JP5892481B2 - DNA primer set for cherry clone identification - Google Patents
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Description
本発明は、サクラのクローン識別用プライマーセットおよびそれを用いるクローン識別方法に関する。更に詳細には、PCR 法によりサクラ属に属する植物のマイクロサテライト領域を増幅するためのプライマーセット、および該プライマーセットを用いて、サクラ属に属する植物の組織より抽出した DNA について PCR 法により増幅し、増幅された DNA の塩基長の相違により、サクラ属に属する植物のクローンを識別するサクラのクローン識別方法に関する。 The present invention relates to a primer set for identifying cherry clones and a clone identifying method using the same. More specifically, a primer set for amplifying a microsatellite region of a plant belonging to the genus Sakura by PCR and a DNA extracted from the tissue of the plant belonging to the genus Sakura using the primer set are amplified by the PCR method. The present invention also relates to a method for identifying a cherry clone, wherein a clone of a plant belonging to the genus Sakura is identified based on the difference in the base length of the amplified DNA.
サクラ（サクラ属、Cerasus）は、日本全国の街路、公園、庭、河川敷および神社や寺において植栽されている、日本国民に最も親しまれている花木の一つである。
サクラは花の色や花弁の数・大きさなどの形態に変異が多い植物として知られており、数多くの品種改良が多く行われ、また、代を重ねることや接木によって、花の形態を固定化することも行われている。
Cherry (Cerasus) is one of the most popular flowering trees in Japan, planted in streets, parks, gardens, riverbeds, shrines and temples throughout Japan.
Sakura is known as a plant with many variations in the form of flowers and the number and size of petals. Many varieties have been improved, and the shape of the flowers is fixed by repeated generations and grafting. It is also done.
近時において、サクラの栽培品種の同定の需要が、園芸産業や緑化産業において増大している。また、寺社等において古くから植えられているサクラが接ぎ木によって正しく増殖されているかについて鑑定する需要も生じている。しかしながら、上記のように栽培されているサクラのクローンの数は膨大である一方、クローンの識別は外観からは困難である。
また、クローンは、一般に適切な遺伝学的マーカーを構築することにより区別でき、植物において生化学的手法を用いたアイソザイム分析のほかにPCR マーカーを用いたクローン識別方法が報告され（特許文献１〜５）、サクラにおいてもＰＣＲマーカーを用いたクローン識別について報告されている（非特許文献１）。しかしながら、同文献において報告されている方法では、２１種類のマーカーを用いているにもかかわらず、特定のクローン（‘ソメイヨシノ’）を含む７栽培品種という、数少ない品種のクローン識別が行われているにすぎない。
なお、「栽培品種」は、その形態価値により人が判断した分類群であり、植物の「クローン」は、１個体から栄養繁殖によって増殖した同一の遺伝子型をもった一の植物個体群である。花を観賞するサクラの場合、栽培品種の多くは接ぎ木で増殖されるため、一つの栽培品種が一つのクローンに対応することが多い。
Recently, the demand for identifying cherry cultivars is increasing in the horticultural and greening industries. There is also a demand to judge whether cherry trees planted in temples and shrines have been properly propagated by grafting. However, while the number of cherry clones cultivated as described above is enormous, identification of the clones is difficult from the appearance.
In addition, clones can generally be distinguished by constructing appropriate genetic markers. In addition to isozyme analysis using biochemical techniques in plants, clone identification methods using PCR markers have been reported (
“Cultivated varieties” are taxonomic groups determined by humans based on their morphological value, and “clone” of a plant is a single plant population having the same genotype that has been propagated by vegetative propagation from one individual. . In the case of cherry blossoms for viewing flowers, many cultivars are grown on grafts, so one cultivar often corresponds to one clone.
本発明は、従来の方法より効率および精度が高いサクラのクローン識別方法を提供することを目的とする。 It is an object of the present invention to provide a method for identifying cherry clones that is more efficient and more accurate than conventional methods.
上記課題に鑑み、本発明者らは鋭意研究を行い、PCR 法によりサクラ属に属する植物のマイクロサテライト領域を増幅するための新たなプライマーセットを構築したところ、驚くべきことに該プライマーセットを用いたPCR 法により得られるＤＮＡ増幅断片の長さに、サクラ属のクローン間で極めて大きな相違と多型性があることを見出し、さらに研究を進めることによって本発明を完成するに至った。 In view of the above problems, the present inventors conducted extensive research and constructed a new primer set for amplifying the microsatellite region of plants belonging to the genus Sakura by PCR, and surprisingly, the primer set was used. The length of the DNA amplified fragment obtained by the conventional PCR method was found to have very large differences and polymorphisms among Sakura clones, and the present invention was completed by further research.
すなわち、本発明は、PCR 法によりサクラ属に属する植物のマイクロサテライト領域を増幅するための、サクラ属に属する植物のクローン識別方法に用いられる２種以上のプライマーセットであって、以下の６種類から選ばれるプライマーセットに関する：
配列番号１で示される塩基配列を有するプライマーまたは配列番号１で示される塩基配列に相補的な塩基配列とストリンジェントな条件でハイブリダイズする塩基配列を有し同様にプライマーとしての機能を有するその変異体と、配列番号２で示される塩基配列を有するプライマーまたは配列番号２で示される塩基配列に相補的な塩基配列とストリンジェントな条件でハイブリダイズする塩基配列を有し同様にプライマーとしての機能を有するその変異体とからなるプライマーセット；
同様に、配列番号３で示される塩基配列を有するプライマーまたは配列番号３で示される塩基配列に相補的な塩基配列とストリンジェントな条件でハイブリダイズする塩基配列を有し同様にプライマーとしての機能を有するその変異体と、配列番号４で示される塩基配列を有するプライマーまたは配列番号４で示される塩基配列に相補的な塩基配列とストリンジェントな条件でハイブリダイズする塩基配列を有し同様にプライマーとしての機能を有するその変異体とからなるプライマーセット；
同様に、配列番号５で示される塩基配列を有するプライマーまたは配列番号５で示される塩基配列に相補的な塩基配列とストリンジェントな条件でハイブリダイズする塩基配列を有し同様にプライマーとしての機能を有するその変異体と、配列番号６で示される塩基配列を有するプライマーまたは配列番号６で示される塩基配列に相補的な塩基配列とストリンジェントな条件でハイブリダイズする塩基配列を有し同様にプライマーとしての機能を有するその変異体とからなるプライマーセット；
同様に、配列番号７で示される塩基配列を有するプライマーまたは配列番号７で示される塩基配列に相補的な塩基配列とストリンジェントな条件でハイブリダイズする塩基配列を有し同様にプライマーとしての機能を有するその変異体と、配列番号８で示される塩基配列を有するプライマーまたは配列番号８で示される塩基配列に相補的な塩基配列とストリンジェントな条件でハイブリダイズする塩基配列を有し同様にプライマーとしての機能を有するその変異体とからなるプライマーセット；
同様に、配列番号９で示される塩基配列を有するプライマーまたは配列番号９で示される塩基配列に相補的な塩基配列とストリンジェントな条件でハイブリダイズする塩基配列を有し同様にプライマーとしての機能を有するその変異体と、配列番号１０で示される塩基配列を有するプライマーまたは配列番号１０で示される塩基配列に相補的な塩基配列とストリンジェントな条件でハイブリダイズする塩基配列を有し同様にプライマーとしての機能を有するその変異体とからなるプライマーセット；および
同様に、配列番号１１で示される塩基配列を有するプライマーまたは配列番号１１で示される塩基配列に相補的な塩基配列とストリンジェントな条件でハイブリダイズする塩基配列を有し同様にプライマーとしての機能を有するその変異体と、配列番号１２で示される塩基配列を有するプライマーまたは配列番号１２で示される塩基配列に相補的な塩基配列とストリンジェントな条件でハイブリダイズする塩基配列を有し同様にプライマーとしての機能を有するその変異体とからなるプライマーセット。
That is, the present invention provides two or more primer sets for use in a method for identifying clones of plants belonging to the genus Sakura, for amplifying the microsatellite region of plants belonging to the genus Sakura by PCR. For primer sets selected from:
A primer having the base sequence shown by SEQ ID NO: 1 or a mutation having a base sequence that hybridizes with a base sequence complementary to the base sequence shown by SEQ ID NO: 1 under stringent conditions and also having a function as a primer And a primer having the base sequence shown by SEQ ID NO: 2 or a base sequence complementary to the base sequence shown by SEQ ID NO: 2 and hybridizing under stringent conditions, and similarly functioning as a primer A primer set comprising the mutant thereof;
Similarly, the primer having the base sequence shown by SEQ ID NO: 3 or the base sequence complementary to the base sequence shown by SEQ ID NO: 3 has a base sequence that hybridizes under stringent conditions, and similarly functions as a primer. A primer having the base sequence shown in SEQ ID NO: 4 or a base sequence complementary to the base sequence shown in SEQ ID NO: 4 and hybridizing under stringent conditions with the mutant having the same A primer set comprising the mutant having the function of
Similarly, a primer having the base sequence shown by SEQ ID NO: 5 or a base sequence complementary to the base sequence shown by SEQ ID NO: 5 is hybridized under stringent conditions, and similarly functions as a primer. A primer having the base sequence shown in SEQ ID NO: 6 or a base sequence complementary to the base sequence shown in SEQ ID NO: 6 and hybridizing under stringent conditions A primer set comprising the mutant having the function of
Similarly, a primer having the base sequence shown by SEQ ID NO: 7 or a base sequence that hybridizes with a base sequence complementary to the base sequence shown by SEQ ID NO: 7 under stringent conditions has the same function as a primer. A primer having the base sequence shown in SEQ ID NO: 8 or a base sequence complementary to the base sequence shown in SEQ ID NO: 8 and a base sequence that hybridizes under stringent conditions A primer set comprising the mutant having the function of
Similarly, a primer having the base sequence shown by SEQ ID NO: 9 or a base sequence complementary to the base sequence shown by SEQ ID NO: 9 is hybridized under stringent conditions, and similarly functions as a primer. A primer having the base sequence shown in SEQ ID NO: 10 or a base sequence complementary to the base sequence shown in SEQ ID NO: 10 and a base sequence that hybridizes under stringent conditions A primer set comprising a variant thereof having the function of: and similarly, a primer having the base sequence represented by SEQ ID NO: 11 or a base sequence complementary to the base sequence represented by SEQ ID NO: 11 under stringent conditions Mutation that has a base sequence for soybean and that also functions as a primer And a primer having the base sequence shown by SEQ ID NO: 12 or a base sequence complementary to the base sequence shown by SEQ ID NO: 12 under a stringent condition and having the function as a primer in the same manner A primer set comprising the mutant.
また、本発明は、選ばれるプライマーセットが、下記プライマーセットの少なくとも１つを含む、前記プライマーセットに関する：
・配列番号３で示される塩基配列を有するプライマーと配列番号４で示される塩基配列を有するプライマーを含むプライマーセット、
・配列番号７で示される塩基配列を有するプライマーと配列番号８で示される塩基配列を有するプライマーを含むプライマーセットおよび
・配列番号１１で示される塩基配列を有するプライマーと配列番号１２で示される塩基配列を有するプライマーを含むプライマーセット。
さらに、本発明は、配列番号１〜１２で示される塩基配列を有するプライマーをすべて含む、前記いずれかのプライマーセットに関する。
またさらに、本発明は、前記６種類のプライマーセットから選ばれる２種以上のプライマーセットを用いて、サクラ属に属する植物の組織より抽出した DNA について PCR 法により増幅し、増幅された DNA の塩基長の相違により、サクラ属に属する植物の個体を識別する、サクラのクローン識別方法に関する。
さらにまた、本発明は、選ばれるプライマーセットが、下記プライマーセットの少なくとも１つを含む、前記サクラのクローン識別方法に関する。
・配列番号３で示される塩基配列を有するプライマーと配列番号４で示される塩基配列を有するプライマーを含むプライマーセット、
・配列番号７で示される塩基配列を有するプライマーと配列番号８で示される塩基配列を有するプライマーを含むプライマーセットおよび
・配列番号１１で示される塩基配列を有するプライマーと配列番号１２で示される塩基配列を有するプライマーを含むプライマーセット。
また、本発明は、選ばれるプライマーセットが、配列番号１〜１２で示される塩基配列を有するプライマーをすべて含む、前記いずれかのサクラのクローン識別方法に関する。
さらに、本発明は、前記いずれかのサクラ属に属する植物のクローン識別方法によって得られた２個体以上のサクラのクローン名および存在する場合には栽培品種名と、前記６種類のプライマーセットから選ばれる２種以上のプライマーセットを用いてPCR 法により増幅された前記クローンのそれぞれについての DNA の塩基長とを示すデータベースを用いる、サクラ属に属する植物のクローンおよび栽培品種を特定する方法に関する。
またさらに本発明は、前記２個体以上のサクラの個体数が５０個体以上である前記方法に関する。
さらにまた本発明は、前記いずれかのサクラ属に属する植物のクローン識別方法によって得られた２個体以上のサクラのクローン名、栽培品種名と、前記の６種類のプライマーセットから選ばれる２種以上のプライマーセットを用いてPCR 法により増幅された前記クローンのそれぞれについての DNA の塩基長とを示すデータベースに関する。
そして本発明は、２個体以上のサクラの個体数が５０個体以上である、前記データベースに関する。
The present invention also relates to the above primer set, wherein the selected primer set comprises at least one of the following primer sets:
A primer set comprising a primer having the base sequence shown by SEQ ID NO: 3 and a primer having the base sequence shown by SEQ ID NO: 4,
A primer set including a primer having the base sequence shown by SEQ ID NO: 7 and a primer having the base sequence shown by SEQ ID NO: 8, and a primer having the base sequence shown by SEQ ID NO: 11 and the base sequence shown by SEQ ID NO: 12 A primer set comprising a primer having
Furthermore, the present invention relates to any one of the above primer sets, including all primers having the base sequences represented by SEQ ID NOs: 1 to 12.
Furthermore, the present invention provides a PCR method for amplifying DNA extracted from a tissue of a plant belonging to the genus Sakura using two or more primer sets selected from the above six types of primer sets. The present invention relates to a method for identifying a clone of a cherry, which identifies an individual plant belonging to the genus Sakura according to differences in length.
Furthermore, the present invention relates to the Sakura clone identification method, wherein the selected primer set includes at least one of the following primer sets.
A primer set comprising a primer having the base sequence shown by SEQ ID NO: 3 and a primer having the base sequence shown by SEQ ID NO: 4,
A primer set including a primer having the base sequence shown by SEQ ID NO: 7 and a primer having the base sequence shown by SEQ ID NO: 8, and a primer having the base sequence shown by SEQ ID NO: 11 and the base sequence shown by SEQ ID NO: 12 A primer set comprising a primer having
The present invention also relates to any one of the above-described cherry clone identification methods, wherein the selected primer set includes all primers having the base sequences represented by SEQ ID NOs: 1 to 12.
Furthermore, the present invention is selected from the clone names of two or more individuals obtained by the method for identifying a clone of a plant belonging to any of the above genus Sakura, and the names of cultivars when present, and the six types of primer sets. The present invention relates to a method for identifying clones and cultivars of plants belonging to the genus Sakura, using a database indicating the DNA base length of each of the clones amplified by PCR using two or more kinds of primer sets.
The present invention still further relates to the above method, wherein the number of the two or more cherry blossoms is 50 or more.
Furthermore, the present invention provides two or more species selected from the clone name and cultivar name of two or more individuals obtained by the method of identifying a clone of a plant belonging to any of the above genus Sakura, and the above six primer sets. It is related with the database which shows the base length of DNA about each of the said clone amplified by PCR method using the primer set of.
And this invention relates to the said database whose number of individuals of a 2 or more cherry tree is 50 or more.
本発明によれば、サクラ属に属する植物のゲノム中のマイクロサテライト領域を得るためのプライマーセットが提供され、このプライマーセットを２種以上使用して PCR 法によってマイクロサテライト領域を増幅し、そのサイズを特定し遺伝子型を決定し、もってサクラ属に属する植物のクローン識別を従来の方法より高い効率および精度で行うことができる。
本発明の方法は、採取後間もない葉等の新鮮な組織に限定されず、伐採後に長時間経過した丸太や、合板等の加工品についてのクローン識別も可能である。また、成長や材質などの形質パラメーターと遺伝的な特性とを比較検討することにより、集団における遺伝的特性と形質との関連についての知見を得ることが期待されるばかりでなく、育種の効率化も期待される。
According to the present invention, there is provided a primer set for obtaining a microsatellite region in the genome of a plant belonging to the genus Sakura. Two or more of these primer sets are used to amplify the microsatellite region by PCR, and the size of the primer set is obtained. Can be identified and genotyped, so that clones of plants belonging to the genus Sakura can be identified with higher efficiency and accuracy than conventional methods.
The method of the present invention is not limited to fresh tissues such as leaves that have just been collected, and can also identify clones for processed products such as logs and plywood that have passed for a long time after cutting. In addition, by comparing and examining trait parameters such as growth and material and genetic characteristics, it is expected not only to obtain knowledge about the relationship between genetic characteristics and traits in the population, but also to improve the efficiency of breeding. Is also expected.
また、本発明によれば、サクラの苗および／または成木の供給において、それぞれの苗および／または成木の遺伝子型を特定することによりサクラの苗および／または成木に付加価値を付与することもできる。サクラの増幅はさし木や接ぎ木で行われることが多いため、いずれかの栽培品種または名木のクローンであるものが多い。すなわち、本発明のプライマーセットを用いる方法は、サクラの苗および／または成木に付加価値を付与するために好適に用いることができる。 In addition, according to the present invention, in the supply of cherry seedlings and / or adult trees, added value is added to the cherry seedlings and / or adult trees by specifying the genotype of each seedling and / or adult tree. You can also. Since cherry blossoms are often amplified by cuttings and grafts, many are cultivars or clones of famous trees. That is, the method using the primer set of the present invention can be suitably used to add value to cherry seedlings and / or adult trees.
なお、植物や動物のゲノム中には、シトシンとアデニン、チミンとグアニンなどの数塩基からなるモチーフの繰り返し配列であるマイクロサテライトと呼ばれる領域が、高頻度で広く分布することが知られている。マイクロサテライトを含む領域を増幅するように設計された PCR マーカーの多くは、多型性が抜きん出て高くしかも共優性であることから、精密な遺伝子解析に適しており、近年、育種学、集団遺伝学などの分野に重用されている。例えば、特許文献１には、イネの DNA を鋳型とし、マイクロサテライトを含むマイクロサテライトマーカーを PCR によって増幅し、増幅されたマイクロサテライトマーカーのサイズによってイネの品種を特定することが記載されている。特許文献２には、ナシ類植物のマイクロサテライト DNA に基づき、ナシ類植物の種や栽培品種の識別、有用形質の選択などに利用することが記載されている。
本発明は、サクラのゲノムに含まれるマイクロサテライト領域を増幅するためのプライマーセットのうち、ＰＣＲによる増幅の効率および得られる増幅断片の多型性が高い、とくに好適なものを選抜したことに基礎をおくものである。
In the genome of plants and animals, it is known that a region called microsatellite, which is a repeated sequence of a motif consisting of several bases such as cytosine and adenine, thymine and guanine, is widely distributed with high frequency. Many PCR markers designed to amplify microsatellite-containing regions are highly polymorphic and co-dominant, making them suitable for precise genetic analysis. It is heavily used in academic fields. For example,
The present invention is based on the selection of a particularly suitable primer set for amplifying the microsatellite region contained in the cherry genome, which has high amplification efficiency by PCR and high polymorphism of the resulting amplified fragment. It is a thing to put.
（１）プライマーセット
本発明のプライマーセットは、上記のとおりのものである。該プライマーセットを構成するプライマーおよびその変異体は、市販されている DNA シンセサイザーを用いて容易に合成することができる。本発明においては、これらのプライマーおよびその変異体は、いかなる機器あるいは方法によってこのプライマーが合成されたかは問題とならず、その機器・方法等の相違によって本発明の目的とする効果が左右されることはない。
(1) Primer set The primer set of the present invention is as described above. Primers constituting the primer set and variants thereof can be easily synthesized using a commercially available DNA synthesizer. In the present invention, these primers and variants thereof do not matter by what equipment or method the primer was synthesized in, and the intended effect of the present invention depends on the difference in the equipment and method. There is nothing.
本発明のプライマーセットは、以下のようにして特定した。
本発明では、サクラ属に属する植物のゲノム中に存在するマイクロサテライト領域に隣接する両端の塩基配列を、dual-suppression-PCR 法（練春蘭ら、日林誌 86(2), 191-198, 2004; Chunlan Lian et al., Journal of Plant Research, 114, 381-386, 2001; Chunlan Lian et al., Molecular Ecology Notes 2, 211-213, 2002）により特定した。この dual-suppression-PCR 法は、以後に記載する実施例１において詳細に説明されており、また、図１に示した通り、マイクロサテライト領域の一端に隣接する塩基配列の決定（第１段階目）と、suppression-PCR 法（Sibert, P.D., et al., Nucleic Acids Res., 23, 1087-1088, 1995）による反対側の一端に隣接する塩基配列の決定（第２段階目）からなっている。
The primer set of the present invention was specified as follows.
In the present invention, the nucleotide sequences at both ends adjacent to the microsatellite region present in the genome of a plant belonging to the genus Sakura are determined by the dual-suppression-PCR method (Naruharu Ran et al., Nichibayashi 86 (2), 191-198, 2004; Chunlan Lian et al., Journal of Plant Research, 114, 381-386, 2001; Chunlan Lian et al., Molecular Ecology Notes 2, 211-213, 2002). This dual-suppression-PCR method is described in detail in Example 1 described later, and as shown in FIG. 1, the determination of the base sequence adjacent to one end of the microsatellite region (first step) ) And determination of the nucleotide sequence adjacent to the opposite end by the suppression-PCR method (Sibert, PD, et al., Nucleic Acids Res., 23, 1087-1088, 1995) (second stage) Yes.
より詳細には、図１に示されるように、dual-suppression-PCR 法では、先ずマイクロサテライト（SSR）部位を含むゲノム DNA を抽出し、制限酵素により DNA 断片を作製する。次いで、図２に示す不等長アダプターを DNA 断片にライゲーションして不等長アダプター付き制限酵素断片を作製する。次いで、図２に示したアダプタープライマー AP2 と、マイクロサテライト中の配列として予想される配列に基づいて作製されたマイクロサテライト（SSR）プライマー（具体的には、アデニンとシトシンの２塩基の繰り返し配列である 5'-ACACACACACACACACACAC-3'を用いた）とを用いて、マイクロサテライト領域の一端を含む配列を増幅し、次いで、サブクローニング、シーケンシング、プライマー IP2 および IP1 による増幅、シーケンシングにより、マイクロサテライト領域の一端に隣接する塩基配列を決定する。次いで、nested PCR 法により、マイクロサテライト領域のもう一端に隣接する塩基配列を決定する。すなわち、図１に示すように、不等長アダプター付き制限酵素断片を、図２に示したアダプタープライマー AP1 と、プライマー IP1 で増幅し、次いで、図２に示すように増幅を繰り返して、シーケンシングにより、マイクロサテライト領域のもう一端に隣接する塩基配列を決定する。かくして、マイクロサテライト領域に隣接する両端に位置する塩基配列が決定される。 More specifically, as shown in FIG. 1, in the dual-suppression-PCR method, first, genomic DNA containing a microsatellite (SSR) site is extracted, and a DNA fragment is prepared using a restriction enzyme. Next, the unequal length adapter shown in FIG. 2 is ligated to the DNA fragment to produce a restriction enzyme fragment with the unequal length adapter. Next, the adapter primer AP2 shown in FIG. 2 and a microsatellite (SSR) primer (specifically, a two-base repeat sequence of adenine and cytosine) prepared based on the sequence expected as the sequence in the microsatellite. Using a 5'-ACACACACACACACACACAC-3 ') and then amplifying the sequence containing one end of the microsatellite region, then subcloning, sequencing, amplification with primers IP2 and IP1, and sequencing. The base sequence adjacent to one end of is determined. Next, a base sequence adjacent to the other end of the microsatellite region is determined by nested PCR. That is, as shown in FIG. 1, the restriction enzyme fragment with an unequal length adapter is amplified with the adapter primer AP1 and the primer IP1 shown in FIG. 2, and then the amplification is repeated as shown in FIG. To determine the base sequence adjacent to the other end of the microsatellite region. Thus, base sequences located at both ends adjacent to the microsatellite region are determined.
このようにして、マイクロサテライト領域の両端に位置する塩基配列として、１２種類の塩基配列が特定された。さらに、増幅の効率および増幅断片長の多型性によってスクリーニングを行い、表１に示す６種類（６セット）のプライマーセットを選抜した。
これらのプライマーセットは、増幅の効率がよく、増幅断片長の多型性も高いため、サクラ属に属する植物のゲノム中のマイクロサテライト領域を PCR により増幅するためのプライマーセットとなるものである。
これらのプライマーセットは、下記表１に示すように、本明細書においては、それぞれSK1-1、SK3-1、SK4-1、SK7-1、SK8-1およびSK9-2と呼ぶこともある。プライマーセットSK1-1の塩基配列をそれぞれ配列番号１および２に、プライマーセットSK3-1の塩基配列をそれぞれ配列番号３および４に、プライマーセットSK4-1の塩基配列をそれぞれ配列番号５および６に、プライマーセット SK7-1の塩基配列をそれぞれ配列番号７および８に、プライマーセット SK8-1 の塩基配列をそれぞれ配列番号９および１０に、プライマーセット SK9-2の塩基配列をそれぞれ配列番号１１および１２に示した。
In this way, 12 types of base sequences were identified as base sequences located at both ends of the microsatellite region. Furthermore, screening was performed based on the amplification efficiency and the polymorphism of the amplified fragment length, and six types (six sets) of primer sets shown in Table 1 were selected.
Since these primer sets have high amplification efficiency and high polymorphism of the amplified fragment length, they serve as primer sets for amplifying the microsatellite region in the genome of plants belonging to the genus Sakura by PCR.
As shown in Table 1 below, these primer sets may be referred to as SK1-1, SK3-1, SK4-1, SK7-1, SK8-1, and SK9-2, respectively, in the present specification. The base sequence of primer set SK1-1 is shown in SEQ ID NOs: 1 and 2, respectively, the base sequence of primer set SK3-1 is shown in SEQ ID NOs: 3 and 4, and the base sequence of primer set SK4-1 is shown in SEQ ID NOs: 5 and 6, respectively. The base sequence of primer set SK7-1 is shown in SEQ ID NOs: 7 and 8, respectively, the base sequence of primer set SK8-1 is shown in SEQ ID NOs: 9 and 10, and the base sequence of primer set SK9-2 is shown in SEQ ID NOs: 11 and 12, respectively. It was shown to.
なお、これらのプライマーは、それぞれのプライマーの配列番号１から１２に示す塩基配列に相補的な塩基配列とストリンジェントな条件でハイブリダイズする塩基配列を有し同様にプライマーとしての機能を有するその変異体であってもよい。ここでいうストリンジェントな条件でハイブリダイズするとは、PCR 法による増幅における、２本鎖 DNA の変性後のアニーリングの工程で、アニーリングと同様の条件下で、配列番号１から１２に示す塩基配列に相補的な塩基配列とハイブリダイズすることを指す。このようなアニーリングと同様の条件としては、例えば、通常の PCR 反応用緩衝液中で、dNTP (dATP、dTTP、dGTP、dCTP）および DNA ポリメラーゼと混合し、混合物を、例えば 43℃から 68℃の温度で反応させる条件が挙げられる。より具体的には、以後に説明する本発明のクローン識別方法において採用される PCR におけるアニーリング条件が挙げられる。
また、同様にプライマーとしての機能を有するとは、PCR による同一個体からのゲノム DNA の増幅において、プライマーとして使用した場合に、変異していない元のプライマーと同様にマイクロサテライト領域を増幅できることを指す。
上記のような変異体の設計は、本技術分野における当業者であれば容易に行うことができる。したがって、当該変異体も当然に本願発明の範囲に包含されるのである。
これらのプライマーおよびその変異体は、市販されている DNA シンセサイザーを用いて容易に合成することができる。本発明においては、これらのプライマーおよびその変異体は、いかなる機器あるいは方法によってこのプライマーが合成されたかは問題とならず、その機器・方法等の相違によって本発明の目的とする効果が左右されることはない。
These primers have base sequences that hybridize under stringent conditions with base sequences complementary to the base sequences shown in SEQ ID NOs: 1 to 12 of the respective primers, and their mutations that also function as primers. It may be a body. The term “hybridization under stringent conditions” as used herein refers to the annealing step after denaturation of double-stranded DNA in amplification by the PCR method, and the nucleotide sequences shown in SEQ ID NOs: 1 to 12 under the same conditions as annealing. Hybridization with a complementary base sequence. As conditions similar to such annealing, for example, in normal PCR reaction buffer, dNTP (dATP, dTTP, dGTP, dCTP) and DNA polymerase are mixed, and the mixture is mixed at, for example, 43 ° C to 68 ° C. The conditions made to react at temperature are mentioned. More specifically, annealing conditions in PCR employed in the clone identification method of the present invention described later are mentioned.
Similarly, having a function as a primer means that when used as a primer in amplification of genomic DNA from the same individual by PCR, the microsatellite region can be amplified in the same manner as the original primer without mutation. .
Such mutants can be easily designed by those skilled in the art. Therefore, the mutant is naturally included in the scope of the present invention.
These primers and mutants thereof can be easily synthesized using a commercially available DNA synthesizer. In the present invention, these primers and variants thereof do not matter by what equipment or method the primer was synthesized in, and the intended effect of the present invention depends on the difference in the equipment and method. There is nothing.
（２）識別方法
本発明においては、上記６つ（６種類）のプライマーセットSK1-1、SK3-1、SK4-1、SK7-1、SK8-1およびSK9-2およびそれぞれのプライマーの変異体から構成されるプライマーセットから２種以上のプライマーセットを選択し、該選択されたプライマーセットを用いて、識別対象であるそれぞれのサクラの組織より抽出した DNA を鋳型として PCR を行い、次いで、この PCR により増幅した DNA について増幅断片長の分析を行うことにより、サクラのクローンの識別を行う。本発明のプライマーセットはいずれも、PCR においてサクラのマイクロサテライト領域を増幅することができ、この結果より、サクラのクローン識別が可能となるのである。
本発明のプライマーセットにより増幅されるマイクロサテライト領域は、より具体的には、上記したプライマーセットの塩基配列を決定する際に用いたマイクロサテライト（SSR）プライマーが、アデニンとシトシンの２塩基の繰り返し配列であるため、アデニンとシトシンの２の繰り返し配列を含むマイクロサテライト領域である。
(2) Identification method In the present invention, the above six (six types) primer sets SK1-1, SK3-1, SK4-1, SK7-1, SK8-1 and SK9-2 and their respective primer variants Two or more types of primer sets are selected from the primer set composed of, and using the selected primer sets, PCR is performed using DNA extracted from each cherry tissue to be identified as a template. The clones of Sakura are identified by analyzing the amplified fragment length of the DNA amplified by PCR. Any of the primer sets of the present invention can amplify the cherry microsatellite region in PCR, and from this result, it becomes possible to identify cherry clones.
More specifically, the microsatellite region amplified by the primer set of the present invention is a microsatellite (SSR) primer used for determining the base sequence of the primer set described above, and a repeat of two bases of adenine and cytosine. Since it is a sequence, it is a microsatellite region containing two repeated sequences of adenine and cytosine.
なお、本発明が適用されるサクラは限定されず、いかなるサクラであってもよい。これらは生木であっても伐採された材であっても加工品であっても構わない。また、いずれの組織から抽出された DNA であってもよい。
さらに、本発明の方法において識別の対象となるサクラの植物体はとくに限定されず、苗または成木であってよい。また、かかる対象は、植栽前のものであっても植栽後のものであってもよい。
In addition, the cherry to which this invention is applied is not limited, Any cherry may be used. These may be raw trees, felled wood, or processed products. Further, it may be DNA extracted from any tissue.
Further, the cherry plant to be identified in the method of the present invention is not particularly limited, and may be a seedling or an adult tree. Moreover, this object may be a thing before planting, or a thing after planting.
サクラの組織からの DNA 抽出は、CTAB 法や SDS 法等の定法、またはこれらの方法を適宜改良した方法により実施することができる。抽出法の相違によって本発明の目的とする効果が左右されることはない。PCR は、こうして得られたDNA を、PCR 反応用緩衝液中で、上記のようにして選択されたプライマーセット、dNTP (dATP、dTTP、dGTP、dCTP）および DNA ポリメラーゼと混合し、この混合物を適当な温度サイクルで繰返し反応させることにより行えばよい。なお、このときの PCR 条件は、最もクリアな電気泳動パターンが得られるよう、適宜設定すればよい。通常は、DNA 25 〜50 ng、10×PCR 反応用緩衝液 1〜10 μl、プライマーをそれぞれ 0.2〜2μM、dNTP 20〜200μM、DNA ポリメラーゼ 0.5〜25 U を混合した後、全液量が 10〜100μl となるように希釈したものについて、次に示すような温度サイクルで反応させた場合に、良好な結果を得ることができる。10×PCR 反応用緩衝液、dNTP および DNA ポリメラーゼについては市販されているので、これを用いることができる。 DNA extraction from cherry tissue can be carried out by standard methods such as the CTAB method and SDS method, or by appropriately modifying these methods. Differences in extraction methods do not affect the intended effect of the present invention. In PCR, the DNA thus obtained is mixed with the primer set, dNTP (dATP, dTTP, dGTP, dCTP) and DNA polymerase selected as described above in the PCR reaction buffer, and this mixture is mixed appropriately. What is necessary is just to carry out by making it react repeatedly by a various temperature cycle. The PCR conditions at this time may be set as appropriate so that the clearest electrophoresis pattern can be obtained. Usually, after mixing 25 to 50 ng of DNA, 1 to 10 μl of 10 × PCR reaction buffer, 0.2 to 2 μM of primer, 20 to 200 μM of dNTP, and 0.5 to 25 U of DNA polymerase, the total volume is 10 to Good results can be obtained when the product diluted to 100 μl is reacted in the following temperature cycle. The 10 × PCR reaction buffer, dNTP and DNA polymerase are commercially available and can be used.
PCR における温度条件
ステップ１：94〜96℃ 約 9 分 1 サイクル
ステップ２：94〜96℃ 約 0.5 分→52〜58℃ 約 0.5〜1 １分→70〜74℃
約 0.5〜1 分 28〜40 サイクル
ステップ３：70〜74℃ 約 3〜5 分 1 サイクル
Temperature conditions in PCR Step 1: 94-96 ° C Approx. 9
About 0.5 to 1 minute 28 to 40 cycles Step 3: 70 to 74 ° C About 3 to 5
PCR 反応後の増幅した DNA 断片長の解析は、DNA シークエンサーを用いたキャピラリー電気泳動や、ガラス板を用いたポリアクリルアミド電気泳動、マススペクトル法等によって行うことができる。キャピラリー電気泳動の場合には、プライマーの片側を蛍光標識して蛍光検出器で検出すればよく、ガラス板を用いたポリアクリルアミド電気泳動の場合には、エチジウムブロマイドや銀染色等の定法を用いて検出することができる。
上記したように、本発明の上記６つのプライマーセットSK1-1、SK3-1、SK4-1、SK7-1、SK8-1およびSK9-2およびそれぞれのプライマーの変異体から構成されるプライマーセットは、これを用いて PCR を行った場合、マイクロサテライト領域を増幅するが、その増幅される部分は、プライマーセットごとに異なっている。したがって、同一個体の組織より抽出された DNA であっても、プライマーセットが異なれば、PCR により増幅される DNA は異なってくる。一方、異なる個体の組織より抽出された DNA に対しては、同じプライマーセットを用いても、PCR により増幅される DNA は、塩基数の違いが互いに異なる場合が生じる。本発明によるサクラのクローン識別方法は、このようなプライマーセットごとの挙動の相違を指標として行われるのである。
Analysis of the length of the amplified DNA fragment after the PCR reaction can be performed by capillary electrophoresis using a DNA sequencer, polyacrylamide electrophoresis using a glass plate, mass spectrometry, or the like. In the case of capillary electrophoresis, one side of the primer may be fluorescently labeled and detected with a fluorescence detector. In the case of polyacrylamide electrophoresis using a glass plate, a conventional method such as ethidium bromide or silver staining may be used. Can be detected.
As described above, the above six primer sets SK1-1, SK3-1, SK4-1, SK7-1, SK8-1 and SK9-2 of the present invention and the primer sets composed of the respective primer variants are When PCR is carried out using this, the microsatellite region is amplified, but the amplified portion is different for each primer set. Therefore, even if DNA is extracted from the tissue of the same individual, the DNA amplified by PCR will differ if the primer set is different. On the other hand, for DNA extracted from tissues of different individuals, even if the same primer set is used, the DNA amplified by PCR may differ in the number of bases. The cherry clone identification method according to the present invention is carried out using the difference in behavior for each primer set as an index.
本発明によるサクラのクローン識別方法には、上記６つのプライマーセットから選択される２種以上のプライマーセットが用いられるところ、用いられるプライマーセットの種類の数は識別対象であるサクラの個体数に応じて改変することができる。例えば、識別対象であるサクラの個体数が約５０個体の場合、３〜６種類のプライマーセットを用いればよく、かかる方法は好ましい。本発明によるサクラのクローン識別方法のうち、３〜５種類のプライマーセットを用いるものはより好ましく、３〜４種類のプライマーセットを用いるものは一層より好ましい。個体数がより少ない場合には、２種類のプライマーセットを用いるものが好ましい。 In the method for identifying cherry clones according to the present invention, two or more primer sets selected from the above six primer sets are used, and the number of types of primer sets used depends on the number of cherry individuals to be identified. Can be modified. For example, when the number of cherry trees to be identified is about 50, 3 to 6 kinds of primer sets may be used, and such a method is preferable. Among the cherry clone identification methods according to the present invention, those using 3 to 5 primer sets are more preferable, and those using 3 to 4 primer sets are even more preferable. When the number of individuals is smaller, one using two kinds of primer sets is preferable.
用いられるプライマーセットとして、以下のプライマーセットを含むものは、増幅断片長の多型性が比較的高く、識別能がより高いため好ましい：
・配列番号３で示される塩基配列を有するプライマーと配列番号４で示される塩基配列を有するプライマーを含むプライマーセット（SK3-1）
・配列番号７で示される塩基配列を有するプライマーと配列番号８で示される塩基配列を有するプライマーを含むプライマーセット（SK7-1）
・配列番号１１で示される塩基配列を有するプライマーと配列番号１２で示される塩基配列を有するプライマーを含むプライマーセット（SK9-2）
上記３種類のプライマーセットの少なくとも１つを含む本発明によるサクラのクローン識別方法は、遺伝子型についてより詳細な情報が得られるため好ましく、これら３種のプライマーセットをすべて含む本発明によるサクラのクローン識別方法は、より好ましい。
As the primer set to be used, those containing the following primer sets are preferred because the polymorphism of the amplified fragment length is relatively high and the discrimination ability is higher:
A primer set (SK3-1) comprising a primer having the base sequence shown by SEQ ID NO: 3 and a primer having the base sequence shown by SEQ ID NO: 4
-Primer set (SK7-1) comprising a primer having the base sequence shown by SEQ ID NO: 7 and a primer having the base sequence shown by SEQ ID NO: 8
A primer set comprising a primer having the base sequence shown by SEQ ID NO: 11 and a primer having the base sequence shown by SEQ ID NO: 12 (SK9-2)
The method for identifying cherry clones according to the present invention comprising at least one of the above three types of primer sets is preferred because more detailed information on the genotype can be obtained, and the cherry clones according to the present invention comprising all these three types of primer sets. The identification method is more preferable.
また、本発明によるサクラのクローン識別方法のうち、上記６種類のプライマーセットをすべて用いるものは、識別の精度がより高いため好ましい。
さらに、本発明によるサクラのクローン識別方法のうち、本発明において特定される遺伝子型におけるＤＮＡ長についての誤差が、０．１％以下であるものは好ましく、０．０５％以下であるものはより好ましく、０．０１％以下であるものは一層より好ましい。
In addition, among the cherry clone identification methods according to the present invention, the method using all of the above six types of primer sets is preferred because the identification accuracy is higher.
Further, among the cherry clone identification methods according to the present invention, it is preferable that the DNA length error in the genotype specified in the present invention is 0.1% or less, more preferably 0.05% or less. Preferably, what is 0.01% or less is still more preferable.
（３）クローンを特定する方法
上記いずれかの本発明によるサクラのクローン識別方法を用いて種々のサクラについての遺伝子型のデータベースを作成することができる。また、分類が不明なサクラについて、その遺伝子型（PCR 法により増幅されたDNA の塩基長）を上記データベースのデータと比較することによって、当該サクラの種・栽培品種を特定することができる。
(3) Method for Identifying Clones Genotype databases for various cherry blossoms can be created using any one of the above-described methods for identifying cherry clones according to the present invention. In addition, by comparing the genotype (base length of DNA amplified by the PCR method) with the data in the above-mentioned database, the cherry seeds and cultivars can be identified.
かかるデータベースの作成には、前記６種類のプライマーセットから選ばれる２種以上のプライマーセットを用いる。かかるデータベースの作成のうち、３〜６種類のプライマーセットを用いるものはより好ましく、５〜６種類のプライマーセットを用いるものは一層より好ましい。
用いられるプライマーセットとして、以下のプライマーセットを含むものは、増幅断片長の多型性が比較的高く、識別能がより高いため好ましい：
・配列番号３で示される塩基配列を有するプライマーと配列番号４で示される塩基配列を有するプライマーを含むプライマーセット（SK3-1）
・配列番号７で示される塩基配列を有するプライマーと配列番号８で示される塩基配列を有するプライマーを含むプライマーセット（SK7-1）
・配列番号１１で示される塩基配列を有するプライマーと配列番号１２で示される塩基配列を有するプライマーを含むプライマーセット（SK9-2）
また、上記６種類のプライマーセットをすべて用いて得られたデータベースを用いる方法は、識別の精度がより高く、かつ、より多くのサクラの遺伝子型の相違が特定されるため好ましい。
In creating such a database, two or more primer sets selected from the six types of primer sets are used. Among these database creations, those using 3 to 6 types of primer sets are more preferable, and those using 5 to 6 types of primer sets are even more preferable.
As the primer set to be used, those containing the following primer sets are preferred because the polymorphism of the amplified fragment length is relatively high and the discrimination ability is higher:
A primer set (SK3-1) comprising a primer having the base sequence shown by SEQ ID NO: 3 and a primer having the base sequence shown by SEQ ID NO: 4
-Primer set (SK7-1) comprising a primer having the base sequence shown by SEQ ID NO: 7 and a primer having the base sequence shown by SEQ ID NO: 8
A primer set comprising a primer having the base sequence shown by SEQ ID NO: 11 and a primer having the base sequence shown by SEQ ID NO: 12 (SK9-2)
In addition, a method using a database obtained by using all of the above six types of primer sets is preferable because the identification accuracy is higher and more genotype differences of cherry are specified.
データベースに示されるサクラのクローンの数は限定されないところ、かかるクローンの数として、５０クローン以上は好ましく、１００クローン以上はより好ましく、１５０クローン以上は一層より好ましい。
本発明において用いられるデータベースの例を図３に示す。
Although the number of cherry clones shown in the database is not limited, the number of such clones is preferably 50 or more, more preferably 100 or more, and even more preferably 150 or more.
An example of the database used in the present invention is shown in FIG.
以下に、本発明を実施例に基づいて説明する。本発明は以下の実施例によってなんら限定されるものではなく、本発明の属する技術分野における通常の変更を加えて実施することができることはいうまでもない。 Hereinafter, the present invention will be described based on examples. The present invention is not limited in any way by the following examples, and it goes without saying that the present invention can be carried out with ordinary modifications in the technical field to which the present invention belongs.
サクラ属に属する植物のゲノム DNA 中に存在するマイクロサテライト領域に隣接する両端の塩基配列を、図１に示す dual-suppression-PCR 法により特定した。このdual-suppression-PCR 法は、図１に示した通り、マイクロサテライト領域の一端に隣接する塩基配列の決定（第１段階目）と、suppression-PCR 法による反対側の一端に隣接する塩基配列の決定（第２段階目）からなっている。
１．サクラからの全 DNA の抽出
全 DNA の抽出は、DNeasy plant mini kit（キアゲン社製）を用いて行った。すなわち、サクラの葉を乳鉢と乳棒を使用して液体窒素中で粉末状にすり潰し、すり潰した粉末を2mlマイクロチューブに移した。これに400μl のBuffer AP１と4μl の100mg/ml RNase A を加え、激しくボルテックスした後、インキュベート（65℃、10 分、途中で2〜3 回転倒混和）した。さらに、130μl のBuffer AP2 を加え、混和し、インキュベート（氷上、5 分）した後、遠心（14,500rpm (20,000×g)、5 分、室温）し、上清をQIAsherdder Mini スピンカラムに移した。これをさらに遠心(14,500rpm (20,000×g)、2 分、室温)し、上清をカラムに通し、通過したろ液画分を新しい2ml マイクロチューブに移した。これに1.5 倍容量のBuffer AP3/E を加え、ピペットで混和し、混和液650μl をDNeasy Mini スピンカラムに移し、遠心（8,000rpm (6,000×g)、1 分、室温）し、ろ液を捨て、DNeasy Mini スピンカラムを新しい2ml マイクロチューブに移し、500μl のBuffer AW を加えた。これをさらに遠心（8,000rpm (6,000×g)、1 分、室温）し、ろ液を捨て、DNeasy Mini スピンカラムに500μl のBuffer AW を加えた後、さらに遠心（14,500rpm (20,000×g)、2 分、室温）し、フィルタを乾燥させた。DNeasy Mini スピンカラムを新しい1.5ml のマイクロチューブに移し、100μl のBuffer AE を加え、インキュベート（室温、5 分）し、遠心（8,000rpm (6,000×g)、1 分、室温）した。得られたペレットを以後の操作に供した。
The base sequences at both ends adjacent to the microsatellite region present in the genomic DNA of plants belonging to the genus Sakura were identified by the dual-suppression-PCR method shown in FIG. In this dual-suppression-PCR method, as shown in FIG. 1, the determination of the base sequence adjacent to one end of the microsatellite region (first stage) and the base sequence adjacent to the opposite end by the suppression-PCR method are performed. (Second stage).
1. Extraction of total DNA from cherry tree Total DNA was extracted using DNeasy plant mini kit (Qiagen). That is, cherry leaves were ground in liquid nitrogen using a mortar and pestle, and the ground powder was transferred to a 2 ml microtube. 400 μl of Buffer AP1 and 4 μl of 100 mg / ml RNase A were added to this, and vortexed vigorously, followed by incubation (65 ° C., 10 minutes, mixing 2 to 3 times in the middle). Furthermore, 130 μl of Buffer AP2 was added, mixed, incubated (on ice, 5 minutes), centrifuged (14,500 rpm (20,000 × g), 5 minutes, room temperature), and the supernatant was transferred to a QIAsherdder Mini spin column. This was further centrifuged (14,500 rpm (20,000 × g), 2 minutes, room temperature), the supernatant was passed through the column, and the filtrate fraction passed was transferred to a new 2 ml microtube. Add 1.5 volumes of Buffer AP3 / E to this, mix with a pipette, transfer 650 μl of the mixture to a DNeasy Mini spin column, centrifuge (8,000 rpm (6,000 × g), 1 minute, room temperature), and discard the filtrate. The DNeasy Mini spin column was transferred to a new 2 ml microtube and 500 μl Buffer AW was added. This is further centrifuged (8,000 rpm (6,000 × g), 1 minute, room temperature), the filtrate is discarded, 500 μl Buffer AW is added to the DNeasy Mini spin column, and then further centrifuged (14,500 rpm (20,000 × g), 2 minutes at room temperature) and let the filter dry. The DNeasy Mini spin column was transferred to a new 1.5 ml microtube, 100 μl Buffer AE was added, incubated (room temperature, 5 minutes), and centrifuged (8,000 rpm (6,000 × g), 1 minute, room temperature). The obtained pellets were subjected to subsequent operations.
２．全 DNA の制限酵素処理
抽出した全 DNA を、各制限酵素（AluI、AfaI、EcoRV、HaeIII、HincII、SspI (宝酒造（株）製)で処理した。すなわち、7μg の DNA に、10μl の 10×buffer と 2μl の酵素を加え、滅菌蒸留水で全液量を 100μl とし、37℃で 3 時間加温した。反応液に 100μl の TE と 200μl のクロロホルム:イソアミルアルコール(24:1) 混液を添加し、混和してから遠心 (15,000rpm、5min、4℃) して上清を回収した。上清に 1/10倍量の 3M NaOAc と3倍量の 99.5％ エタノールを加え、よく混和した後、10 分間氷上に静置した。遠心 (15,000rpm、10min、4℃) して得られたペレットに 80％ エタノールを加えて、遠心 (15,000rpm、10min、 4℃) し、上清を捨てた。得られたペレットに 36μl の TE 緩衝液を加えて溶解し、以後の操作に供した。
2. Restriction enzyme treatment of total DNA Extracted total DNA was treated with each restriction enzyme (AluI, AfaI, EcoRV, HaeIII, HincII, SspI (Takara Shuzo Co., Ltd.)), that is, 10 μl of 10 × buffer in 7 μg of DNA. And 2 μl of enzyme, bring the total volume to 100 μl with sterile distilled water and warm for 3 hours at 37 °
３．不等長アダプターのライゲーション
アダプターライゲーションキット(宝酒造（株）製)を用いて、図２に示すように、以下の配列からなる不等長アダプターをライゲーションした。
長鎖: 5'-GTAATACGACTCACTATAGGGCACGCGTGGTCGACGGCCCGGGCTGGT-3'
短鎖： 5'-ACCAGCCC-NH2-3'（3'末端にアミノ基を付加）
すなわち、制限酵素処理した DNA 液 5μl(0.5μg)に、Ligation Solution A を 40μl、 Ligation Solution B を 10μl、Adaptor Solution を1.61μl(1.4μgの DNA を含む)加え、滅菌蒸留水で全液量を 60μl として、反応液を 16℃ で 1 時間置いた。次に 140μl の TE 緩衝液および 200μl のクロロホルム:イソアミルアルコール(24:1) 混液を添加して混和し、遠心 (15,000rpm、5min、4℃) し、上清を回収した。上清に 1/10 倍量の 3M NaOAc と3 倍量の 99.5％エタノールを加え、よく混和した後、10 分間氷上に静置した。遠心(15,000rpm、10min、4℃)して得られたペレットに80％エタノールを加えて、遠心 (15,000rpm、10min、4℃) し、上清を捨てた。得られたペレットに 100μl の TE 緩衝液を加え溶解した。
3. Unequal length adapter ligation Using an adapter ligation kit (Takara Shuzo Co., Ltd.), as shown in FIG. 2, unequal length adapters having the following sequences were ligated.
Long chain: 5'-GTAATACGACTCACTATAGGGCACGCGTGGTCGACGGCCCGGGCTGGT-3 '
Short chain: 5'-ACCAGCCC-NH 2 -3 '(added amino group at 3' end)
Specifically, 40 μl of Ligation Solution A, 10 μl of Ligation Solution B, and 1.61 μl of Adaptor Solution (containing 1.4 μg of DNA) are added to 5 μl (0.5 μg) of DNA solution treated with the restriction enzyme, and the total volume is made up with sterile distilled water. The reaction solution was left at 16 ° C for 1 hour to make 60 µl. Next, 140 μl of TE buffer and 200 μl of chloroform: isoamyl alcohol (24: 1) mixture were added and mixed, and centrifuged (15,000 rpm, 5 min, 4 ° C.), and the supernatant was collected. To the supernatant, 1/10 volume of 3M NaOAc and 3 volumes of 99.5% ethanol were added and mixed well, then left on ice for 10 minutes. 80% ethanol was added to the pellet obtained by centrifugation (15,000 rpm, 10 min, 4 ° C.), centrifuged (15,000 rpm, 10 min, 4 ° C.), and the supernatant was discarded. 100 μl of TE buffer was added to the resulting pellet and dissolved.
４．不等長アダプター短鎖 3'末端のddGTP 処理
PCR における DNA 伸長反応を防ぐため、不等長アダプター短鎖 3'末端を完全にブロックする目的で GeneAmp AmpliTaq Gold PCR Reagent kit（アプライドバイオシステムズ(株)製）を用いて反応を行った。
すなわち、50μl の 5ng/μl DNA 溶液に、10×buffer を 10μl、25mM MgCl2 を 6μl、2mM ddGTP を 1μl、AmpliTaq Gold DNA Polymerase (5U/μl) を 0.5μl加え、滅菌蒸留水で全液量を 100μl として、反応液を 94℃で 9 分間、続いて50℃で 10 分間加温した。次に 140μl の TE 緩衝液および 200μl のクロロホルム:イソアミルアルコール (24:1) 混液を添加して混和し、遠心 (15,000rpm、5min、4℃) し、上清を回収した。上清に 1/10 倍量の 3M NaOAc と3 倍量の 99.5％エタノールを加え、よく混和した後、10 分間氷上に静置した。遠心 (15,000rpm、10min、4℃) して得られたペレットに 80％ エタノールを加えて、遠心 (15,000rpm、10min、4℃) し、上清を捨てた。得られたペレットに 50μl の TE 緩衝液を加え溶解した。
4). Treatment of ddGTP at the 3 'end of short adapter chain
In order to prevent DNA elongation reaction in PCR, the reaction was performed using GeneAmp AmpliTaq Gold PCR Reagent kit (Applied Biosystems Co., Ltd.) in order to completely block the 3 ′ end of the unequal length adapter short chain.
That is, 5 ng / [mu] l DNA solution 50 [mu] l, 10 [mu] l of 10 × buffer, a 25 mM MgCl 2 6 [mu] l, 1 [mu] l of 2mM ddGTP, AmpliTaq Gold DNA Polymerase a (5U / μl) was added 0.5 [mu] l, the total liquid volume in sterile distilled water The reaction was warmed at 94 ° C. for 9 minutes and then at 50 ° C. for 10 minutes to make 100 μl. Next, 140 μl of TE buffer and 200 μl of chloroform: isoamyl alcohol (24: 1) mixture were added and mixed, and centrifuged (15,000 rpm, 5 min, 4 ° C.), and the supernatant was collected. To the supernatant, 1/10 volume of 3M NaOAc and 3 volumes of 99.5% ethanol were added and mixed well, then left on ice for 10 minutes. 80% ethanol was added to the pellet obtained by centrifugation (15,000 rpm, 10 min, 4 ° C.), centrifuged (15,000 rpm, 10 min, 4 ° C.), and the supernatant was discarded. To the resulting pellet, 50 μl of TE buffer was added and dissolved.
５．マイクロサテライト領域の一端に隣接する塩基配列の決定
（１）CA リピートを含む断片の増幅
GeneAmp AmpliTaq Gold PCR Reagent kit（アプライドバイオシステムズ(株)製）を用いて、以下に示すように、アデニンとシトシンの２塩基の繰り返し配列のプライマー (AC)10 と、図２に示すプライマー AP2 で PCR を行った。プライマー AP2 は、不等長アダプターの長鎖１本鎖部分の 3'よりの部分と同じ配列をもつ。
プライマー(AC)10：5'-ACACACACACACACACACAC-3'
プライマー AP2: 5'-CTATAGGGCACGCGTGGT-3'
すなわち、2μl の 5ng/μl DNA 溶液に、10×buffer を 10μl、25mM MgCl2 を 6μl、10mM dNTP を 10μl、0.4μM のプライマーを各 2μl ずつ、AmpliTaq Gold DNA Polymerase (5U/μl) を0.5μl を加え、滅菌蒸留水で全液量を 100μl とした。PCR 条件は、以下の通りとした。
5. Determination of base sequence adjacent to one end of microsatellite region (1) Amplification of fragment containing CA repeat
PCR using GeneAmp AmpliTaq Gold PCR Reagent kit (Applied Biosystems Co., Ltd.) with primer (AC) 10 of a repeat sequence of two bases of adenine and cytosine as shown below and primer AP2 shown in FIG. Went. Primer AP2 has the same sequence as the 3 ′ portion of the long single-stranded portion of the unequal-length adapter.
Primer (AC) 10: 5'-ACACACACACACACACACAC-3 '
Primer AP2: 5'-CTATAGGGCACGCGTGGT-3 '
That is, 2 μl of 5 ng / μl DNA solution, 10 μl of 10 × buffer, 6 μl of 25 mM MgCl2, 10 μl of 10 mM dNTP, 2 μl of 0.4 μM primer, 0.5 μl of AmpliTaq Gold DNA Polymerase (5 U / μl) In addition, the total volume was adjusted to 100 μl with sterile distilled water. PCR conditions were as follows.
ステップ1：94℃ 9分→62℃ 30秒→72℃ 1分 1サイクル
ステップ2：94℃ 30秒→62℃ 30秒→72℃ 1分 5サイクル
ステップ3：94℃ 30秒→60℃ 30秒→72℃ 1分 35サイクル
ステップ3：94℃ 30秒→60℃ 30秒→72℃ 5分 1サイクル
Step 1: 94 ° C 9 minutes → 62 ° C 30 seconds → 72 °
この際、不等長アダプター内には、プライマー AP2 が結合できる相補塩基配列がなく、しかも短鎖の 3'末端がブロックされているので DNA 伸長反応が起こらず、相補的なマイクロサテライト配列をもつ制限酵素断片に結合したプライマー(AC)10 の 3'末端からしか DNA 伸長反応は起こらない。この伸長反応が起こると、不等アダプターの長鎖の相補鎖上にプライマー AP2 の相補配列が生じ、プライマー(AC)10 とプライマー AP2 との間が PCR により増幅され、マイクロサテライト領域とその隣接配列を含む部分が増幅される。 In this case, there is no complementary base sequence to which primer AP2 can bind in the unequal-length adapter, and since the 3 'end of the short chain is blocked, DNA extension reaction does not occur and it has a complementary microsatellite sequence. DNA extension reaction occurs only from the 3 'end of primer (AC) 10 bound to the restriction enzyme fragment. When this extension reaction occurs, a complementary sequence of primer AP2 is formed on the long complementary strand of the unequal adapter, and PCR is amplified between primer (AC) 10 and primer AP2, and the microsatellite region and its adjacent sequence are amplified. The portion containing is amplified.
（２）PCR 断片のサブクローニング
pT7 Blue perfectly blunt cloning kit(Novagen社, USA)を用いて、以下の操作を行った。
a) エンドコンバージョン
2μl の PCR 産物に、3μl の Nuclease-free water と 5μl の End Conversion Mix を加えてゆっくり混和し、22℃で 15 分間静置した。次に 75℃で 5 分間加温した後、氷上に 2 分間静置した。
b) ライゲーション
氷冷したエンドコンバージョン反応物に、1μl の Blunt Vector および 1μlの T4 DNA Ligase を加え、22℃で 15 分間静置した後、氷上に 15 分間静置した。
c) トランスフォーメーション
氷上で 50μl の NovaBlue Singles Competent cell にライゲーション反応物を 2μl 加え、5 分間静置してすばやく 42℃で 30 秒間加温した後、氷上で2分間冷やした。クリーンベンチ内で SOC Medium を300μl 加え、37℃で 30 分間、200rpm で振とうした。LB 寒天プレートに 30μl の菌液をまき、37℃で 15時間培養した。
d) コロニー PCR
培養して形成されたコロニーのうち、白いポジティブコロニーを滅菌した爪楊枝で取り、10μl の PCR 反応液を含むチューブに懸濁した。反応液は TaKaRa LA Taq (宝酒造（株）製)を用いて、10×buffer を 1μl、25mM MgCl2 を 1.6μl、2.5mM dNTP mixture を 1.6μl、0.2μM の Primer U-19 (5'-CAGGAAACAGCTATGAC-3')および 0.2 のμM の Primer M13-RV (5'-GGTTTTCCCAGTCACGACG-3') を各 0.1μl、TaKaRa LA Taq (5U/μl) を 0.1μl を加え、滅菌蒸留水で全液量を 10μl とした。PCR 条件は、以下の通りとした。
(2) PCR fragment subcloning
The following operations were performed using pT7 Blue perfectly blunt cloning kit (Novagen, USA).
a) End conversion
To 2 μl of the PCR product, 3 μl of Nuclease-free water and 5 μl of End Conversion Mix were added and mixed slowly, and left at 22 ° C. for 15 minutes. Next, it was heated at 75 ° C. for 5 minutes and then left on ice for 2 minutes.
b) Ligation To the ice-cooled end conversion reaction, 1 μl of Blunt Vector and 1 μl of T4 DNA Ligase were added, allowed to stand at 22 ° C. for 15 minutes, and then left on ice for 15 minutes.
c) Transformation 2 μl of the ligation reaction was added to 50 μl of NovaBlue Singles Competent cells on ice, allowed to stand for 5 minutes, quickly warmed at 42 ° C. for 30 seconds, and then cooled on ice for 2 minutes. 300 µl of SOC Medium was added in a clean bench and shaken at 37 ° C for 30 minutes at 200 rpm. 30 μl of the bacterial solution was plated on an LB agar plate and cultured at 37 ° C. for 15 hours.
d) Colony PCR
Of the colonies formed by culturing, white positive colonies were picked with a sterilized toothpick and suspended in a tube containing 10 μl of a PCR reaction solution. The reaction solution was TaKaRa LA Taq (Takara Shuzo Co., Ltd.), 10 ×
ステップ1：94℃ 5分 1サイクル
ステップ2：94℃ 30秒→54℃ 30秒→72℃ 45秒 29サイクル
ステップ3：94℃ 30秒→54℃ 30秒→72℃ 5分 1サイクル
Step 1: 94 °
（３）PCR 産物のサイズ確認
PCR 産物 2μl をアガロースゲル (1.5%) で電気泳動し、インサート部位のサイズを確認した。インサート部分が 150bp 以上の産物について、次のシークエンスを行った。
（４）シークエンス１(片側)
１２の産物についてシークエンスを行った。
BigDye Terminator v3.1 Cycle Sequencing Kit (アプライドバイオシステムズ（株）製)を用いた。反応液の組成は、2μl の PCR 産物に 1μl の 0.08μM の Texas Red-T7 primerと 10μl の滅菌蒸留水を加え、2μl ずつ 4 つに分注した。dNTP mix 2μl をそれぞれ加え、以下の条件で PCR 反応を行った。
(3) PCR product size confirmation
2 μl of the PCR product was electrophoresed on an agarose gel (1.5%), and the size of the insert site was confirmed. The following sequence was performed for products with an insert portion of 150 bp or more.
(4) Sequence 1 (one side)
Twelve products were sequenced.
BigDye Terminator v3.1 Cycle Sequencing Kit (Applied Biosystems Co., Ltd.) was used. The composition of the reaction solution was 1 μl of 0.08 μM Texas Red-T7 primer and 10 μl of sterilized distilled water added to 2 μl of the PCR product, and dispensed in 2 μl portions. 2 μl of dNTP mix was added, and PCR was performed under the following conditions.
ステップ1：95℃ 5分 1サイクル
ステップ2：95℃ 30秒→51℃ 30秒→72℃ 1分 25サイクル
Step 1: 95 °
反応産物は、ABI PRISM 3130 Genetic Analyzer (アプライドバイオシステムズ（株）製)を用いて塩基配列を決定した。決定した１２種の塩基配列を元に、それぞれ AP2 と SSR の間の AP2 側に IP1、SSR 側に IP2 の 2 つのプライマーを設計し、いずれか一方をそれぞれ各プライマーセットの左側とした。プライマーを設計するにあたり、IP1 は長さ 24〜27 塩基で、GC 含量が 35〜60％になるようにし、IP2 は長さ 19〜24 塩基で、GC 含量が 35〜60％になるようにした。 The nucleotide sequence of the reaction product was determined using ABI PRISM 3130 Genetic Analyzer (Applied Biosystems). Based on the determined 12 kinds of base sequences, two primers, IP1 on the AP2 side and AP2 on the SSR side, were designed between AP2 and SSR, respectively, and either one was set as the left side of each primer set. In designing the primer, IP1 was 24 to 27 bases in length and the GC content was 35-60%, and IP2 was 19-24 bases in length and the GC content was 35-60%. .
６．マイクロサテライト領域のもう一端に隣接する塩基配列の決定
図１の４に示すように、nested PCR により、マイクロサテライト領域のもう一端に隣接する塩基配列を決定した。
（１）nested PCR
プライマー AP1 (5'-CCATCGTAATACGACTCACTATAGGGC-3') と IP1 をプライマーとして先に不等長アダプターをライゲーションして ddGTP 処理した DNA (6 つの制限酵素で処理したそれぞれの DNA) を鋳型として、PCR を行った。図２に示すようにプライマー AP1 は、不等長アダプターの長鎖１本鎖部分の 5'末端配列と同じ配列を含む。次にその PCR 産物を 100 倍に希釈した DNA を鋳型として、AP2 と IP2 をプライマーとして再度 PCR を行った。
反応液は、GeneAmp AmpliTaq Gold PCR Reagent kit（アプライドバイオシステムズ(株)製）を用いて調製した。すなわち、0.5μl の DNA 溶液に、10×buffer を 2μl、25mM MgCl2 を 2μl、10mM dNTP を 2μl、0.5μM のプライマーを各 0.5μl ずつ、AmpliTaq Gold DNA Polymerase (5U/μl)を0.6μl を加え、滅菌蒸留水で全液量を 20μl とした。PCR 条件は、以下の通りとした。
6). Determination of the base sequence adjacent to the other end of the microsatellite region As shown in 4 of FIG. 1, the base sequence adjacent to the other end of the microsatellite region was determined by nested PCR.
(1) nested PCR
PCR was performed using primer AP1 (5'-CCATCGTAATACGACTCACTATAGGGC-3 ') and IP1 as primers and ddGTP-treated DNA ligated with unequal-length adapters (each DNA treated with 6 restriction enzymes) as a template. . As shown in FIG. 2, primer AP1 contains the same sequence as the 5 ′ end sequence of the long single-stranded portion of the unequal-length adapter. Next, PCR was performed again using DNA obtained by diluting the PCR product 100-fold as a template and AP2 and IP2 as primers.
The reaction solution was prepared using GeneAmp AmpliTaq Gold PCR Reagent kit (Applied Biosystems Co., Ltd.). That is, add 2 μl of 10 × buffer, 2 μl of 25 mM MgCl2, 2 μl of 10 mM dNTP, 0.5 μl of 0.5 μM primer, and 0.6 μl of AmpliTaq Gold DNA Polymerase (5 U / μl) to 0.5 μl of DNA solution. The total liquid volume was adjusted to 20 μl with sterile distilled water. PCR conditions were as follows.
ステップ1：94℃ 9分→Tann. 30秒→72℃ 1分 1サイクル
ステップ2：94℃ 30秒→Tann. 30秒→72℃ 1分 38サイクル
ステップ3：94℃ 30秒→Tann. 30秒→72℃ 5分 1サイクル
Step 1: 94 ° C 9 minutes → Tann. 30 seconds → 72 °
（２）シークエンス２(逆側)
nested PCR産物 4μlをアガロースゲル (1.5%) で電気泳動し、増幅産物を確認した。クリアで十分な長さのある産物が１つだけ得られたものについて、前述の方法でシークエンスを行った。シークエンスの結果より、SSRとAP2 の間にIP3 を設計し、それぞれプライマーセットの右側とした。
上記の手法により１２セットのプライマーセットを得た。
(2) Sequence 2 (reverse side)
4 μl of nested PCR product was electrophoresed on an agarose gel (1.5%) to confirm the amplified product. A single product that was clear and sufficiently long was obtained and sequenced as described above. From the sequence results, IP3 was designed between SSR and AP2, and each was placed on the right side of the primer set.
Twelve primer sets were obtained by the above method.
プライマーセットのスクリーニング
上記１２セットのプライマーセットのうち、６セットのプライマーセット(表１を参照)は、PCRでの増幅効率および／または増幅断片長の多型性の高さ等の点で、他の６セットのプライマーセットより優れていた。
Screening of primer sets Of the above 12 primer sets, 6 primer sets (see Table 1) are different in terms of amplification efficiency in PCR and / or high polymorphism of amplified fragment length, etc. This was superior to the six primer sets.
得られた上記６セットのプライマーセット（マーカー）を用いて、以下のような手順によりサクラのクローン識別を行った。
（１）全DNA の抽出
DNeasy plant mini kit（キアゲン社製）を用い、以下のようにして DNA を抽出した。
サクラの葉の５０個体のサンプルを乳鉢と乳棒を使用して液体窒素中で粉末状にすり潰し、すり潰した粉末を2mlマイクロチューブに移した。これに400μl のBuffer AP１と4μl の100mg/ml RNase A を加え、激しくボルテックスした後、インキュベート（65℃、10 分、途中で2〜3 回転倒混和）した。さらに、130μl のBuffer AP2 を加え、混和し、インキュベート（氷上、5 分）した後、遠心（14,500rpm (20,000×g)、5 分、室温）し、上清をQIAsherdder Mini スピンカラムに移した。これをさらに遠心(14,500rpm (20,000×g)、2 分、室温)し、上清をカラムに通し、通過したろ液画分を新しい2ml マイクロチューブに移した。これに1.5 倍容量のBuffer AP3/E を加え、ピペットで混和し、混和液650μl をDNeasy Mini スピンカラムに移し、遠心（8,000rpm (6,000×g)、1 分、室温）し、ろ液を捨て、DNeasy Mini スピンカラムを新しい2ml マイクロチューブに移し、500μl のBuffer AW を加えた。これをさらに遠心（8,000rpm (6,000×g)、1 分、室温）し、ろ液を捨て、DNeasy Mini スピンカラムに500μl のBuffer AW を加えた後、さらに遠心（14,500rpm (20,000×g)、2 分、室温）し、フィルタを乾燥させた。DNeasy Mini スピンカラムを新しい1.5ml のマイクロチューブに移し、100μl のBuffer AE を加え、インキュベート（室温、5 分）し、遠心（8,000rpm (6,000×g)、1 分、室温）した。得られたペレットを以後の操作に供した。
Using the obtained six primer sets (markers), cherry clones were identified by the following procedure.
(1) Extraction of total DNA
DNA was extracted as follows using DNeasy plant mini kit (Qiagen).
A sample of 50 cherry leaves was ground in liquid nitrogen using a mortar and pestle, and the ground powder was transferred to a 2 ml microtube. 400 μl of Buffer AP1 and 4 μl of 100 mg / ml RNase A were added to this, and vortexed vigorously, followed by incubation (65 ° C., 10 minutes, mixing 2 to 3 times in the middle). Furthermore, 130 μl of Buffer AP2 was added, mixed, incubated (on ice, 5 minutes), centrifuged (14,500 rpm (20,000 × g), 5 minutes, room temperature), and the supernatant was transferred to a QIAsherdder Mini spin column. This was further centrifuged (14,500 rpm (20,000 × g), 2 minutes, room temperature), the supernatant was passed through the column, and the filtrate fraction passed was transferred to a new 2 ml microtube. Add 1.5 volumes of Buffer AP3 / E to this, mix with a pipette, transfer 650 μl of the mixture to a DNeasy Mini spin column, centrifuge (8,000 rpm (6,000 × g), 1 minute, room temperature), and discard the filtrate. The DNeasy Mini spin column was transferred to a new 2 ml microtube and 500 μl Buffer AW was added. This is further centrifuged (8,000 rpm (6,000 × g), 1 minute, room temperature), the filtrate is discarded, 500 μl Buffer AW is added to the DNeasy Mini spin column, and then further centrifuged (14,500 rpm (20,000 × g), 2 minutes at room temperature) and let the filter dry. The DNeasy Mini spin column was transferred to a new 1.5 ml microtube, 100 μl Buffer AE was added, incubated (room temperature, 5 minutes), and centrifuged (8,000 rpm (6,000 × g), 1 minute, room temperature). The obtained pellets were subjected to subsequent operations.
（２）クローンの識別
上記抽出した DNA を用い、実施例２に記載の方法で PCR を行った。プライマーセットSK1-1、SK3-1、SK4-1、SK7-1、SK8-1およびSK9-2を用いたPCR 産物を実施例２と同様に、ABI PRISM 3130 Genetic Analyzer (アプライドバイオシステムズ(株)製) を用いて増幅断片長を求めた。その結果、５０サンプルのすべてについて、上記６セットのプライマーセットのうち任意の２セットによってクローン識別が可能であった（表２）。とくに、SK3-1、SK7-1およびSK9-2における増幅断片長の多型性が高く、これら３セットのプライマーセットのうち少なくとも１セットを用いると識別の効率が一層高かった。
また、表２に示される各サンプルについてのクローンおよび栽培品種と対応する各増幅断片長とのデータにより、当該５０種のクローンについてのデータベースが構築された。
(2) Identification of clones PCR was performed by the method described in Example 2 using the extracted DNA. PCR products using primer sets SK1-1, SK3-1, SK4-1, SK7-1, SK8-1 and SK9-2 were prepared in the same manner as in Example 2 using the ABI PRISM 3130 Genetic Analyzer (Applied Biosystems) Was used to obtain the amplified fragment length. As a result, clone identification was possible for all 50 samples using any two of the above 6 primer sets (Table 2). In particular, the amplified fragment length polymorphisms in SK3-1, SK7-1, and SK9-2 were high, and the discrimination efficiency was higher when at least one of these three primer sets was used.
Further, a database for the 50 clones was constructed based on the clones and cultivars for each sample shown in Table 2 and the data of the corresponding amplified fragment lengths.
同データベースを用いることによって、同一種についてのクローン識別による栽培品種および栽培ラインの同定も可能であった。例えば、サンプルＮｏ．１２、１３、１５、１９、２０、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、４１、４２、４３および４４の合計２６サンプルは、種はいずれもエドヒガンであったところ、これらのクローンならびに栽培品種および栽培ラインをいずれか２セットのプライマーセットによって識別することができた。なお、本明細書において、「栽培ライン」とは、同じ由来を有する増殖個体群を意味する。
上記のとおり、本発明によれば、サクラのクローン識別を高精度かつ高い効率で、行うことができる。
By using this database, it was possible to identify cultivars and cultivation lines by clone identification for the same species. For example, sample no. 12, 13, 15, 19, 20, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43 and Forty-six total 26 samples were all Edhigan species, and these clones and cultivars and lines could be identified by any two primer sets. In the present specification, “cultivation line” means a growing population having the same origin.
As described above, according to the present invention, cherry clone identification can be performed with high accuracy and high efficiency.
実施例３と同様にして、さらに１３０サンプルについてクローンの特定を行い、合計１８０サンプルについてのデータベースを構築した（図３）。同データベースを用いることによってさらに多くのサンプルのクローンの特定が可能となった。
なお、図３においてはクローン名および栽培品種名は記号で示したが、それぞれの記号に対応するクローン名および栽培品種名は明らかになっている。
In the same manner as in Example 3, clones were further identified for 130 samples, and a database for a total of 180 samples was constructed (FIG. 3). By using this database, it was possible to identify more clones of samples.
In FIG. 3, the clone name and the cultivar name are shown by symbols, but the clone name and the cultivar name corresponding to each symbol are clarified.
実施例４において構築したデータベースを用いて、クローンが不明なサンプルについてクローンの同定を行った。すなわち、同サンプルについて本発明の６セットのプライマーセットに対する増幅断片長を上記の方法と同様にして求め、上記データベースによって前記増幅断片長と一致する増幅断片長を有するクローンを探索した。その結果、同サンプルの増幅断片長は、いずれのプライマーセットについても図３のｅｓ（クローン：江戸、栽培品種：‘江戸’）の増幅断片長に一致した。したがって、当該サンプルのクローンは江戸であり、栽培品種も‘江戸’であると同定された。 Using the database constructed in Example 4, clones were identified for samples with unknown clones. That is, the amplified fragment lengths for the six primer sets of the present invention were determined for the same sample in the same manner as described above, and clones having an amplified fragment length that matched the amplified fragment length were searched using the database. As a result, the length of the amplified fragment of the sample coincided with the length of the amplified fragment of es (clone: Edo, cultivar: 'Edo') in FIG. 3 for any primer set. Therefore, the clone of the sample was identified as Edo and the cultivar was identified as 'Edo'.
本発明により提供される、マイクロサテライト領域を増幅するためのプライマーセットを複数使用してPCR 法によって、サクラ属に属する植物のゲノム DNA を増幅し、増幅されるマイクロサテライト DNA のサイズを調べることで、サクラのクローン識別および種の栽培品種の同定を精度高く、かつ高い効率で行うことができる。葉等の新鮮な組織に限定されず、伐採後、長時間経過した丸太や、合板等の加工品ですらクローン識別することができる。また、成長や材質などの形質パラメーターと遺伝的な特性とを比較検討することにより、集団における遺伝的特性と形質との関連についての知見を得ることが期待される。育種の効率化が期待される。 By using a plurality of primer sets provided by the present invention for amplifying microsatellite regions, the genomic DNA of plants belonging to the genus Sakura is amplified by PCR, and the size of the amplified microsatellite DNA is examined. In addition, identification of cherry clones and identification of cultivars of seeds can be performed with high accuracy and high efficiency. It is not limited to fresh tissues such as leaves, and even a log or a processed product such as plywood that has passed for a long time after cutting can be identified as a clone. In addition, it is expected to obtain knowledge about the relationship between genetic characteristics and traits in a population by comparing and examining trait parameters such as growth and material and genetic characteristics. It is expected to increase the efficiency of breeding.
Claims (4)
前記クローン名に対応する栽培品種名と、
前記クローン名により示されるクローンのそれぞれについての前記プライマーセットを用いて増幅されたDNA の塩基長
とを示すデータベースを用いて、サクラ属に属する植物のクローンおよび栽培品種を特定する方法：
配列番号１で示される塩基配列を有するプライマーと、配列番号２で示される塩基配列を有するプライマーとからなるプライマーセット；
同様に、配列番号３で示される塩基配列を有するプライマーと、配列番号４で示される塩基配列を有するプライマーとからなるプライマーセット；
同様に、配列番号５で示される塩基配列を有するプライマーと、配列番号６で示される塩基配列を有するプライマーとからなるプライマーセット；
同様に、配列番号７で示される塩基配列を有するプライマーと、配列番号８で示される塩基配列を有するプライマーとからなるプライマーセット；
同様に、配列番号９で示される塩基配列を有するプライマーと、配列番号１０で示される塩基配列を有するプライマーとからなるプライマーセット；および
同様に、配列番号１１で示される塩基配列を有するプライマーと、配列番号１２で示される塩基配列を有するプライマーとからなるプライマーセット。 The DNA extracted from the tissues of plants belonging to the genus Sakura using two or more primer sets selected from the following 6 types is amplified by PCR, and the plants belonging to the genus Sakura due to the difference in the base length of the amplified DNA The clone names of two or more cherry blossoms obtained by identifying the clones of
Cultivar name corresponding to the clone name ,
A method for identifying clones and cultivars of plants belonging to the genus Sakura using a database indicating the base length of DNA amplified using the primer set for each of the clones indicated by the clone name:
A primer set comprising a primer having the base sequence represented by SEQ ID NO: 1 and a primer having the base sequence represented by SEQ ID NO: 2;
Similarly, a primer set comprising a primer having the base sequence represented by SEQ ID NO: 3 and a primer having the base sequence represented by SEQ ID NO: 4;
Similarly, a primer set consisting of a primer having the base sequence shown by SEQ ID NO: 5 and a primer having the base sequence shown by SEQ ID NO: 6;
Similarly, a primer set comprising a primer having the base sequence represented by SEQ ID NO: 7 and a primer having the base sequence represented by SEQ ID NO: 8;
Similarly, a primer set comprising a primer having the base sequence represented by SEQ ID NO: 9 and a primer having the base sequence represented by SEQ ID NO: 10; and similarly, a primer having the base sequence represented by SEQ ID NO: 11, A primer set comprising a primer having the base sequence represented by SEQ ID NO: 12.
・配列番号３で示される塩基配列を有するプライマーと配列番号４で示される塩基配列を有するプライマーを含むプライマーセット、
・配列番号７で示される塩基配列を有するプライマーと配列番号８で示される塩基配列を有するプライマーを含むプライマーセットおよび
・配列番号１１で示される塩基配列を有するプライマーと配列番号１２で示される塩基配列を有するプライマーを含むプライマーセット。 The method of claim 1, wherein the selected primer set comprises at least one of the following primer sets:
A primer set comprising a primer having the base sequence shown by SEQ ID NO: 3 and a primer having the base sequence shown by SEQ ID NO: 4,
A primer set including a primer having the base sequence shown by SEQ ID NO: 7 and a primer having the base sequence shown by SEQ ID NO: 8, and a primer having the base sequence shown by SEQ ID NO: 11 and the base sequence shown by SEQ ID NO: 12 A primer set comprising a primer having
The method in any one of Claims 1-3 whose number of individuals of a 2 or more cherry tree is 50 or more.
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2010
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