増幅した。

得られたＰＣＲ産物をエントリーベクターｐＥＮＴＲ−Ｄ／ＴＯＰＯ（インビトロジェン社製）へクローニングした後、ｐｃＤＮＡ３．２−Ｖ５／ＤＥＳＴ（インビトロジェン社製）へサブクローニングし、リポフェクトアミン２０００（インビトロジェン社製）によりＨＥＫ２９３細胞へ形質導入した。形質導入された細胞を、４５０μｇ／ｍｌのＧ−４１８（プロメガ社製）を含有するＤＭＥＭ培地中で増殖させることにより選抜した。ＨＥＫ２９３細胞は、内在性ＴＲＰＶ３を発現しないため、ＴＲＰＶ３形質導入株に対する対照（コントロール）として使用できる。

（２）カルシウムイメージング：
蛍光カルシウムイメージング法を用いて、ＨＥＫ２９３細胞へ形質導入したＴＲＰＶ３活性の測定を行った。まず、培養したＴＲＰＶ３発現細胞をポリ−Ｄ−リジンコートされた９６ウェルプレート（ＢＤファルコン社製）へ播種（３０，０００細胞／ウェル）し、３７℃で一晩インキュベートした後、培養液を除去し、リンガー液に溶解させたＦｌｕｏ４−ＡＭ（２μｇ／ｍｌ；同仁化学社製）を添加し、３７℃で３０〜６０分間インキュベートした。その後、９６ウェルプレートを蛍光プレートリーダー（ＦＤＳＳ３０００；浜松ホトニクス社製）にセットし、装置庫内温度を２５℃にした状態で、励起波長４８０ｎｍで励起させたときのＦｌｕｏ４による蛍光イメージを、検出波長５２０ｎｍにてＣＣＤカメラで検出した。測定は１秒毎に４分間行い、測定開始１５秒後に、ＦＤＳＳ３０００内蔵の分注器により、上記で調製した試験サンプル（終濃度１００μＭ）を添加し、蛍光強度の変化によりＴＲＰＶ３の活性を評価した。

（３）ＴＲＰＶ３活性化の評価：
ＴＲＰＶ３活性は、試験サンプルによる自家蛍光の影響を排除するため、下記の式で自家蛍光分を差し引いた。自家蛍光を差し引いた蛍光強度（Ｆ_sub）＝ＴＲＰＶ３発現細胞の蛍光強度（Ｆ_V3）−ＨＥＫ２９３細胞の蛍光強度（Ｆ_HEK）また、２−アルキルフェノール及びその誘導体によるＴＲＰＶ３活性化作用は、試験サンプル添加後の蛍光強度比のピークを用いて評価した。下記の式を用いて蛍光強度比を算出した。蛍光強度比＝各時点のＦ_sub／測定開始時のＦ_sub各処理群あたり２ウェルで評価を行い、その平均値を用いた。

（４）２−アルキルフェノール及びその誘導体のＴＲＰＶ３活性化作用：
上記実施例１で得られた各試験サンプルを１００μＭの濃度で用い、実施例２に記載の評価方法により測定したＴＲＰＶ３活性化強度を、表１に示す。なお、表の数値は、コントロールであるカルバクロールによる活性化強度を１とした場合の相対値である。

以上より、２−ｔ−ブチル−ｐ−クレゾール、ｏ−ｔ−ブチルフェノール、及び２−ｔ−ブチル−４−エチルフェノールは、公知のＴＲＰＶ３活性化剤であるカルバクロールと比較し、顕著に高いＴＲＰＶ３活性化作用を示した。

Claims

下記式（１）：

〔式中、Ｒは水素原子、炭素数１〜４のアルキル基又は炭素数２〜４のアルケニル基を示す〕
で表される２−アルキルフェノール誘導体を有効成分とするＴＲＰＶ３活性化剤。
下記式（１）：

〔式中、Ｒは水素原子、炭素数１〜４のアルキル基又は炭素数２〜４のアルケニル基を示す〕
で表される２−アルキルフェノール誘導体を有効成分とする温感剤。