JP5897931B2 - 化粧品原料または化粧品が皮膚に与える刺激性の検査方法 - Google Patents
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Description
例えば、化粧品に通常防腐剤として配合される成分であるパラベン(パラヒドロキシ安息香酸エステル)はこのような微小ストレスの原因物質として良く研究されている。パラベンは上記試験ではいずれも安全と評価されている。しかし、パラベン配合化粧料ではしばしばパラベンアレルギーと呼ばれる症状が発生する(非特許文献3:日皮協情報、No.48 2002年5月)。このため、パラベンの使用を避けてフェノキシエタノールを使用する化粧品が多く見られる。フェノキシエタノールは、グリコールエーテルの一種であり、微かな芳香を有する化合物であり、上記のパラベンよりも皮膚刺激性が少ない防腐剤として知られている。しかし、このフェノキシエタノールを含む化粧品を塗布した皮膚に強い痛みと接触性蕁麻疹が発生する例が知られている(非特許文献3:Mitani T,香粧会誌,12(4),238-247,1998)。また、正常な皮膚を持つ11歳から64歳までの男女にフェノキシエタノールを含む化粧料を塗布したところ統計的有意にスティンギング(Stinging)と呼ばれる痛みを伴う微小刺激を皮膚に与えることを確認している(非特許文献3参照)。
従来は、このような刺激に対しては皮膚のバリアー機能を増強することが有効とされ、そのような物質の探索が積極的に行われてきた(特許文献1:特開2011−162469号公報、特許文献2:特開2011−16718号公報等参照)
すなわち、本発明は以下の構成である。
(1)皮膚由来の表皮角化細胞を培養し、
この培養細胞に表皮角化細胞50%死濃度(EC50)の10分の1以下の濃度で化粧品原料又は化粧品を添加し、
次いでヒートショックプロテイン(HSP)27の発現量を測定し、
被検物質無添加の表皮角化細胞中のHSP27の発現量と比較してHSP27の増加を検出することにより、
表皮角化細胞50%死濃度の10分の1以下の濃度で化粧品原料又は化粧品の与える表皮角化細胞への微小刺激を検出し、
表皮角化細胞に微小ストレスを与える物質を選別する方法。
(2)HSP27の発現量の検出がウエスタンブロッティング法によるものである(1)
に記載の方法。
(3)被検物質添加後3日目にHSP27の発現量を測定する(1)又は(2)に記載の方法。
HSP27とは一連のヒートショック蛋白質ファミリーの一つとして知られている分子量27KDの蛋白質で分子シャペロンとしての機能を有している。そして細胞の保護機能を担っているといわれている。
本発明の検査方法は、この角化細胞を培養し、角化細胞中に発現するHSP27の増加を検出することで、化粧品原料や化粧品などの皮膚に対する微小刺激の有無を判定する方法である。この試験に用いる表皮角化細胞としては、自己増殖性を有する正常な表皮角化細胞であれば使用可能であり、マウス、ブタ、ラットなどの異種の動物の皮膚角化細胞でも使用可能である。しかしヒト皮膚に対する刺激の有無を判断するものであり、ヒトの細胞を用いるのが好ましい。動物の表皮角化細胞を用いる場合には、動物より表皮角化細胞を採取し、常法に従って処理して用いることもできる。あるいは、既に市販されているものを購入して利用することもできる。
次いで、細胞を播種した6ウエルの細胞培養プレートを二酸化炭素インキュベーター中で24時間培養し、その後培養溶液でこのEC50の10分の1の濃度になるように希釈した被検物質を6ウエルの細胞培養プレートに加え、3〜5日間培養を行う。培養終了後、細胞を回収しイムノアッセイ法又はウエスタンブロット法、あるいはPCR法などによって、HSP27の蛋白質又は遺伝子のコピー数を測定してHSP27の発現量を測定する。同様にして被検物質を添加しなかったウエル殻も細胞を回収して、HSP27を測定する。被検物質を添加したウエルのHSP27の発現量が、被検物質を添加しなかったウエルの発現量より高値を示した場合を皮膚の微小刺激が陽性であると判定する。
試験例 :メチルパラベンの示す微小刺激の限界確認試験
メチルパラベンを対象としてヒト表皮角化細胞に与える刺激のレベルを測定した。
(1)細胞の調整
凍結ヒト皮膚角化細胞(Lonza社製)を解凍し、培養液としてEpifile(Life Technologies社製)用いてT−25フラスコに播種した。これを37℃の二酸化炭素インキュベーターでほぼコンフルエント状態になるまで培養した。
その後細胞をトリプシン処理して単細胞化し、96ウエル細胞培養プレートに1ウエルあたり104個になるように播種し24時間培養した。この96ウエルプレートを以下の細胞毒性確認試験に用いた。また、6ウエル細胞培養プレートに1ウエル当り105個になるように播種し、24時間培養した。この6ウエルプレートを以下の微小刺激試験に用いた。
メチルパラベン(和光純薬株式会社、以下MPという)を上記の培養に用いた培養液で0.2%から8段階の希釈し、最大希釈濃度0.00015625%の濃度になるようにウエルに加え約24時間培養した。
24時間経過後培養液を交換しさらに、MTT(3-[4,5-Dimethylthiazol-2-yl]-2,5-diphenyltetrazoliumbromide; Thiazolyl blue)溶液を加え約3時間培養して生細胞を染色した。そしてリン酸緩衝液(PBS)で洗浄後、イソプロパノールを100μl/well添加して室温で10分間振とうした。このイソプロパノール溶液の着色度を570nmの吸光度(OD)を測定し、得られたODをMPを添加しなかったウエルのOD度で除した値を細胞生存率とした。段階希釈系列から求めたMPのEC50値は0.1質量%であった。
細胞を播種し、24時間培養した6ウエルのプレートの培養液を、0.01質量%、0.003質量%になるようMPが含まれるように上記の培養液で希釈したものと交換し、表皮角化細胞を低濃度のMPで刺激した。対照としてMPを添加しないウエルを置いた。3日後に培養液を除去し、PBSで洗浄後、界面活性剤(Igepal CA-630 SIGMA社製)を含む細胞溶解液を100μl/well加え、細胞をスクレーパーでこすって、細胞破砕液を回収した。
検出結果は3ウエルの平均値を求めさらに、MP無添加のウエルの測定値を100とする相対値で表した。結果を図1に示す。
この結果からMPは0.01質量%濃度(EC50値の10%)ではHSP27の発現を誘導するが0.003質量%濃度ではHSP27の発現を誘導しないことがわかった。すなわち、HSP27の発現を指標とする微小刺激試験では、細胞毒性を示すEC50の10分の1以上の濃度で引き起こされる影響を検出できることがわかった。従って、この試験方法を使用すれば低刺激性の物質を選別することが可能となる。
上述したとおり、メチルパラベンは安全な防腐剤として広く普及しているが、所謂敏感肌の女性はメチルパラベンなどのパラベン類が原因となる肌荒れや痛みをしばしば感じている。このためメチルパラベンに代えてフェノキシエタノールが使用される。
このフェノキシエタノール(以下PEという)と同様に化粧品に配合される成分で、皮膚刺激や肌荒れの原因とならないことが良く知られている成分として、1,3−ブチレングリコール(以下BGという)が保湿剤や抗菌剤として使用されている。また美白化粧料にしばしば配合されるアスコルビン酸誘導体である安全性の高いアスコルビン酸2グルコシド(以下AA2Gという)がある。これらの3物質について、本発明の検査方法で行った。
下記表1の段階希釈系列で希釈し、ヒト表皮角化細胞に対する細胞毒性を検査した。
試験例と同様にして各化粧品原料のヒト角化細胞のHSP27発現量を誘導する濃度を測定した。測定結果を図2〜図4に示す。
PEはEC50値の10分の1濃度でHSP27の発現を誘導し、BG及びAA2Gは誘導しなかった。この結果は従来経験的に言われている化粧品原料としての安全性の評価結果によく一致している。従って、本方法によって化粧品原料又は化粧品の微小刺激を細胞毒性の数値にもとづく具体的な作用濃度として数値化することが可能となった。
Claims (3)
- 皮膚由来の表皮角化細胞を培養し、
この培養細胞に表皮角化細胞50%死濃度(EC50)の10分の1以下の濃度で化粧品原料又は化粧品を添加し、
次いでヒートショックプロテイン(HSP)27の発現量を測定し、
被検物質無添加の表皮角化細胞中のHSP27の発現量と比較してHSP27の増加を検出することにより、
表皮角化細胞50%死濃度の10分の1以下の濃度で化粧品原料又は化粧品の与える表皮角化細胞への微小刺激を検出し、
表皮角化細胞に微小ストレスを与える物質を選別する方法。 - HSP27の発現量の検出がウエスタンブロッティング法によるものである請求項1に記載の方法。
- 被検物質添加後3日目にHSP27の発現量を測定する請求項1又は2に記載の方法。
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