JP5897931B2 - 化粧品原料または化粧品が皮膚に与える刺激性の検査方法 - Google Patents
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Description
本発明は、化粧品原料又は化粧品がヒト皮膚に与える微小刺激の検査方法に関する。
化粧品は日常的に、また長期間継続して皮膚に塗布するため、原料も含めてその安全性には細心の注意が必要とされる。化粧品や、化粧品原料の安全性を担保するための試験として、厚生労働省は、昭和６２年に「新規原料の安全性確保のためのガイドライン」を通知し、確認すべき安全性試験を定めている（非特許文献１：厚生省薬務局審査第２課事務連絡）。これによれば、実施すべき試験として、１．急性毒性試験、２．皮膚一次刺激性、３．連続皮膚刺激性、４．感作性、５．光毒性、６．光感作性、７．目刺激性、８．変異原性９．ヒトパッチ以上の９項目の試験である。
しかし、このような多種多様な、安全性試験を実施しても、化粧品による炎症や肌荒れなどが発生することが良く知られている（非特許文献２：化粧品事典２４０〜２５１ページ、日本化粧品技術者協会編集、丸善株式会社、平成１５年１２月１５日発行）。このような、従来の安全性試験で予測不能な皮膚のトラブルの原因は、たとえ安全な成分であるとして化粧品に配合されている成分であっても長期間の連用によって、皮膚に微小なストレスを与え続け、それらのストレスが蓄積されて皮膚トラブルにつながることが知られている。このような微小なストレスを与えるか否かは上記の一連の安全性試験では検出できない。
例えば、化粧品に通常防腐剤として配合される成分であるパラベン（パラヒドロキシ安息香酸エステル）はこのような微小ストレスの原因物質として良く研究されている。パラベンは上記試験ではいずれも安全と評価されている。しかし、パラベン配合化粧料ではしばしばパラベンアレルギーと呼ばれる症状が発生する（非特許文献３：日皮協情報、Ｎｏ．４８ ２００２年５月）。このため、パラベンの使用を避けてフェノキシエタノールを使用する化粧品が多く見られる。フェノキシエタノールは、グリコールエーテルの一種であり、微かな芳香を有する化合物であり、上記のパラベンよりも皮膚刺激性が少ない防腐剤として知られている。しかし、このフェノキシエタノールを含む化粧品を塗布した皮膚に強い痛みと接触性蕁麻疹が発生する例が知られている（非特許文献３：Mitani T,香粧会誌,12(4),238-247,1998)。また、正常な皮膚を持つ１１歳から６４歳までの男女にフェノキシエタノールを含む化粧料を塗布したところ統計的有意にスティンギング（Stinging）と呼ばれる痛みを伴う微小刺激を皮膚に与えることを確認している（非特許文献３参照）。
例えば、化粧品に通常防腐剤として配合される成分であるパラベン（パラヒドロキシ安息香酸エステル）はこのような微小ストレスの原因物質として良く研究されている。パラベンは上記試験ではいずれも安全と評価されている。しかし、パラベン配合化粧料ではしばしばパラベンアレルギーと呼ばれる症状が発生する（非特許文献３：日皮協情報、Ｎｏ．４８ ２００２年５月）。このため、パラベンの使用を避けてフェノキシエタノールを使用する化粧品が多く見られる。フェノキシエタノールは、グリコールエーテルの一種であり、微かな芳香を有する化合物であり、上記のパラベンよりも皮膚刺激性が少ない防腐剤として知られている。しかし、このフェノキシエタノールを含む化粧品を塗布した皮膚に強い痛みと接触性蕁麻疹が発生する例が知られている（非特許文献３：Mitani T,香粧会誌,12(4),238-247,1998)。また、正常な皮膚を持つ１１歳から６４歳までの男女にフェノキシエタノールを含む化粧料を塗布したところ統計的有意にスティンギング（Stinging）と呼ばれる痛みを伴う微小刺激を皮膚に与えることを確認している（非特許文献３参照）。
このような健康な皮膚を持つ人より外界刺激に対する抵抗性が低く、容易に皮膚トラブルを生ずる皮膚を皮膚科学分野では敏感肌と呼ぶ。一般にもこの呼称が普及している（非特許文献４：伊藤正敏,Fragrance Jounal,30(10),11-16,2002)。
従来は、このような刺激に対しては皮膚のバリアー機能を増強することが有効とされ、そのような物質の探索が積極的に行われてきた（特許文献１：特開２０１１−１６２４６９号公報、特許文献２：特開２０１１−１６７１８号公報等参照）
従来は、このような刺激に対しては皮膚のバリアー機能を増強することが有効とされ、そのような物質の探索が積極的に行われてきた（特許文献１：特開２０１１−１６２４６９号公報、特許文献２：特開２０１１−１６７１８号公報等参照）
厚生省薬務局審査第２課事務連絡「新規原料を配合した化粧品の製造、または輸入申請に添付すべき安全性資料の範囲について」 昭和６２年６月１８日付
化粧品事典２４０〜２５１ページ、日本化粧品技術者協会編集、丸善株式会社、平成１５年１２月１５日発行
Mitani T,香粧会誌,12(4),238-247,1998
伊藤正敏,Fragrance Jounal,30(10),11-16,2002)
本発明は、化粧品原料または化粧品が肌に与える微小な刺激を検出する検査方法を提供することを課題とする。
本発明は、従来の皮膚バリアー機能の強化という発想とはまったく異なるもので、皮膚の微小刺激の原因となる物質を化粧品原料または化粧品から除くための技術を提供するものである。
すなわち、本発明は以下の構成である。
（１）皮膚由来の表皮角化細胞を培養し、
この培養細胞に表皮角化細胞５０％死濃度（ＥＣ５０）の１０分の１以下の濃度で化粧品原料又は化粧品を添加し、
次いでヒートショックプロテイン（ＨＳＰ）２７の発現量を測定し、
被検物質無添加の表皮角化細胞中のＨＳＰ２７の発現量と比較してＨＳＰ２７の増加を検出することにより、
表皮角化細胞５０％死濃度の１０分の１以下の濃度で化粧品原料又は化粧品の与える表皮角化細胞への微小刺激を検出し、
表皮角化細胞に微小ストレスを与える物質を選別する方法。
（２）ＨＳＰ２７の発現量の検出がウエスタンブロッティング法によるものである（１）
に記載の方法。
（３）被検物質添加後３日目にＨＳＰ２７の発現量を測定する（１）又は（２）に記載の方法。
すなわち、本発明は以下の構成である。
（１）皮膚由来の表皮角化細胞を培養し、
この培養細胞に表皮角化細胞５０％死濃度（ＥＣ５０）の１０分の１以下の濃度で化粧品原料又は化粧品を添加し、
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（２）ＨＳＰ２７の発現量の検出がウエスタンブロッティング法によるものである（１）
に記載の方法。
（３）被検物質添加後３日目にＨＳＰ２７の発現量を測定する（１）又は（２）に記載の方法。
本発明の評価方法によれば、従来の検査方法では検出できなかった化粧品原料又は化粧品の肌に及ぼす微小な刺激を検出することが可能となる。またこのような刺激の有無を検査することによって、化粧品が肌に持続的に与える刺激のない、あるいは刺激を軽減した化粧品を設計することができる。さらにまた、敏感肌の患者に適した化粧品を提供することが可能となる。
以下、本発明について詳細に説明する。
ＨＳＰ２７とは一連のヒートショック蛋白質ファミリーの一つとして知られている分子量２７ＫＤの蛋白質で分子シャペロンとしての機能を有している。そして細胞の保護機能を担っているといわれている。
ＨＳＰ２７とは一連のヒートショック蛋白質ファミリーの一つとして知られている分子量２７ＫＤの蛋白質で分子シャペロンとしての機能を有している。そして細胞の保護機能を担っているといわれている。
角層は、皮膚の一番上にある組織であって、角化細胞からなり、体の外からの異物や刺激から皮膚を守る働きを有している。
本発明の検査方法は、この角化細胞を培養し、角化細胞中に発現するＨＳＰ２７の増加を検出することで、化粧品原料や化粧品などの皮膚に対する微小刺激の有無を判定する方法である。この試験に用いる表皮角化細胞としては、自己増殖性を有する正常な表皮角化細胞であれば使用可能であり、マウス、ブタ、ラットなどの異種の動物の皮膚角化細胞でも使用可能である。しかしヒト皮膚に対する刺激の有無を判断するものであり、ヒトの細胞を用いるのが好ましい。動物の表皮角化細胞を用いる場合には、動物より表皮角化細胞を採取し、常法に従って処理して用いることもできる。あるいは、既に市販されているものを購入して利用することもできる。
本発明の検査方法は、この角化細胞を培養し、角化細胞中に発現するＨＳＰ２７の増加を検出することで、化粧品原料や化粧品などの皮膚に対する微小刺激の有無を判定する方法である。この試験に用いる表皮角化細胞としては、自己増殖性を有する正常な表皮角化細胞であれば使用可能であり、マウス、ブタ、ラットなどの異種の動物の皮膚角化細胞でも使用可能である。しかしヒト皮膚に対する刺激の有無を判断するものであり、ヒトの細胞を用いるのが好ましい。動物の表皮角化細胞を用いる場合には、動物より表皮角化細胞を採取し、常法に従って処理して用いることもできる。あるいは、既に市販されているものを購入して利用することもできる。
ヒト皮膚角化細胞としては、初代培養や継代培養されたものであってもよいが、ケラチノサイトとしての特性を失わないように注意しなければならない。好ましくは継代が１０代以内、特に好ましくは４〜５代以内の培養細胞を用いると良い。多くのメーカーより凍結角化細胞が市販されておりこれを利用することができる。凍結細胞は、解凍後培養液で培養しコンフルエントになるまで増殖させ、これをトリプシン処理して培養容器から剥離、単細胞化したのちハーベストしてプラスチックの９６穴ウエルあるいは６ウエルの細胞培養プレートなどに播種し、１〜２日培養し、このウエルを用いて試験を行う。培養液は表皮角化細胞の培養に適した複数の組成のものが市販されており、いずれのものであっても使用できる。代表的な培養液として、「Humedia−KG2」（倉敷紡績株式会社製）、「Epilife」（Life Technology社製）を例示することができる。
上述した細胞を播種した９６ウエルプレートを二酸化炭素インキュベーター中で２４時間培養し、その後培養溶液で希釈した被検物質を０．２〜２０質量％の濃度範囲で、ウエルに添加し、約８〜２４時間培養し、細胞毒性を確認する。被検物質の希釈濃度系列からそれぞれの被検物質のＥＣ５０（細胞が５０％死亡する濃度）を求める。
次いで、細胞を播種した６ウエルの細胞培養プレートを二酸化炭素インキュベーター中で２４時間培養し、その後培養溶液でこのＥＣ５０の１０分の１の濃度になるように希釈した被検物質を６ウエルの細胞培養プレートに加え、３〜５日間培養を行う。培養終了後、細胞を回収しイムノアッセイ法又はウエスタンブロット法、あるいはＰＣＲ法などによって、ＨＳＰ２７の蛋白質又は遺伝子のコピー数を測定してＨＳＰ２７の発現量を測定する。同様にして被検物質を添加しなかったウエル殻も細胞を回収して、ＨＳＰ２７を測定する。被検物質を添加したウエルのＨＳＰ２７の発現量が、被検物質を添加しなかったウエルの発現量より高値を示した場合を皮膚の微小刺激が陽性であると判定する。
次いで、細胞を播種した６ウエルの細胞培養プレートを二酸化炭素インキュベーター中で２４時間培養し、その後培養溶液でこのＥＣ５０の１０分の１の濃度になるように希釈した被検物質を６ウエルの細胞培養プレートに加え、３〜５日間培養を行う。培養終了後、細胞を回収しイムノアッセイ法又はウエスタンブロット法、あるいはＰＣＲ法などによって、ＨＳＰ２７の蛋白質又は遺伝子のコピー数を測定してＨＳＰ２７の発現量を測定する。同様にして被検物質を添加しなかったウエル殻も細胞を回収して、ＨＳＰ２７を測定する。被検物質を添加したウエルのＨＳＰ２７の発現量が、被検物質を添加しなかったウエルの発現量より高値を示した場合を皮膚の微小刺激が陽性であると判定する。
以下に試験例、実施例を示し、本発明をより詳細に説明する。
試験例 ：メチルパラベンの示す微小刺激の限界確認試験
メチルパラベンを対象としてヒト表皮角化細胞に与える刺激のレベルを測定した。
（１）細胞の調整
凍結ヒト皮膚角化細胞（Lonza社製）を解凍し、培養液としてEpifile（Life Technologies社製）用いてＴ−２５フラスコに播種した。これを３７℃の二酸化炭素インキュベーターでほぼコンフルエント状態になるまで培養した。
その後細胞をトリプシン処理して単細胞化し、９６ウエル細胞培養プレートに１ウエルあたり１０４個になるように播種し２４時間培養した。この９６ウエルプレートを以下の細胞毒性確認試験に用いた。また、６ウエル細胞培養プレートに１ウエル当り１０５個になるように播種し、２４時間培養した。この６ウエルプレートを以下の微小刺激試験に用いた。
試験例 ：メチルパラベンの示す微小刺激の限界確認試験
メチルパラベンを対象としてヒト表皮角化細胞に与える刺激のレベルを測定した。
（１）細胞の調整
凍結ヒト皮膚角化細胞（Lonza社製）を解凍し、培養液としてEpifile（Life Technologies社製）用いてＴ−２５フラスコに播種した。これを３７℃の二酸化炭素インキュベーターでほぼコンフルエント状態になるまで培養した。
その後細胞をトリプシン処理して単細胞化し、９６ウエル細胞培養プレートに１ウエルあたり１０４個になるように播種し２４時間培養した。この９６ウエルプレートを以下の細胞毒性確認試験に用いた。また、６ウエル細胞培養プレートに１ウエル当り１０５個になるように播種し、２４時間培養した。この６ウエルプレートを以下の微小刺激試験に用いた。
（２）細胞毒性確認試験
メチルパラベン（和光純薬株式会社、以下ＭＰという）を上記の培養に用いた培養液で０．２％から８段階の希釈し、最大希釈濃度０．０００１５６２５％の濃度になるようにウエルに加え約２４時間培養した。
２４時間経過後培養液を交換しさらに、MTT(3-[4,5-Dimethylthiazol-2-yl]-2,5-diphenyltetrazoliumbromide; Thiazolyl blue)溶液を加え約３時間培養して生細胞を染色した。そしてリン酸緩衝液（ＰＢＳ）で洗浄後、イソプロパノールを１００μｌ/well添加して室温で１０分間振とうした。このイソプロパノール溶液の着色度を５７０ｎｍの吸光度（ＯＤ）を測定し、得られたＯＤをＭＰを添加しなかったウエルのＯＤ度で除した値を細胞生存率とした。段階希釈系列から求めたＭＰのＥＣ５０値は０．１質量％であった。
メチルパラベン（和光純薬株式会社、以下ＭＰという）を上記の培養に用いた培養液で０．２％から８段階の希釈し、最大希釈濃度０．０００１５６２５％の濃度になるようにウエルに加え約２４時間培養した。
２４時間経過後培養液を交換しさらに、MTT(3-[4,5-Dimethylthiazol-2-yl]-2,5-diphenyltetrazoliumbromide; Thiazolyl blue)溶液を加え約３時間培養して生細胞を染色した。そしてリン酸緩衝液（ＰＢＳ）で洗浄後、イソプロパノールを１００μｌ/well添加して室温で１０分間振とうした。このイソプロパノール溶液の着色度を５７０ｎｍの吸光度（ＯＤ）を測定し、得られたＯＤをＭＰを添加しなかったウエルのＯＤ度で除した値を細胞生存率とした。段階希釈系列から求めたＭＰのＥＣ５０値は０．１質量％であった。
（３）微小刺激試験
細胞を播種し、２４時間培養した６ウエルのプレートの培養液を、０．０１質量％、０．００３質量％になるようＭＰが含まれるように上記の培養液で希釈したものと交換し、表皮角化細胞を低濃度のＭＰで刺激した。対照としてＭＰを添加しないウエルを置いた。３日後に培養液を除去し、ＰＢＳで洗浄後、界面活性剤（Igepal CA-630 SIGMA社製）を含む細胞溶解液を１００μl/well加え、細胞をスクレーパーでこすって、細胞破砕液を回収した。
細胞を播種し、２４時間培養した６ウエルのプレートの培養液を、０．０１質量％、０．００３質量％になるようＭＰが含まれるように上記の培養液で希釈したものと交換し、表皮角化細胞を低濃度のＭＰで刺激した。対照としてＭＰを添加しないウエルを置いた。３日後に培養液を除去し、ＰＢＳで洗浄後、界面活性剤（Igepal CA-630 SIGMA社製）を含む細胞溶解液を１００μl/well加え、細胞をスクレーパーでこすって、細胞破砕液を回収した。
細胞回収液をウエスタンブロッティングプロトコール（ＣＳＴジャパン社）に従って、ＳＤＳゲル電気泳動を行った。このＳＤＳゲルをHybond-P PVDFメンブレン（ＧＥヘルスケア バイオサイエンス）へ転写した。メンブレンを５％スキムミルク溶液でブロッキングし、１次抗体としてＨＳＰ２７：mouse monoclonal antibody (Stressgen社製)を４℃一晩で反応させ、翌日ＰＢＳで洗浄後、２次抗体Goat-Anti-IgG mouse（Invitrogen社製）で１時間反応させ、ECL plus western Blotting Detection system（ＧＥヘルスケア バイオサイエンス社製）を用いて検出した。
検出結果は３ウエルの平均値を求めさらに、ＭＰ無添加のウエルの測定値を１００とする相対値で表した。結果を図１に示す。
この結果からＭＰは０．０１質量％濃度（ＥＣ５０値の１０％）ではＨＳＰ２７の発現を誘導するが０．００３質量％濃度ではＨＳＰ２７の発現を誘導しないことがわかった。すなわち、ＨＳＰ２７の発現を指標とする微小刺激試験では、細胞毒性を示すＥＣ５０の１０分の１以上の濃度で引き起こされる影響を検出できることがわかった。従って、この試験方法を使用すれば低刺激性の物質を選別することが可能となる。
検出結果は３ウエルの平均値を求めさらに、ＭＰ無添加のウエルの測定値を１００とする相対値で表した。結果を図１に示す。
この結果からＭＰは０．０１質量％濃度（ＥＣ５０値の１０％）ではＨＳＰ２７の発現を誘導するが０．００３質量％濃度ではＨＳＰ２７の発現を誘導しないことがわかった。すなわち、ＨＳＰ２７の発現を指標とする微小刺激試験では、細胞毒性を示すＥＣ５０の１０分の１以上の濃度で引き起こされる影響を検出できることがわかった。従って、この試験方法を使用すれば低刺激性の物質を選別することが可能となる。
化粧品原料の刺激性の検出例
上述したとおり、メチルパラベンは安全な防腐剤として広く普及しているが、所謂敏感肌の女性はメチルパラベンなどのパラベン類が原因となる肌荒れや痛みをしばしば感じている。このためメチルパラベンに代えてフェノキシエタノールが使用される。
このフェノキシエタノール（以下ＰＥという）と同様に化粧品に配合される成分で、皮膚刺激や肌荒れの原因とならないことが良く知られている成分として、１，３−ブチレングリコール(以下ＢＧという)が保湿剤や抗菌剤として使用されている。また美白化粧料にしばしば配合されるアスコルビン酸誘導体である安全性の高いアスコルビン酸２グルコシド(以下ＡＡ２Ｇという)がある。これらの３物質について、本発明の検査方法で行った。
上述したとおり、メチルパラベンは安全な防腐剤として広く普及しているが、所謂敏感肌の女性はメチルパラベンなどのパラベン類が原因となる肌荒れや痛みをしばしば感じている。このためメチルパラベンに代えてフェノキシエタノールが使用される。
このフェノキシエタノール（以下ＰＥという）と同様に化粧品に配合される成分で、皮膚刺激や肌荒れの原因とならないことが良く知られている成分として、１，３−ブチレングリコール(以下ＢＧという)が保湿剤や抗菌剤として使用されている。また美白化粧料にしばしば配合されるアスコルビン酸誘導体である安全性の高いアスコルビン酸２グルコシド(以下ＡＡ２Ｇという)がある。これらの３物質について、本発明の検査方法で行った。
（１）評価濃度の設定
下記表１の段階希釈系列で希釈し、ヒト表皮角化細胞に対する細胞毒性を検査した。
下記表１の段階希釈系列で希釈し、ヒト表皮角化細胞に対する細胞毒性を検査した。
試験例と同様にＥＣ５０値を測定し、さらに下記の表２とおりＥＣ５０値の１０分の１並びに３分の１の濃度を試験濃度に設定した。
（２）試験結果
試験例と同様にして各化粧品原料のヒト角化細胞のＨＳＰ２７発現量を誘導する濃度を測定した。測定結果を図２〜図４に示す。
ＰＥはＥＣ５０値の１０分の１濃度でＨＳＰ２７の発現を誘導し、ＢＧ及びＡＡ２Ｇは誘導しなかった。この結果は従来経験的に言われている化粧品原料としての安全性の評価結果によく一致している。従って、本方法によって化粧品原料又は化粧品の微小刺激を細胞毒性の数値にもとづく具体的な作用濃度として数値化することが可能となった。
試験例と同様にして各化粧品原料のヒト角化細胞のＨＳＰ２７発現量を誘導する濃度を測定した。測定結果を図２〜図４に示す。
ＰＥはＥＣ５０値の１０分の１濃度でＨＳＰ２７の発現を誘導し、ＢＧ及びＡＡ２Ｇは誘導しなかった。この結果は従来経験的に言われている化粧品原料としての安全性の評価結果によく一致している。従って、本方法によって化粧品原料又は化粧品の微小刺激を細胞毒性の数値にもとづく具体的な作用濃度として数値化することが可能となった。
Claims (3)
- 皮膚由来の表皮角化細胞を培養し、
この培養細胞に表皮角化細胞５０％死濃度（ＥＣ５０）の１０分の１以下の濃度で化粧品原料又は化粧品を添加し、
次いでヒートショックプロテイン（ＨＳＰ）２７の発現量を測定し、
被検物質無添加の表皮角化細胞中のＨＳＰ２７の発現量と比較してＨＳＰ２７の増加を検出することにより、
表皮角化細胞５０％死濃度の１０分の１以下の濃度で化粧品原料又は化粧品の与える表皮角化細胞への微小刺激を検出し、
表皮角化細胞に微小ストレスを与える物質を選別する方法。 - ＨＳＰ２７の発現量の検出がウエスタンブロッティング法によるものである請求項１に記載の方法。
- 被検物質添加後３日目にＨＳＰ２７の発現量を測定する請求項１又は２に記載の方法。
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