JP5891491B2 - Reagent and method for measuring the amount of total protein S in a sample - Google Patents
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Description
本発明は、試料中の総プロテインＳタンパク質量を測定することができる測定試薬及び測定方法に関するものである。
本発明は、特に、臨床検査、分子生物学、及び医学などの生命科学分野等において有用なものである。
The present invention relates to a measuring reagent and a measuring method capable of measuring the total protein S protein amount in a sample.
The present invention is particularly useful in the field of life science such as clinical examination, molecular biology, and medicine.
プロテインＳは、生体内の血液凝固系の制御機構において中心的に機能する血漿タンパク質である。 Protein S is a plasma protein that functions centrally in the control mechanism of the blood coagulation system in the living body.
このプロテインＳは、主に血液中に存在するものであって、活性化プロテインＣの補欠因子（補助因子）であり、活性化プロテインＣの活性を上昇させることができ、血液中での活性化プロテインＣの働きに欠かせないものである。 This protein S is mainly present in blood and is a prosthetic factor (cofactor) of activated protein C, which can increase the activity of activated protein C, and is activated in blood. It is indispensable for the function of protein C.
なお、活性化プロテインＣは、ヒトにおける血液凝固を促進する活性化血液凝固第Ｖ因子（第Ｖａ因子；ＦＶａ）、及び活性化血液凝固第ＶＩＩＩ因子（第ＶＩＩＩａ因子；ＦＶＩＩＩａ）を分解することにより、血液凝固反応を抑制する役割を担った因子である。 In addition, activated protein C decomposes activated blood coagulation factor V (factor Va; FVA) and activated blood coagulation factor VIII (factor VIIIa; FVIIIa) that promote blood coagulation in humans. It is a factor that plays a role in suppressing the blood coagulation reaction.
プロテインＳは、Ｃ４ｂ結合タンパク質（補体第４因子ｂ結合タンパク質；Ｃ４ｂＢＰ）と１対１で特異的に結合し、複合体を形成する。つまり、Ｃ４ｂ結合タンパク質は、プロテインＳのリガンドとなる。 Protein S specifically binds one-to-one with a C4b binding protein (complement factor 4b binding protein; C4bBP) to form a complex. That is, the C4b binding protein is a protein S ligand.
このプロテインＳとＣ４ｂ結合タンパク質との複合体形成反応は、下に示した通りであるが、この反応は可逆反応である。 This complex formation reaction between protein S and C4b binding protein is as shown below, but this reaction is a reversible reaction.
そして、ヒト血液中においては、通常、プロテインＳに比べてＣ４ｂ結合タンパク質のモル濃度は小さく、また解離定数も小さいため、血液中には「プロテインＳ」及び「プロテインＳ−Ｃ４ｂ結合タンパク質複合体」のみ存在する。つまり、上記の反応の平衡は、完全に右に寄っていることになる。 In human blood, since the molar concentration of C4b binding protein is usually smaller than that of protein S and the dissociation constant is small, “protein S” and “protein S-C4b binding protein complex” are present in blood. Exists only. In other words, the equilibrium of the above reaction SL is entirely would have shifted to the right.
通常、健常者の血液中（血漿中）のプロテインＳは、その約６０％が「プロテインＳ−Ｃ４ｂ結合タンパク質複合体」（すなわち、結合型）であり、その約４０％は「遊離状態のプロテインＳ」（すなわち、遊離型）である。 Usually, about 60% of protein S in the blood (plasma) of healthy individuals is “protein S-C4b binding protein complex” (ie, bound type), and about 40% of “protein S in free state”. S "(ie free).
なお、遊離のプロテインＳ（すなわち、遊離型）のみが、活性化プロテインＣに対する補酵素活性を示し、活性化プロテインＣの活性を上昇させることができるのである。 Only free protein S (that is, free form) exhibits a coenzyme activity for activated protein C and can increase the activity of activated protein C.
なお、本明細書において、「プロテインＳ」又は「Ｃ４ｂ結合タンパク質」等の語は、特に複合体（若しくは結合型）又は遊離（若しくは遊離型）等の記載が無い場合は、それぞれこれらの物質の複合体（又は結合型）及び遊離状態（又は遊離型）のものの総称を意味するものとする。 In the present specification, the term “protein S” or “C4b binding protein” means that each of these substances, unless there is a description of complex (or binding type) or free (or free type). It shall mean the generic name of complex (or bound) and free (or free).
活性化プロテインＣは、ヒトにおける血液凝固を促進する活性化血液凝固第Ｖ因子、及び活性化血液凝固第ＶＩＩＩ因子を分解することにより、血液凝固反応を抑制する役割を担ったセリンプロテアーゼである。 Activated protein C is a serine protease that plays a role in suppressing blood coagulation by degrading activated blood coagulation factor V and activated blood coagulation factor VIII that promote blood coagulation in humans.
プロテインＳは、活性化プロテインＣの補欠因子（補助因子）であり、プロテインＳの存在により、活性化プロテインＣの活性は上昇し、活性化プロテインＣによる活性化血液凝固第Ｖ因子の分解反応及び活性化血液凝固第ＶＩＩＩ因子の分解反応は促進される。 Protein S is a prosthetic factor (cofactor) of activated protein C, and the presence of protein S increases the activity of activated protein C, and the activated blood coagulation factor V degradation reaction by activated protein C and The degradation reaction of activated blood coagulation factor VIII is promoted.
血液凝固反応を抑制する働きを持つプロテインＳの活性の低下又は異常は、生体内において血栓症を引き起こす原因となりうる。
実際、プロテインＳの先天性異常症者は、高い頻度で深部静脈血栓症、表在性静脈炎若しくは肺梗塞などの静脈性血栓症、又は心不全の原因となる冠状動脈血栓症などの動脈性血栓症等を発症することになる。
また、播種性血管内凝固症候群（ＤＩＣ）、ビタミンＫ欠乏症又は肝機能低下症等においても、プロテインＳの活性の低下又は異常が認められる。
A decrease or abnormality in the activity of protein S, which has a function of suppressing the blood coagulation reaction, can cause thrombosis in vivo.
In fact, people with congenital anomalies of protein S frequently have arterial thrombosis such as deep vein thrombosis, venous thrombosis such as superficial phlebitis or pulmonary infarction, or coronary thrombosis causing heart failure. Will develop symptoms.
In addition, a decrease or abnormality in protein S activity is also observed in disseminated intravascular coagulation syndrome (DIC), vitamin K deficiency, or hepatic hypofunction.
即ち、プロテインＳの活性の低下又は異常を伴う遺伝子変異の検出は、血栓症の病態解明に大いに役立つものと思われる。例えば、プロテインＳ徳島のような遺伝子変異は、血中に分泌されるプロテインＳタンパク質量は正常であるが、活性が低下するＩＩ型異常症であるため、プロテインＳ活性とプロテインＳタンパク質量を測定し、プロテインＳ比活性（比活性＝活性／タンパク質量）を求めることで、間接的にプロテインＳ遺伝子変異を検出することが可能であると考えられる。 That is, detection of a gene mutation accompanied by a decrease or abnormality in protein S activity is considered to be very useful for elucidating the pathogenesis of thrombosis. For example, genetic mutations such as Protein S Tokushima are type II abnormalities in which the amount of protein S protein secreted into the blood is normal but the activity decreases, so protein S activity and protein S protein amount are measured. Then, it is considered that the protein S gene mutation can be indirectly detected by determining the protein S specific activity (specific activity = activity / protein amount).
また、遊離プロテインＳは総プロテインＳに比べて血中濃度が低く、測定誤差の影響を受けやすいので、プロテインＳ遺伝子変異の検出には、総プロテインＳの測定が最適であると思われる。 Moreover, since free protein S has a lower blood concentration than total protein S and is susceptible to measurement errors, measurement of total protein S seems to be optimal for detection of protein S gene mutations.
現在、試料中の総プロテインＳタンパク質量の測定方法として、例えば、総プロテインＳに対する抗体を使用したＥＬＩＳＡ法（例えば、非特許文献１参照）等が提案されているが、用手法であり、操作が煩雑なものであった。 Currently, as a method for measuring the total protein S protein amount in a sample, for example, an ELISA method using an antibody against total protein S (for example, see Non-Patent Document 1) has been proposed. Was complicated.
従って、本発明の課題は、試料中に存在する全てのプロテインＳ〔プロテインＳとＣ４ｂ結合タンパク質との複合体（結合型）、及び遊離のプロテインＳ（遊離型）〕、すなわち、総プロテインＳのタンパク質量を簡便かつ正確に測定することが出来る、試料中の総プロテインＳタンパク質量の測定試薬及び測定方法を提供することである。 Therefore, the object of the present invention is to provide all the protein S present in the sample [complex of protein S and C4b binding protein (bound type) and free protein S (free type)], that is, total protein S To provide a measuring reagent and a measuring method for the total protein S protein amount in a sample, which can easily and accurately measure the protein amount.
本発明者らは、上記の課題の解決を目指して鋭意検討を行った結果、プロテインＳに対する抗体を固定化した担体粒子と試料とを接触させ、前記抗体と試料に含まれていたプロテインＳとの抗原抗体反応により生成した凝集物を測定することにより、試料中の総プロテインＳタンパク質量を測定する測定試薬及び測定方法において、抗原抗体反応の反応時にＣ４ｂ結合タンパク質を含有又は存在させることにより、試料中の総プロテインＳ蛋白質量を簡便かつ正確に測定できることを見出し、本発明を完成するに至った。 As a result of intensive studies aimed at solving the above problems, the present inventors brought carrier particles immobilized with antibodies against protein S into contact with the sample, and the antibodies and protein S contained in the sample were contacted with each other. In the measurement reagent and measurement method for measuring the amount of total protein S protein in the sample by measuring the aggregate produced by the antigen-antibody reaction, by containing or present the C4b binding protein during the antigen-antibody reaction, The present inventors have found that the total protein S protein amount in a sample can be measured easily and accurately, and have completed the present invention.
すなわち、本発明は、以下の発明を提供する。
（１） プロテインＳに対する抗体を固定化した担体粒子と試料とを接触させ、前記抗体と試料に含まれていたプロテインＳとの抗原抗体反応により生成した凝集物を測定することにより、試料中の総プロテインＳタンパク質量を測定する方法において、前記抗原抗体反応の反応時にＣ４ｂ結合タンパク質を存在させることを特徴とする測定方法。
（２） 担体粒子がラテックス粒子である、前記（１）記載の測定方法。
（３） 試料中の総プロテインＳタンパク質量の測定が、次の（ａ）及び（ｂ）の工程を含む方法により行われるものである、前記（１）又は（２）に記載の試料中の総プロテインＳタンパク質量の測定方法。
（ａ）試料と、Ｃ４ｂ結合タンパク質とを混合し、接触させ、この混合液中において前記試料に含まれる遊離のプロテインＳとＣ４ｂ結合タンパク質との複合体を形成させる工程。
（ｂ）前記混合液をプロテインＳに対する抗体を固定化した担体粒子と接触させ、前記抗体とプロテインＳとＣ４ｂ結合タンパク質との複合体との抗原抗体反応により生成した凝集物を測定する工程。
（４） プロテインＳに対する抗体を固定化した担体粒子を含む測定試薬において、Ｃ４ｂ結合タンパク質を含有することを特徴とする試料中の総プロテインＳタンパク質量の測定試薬。
（５） 担体粒子がラテックス粒子である、請求項４記載の測定試薬。
（６） 次の（ａ）及び（ｂ）の工程を含む試料中の総プロテインＳタンパク質量の測定のためのものである、前記（４）又は（５）に記載の試料中の総プロテインＳタンパク質量の測定試薬。
（ａ）試料と、Ｃ４ｂ結合タンパク質とを混合し、接触させ、この混合液中において前記試料に含まれる遊離のプロテインＳとＣ４ｂ結合タンパク質との複合体を形成させる工程。
（ｂ）前記混合液をプロテインＳに対する抗体を固定化した担体粒子と接触させ、前記抗体とプロテインＳとＣ４ｂ結合タンパク質との複合体との抗原抗体反応により生成した凝集物を測定する工程。
That is, the present invention provides the following inventions.
(1) A carrier particle on which an antibody against protein S is immobilized is brought into contact with a sample, and an aggregate produced by an antigen-antibody reaction between the antibody and protein S contained in the sample is measured. In the method for measuring the total protein S protein amount, a C4b binding protein is present during the antigen-antibody reaction.
(2) The measuring method according to (1) above, wherein the carrier particles are latex particles.
(3) In the sample according to (1) or (2), the total protein S protein amount in the sample is measured by a method including the following steps (a) and (b): Method for measuring total protein S protein amount.
(A) A step of mixing a sample and a C4b binding protein, bringing them into contact with each other, and forming a complex of free protein S and C4b binding protein contained in the sample in the mixed solution.
(B) A step of contacting the mixed solution with carrier particles on which an antibody against protein S is immobilized, and measuring an aggregate produced by an antigen-antibody reaction between the antibody, a complex of protein S and a C4b binding protein.
(4) A reagent for measuring the amount of total protein S protein in a sample, comprising a C4b binding protein in a measuring reagent comprising carrier particles on which an antibody against protein S is immobilized.
(5) The measuring reagent according to claim 4, wherein the carrier particles are latex particles.
(6) Total protein S in the sample according to (4) or (5), which is for measurement of the total protein S protein amount in the sample including the following steps (a) and (b): Reagent for measuring protein content.
(A) A step of mixing a sample and a C4b binding protein, bringing them into contact with each other, and forming a complex of free protein S and C4b binding protein contained in the sample in the mixed solution.
(B) A step of contacting the mixed solution with carrier particles on which an antibody against protein S is immobilized, and measuring an aggregate produced by an antigen-antibody reaction between the antibody, a complex of protein S and a C4b binding protein.
本発明の試料中の総プロテインＳタンパク質量の測定試薬及び測定方法は、試料中に存在する全てのプロテインＳ〔プロテインＳとＣ４ｂ結合タンパク質との複合体（結合型）、及び遊離のプロテインＳ（遊離型）〕についてそのタンパク質量を、すなわち、総プロテインＳのタンパク質量を簡便かつ正確に測定することが出来るものである。 The reagent and method for measuring the total protein S protein amount in the sample of the present invention include all the protein S [complex of protein S and C4b binding protein (bound type), and free protein S ( Free protein), that is, the protein amount of total protein S can be measured easily and accurately.
以下、本発明を詳細に説明する。
〔１〕プロテインＳに対する抗体
本発明において、プロテインＳに対する抗体とは、プロテインＳに結合することができる抗体（抗プロテインＳ抗体）のことをいう。
Hereinafter, the present invention will be described in detail.
[1] Antibody to protein S In the present invention, an antibody to protein S refers to an antibody that can bind to protein S (anti-protein S antibody).
この抗プロテインＳ抗体としては、例えば、（プロテインＳに結合することができる）モノクローナル抗体、ポリクローナル抗体、ポリクローナル抗体を含む抗血清、キメラ抗体、ヒト化抗体又は一本鎖抗体（ｓｃＦｖ）、及びこれらの抗体の断片〔Ｆａｂ、Ｆ（ａｂ’）2、Ｆａｂ’、Ｆｖ、ｓＦｖ、ｄｓＦｖなど〕等を挙げることができる。
また、前記の抗体又は抗体断片に、蛋白質又は低分子化合物を結合させた誘導体を使用することもできる。
Examples of the anti-protein S antibody include monoclonal antibodies (which can bind to protein S), polyclonal antibodies, antisera containing polyclonal antibodies, chimeric antibodies, humanized antibodies or single chain antibodies (scFv), and these And the like [Fab, F (ab ′) 2 , Fab ′, Fv, sFv, dsFv, etc.].
In addition, a derivative obtained by binding a protein or a low molecular weight compound to the antibody or antibody fragment can also be used.
なお、抗プロテインＳ抗体の由来については特に限定はなく、例えば、哺乳動物（マウス、ウサギ、ラット、ヒツジ、ヤギ、若しくはウマなど）、又は鳥類（ニワトリ、ウズラ、キジ、ダチョウ、若しくはアヒルなど）等を挙げることができる。 The origin of the anti-protein S antibody is not particularly limited, and for example, mammals (mouse, rabbit, rat, sheep, goat, horse, etc.) or birds (chicken, quail, pheasant, ostrich, duck etc.) Etc.
また、本発明においては、抗プロテインＳ抗体が、Ｃ４ｂ結合タンパク質と複合体を形成したプロテインＳに、より強い反応性を示す抗体であることがより好ましい。 In the present invention, it is more preferable that the anti-protein S antibody is an antibody having a stronger reactivity with protein S complexed with a C4b binding protein.
〔２〕担体粒子
本発明において、担体粒子は、前記の抗プロテインＳ抗体を固定化することができるものであれば、特に制限なく用いることができる。
[2] Carrier particles In the present invention, the carrier particles can be used without particular limitation as long as they can immobilize the anti-protein S antibody.
すなわち、プロテインＳと抗プロテインＳ抗体との抗原抗体反応を利用して試料中の総プロテインＳタンパク質量の測定を行う測定試薬及び測定方法に使用されている担体粒子、又は使用することが可能な担体粒子であればよい。 That is, it is possible to use a carrier particle used in a measurement reagent and a measurement method for measuring the total protein S protein amount in a sample using an antigen-antibody reaction between protein S and anti-protein S antibody, or a measurement method. Any carrier particles may be used.
この担体粒子の材質は、特に限定はなく、例えば、ポリスチレン、スチレン−スチレンスルホン酸塩共重合体、アクリロニトリル−ブタジエン−スチレン共重合体、塩化ビニル−アクリル酸エステル共重合体、酢酸ビニル−アクリル酸共重合体、ポリアクロレイン、スチレン−メタクリル酸共重合体、スチレン−グリシジル（メタ）アクリル酸共重合体、スチレン−ブタジエン共重合体、メタクリル酸重合体、アクリル酸重合体、ゼラチン、シリカ、アルミナ、カーボンブラック、金属化合物、金属、セラミックス又は磁性体等を挙げることができる。 The material of the carrier particles is not particularly limited. For example, polystyrene, styrene-styrene sulfonate copolymer, acrylonitrile-butadiene-styrene copolymer, vinyl chloride-acrylate copolymer, vinyl acetate-acrylic acid. Copolymer, polyacrolein, styrene-methacrylic acid copolymer, styrene-glycidyl (meth) acrylic acid copolymer, styrene-butadiene copolymer, methacrylic acid polymer, acrylic acid polymer, gelatin, silica, alumina, Examples thereof include carbon black, metal compounds, metals, ceramics, and magnetic materials.
そして、この担体粒子としては、例えば、ラテックス粒子、金属コロイド粒子、リポソーム、マイクロカプセル、又は赤血球等の粒子等を挙げることができる。
また、本発明における担体粒子としては、ラテックス粒子であることが好ましい。
Examples of the carrier particles include latex particles, metal colloid particles, liposomes, microcapsules, and red blood cells.
The carrier particles in the present invention are preferably latex particles.
本発明において、抗プロテインＳ抗体を担体粒子に固定化することは、物理的吸着法、化学的結合法又はこれらの併用等の公知の方法により行うことができる。
物理的吸着法による場合は、公知の方法に従い、抗プロテインＳ抗体と、担体粒子とを、緩衝液等の溶液中で混合し接触させたり、或いは緩衝液等に溶解した抗プロテインＳ抗体を、担体粒子に接触させること等により行うことができる。
In the present invention, the anti-protein S antibody can be immobilized on the carrier particles by a known method such as a physical adsorption method, a chemical binding method, or a combination thereof.
In the case of the physical adsorption method, the anti-protein S antibody and the carrier particles are mixed and brought into contact with each other in a solution such as a buffer solution according to a known method, or the anti-protein S antibody dissolved in the buffer solution or the like is used. It can be performed by contacting with carrier particles.
また、化学的結合法により行う場合は、日本臨床病理学会編「臨床病理臨時増刊特集第５３号 臨床検査のためのイムノアッセイ−技術と応用−」，臨床病理刊行会，１９８３年発行；日本生化学会編「新生化学実験講座１ タンパク質ＩＶ」，東京化学同人，１９９１年発行等に記載の公知の方法に従い、抗プロテインＳ抗体と、担体粒子とを、グルタルアルデヒド、カルボジイミド、イミドエステル又はマレイミド等の二価性の架橋試薬と混合、接触させ、抗プロテインＳ抗体と、担体粒子の、それぞれのアミノ基、カルボキシル基、チオール基、アルデヒド基又は水酸基等と前記の二価性の架橋試薬とを反応させること等により行うことができる。 When the chemical binding method is used, the Japanese Society of Clinical Pathology, “Special Issue on Extraordinary Clinical Pathology No. 53, Immunoassay for Clinical Examination—Technology and Applications”, Clinical Pathology Publications, 1983; Japan Biochemical Society In accordance with a known method described in ed. “Shinsei Kagaku Kenkyu Ken 1 Protein IV”, published by Tokyo Kagaku Dojin, published in 1991, etc., anti-protein S antibody and carrier particles are mixed with two types such as glutaraldehyde, carbodiimide, imide ester or maleimide. Mixed with and brought into contact with a valent cross-linking reagent to react the anti-protein S antibody with each of the amino group, carboxyl group, thiol group, aldehyde group, hydroxyl group, etc. of the carrier particles and the bivalent cross-linking reagent. Etc.
更に、抗プロテインＳ抗体を固定化した担体粒子の自然凝集や、非特異的反応等を抑制するために処理を行う必要があれば、抗プロテインＳ抗体を固定化した担体粒子の表面に、ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）、カゼイン、ゼラチン、卵白アルブミン若しくはその塩などのタンパク質、界面活性剤又は脱脂粉乳等を接触させ被覆させること等の公知の方法により処理して、担体粒子のブロッキング処理（マスキング処理）を行ってもよい。 Furthermore, if it is necessary to perform treatment in order to suppress spontaneous aggregation of the carrier particles immobilized with the anti-protein S antibody, non-specific reaction, etc., the surface of the carrier particles immobilized with the anti-protein S antibody is treated with bovine. Blocking treatment of carrier particles (masking treatment) by treatment with a known method such as serum albumin (BSA), protein such as casein, gelatin, ovalbumin or its salt, surfactant or nonfat dry milk ) May be performed.
なお、本発明における試料中の総プロテインＳタンパク質量の測定を、ラテックス免疫比濁法等の比濁法により測定を行う場合、ラテックス粒子等の担体粒子の大きさ（粒径）については、特に制限はない。
しかし、抗プロテインＳ抗体を固定化した担体粒子が、試料中に含まれていたプロテインＳとの凝集物（凝集塊）を生成する程度、及びこの生成した凝集物の測定の容易さ等の理由より、担体粒子の大きさ（粒径）は、その平均径（平均粒径）が、０．０１μｍ〜１０μｍであることが好ましく、０．０４μｍ〜１μｍであることがより好ましい。
また、本発明の試料中のプロテインＳタンパク質量の測定試薬及び測定方法において、担体粒子は、その大きさ（粒径）、材質、又は形状等が異なる２種類以上の担体を使用してもよい。
When measuring the total protein S protein amount in the sample of the present invention by a turbidimetric method such as latex immunoturbidimetric method, the size (particle size) of carrier particles such as latex particles is particularly There is no limit.
However, reasons such as the degree to which the carrier particles on which the anti-protein S antibody is immobilized generate an aggregate (aggregate) with protein S contained in the sample, and the ease of measurement of the generated aggregate More preferably, the carrier particle size (particle diameter) has an average diameter (average particle diameter) of preferably 0.01 μm to 10 μm, more preferably 0.04 μm to 1 μm.
Further, in the reagent and method for measuring the protein S protein amount in the sample of the present invention, the carrier particles may use two or more types of carriers having different sizes (particle diameters), materials, shapes, etc. .
なお、本発明における試料中の総プロテインＳタンパク質量の測定を、ラテックス免疫比濁法等の比濁法により測定を行う場合、抗プロテインＳ抗体を固定化した担体粒子の測定反応時における濃度は、前記の特異的結合物質の担体表面上での分布密度、担体粒子の大きさ（粒径）、試料と測定試薬の混合比率等の各種条件により最適な濃度は異なるので一概に言うことはできない。
しかし、通常は、試料と測定試薬が混合され、担体粒子に固定化された抗プロテインＳ抗体と、試料中に含まれていたプロテインＳとの、抗原抗体反応が行われる測定反応時に、抗プロテインＳ抗体を固定化した担体粒子の濃度が、この測定反応時の反応混合液中において０．００５〜１％（Ｗ／Ｖ）となるようにするのが一般的であり、この場合、反応混合液中においてこのような濃度になるような濃度の抗プロテインＳ抗体を固定化した担体粒子を測定試薬に含有させることが好ましい。
In the present invention, when measuring the total protein S protein amount in the sample by a turbidimetric method such as a latex immunoturbidimetric method, the concentration of the carrier particles immobilized with the anti-protein S antibody during the measurement reaction is The optimum concentration varies depending on various conditions such as the distribution density of the specific binding substance on the carrier surface, the size (particle size) of the carrier particles, and the mixing ratio of the sample and the measurement reagent, and cannot be generally stated. .
However, the anti-protein S antibody is usually mixed with the anti-protein S antibody immobilized on the carrier particles and the protein S contained in the sample during the measurement reaction in which the antigen-antibody reaction is performed. In general, the concentration of the carrier particles on which the S antibody is immobilized is 0.005 to 1% ( W / V ) in the reaction mixture at the time of this measurement reaction. It is preferable that the measurement reagent contains carrier particles on which the anti-protein S antibody having such a concentration in the solution is immobilized.
本発明の測定試薬及び測定方法においては、抗プロテインＳ抗体を固定化した担体粒子を、ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）、ヒト血清アルブミン（ＨＳＡ）、カゼイン若しくはその塩などのタンパク質；カルシウムイオンなどの各種金属イオン；カルシウム塩などの各種塩類；各種糖類；脱脂粉乳；正常ウサギ血清などの各種動物血清；アジ化ナトリウム若しくは抗生物質などの各種防腐剤；活性化物質；反応促進物質；ポリエチレングリコールなどの感度増加物質；非特異的反応抑制物質；又は、非イオン性界面活性剤、両性界面活性剤もしくは陰イオン性界面活性剤などの各種界面活性剤等の１種又は２種以上と共存させてもよい。 In the measurement reagent and measurement method of the present invention, carrier particles on which an anti-protein S antibody is immobilized are treated with proteins such as bovine serum albumin (BSA), human serum albumin (HSA), casein or a salt thereof; Metal ions; Various salts such as calcium salts; Various sugars; Nonfat dry milk; Various animal sera such as normal rabbit serum; Various preservatives such as sodium azide or antibiotics; Activating substances; Reaction accelerators; Sensitivity such as polyethylene glycol Increasing substance; non-specific reaction inhibiting substance; or one or more of various surfactants such as nonionic surfactant, amphoteric surfactant or anionic surfactant may coexist. .
そして、上記の各物質を共存させる際の濃度は特に限定されるものではないが、０．００１〜１０％（Ｗ／Ｖ）が好ましく、特に０．０１〜５％（Ｗ／Ｖ）が好ましい。 The concentration when the above substances coexist is not particularly limited, but is preferably 0.001 to 10% (W / V), and particularly preferably 0.01 to 5% (W / V). .
〔３〕Ｃ４ｂ結合タンパク質
本発明の測定試薬及び測定方法においては、Ｃ４ｂ結合タンパク質を含有又は存在させる。ここで、Ｃ４ｂ結合タンパク質とは、肝細胞やマクロファージで産生される高分子糖タンパク質であり、プロテインＳと１対１で特異的に結合し、複合体を形成するものをいう。
[3] C4b binding protein In the measuring reagent and measuring method of the present invention, a C4b binding protein is contained or present. Here, the C4b binding protein is a high-molecular glycoprotein produced by hepatocytes or macrophages and specifically binds protein S in a one-to-one relationship to form a complex.
また、本発明において用いるＣ４ｂ結合タンパク質は、その由来（起源）や調製方法によらず、特に制限なく用いることができる。
例えば、ヒト、ウシ又はブタ等の哺乳動物由来のもの等を挙げることができる。また、血漿等の体液若しくは臓器などから精製し調製したものや、又は遺伝子工学操作、細胞工学操作若しくは細胞培養操作などにより調製したもの等を挙げることができる。
Moreover, the C4b binding protein used in the present invention can be used without any particular limitation regardless of its origin (origin) or preparation method.
For example, the thing derived from mammals, such as a human, a cow, or a pig, etc. can be mentioned. Moreover, what was refine | purified and prepared from body fluids or organs, such as plasma, or what was prepared by genetic engineering operation, cell engineering operation, cell culture operation, etc. can be mentioned.
本発明において、前記のＣ４ｂ結合タンパク質を総プロテインＳタンパク質量の測定試薬に存在させる濃度は、試料と測定試薬を混合した後の測定反応液中において、Ｃ４ｂ結合タンパク質とプロテインＳとのモル比が０．９以上（Ｃ４ｂ結合タンパク質／プロテインＳ≧０．９）となるように設定することが好ましい。 In the present invention, the concentration at which the C4b binding protein is present in the measurement reagent for the total protein S protein amount is such that the molar ratio of the C4b binding protein to protein S in the measurement reaction solution after mixing the sample and the measurement reagent. It is preferable to set it to be 0.9 or more (C4b binding protein / protein S ≧ 0.9).
なお、前記のＣ４ｂ結合タンパク質を総プロテインＳタンパク質量の測定試薬に存在させる方法であるが、このＣ４ｂ結合タンパク質を、担体粒子に固定化された抗プロテインＳ抗体と、試料に含まれていたプロテインＳとの、抗原抗体反応が行われる測定反応時に、前記の総プロテインＳタンパク質量の測定試薬に存在させることができればいかなる方法でも良い。 In this method, the C4b binding protein is present in the reagent for measuring the total protein S protein amount. This C4b binding protein is mixed with the anti-protein S antibody immobilized on the carrier particles and the protein contained in the sample. Any method can be used as long as it can be present in the above-mentioned reagent for measuring the amount of protein S in the measurement reaction in which the antigen-antibody reaction with S is performed.
例えば、前記のＣ４ｂ結合タンパク質を緩衝液に含有させた試薬を調製し、抗プロテインＳ抗体を固定化した担体粒子を含む試薬と混合することによって、担体粒子に固定化された抗プロテインＳ抗体と試料に含まれていたプロテインＳとの、抗原抗体反応が行われる測定反応時に、Ｃ４ｂ結合タンパク質を存在させるようにすれば良い。 For example, an anti-protein S antibody immobilized on carrier particles is prepared by preparing a reagent containing the above-mentioned C4b binding protein in a buffer and mixing with a reagent containing carrier particles on which anti-protein S antibody is immobilized. The C4b binding protein may be present during a measurement reaction in which an antigen-antibody reaction is performed with protein S contained in the sample.
なお、通常、健常者の試料中には、「プロテインＳとＣ４ｂ結合タンパク質との複合体（結合型）」と、「遊離のプロテインＳ（遊離型）」の両方が存在しているが、本発明においては、Ｃ４ｂ結合タンパク質を、試料と混合、接触させることにより、試料に含まれていた遊離のプロテインＳがこのＣ４ｂ結合タンパク質と複合体を形成する。
すなわち、試料中のプロテインＳは、全て「プロテインＳとＣ４ｂ結合タンパク質との複合体（結合型）」となる。
これにより、本発明の測定試薬及び測定方法では、全てのプロテインＳ〔プロテインＳとＣ４ｂ結合タンパク質との複合体（結合型）、及び遊離のプロテインＳ（遊離型）〕についてそのタンパク質量を、すなわち、総プロテインＳのタンパク質量を測定することが可能となる。
Normally, both a “complex of protein S and C4b binding protein (binding type)” and “free protein S (free type)” exist in the sample of a healthy person. In the invention, the C4b binding protein is mixed and brought into contact with the sample, so that the free protein S contained in the sample forms a complex with the C4b binding protein.
That is, all of the protein S in the sample is a “complex of protein S and C4b binding protein (binding type)”.
Thus, in the measurement reagent and measurement method of the present invention, the protein amount of all protein S (complex of protein S and C4b binding protein (bound type) and free protein S (free type)) is determined, that is, It becomes possible to measure the protein amount of total protein S.
〔４〕試料
本発明において、試料とは、プロテインＳが存在する可能性があり、かつプロテインＳの存在の有無、又は含有量（濃度）の測定を行おうとするものをいう。
このような試料としては、例えば、ヒト又は動物の血液、血清、血漿、唾液、汗、尿、涙、髄液、羊水、腹水などの体液、又は肝臓、心臓、脳、骨、毛髪、皮膚、爪、筋肉、神経組織などの臓器、組織若しくは細胞などの抽出液等、プロテインＳが含まれる可能性のあるものを挙げることができる。
[4] Sample In the present invention, the sample refers to a sample in which protein S may be present and the presence or absence or content (concentration) of protein S is to be measured.
Such samples include, for example, human or animal blood, serum, plasma, saliva, sweat, urine, tears, cerebrospinal fluid, amniotic fluid, ascites fluid, or liver, heart, brain, bone, hair, skin, Examples include organs such as nails, muscles, and nerve tissues, extracts of tissues or cells, and the like that may contain protein S.
〔５〕測定試薬
本発明の測定試薬は、プロテインＳに対する抗体を固定化した担体粒子を含む総プロテインＳタンパク質量の測定試薬において、Ｃ４ｂ結合タンパク質を含有することを特徴とするものである。
[5] Measuring reagent The measuring reagent of the present invention is a measuring reagent for the total protein S protein amount including carrier particles on which an antibody against protein S is immobilized, and is characterized by containing a C4b binding protein.
これにより、試料中の総プロテインＳタンパク質量を正確に測定することができるものである。 Thereby, the total protein S protein amount in a sample can be measured correctly.
本発明の測定試薬は、一つの測定試薬よりなるものであってよい。この場合、Ｃ４ｂ結合タンパク質は、その一つの測定試薬に含有される。 The measurement reagent of the present invention may consist of one measurement reagent. In this case, the C4b binding protein is contained in the one measurement reagent.
また、本発明の測定試薬は、二つ以上の測定試薬より構成されるものであってもよい。この場合、Ｃ４ｂ結合タンパク質は、二つ以上の測定試薬の内の一つの測定試薬に含有されるものであってもよく、また、二つ以上の測定試薬に含有されるものであってもよい。 Moreover, the measurement reagent of the present invention may be composed of two or more measurement reagents. In this case, the C4b binding protein may be contained in one measurement reagent of two or more measurement reagents, or may be contained in two or more measurement reagents. .
例えば、本発明の測定試薬が、第１試薬及び第２試薬の二つの測定試薬より構成されるものである場合、Ｃ４ｂ結合タンパク質は、第１試薬にのみ含有させてもよく、また、第２試薬にのみ含有させてもよく、更には、第１試薬と第２試薬の両方に含有させてもよい。 For example, when the measurement reagent of the present invention is composed of two measurement reagents, the first reagent and the second reagent, the C4b binding protein may be contained only in the first reagent, It may be contained only in the reagent, and may be contained in both the first reagent and the second reagent.
本発明の測定試薬が二つの測定試薬より構成される場合、Ｃ４ｂ結合タンパク質は、第１試薬にのみ含有させることが好ましい。 When the measurement reagent of the present invention is composed of two measurement reagents, the C4b binding protein is preferably contained only in the first reagent.
また、本発明の測定試薬が二つ以上の測定試薬より構成されるものである場合、Ｃ４ｂ結合タンパク質を含有しない方の試薬は、例えば、プロテインＳに対する抗体を固定化した担体粒子を含む緩衝液等であってよい。 When the measurement reagent of the present invention is composed of two or more measurement reagents, the reagent not containing the C4b binding protein is, for example, a buffer solution containing carrier particles on which an antibody against protein S is immobilized. Etc.
なお、本発明の試料中の総プロテインＳタンパク質量の測定試薬の溶媒としては、各種の水系溶媒を用いることができる。 Various aqueous solvents can be used as a solvent for the reagent for measuring the total protein S protein content in the sample of the present invention.
この水系溶媒としては、例えば、精製水、生理食塩水、又は、トリス（ヒドロキシメチル）アミノメタン緩衝液、リン酸緩衝液、若しくはリン酸緩衝生理食塩水などの各種緩衝液等を挙げることができる。 Examples of the aqueous solvent include purified water, physiological saline, or various buffer solutions such as tris (hydroxymethyl) aminomethane buffer, phosphate buffer, or phosphate buffered saline. .
この緩衝液のｐＨについては、適宜適当なｐＨを選択して用いればよく、特に制限はないものの、通常は、ｐＨ５〜１０の範囲内のｐＨを選択して用いることが一般的である。
About the pH of this buffer solution, an appropriate pH may be selected and used as appropriate. Although there is no particular limitation, it is general to select and use a pH within the range of
また、本発明の試料中の総プロテインＳタンパク質量の測定試薬には、前記のプロテインＳに対する特異的結合物質を固定化した担体粒子、及び前記のＣ４ｂ結合タンパク質の他に、ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）、ヒト血清アルブミン（ＨＳＡ）、カゼイン若しくはその塩などの蛋白質；カルシウムイオンなどの各種塩類；各種糖類；脱脂粉乳；正常ウサギ血清などの各種動物血清；アジ化ナトリウム若しくは抗生物質などの各種防腐剤；活性化物質；反応促進物質；ポリエチレングリコールなどの感度増加物質；非特異的反応抑制物質；又は、非イオン性界面活性剤、両イオン性界面活性剤若しくは陰イオン性界面活性剤などの各種界面活性剤等の１種又は２種以上を適宜含有させてもよい。 The reagent for measuring the amount of total protein S in the sample of the present invention includes bovine serum albumin (BSA) in addition to the carrier particles on which a specific binding substance for protein S is immobilized and the C4b binding protein. ), Proteins such as human serum albumin (HSA), casein or salts thereof; various salts such as calcium ions; various sugars; skim milk powder; various animal sera such as normal rabbit serum; various preservatives such as sodium azide or antibiotics Activating substance; reaction promoting substance; sensitivity increasing substance such as polyethylene glycol; nonspecific reaction inhibiting substance; or various interfaces such as nonionic surfactant, amphoteric surfactant or anionic surfactant You may contain 1 type (s) or 2 or more types, such as an activator, suitably.
なお、前記の界面活性剤としては、例えば、ソルビタン脂肪酸エステル、グリセリン脂肪酸エステル、デカグリセリン脂肪酸エステル、ポリオキシエチレンソルビタン脂肪酸エステル、ポリオキシエチレングリセリン脂肪酸エステル、ポリエチレングリコール脂肪酸エステル、ポリオキシエチレンアルキルエーテル、ポリオキシエチレンフィトステロール、フィトスタノール、ポリオキシエチレンポリオキシプロピレンアルキルエーテル、ポリオキシエチレンアルキルフェニルエーテル、ポリオキシエチレンヒマシ油、硬化ヒマシ油若しくはポリオキシエチレンラノリンなどの非イオン性界面活性剤；酢酸ベタインなどの両性界面活性剤；又は、ポリオキシエチレンアルキルエーテル硫酸塩若しくはポリオキシエチレンアルキルエーテル酢酸塩などの陰イオン性界面活性剤等を挙げることができる。 Examples of the surfactant include sorbitan fatty acid ester, glycerin fatty acid ester, decaglycerin fatty acid ester, polyoxyethylene sorbitan fatty acid ester, polyoxyethylene glycerin fatty acid ester, polyethylene glycol fatty acid ester, polyoxyethylene alkyl ether, Nonionic surfactants such as polyoxyethylene phytosterol, phytostanol, polyoxyethylene polyoxypropylene alkyl ether, polyoxyethylene alkylphenyl ether, polyoxyethylene castor oil, hydrogenated castor oil or polyoxyethylene lanolin; betaine acetate, etc. Amphoteric surfactants; or polyoxyethylene alkyl ether sulfate or polyoxyethylene alkyl ether acetic acid Anionic surfactants, such as and the like.
なお、本発明の試料中の総プロテインＳタンパク質量の測定試薬は、そのもの単独にて、販売し、又は試料中の総プロテインＳタンパク質量の測定に使用することができる。
また、本発明の試料中の総プロテインＳタンパク質量の測定試薬は、他の試薬と組み合わせて、販売し、又は試料中の総プロテインＳタンパク質量の測定に使用することもできる。
In addition, the measuring reagent of the total protein S protein amount in the sample of the present invention can be sold alone or used for measuring the total protein S protein amount in the sample.
Further, the reagent for measuring the total protein S protein content in the sample of the present invention can be sold in combination with other reagents or used for measuring the total protein S protein content in the sample.
前記の他の試薬としては、例えば、緩衝液、試料希釈液、試薬希釈液、標識物質を含有する試薬、発色などのシグナルを生成する物質を含有する試薬、又は校正（キャリブレーション）を行うための物質を含有する物質の試薬等を挙げることができる。 Examples of the other reagent include a buffer solution, a sample diluent, a reagent diluent, a reagent containing a labeling substance, a reagent containing a substance that generates a signal such as color development, or calibration (calibration). The reagent of the substance containing these substances can be mentioned.
〔６〕測定方法
本発明における試料中の総プロテインＳタンパク質量の測定方法は、担体粒子に固定化された「プロテインＳに対する抗体」と試料中に含まれていた「プロテインＳ」との抗原抗体反応により生成した凝集物を測定することにより、試料中の総プロテインＳタンパク質量を測定する方法において、該抗原抗体反応の反応時にＣ４ｂ結合タンパク質を存在させるものである。
[6] Measuring method The measuring method of the total protein S protein amount in the sample in the present invention is an antigen antibody between “antibody against protein S” immobilized on carrier particles and “protein S” contained in the sample. In the method for measuring the amount of total protein S protein in a sample by measuring the aggregate produced by the reaction, the C4b binding protein is present during the antigen-antibody reaction.
本発明の試料中の総プロテインＳタンパク質量の測定方法における測定操作は、公知の測定操作に従って行うことができる。 The measurement operation in the method for measuring the total protein S protein amount in the sample of the present invention can be performed according to a known measurement operation.
この測定は、用手法により行ってもよいし、又は分析装置等の装置を用いて行ってもよい。 This measurement may be performed by a method or using an apparatus such as an analyzer.
また、この測定は、１ステップ法（１試薬法）により行ってもよいし、又は２ステップ法（２試薬法）等の複数の操作ステップにより行う方法によって実施してもよい。 In addition, this measurement may be performed by a one-step method (one-reagent method) or by a method performed by a plurality of operation steps such as a two-step method (two-reagent method).
以下、ラテックス免疫比濁法を測定原理とする試料中の総プロテインＳタンパク質量の測定試薬を用いて、試料中の総プロテインＳタンパク質量の測定を行う場合を例にとって、具体的に説明を行う。 Hereinafter, a specific description will be given, taking as an example the case of measuring the total protein S protein amount in a sample using a reagent for measuring the total protein S protein amount in the sample based on the latex immunoturbidimetric method. .
（１）まず、試料中の総プロテインＳタンパク質量の測定試薬として、以下のものを準備する。
第１試薬：Ｃ４ｂ結合タンパク質を含有する緩衝液
第２試薬：プロテインＳに対する抗体を固定化したラテックス粒子を含有する緩衝液
(1) First, the following is prepared as a reagent for measuring the total protein S protein amount in a sample.
First reagent: buffer containing C4b binding protein Second reagent: buffer containing latex particles on which an antibody against protein S is immobilized
（２）血漿等の試料の一定量と前記の第１試薬の一定量を混合し、一定温度下で一定時間静置する。
なお、試料と第１試薬の混合比率（量比）は、適宜選択すればよい。
また、前記の静置時の温度は、室温（１〜３０℃）又は微温（３０〜４０℃）の範囲内の一定温度であることが好ましい（例えば、３７℃等）。
(2) A certain amount of a sample such as plasma and a certain amount of the first reagent are mixed and allowed to stand at a certain temperature for a certain time.
In addition, what is necessary is just to select the mixing ratio (quantity ratio) of a sample and a 1st reagent suitably.
Moreover, it is preferable that the temperature at the time of the said stationary is a fixed temperature within the range of room temperature (1-30 degreeC) or very low temperature (30-40 degreeC) (for example, 37 degreeC etc.).
試料と第１試薬との混合により、試料に含まれていた遊離のプロテインＳがこのＣ４ｂ結合タンパク質と複合体を形成する。
すなわち、試料中のプロテインＳは、全て「プロテインＳとＣ４ｂ結合タンパク質との複合体（結合型）」となる。
By mixing the sample and the first reagent, free protein S contained in the sample forms a complex with the C4b binding protein.
That is, all of the protein S in the sample is a “complex of protein S and C4b binding protein (binding type)”.
（３）一定時間後、前記の試料と第１試薬との混合液に、前記の第２試薬の一定量を添加、混合し、反応混合液として、一定温度下で一定時間静置する。
なお、第２試薬の添加量は、適宜選択すればよい。
また、前記の静置時の温度は、室温（１〜３０℃）又は微温（３０〜４０℃）の範囲内の一定温度であることが好ましい（例えば、３７℃等）。
そして、前記の静置の時間は、１分以上、１０分以下の一定時間であることが好ましく、３分以上、５分以下の一定時間であることがより好ましい。
(3) After a certain time, a predetermined amount of the second reagent is added to and mixed with the mixed solution of the sample and the first reagent, and left as a reaction mixture at a constant temperature for a certain time.
In addition, what is necessary is just to select the addition amount of a 2nd reagent suitably.
Moreover, it is preferable that the temperature at the time of the said stationary is a fixed temperature within the range of room temperature (1-30 degreeC) or very low temperature (30-40 degreeC) (for example, 37 degreeC etc.).
The standing time is preferably a fixed time of 1 minute or more and 10 minutes or less, and more preferably a fixed time of 3 minutes or more and 5 minutes or less.
試料と第１試薬との混合液への第２試薬の添加、混合により、ラテックス粒子に固定化した抗プロテインＳ抗体と、試料中のプロテインＳ（プロテインＳとＣ４ｂ結合タンパク質との複合体（結合型））との抗原抗体反応（測定反応）を行わせる。 Addition and mixing of the second reagent to the mixed solution of the sample and the first reagent to mix the anti-protein S antibody immobilized on the latex particles with the protein S (protein S and C4b binding protein complex (binding) in the sample Type)) and antigen-antibody reaction (measurement reaction).
そして、この抗原抗体反応（測定反応）により、「…〔抗プロテインＳ抗体＝ラテックス粒子＝抗プロテインＳ抗体〕−〔プロテインＳ〕−〔抗プロテインＳ抗体＝ラテックス粒子＝抗プロテインＳ抗体〕…」の架橋が形成され、抗プロテインＳ抗体を固定化したラテックス粒子同士の凝集物が生成する。 Then, by this antigen-antibody reaction (measurement reaction), “... [anti-protein S antibody = latex particle = anti-protein S antibody] − [protein S] − [anti-protein S antibody = latex particle = anti-protein S antibody] ...” Are formed, and aggregates of latex particles to which the anti-protein S antibody is immobilized are formed.
（４）そして、分析装置又は分光光度計等において、反応混合液に光を照射して、生成したラテックス粒子同士の凝集物により生ずるシグナルである適当な波長の透過光強度の減少（吸光度の増加）又は散乱光強度の増加を測定することにより、生成した前記凝集物の量、すなわち、試料中の総プロテインＳタンパク質量を求める。 (4) Then, in an analyzer or spectrophotometer, the reaction mixture is irradiated with light, and the transmitted light intensity at an appropriate wavelength, which is a signal generated by the aggregates of the latex particles generated, is decreased (increase in absorbance). ) Or by measuring the increase in scattered light intensity, the amount of the aggregate produced, that is, the total protein S protein in the sample is determined.
（５）そして、「試料の測定を行って得た測定値（透過光強度の減少（吸光度の増加）又は散乱光強度の増加の値）」と、「標準液、標準血清等の標準物質（既知濃度のプロテインＳを含む試料）の測定を行って得た測定値（透過光強度の減少（吸光度の増加）又は散乱光強度の増加の値）」とを比較することにより、測定を行った試料中の総プロテインＳタンパク質量（濃度）の算出を行う。 (5) And "measurement value obtained by measuring the sample (decrease in transmitted light intensity (increase in absorbance) or increase in scattered light intensity)" and "standard substances such as standard solution and standard serum ( The measurement was performed by comparing the measurement value obtained by measuring a sample containing protein S with a known concentration (decrease in transmitted light intensity (increase in absorbance) or increase in scattered light intensity). The total protein S protein amount (concentration) in the sample is calculated.
以下、実施例により本発明をより具体的に詳述するが、本発明はこれらの実施例によって限定されるものではない。 EXAMPLES Hereinafter, although an Example demonstrates this invention more specifically in detail, this invention is not limited by these Examples.
〔実施例１〕
（本発明の試料中の総プロテインＳタンパク質量の測定試薬及び測定方法の効果の確認−１）
本発明の総プロテインＳタンパク質量の測定試薬における検量線を作成した。
[Example 1]
(Confirmation of effect of measuring reagent and measuring method of total protein S protein amount in sample of the present invention-1)
A calibration curve was prepared for the reagent for measuring the total protein S protein amount of the present invention.
１．測定試薬
（１）第１試薬の調製
Ｃ４ｂ結合タンパク質を、Ｂ．Ｄａｈｌｂｅａｃｋらの方法〔Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｊ．，２０９巻，８４７〜８５６頁，１９８３年〕に基づいて、ヒト血漿より調製した。
次に、０．１％（Ｗ／Ｖ）ＢＳＡ、０．３ｍｏｌ／Ｌ塩化ナトリウム及び０．０５％アジ化ナトリウムを含有する５０ｍＭ ＭＥＳ−塩酸緩衝液〔ｐＨ６．２（２０℃）〕を調製した。ここに、前記の通り調製したＣ４ｂ結合タンパク質を０μｇ／ｍＬ、２μｇ／ｍＬ、４μｇ／ｍＬ、６μｇ／ｍＬ及び８μｇ／ｍＬの濃度となるように添加し、Ｃ４ｂ結合タンパク質濃度の異なる５種類の試薬を第１試薬とした。
1. Measurement reagent (1) Preparation of first reagent C4b binding protein The method of Dahlbeack et al. [Biochem. J. et al. 209, 847-856, 1983].
Next, a 50 mM MES-hydrochloric acid buffer solution (pH 6.2 (20 ° C.)) containing 0.1% ( W / V ) BSA, 0.3 mol / L sodium chloride and 0.05% sodium azide was prepared. . To this, 5 kinds of reagents with different concentrations of C4b-binding protein were added by adding C4b-binding protein prepared as described above to a concentration of 0 μg / mL, 2 μg / mL, 4 μg / mL, 6 μg / mL and 8 μg / mL. Was used as the first reagent.
（２）第２試薬の調製
（ａ）抗プロテインＳ抗体の調製
本発明者らが、精製した遊離状態のプロテインＳを免疫抗原として、常法に従って抗プロテインＳ抗体の調製を行った。
プロテインＳのＣ４ｂ結合タンパク質との結合部位以外の部位に特異的に結合するモノクローナル抗体を産生するハイブリドーマのスクリーニングを行い、マウス／マウスのハイブリドーマ（９Ｈ６株）を得た。
(2) Preparation of Second Reagent (a) Preparation of Anti-Protein S Antibody The present inventors prepared anti-protein S antibody according to a conventional method using purified free protein S as an immunizing antigen.
A hybridoma producing a monoclonal antibody that specifically binds to a site other than the binding site of protein S to the C4b binding protein was screened to obtain a mouse / mouse hybridoma (strain 9H6).
このハイブリドーマ（９Ｈ６株）より産生されたマウス抗プロテインＳ・モノクローナル抗体の５ｍｇを、０．５ｍＬのリン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ７．５）に溶解した。
これに、０．６ｍｇのＳ−アセチルメルカプトコハク酸無水物を溶解した０．０１ｍＬのＮ，Ｎ−ジメチルホルムアミドを加え、室温で３０分間インキュベートした。
5 mg of mouse anti-protein S monoclonal antibody produced from this hybridoma (9H6 strain) was dissolved in 0.5 mL of sodium phosphate buffer (pH 7.5).
To this, 0.01 mL of N, N-dimethylformamide in which 0.6 mg of S-acetylmercaptosuccinic anhydride was dissolved was added and incubated at room temperature for 30 minutes.
次に、これに、０．１Ｍ ＥＤＴＡ水溶液の０．０２ｍＬ、１Ｍトリス（ヒドロキシメチル）アミノメタン緩衝液（ｐＨ７．０）の０．１ｍＬ、及び１Ｍヒドロキシルアミン塩酸緩衝液（ｐＨ７．０）の０．１ｍＬをそれぞれ加え、３０℃で３０分間インキュベートした。
その後、これを、５ｍＭ ＥＤＴＡを含む０．１Ｍリン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ６．０）で平衡化しておいた、セファデックスＧ−２５カラムでゲルろ過を行い、メルカプト・サクシニル化したマウス抗プロテインＳモノクローナル抗体を得た。
Next, 0.02 mL of 0.1 M EDTA aqueous solution, 0.1 mL of 1 M tris (hydroxymethyl) aminomethane buffer (pH 7.0), and 0 of 1 M hydroxylamine hydrochloride buffer (pH 7.0) were added thereto. Each 1 mL was added and incubated at 30 ° C. for 30 minutes.
Thereafter, this was subjected to gel filtration with a Sephadex G-25 column, which had been equilibrated with 0.1 M sodium phosphate buffer (pH 6.0) containing 5 mM EDTA, and mercapto-succinylated mouse anti-protein S. A monoclonal antibody was obtained.
（ｂ）抗プロテインＳ抗体固定化ラテックス粒子懸濁液の調製
平均粒径０．１９２μｍのラテックス粒子の１０％懸濁液１．０ｍＬと５０ｍＭ ＭＥＳ−塩酸緩衝液〔ｐＨ６．０（２０℃）〕１．０ｍＬとを混和し、更に３２０ｍＭカルボジイミド（同仁化学研究所；製品番号：３４８−０３６３１）水溶液３２μＬを添加して混和し、氷上で１０分間放置した。
前記の氷上で１０分間放置したラテックス粒子懸濁液１．２ｍＬに、前記（ａ）で調製したメルカプト・サクシニル化したマウス抗プロテインＳモノクローナル抗体を０．０８３ｇ／ｄＬの濃度で５０ｍＭ
ＭＥＳ−塩酸緩衝液〔ｐＨ６．０（２０℃）〕に混和した液１．８ｍＬを加え、４℃で一晩攪拌した。
次に、遠心分離により上清を除去した後、沈殿部を０．８％ＢＳＡを含む５０ｍＭ Ｔｒｉｓ−塩酸緩衝液〔ｐＨ８．０（２０℃）〕にて懸濁し、３７℃で３時間放置し、ブロッキング処理を行った。
次に、遠心分離により沈殿部を回収した後、これを０．１％ＢＳＡを含む０．０５％アジ化ナトリウム水溶液で再分散し、波長７００ｎｍにおける吸光度が１５．０ＯＤとなるように懸濁した。
これを抗プロテインＳ抗体固定化ラテックス粒子懸濁液とした。
(B) Preparation of anti-protein S antibody-immobilized latex particle suspension 1.0 mL of 10% suspension of latex particles having an average particle size of 0.192 μm and 50 mM MES-HCl buffer (pH 6.0 (20 ° C.)) 1.0 mL was mixed, 32 μL of a 320 mM carbodiimide (Dojindo Laboratories; product number: 348-03631) aqueous solution was added and mixed, and the mixture was allowed to stand on ice for 10 minutes.
The mercapto-succinylated mouse anti-protein S monoclonal antibody prepared in (a) above was added to 1.2 mL of the latex particle suspension that was allowed to stand on ice for 10 minutes at a concentration of 0.083 g / dL and 50 mM.
1.8 mL of a solution mixed with MES-hydrochloric acid buffer (pH 6.0 (20 ° C.)) was added, and the mixture was stirred at 4 ° C. overnight.
Next, after removing the supernatant by centrifugation, the precipitate was suspended in 50 mM Tris-HCl buffer (pH 8.0 (20 ° C.)) containing 0.8% BSA and left at 37 ° C. for 3 hours. The blocking process was performed.
Next, after collecting the precipitate by centrifugation, it was redispersed with a 0.05% sodium azide aqueous solution containing 0.1% BSA and suspended so that the absorbance at a wavelength of 700 nm was 15.0 OD. .
This was designated as an anti-protein S antibody-immobilized latex particle suspension.
（ｃ）第２試薬の調製
前記（ｂ）で調製した抗プロテインＳ抗体固定化ラテックス粒子懸濁液を、０．１％ＢＳＡを含む０．０５％アジ化ナトリウム水溶液で１０倍希釈し、０．１％の「抗プロテインＳ抗体固定化ラテックス粒子」を含有する懸濁液を調製した。
これを第２試薬とした。
(C) Preparation of Second Reagent The anti-protein S antibody-immobilized latex particle suspension prepared in (b) was diluted 10-fold with 0.05% sodium azide aqueous solution containing 0.1% BSA, and 0 A suspension containing 1% “anti-protein S antibody immobilized latex particles” was prepared.
This was used as the second reagent.
２．試料
（１）試料希釈液の調製
抗プロテインＳ抗体結合アフィニティカラムを用いて調製したプロテインＳ欠損血漿（３．２％クエン酸血漿）を試料希釈液とした。
なお、プロテインＳ欠損血漿は、実施例１の（２）で作製したマウス抗プロテインＳモノクローナル抗体を結合させたアフィニティカラム（９Ｈ６-Sepharose）を作製し、このカラムに健常人血漿を通し、カラムを素通りした血漿を回収することにより作製した。
また、前記アフィニティカラム（９Ｈ６-Sepharose）は、CNBr activated Sepharose（アマシャムファルマシアバイオテク社製）に、マウス抗プロテインＳ・モノクローナル抗体を、インストラクションマニュアルに従って結合させて作製した。
2. Sample (1) Preparation of Sample Diluent Protein S deficient plasma (3.2% citrate plasma) prepared using an anti-protein S antibody-binding affinity column was used as a sample diluent.
For protein S-deficient plasma, an affinity column (9H6-Sepharose) to which the mouse anti-protein S monoclonal antibody prepared in (2) of Example 1 was bound was prepared, and normal human plasma was passed through this column. It was prepared by collecting the passed plasma.
The affinity column (9H6-Sepharose) was prepared by binding mouse anti-protein S / monoclonal antibody to CNBr activated Sepharose (manufactured by Amersham Pharmacia Biotech) according to the instruction manual.
（２）試料の調製
（ａ）試料１
前記（１）で調製した試料希釈液を、プロテインＳタンパク質濃度０．０μｇ／ｍＬの試料１とした。
（ｂ）試料２
総プロテインＳタンパク質濃度が２４．２μｇ／ｍＬの３．２％クエン酸血漿を前記（１）の試料希釈液で希釈することにより、プロテインＳタンパク質濃度１２．４μｇ／ｍＬの試料２を調製した。なお、この試料２において、試料中の遊離プロテインＳ濃度は、５μｇ／ｍＬであった。
（ｃ）試料３
総プロテインＳタンパク質濃度が２４．２μｇ／ｍＬの３．２％クエン酸血漿を、プロテインＳタンパク質濃度２４．２μｇ／ｍＬの試料３とした。なお、この試料３において、試料中の遊離プロテインＳ濃度は、９．６μｇ／ｍＬであった。
（ｄ）試料４
総プロテインＳタンパク質濃度が２４．２μｇ／ｍＬの３．２％クエン酸血漿に、プロテインＳ精製品（Enzyme Research Laboratories社製）を添加することにより、プロテインＳタンパク質濃度が３１．６μｇ／ｍＬの試料４を調製した。なお、この試料４において、試料中の遊離プロテインＳ濃度は、１７．６μｇ／ｍＬであった。
（ｅ）試料５
総プロテインＳタンパク質濃度が２４．２μｇ／ｍＬの３．２％クエン酸血漿に、プロテインＳ精製品（Enzyme Research Laboratories社製）を添加することにより、プロテインＳタンパク質濃度が３８．７μｇ／ｍＬの試料５を調製した。なお、この試料５において、試料中の遊離プロテインＳ濃度は、２５．７μｇ／ｍＬであった。
(2) Sample preparation (a) Sample 1
The sample diluent prepared in (1) above was designated as Sample 1 having a protein S protein concentration of 0.0 μg / mL.
(B)
(C) Sample 3
3.2% citrated plasma with a total protein S protein concentration of 24.2 μg / mL was designated as sample 3 with a protein S protein concentration of 24.2 μg / mL. In Sample 3, the free protein S concentration in the sample was 9.6 μg / mL.
(D) Sample 4
By adding Protein S purified product (Enzyme Research Laboratories) to 3.2% citrated plasma with a total protein S protein concentration of 24.2 μg / mL, a sample with a protein S protein concentration of 31.6 μg / mL 4 was prepared. In Sample 4, the free protein S concentration in the sample was 17.6 μg / mL.
(E)
By adding Protein S purified product (Enzyme Research Laboratories) to 3.2% citrated plasma with a total protein S protein concentration of 24.2 μg / mL, a sample with a protein S protein concentration of 38.7 μg /
なお、ここで調製した試料２〜５は、「プロテインＳとＣ４ｂ結合タンパク質との複合体（結合型）」と、「遊離のプロテインＳ（遊離型）」の両方が存在している試料である。
３．試料中の総プロテインＳタンパク質濃度の測定
（１）測定手順
（ａ）測定は、東芝−１２０ＦＲ自動分析装置（東芝メディカルシステムズ社製）を使用して行った。
まず、測定用セル（キュベット）に、前記２の（２）の試料１〜５の３μＬを添加した。
次に、これらの測定用セル（キュベット）に、前記１の（１）の第１試薬の１００μＬを添加し、混合した。
そして、これらの測定用セル（キュベット）を、３７℃で静置した。
3. Measurement of total protein S protein concentration in the sample (1) Measurement Procedure (a) measurements were performed using a Toshiba -120F R automated analyzer (manufactured by Toshiba Medical Systems).
First, 3 μL of the samples 1 to 5 of 2 above (2) was added to the measurement cell (cuvette).
Next, 100 μL of the first reagent (1) was added to these measurement cells (cuvettes) and mixed.
These measurement cells (cuvettes) were allowed to stand at 37 ° C.
これにより、前記の試料に含まれていた遊離のプロテインＳと、前記の第１試薬中のＣ４ｂ結合タンパク質との複合体を形成させた。すなわち、試料に含まれていたプロテインＳは、全て「プロテインＳとＣ４ｂ結合タンパク質との複合体（結合型）」となった。 Thereby, the complex of the free protein S contained in the sample and the C4b binding protein in the first reagent was formed. That is, all the protein S contained in the sample became a “complex of protein S and C4b binding protein (binding type)”.
（ｂ）前記の第１試薬の添加後４分４０秒目（１６ポイント目）に、これらの測定用セル（キュベット）内の混合液に、更に、前記１の（２）の（ｃ）の第２試薬の１００μＬを添加し、混合した。 (B) At 4 minutes and 40 seconds (16th point) after the addition of the first reagent, the liquid mixture in these measurement cells (cuvette) is further added to ( c ) of (1) (2) above. 100 μL of the second reagent was added and mixed.
（ｃ）前記の第１試薬の添加後５分３５秒目（１９ポイント目）に、これらの測定用セル（キュベット）内の混合液の吸光度（波長７００ｎｍ）を試料盲検として測定した。
そして、これらの測定用セル（キュベット）を、３７℃で静置して、反応を行わせた。
これにより、前記のラテックス粒子に固定化された抗プロテインＳ抗体と、前記の試料に含まれていたプロテインＳとの抗原抗体反応を行わせ、ラテックス粒子の凝集塊を生成させた。
(C) At 5 minutes and 35 seconds (19th point) after the addition of the first reagent, the absorbance (wavelength 700 nm) of the mixed solution in these measurement cells (cuvettes) was measured as a sample blind test.
These measurement cells (cuvettes) were allowed to stand at 37 ° C. for reaction.
As a result, an antigen-antibody reaction between the anti-protein S antibody immobilized on the latex particles and the protein S contained in the sample was performed to generate latex particle aggregates.
（ｄ）前記の第１試薬の添加後９分４７秒目（３３ポイント目）に、この測定用セル（キュベット）内の反応混合液の吸光度（波長７００ｎｍ）を、前記試料の測定値として測定した。 (D) At 9 minutes and 47 seconds (33 points) after the addition of the first reagent, the absorbance (wavelength 700 nm) of the reaction mixture in the measurement cell (cuvette) is measured as the measurement value of the sample. did.
（ｅ）前記（ｄ）において測定した吸光度（測定値）から前記（ｃ）において測定した吸光度（試料盲検）を差し引き、吸光度差を得た。
なお、この吸光度差は試料に含まれる総プロテインＳタンパク質量（濃度）に比例したものである。
これらの試料の吸光度差より検量線を作成し、実検体（３．２％クエン酸血漿）を同様の方法で測定した際の吸光度差を検量線に当てはめて、試料中の総プロテインＳタンパク質濃度を求めた。
(E) The absorbance (sample blind) measured in (c) was subtracted from the absorbance (measured value) measured in (d) to obtain an absorbance difference.
This difference in absorbance is proportional to the total protein S protein amount (concentration) contained in the sample.
A calibration curve was created from the absorbance difference of these samples, and the absorbance difference when the actual sample (3.2% citrate plasma) was measured by the same method was applied to the calibration curve to obtain the total protein S protein concentration in the sample. Asked.
（２）測定結果
前記（１）において、試料中のプロテインＳの測定を行って得られた、前記各試料の測定値、即ち検量線を図１に示した。
なお、この図１において、横軸は試料中に含まれる総プロテインＳタンパク質の濃度、縦軸は７００ｎｍにおける吸光度の測定値を表す。
(2) Measurement Results FIG. 1 shows the measured values, that is, calibration curves, of the samples obtained by measuring protein S in the sample in (1).
In FIG. 1, the horizontal axis represents the concentration of total protein S protein contained in the sample, and the vertical axis represents the measured absorbance at 700 nm.
４．考察
図１から明らかなように、第１試薬中のＣ４ｂ結合タンパク質濃度に比例して試料中の総プロテインＳタンパク質量に比例した吸光度の上昇が見られる。また、各試料を測定した際の吸光度の上昇は、第１試薬中のＣ４ｂ結合タンパク質の濃度が６μｇ／ｍＬ以上で、ほぼ飽和状態になることが確認できる。
なお、試料２及び試料３では、第１試薬中のＣ４ｂ結合タンパク質の濃度が０μｇ／ｍＬでも、試料中のプロテインＳタンパク質量に比例した吸光度の上昇が確認できるが、これは、元々試料に含まれていたＣ４ｂ結合タンパク質とプロテインＳとの複合体に起因するものであり、試料中の総プロテインＳタンパク質量を正確に反映した吸光度の上昇ではない。
4). Discussion As is apparent from FIG. 1, an increase in absorbance proportional to the amount of total protein S protein in the sample is seen in proportion to the concentration of the C4b binding protein in the first reagent. Further, it can be confirmed that the increase in absorbance when each sample is measured is almost saturated when the concentration of the C4b binding protein in the first reagent is 6 μg / mL or more.
In
これらのことより、本発明のＣ４ｂ結合タンパク質を含有又は存在させた試料中の総プロテインＳタンパク質量の測定試薬及び測定方法であれば、試料中に含まれる総プロテインＳタンパク質量を正確に測定できることが確かめられた。
すなわち、本発明は、試料中に含まれる全てのプロテインＳ〔プロテインＳとＣ４ｂ結合タンパク質との複合体（結合型）、及び遊離のプロテインＳ（遊離型）〕についてそのタンパク質量を、すなわち、総プロテインＳのタンパク質量を正確に測定することができる測定試薬及び測定方法であることが確かめられた。
From these things, if it is a measuring reagent and measuring method of the total protein S protein amount in the sample which contained or made the C4b binding protein of this invention exist, it can measure the total protein S protein amount contained in a sample correctly. Was confirmed.
That is, the present invention relates to the total amount of protein S (complex of protein S and C4b binding protein (binding type) and free protein S (free type)) contained in the sample, It was confirmed that the measurement reagent and the measurement method were able to accurately measure the protein amount of protein S.
〔実施例２〕
（本発明の試料中の総プロテインＳタンパク質量の測定試薬とＥＬＳＡ法との相関）
本発明の試料中の総プロテインＳタンパク質量の測定試薬及び測定方法と、ＥＬＳＡ法による試料中の総プロテインＳタンパク質量の測定試薬及び測定方法との相関を確かめた。
[Example 2]
(Correlation between the reagent for measuring the total protein S amount in the sample of the present invention and the ELSA method)
The correlation between the measuring reagent and measuring method for the total protein S protein in the sample of the present invention and the measuring reagent and measuring method for the total protein S protein in the sample by the ELSA method was confirmed.
Ｉ．本発明の試料中の総プロテインＳタンパク質量の測定試薬及び測定方法による測定
（１）第１試薬の調製
第１試薬として、前記の実施例１の１の（１）の第１試薬を用いた。
I. Measurement of total protein S protein in the sample of the present invention by measurement reagent and measurement method (1) Preparation of first reagent The first reagent of (1) in Example 1 was used as the first reagent. .
（２）第２試薬の調製
第２試薬として、前記の実施例１の１の（２）の第２試薬を用いた。
(2) Preparation of Second Reagent As the second reagent, the second reagent (1) in Example 1 (2) was used.
２．試料
健常人９名の血漿を、試料として用いた。
2. Sample Plasma of 9 healthy people was used as a sample.
３．試料中の総プロテインＳタンパク質量の測定
前記２の試料のそれぞれについて、前記の実施例１の３の記載の通りに総プロテインＳタンパク質量の測定を行い、各試料の総プロテインＳタンパク質量を得た。
3. Measurement of total protein S protein amount in the sample For each of the two samples, the total protein S protein amount is measured as described in 3 of Example 1 to obtain the total protein S protein amount of each sample. It was.
この試料中の総プロテインＳタンパク質量の測定を行って得られた結果を図２〜５に示した。 The results obtained by measuring the total protein S protein amount in this sample are shown in FIGS.
ここで、第１試薬中のＣ４ｂ結合タンパク質濃度が２μｇ／ｍＬのものが図２、４ｇ／ｍＬのものが図３、６μｇ／ｍＬのものが図４、そして、８μｇ／ｍＬのものが図５である。なお、第１試薬中のＣ４ｂ結合タンパク質濃度が０μｇ／ｍＬでは、検量線が作成できなかったため、測定を行っていない。 Here, the C4b binding protein concentration in the first reagent is 2 μg / mL in FIG. 2, 4 g / mL is in FIG. 3, 6 μg / mL is in FIG. 4, and 8 μg / mL is in FIG. 5. It is. Note that, when the C4b binding protein concentration in the first reagent was 0 μg / mL, a calibration curve could not be created, and thus measurement was not performed.
ＩＩ．ＥＬＳＡ法による試料中の総プロテインＳのタンパク質量の測定方法及び測定試薬による測定
１．ＥＬＳＡ法による総プロテインＳタンパク質量の測定試薬
（１）Ｃ４ｂ結合タンパク質固定化マイクロプレート試薬の調製
（ａ） Ｃ４ｂ結合タンパク質を、Ｂ．Ｄａｈｌｂｅａｃｋらの方法〔Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｊ．，２０９巻，８４７〜８５６頁，１９８３年〕に基づいて、ヒト血漿より調製した。
II. 1. Method for measuring the protein amount of total protein S in a sample by ELSA method and measurement using a measurement reagent Reagent for measurement of total protein S protein amount by ELSA method (1) Preparation of C4b binding protein-immobilized microplate reagent (a) C4b binding protein The method of Dahlbeack et al. [Biochem. J. et al. 209, 847-856, 1983].
（ｂ）この調製したＣ４ｂ結合タンパク質を、炭酸緩衝液（５０ｍＭ炭酸水素ナトリウム（ｐＨ９．６））に２．５μｇ／ｍＬとなるように溶解した。
これを、９６ウェル−マイクロプレート（「MODULE
PLATE F8」（商品名）；ヌンク社製）の各ウェルに１ウェル当たり１００μＬずつ加え、４℃で一晩静置して、Ｃ４ｂ結合タンパク質のマイクロプレートのウェルへの固定化を行った。
(B) The prepared C4b binding protein was dissolved in a carbonate buffer (50 mM sodium hydrogen carbonate (pH 9.6)) to a concentration of 2.5 μg / mL.
This is a 96-well microplate ("MODULE
100 μL per well was added to each well of “PLATE F8” (trade name); manufactured by NUNK), and allowed to stand at 4 ° C. overnight to immobilize the C4b binding protein on the well of the microplate.
（ｃ）このマイクロプレートの各ウェルを、洗浄液〔０．０５％ツイーン２０（Tween20）を含む５０ｍＭリン酸緩衝生理食塩水（ｐＨ７．４）〕で３回洗浄した後、ブロッキング液〔「Ｂｌｏｃｋ Ａｃｅ」（商品名）（大日本製薬社製）を純水に溶解し、２５％の濃度としたもの〕を１ウェル当たり２５０μＬずつ加え、４℃で一晩静置することによりブロッキングを行い、その後再び洗浄液で洗浄した。
以上の操作により、Ｃ４ｂ結合タンパク質固定化マイクロプレート試薬の調製を行った。
(C) Each well of the microplate was washed three times with a washing solution [50 mM phosphate buffered saline (pH 7.4) containing 0.05% Tween 20], and then a blocking solution [“Block Ace "(Trade name) (Dainippon Pharmaceutical Co., Ltd.) dissolved in pure water to a concentration of 25%" was added at 250 μL per well, and the mixture was allowed to stand at 4 ° C overnight, followed by blocking. It was washed again with a washing solution.
By the above operation, a C4b binding protein-immobilized microplate reagent was prepared.
（２）パーオキシダーゼ標識抗プロテインＳ・モノクローナル抗体試薬の調製
（ａ）抗プロテインＳ抗体の調製
実施例１の１の（ａ）に記載した方法に従ってメルカプト・サクシニル化したマウス抗プロテインＳ・モノクローナル抗体を得た。
(2) Preparation of peroxidase-labeled anti-Protein S monoclonal antibody reagent (a) Preparation of anti-Protein S antibody Mercapto-succinylated mouse anti-Protein S monoclonal antibody according to the method described in Example 1, 1 (a) Got.
（ｂ）パーオキシダーゼの調製
２ｍｇのパーオキシダーゼ（ＰＯＤ、又はＨＲＰ）〔ホースラディシュ由来；東洋紡績社製〕を、０．３ｍＬの０．１Ｍリン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ７．０）に溶解した。
これに、０．２５ｍｇのＮ−サクシミジル−６−マレイミドヘキサン酸を溶解したＮ，Ｎ−ジメチルホルムアミドを３０μＬ加えて、３０℃で６０分間インキュベートした。
(B) Preparation of
30 μL of N, N-dimethylformamide in which 0.25 mg of N-succimidyl-6-maleimidohexanoic acid was dissolved was added thereto and incubated at 30 ° C. for 60 minutes.
その後、これを、０．１Ｍリン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ６．０）で平衡化しておいた、セファデックスＧ−２５カラムでゲルろ過を行い、マレイミド化したパーオキシダーゼを得た。 Thereafter, this was subjected to gel filtration with a Sephadex G-25 column which had been equilibrated with 0.1 M sodium phosphate buffer (pH 6.0) to obtain maleimidated peroxidase.
（ｃ）前記（ａ）で調製したメルカプト・サクシニル化したマウス抗プロテインＳ・モノクローナル抗体の２．３ｍｇを、５ｍＭ
ＥＤＴＡを含む０．１Ｍリン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ６．０）の０．２５ｍＬに溶解した。
これに、前記（ｂ）で調製したマレイミド化したパーオキシダーゼの１．８ｍｇを０．２５ｍＬの０．１Ｍリン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ６．０）に溶解したものを添加した。
(C) 2.3 mg of the mercapto-succinylated mouse anti-protein S monoclonal antibody prepared in (a) above was added to 5 mM.
It melt | dissolved in 0.25 mL of 0.1M sodium phosphate buffer (pH 6.0) containing EDTA.
To this was added 1.8 mg of the maleimidated peroxidase prepared in (b) above dissolved in 0.25 mL of 0.1 M sodium phosphate buffer (pH 6.0).
この混合物を、３０℃で２０時間インキュベートした後、０．１Ｍリン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ６．５）で平衡化しておいた、ウルトラゲルＡｃＡ３４カラムでゲルろ過を行い、マウス抗プロテインＳ・モノクローナル抗体をパーオキシダーゼで標識した、パーオキシダーゼ標識抗プロテインＳ・モノクローナル抗体を得た。 This mixture was incubated at 30 ° C. for 20 hours, and then subjected to gel filtration with an ultragel AcA34 column equilibrated with 0.1 M sodium phosphate buffer (pH 6.5) to obtain mouse anti-protein S / monoclonal antibody. Peroxidase-labeled anti-protein S monoclonal antibody labeled with peroxidase was obtained.
（ｄ） 前記（ｃ）で得たパーオキシダーゼ標識抗プロテインＳ・モノクローナル抗体を、検体希釈液〔２５％の「Ｂｌｏｃｋ Ａｃｅ」（商品名）（大日本製薬社製）、０.１Ｍ塩化ナトリウム、及び５ｍＭ塩化カルシウムを含む、１０ｍＭトリス（ヒドロキシメチル）アミノメタン緩衝液（ｐＨ７.５）〕で、１μｇ／ｍＬになるように希釈して、パーオキシダーゼ標識抗プロテインＳ・モノクローナル抗体試薬を調製した。 (D) The peroxidase-labeled anti-protein S monoclonal antibody obtained in (c) above was diluted with a specimen diluent [25% “Block Ace” (trade name) (Dainippon Pharmaceutical Co., Ltd.), 0.1M sodium chloride, And 10 mM Tris (hydroxymethyl) aminomethane buffer (pH 7.5) containing 5 mM calcium chloride] was diluted to 1 μg / mL to prepare a peroxidase-labeled anti-protein S / monoclonal antibody reagent.
２．試料
前記のＩの２における試料（健常人９名の血漿）を、試料として用いた。
2. Sample The sample in I-2 above (plasma of 9 healthy subjects) was used as a sample.
３．試料中の総プロテインＳタンパク質量の測定
（１）測定手順
（ａ）前記１の（１）で調製した「Ｃ４ｂ結合タンパク質固定化マイクロプレート試薬」、及び前記１の（２）で調製した「パーオキシダーゼ標識抗プロテインＳ・モノクローナル抗体試薬」を用いて前記２の試料の測定を行った。
3. Measurement of total protein S protein in sample (1) Measurement procedure (a) “C4b-binding protein-immobilized microplate reagent” prepared in (1) above and “Per” prepared in (2) above Using the oxidase-labeled anti-protein S / monoclonal antibody reagent, the above two samples were measured.
（ｂ） 前記２の試料と検体希釈液〔０．１％ＢＳＡ、０．１％塩化ナトリウム、５ｍＭ塩化カルシウムを含む５０ｍＭトリス−塩酸緩衝液（ｐＨ７．４）〕で、５２７１倍希釈し、前記１の（１）で調製したＣ４ｂ結合タンパク質固定化マイクロプレート試薬のマイクロプレートのウェルに、１ウェル当たり１００μＬ分注した。
この操作を、前記マイクロプレートの９枚について行った。
(B) Diluting 5271 times with the sample of 2 and specimen dilution solution [50 mM Tris-HCl buffer (pH 7.4) containing 0.1% BSA, 0.1% sodium chloride, 5 mM calcium chloride], 100 μL per well was dispensed into the microplate wells of the C4b binding protein-immobilized microplate reagent prepared in (1).
This operation was performed on nine microplates.
そして、このマイクロプレートの各々をそれぞれ、３７℃で４時間静置して反応を行わせた。 And each of this microplate was left still at 37 degreeC for 4 hours, and reaction was performed.
（ｃ） この３７℃での４時間の反応の後、反応を行わせたマイクロプレートの各ウェルを、前記１の（１）の（ｃ）の洗浄液で５回ずつ洗浄した。
この操作により、固定化されたＣ４ｂ結合タンパク質に結合しなかったプロテインＳ等の成分を前記ウェルより除去した。（ＢＦ分離）
(C) After the reaction at 37 ° C. for 4 hours, each well of the microplate subjected to the reaction was washed 5 times with the washing solution of (1) (c).
By this operation, components such as protein S that did not bind to the immobilized C4b binding protein were removed from the well. (BF separation)
（ｄ） 前記１の（２）で調製したパーオキシダーゼ標識抗プロテインＳ・モノクローナル抗体試薬を、前記（ｃ）で洗浄した後のマイクロプレートの各ウェルに１００μＬずつ分注した。そして、これを２５℃で１時間静置して反応を行わせた。 (D) 100 μL of the peroxidase-labeled anti-protein S / monoclonal antibody reagent prepared in (1) above was dispensed into each well of the microplate after washing in (c). And this was left still at 25 degreeC for 1 hour, and reaction was performed.
この操作により、マイクロプレートのウェルに固定化されたＣ４ｂ結合タンパク質に結合したプロテインＳに、パーオキシダーゼ標識抗プロテインＳ・モノクローナル抗体を結合させた。 By this operation, peroxidase-labeled anti-protein S / monoclonal antibody was bound to protein S bound to the C4b binding protein immobilized on the well of the microplate.
（ｅ） この２５℃、１時間の反応の後、反応を行わせたマイクロプレートの各ウェルを、前記の洗浄液で５回ずつ洗浄した。
この操作により、マイクロプレートに間接的に固定化されたプロテインＳに結合しなかったパーオキシダーゼ標識抗プロテインＳ・モノクローナル抗体等の成分を前記ウェルより除去した。（ＢＦ分離）
(E) After the reaction at 25 ° C. for 1 hour, each well of the microplate subjected to the reaction was washed five times with the washing solution.
By this operation, components such as peroxidase-labeled anti-protein S / monoclonal antibody that did not bind to protein S indirectly immobilized on the microplate were removed from the wells. (BF separation)
（ｆ）その後、ＨＲＰ発色試薬〔３，３’，５，５’−テトラメチルベンジジン（ＴＭＢ）を含む；「ＴＭＢ
Ｓｏｌｕｂｌｅ Ｒｅａｇｅｎｔ」、Ｓｃｙ Ｔｅｋ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ社（米国）製〕を、前記（ｅ）で洗浄した後のマイクロプレートの各ウェルに１００μＬずつ加え、室温で１０分間、発色反応を行わせた。
(F) Thereafter, HRP coloring reagent [including 3,3 ′, 5,5′-tetramethylbenzidine (TMB);
100 [mu] L of Soluble Reagent "(manufactured by Scy Tek Laboratories (USA)) was added to each well of the microplate after washing in (e) above, and the color reaction was performed at room temperature for 10 minutes.
（ｇ） この後、この反応を行わせたマイクロプレートの各ウェルに、発色停止試薬〔「ＴＭＢ
Ｓｔｏｐ Ｂｕｆｆｅｒ」、Ｓｃｙ Ｔｅｋ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ社（米国）製〕を１００μＬずつ加え、撹拌することにより、発色反応を停止させた。
(G) Thereafter, a color development stopping reagent [“TMB” was added to each well of the microplate subjected to this reaction.
Stop buffer ", manufactured by Scy Tek Laboratories (USA)] was added 100 μL at a time, and the color reaction was stopped by stirring.
（ｈ） このマイクロプレートの各ウェルの、４５０ｎｍにおける吸光度の測定を、ＥＩＡマイクロプレートリーダー（バイオラッド社製）により行った。 (H) The absorbance at 450 nm of each well of the microplate was measured with an EIA microplate reader (Bio-Rad).
（ｉ）そして、試料中のプロテインＳの測定値（濃度）を、次のようにして求めた。
実施例１の２で調製した試料を標準物質とし、これを先の試料と同様にして前記の測定操作を行って吸光度を求め、試料と標準物質の両方の吸光度を比較することにより測定を行った試料中の総プロテインＳタンパク質濃度の算出を行った。
(I) The measured value (concentration) of protein S in the sample was determined as follows.
The sample prepared in 2 of Example 1 was used as a standard substance, and the measurement was performed in the same manner as the previous sample to obtain the absorbance, and the measurement was performed by comparing the absorbance of both the sample and the standard substance. The total protein S protein concentration in each sample was calculated.
この試料中の総プロテインＳタンパク質量の測定を行って得られた結果を図２〜５に示した。 The results obtained by measuring the total protein S protein amount in this sample are shown in FIGS.
ＩＩＩ．測定結果
前記Ｉにおける試料中の総プロテインＳタンパク質量の測定結果と、前記ＩＩにおける試料中の総プロテインＳタンパク質量の測定結果とを、これらの相関の図として図２〜５に示した。
III. Measurement Result The measurement result of the total protein S protein amount in the sample in the above I and the measurement result of the total protein S protein amount in the sample in the above II are shown in FIGS.
これらの図において、横軸（ｘ）は前記ＩＩのＥＬＳＡ法による試料中の総プロテインＳタンパク質量の測定結果を表す。この測定値の単位は「μｇ／ｍＬ」である。
また、これらの図において、縦軸（ｙ）は前記Ｉにおける本発明の測定試薬及び測定方法による試料中の総プロテインＳタンパク質量の測定結果を表す。この測定値の単位は「μｇ／ｍＬ」である。
In these figures, the horizontal axis (x) represents the measurement result of the total protein S protein amount in the sample by the ELSA method of II. The unit of this measured value is “μg / mL”.
In these figures, the vertical axis (y) represents the measurement result of the total protein S protein amount in the sample by the measurement reagent and measurement method of the present invention in I above. The unit of this measured value is “μg / mL”.
また、相関の関係式を求めた結果を表１に示した。 In addition, Table 1 shows the result of obtaining the correlation relational expression.
この表１において、第１試薬中のＣ４ｂ結合タンパク質濃度毎に、回帰式及び相関係数を示した。 In Table 1, the regression equation and the correlation coefficient are shown for each C4b binding protein concentration in the first reagent.
この図、そして相関の回帰式より、本発明の試料中の総プロテインＳタンパク質量の測定試薬及び測定方法は、Ｃ４ｂ結合タンパク質の濃度が６μｇ／ｍＬ以上の場合に、ＥＬＳＡ法による試料中の総プロテインＳタンパク質量とより良好な相関性を示すことが分かる。 From this figure and the regression equation of correlation, the reagent and method for measuring the amount of total protein S protein in the sample of the present invention are as follows. When the concentration of C4b binding protein is 6 μg / mL or more, It can be seen that there is a better correlation with the amount of protein S protein.
このようにＥＬＳＡ法による総プロテインＳタンパク質量の測定値と良好な相関性を示すことより、本発明の試料中の総プロテインＳタンパク質量の測定試薬及び測定方法が、正確なものであることが分かる。 Thus, since it shows a good correlation with the measurement value of the total protein S protein amount by the ELSA method, the measurement reagent and measurement method of the total protein S protein amount in the sample of the present invention are accurate. I understand.
そして、このようにＥＬＳＡ法による総プロテインＳタンパク質量の測定値と良好な相関性を示すことより、本発明の試料中の総プロテインＳタンパク質量の測定試薬及び測定方法が、試料中に存在する全てのプロテインＳ〔プロテインＳとＣ４ｂ結合タンパク質との複合体（結合型）、及び遊離のプロテインＳ（遊離型）〕についてそのタンパク質量を、すなわち、総プロテインＳのタンパク質量を正確に測定することができる測定試薬及び測定方法であることが確かめられた。 And since it shows a good correlation with the measured value of the total protein S protein amount by the ELSA method in this way, the measuring reagent and measuring method for the total protein S protein amount in the sample of the present invention exist in the sample. Accurately measure the protein amount of all protein S [complex of protein S and C4b binding protein (bound type) and free protein S (free type)], that is, the amount of protein of total protein S It was confirmed that this was a measuring reagent and a measuring method capable of
また、前記のＣ４ｂ結合タンパク質を総プロテインＳタンパク質量の測定試薬に存在させる濃度が６μｇ／ｍＬ以上の場合、試料と測定試薬を混合した後の測定反応液中において、Ｃ４ｂ結合タンパク質とプロテインＳとのモル比は、０．９であった。
すなわち、本発明において、Ｃ４ｂ結合タンパク質を総プロテインＳタンパク質量の測定試薬に存在させる濃度は、試料と測定試薬を混合した後の測定反応液中において、Ｃ４ｂ結合タンパク質とプロテインＳとのモル比が０．９以上（Ｃ４ｂ結合タンパク質／プロテインＳ≧０．９）となるように設定することが好ましいことが確かめられた。
In addition, when the concentration at which the C4b-binding protein is present in the measurement reagent for the total protein S protein amount is 6 μg / mL or more, the C4b-binding protein, protein S, and The molar ratio of was 0.9.
That is, in the present invention, the concentration at which the C4b binding protein is present in the measurement reagent for the total protein S protein is such that the molar ratio of the C4b binding protein to protein S in the measurement reaction mixture after mixing the sample and the measurement reagent. It was confirmed that it was preferable to set the ratio to 0.9 or more (C4b binding protein / protein S ≧ 0.9).
〔実施例３〕
（本発明の試料中の総プロテインＳタンパク質量の測定試薬及び測定方法の再現性の検討）
本発明の試料中の総プロテインＳタンパク質量の測定試薬及び測定方法により試料中の総プロテインＳタンパク質量を測定する際の測定の再現性について検討した。
Example 3
(Examination of reproducibility of measuring reagent and measuring method of total protein S protein amount in sample of the present invention)
The reproducibility of the measurement when measuring the total protein S protein amount in the sample by the measuring reagent and measuring method of the total protein S protein amount in the sample of the present invention was examined.
１．測定試薬
（１）第１試薬の調製
Ｃ４ｂ結合タンパク質を２５μｇ／ｍＬの濃度となるように添加すること以外は、前記の実施例１の１の（１）と同様に第１試薬を調製した。
1. Measurement reagent (1) Preparation of first reagent A first reagent was prepared in the same manner as in (1) of Example 1 except that C4b-binding protein was added to a concentration of 25 μg / mL.
（２）第２試薬の調製
第２試薬として、前記の実施例１の１の（２）の第２試薬を用いた。
(2) Preparation of Second Reagent As the second reagent, the second reagent (1) in Example 1 (2) was used.
２．試料
ヒトの血漿の４検体を、試料として用いた。
2. Samples Four specimens of human plasma were used as samples.
３．試料中の総プロテインＳタンパク質量の測定
（１）前記２の試料のそれぞれについて、前記の実施例１の３の記載の通りに総プロテインＳタンパク質量の測定を行った。
3. Measurement of total protein S protein amount in sample (1) For each of the two samples, the total protein S protein amount was measured as described in 3 of Example 1 above.
（２）前記（１）の操作を繰り返して計５回行い、同時再現性の検討を行なった。 (2) The above operation (1) was repeated 5 times in total, and the simultaneous reproducibility was examined.
（３）また、前記（１）の操作を連続する３日間のそれぞれの日に行い、日差再現性の検討を行なった。 (3) Further, the operation of the above (1) was performed on each of three consecutive days, and the daily difference reproducibility was examined.
４．測定結果
前記の通りに試料中の総プロテインＳタンパク質量の測定を行って得られた結果を表２に示した。
4). Measurement Results Table 2 shows the results obtained by measuring the total protein S protein amount in the sample as described above.
この表において、同時再現性のデータ、及び日差再現性のデータとも、それぞれの試料毎に、「平均値±標準偏差（ＳＤ）」及び「変動係数（ＣＶ）」を示した。 In this table, both of the data of simultaneous reproducibility and the data of daily reproducibility show “average ± standard deviation (SD)” and “coefficient of variation (CV)” for each sample.
この表より、同時再現性における変動係数（ＣＶ）は０．４％〜１．２％の範囲のものであり、測定値のバラツキが小さく、精密に測定できていることが分かる。 From this table, it can be seen that the coefficient of variation (CV) in the simultaneous reproducibility is in the range of 0.4% to 1.2%, and there is little variation in the measured values, so that accurate measurement can be performed.
また、日差再現性における変動係数（ＣＶ）は０．７％〜１．４％の範囲のものであり、例え測定を行う日が異なったとしてもその測定値のバラツキは小さく、精密に測定できることが分かる。 In addition, the coefficient of variation (CV) in the daily difference reproducibility is in the range of 0.7% to 1.4%. Even if the measurement days are different, the variation in the measured values is small and the measurement is accurate. I understand that I can do it.
これらのことより、本発明の試料中の総プロテインＳタンパク質量の測定試薬及び測定方法は測定の再現性がよく、精密に測定が行えるものであることが確かめられた。 From these facts, it was confirmed that the measuring reagent and measuring method for the total protein S protein amount in the sample of the present invention had good reproducibility of measurement and could be measured accurately.
〔実施例４〕
（本発明の試料中の総プロテインＳタンパク質量の測定試薬とＥＬＩＳＡ法との相関）
本発明の試料中の総プロテインＳタンパク質量の測定試薬及び測定方法と、ＥＬＩＳＡ法による試料中の総プロテインＳタンパク質量の測定試薬及び測定方法との相関を確かめた。
Example 4
(Correlation between reagent for measuring total protein S protein in the sample of the present invention and ELISA method)
The correlation between the measuring reagent and measuring method for the total protein S protein in the sample of the present invention and the measuring reagent and measuring method for the total protein S protein in the sample by the ELISA method was confirmed.
Ｉ．本発明の試料中の総プロテインＳタンパク質量の測定試薬及び測定方法による測定
１．測定試薬
（１）第１試薬の調製
第１試薬として、前記の実施例３の１の（１）の第１試薬を用いた。
I. 1. Measurement of total protein S protein amount in the sample of the present invention by a measuring reagent and measuring method Measurement reagent (1) Preparation of first reagent As the first reagent, the first reagent (1) of Example 3 described above was used.
（２）第２試薬の調製
第２試薬として、前記の実施例１の１の（２）の第２試薬を用いた。
(2) Preparation of Second Reagent As the second reagent, the second reagent (1) in Example 1 (2) was used.
２．試料
健常人５０名の血漿を、試料として用いた。
2. Sample Plasma of 50 healthy people was used as a sample.
３．試料中の総プロテインＳタンパク質量の測定
前記２の試料のそれぞれについて、前記の実施例１の３の記載の通りに総プロテインＳタンパク質量の測定を行い、各試料の総プロテインＳタンパク質量を得た。
3. Measurement of total protein S protein amount in the sample For each of the two samples, the total protein S protein amount is measured as described in 3 of Example 1 to obtain the total protein S protein amount of each sample. It was.
この試料中の総プロテインＳタンパク質量の測定を行って得られた結果を図６に示した。 The results obtained by measuring the total protein S protein amount in this sample are shown in FIG.
ＩＩ．ＥＬＩＳＡ法による試料中の総プロテインＳのタンパク質量の測定方法及び測定試薬による測定
１．ＥＬＩＳＡ法による総プロテインＳタンパク質量の測定試薬
ＥＬＩＳＡ法による総プロテインＳタンパク質量の測定試薬として、市販の「アセラクロム トータルプロテイン Ｓ ＴＭＢ」（製造者：ＤＩＡＧＮＯＳＴＩＣＡ ＳＴＡＧＯ社、フランス国；製造販売者：ロシュ・ダイアグノスティックス社、日本国）を用いた。
II. 1. Method for measuring the amount of total protein S in a sample by ELISA method and measurement with a measuring reagent Reagent for measuring total protein S protein amount by ELISA method As a reagent for measuring total protein S protein amount by ELISA method, commercially available “Acerachrome Total Protein S TMB” (manufacturer: DIAGNOSTICA STAGO, France; manufacturer: Roche)・ Diagnostics Inc., Japan).
なお、この「アセラクロム トータルプロテイン Ｓ ＴＭＢ」は次のものより構成される。
（ａ）抗体コーティングストリップ（抗総プロテインＳマウスモノクローナル抗体）
（ｂ）抗体コンジュゲート（ペルオキシダーゼ標識抗総プロテインＳマウスモノクローナル抗体）
（ｃ）基質液（３，３’，５，５’−テトラメチルベンジジン、及び３０％過酸化水素水）
（ｄ）希釈緩衝液
（ｅ）洗浄液
（ｆ）スタンダード（総プロテインＳ・キャリブレーター）
（ｇ）コントロール（総プロテインＳ・コントロール）
（ｈ）プレートフレーム
（ｉ）プレートカバー
This “Acerachrome Total Protein S TMB” is composed of the following:
(A) Antibody-coated strip (anti-total protein S mouse monoclonal antibody)
(B) Antibody conjugate (peroxidase-labeled anti-total protein S mouse monoclonal antibody)
(C) Substrate solution (3,3 ′, 5,5′-tetramethylbenzidine and 30% aqueous hydrogen peroxide)
(D) Dilution buffer (e) Wash solution (f) Standard (total protein S calibrator)
(G) Control (Total Protein S / Control)
(H) Plate frame (i) Plate cover
２．試料
前記のＩの２における試料（健常人５０名の血漿）を、試料として用いた。
2. Sample The sample in I-2 above (plasma of 50 healthy subjects) was used as a sample.
３．試料中の総プロテインＳタンパク質量の測定
「アセラクロム トータルプロテイン Ｓ ＴＭＢ」の添付文書の記載に従い、試料中の総プロテインＳタンパク質量の測定を行った。
3. Measurement of total protein S protein in the sample The total protein S protein in the sample was measured according to the description in the package insert of “Acerachrome Total Protein S TMB”.
なお、この「アセラクロム トータルプロテイン Ｓ ＴＭＢ」における操作方法は次の通りである。
（ａ） 検体（クエン酸血漿）を希釈緩衝液で１０１倍に希釈し、試料とする。
（ｂ） 希釈緩衝液で１０１倍に希釈して調製したスタンダードを段階的に希釈し、希釈系列を作成する。
（ｃ） 抗体コーティングストリップの各ウェルに抗体コンジュゲートを５０μＬ分注する。
（ｄ） 試料又は希釈したスタンダード２００μＬをそれぞれ分注し、１８〜２５℃で１時間インキュベーションする。
（ｅ） 各ウェルの内容液を吸引除去し、洗浄液で５回洗浄する。
（ｆ） 洗浄液を吸引除去した後、各ウェルに基質液２００μＬを分注し、１８〜２５℃で５分間インキュベーションする。
（ｇ） １Ｍ硫酸５０μＬを分注し、プレートを穏やかに揺らして内容物を混和する。１５分間放置した後、１時間以内に波長４５０ｎｍにおける吸光度を測定する。
（ｈ） スタンダードの吸光度と試料の吸光度を比較し、試料中の総プロテインＳ濃度を求める。
The operation method in “Acerachrome Total Protein S TMB” is as follows.
(A) A sample (citrate plasma) is diluted 101 times with a dilution buffer to prepare a sample.
(B) A standard prepared by diluting 101 times with a dilution buffer is diluted stepwise to prepare a dilution series.
(C) Dispense 50 μL of antibody conjugate into each well of the antibody-coated strip.
(D) Each sample or 200 μL of diluted standard is dispensed and incubated at 18-25 ° C. for 1 hour.
(E) Aspirate the contents of each well and wash 5 times with the washing solution.
(F) After removing the washing solution by suction, 200 μL of the substrate solution is dispensed into each well and incubated at 18 to 25 ° C. for 5 minutes.
(G) Dispense 50 μL of 1M sulfuric acid and gently shake the plate to mix the contents. After standing for 15 minutes, the absorbance at a wavelength of 450 nm is measured within 1 hour.
(H) Compare the absorbance of the standard with the absorbance of the sample to determine the total protein S concentration in the sample.
このようにして、前記２の各試料の総プロテインＳタンパク質量を得た。 In this way, the total protein S protein amount of each of the two samples was obtained.
この試料中の総プロテインＳタンパク質量の測定を行って得られた結果を図６に示した。 The results obtained by measuring the total protein S protein amount in this sample are shown in FIG.
ＩＩＩ．測定結果
前記Ｉにおける試料中の総プロテインＳタンパク質量の測定結果と、前記ＩＩにおける試料中の総プロテインＳタンパク質量の測定結果とを、これらの相関の図として図６に示した。
III. Measurement Result The measurement result of the total protein S protein amount in the sample in the above I and the measurement result of the total protein S protein amount in the sample in the above II are shown in FIG.
この図において、横軸（ｘ）は前記ＩＩのＥＬＩＳＡ法による試料中の総プロテインＳタンパク質量の測定結果を表す。この測定値の単位は「μｇ／ｍＬ」である。
また、この図において、縦軸（ｙ）は前記Ｉにおける本発明の測定試薬及び測定方法による試料中の総プロテインＳタンパク質量の測定結果を表す。この測定値の単位は「μｇ／ｍＬ」である。
In this figure, the horizontal axis (x) represents the measurement result of the total protein S protein amount in the sample by the ELISA method of II. The unit of this measured value is “μg / mL”.
In this figure, the vertical axis (y) represents the measurement result of the total protein S protein amount in the sample by the measurement reagent and measurement method of the present invention in I above. The unit of this measured value is “μg / mL”.
この相関の回帰式を求めた結果、回帰式はｙ＝０．９０８ｘ−１．２８２であり、相関係数はｒ＝０．９７であった。（ｘ：前記ＩＩのＥＬＩＳＡ法による総プロテインＳタンパク質量の測定結果、ｙ：前記Ｉの本発明による総プロテインＳタンパク質量の測定結果） As a result of obtaining the regression equation of this correlation, the regression equation was y = 0.908x-1.282, and the correlation coefficient was r = 0.97. (X: measurement result of total protein S protein amount by ELISA method of II above, y: measurement result of total protein S protein amount of the present invention of I above)
この図、そして相関の回帰式より、本発明の試料中の総プロテインＳタンパク質量の測定試薬及び測定方法は、ＥＬＩＳＡ法による試料中の総プロテインＳタンパク質量と良好な相関性を示すことが分かる。 From this figure and the regression equation of the correlation, it can be seen that the reagent and method for measuring the total protein S protein amount in the sample of the present invention show a good correlation with the total protein S protein amount in the sample by the ELISA method. .
このようにＥＬＩＳＡ法による総プロテインＳタンパク質量の測定値と良好な相関性を示すことより、本発明の試料中の総プロテインＳタンパク質量の測定試薬及び測定方法が、正確なものであることが分かる。 Thus, since it shows a good correlation with the measurement value of the total protein S protein amount by the ELISA method, the measurement reagent and measurement method for the total protein S protein amount in the sample of the present invention are accurate. I understand.
そして、このようにＥＬＩＳＡ法による総プロテインＳタンパク質量の測定値と良好な相関性を示すことより、本発明の試料中の総プロテインＳタンパク質量の測定試薬及び測定方法が、試料中に存在する全てのプロテインＳ〔プロテインＳとＣ４ｂ結合タンパク質との複合体（結合型）、及び遊離のプロテインＳ（遊離型）〕についてそのタンパク質量を測定することが出来るものであることが分かる。 And since it shows a good correlation with the measured value of the total protein S protein amount by the ELISA method in this way, the measuring reagent and measuring method for the total protein S protein amount in the sample of the present invention exist in the sample. It turns out that the protein amount can be measured about all the protein S [The complex (binding type) of protein S and C4b binding protein, and free protein S (free type)]].
これらのことより、本発明の試料中の総プロテインＳタンパク質量の測定試薬及び測定方法が、試料中の総プロテインＳタンパク質量を正確に測定することが出来るものであることが確かめられた。 From these facts, it was confirmed that the measuring protein and measuring method of the total protein S protein in the sample of the present invention can accurately measure the total protein S protein in the sample.
〔実施例５〕
（総プロテインＳのタンパク質量と総プロテインＳの活性値との比較）
本発明の試料中の総プロテインＳのタンパク質量の測定試薬及び測定方法により得た総プロテインＳのタンパク質量と、比色法による試料中の総プロテインＳの活性値の測定方法及び測定試薬により得た総プロテインＳの活性値とを比較した。
Example 5
(Comparison of total protein S protein amount and total protein S activity)
Obtained by the measuring method and measuring reagent of the total protein S protein amount obtained by the reagent and measuring method of the total protein S in the sample of the present invention, and the total protein S activity value in the sample by the colorimetric method The total protein S activity values were compared.
Ｉ．本発明の試料中の総プロテインＳのタンパク質量の測定方法及び測定試薬による測定
１．総プロテインＳのタンパク質量の測定試薬
（１）第１試薬の調製
第１試薬として、前記の実施例３の１の（１）の第１試薬を用いた。
I. 1. Method for measuring the amount of protein of total protein S in the sample of the present invention and measurement using a measurement reagent Reagent for measuring protein amount of total protein S (1) Preparation of first reagent As the first reagent, the first reagent of (1) in Example 1 was used.
（２）第２試薬の調製
第２試薬として、前記の実施例１の１の（２）の第２試薬を用いた。
(2) Preparation of Second Reagent As the second reagent, the second reagent (1) in Example 1 (2) was used.
２．試料
次の（１）〜（４）をそれぞれ試料として用いた。
（１）健常人２１１名の血漿
（２）プロテインＳの遺伝子変異であるＰＳ−Ｋ１５５Ｅヘテロ接合体（プロテインＳの異常症の一つであるプロテインＳ徳島）であることが判明している７名の血漿
（３）プロテインＳの遺伝子変異であるＰＳ−Ｋ１５５Ｅホモ接合体（プロテインＳの異常症の一つであるプロテインＳ徳島）であることが判明している１名の血漿
（４）プロテインＳの遺伝子変異であるＣ２０６Ｆヘテロ接合体（プロテインＳの異常症の一つ）であることが判明している１名の血漿
2. Samples The following (1) to (4) were used as samples.
(1) Plasma of 211 healthy people (2) Seven who have been found to be PS-K155E heterozygote (protein S Tokushima, which is one of the abnormalities of protein S), which is a genetic mutation of protein S (3) One plasma known to be PS-K155E homozygote (protein S Tokushima, which is one of the abnormalities of protein S), which is a genetic mutation of protein S (4) Protein S Plasma of one who has been found to be a C206F heterozygote (a protein S abnormality)
３．試料中の総プロテインＳのタンパク質量の測定
前記２の試料のそれぞれについて、前記の実施例１の３の記載の通りに総プロテインＳのタンパク質量の測定を行い、各試料の総プロテインＳのタンパク質量を得た。
3. Measurement of total protein S in the sample For each of the two samples, the amount of total protein S was measured as described in 3 of Example 1 above, and the total protein S protein of each sample was measured. Got the amount.
この試料中の総プロテインＳのタンパク質量の測定を行って得られた結果を図７に示した。 The results obtained by measuring the amount of total protein S in this sample are shown in FIG.
ＩＩ．比色法による試料中の総プロテインＳの活性値の測定方法及び測定試薬による測定
１．比色法による総プロテインＳの活性測定試薬
（１）希釈液
下記の成分をそれぞれ記載の濃度になるように純水に溶解し、ｐＨをｐＨ８．０（２０℃）に調整して、希釈液を調製した。
II. 1. Measuring method of activity value of total protein S in sample by colorimetric method and measurement with measuring reagent Reagent for measuring activity of total protein S by colorimetric method (1) Diluent Solution The following components are dissolved in pure water so that each concentration is as described, and the pH is adjusted to pH 8.0 (20 ° C.). Was prepared.
Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ−１００（和光純薬工業社、日本国） ０．０６％（Ｗ／Ｖ）
ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ） ０．１％（Ｗ／Ｖ）
塩化ナトリウム ０．１Ｍ
クエン酸三ナトリウム １０．６ｍＭ
トリス（ヒドロキシメチル）アミノメタン ５０ｍＭ
Triton X-100 (Wako Pure Chemical Industries, Japan) 0.06% (W / V)
Bovine serum albumin (BSA) 0.1% (W / V)
Sodium chloride 0.1M
Trisodium citrate 10.6 mM
Tris (hydroxymethyl) aminomethane 50 mM
（２）第１試薬
下記の成分をそれぞれ記載の濃度になるように純水に溶解し、ｐＨをｐＨ８．０（２０℃）に調整して、第１試薬を調製した。
(2) 1st reagent The following component was melt | dissolved in the pure water so that it might become each described density | concentration, pH was adjusted to pH 8.0 (20 degreeC), and the 1st reagent was prepared.
活性化プロテインＣ（精製ヒト活性化プロテインＣ；Ｅｎｚｙｍｅ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，Ｉｎｃ社、米国） ３９７ｐＭ
界面活性剤
リン脂質
塩化カルシウム ２．５ｍＭ
ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ；Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ社、米国） ０．１％（Ｗ／Ｖ）
塩化ナトリウム ０．１Ｍ
トリス（ヒドロキシメチル）アミノメタン ５０ｍＭ
Activated protein C (purified human activated protein C; Enzyme Research Laboratories, Inc., USA) 397 pM
Surfactant Phospholipid Calcium chloride 2.5 mM
Bovine serum albumin (BSA; Sigma-Aldrich, USA) 0.1% (W / V)
Sodium chloride 0.1M
Tris (hydroxymethyl) aminomethane 50 mM
なお、界面活性剤は、Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ−１００（ポリオキシエチレン（ｎ＝９，１０）ｐ−ｔ−オクチルフェニルエーテル、和光純薬工業社、日本国）を０．００６％（Ｗ／Ｖ）の濃度となるように含有させた。 The surfactant is Triton X-100 (polyoxyethylene (n = 9,10) pt-octylphenyl ether, Wako Pure Chemical Industries, Japan) of 0.006% (W / V). It contained so that it might become a density | concentration.
また、リン脂質は、ホスファチジルセリン（ブタ脳ホスファチジルセリン；ＰＳ；ＤＯＯＳＡＮ Ｓｅｒｄａｒｙ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ社、韓国）０．４ｍｇ、ホスファチジルコリン（ブタ肝臓ホスファチジルコリン；ＰＣ；ＤＯＯＳＡＮ Ｓｅｒｄａｒｙ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ社、韓国）０．４ｍｇ、及びホスファチジルエタノールアミン（ブタ肝臓ホスファチジルエタノールアミン；ＰＥ；ＤＯＯＳＡＮ Ｓｅｒｄａｒｙ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ社、韓国）０．４ｍｇをそれぞれ試験管に採取し、エバポレーターにて溶媒であるクロロフォルムを蒸発させた後、蒸留水を添加し１分間激しく撹拌した後、６０℃で１０分間超音波処理を行って調製したホスファチジルセリン、ホスファチジルコリン及びホスファチジルエタノールアミンの組成比が１：１：１のリン脂質を、２４μＭの濃度となるように含有させた。〔なお、このホスファチジルセリン、ホスファチジルコリン及びホスファチジルエタノールアミンの組成比が１：１：１のリン脂質を、以下「リン脂質（ＰＳ：ＰＣ：ＰＥ＝１：１：１）」ということがある。〕 In addition, phosphatidylserine (porcine brain phosphatidylserine; PS; DOOSAN Serial Research Laboratories, Korea) 0.4 mg, phosphatidylcholine (porcine liver phosphatidylcholine; PC; DOOSAN Serial Research Laboratories, Korea) 0.4 mg, 0.4 mg of ethanolamine (porcine liver phosphatidylethanolamine; PE; DOOSAN Serial Research Laboratories, Korea) was collected in a test tube, and after evaporation of chloroform as a solvent with an evaporator, distilled water was added for 1 minute. Phosphatidyl prepared by vigorous stirring and sonication at 60 ° C. for 10 minutes Phosphorus, the composition ratio of phosphatidylcholine and phosphatidylethanolamine 1: 1: 1 of the phospholipid was included at a concentration of 24 [mu] M. [The phospholipid having a 1: 1: 1 composition ratio of phosphatidylserine, phosphatidylcholine and phosphatidylethanolamine may be hereinafter referred to as “phospholipid (PS: PC: PE = 1: 1: 1)”. ]
（３）第２試薬
下記の成分をそれぞれ記載の濃度になるように純水に溶解し、ｐＨをｐＨ８．０（２０℃）に調整して、第２試薬を調製した。
(3) Second Reagent The following components were dissolved in pure water so that each concentration was as described, and the pH was adjusted to 8.0 (20 ° C.) to prepare a second reagent.
活性化血液凝固第Ｖ因子（精製ヒト活性化血液凝固第Ｖ因子；Ｈａｅｍａｔｏｌｏｇｉｃ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，Ｉｎｃ社、米国） ３５７ｐＭ
界面活性剤
リン脂質
塩化カルシウム ２．５ｍＭ
ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ；Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ社、米国） ０．１％（Ｗ／Ｖ）
塩化ナトリウム ０．１Ｍ
トリス（ヒドロキシメチル）アミノメタン ５０ｍＭ
Activated blood coagulation factor V (purified human activated blood coagulation factor V; Haematologic Technologies, Inc., USA) 357 pM
Surfactant Phospholipid Calcium chloride 2.5 mM
Bovine serum albumin (BSA; Sigma-Aldrich, USA) 0.1% (W / V)
Sodium chloride 0.1M
Tris (hydroxymethyl) aminomethane 50 mM
なお、界面活性剤は、Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ−１００（ポリオキシエチレン（ｎ＝９，１０）ｐ−ｔ−オクチルフェニルエーテル、和光純薬工業社、日本国）を０．００６％（Ｗ／Ｖ）の濃度となるように含有させた。 The surfactant is Triton X-100 (polyoxyethylene (n = 9,10) pt-octylphenyl ether, Wako Pure Chemical Industries, Japan) of 0.006% (W / V). It contained so that it might become a density | concentration.
また、リン脂質は、前記のリン脂質（ＰＳ：ＰＣ：ＰＥ＝１：１：１）を、２４μＭの濃度となるように含有させた。 Moreover, the phospholipid (PS: PC: PE = 1: 1: 1) was contained so that it might become a density | concentration of 24 micromol.
（４）第３試薬
下記の成分をそれぞれ記載の濃度になるように純水に溶解し、ｐＨをｐＨ７．５（２０℃）に調整して、第３試薬を調製した。
(4) 3rd reagent The following component was melt | dissolved in the pure water so that it might become each described density | concentration, pH was adjusted to pH7.5 (20 degreeC), and the 3rd reagent was prepared.
活性化血液凝固第Ｘ因子（精製ウシ活性化血液凝固第Ｘ因子；Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ，Ｉｎｃ社、米国） ５０ｐＭ
プロトロンビン（精製ヒトプロトロンビン；Ｅｎｚｙｍｅ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，Ｉｎｃ社、米国） ７３８ｎＭ
Ｓ−２２３８（トロンビンの基質〔トロンビンの発色基質〕；Ｃｈｒｏｍｏｇｅｎｉｘ-Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔａｔｉｏｎ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ社、イタリア国） ７５０μＭ
リン脂質
塩化カルシウム ５．０ｍＭ
ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ；Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ社、米国） ０．１％（Ｗ／Ｖ）
塩化ナトリウム ０．１５Ｍ
トリス（ヒドロキシメチル）アミノメタン ５０ｍＭ
Activated blood coagulation factor X (purified bovine activated blood coagulation factor X; New England Biolabs, Inc, USA) 50 pM
Prothrombin (purified human prothrombin; Enzyme Research Laboratories, Inc., USA) 738 nM
S-2238 (Thrombin substrate [Thrombin chromogenic substrate]; Chromogenix-Instrumentation Laboratories, Italy) 750 μM
Phospholipid calcium chloride 5.0 mM
Bovine serum albumin (BSA; Sigma-Aldrich, USA) 0.1% (W / V)
Sodium chloride 0.15M
Tris (hydroxymethyl) aminomethane 50 mM
なお、リン脂質は、ホスファチジルセリン（ブタ脳ホスファチジルセリン；ＰＳ；ＤＯＯＳＡＮ Ｓｅｒｄａｒｙ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ社、韓国）０．６ｍｇ、ホスファチジルコリン（ブタ肝臓ホスファチジルコリン；ＰＣ；ＤＯＯＳＡＮ Ｓｅｒｄａｒｙ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ社、韓国）０．４ｍｇ、及びホスファチジルエタノールアミン（ブタ肝臓ホスファチジルエタノールアミン；ＰＥ；ＤＯＯＳＡＮ Ｓｅｒｄａｒｙ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ社、韓国）１．０ｍｇをそれぞれ試験管に採取し、エバポレーターにて溶媒であるクロロフォルムを蒸発させた後、蒸留水を添加し１分間激しく撹拌した後、６０℃で１０分間超音波処理を行って調製したホスファチジルセリン、ホスファチジルコリン及びホスファチジルエタノールアミンの組成比が３：２：５（すなわち、３０％（Ｗ／Ｖ）：２０％（Ｗ／Ｖ）：５０％（Ｗ／Ｖ））のリン脂質を、７．５μＭの濃度となるように含有させた。〔なお、このホスファチジルセリン、ホスファチジルコリン及びホスファチジルエタノールアミンの組成比が３：２：５のリン脂質を、以下「リン脂質（ＰＳ：ＰＣ：ＰＥ＝３：２：５）」ということがある。〕
The phospholipids were phosphatidylserine (porcine brain phosphatidylserine; PS; DOOSSAN Serial Research Laboratories, Korea) 0.6 mg, phosphatidylcholine (porcine liver phosphatidylcholine; PC; DOOSAN Secondary Research Laboratories, Korea) 0.4 mg, 1.0 mg of ethanolamine (porcine liver phosphatidylethanolamine; PE; DOOSAN Serial Research Laboratories, Korea) was collected in a test tube, and after evaporation of chloroform as a solvent with an evaporator, distilled water was added for 1 minute. Phosphatidyl prepared by vigorous stirring and sonication at 60 ° C. for 10
２．試料
前記のＩの２の（１）〜（４）の各試料を、試料として用いた。
2. Samples Each of the samples I (2) (1) to (4) was used as a sample.
３．試料中の総プロテインＳの活性値の測定及び算出
各試料の総プロテインＳの活性値の測定は、日立ハイテクノロジーズ社（日本国）の７１７０Ｓ形汎用自動分析装置を使用して行った。
3. Measurement and Calculation of Activity Value of Total Protein S in Sample Measurement of the activity value of total protein S in each sample was performed using a 7170S type general-purpose automatic analyzer of Hitachi High-Technologies Corporation (Japan).
（１）前記２の試料それぞれについて、前記１の（１）の希釈液により希釈倍率１５倍で希釈を行った。 (1) About each of said 2 samples, it diluted with the dilution rate of 15 times with the dilution liquid of said (1).
（２）前記（１）で希釈した試料２．０μＬに、前記１の（２）の第１試薬の９８μＬを添加し、３７℃で１．４分間反応させた。 (2) To 2.0 μL of the sample diluted in (1) above, 98 μL of the first reagent in (1) above was added and reacted at 37 ° C. for 1.4 minutes.
（３）次に、前記１の（３）の第２試薬の２０μＬを添加し、３７℃で８．３分間反応させた。 (3) Next, 20 μL of the second reagent of (1) above was added and reacted at 37 ° C. for 8.3 minutes.
（４）次に、前記１の（４）の第３試薬の２３６μＬを添加し、３７℃で反応させた。 (4) Next, 236 μL of the third reagent of (1) above was added and reacted at 37 ° C.
（５）前記（４）における第３試薬の添加の後、主波長４０５ｎｍ及び副波長５０５ｎｍにおける吸光度の変化を１２、３分間測定した。 (5) After the addition of the third reagent in the above (4), the change in absorbance at the main wavelength of 405 nm and the sub wavelength of 505 nm was measured for 12 or 3 minutes.
４．試料中の総プロテインＳの活性値の算出
前記３の（５）において測定した第３試薬添加後の吸光度変化（反応のタイムコース）の値を微分して、試料中の総プロテインＳの活性値を求めた。
4). Calculation of the activity value of total protein S in the sample The activity value of total protein S in the sample is obtained by differentiating the value of the change in absorbance (reaction time course) after addition of the third reagent measured in (3) above. Asked.
なお、予め、総プロテインＳ活性値が既知の試料について、前記３の通り測定を行い、測定した第３試薬添加後の吸光度変化（反応のタイムコース）の１分間当りの吸光度変化量を時間に対して直線式（微分直線）を求め、この直線の傾きをこの既知の総プロテインＳ活性値に対してプロットして検量線を作成した。 In addition, a sample with a known total protein S activity value is measured in advance as described above, and the amount of change in absorbance per minute of the change in absorbance (reaction time course) after addition of the measured third reagent is measured as time. On the other hand, a linear equation (differential line) was obtained, and a calibration curve was prepared by plotting the slope of this straight line against this known total protein S activity value.
そして、前記２の試料を前記３の通り測定を行って得た、第３試薬添加後の吸光度変化（反応のタイムコース）の１分間当りの吸光度変化量を、時間に対して直線式（微分直線）を求め、この直線の傾きを前記の検量線に当てはめて、試料中の総プロテインＳの活性値を算出した。
すなわち、測定により得られた吸光度より吸光度変化の加速度（吸光度の二次微分値）を求め、検量線に当てはめることにより、試料中の総プロテインＳの活性値を算出した。
Then, the absorbance change amount per minute of the absorbance change (reaction time course) after the addition of the third reagent, obtained by measuring the sample of 2 as described in 3 above, is expressed linearly (differentiated) with respect to time. A straight line) was obtained, and the slope of this straight line was applied to the calibration curve to calculate the activity value of total protein S in the sample.
That is, the acceleration of change in absorbance (second derivative of absorbance) was obtained from the absorbance obtained by measurement, and applied to a calibration curve to calculate the activity value of total protein S in the sample.
なお、本特許出願の明細書及び図面においては、精製ヒトプロテインＳ（Ｅｎｚｙｍｅ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，Ｉｎｃ社、米国）の１μｇ／ｍＬが有する総プロテインＳ活性値を、総プロテインＳ活性値１μｇ／ｍＬ当量と定義した。
よって、本特許出願の明細書及び図面においては、総プロテインＳの活性は、「μｇ／ｍＬ当量」を用いて表している。
In the specification and drawings of this patent application, the total protein S activity value of 1 μg / mL of purified human protein S (Enzyme Research Laboratories, Inc., USA) is expressed as the total protein S activity value of 1 μg / mL equivalent. Defined.
Therefore, in the specification and drawings of this patent application, the activity of total protein S is expressed using “μg / mL equivalent”.
この試料中の総プロテインＳの活性値の測定を行って得られた結果を図７に示した。 The results obtained by measuring the activity value of total protein S in this sample are shown in FIG.
ＩＩＩ．測定結果
１．図の説明
前記Ｉにおける試料中の総プロテインＳのタンパク質量の測定結果と、前記ＩＩにおける試料中の総プロテインＳの活性値の測定結果とを比較する図を、図７として示した。
III. Measurement result 1. FIG. 7 is a diagram comparing the measurement result of the protein amount of the total protein S in the sample in I with the measurement result of the activity value of the total protein S in the sample in II.
この図において、横軸（ｘ）は前記Ｉの本発明による試料中の総プロテインＳのタンパク質量の測定結果を表す。この測定値の単位は「μｇ／ｍＬ」である。
また、この図において、縦軸（ｙ）は前記ＩＩにおける比色法による試料中の総プロテインＳの活性測定方法及び活性測定試薬による試料中の総プロテインＳの活性値の測定結果を表す。この測定値の単位は「μｇ／ｍＬ当量」である。
In this figure, the horizontal axis (x) represents the measurement result of the protein amount of total protein S in the sample according to the present invention of I above. The unit of this measured value is “μg / mL”.
In this figure, the vertical axis (y) represents the total protein S activity measurement method in the sample by the colorimetric method in II and the measurement result of the total protein S activity value in the sample by the activity measurement reagent. The unit of this measured value is “μg / mL equivalent”.
２．健常人の試料の比較
前記Ｉの本発明による総プロテインＳのタンパク質量の測定結果と、前記ＩＩの比色法による総プロテインＳの活性値の測定結果との比較を、次のようにして行った。
2. Comparison of Healthy Person Samples The measurement result of the total protein S according to the present invention of the above I and the measurement result of the activity value of the total protein S by the colorimetric method of the above II were compared as follows. It was.
試料が健常人２１１名の血漿である場合について、前記Ｉの総プロテインＳのタンパク質量の測定結果と、前記ＩＩの総プロテインＳの活性値の測定結果より、プロテインＳの比活性（総プロテインＳ活性値／総プロテインＳタンパク質量）を求めた。 When the sample is plasma of 211 healthy individuals, the specific activity of protein S (total protein S) is determined from the measurement result of the total protein S of I and the measurement value of the activity of total protein S of II. Activity value / total protein S protein amount) was determined.
この健常人２１１名の血漿の試料のプロテインＳの比活性の平均値と標準偏差（以下、ＳＤということがある）を算出し、平均±２ＳＤ（０．９８±０．２６）の範囲を求めた。
この範囲を外れる試料が１０あったので、この１０の試料を除外した健常人２０１名の試料について、再度、総プロテインＳのタンパク質量の測定結果と、総プロテインＳの活性値の測定結果より求めたプロテインＳの比活性（総プロテインＳ活性値／総プロテインＳタンパク質量）の平均値と標準偏差を算出し、平均±２ＳＤ（０．９９±０．２０）の範囲と平均±３ＳＤ（０．９９±０．３０）の範囲を求めた。
The average value and standard deviation (hereinafter sometimes referred to as SD) of the specific activity of protein S in the plasma samples of 211 healthy individuals were calculated, and the average ± 2SD (0.98 ± 0.26) range was obtained. It was.
Since there were 10 samples out of this range, 201 samples of healthy persons excluding these 10 samples were obtained again from the measurement result of the protein amount of total protein S and the measurement result of the activity value of total protein S. The average value and standard deviation of the specific activity of protein S (total protein S activity value / total protein S protein amount) were calculated, and the range of mean ± 2SD (0.99 ± 0.20) and mean ± 3SD (0. 99 was determined range of ± 0.30).
なお、この図は、各々の試料について、試料中の総プロテインＳの活性値を総プロテインＳのタンパク質量で除した比活性を表すものでもある。 In addition, this figure also represents the specific activity which divided | segmented the activity value of the total protein S in a sample by the protein amount of the total protein S about each sample.
この図において、比活性の平均値であるｙ＝０．９９ｘの式の線を実線で表した。
また、この式ｙ＝０．９９ｘの上及び下に、平均±２ＳＤを示す線（ｙ＝１．１９ｘ、及びｙ＝０．７９ｘ）を破線でこの図に表した。
そして、この式ｙ＝０．９９ｘの線の上に平均＋３ＳＤを示す線（ｙ＝１．２９ｘ）を点線で、またこの式ｙ＝０．９９ｘの線の下に平均−３ＳＤを示す線（ｙ＝０．６９ｘ）を実線でこの図に表した。
In this figure, the line of the equation y = 0.99x, which is the average value of specific activity, is represented by a solid line.
In addition, lines (y = 1.19x and y = 0.79x) indicating the mean ± 2SD above and below the formula y = 0.99x are represented by broken lines in this figure.
A line indicating the average + 3SD (y = 1.29x) is a dotted line on the line of the equation y = 0.99x, and a line indicating the average −3SD is below the line of the equation y = 0.99x ( y = 0.69x) is represented in this figure by a solid line.
健常人２１１名の血漿の試料の測定結果において、この図７で、前記のｙ＝０．６９ｘ（平均−３ＳＤ）の線よりも下に外れるものが、７つ認められた。
すなわち、総プロテインＳの活性値を総プロテインＳのタンパク質量で除した比活性が０．６９以下の試料が、７つ認められた。
In the measurement results of the plasma samples of 211 healthy people, seven cases were found in this FIG. 7 that fall below the line of y = 0.69x (average-3SD).
That is, seven samples having a specific activity of 0.69 or less obtained by dividing the activity value of total protein S by the protein amount of total protein S were observed.
これらの比活性が０．６９以下の７つの試料のうち、すなわち総プロテインＳの活性値と総プロテインＳのタンパク質量が大きく乖離している７の試料のうち、同意が得られた３つの試料についてプロテインＳ遺伝子の塩基配列を調べたところ、これらの３つの試料のいずれもプロテインＳ遺伝子のＰＳ−Ｋ１５５Ｅ変異（プロテインＳの異常症の一つ）であることが判明した。〔図７において、これらの３つの試料に矢印（↓又は↑）を付した。〕 Of these seven samples with a specific activity of 0.69 or less, that is, among the seven samples in which the activity value of total protein S and the amount of protein of total protein S are significantly different, three samples for which consent was obtained When the nucleotide sequence of the protein S gene was examined, it was found that all of these three samples were PS-K155E mutations (one of protein S abnormalities) of the protein S gene. [In FIG. 7, arrows (↓ or ↑) are attached to these three samples. ]
このことより、試料中の総プロテインＳのタンパク質量及び試料中の総プロテインＳの活性値を測定し、この測定により得た総プロテインＳのタンパク質量と総プロテインＳの活性値とを、比活性を求める等により比較することにより、プロテインＳの遺伝子の変異等のプロテインＳの異常症を検出することが出来ることが確かめられた。 From this, the protein amount of the total protein S in the sample and the activity value of the total protein S in the sample were measured, and the protein amount of the total protein S and the activity value of the total protein S obtained by this measurement were determined as the specific activity. It was confirmed that abnormalities of protein S such as mutations in the protein S gene can be detected by comparing the values obtained by, for example.
３．プロテインＳの遺伝子変異（プロテインＳの異常症）であることが判明している試料の比較
前記Ｉの２の（２）〜（４）のプロテインＳの遺伝子変異（プロテインＳの異常症）であることが判明している試料（計９名の試料）のそれぞれについて、前記Ｉの本発明による総プロテインＳのタンパク質量の測定結果と、前記ＩＩの比色法による総プロテインＳの活性値の測定結果との比較を行う。
3. Comparison of samples known to be protein S gene mutation (Protein S abnormality) Protein S gene mutation (Protein S abnormality) of I-2 (2) to (4) For each of the known samples (total of 9 samples), the measurement result of the protein amount of the total protein S according to the present invention of I and the measurement of the activity value of the total protein S by the colorimetric method of II Compare with results.
図７において、前記Ｉの２の（２）のプロテインＳの遺伝子変異であるＰＳ−Ｋ１５５Ｅヘテロ接合体（プロテインＳの異常症の一つ）であることが判明している７名の血漿の試料を「●」で示した。
また、前記Ｉの２の（３）のプロテインＳの遺伝子変異であるＰＳ−Ｋ１５５Ｅホモ接合体（プロテインＳの異常症の一つ）であることが判明している１名の血漿の試料を「◆」で示した。
そして、前記Ｉの２の（４）のプロテインＳの遺伝子変異であるＣ２０６Ｆヘテロ接合体（プロテインＳの異常症の一つ）であることが判明している１名の血漿の試料を「□」で示した。
In FIG. 7, seven plasma samples that have been found to be PS-K155E heterozygotes (one of the abnormalities of protein S), which is a gene mutation of protein S of 2 (2) of I above Is indicated by “●”.
In addition, a plasma sample of one person who has been found to be a PS-K155E homozygote (one of protein S abnormalities), which is a protein S gene mutation of 2 (3) of I above, is referred to as “ ◆ ".
Then, one of the plasma samples known to be a C206F heterozygote (one of protein S abnormalities), which is a protein S gene mutation of I-2 (4) above, is indicated by “□”. It showed in.
プロテインＳの遺伝子変異であることが判明しているこれらの９つの試料（●、◆及び□）はいずれも、前記の図７におけるｙ＝０．６９ｘ（平均−３ＳＤ）の線よりも下に外れていることが分かる。
すなわち、プロテインＳの遺伝子変異であることが判明しているこれらの９つの試料（●、◆及び□）はいずれも、総プロテインＳの活性値を総プロテインＳのタンパク質量で除した比活性が０．６９以下であることが分かる。
つまり、これらの９つの試料は、総プロテインＳの活性値と総プロテインＳのタンパク質量が大きく乖離していることが分かる。
All of these nine samples (●, ◆, and □) that have been found to be protein S gene mutations are below the y = 0.69x (average −3 SD) line in FIG. You can see that it is off.
That is, all of these nine samples (●, ◆, and □) that have been found to be protein S gene mutations have specific activities obtained by dividing the activity value of total protein S by the amount of protein of total protein S. It turns out that it is 0.69 or less.
That is, it can be seen that these nine samples have a large difference between the activity value of total protein S and the protein amount of total protein S.
よって、試料中の総プロテインＳのタンパク質量及び試料中の総プロテインＳの活性値を測定し、この測定により得た総プロテインＳのタンパク質量と総プロテインＳの活性値とを、比活性を求める等により比較することにより、プロテインＳの遺伝子の変異等のプロテインＳの異常症を検出することが出来ることが、これらのプロテインＳの遺伝子変異の９つの試料の比較結果からも確かめられた。 Therefore, the protein amount of the total protein S in the sample and the activity value of the total protein S in the sample are measured, and the specific activity is obtained from the protein amount of the total protein S and the activity value of the total protein S obtained by this measurement. It was also confirmed from the comparison results of nine samples of these protein S gene mutations that protein S abnormalities such as protein S gene mutations can be detected by comparing the above.
本発明の試料中の総プロテインＳタンパク質量の測定試薬及び測定方法は、試料中に存在する全てのプロテインＳ〔プロテインＳとＣ４ｂ結合タンパク質との複合体（結合型）、及び遊離のプロテインＳ（遊離型）〕についてそのタンパク質量を、すなわち、総プロテインＳのタンパク質量を測定することが出来るものである。
よって、本発明により総プロテインＳタンパク質量を求めた試料について、別途総プロテインＳの活性値を求め、その試料におけるプロテインＳの比活性（活性値／タンパク質量）を算出することにより、プロテインＳの異常症を検出することができる。
The reagent and method for measuring the total protein S protein amount in the sample of the present invention include all the protein S [complex of protein S and C4b binding protein (bound type), and free protein S ( Free protein), that is, the protein amount of total protein S can be measured.
Therefore, for the sample for which the total protein S protein amount was obtained according to the present invention, the activity value of total protein S was separately obtained, and the specific activity of protein S (activity value / protein amount) in the sample was calculated. Abnormalities can be detected.
すなわち、本発明の試料中の総プロテインＳタンパク質量の測定試薬及び測定方法を用いることにより、プロテインＳの異常症を検出し、血栓症等の疾患の予防、診断及び治療等に役立てることができる。 That is, by using the measuring reagent and measuring method for the total protein S protein amount in the sample of the present invention, protein S abnormality can be detected and used for the prevention, diagnosis and treatment of diseases such as thrombosis. .
Claims (5)
（ａ）試料と、Ｃ４ｂ結合タンパク質とを混合し、接触させ、この混合液中において前記試料に含まれる遊離のプロテインＳとＣ４ｂ結合タンパク質との複合体を形成させる工程。
（ｂ）前記混合液をプロテインＳに対する抗体を固定化した担体粒子と接触させ、前記抗体とプロテインＳとＣ４ｂ結合タンパク質との複合体との抗原抗体反応により生成した凝集物を測定する工程。 The carrier particles on which the antibody against protein S is immobilized are brought into contact with the sample, and aggregates produced by the antigen-antibody reaction between the antibody and protein S contained in the sample are measured, whereby the total protein S in the sample is measured. A method for measuring a protein amount, comprising the following steps (a) and (b): A method for measuring the total protein S protein amount in a sample.
(A) A step of mixing a sample and a C4b binding protein, bringing them into contact with each other, and forming a complex of free protein S and C4b binding protein contained in the sample in the mixed solution.
(B) A step of contacting the mixed solution with carrier particles on which an antibody against protein S is immobilized, and measuring an aggregate produced by an antigen-antibody reaction between the antibody, a complex of protein S and a C4b binding protein.
（ａ）試料と、Ｃ４ｂ結合タンパク質とを混合し、接触させ、この混合液中において前記試料に含まれる遊離のプロテインＳとＣ４ｂ結合タンパク質との複合体を形成させる工程。
（ｂ）前記混合液をプロテインＳに対する抗体を固定化した担体粒子と接触させ、前記抗体とプロテインＳとＣ４ｂ結合タンパク質との複合体との抗原抗体反応により生成した凝集物を測定する工程。 The reagent for measuring the amount of total protein S protein in a sample according to claim 3 or 4 , which is used for measuring the amount of total protein S protein in the sample including the following steps (a) and (b).
(A) A step of mixing a sample and a C4b binding protein, bringing them into contact with each other, and forming a complex of free protein S and C4b binding protein contained in the sample in the mixed solution.
(B) A step of contacting the mixed solution with carrier particles on which an antibody against protein S is immobilized, and measuring an aggregate produced by an antigen-antibody reaction between the antibody, a complex of protein S and a C4b binding protein.
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