JP4585708B2 - Method and reagent for measuring substance forming complex - Google Patents

Description

【０００８】
このプロテインＳの測定法の一つとして、最近、Ｂ．Ｄａｈｌｂｅａｃｋらが、下記の方法を示した。〔Ｔｈｒｏｍｂ．Ｈａｅｍｏｓｔ．，７９巻，７６７〜７７２頁，１９９８年、及びＷＯ９８／２３９６３号公報〕
【０００９】
（１） まず、Ｃ４ｂ結合タンパク質をウェルに固定化したマイクロプレートに、試料であるヒト血漿を室温下で接触させて、マイクロプレートに固定化したＣ４ｂ結合タンパク質に試料中のプロテインＳを特異的に結合させて、「プロテインＳ−Ｃ４ｂ結合タンパク質−マイクロプレート」の結合によりプロテインＳをマイクロプレートに間接的に固定化させた後に洗浄し、固定化されない成分を除去する。
【００１０】
（２） その後、プロテインＳに対するマウス抗体（抗プロテインＳ・マウスモノクローナル抗体）にホースラディッシュ由来のパーオキシダーゼ（ＰＯＤ）を標識化させたパーオキシダーゼ標識抗プロテインＳ・マウスモノクローナル抗体を、前記（１）の操作を行ったマイクロプレートのウェルに室温下で接触させることによりプロテインＳに特異的に結合させて、「パーオキシダーゼ標識抗プロテインＳ・マウスモノクローナル抗体−プロテインＳ−Ｃ４ｂ結合タンパク質−マイクロプレート」の結合を形成させた後洗浄し、結合しなかった遊離のパーオキシダーゼ標識抗プロテインＳ・マウスモノクローナル抗体を除去する。
【００１１】
（３） ここに、１，２−フェニレンジアミン（ＯＰＤ）と過酸化水素を添加し、標識パーオキシダーゼの酸化触媒作用によりロイコ型色素を室温下で生成させ、このロイコ型色素の発色、又はその吸光度を測定することにより、試料中におけるプロテインＳの存在の有無、又は濃度を知ることができるものである。（図１８を参照願います。）
【００１２】
この測定方法は、担体に固相化した測定対象物質のリガンドと、酵素で標識化した測定対象物質に対する抗体とで、測定対象物質を「サンドイッチ」して測定を行うものであるので、担体に固相化した測定対象物質に対する抗体（又は抗原）と、酵素で標識化した測定対象物質に対する抗体（又は抗原）とで、測定対象物質を「サンドイッチ」して測定を行うＥＬＩＳＡ法（enzyme-linked immunosorbent assay；固相酵素免疫測定法）のサンドイッチ法の変法と考えることができるが、Ｄａｈｌｂｅａｃｋらは上記の測定方法をＥＬＳＡ法（enzyme-linked ligandsorbent assay）と称している。
【００１３】
しかしながら、本発明者らは、以上のような測定方法にも下記のような重大な問題点があることに気付いた。
それは、測定対象物質のプロテインＳだけではなく、プロテインＳ−Ｃ４ｂ結合タンパク質複合体も測り込んでしまい、プロテインＳの測定値に正の誤差が生じてしまうことである。
【００１４】
プロテインＳ−Ｃ４ｂ結合タンパク質複合体は、マイクロプレートに固定化されたＣ４ｂ結合タンパク質にはもう結合することができないので、本来はＤａｈｌｂｅａｃｋらの測定法では、測定されない（シグナルが出ない）はずである。
【００１５】
しかしながら、プロテインＳ−Ｃ４ｂ結合タンパク質複合体の精製品を試料として測定した場合、プロテインＳの精製品を試料とした時と同じようにシグナルが生成し、測定された。
【００１６】
すなわち、試料中のプロテインＳの測定を、Ｄａｈｌｂｅａｃｋらの測定法で行った場合、試料中に含まれるプロテインＳ−Ｃ４ｂ結合タンパク質複合体をも測り込んでしまい、正の誤差が生じた。
【００１７】
この理由は、次のような理由によるものと考える。
試料中に含まれていたプロテインＳが、マイクロプレートのウェルに固定化したＣ４ｂ結合タンパク質に結合すると、遊離状態のプロテインＳの反応液中における濃度は減少する。
【００１８】
そうすると、下記の反応の平衡が左に移動し、やはり試料中に含まれていたプロテインＳ−Ｃ４ｂ結合タンパク質複合体が解離して、プロテインＳとＣ４ｂ結合タンパク質がそれぞれ１分子ずつ生成する。
【００１９】
【化２】

【００２０】
ここでプロテインＳ−Ｃ４ｂ結合タンパク質複合体より生じたプロテインＳが、マイクロプレートに固定化したＣ４ｂ結合タンパク質に結合して固定化されることより、結果的にシグナルが生成してしまう。
【００２１】
以上のことより、試料中に含まれていたプロテインＳ−Ｃ４ｂ結合タンパク質複合体が、プロテインＳとして測り込まれてしまうため、プロテインＳの測定時に正誤差を生じてしまう。
【００２２】
以上、試料中のプロテインＳを前記のＤａｈｌｂｅａｃｋらが示したＥＬＳＡ法で測定する場合を例に説明したが、測定方法（測定原理）が、測定対象物質と測定対象物質に特異的に結合する物質との結合反応を利用して、試料中の測定対象物質の測定を行う方法（原理）のものであって、かつ、測定対象物質が、この測定対象物質と、測定対象物質とそのリガンドとの複合体の両方の物質が、試料中に共に含有されるものである場合には、いずれの場合でも同じ問題が生じる可能性がある。
【００２３】
つまり、試料中の測定対象物質の測定時に、測定対象物質とそのリガンドとの複合体が解離して測定対象物質とリガンドをそれぞれ生じる反応が起こり、この複合体の解離により生じた測定対象物質が測定対象物質に特異的に結合する物質と結合することにより、測定に正の誤差が生じてしまうという問題である。
【００２４】
【発明が解決しようとする課題】
本発明の課題は、前述の従来の測定法及び測定試薬が有する問題点の解決であり、すなわち、測定対象物質と測定対象物質に特異的に結合する物質との結合反応を利用して、試料中の測定対象物質の測定を行う方法及び測定試薬において、測定対象物質が、この測定対象物質と、測定対象物質とそのリガンドとの複合体の両方の物質が、試料中に共に含有されるものである場合に、測定対象物質とそのリガンドとの複合体が解離して生じる測定対象物質の測り込みによる正誤差の発生を防ぐことができ、試料中の測定対象物質を正確に測定することができる測定方法、及び測定試薬を提供することである。
【００２５】
【課題を解決するための手段】
本発明は、測定対象物質と測定対象物質に特異的に結合する物質との結合反応を利用して、試料中の測定対象物質の測定を行う方法において、測定対象物質が、この測定対象物質と、測定対象物質とそのリガンドとの複合体の両方の物質が、試料中に共に含有されるものである場合に、測定対象物質とそのリガンドとの複合体が解離して測定対象物質とリガンドをそれぞれ生じる反応を抑制する条件下で、測定対象物質と測定対象物質に特異的に結合する物質との結合反応を行わせることを特徴とする、試料中の測定対象物質の測定方法である。
【００２６】
なお、本発明の試料中の測定対象物質の測定方法においては、測定対象物質とそのリガンドとの複合体が解離して測定対象物質とリガンドをそれぞれ生じる反応を抑制する条件として、温度を一定の範囲内の温度とすることを挙げることができる。
【００２７】
この際、前記の一定の範囲内の温度としては、０〜１５℃の温度であることが好適である。
【００２８】
特に、一定の範囲内の温度が、０〜１０℃の温度であることが好適である。
【００２９】
また、本発明の試料中の測定対象物質の測定方法においては、測定対象物質とそのリガンドとの複合体が解離して測定対象物質とリガンドをそれぞれ生じる反応を抑制する条件として、ｐＨを一定の範囲内のｐＨとすることを挙げることができる。
【００３０】
この際、前記の一定の範囲内のｐＨとしては、ｐＨ７．１以下のｐＨであることが好適である。
【００３１】
更に、本発明の試料中の測定対象物質の測定方法においては、測定対象物質とそのリガンドとの複合体が解離して測定対象物質とリガンドをそれぞれ生じる反応を抑制する条件として、塩濃度を一定の範囲内の濃度とすることを挙げることができる。
【００３２】
この際、前記の一定の範囲内の塩濃度としては、２０ｍＭ以下の濃度、特に１０ｍＭ〜以下の濃度であることが好適である。
【００３３】
そして、本発明の試料中の測定対象物質の測定方法においては、測定対象物質が、プロテインＳであることが好適である。
【００３４】
また、本発明は、測定対象物質と測定対象物質に特異的に結合する物質との結合反応を利用して、試料中の測定対象物質の測定を行う測定試薬において、測定対象物質が、この測定対象物質と、測定対象物質とそのリガンドとの複合体の両方の物質が、試料中に共に含有されるものである場合に、測定対象物質とそのリガンドとの複合体が解離して測定対象物質とリガンドをそれぞれ生じる反応を抑制する条件下で、測定対象物質と測定対象物質に特異的に結合する物質との結合反応を行わせるようにしたことを特徴とする、試料中の測定対象物質の測定試薬である。
【００３５】
なお、本発明の試料中の測定対象物質の測定試薬においては、測定対象物質とそのリガンドとの複合体が解離して測定対象物質とリガンドをそれぞれ生じる反応を抑制する条件として、温度を一定の範囲内の温度とすることを挙げることができる。
【００３６】
この際、前記の一定の範囲内の温度としては、０〜１５℃の温度であることが好適である。
【００３７】
特に、一定の範囲内の温度が、０〜１０℃の温度であることが好適である。
【００３８】
更に、本発明の試料中の測定対象物質の測定試薬においては、測定対象物質とそのリガンドとの複合体が解離して測定対象物質とリガンドをそれぞれ生じる反応を抑制する条件として、ｐＨを一定の範囲内のｐＨとすることを挙げることができる。
【００３９】
この際、前記の一定の範囲内のｐＨとしては、ｐＨ７．１以下のｐＨであることが好適である。
【００４０】
そして、本発明の試料中の測定対象物質の測定試薬においては、測定対象物質とそのリガンドとの複合体が解離して測定対象物質とリガンドをそれぞれ生じる反応を抑制する条件として、塩濃度を一定の範囲内の濃度とすることを挙げることができる。
【００４１】
この際、前記の一定の範囲内の塩濃度としては、２０ｍＭ以下の濃度、特に１０ｍＭ以下の濃度であることが好適である。
【００４２】
また、本発明の試料中の測定対象物質の測定試薬においては、測定対象物質が、プロテインＳであることが好適である。
【００４３】
【発明の実施の形態】
本発明の試料中の測定対象物質の測定方法及び測定試薬は、測定対象物質とそのリガンドとの複合体が解離して測定対象物質とリガンドをそれぞれ生じる反応を抑制する条件下で、測定対象物質と測定対象物質に特異的に結合する物質（以下、特異的結合物質ということがある。）との結合反応を行わせることを特徴とするものである。
【００４４】
すなわち、下の反応式（１）における右から左への解離反応を抑制する条件下で、測定対象物質と特異的結合物質との結合反応〔反応式（２）〕を行わせることを特徴とするものである。
【００４５】
【化３】

【００４６】
本発明においては、測定対象物質とそのリガンドとの複合体が解離して測定対象物質とリガンドをそれぞれ生じる反応を抑制することができるのであれば、いかなる方法、手段であっても特に制限無く用いることができる。
【００４７】
例えば、この測定対象物質とそのリガンドとの複合体が解離して測定対象物質とリガンドをそれぞれ生じる反応を抑制する条件として、温度を一定の範囲内の温度とすることを挙げることができる。
【００４８】
この際、前記の一定の範囲内の温度としては、０〜１５℃の温度であることが好適である。
特に、一定の範囲内の温度が、０〜１０℃の温度であることが好適である。
【００４９】
また、前記の条件の例として、ｐＨを一定の範囲内のｐＨとすることを挙げることができる。
【００５０】
この際、前記の一定の範囲内のｐＨとしては、ｐＨ７．１以下のｐＨであることが好適である。
【００５１】
更に、前記の条件の例として、塩濃度（イオン強度）を一定の範囲内の濃度とすることを挙げることができる。
【００５２】
この際、前記の一定の範囲内の塩濃度（イオン強度）としては、２０ｍＭ以下の濃度、特に１０ｍＭ以下の濃度であることが好適である。
【００５３】
このようにして、測定対象物質とそのリガンドとの複合体が解離して測定対象物質とリガンドをそれぞれ生じる反応を抑制する条件下で、測定対象物質と特異的結合物質との結合反応を行わせることにより、以下のことを達成することができる。
【００５４】
また、測定試薬においては、このようにして、測定対象物質とそのリガンドとの複合体が解離して測定対象物質とリガンドをそれぞれ生じる反応を抑制する条件下で、測定対象物質と特異的結合物質との結合反応を行わせるように試薬の成分を選択、調整することにより、以下のことを達成することができる。
【００５５】
すなわち、測定時に、試料中に含有される測定対象物質が、特異的結合物質と結合することにより、測定反応系中では、遊離状態の測定対象物質の濃度が減少し、これにより下記の反応の平衡が左に移動して、測定対象物質とそのリガンドとの複合体が解離して測定対象物質が生成することを防ぐことができることである。
【００５６】
【化４】

【００５７】
これにより、試料中にもともと含有される測定対象物質だけを、下記の反応により特異的結合物質に結合させて、検出を行うことにより、測定対象物質とそのリガンドとの複合体が解離して生じる測定対象物質の測り込みを防止して、正確な試料中の測定対象物質の測定が行えるようになる。
【００５８】
【化５】

【００５９】
本発明の試料中の測定対象物質の測定方法、及び本発明の試料中の測定対象物質の測定試薬において、試料とは、測定対象物質を含有する可能性がある物質であって、そして、測定対象物質とそのリガンドとの複合体をも含有する可能性があるものである。
【００６０】
この試料として、例えば、生体試料（ヒト、動物、又は植物などに由来する試料）、食品、飲料、環境試料等を挙げることができる。
【００６１】
生体試料としては、例えば、血液、血清、血漿、唾液、汗、尿、糞便、精液、涙、髄液、腹水、羊水などの生体の液体；肝臓、心臓、脳、骨、毛髪、皮膚、爪、筋肉、神経組織などの臓器、組織、細胞などの抽出液；糞便の抽出液若しくは懸濁液、菌体などの抽出液、又は植物の抽出液等を挙げることができる。
【００６２】
食品としては、例えば、肉、魚介類、野菜、果物、若しくは加工食品などの抽出液又は懸濁液等を挙げることができる。
【００６３】
飲料としては、例えば、水道水、井戸水、又は牛乳等を挙げることができる。
環境試料としては、例えば、土壌、若しくは大気などの抽出液又は懸濁液、あるいは海水、河川水、湖沼水等を挙げることができる。
【００６４】
また、本発明の測定方法、及び測定試薬において、測定対象物質とは、試料中におけるその存在の有無、又は含有量（濃度）を測定しようとする物質であって、そして、この「測定対象物質」と、「測定対象物質とそのリガンドとの複合体」の両方の物質が試料中に共に含有される可能性がある物質のことである。
【００６５】
この測定対象物質として、例えば、心身の状態を反映する物質、疾患のマーカー物質、食品若しくは飲料の安全性、栄養などを示す物質、又は環境の状況を示す物質等を挙げることができる。
【００６６】
この測定対象物質をより具体的に例示すると、例えば、血液凝固・線溶系にかかわる物質を挙げることができる。
この例を以下に示す。〔カッコ〕内は、そのリガンドである。
プロテインＳ〔Ｃ４ｂ結合タンパク質〕等。
【００６７】
また、ホルモンを挙げることができる。
この例を以下に示す。〔カッコ〕内は、そのリガンドである。
総サイロキシン（Ｔ4）〔Ｔ4結合グロブリン、プレアルブミン、又はアルブミンなどの甲状腺ホルモン結合タンパク質〕、遊離サイロキシン（ＦＴ4）〔Ｔ4結合グロブリン、プレアルブミン、又はアルブミンなどの甲状腺ホルモン結合タンパク質〕、遊離トリヨードサイロニン（ＦＴ3）〔Ｔ4結合グロブリン、プレアルブミン、又はアルブミンなどの甲状腺ホルモン結合タンパク質〕、リバース・トリヨードサイロニン〔Ｔ4結合グロブリンなどの甲状腺ホルモン結合タンパク質〕、インスリン様成長因子（ＩＧＦ Ｉ、ＩＧＦ ＩＩ）〔ＩＧＦ結合タンパク質（ＩＧＦ−ＢＰ）〕、コルチコステロン〔コルチコステロイド結合タンパク質（ＣＢＧ）〕、性ホルモン結合グロブリン（ＳＨＢＧ）〔アルブミン、又はテストステロン〕等。
【００６８】
そして、電解質を挙げることができる。
この例を以下に示す。（カッコ）内は、そのリガンドである。
鉄（トランスフェリン）、銅（セルロプラスミン）、カルシウム（タンパク質）、ヨウ素（タンパク質）等。
【００６９】
更に、抗原、抗体等の免疫反応に関する物質を挙げることができる。
この例を以下に示す。（カッコ）内は、そのリガンドである。
補体Ｃ１ｑ〔免疫グロブリンとこれに対する抗原との免疫複合体〕等。
【００７０】
本発明における、測定対象物質と特異的結合物質との結合反応を利用して、試料中の測定対象物質の測定を行う方法及び測定試薬であるが、これは公知の免疫学的測定方法若しくは免疫学的測定試薬、又は遺伝子測定方法若しくは遺伝子測定試薬等を適用することができ、例えば、ラテックス凝集反応若しくは赤血球凝集反応などの間接凝集反応測定法、ラテックス比濁法、免疫比濁法、酵素免疫測定法若しくは発光免疫測定法などの標識免疫測定法、イムノクロマトグラフィー法、前記のＤａｈｌｂｅａｃｋらが示したＥＬＳＡ法、又は特開平９−２２９９３６号公報及び特開平１０−１３２８１９号公報などに記載された被検物質に対する特異的結合物質が固定され被覆された面を有する担体並びに被検物質に対する特異的結合物質が固定された粒子を用いる方法等を適用する測定方法及び測定試薬を挙げることができる。
【００７１】
本発明においては、前記の測定対象物質と特異的結合物質との結合反応を利用して、試料中の測定対象物質の測定を行う方法及び測定試薬において、測定対象物質とそのリガンドとの複合体が解離して測定対象物質とリガンドをそれぞれ生じる反応を抑制する条件下で、測定対象物質と特異的結合物質との結合反応を行わせるものである。
【００７２】
本発明の試料中の測定対象物質の測定を行う方法及び試料中の測定対象物質の測定試薬における、測定対象物質と特異的結合物質との結合反応としては、抗原と抗体の抗原抗体反応（免疫反応）、主にタンパク質よりなる物質とそのリガンドとの反応、糖とレクチンの反応、ヌクレオチド鎖とそれに相補的なヌクレオチド鎖の反応、又はレセプターとそれに対する物質の反応等、測定対象物質とこの測定対象物質に特異的な親和性を有し結合する物質（特異的結合物質）の間の反応を挙げることができる。
【００７３】
なお、本発明の試料中の測定対象物質の測定を行う方法及び試料中の測定対象物質の測定試薬キットにおいて、測定対象物質と特異的結合物質との結合反応は、複数種類のものを組み合わせて利用してもよい。
【００７４】
例えば、特異的結合物質が測定対象物質に対する抗体であり、この抗体と測定対象物質との抗原抗体反応（免疫反応）を利用して測定を行う場合は、遊離状態の前記抗体、マイクロタイタープレートなどの容器よりなる担体若しくはラテックス粒子などの粒子担体に固定化された前記抗体、又は酵素、蛍光物質、放射性同位体、発光物質、発光反応関連物質、若しくは粒子などに結合し標識化された前記抗体等と、測定対象物質との結合反応（抗原抗体反応、免疫反応）を、測定対象物質とそのリガンドとの複合体が解離して測定対象物質とリガンドをそれぞれ生じる反応を抑制する条件下で行わせる。
【００７５】
また、試料中の測定対象物質が抗体であって、特異的結合物質が測定対象物質である抗体にとっての抗原であり、この抗原と測定対象物質との抗原抗体反応（免疫反応）を利用して測定を行う場合は、遊離状態の前記抗原、マイクロタイタープレートなどの容器よりなる担体若しくはラテックス粒子などの粒子担体に固定化された前記抗原、又は酵素、蛍光物質、放射性同位体、発光物質、発光反応関連物質、若しくは粒子などに結合し標識化された前記抗原等と、測定対象物質との結合反応（抗原抗体反応、免疫反応）を、測定対象物質とそのリガンドとの複合体が解離して測定対象物質とリガンドをそれぞれ生じる反応を抑制する条件下で行わせる。
【００７６】
更に、特異的結合物質が試料中の測定対象物質にとってのリガンドであり、このリガンドと測定対象物質との特異的結合反応を利用して測定を行う場合は、マイクロタイタープレートなどの容器よりなる担体若しくはラテックス粒子などの粒子担体に固定化された前記リガンド、又は酵素、蛍光物質、放射性同位体、発光物質、発光反応関連物質、若しくは粒子などに結合し標識化された前記リガンド等と、測定対象物質との特異的結合反応を、測定対象物質とそのリガンド（前記リガンドと同種又は異種のリガンド）との複合体が解離して測定対象物質とリガンドをそれぞれ生じる反応を抑制する条件下で行わせる。
【００７７】
そして、試料中の測定対象物質とこの測定対象物質に特異的に結合する物質（特異的結合物質）との結合反応における、測定対象物質と競合する物質（競合物質；例えば、測定対象物質自体、測定対象物質の一部、又は測定対象物質の一部若しくは全部の誘導体）と測定対象物質との競合を利用して測定を行う場合は、測定対象物質又は競合物質と、特異的結合物質との特異的結合反応を、測定対象物質とそのリガンドとの複合体が解離して測定対象物質とリガンドをそれぞれ生じる反応を抑制する条件下で行わせる。
【００７８】
なお、本発明により、測定対象物質と特異的結合物質との結合反応を利用して、試料中の測定対象物質の測定を行う場合において、一度、測定対象物質とそのリガンドとの複合体が解離して測定対象物質とリガンドをそれぞれ生じる反応を抑制する条件下で、測定対象物質と特異的結合物質との結合反応を行わせ、その後、洗浄操作を行い除去すること等により測定反応系に測定対象物質とそのリガンドとの複合体が既に存在しなくなっている場合には、特異的結合物質に結合している測定対象物質に更に特異的結合物質（先の特異的結合物質と同種又は異種のもの）を反応させ、結合させるとしても、測定対象物質とそのリガンドとの複合体が解離して測定対象物質とリガンドをそれぞれ生じる反応を抑制する条件下で行わせる必要はない。
【００７９】
本発明の試料中の測定対象物質の測定試薬であるが、特異的結合物質などの試料中の測定対象物質の測定に必要な成分、及び測定対象物質とそのリガンドとの複合体が解離して測定対象物質とリガンドをそれぞれ生じる反応を抑制するための成分等よりなる試薬である。
【００８０】
この本発明の測定試薬は、その成分を分けた複数のものからなるものであってもよい。
【００８１】
◎ 本発明の測定を間接凝集反応測定法に適用して行う場合の説明
【００８２】
本発明の測定を、ラテックス凝集反応測定法、赤血球凝集反応測定法などの担体粒子の凝集形成により測定を行う間接凝集反応測定法に適用して行う場合について、以下例を挙げて説明を行う。
【００８３】
この測定の手順の一例を以下に示す。
【００８４】
▲１▼ 測定対象物質に特異的に結合する物質（第１特異的結合物質；例えば、抗体、抗原、リガンド等）を溶液収容部分に固定化した測定容器を用意し、この第１特異的結合物質を固定化した測定容器の溶液収容部分に一定量の試料を添加して接触させる。
これにより、試料中の測定対象物質と測定容器の溶液収容部分に固定化した第１特異的結合物質との結合反応を行わせる。
【００８５】
この際、試料中に含まれていた測定対象物質とそのリガンドとの複合体が解離して測定対象物質とリガンドをそれぞれ生じる反応を抑制する条件下で行わせる。
【００８６】
（例えば、前記の測定対象物質と測定容器の溶液収容部分に固定化された第１特異的結合物質との結合反応を、一定の範囲内の温度で行わせる。又は、前記の測定対象物質と測定容器の溶液収容部分に固定化された第１特異的結合物質との結合反応が、一定の範囲内のｐＨ、若しくは一定の範囲内の塩濃度（イオン強度）で行われるような成分の試薬を用いて行う等。）
【００８７】
▲２▼ この添加・接触と同時に又は一定時間のうちに、測定対象物質に特異的に結合する物質であって前記測定容器の溶液収容部分に固定化された第１特異的結合物質と同一又は異なる物質（第２特異的結合物質；例えば、抗体、抗原、リガンド等）が固定化された粒子担体の一定量をこの溶液収容部分に添加して接触させる。
【００８８】
▲３▼ そして、これをミキサー等で一定時間撹拌した後静置して、試料中に測定対象物質が存在する場合には「測定容器の溶液収容部分−第１特異的結合物質−測定対象物質−第２特異的結合物質−粒子担体」の結合を形成させる。
【００８９】
この時も、測定対象物質とそのリガンドとの複合体が解離して測定対象物質とリガンドをそれぞれ生じる反応を抑制する条件下で行わせる。
【００９０】
（例えば、前記の測定容器の溶液収容部分に第１特異的結合物質を介して固定化された測定対象物質と、粒子担体に固定化された第２特異的結合物質との結合反応を、一定の範囲内の温度で行わせる。又は、前記の測定容器の溶液収容部分に第１特異的結合物質を介して固定化された測定対象物質と、粒子担体に固定化された第２特異的結合物質との結合反応が、一定の範囲内のｐＨ、若しくは一定の範囲内の塩濃度（イオン強度）で行われるような成分の試薬を用いて行う等。）
【００９１】
▲４▼ 静置後、一定時間内にこの第２特異的結合物質を固定化した粒子担体の溶液収容部分内における像を目視により判定又はマイクロプレートリーダー等の測定装置により測定し、凝集像が検出できれば試料中に測定対象物質が存在すると判定し、凝集像が検出できなければ試料中に測定対象物質は存在しないと判定することにより、試料中の測定対象物質の測定を行う。
【００９２】
この測定においては、測定容器の溶液収容部分内壁と粒子担体が試料中の測定対象物質を介して、「測定容器溶液収容部分内壁−第１特異的結合物質−測定対象物質−第２特異的結合物質−粒子担体」と結合することにより、第２特異的結合物質を固定化した粒子担体の凝集像を得ることができるものである。
【００９３】
試料中の測定対象物質は、測定容器の溶液収容部分の内壁に固定化された第１特異的結合物質と、粒子担体に固定化した第２特異的結合物質の両方に結合するので、前記の結合を形成することができ、試料中の測定対象物質の量を反映した凝集像（測定容器の溶液収容部分の内壁面底部に広がった像、陽性像）が得られることになる。
【００９４】
これを図１９のＢに示した。
【００９５】
一方、試料中に測定対象物質が存在しない場合は、「第１特異的結合物質−測定対象物質−第２特異的結合物質」の結合が形成されることはなく、つまり「測定容器溶液収容部分内壁−第１特異的結合物質−測定対象物質−第２特異的結合物質−粒子担体」の結合は形成されないので、第２特異的結合物質を固定化した粒子担体は測定容器の溶液収容部分の内壁面上を転がり（滑り）落ちてしまい、凝集像は得られずに底部に収束した像（陰性像）が生じる。
【００９６】
これを図１９のＡに示した。
【００９７】
よって、これにより試料中の測定対象物質のみを選択的に測定することができることとなる。
【００９８】
なお、段階的に希釈した試料のそれぞれを測定した時の、粒子担体による凝集像が得られる最大の希釈倍数である凝集価を求めることにより、試料中に含まれる測定対象物質の量を確かめることができる。
【００９９】
この凝集価の測定は、常法に従って行えばよく、例えば、まず、第１特異的結合物質を固定化した測定容器（マイクロプレート等）のウェル等の溶液収容部分に試料を添加し、これを緩衝液等よりなる試料の希釈液で段階的に希釈してその希釈列を作る。
【０１００】
この際、測定対象物質とそのリガンドとの複合体が解離して測定対象物質とリガンドをそれぞれ生じる反応を抑制する条件下で行わせる。
【０１０１】
次に各溶液収容部分に第２特異的結合物質の抗体を固定化した粒子担体を添加し、混合撹拌する。
【０１０２】
この時も、測定対象物質とそのリガンドとの複合体が解離して測定対象物質とリガンドをそれぞれ生じる反応を抑制する条件下で行わせる。
【０１０３】
その後、静置してこの第２特異的結合物質を固定化した粒子担体による凝集の有無を判定又は測定し、凝集像が得られた最大の希釈倍数を凝集価として採用し、求めることができる。
【０１０４】
また、予め規定した希釈倍数で希釈した試料を本発明により測定し、この時の凝集の有無から試料中における測定対象物質の存在の有無を定性的に測定することもできる。
【０１０５】
なお、本発明による試料中の測定対象物質の測定においては、第２特異的結合物質を固定化する粒子担体として磁性粒子を用い、この第２特異的結合物質を固定化した粒子担体に磁力を作用させることにより短時間で凝集像を生じさせることができる、特開平４−２１６４６６号公報及び特開平４−２４２１６７号公報に記載されているような測定方法を適用することもできる。
【０１０６】
そして、本発明による試料中の測定対象物質の測定においては、まず第２特異的結合物質を固定化した粒子担体と試料を混合し接触させ、次いでこれを第１特異的結合物質を固定化した測定容器の溶液収容部分に添加して接触させ、「第１特異的結合物質−測定対象物質−第２特異的結合物質」の結合を形成させて、この結合により生じた第２特異的結合物質を固定化した粒子担体の凝集による凝集像の検出により、試料中の測定対象物質の測定を行うこともできる。
【０１０７】
この場合、粒子担体と試料を混合、接触させ反応させること、及びこれを測定容器の溶液収容部分に添加、接触させることを、測定対象物質とそのリガンドとの複合体が解離して測定対象物質とリガンドをそれぞれ生じる反応を抑制する条件下で行わせる。
【０１０８】
更に、本発明による試料中の測定対象物質の測定においては、第１特異的結合物質を固定化した測定容器の溶液収容部分に、予め第２特異的結合物質を固定化した粒子担体を存在させておき、この測定容器の溶液収容部分に試料を添加して接触させ、「第１特異的結合物質−測定対象物質−第２特異的結合物質」の結合を形成させて、この結合により生じた第２特異的結合物質を固定化した粒子担体の凝集による凝集像の検出により、試料中の測定対象物質を測定することもできる。
【０１０９】
この場合、粒子担体を存在させておいた測定容器の溶液収容部分に試料を添加、接触させ反応させることを、測定対象物質とそのリガンドとの複合体が解離して測定対象物質とリガンドをそれぞれ生じる反応を抑制する条件下で行わせる。
【０１１０】
本発明による試料中の測定対象物質の測定を間接凝集反応測定法により行う場合、測定容器としては、溶液を収容することができるものであれば、その種類、材質、形状等は特に制限されずに用いることができる。
【０１１１】
これは、赤血球やゼラチン粒子などを用いる粒子凝集反応測定法又はラテックス凝集反応測定法等の間接凝集反応測定法において一般的に測定に用いられている容器については、問題なく用いることができる。
【０１１２】
例えば、ガラス、ポリスチレン、ポリ塩化ビニル又はポリメタクリレートなどからなる試験管、マイクロプレート（マイクロタイタープレート）又はトレイ等を用いることができる。
【０１１３】
なお、測定容器の溶液収容部分（マイクロプレートのウェル等）の底面は、Ｕ型、Ｖ型又はＵＶ型等の底面中央から周辺にかけて傾斜をもつ形状であることが望ましい。
【０１１４】
粒子担体としては、一般に粒子凝集反応測定法又はラテックス凝集反応測定法等の間接凝集反応測定法に使用される粒子担体であれば特に制限無く用いることができる。
【０１１５】
例えば、ヒツジ赤血球等の動物赤血球、リポソーム、ラテックス、ゼラチン、ポリアクリルアミド、マイクロカプセル若しくはエマルジョン等の有機高分子物質よりなる粒子担体、ガラス、シリカゲル、カーボン若しくはベントナイト等の無機高分子物質よりなる粒子担体又はその他の人工担体等を挙げることができる。
【０１１６】
また、前記の高分子粒子担体を強磁性体で被覆又は粒子成型時に強磁性体を分散させて調製した磁性粒子担体等を用いることもできる。
【０１１７】
これらの粒子担体は、粒子径が０．０１〜１００μｍの範囲のものが好ましく、特に好ましくは０．５〜１０μｍのものである。
【０１１８】
また、これらの粒子担体の比重は、１〜１０の範囲が好ましく、特に好ましくは１〜２である。
【０１１９】
測定容器の溶液収容部分の内壁面又は粒子担体に、特異的結合物質を固定化させる方法は、物理的吸着法又は化学的結合法等の公知の方法を用いることができる。
【０１２０】
物理的吸着法による場合は、公知の方法に従い、緩衝液等に溶解した特異的結合物質を測定容器の溶液収容部分に添加し内壁面に接触させたり、又は特異的結合物質と粒子担体を緩衝液等の溶液中で混合し接触させること等により行うことができる。
【０１２１】
例えば、緩衝液等に溶解した特異的結合物質を測定容器の溶液収容部分に添加し内壁面に接触させ、又は特異的結合物質と粒子担体を緩衝液等の溶液中で混合し接触させ、これを約２℃〜約４０℃で約１０分〜約１日間行う。
【０１２２】
また、化学的結合法により行う場合には、日本臨床病理学会編「臨床病理臨時増刊特集第５３号 臨床検査のためのイムノアッセイ−技術と応用−」，臨床病理刊行会，１９８３年、日本生化学会編「新生化学実験講座１ タンパク質ＩＶ」，東京化学同人，１９９１年等に記載の公知の方法に従い、測定容器の溶液収容部分の内壁面又は粒子担体と特異的結合物質をグルタルアルデヒド、カルボジイミド、イミドエステル又はマレイミド等の二価性の架橋試薬と混合、接触させ、測定容器の溶液収容部分の内壁面、粒子担体、特異的結合物質のそれぞれのアミノ基、カルボキシル基、ＳＨ基、アルデヒド基又は水酸基等と反応させることにより固定化を行うことができる。
【０１２３】
更に非特異的反応を抑制するために処理を行う必要があれば、特異的結合物質を固定化させた測定容器の溶液収容部分の内壁面又は粒子担体を、ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）、カゼイン、ゼラチン、卵白アルブミン若しくはその塩などのタンパク質、界面活性剤又は脱脂粉乳等を接触させ被覆させること等の公知の方法により処理して、ブロッキング処理（マスキング処理）を行ってもよい。
【０１２４】
特異的結合物質を固定化した粒子担体を懸濁させる分散媒、又は試料の希釈液については、各種水系溶媒を用いることができる。
【０１２５】
例えば、精製水、生理食塩水又はトリス（ヒドロキシメチル）アミノメタン緩衝液、リン酸緩衝液若しくはリン酸緩衝生理食塩水などの各種緩衝液等の水系溶媒を用いることができる。なお、この緩衝液のｐＨについては、ｐＨ３〜１２の範囲内にあることが好ましい。
【０１２６】
また、特異的結合物質を固定化した粒子担体を懸濁させる分散媒、又は試料の希釈液には、ＢＳＡ、ヒト血清アルブミン、カゼイン若しくはその塩などのタンパク質、塩化ナトリウムなどの各種塩類、各種糖類、脱脂粉乳、正常ウサギ血清などの各種動物血清、アジ化ナトリウムなどの各種防腐剤又は非イオン性界面活性剤、両イオン性界面活性剤若しくは陰イオン性界面活性剤などの各種界面活性剤等を適宜添加して用いることができる。
【０１２７】
そして、これらを添加する際の濃度は特に限定されるものではないが、０．００１〜１０％（Ｗ／Ｖ）が好ましく、特に０．０１〜５％（Ｗ／Ｖ）が好ましい。
【０１２８】
なお、この各種界面活性剤としては、ソルビタン脂肪酸エステル、グリセリン脂肪酸エステル、デカグリセリン脂肪酸エステル、ポリオキシエチレンソルビタン脂肪酸エステル、ポリオキシエチレングリセリン脂肪酸エステル、ポリエチレングリコール脂肪酸エステル、ポリオキシエチレンアルキルエーテル、ポリオキシエチレンフィトステロール、フィトスタノール、ポリオキシエチレンポリオキシプロピレンアルキルエーテル、ポリオキシエチレンアルキルフェニルエーテル、ポリオキシエチレンヒマシ油、硬化ヒマシ油若しくはポリオキシエチレンラノリンなどの非イオン性界面活性剤、酢酸ベタインなどの両性界面活性剤又はポリオキシエチレンアルキルエーテル硫酸塩若しくはポリオキシエチレンアルキルエーテル酢酸塩などの陰イオン性界面活性剤等を挙げることができる。
【０１２９】
◎ 本発明の測定を標識物質を用いる測定法に適用して行う場合の説明
【０１３０】
本発明の測定を、ＥＬＩＳＡ法、ＥＬＳＡ法などの標識物質を用いる測定法に適用して行う場合について、以下例を挙げて説明を行う。
【０１３１】
この測定対象物質に特異的に結合する物質（特異的結合物質）に結合した標識物質、又は測定対象物質と競合する物質（競合物質）に結合した標識物質を検出し測定を行うことは、ＥＬＩＳＡ法などの酵素免疫測定法、蛍光免疫測定法、放射免疫測定法、若しくは発光免疫測定法などの標識物質を用いた免疫測定法、又は前述したＥＬＳＡ法等のサンドイッチ法、競合法、又は均一系法（ホモジニアス系法）等の手法により行うことができる。
【０１３２】
これらの標識物質を用いる測定法により測定を行う場合は、公知の方法の手順に従って行うことができるが、サンドイッチ法により測定を行う場合の一例を以下に示す。
【０１３３】
▲１▼ 測定対象物質に特異的に結合する物質（第１特異的結合物質；例えば、抗体、抗原、リガンド等）を固定化した固相担体を用意し、この固相担体の第１特異的結合物質を固定化した部分に一定量の試料を添加して一定時間接触させる。
【０１３４】
これにより、試料中に測定対象物質が存在する場合には、「固相担体−第１特異的結合物質−測定対象物質」の結合を形成させる。
【０１３５】
この際、試料中に含まれていた測定対象物質とそのリガンドとの複合体が解離して測定対象物質とリガンドをそれぞれ生じる反応を抑制する条件下で、結合形成反応を行わせる。
【０１３６】
（例えば、前記の測定対象物質と固相担体に固定化された第１特異的結合物質との結合反応を、一定の範囲内の温度で行わせる。又は、前記の測定対象物質と固相担体に固定化された第１特異的結合物質との結合反応が、一定の範囲内のｐＨ、若しくは一定の範囲内の塩濃度（イオン強度）で行われるような成分の試薬を用いて行う等。）
【０１３７】
▲２▼ この添加・接触と同時に、若しくは一定時間のうちに、又は洗浄の後に、測定対象物質に特異的に結合する物質であって前記固相担体に固定化した第１特異的結合物質と同一又は異なる物質（第２特異的結合物質；例えば、抗体、抗原、リガンド等）に酵素等の標識物質を結合させたものの一定量を、この固相担体の第１特異的結合物質を固定化した部分に添加して一定時間接触させる。
【０１３８】
この操作により、試料中に測定対象物質が存在する場合には、「固相担体−第１特異的結合物質−測定対象物質−第２特異的結合物質−標識物質」の結合を形成させる。
【０１３９】
この際も、洗浄を行ったとき以外は、試料中に含まれていた測定対象物質とそのリガンドとの複合体が解離して測定対象物質とリガンドをそれぞれ生じる反応を抑制する条件下で、結合形成反応を行わせる。
【０１４０】
（例えば、前記の固相担体に第１特異的結合物質を介して固定化された測定対象物質と、標識物質を結合した第２特異的結合物質との結合反応を、一定の範囲内の温度で行わせる。又は、前記の固相担体に第１特異的結合物質を介して固定化された測定対象物質と、標識物質を結合した第２特異的結合物質との結合反応が、一定の範囲内のｐＨ、若しくは一定の範囲内の塩濃度（イオン強度）で行われるような成分の試薬を用いて行う等。）
【０１４１】
〔洗浄を行った場合は、試料中に含まれていた測定対象物質とそのリガンドとの複合体が、洗浄除去されてしまっており、測定反応系に存在しないので、測定対象物質とそのリガンドとの複合体が解離して測定対象物質とリガンドをそれぞれ生じる反応を抑制する条件下で結合形成反応を行わせる必要がない。〕
【０１４２】
▲３▼ 次に、固相担体に結合していない未結合の「標識物質を結合した第２特異的結合物質」を洗浄分離する。（Ｂ／Ｆ分離）
【０１４３】
▲４▼ そして、「固相担体−第１特異的結合物質−測定対象物質−第２特異的結合物質−標識物質」の結合により固相担体に結合した標識物質を検出することにより、試料中の測定対象物質の測定を行う。
【０１４４】
この測定においては、固相担体と標識物質が試料中の測定対象物質を介して、「固相担体−第１特異的結合物質−測定対象物質−第２特異的結合物質−標識物質」と結合するので、固相担体に結合した標識物質の量を測定することにより試料中に含まれていた測定対象物質の有無、又は量を測定することができるものである。
【０１４５】
「固相担体−第１特異的結合物質−測定対象物質−第２特異的結合物質−標識物質」の結合により固相担体に結合した標識物質の検出であるが、酵素免疫測定法、又はＥＬＳＡ法等の標識物質として酵素を用いて測定を行う方法、測定試薬においては、標識酵素にその至適条件下で基質を反応させ、その反応生成物の量を反応生成物の吸光度を測るなどの光学的方法等により測定を行う。
【０１４６】
蛍光免疫測定法等の標識物質として蛍光物質を用いて測定を行う方法、測定試薬においては、標識蛍光物質による蛍光強度を測定することにより測定を行う。
【０１４７】
放射免疫測定法等の標識物質として放射性物質を用いて測定を行う方法、測定試薬においては、標識放射性物質による放射線量を測定することにより測定を行う。
【０１４８】
発光免疫測定法等の標識物質として発光反応に係わる物質を用いて測定を行う方法、測定試薬においては、標識物質が係わる発光反応系における発光量を測定することにより測定を行う。
【０１４９】
いずれの場合においても、標識物質を用いる測定法の公知の手法に従って、標識物質の検出を行うことができる。
【０１５０】
なお、本発明の試料中の測定対象物質の測定を標識物質を用いて行う場合には、まず酵素等の標識物質を結合した第２特異的結合物質と試料を混合し接触させ、次いでこれを第１特異的結合物質を固定化した固相担体の第１特異的結合物質を固定化した部分に添加して接触させ、「固相担体−第１特異的結合物質−測定対象物質−第２特異的結合物質−標識物質」の結合を形成させて、この結合により固相担体に結合した標識物質の量を測定することによって、試料中の測定対象物質の有無、又は量を測定することもできる。
【０１５１】
この場合には、標識物質を結合した第２特異的結合物質と試料を混合、接触させ反応させる際、及び、次にこの混合物を固相担体の第１特異的結合物質を固定化した部分に添加、接触させ反応させる際に、試料中に含まれていた測定対象物質とそのリガンドとの複合体が解離して測定対象物質とリガンドをそれぞれ生じる反応を抑制する条件下で反応を行わせる。
【０１５２】
また、本発明の試料中の測定対象物質の測定を標識物質を用いて行う場合に、第１特異的結合物質を固定化した固相担体上に、予め酵素等の標識物質を結合させた第２特異的結合物質を存在させておき、この固相担体に試料を添加して接触させ、「固相担体−第１特異的結合物質−測定対象−第２特異的結合物質−標識物質」の結合を形成させて、この結合により固相担体に結合した標識物質を測定することにより、試料中の測定対象物質の有無、又は量を測定することもできる。
【０１５３】
ここでは、標識物質を結合させた第２特異的結合物質を存在させておいた固相担体に、試料を添加、接触させ反応させる際に、試料中に含まれていた測定対象物質とそのリガンドとの複合体が解離して測定対象物質とリガンドをそれぞれ生じる反応を抑制する条件下で反応を行わせる。
【０１５４】
そして、本発明の試料中の測定対象物質の測定を標識物質を用いて行う場合に、特開平１−１２３１４８号公報に記載されている、連続する一連の反応を触媒する２種類の酵素をそれぞれ別々に測定対象物質に特異的に結合する物質（特異的結合物質）と共に不溶性担体に結合した２種類の酵素標識物質を用いて、これらを特異的結合部位を二つ以上有する測定対象物質を介して近接させ連続した酵素反応により測定対象物質量を求める、均一系（ホモジニアス系）による特異的結合部位を有する物質の測定法に適用して測定を行うこともできる。
【０１５５】
例えば、第１特異的結合物質並びにグルコースオキシダーゼを結合したラテックス粒子等の不溶性担体、及び第２特異的結合物質並びにパーオキシダーゼを結合したラテックス粒子等の不溶性担体を用意し、これらに測定対象物質を含有すると推測される試料及びグルコースを混合し接触させ、測定対象物質を介して近接したグルコースオキシダーゼ及びパーオキシダーゼより生じた過酸化水素の量を、４−アミノアンチピリン等及びフェノール誘導体若しくはアニリン誘導体等を用いるトリンダー反応系により測定して、試料中に含まれている測定対象物質を均一系（ホモジニアス系）により測定することもできる。
【０１５６】
なお、ここで、第１特異的結合物質並びにグルコースオキシダーゼを結合したラテックス粒子等の不溶性担体、及び第２特異的結合物質並びにパーオキシダーゼを結合したラテックス粒子等の不溶性担体と、試料を混合、接触させて反応させる際に、試料中に含まれていた測定対象物質とそのリガンドとの複合体が解離して測定対象物質とリガンドをそれぞれ生じる反応を抑制する条件下で反応を行わせる。
【０１５７】
あるいは、本発明の試料中の測定対象物質の測定を標識物質を用いて行う場合に、第１特異的結合物質を固定化した固相担体、標識物質を結合させていない第２特異的結合物質、及び酵素等の標識物質を結合させた第２特異的結合物質に特異的に結合する物質を用いて、「固相担体−第１特異的結合物質−測定対象物質−第２特異的結合物質−第２特異的結合物質に特異的に結合する物質−標識物質」の結合を形成させて、固相担体に結合した標識物質を測定することにより、試料中の測定対象物質の有無、又は量を測定することもできる。
【０１５８】
ここで、固相担体の第１特異的結合物質を固定化した部分に試料を添加、接触させ反応させる際、及び、更にこれに第２特異的結合物質を添加、接触させ反応させる際に、試料中に含まれていた測定対象物質とそのリガンドとの複合体が解離して測定対象物質とリガンドをそれぞれ生じる反応を抑制する条件下で反応を行わせる。
【０１５９】
更に、酵素等の標識物質を結合させた第２特異的結合物質を過剰に添加し、その後、この標識物質を結合させた第２特異的結合物質の未結合のものの量を別に定量することにより、試料中の測定対象物質の量を測定することもできる。
【０１６０】
また、本発明による試料中の測定対象物質の測定においては、固相担体として磁性体よりなる物質又は磁性体を含む物質を用い、これに磁力を作用させて、Ｂ／Ｆ分離を磁気的に行うこともできる。
【０１６１】
本発明の試料中の測定対象物質の測定を標識物質を用いて行う場合、固相担体としては、特異的結合物質を固定化することができる担体であれば、その種類、材質、形状等を特に限定することなく使用することができる。
【０１６２】
これは、酵素免疫測定法、蛍光免疫測定法、放射免疫測定法、発光免疫測定法、又はＥＬＳＡ法などの標識物質を用いた免疫測定法等において、一般的に測定に用いられている担体については、問題なく用いることができる。
【０１６３】
例えば、ポリスチレン、ポリカーボネイト、ポリビニルトルエン、ポリプロピレン、ポリエチレン、ポリ塩化ビニル、ナイロン、ポリメタクリレート、ポリアクリルアミド、ラテックス、リポソーム、ゼラチン、アガロース、セルロース、セファロース、ガラス、金属、セラミックス又は磁性体等の材質よりなる粒子、マイクロカプセル、ビーズ、マイクロプレート、試験管、スティック又は試験片等の固相担体を用いることができる。
【０１６４】
また、前記の固相担体を強磁性体で被覆又は固相担体成型時に強磁性体を含有させて調製した磁性固相担体等を用いることもできる。
【０１６５】
標識物質を、特異的結合物質、又は測定対象物質等に結合させる方法は、化学的結合法等の公知の方法を用いることができる。
【０１６６】
この化学的結合法により行う場合には、日本臨床病理学会編「臨床病理臨時増刊特集第５３号 臨床検査のためのイムノアッセイ−技術と応用−」，臨床病理刊行会，１９８３年、日本生化学会編「新生化学実験講座１ タンパク質ＩＶ」，東京化学同人，１９９１年等に記載の公知の方法に従い、酵素、蛍光物質又は放射性物質等の標識物質と、特異的結合物質又は測定対象物質等を、グルタルアルデヒド、カルボジイミド、イミドエステル又はマレイミド等の二価性の架橋試薬と混合、接触させ、標識物質、特異的結合物質又は測定対象物質等のそれぞれのアミノ基、カルボシキル基、ＳＨ基、アルデヒド基又は水酸基等と反応させることにより結合を行うことができる。
【０１６７】
固相担体に、特異的結合物質、又は測定対象物質等を固定化させる方法は、物理的吸着法又は化学的結合法等の公知の方法を用いることができる。
【０１６８】
物理的吸着法による場合は、公知の方法に従い、緩衝液等に溶解した特異的結合物質若しくは測定対象物質等を、固相担体の固定化したい部分に添加し接触させたり、又は、特異的結合物質若しくは測定対象物質等と固相担体を、緩衝液等の溶液中で混合し接触させること等により行うことができる。
【０１６９】
例えば、緩衝液等に溶解した特異的結合物質若しくは測定対象物質等を、固相担体の固定化したい部分に添加し接触させ、又は、特異的結合物質若しくは測定対象物質等と固相担体を、緩衝液等の溶液中で混合し接触させ、これを約２℃〜約４０℃で約１０分〜約１日間行う。
【０１７０】
また、化学的結合法により行う場合には、日本臨床病理学会編「臨床病理臨時増刊特集第５３号 臨床検査のためのイムノアッセイ−技術と応用−」，臨床病理刊行会，１９８３年、日本生化学会編「新生化学実験講座１ タンパク質ＩＶ」，東京化学同人，１９９１年等に記載の公知の方法に従い、固相担体又は固相担体の固定化したい部分と、特異的結合物質又は測定対象物質等を、グルタルアルデヒド、カルボジイミド、イミドエステル又はマレイミド等の二価性の架橋試薬と混合、接触させ、固相担体、固相担体の固定化したい部分、特異的結合物質、又は測定対象物質等のそれぞれのアミノ基、カルボキシル基、ＳＨ基、アルデヒド基又は水酸基等と反応させることにより固定化を行うことができる。
【０１７１】
更に、非特異的反応を抑制するために処理を行う必要があれば、特異的結合物質又は測定対象物質等を固定化させた固相担体のこの固定化した部分を、ＢＳＡ、カゼイン、ゼラチン、卵白アルブミン若しくはその塩などのタンパク質、界面活性剤又は脱脂粉乳等を接触させ被覆させること等の公知の方法により処理して、ブロッキング処理（マスキング処理）を行ってもよい。
【０１７２】
標識物質を結合させた特異的結合物質若しくは測定対象物質等を溶解させる溶液、又は試料の希釈液については、各種水系溶媒を用いることができる。
【０１７３】
例えば、精製水、生理食塩水又はトリス（ヒドロキシメチル）アミノメタン緩衝液、リン酸緩衝液若しくはリン酸緩衝生理食塩水などの各種緩衝液等の水系溶媒を用いることができる。なお、この緩衝液のｐＨについては、ｐＨ３〜１２の範囲内にあることが好ましい。
【０１７４】
また、標識物質を結合させた特異的結合物質若しくは測定対象物質等を溶解させる溶液、又は試料の希釈液には、ＢＳＡ、ヒト血清アルブミン、カゼイン若しくはその塩などのタンパク質、塩化ナトリウムなどの各種塩類、各種糖類、脱脂粉乳、正常ウサギ血清などの各種動物血清、アジ化ナトリウムなどの各種防腐剤又は非イオン性界面活性剤、両イオン性界面活性剤若しくは陰イオン性界面活性剤などの各種界面活性剤等を適宜添加して用いることができる。
【０１７５】
そして、これらを添加する際の濃度は特に限定されるものではないが、０．００１〜１０％（Ｗ／Ｖ）が好ましく、特に０．０１〜５％（Ｗ／Ｖ）が好ましい。
【０１７６】
なお、この各種界面活性剤としては、ソルビタン脂肪酸エステル、グリセリン脂肪酸エステル、デカグリセリン脂肪酸エステル、ポリオキシエチレンソルビタン脂肪酸エステル、ポリオキシエチレングリセリン脂肪酸エステル、ポリエチレングリコール脂肪酸エステル、ポリオキシエチレンアルキルエーテル、ポリオキシエチレンフィトステロール、フィトスタノール、ポリオキシエチレンポリオキシプロピレンアルキルエーテル、ポリオキシエチレンアルキルフェニルエーテル、ポリオキシエチレンヒマシ油、硬化ヒマシ油若しくはポリオキシエチレンラノリンなどの非イオン性界面活性剤、酢酸ベタインなどの両性界面活性剤又はポリオキシエチレンアルキルエーテル硫酸塩若しくはポリオキシエチレンアルキルエーテル酢酸塩などの陰イオン性界面活性剤等を挙げることができる。
【０１７７】
標識物質としては、測定を酵素免疫測定法により行う場合には、パーオキシダーゼ（ＰＯＤ）、アルカリ性ホスファターゼ（ＡＬＰ）、β−ガラクトシダーゼ、ウレアーゼ、カタラーゼ、グルコースオキシダーゼ、乳酸脱水素酵素若しくはα−アミラーゼ等の酵素を、蛍光免疫測定法により行う場合には、フルオレセインイソチオシアネート、テトラメチルローダミンイソチオシアネート、置換ローダミンイソチオシアネート若しくはジクロロトリアジンイソチオシアネート等の蛍光物質を、そして放射免疫測定法により行う場合には、トリチウム、ヨウ素１２５又はヨウ素１３１等の放射性物質を用いることができる。
【０１７８】
また、測定を発光免疫測定法により行う場合には、アクリジニウムエステル、アルカリ性ホスファターゼ、パーオキシダーゼ又はグルコースオキシダーゼ等を標識物質として用い、アクリジニウムエステル系、ジオキセタン化合物系、ルミノール−過酸化水素−ＰＯＤ系又はＮＡＤＨ−ＦＭＮＨ_２ −ルシフェラーゼ系等により固相担体に結合した標識物質の検出を行うことができる。
【０１７９】
【実施例】
以下、本発明を、実施例、及び参考例により更に説明する。なお、本発明はこれらにより限定されるものではない。
【０１８０】
〔実施例１〕 種々の温度での、プロテインＳ−Ｃ４ｂ結合タンパク質複合体よりなる試料の、ＥＬＳＡ法・サンドイッチ法での測定
【０１８１】
ＥＬＳＡ法・サンドイッチ法による試料中のプロテインＳの測定方法（測定試薬）により、プロテインＳ−Ｃ４ｂ結合タンパク質複合体よりなる試料について測定を行う際の、試料とマイクロプレートのウェルに固定化されたＣ４ｂ結合タンパク質との反応を、種々の温度で行わせ測定を行った。
【０１８２】
（１） Ｃ４ｂ結合タンパク質固定化マイクロプレート試薬の調製
【０１８３】
▲１▼ Ｃ４ｂ結合タンパク質を、Ｂ．Ｄａｈｌｂｅａｃｋらの方法〔Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｊ．，２０９巻，８４７〜８５６頁，１９８３年〕に基づいて、ヒト血漿より調製した。
【０１８４】
▲２▼ この調製したＣ４ｂ結合タンパク質を、炭酸緩衝液（５０ｍＭ炭酸水素ナトリウム（ｐＨ９．６））に２．５μｇ／ｍＬとなるように溶解した。
これを、９６ウェル−マイクロプレート（「MODULE PLATE F8」（商品名）；ヌンク社製）の各ウェルに１ウェル当たり１００μＬずつ加え、４℃で一晩静置して、Ｃ４ｂ結合タンパク質のマイクロプレートのウェルへの固定化を行った。
【０１８５】
▲３▼ このマイクロプレートの各ウェルを、洗浄液〔０．０５％ツイーン２０（Tween20）を含む５０ｍＭリン酸緩衝生理食塩水（ｐＨ７．４）〕で３回洗浄した後、ブロッキング液〔「Ｂｌｏｃｋ Ａｃｅ」（商品名）（大日本製薬社製）を純水に溶解し、２５％の濃度としたもの〕を１ウェル当たり２５０μＬずつ加え、４℃で一晩静置することによりブロッキングを行い、その後再び洗浄液で洗浄した。
以上の操作により、Ｃ４ｂ結合タンパク質固定化マイクロプレート試薬の調製を行った。
【０１８６】
（２） パーオキシダーゼ標識抗プロテインＳ・モノクローナル抗体試薬の調製
【０１８７】
▲１▼ 本発明者らが、精製した遊離状態のプロテインＳを免疫抗原として、常法に従ってモノクローナル抗体の調製を行った。
プロテインＳのＣ４ｂ結合タンパク質との結合部位以外の部位に特異的に結合するモノクローナル抗体を産生するハイブリドーマのスクリーニングを行い、マウス／マウスのハイブリドーマ（９Ｈ６株）を得た。
【０１８８】
このハイブリドーマ（９Ｈ６株）より産生されたマウス抗プロテインＳ・モノクローナル抗体の５ｍｇを、０．５ｍＬのリン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ７．５）に溶解した。
これに、０．６ｍｇのＳ−アセチルメルカプトコハク酸無水物を溶解した０．０１ｍＬのＮ，Ｎ−ジメチルホルムアミドを加え、室温で３０分間インキュベートした。
【０１８９】
▲２▼ 次に、これに、０．１Ｍ ＥＤＴＡ水溶液の０．０２ｍＬ、１Ｍトリス（ヒドロキシメチル）アミノメタン緩衝液（ｐＨ７．０）の０．１ｍＬ、及び１Ｍヒドロキシルアミン塩酸緩衝液（ｐＨ７．０）の０．１ｍＬをそれぞれ加え、３０℃で３０分間インキュベートした。
その後、これを、５ｍＭ ＥＤＴＡを含む０．１Ｍリン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ６．０）で平衡化しておいた、セファデックスＧ−２５カラムでゲルろ過を行い、メルカプト・サクシニル化したマウス抗プロテインＳ・モノクローナル抗体を得た。
【０１９０】
▲３▼ ２ｍｇのパーオキシダーゼ（ＰＯＤ、又はＨＲＰ）〔ホースラディシュ由来；東洋紡績社製〕を、０．３ｍＬの０．１Ｍリン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ７．０）に溶解した。
これに、０．２５ｍｇのＮ−サクシミジル−６−マレイミドヘキサン酸を溶解したＮ，Ｎ−ジメチルホルムアミドを３０μＬ加えて、３０℃で６０分間インキュベートした。
【０１９１】
その後、これを、０．１Ｍリン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ６．０）で平衡化しておいた、セファデックスＧ−２５カラムでゲルろ過を行い、マレイミド化したパーオキシダーゼを得た。
【０１９２】
▲４▼ 前記▲２▼で調製したメルカプト・サクシニル化したマウス抗プロテインＳ・モノクローナル抗体の２．３ｍｇを、５ｍＭ ＥＤＴＡを含む０．１Ｍリン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ６．０）の０．２５ｍＬに溶解した。
これに、前記▲３▼で調製したマレイミド化したパーオキシダーゼの１．８ｍｇを０．２５ｍＬの０．１Ｍリン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ６．０）に溶解したものを添加した。
【０１９３】
この混合物を、３０℃で２０時間インキュベートした後、０．１Ｍリン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ６．５）で平衡化しておいた、ウルトラゲルＡｃＡ３４カラムでゲルろ過を行い、マウス抗プロテインＳ・モノクローナル抗体をパーオキシダーゼで標識した、パーオキシダーゼ標識抗プロテインＳ・モノクローナル抗体を得た。
【０１９４】
▲５▼ 前記▲４▼で得たパーオキシダーゼ標識抗プロテインＳ・モノクローナル抗体を、検体希釈液〔２５％の「Ｂｌｏｃｋ Ａｃｅ」（商品名）（大日本製薬社製）、０.１Ｍ塩化ナトリウム、及び５ｍＭ塩化カルシウムを含む、１０ｍＭトリス（ヒドロキシメチル）アミノメタン緩衝液（ｐＨ７.５）〕で、１μｇ／ｍＬになるように希釈して、パーオキシダーゼ標識抗プロテインＳ・モノクローナル抗体試薬を調製した。
【０１９５】
（３） 試料の調製
【０１９６】
◎ プロテインＳ−Ｃ４ｂ結合タンパク質複合体の調製
プロテインＳ−Ｃ４ｂ結合タンパク質複合体を、Ｂ．Ｄａｈｌｂｅａｃｋらの方法〔Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｊ．，２０９巻，８３７〜８４６頁，１９８３年〕に基づいて、ヒト血漿より調製した。
【０１９７】
これを、前記の検体希釈液で希釈して、プロテインＳ−Ｃ４ｂ結合タンパク質複合体濃度が、０．２７ｎＭ、及び２．７ｎＭの２種類の「プロテインＳ−Ｃ４ｂ結合タンパク質複合体試料」を調製した。
【０１９８】
なお、この３種類の「プロテインＳ−Ｃ４ｂ結合タンパク質複合体試料」は、いずれも、遊離状態のプロテインＳを含まないものである。
また、これらの３種類の「プロテインＳ試料−Ｃ４ｂ結合タンパク質複合体試料」とも、ｐＨは７．５であり、塩濃度は１００ｍＭであった。
【０１９９】
そして、検体希釈液を、プロテインＳの濃度及びプロテインＳ−Ｃ４ｂ結合タンパク質複合体の濃度が０ｎＭの試料とした。
【０２００】
（４） 試料中のプロテインＳの測定
【０２０１】
前記（１）で調製した「Ｃ４ｂ結合タンパク質固定化マイクロプレート試薬」、及び前記（２）で調製した「パーオキシダーゼ標識抗プロテインＳ・モノクローナル抗体試薬」を用いることにより、試料中の遊離状態のプロテインＳの測定を行うことができるが、この試薬を用いて前記（３）で調製した「プロテインＳ−Ｃ４ｂ結合タンパク質複合体試料」の測定を種々の温度で行った。
【０２０２】
▲１▼ 前記（３）で調製した、プロテインＳ−Ｃ４ｂ結合タンパク質複合体の濃度が、０．２７ｎＭ、及び２．７ｎＭの２種類の試料と検体希釈液（プロテインＳ−Ｃ４ｂ結合タンパク質複合体及びプロテインＳの濃度が０ｎＭの試料）を、前記（２）で調製したＣ４ｂ結合タンパク質固定化マイクロプレート試薬のマイクロプレートのウェルに、１ウェル当たり１００μＬ分注した。
この操作を、前記マイクロプレートの９枚について行った。
【０２０３】
そして、このマイクロプレートの各々をそれぞれ、０℃、５℃、１０℃、１５℃、２０℃、２５℃、２９℃、３３℃、又は３７℃の９種類の温度で、１時間静置して反応を行わせた。
【０２０４】
▲２▼ この各温度での１時間の反応の後、反応を行わせたマイクロプレートの各ウェルを、前記（１）の▲３▼の洗浄液で３回ずつ洗浄した。
この操作により、固定化されたＣ４ｂ結合タンパク質に結合しなかったプロテインＳ等の成分を前記ウェルより除去した。（ＢＦ分離）
【０２０５】
▲３▼ 前記（２）で調製したパーオキシダーゼ標識抗プロテインＳ・モノクローナル抗体試薬を、前記▲２▼で洗浄した後のマイクロプレートの各ウェルに１００μＬずつ分注した。
そして、これを室温で１時間静置して反応を行わせた。
【０２０６】
この操作により、マイクロプレートのウェルに固定化されたＣ４ｂ結合タンパク質に結合したプロテインＳに、パーオキシダーゼ標識抗プロテインＳ・モノクローナル抗体を結合させた。
【０２０７】
▲４▼ この室温、１時間の反応の後、反応を行わせたマイクロプレートの各ウェルを、前記の洗浄液で３回ずつ洗浄した。
この操作により、マイクロプレートに間接的に固定化されたプロテインＳに結合しなかったパーオキシダーゼ標識抗プロテインＳ・モノクローナル抗体等の成分を前記ウェルより除去した。（ＢＦ分離）
【０２０８】
▲５▼ その後、ＨＲＰ発色試薬〔３，３’，５，５’−テトラメチルベンジジン（ＴＭＢ）を含む；「ＴＭＢ Ｓｏｌｕａｂｌｅ Ｒｅａｇｅｎｔ」、Ｓｃｙ Ｔｅｋ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ社（米国）製〕を、前記▲４▼で洗浄した後のマイクロプレートの各ウェルに１００μＬずつ加え、室温で１５分間、発色反応を行わせた。
【０２０９】
▲６▼ この後、この反応を行わせたマイクロプレートの各ウェルに、発色停止試薬〔「ＴＭＢ Ｓｏｌｕａｂｌｅ Ｒｅａｇｅｎｔ」、Ｓｃｙ Ｔｅｋ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ社（米国）製〕を１００μＬずつ加え、撹拌することにより、発色反応を停止させた。
【０２１０】
▲７▼ このマイクロプレートの各ウェルの、４５０ｎｍにおける吸光度の測定を、ＥＩＡマイクロプレートリーダー（バイオラッド社製）により行った。
【０２１１】
▲８▼ そして、試料中のプロテインＳの測定値（濃度）を、次のようにして求めた。
Ｂ．Ｄａｈｌｂｅａｃｋらの方法〔Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｊ．，２０９巻，８３７〜８４６頁，１９８３年〕に基づいて、ヒト血漿より調製した遊離状態のプロテインＳを標準物質とし、これを先の試料と同様にして前記の測定操作を行って吸光度を求め、試料と標準物質の両方の吸光度を比較することにより測定を行った試料中のプロテインＳ濃度の算出を行った。
【０２１２】
▲９▼ なお、前記▲１▼〜▲８▼の測定操作を、前記（３）で調製した検体希釈液（プロテインＳ−Ｃ４ｂ結合タンパク質複合体及びプロテインＳの濃度が０ｎＭの試料）についても行った。
【０２１３】
これらの測定の結果を、表１に示した。
【０２１４】
【表１】

【０２１５】
また、これらの測定の結果を、縦軸を試料中のプロテインＳの測定値（４５０ｎｍにおける吸光度差）とし、横軸を試料中のプロテインＳ−Ｃ４ｂ結合タンパク質複合体の濃度として表した図を、図１〜図９に示した。
【０２１６】
ここで、試料とマイクロプレートのウェルに固定化されたＣ４ｂ結合タンパク質との反応を、０℃で行った時のものが図１、５℃で行った時のものが図２、１０℃で行った時のものが図３、１５℃で行った時のものが図４、２０℃で行った時のものが図５、２５℃で行った時のものが図６、２９℃で行った時のものが図７、３３℃で行った時のものが図８、そして、３７℃で行った時のものが図９である。
【０２１７】
これらの図において、「プロテインＳ−Ｃ４ｂ結合タンパク質複合体試料」の測定値を「◆」で表している。
【０２１８】
また、以上の測定の結果を、縦軸を試料中のプロテインＳの測定値〔濃度（ｎＭ）〕とし、横軸を試料とマイクロプレートのウェルに固定化されたＣ４ｂ結合タンパク質との反応を行わせた際の温度として表した図を、図１０〜図１２に示した。
【０２１９】
ここで、プロテインＳ−Ｃ４ｂ結合タンパク質複合体及びプロテインＳの濃度が０ｎＭ（検体希釈液）の試料の結果が図１０であり、プロテインＳ−Ｃ４ｂ結合タンパク質複合体の濃度が、０．２７ｎＭの試料の結果が図１１であり、そして、２．７Ｍの試料の結果が図１２である。
図１０〜図１２において、「プロテインＳ−Ｃ４ｂ結合タンパク質複合体試料」の測定値を「◆」で表している。
【０２２０】
（５） 考察
【０２２１】
▲１▼ プロテインＳは、そのリガンドであるＣ４ｂ結合タンパク質とは、一対一でしか結合できない。
よって、プロテインＳ−Ｃ４ｂ結合タンパク質複合体は、更にＣ４ｂ結合タンパク質とは結合できない。
【０２２２】
従って、前記（４）のＥＬＳＡ法・サンドイッチ法による測定においても、試料中に含まれていたプロテインＳ−Ｃ４ｂ結合タンパク質複合体は、マイクロプレートのウェルに固定化されたＣ４ｂ結合タンパク質にはもう結合できないので、マイクロプレートに間接的に固定化されることはなく、発色は生じず吸光度の増加は見られないはずである。
【０２２３】
しかしながら、例えば、前記（４）の▲１▼における試料とマイクロプレートのウェルに固定化されたＣ４ｂ結合タンパク質との反応を３７℃で行った場合には、前記の図９より明白なように、プロテインＳ−Ｃ４ｂ結合タンパク質複合体を試料として測定を行った時も、吸光度が生じてしまっていることが分かる。
【０２２４】
つまり、試料中のプロテインＳの測定において、試料とマイクロプレートのウェルに固定化されたＣ４ｂ結合タンパク質との反応を３７℃で行った合には、試料中に含有されるプロテインＳ−Ｃ４ｂ結合タンパク質複合体が解離してプロテインＳとＣ４ｂ結合タンパク質複合体をそれぞれ生じる反応が起こり、この解離により生じたプロテインＳもマイクロプレートのウェルに固定化されたＣ４ｂ結合タンパク質に結合してしまい、もともと試料中に含有されるプロテインＳに加えて、プロテインＳ−Ｃ４ｂ結合タンパク質複合体をもプロテインＳとして測り込んでしまい、試料中のプロテインＳに測定値に正の誤差が生じてしまうことが分かる。
【０２２５】
従って、測定対象物質であるプロテインＳと、そのリガンドであるＣ４ｂ結合タンパク質との結合反応を３７℃で行わせることは、測定対象物質とそのリガンドとの複合体が解離してそれぞれ生じる反応が進む条件下であることが明白である。
【０２２６】
▲２▼ ２０℃以上の温度で、試料とマイクロプレートのウェルに固定化されたＣ４ｂ結合タンパク質との反応を行った場合も、先の３７℃で反応を行った場合と同じことが言える。
これは、前記の表１、及び各図に示された結果より明らかである。
【０２２７】
つまり、プロテインＳ−Ｃ４ｂ結合タンパク質複合体が０．２７ｎＭ、又は２．７ｎＭの濃度で含まれており、かつプロテインＳは含まれていない試料においては、いずれも、試料とマイクロプレートのウェルに固定化されたＣ４ｂ結合タンパク質との反応を行わせた際の温度が、２０℃未満の場合は、プロテインＳの測定値〔吸光度差、濃度〕がゼロ（又はほとんどゼロ）であるのに対して、２０℃以上の場合は、温度が上がるほど高い吸光度差（又は濃度）のプロテインＳの測定値が得られてしまっている。
【０２２８】
つまり、２０℃未満においては、試料中に含まれていたプロテインＳ−Ｃ４ｂ結合タンパク質複合体が解離してプロテインＳとＣ４ｂ結合タンパク質をそれぞれ生じる反応を抑制することができるが、２０℃以上では、試料中に含まれていたプロテインＳ−Ｃ４ｂ結合タンパク質複合体が解離し、プロテインＳとＣ４ｂ結合タンパク質をそれぞれ生じてしまい、試料中のプロテインＳの測定において正の誤差が発生することが確かめられた。
【０２２９】
▲３▼ 以上の結果より、試料中に含まれる測定対象物質と特異的結合物質との結合反応を、２０℃未満で行うことにより、測定対象物質とそのリガンドとの複合体が解離して測定対象物質とリガンドをそれぞれ生じる反応を抑制することができ、これにより、正誤差の発生を防いで、試料中の測定対象物質を正確に測定することができることを確認できた。
【０２３０】
なお、この検討結果より分かるように、測定対象物質と特異的結合物質との結合反応は、０℃〜１５℃で行うことが正確性の点でより好ましく、更に０℃〜１０℃で行うことが特に好ましい。
【０２３１】
〔実施例２〕 試料中のプロテインＳを本発明の測定方法、測定試薬により測定する場合の添加回収試験
【０２３２】
本発明の測定方法、測定試薬を、ＥＬＳＡ法・サンドイッチ法による試料中のプロテインＳの測定に適用した際、試料に添加したプロテインＳの量を正確に測定できるか否かを確かめて、その測定の正確度を確認する試験（添加回収試験）を行った。
【０２３３】
（１） Ｃ４ｂ結合タンパク質固定化マイクロプレート試薬の調製
【０２３４】
前記の実施例１の（１）の記載の通りにして、「Ｃ４ｂ結合タンパク質固定化マイクロプレート試薬」を調製した。
【０２３５】
（２） パーオキシダーゼ標識抗プロテインＳ・モノクローナル抗体試薬の調製
【０２３６】
前記の実施例１の（２）の記載の通りにして、「パーオキシダーゼ標識抗プロテインＳ・モノクローナル抗体試薬」を調製した。
【０２３７】
（３） 試料の調製
【０２３８】
▲１▼ プロテインＳの調製
プロテインＳを、Ｂ．Ｄａｈｌｂｅａｃｋらの方法〔Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｊ．，２０９巻，８３７〜８４６頁，１９８３年〕に基づいて、ヒト血漿より調製した。
そして、プロテインＳの濃度及びプロテインＳ−Ｃ４ｂ結合タンパク質複合体の濃度が０ｎＭの試料を検体希釈液とした。
【０２３９】
▲２▼ プロテインＳ添加血漿試料の調製
プロテインＳ欠損血漿、つまりプロテインＳ濃度が０ｎＭの血漿を作製し、前記▲１▼のプロテインＳを添加して、プロテインＳ濃度が、５ｎＭ、１０ｎＭ、２０ｎＭ、及び４０ｎＭの４種類の血漿試料を調製した。
プロテインＳ欠損血漿は、実施例１の（２）で作製したマウス抗プロテインＳ・モノクローナル抗体を結合させたアフィニティーカラム（９Ｈ６-Sepharose）を作製し、このカラムに健常人血漿を通し、カラムを素通りした血漿を回収することにより作製した。
なお、前記アフィニティーカラム（９Ｈ６-Sepharose）は、CNBr activated Sepharose（アマシャムファルマシアバイオテク社製）に、マウス抗プロテインＳ・モノクローナル抗体を、インストラクションマニュアルに従って結合させて作製した。
【０２４０】
（４） 試料中のプロテインＳの測定
【０２４１】
前記（１）の「Ｃ４ｂ結合タンパク質固定化マイクロプレート試薬」、及び前記（２）の「パーオキシダーゼ標識抗プロテインＳ・モノクローナル抗体試薬」を用い、前記（３）で調製した４種類の「プロテインＳ添加血漿試料」及び「プロテインＳ欠損血漿試料」について、試料中のプロテインＳの測定を行った。
【０２４２】
なお、このように試料を変えたこと、及び試料とマイクロプレートのウェルに固定化されたＣ４ｂ結合タンパク質との反応を４℃でのみ行ったこと以外は、前記実施例１の（４）の記載の通りに測定操作を行った。
【０２４３】
（５） 測定結果
【０２４４】
測定結果を、図１３に示した。
なお、この図で、横軸は測定を行った試料中に含まれるプロテインＳの濃度（ｎＭ）を、縦軸は測定で得られたプロテインＳ濃度測定値（ｎＭ）を表す。
【０２４５】
この結果より、プロテインＳ欠損血漿に添加したプロテインＳの量が、正しく測定できていることが分かる。
これよりも、本発明の測定方法、測定試薬が、試料中の測定対象物質の測定を正確に行えることが確かめられた。
【０２４６】
〔実施例３〕 試料中のプロテインＳを本発明の測定方法、測定試薬により測定する場合の添加回収試験
【０２４７】
本発明の測定方法、測定試薬を、ＥＬＳＡ法・サンドイッチ法による試料中のプロテインＳの測定に適用した際、試料に添加したプロテインＳの量を正確に測定できるか否かを確かめて、その測定の正確度を確認する試験（添加回収試験）を行った。
【０２４８】
（１） Ｃ４ｂ結合タンパク質固定化マイクロプレート試薬の調製
【０２４９】
前記の実施例１の（１）の記載の通りにして、「Ｃ４ｂ結合タンパク質固定化マイクロプレート試薬」を調製した。
【０２５０】
（２） パーオキシダーゼ標識抗プロテインＳ・モノクローナル抗体試薬の調製
【０２５１】
前記の実施例１の（２）の記載の通りにして、「パーオキシダーゼ標識抗プロテインＳ・モノクローナル抗体試薬」を調製した。
【０２５２】
（３） 試料の調製
【０２５３】
▲１▼ プロテインＳの調製
プロテインＳを、Ｂ．Ｄａｈｌｂｅａｃｋらの方法〔Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｊ．，２０９巻，８３７〜８４６頁，１９８３年〕に基づいて、ヒト血漿より調製した。
そして、プロテインＳの濃度及びプロテインＳ−Ｃ４ｂ結合タンパク質複合体の濃度が０ｎＭの試料を検体希釈液とした。
【０２５４】
▲２▼ プロテインＳ添加健常人血漿試料の調製
プロテインＳ濃度が１１７ｎＭの健常人血漿と、１３３ｎＭ、２６７ｎＭ、４００ｎＭ、５３３ｎＭ、６６７ｎＭ、８００ｎＭ、９３３ｎＭ、１０６７ｎＭ及び１２００ｎＭの濃度の前記▲１▼のプロテインＳを１：１の割合で混合して、９種類のプロテインＳ添加血漿試料を調製した。
ここで、この９種類の血漿試料におけるプロテインＳ濃度の理論値は、各々１２５ｎＭ、１９２ｎＭ、２５９ｎＭ、３２５ｎＭ、３９２ｎＭ、４５９ｎＭ、５２５ｎＭ、５９２ｎＭ及び６５９ｎＭとなる。
【０２５５】
▲３▼ プロテインＳ添加妊婦血漿試料の調製
プロテインＳ濃度が４８ｎＭの妊娠３３週の妊婦血漿と、２７ｎＭ、５３ｎＭ、８０ｎＭ、１０７ｎＭ、１３３ｎＭ、１６０ｎＭ、１８７ｎＭ及び２１３ｎＭの濃度の前記▲１▼のプロテインＳを１：１の割合で混合して、８種類のプロテインＳ添加血漿試料を調製した。
ここで、この８種類の血漿試料におけるプロテインＳ濃度の理論値は、各々３８ｎＭ、５１ｎＭ、６４ｎＭ、７８ｎＭ、９１ｎＭ、１０４ｎＭ、１１８ｎＭ、及び１３１ｎＭとなる。
【０２５６】
（４） 試料中のプロテインＳの測定
【０２５７】
前記（１）の「Ｃ４ｂ結合タンパク質固定化マイクロプレート試薬」、及び前記（２）の「パーオキシダーゼ標識抗プロテインＳ・モノクローナル抗体試薬」を用い、前記（３）で調製した９種類の「プロテインＳ添加健常人血漿試料」及び８種類の「プロテインＳ添加妊婦血漿試料」について、各々試料中のプロテインＳの測定を行った。
【０２５８】
なお、このように試料を変えたこと、及び試料とマイクロプレートのウェルに固定化されたＣ４ｂ結合タンパク質との反応を４℃でのみ行ったこと以外は、前記実施例１の（４）の記載の通りに測定操作を行った。
【０２５９】
（５） 測定結果
【０２６０】
測定結果を、表２に示した。
【０２６１】
【表２】

【０２６２】
表２から明らかなように、健常人血漿及び妊婦血漿ともに、添加したプロテインＳの濃度がいずれの場合にもプロテインＳの回収率は高く、試料に添加したプロテインＳの量が、正しく測定できていることが分かる。
このことからも、本発明の測定方法、測定試薬が、試料中の測定対象物質の測定を正確に行えることが確かめられた。
【０２６３】
〔実施例４〕 種々のｐＨでの、プロテインＳ−Ｃ４ｂ結合タンパク質複合体よりなる試料の、ＥＬＳＡ法・サンドイッチ法での測定
【０２６４】
ＥＬＳＡ法・サンドイッチ法による試料中のプロテインＳの測定方法（測定試薬）により、プロテインＳ−Ｃ４ｂ結合タンパク質複合体よりなる試料について測定を行う際の、試料とマイクロプレートのウェルに固定化されたＣ４ｂ結合タンパク質との反応を、種々のｐＨにおいて行わせ測定を行った。
【０２６５】
（１） Ｃ４ｂ結合タンパク質固定化マイクロプレート試薬の調製
【０２６６】
前記の実施例１の（１）の記載の通りにして、「Ｃ４ｂ結合タンパク質固定化マイクロプレート試薬」を調製した。
【０２６７】
（２） パーオキシダーゼ標識抗プロテインＳ・モノクローナル抗体試薬の調製
【０２６８】
前記の実施例１の（２）の記載の通りにして、「パーオキシダーゼ標識抗プロテインＳ・モノクローナル抗体試薬」を調製した。
【０２６９】
（３） 試料の調製
【０２７０】
▲１▼ 検体希釈液の調製
ａ） 検体希釈液（ｐＨ８．６）の調製
２５％の「Ｂｌｏｃｋ Ａｃｅ」（商品名）（大日本製薬社製）、０.１Ｍ塩化ナトリウム、及び５ｍＭ塩化カルシウムを含む、１０ｍＭトリス（ヒドロキシメチル）アミノメタン緩衝液（ｐＨ８．６）〕を調製し、「検体希釈液（ｐＨ８．６）」とした。
【０２７１】
ｂ） 検体希釈液（ｐＨ７．６）の調製
２５％の「Ｂｌｏｃｋ Ａｃｅ」（商品名）（大日本製薬社製）、０.１Ｍ塩化ナトリウム、及び５ｍＭ塩化カルシウムを含む、１０ｍＭトリス（ヒドロキシメチル）アミノメタン緩衝液（ｐＨ７．６）〕を調製し、「検体希釈液（ｐＨ７．６）」とした。
【０２７２】
ｃ） 検体希釈液（ｐＨ７．１）の調製
２５％の「Ｂｌｏｃｋ Ａｃｅ」（商品名）（大日本製薬社製）、０.１Ｍ塩化ナトリウム、及び５ｍＭ塩化カルシウムを含む、１０ｍＭトリス（ヒドロキシメチル）アミノメタン緩衝液（ｐＨ７．１）〕を調製し、「検体希釈液（ｐＨ７．１）」とした。
【０２７３】
ｄ） 検体希釈液（ｐＨ６．８）の調製
２５％の「Ｂｌｏｃｋ Ａｃｅ」（商品名）（大日本製薬社製）、０.１Ｍ塩化ナトリウム、及び５ｍＭ塩化カルシウムを含む、１０ｍＭ ＭＥＳ緩衝液（ｐＨ６．８）〕を調製し、「検体希釈液（ｐＨ６．８）」とした。
【０２７４】
ｅ） 検体希釈液（ｐＨ６．３）の調製
２５％の「Ｂｌｏｃｋ Ａｃｅ」（商品名）（大日本製薬社製）、０.１Ｍ塩化ナトリウム、及び５ｍＭ塩化カルシウムを含む、１０ｍＭ ＭＥＳ緩衝液（ｐＨ６．３）〕を調製し、「検体希釈液（ｐＨ６．３）」とした。
【０２７５】
ｆ） 検体希釈液（ｐＨ５．５）の調製
２５％の「Ｂｌｏｃｋ Ａｃｅ」（商品名）（大日本製薬社製）、０.１Ｍ塩化ナトリウム、及び５ｍＭ塩化カルシウムを含む、１０ｍＭ ＭＥＳ緩衝液（ｐＨ５．５）〕を調製し、「検体希釈液（ｐＨ５．５）」とした。
【０２７６】
▲２▼ プロテインＳ−Ｃ４ｂ結合タンパク質複合体の調製
プロテインＳ−Ｃ４ｂ結合タンパク質複合体を、Ｂ．Ｄａｈｌｂｅａｃｋらの方法〔Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｊ．，２０９巻，８３７〜８４６頁，１９８３年〕に基づいて、ヒト血漿より調製した。
【０２７７】
これを、前記▲１▼の６種類の検体希釈液、すなわち「検体希釈液（ｐＨ８．６）」、「検体希釈液（ｐＨ７．６）」、「検体希釈液（ｐＨ７．１）」、「検体希釈液（ｐＨ６．８）」、「検体希釈液（ｐＨ６．３）」、又は「検体希釈液（ｐＨ５．５）」により、それぞれ希釈して、プロテインＳ−Ｃ４ｂ結合タンパク質複合体濃度が各々０．６７ｎＭであって、ｐＨが８．６であった「プロテインＳ−Ｃ４ｂ結合タンパク質複合体試料−１」、ｐＨが７．６であった「プロテインＳ−Ｃ４ｂ結合タンパク質複合体試料−２」、ｐＨが７．１であった「プロテインＳ−Ｃ４ｂ結合タンパク質複合体試料−３」、ｐＨが６．８であった「プロテインＳ−Ｃ４ｂ結合タンパク質複合体試料−４」、ｐＨが６．３であった「プロテインＳ−Ｃ４ｂ結合タンパク質複合体試料−５」、及びｐＨが５．５であった「プロテインＳ−Ｃ４ｂ結合タンパク質複合体試料−６」を調製した。
【０２７８】
なお、この６種類の「プロテインＳ−Ｃ４ｂ結合タンパク質複合体試料」は、いずれも、遊離状態のプロテインＳを含まないものである。
また、これらの６種類の各プロテインＳ−Ｃ４ｂ結合タンパク質複合体試料とも、塩濃度は１００ｍＭであった。
そして、各ｐＨにおける検体希釈液を、プロテインＳの濃度及びプロテインＳ−Ｃ４ｂ結合タンパク質複合体の濃度が０ｎＭの試料とした。
【０２７９】
（４） 試料中のプロテインＳの測定
【０２８０】
前記（１）の「Ｃ４ｂ結合タンパク質固定化マイクロプレート試薬」、及び前記（２）の「パーオキシダーゼ標識抗プロテインＳ・モノクローナル抗体試薬」を用い、前記（３）で調製した各々の「プロテインＳ−Ｃ４ｂ結合タンパク質複合体試料」について、遊離状態のプロテインＳの測定を種々のｐＨで行った。
【０２８１】
▲１▼ 前記（３）で調製した、「プロテインＳ−Ｃ４ｂ結合タンパク質複合体試料−１」〜「プロテインＳ−Ｃ４ｂ結合タンパク質複合体試料−６」の６種類のプロテインＳ−Ｃ４ｂ結合タンパク質複合体試料、及び検体希釈液（プロテインＳ−Ｃ４ｂ結合タンパク質複合体及びプロテインＳの濃度が０ｎＭの試料）を、前記（２）で調製したＣ４ｂ結合タンパク質固定化マイクロプレート試薬のマイクロプレートのウェルに、１ウェル当たり１００μＬ分注した。
【０２８２】
そして、このマイクロプレートの各々をそれぞれ、２５℃で、１時間静置して反応を行わせた。
【０２８３】
なお、この試料とマイクロプレートのウェルに固定化されたＣ４ｂ結合タンパク質との反応は、各々の「プロテインＳ−Ｃ４ｂ結合タンパク質複合体試料」のｐＨで行われることになる。
【０２８４】
すなわち、「プロテインＳ−Ｃ４ｂ結合タンパク質複合体試料−１」の場合はｐＨ８．６、「プロテインＳ−Ｃ４ｂ結合タンパク質複合体試料−２」の場合はｐＨ７．６、「プロテインＳ−Ｃ４ｂ結合タンパク質複合体試料−３」の場合はｐＨ７．１、「プロテインＳ−Ｃ４ｂ結合タンパク質複合体試料−４」の場合はｐＨ６．８、「プロテインＳ−Ｃ４ｂ結合タンパク質複合体試料−５」の場合はｐＨ６．３、「プロテインＳ−Ｃ４ｂ結合タンパク質複合体試料−６」の場合はｐＨ５．５であった。
【０２８５】
▲２▼ この２５℃での１時間の反応の後、反応を行わせたマイクロプレートの各ウェルを、前記実施例１の（１）の▲３▼の洗浄液で３回ずつ洗浄した。
この操作により、固定化されたＣ４ｂ結合タンパク質に結合しなかったプロテインＳ等の成分を前記ウェルより除去した。（ＢＦ分離）
【０２８６】
▲３▼ 前記（２）のパーオキシダーゼ標識抗プロテインＳ・モノクローナル抗体試薬を、前記▲２▼で洗浄した後のマイクロプレートの各ウェルに１００μＬずつ分注した。
そして、これを室温で１時間静置して反応を行わせた。
【０２８７】
この操作により、マイクロプレートのウェルに固定化されたＣ４ｂ結合タンパク質に結合したプロテインＳに、パーオキシダーゼ標識抗プロテインＳ・モノクローナル抗体を結合させた。
【０２８８】
▲４▼ この室温、１時間の反応の後、反応を行わせたマイクロプレートの各ウェルを、前記の洗浄液で３回ずつ洗浄した。
この操作により、マイクロプレートに間接的に固定化されたプロテインＳに結合しなかったパーオキシダーゼ標識抗プロテインＳ・モノクローナル抗体等の成分を前記ウェルより除去した。（ＢＦ分離）
【０２８９】
▲５▼ その後、ＨＲＰ発色試薬〔３，３’，５，５’−テトラメチルベンジジン（ＴＭＢ）を含む；「ＴＭＢ Ｓｏｌｕａｂｌｅ Ｒｅａｇｅｎｔ」、Ｓｃｙ Ｔｅｋ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ社（米国）製〕を、前記▲４▼で洗浄した後のマイクロプレートの各ウェルに１００μＬずつ加え、室温で１５分間、発色反応を行わせた。
【０２９０】
▲６▼ この後、この反応を行わせたマイクロプレートの各ウェルに、発色停止試薬〔「ＴＭＢ Ｓｏｌｕａｂｌｅ Ｒｅａｇｅｎｔ」、Ｓｃｙ Ｔｅｋ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ社（米国）製〕を１００μＬずつ加え、撹拌することにより、発色反応を停止させた。
【０２９１】
▲７▼ このマイクロプレートの各ウェルの、４５０ｎｍにおける吸光度の測定を、ＥＩＡマイクロプレートリーダー（バイオラッド社製）により行った。
【０２９２】
▲８▼ そして、試料中のプロテインＳの測定値（濃度）を、次のようにして求めた。
Ｂ．Ｄａｈｌｂｅａｃｋらの方法〔Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｊ．，２０９巻，８３７〜８４６頁，１９８３年〕に基づいて、ヒト血漿より調製した遊離状態のプロテインＳを標準物質とし、これを先の試料と同様にして前記の測定操作を行って吸光度を求め、試料と標準物質の両方の吸光度を比較することにより測定を行った試料中のプロテインＳ濃度の算出を行った。
【０２９３】
▲９▼ なお、前記▲１▼〜▲８▼の測定操作を、各ｐＨにおける検体希釈液（プロテインＳ−Ｃ４ｂ結合タンパク質複合体及びプロテインＳの濃度が０ｎＭの試料）についても行った。
【０２９４】
これらの測定の結果を、表３に示した。
【０２９５】
【表３】

【０２９６】
また、以上の測定の結果を、縦軸を試料中のプロテインＳの測定値〔濃度（ｎＭ）〕とし、横軸を試料とマイクロプレートのウェルに固定化されたＣ４ｂ結合タンパク質との反応を行わせた際のｐＨとして表した図を、図１４及び図１５に示した。
【０２９７】
図１４は、各ｐＨにおける、プロテインＳ−Ｃ４ｂ結合タンパク質複合体の濃度が０．６７ｎＭの試料の結果を、実施例６のプロテインＳ−Ｃ４ｂ結合タンパク質複合体の濃度が０．６７ｎＭの試料の結果とともに示した図であり、この図１４において、本実施例の「プロテインＳ−Ｃ４ｂ結合タンパク質複合体試料」の測定値を「◆」で表している。
また、図１５は、プロテインＳ−Ｃ４ｂ結合タンパク質複合体及びプロテインＳの濃度が０ｎＭ（検体希釈液）の試料の結果を、実施例６のプロテインＳ−Ｃ４ｂ結合タンパク質複合体及びプロテインＳの濃度が０ｎＭ（検体希釈液）の試料の結果とともに示した図であり、この図１５において、本実施例の「各ｐＨにおけるプロテインＳ−Ｃ４ｂ結合タンパク質複合体及びプロテインＳの濃度が０ｎＭ（検体希釈液）の試料」の測定値を「◆」で表している。
【０２９８】
（５） 考察
【０２９９】
▲１▼ 前記（４）の▲１▼における試料とマイクロプレートのウェルに固定化されたＣ４ｂ結合タンパク質との反応を、例えば、ｐＨ８．６で行った場合には、前記の図１４より明白なように、プロテインＳ−Ｃ４ｂ結合タンパク質複合体を試料として測定を行った時も、正の誤差が生じてしまっていることが分かる。
【０３００】
つまり、試料中のプロテインＳの測定において、試料とマイクロプレートのウェルに固定化されたＣ４ｂ結合タンパク質との反応をｐＨ８．６で行った場合には、試料中に含有されるプロテインＳ−Ｃ４ｂ結合タンパク質複合体が解離してプロテインＳとＣ４ｂ結合タンパク質複合体をそれぞれ生じる反応が起こり、この解離により生じたプロテインＳもマイクロプレートのウェルに固定化されたＣ４ｂ結合タンパク質に結合してしまい、もともと試料中に含有されるプロテインＳに加えて、プロテインＳ−Ｃ４ｂ結合タンパク質複合体をもプロテインＳとして測り込んでしまい、試料中のプロテインＳに測定値に正の誤差が生じてしまうことが分かる。
【０３０１】
従って、測定対象物質であるプロテインＳと、そのリガンドであるＣ４ｂ結合タンパク質との結合反応をｐＨ８．６で行わせることは、測定対象物質とそのリガンドとの複合体が解離してそれぞれ生じる反応が進む条件下であることが明白である。
【０３０２】
▲２▼ しかしながら、やはり上記の結果より、測定対象物質であるプロテインＳと、そのリガンドであるＣ４ｂ結合タンパク質との結合反応を、より低いｐＨで行うことにより、試料中に含まれていたプロテインＳ−Ｃ４ｂ結合タンパク質複合体が解離してプロテインＳとＣ４ｂ結合タンパク質をそれぞれ生じる反応を抑制することができることも分かる。
【０３０３】
例えば、測定対象物質であるプロテインＳと、そのリガンドであるＣ４ｂ結合タンパク質との結合反応をｐＨ７．１以下で行わせることにより、ｐＨ８．６で行わせた時に比べて、試料中に含まれていたプロテインＳ−Ｃ４ｂ結合タンパク質複合体の解離を明らかに抑制することができるようになる。
【０３０４】
▲３▼ 以上の結果より、試料中に含まれる測定対象物質と特異的結合物質との結合反応を、低いｐＨで行うことにより、測定対象物質とそのリガンドとの複合体が解離して測定対象物質とリガンドをそれぞれ生じる反応を抑制することができ、これにより、正誤差の発生を防いで、試料中の測定対象物質を正確に測定することができることを確認できた。
【０３０５】
なお、この検討結果より分かるように、測定対象物質と特異的結合物質との結合反応は、１５℃以上の反応温度で行う場合には、ｐＨ７．１以下で行うことが正確性の点で特に好ましい。
【０３０６】
〔実施例５〕 種々の塩濃度（イオン強度）での、プロテインＳ−Ｃ４ｂ結合タンパク質複合体よりなる試料の、ＥＬＳＡ法・サンドイッチ法での測定
【０３０７】
ＥＬＳＡ法・サンドイッチ法による試料中のプロテインＳの測定方法（測定試薬）により、プロテインＳ−Ｃ４ｂ結合タンパク質複合体よりなる試料について測定を行う際の、試料とマイクロプレートのウェルに固定化されたＣ４ｂ結合タンパク質との反応を、種々の塩濃度（イオン強度）において行わせ測定を行った。
【０３０８】
（１） Ｃ４ｂ結合タンパク質固定化マイクロプレート試薬の調製
【０３０９】
前記の実施例１の（１）の記載の通りにして、「Ｃ４ｂ結合タンパク質固定化マイクロプレート試薬」を調製した。
【０３１０】
（２） パーオキシダーゼ標識抗プロテインＳ・モノクローナル抗体試薬の調製
【０３１１】
前記の実施例１の（２）の記載の通りにして、「パーオキシダーゼ標識抗プロテインＳ・モノクローナル抗体試薬」を調製した。
【０３１２】
（３） 試料の調製
【０３１３】
▲１▼ 検体希釈液の調製
ａ） 検体希釈液（２００ｍＭ）の調製
２５％の「Ｂｌｏｃｋ Ａｃｅ」（商品名）（大日本製薬社製）、２００ｍＭ塩化ナトリウム、及び５ｍＭ塩化カルシウムを含む、１０ｍＭトリス（ヒドロキシメチル）アミノメタン緩衝液（ｐＨ７．４）〕を調製し、「検体希釈液（２００ｍＭ）」とした。
【０３１４】
ｂ） 検体希釈液（１００ｍＭ）の調製
２５％の「Ｂｌｏｃｋ Ａｃｅ」（商品名）（大日本製薬社製）、１００ｍＭ塩化ナトリウム、及び５ｍＭ塩化カルシウムを含む、１０ｍＭトリス（ヒドロキシメチル）アミノメタン緩衝液（ｐＨ７．４）〕を調製し、「検体希釈液（１００ｍＭ）」とした。
【０３１５】
ｃ） 検体希釈液（５０ｍＭ）の調製
２５％の「Ｂｌｏｃｋ Ａｃｅ」（商品名）（大日本製薬社製）、５０ｍＭ塩化ナトリウム、及び５ｍＭ塩化カルシウムを含む、１０ｍＭトリス（ヒドロキシメチル）アミノメタン緩衝液（ｐＨ７．４）〕を調製し、「検体希釈液（５０ｍＭ）」とした。
【０３１６】
ｄ） 検体希釈液（２０ｍＭ）の調製
２５％の「Ｂｌｏｃｋ Ａｃｅ」（商品名）（大日本製薬社製）、２５ｍＭ塩化ナトリウム、及び５ｍＭ塩化カルシウムを含む、１０ｍＭトリス（ヒドロキシメチル）アミノメタン緩衝液（ｐＨ７．４）〕を調製し、「検体希釈液（２０ｍＭ）」とした。
【０３１７】
ｅ） 検体希釈液（１０ｍＭ）の調製
２５％の「Ｂｌｏｃｋ Ａｃｅ」（商品名）（大日本製薬社製）、１２．５ｍＭ塩化ナトリウム、及び５ｍＭ塩化カルシウムを含む、１０ｍＭトリス（ヒドロキシメチル）アミノメタン緩衝液（ｐＨ７．４）〕を調製し、「検体希釈液（１０ｍＭ）」とした。
【０３１８】
ｆ） 検体希釈液（０ｍＭ）の調製
２５％の「Ｂｌｏｃｋ Ａｃｅ」（商品名）（大日本製薬社製）、及び５ｍＭ塩化カルシウムを含む、１０ｍＭトリス（ヒドロキシメチル）アミノメタン緩衝液（ｐＨ７．４）〕を調製し、「検体希釈液（０ｍＭ）」とした。
【０３１９】
▲２▼ プロテインＳ−Ｃ４ｂ結合タンパク質複合体の調製
プロテインＳ−Ｃ４ｂ結合タンパク質複合体を、Ｂ．Ｄａｈｌｂｅａｃｋらの方法〔Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｊ．，２０９巻，８３７〜８４６頁，１９８３年〕に基づいて、ヒト血漿より調製した。
【０３２０】
これを、前記▲１▼の６種類の検体希釈液、すなわち「検体希釈液（２００ｍＭ）」、「検体希釈液（１００ｍＭ）」、「検体希釈液（５０ｍＭ）」、「検体希釈液（２０ｍＭ）」、「検体希釈液（１０ｍＭ）」、又は「検体希釈液（０ｍＭ）」により希釈して、プロテインＳ−Ｃ４ｂ結合タンパク質複合体濃度が各々０．６７ｎＭであって、塩化ナトリウム濃度が２００ｍＭであった「プロテインＳ−Ｃ４ｂ結合タンパク質複合体試料−１」、塩化ナトリウム濃度が１００ｍＭであった「プロテインＳ−Ｃ４ｂ結合タンパク質複合体試料−２」、塩化ナトリウム濃度が５０ｍＭであった「プロテインＳ−Ｃ４ｂ結合タンパク質複合体試料−３」、塩化ナトリウム濃度が２０ｍＭであった「プロテインＳ−Ｃ４ｂ結合タンパク質複合体試料−４」、塩化ナトリウム濃度が１０ｍＭであった「プロテインＳ−Ｃ４ｂ結合タンパク質複合体試料−５」、及び塩化ナトリウム濃度が０ｍＭであった「プロテインＳ−Ｃ４ｂ結合タンパク質複合体試料−６」を調製した。
【０３２１】
なお、この６種類の「プロテインＳ−Ｃ４ｂ結合タンパク質複合体試料」は、いずれも、遊離状態のプロテインＳを含まないものである。
また、これらの６種類の各プロテインＳ−Ｃ４ｂ結合タンパク質複合体試料とも、ｐＨは７．４であった。
そして、各塩化ナトリウム濃度における検体希釈液を、プロテインＳの濃度及びプロテインＳ−Ｃ４ｂ結合タンパク質複合体の濃度が０ｎＭの試料とした。
【０３２２】
（４） 試料中のプロテインＳの測定
【０３２３】
前記（１）の「Ｃ４ｂ結合タンパク質固定化マイクロプレート試薬」、及び前記（２）の「パーオキシダーゼ標識抗プロテインＳ・モノクローナル抗体試薬」を用い、前記（３）で調製した各々の「プロテインＳ−Ｃ４ｂ結合タンパク質複合体試料」について、遊離状態のプロテインＳの測定を種々の塩濃度（イオン強度）で行った。
【０３２４】
▲１▼ 前記（３）で調製した、「プロテインＳ−Ｃ４ｂ結合タンパク質複合体試料−１」〜「プロテインＳ−Ｃ４ｂ結合タンパク質複合体試料−６」の６種類のプロテインＳ−Ｃ４ｂ結合タンパク質複合体試料と検体希釈液（プロテインＳ−Ｃ４ｂ結合タンパク質複合体及びプロテインＳの濃度が０ｎＭの試料）を、前記（２）で調製したＣ４ｂ結合タンパク質固定化マイクロプレート試薬のマイクロプレートのウェルに、１ウェル当たり１００μＬ分注した。
【０３２５】
そして、このマイクロプレートの各々をそれぞれ、２５℃で、１時間静置して反応を行わせた。
【０３２６】
なお、この試料とマイクロプレートのウェルに固定化されたＣ４ｂ結合タンパク質との反応は、各々の「プロテインＳ−Ｃ４ｂ結合タンパク質複合体試料」の塩濃度（イオン強度）で行われることになる。
【０３２７】
すなわち、「プロテインＳ−Ｃ４ｂ結合タンパク質複合体試料−１」の場合は塩化ナトリウム濃度２００ｍＭ、「プロテインＳ−Ｃ４ｂ結合タンパク質複合体試料−２」の場合は塩化ナトリウム濃度１００ｍＭ、「プロテインＳ−Ｃ４ｂ結合タンパク質複合体試料−３」の場合は塩化ナトリウム濃度５０ｍＭ、「プロテインＳ−Ｃ４ｂ結合タンパク質複合体試料−４」の場合は塩化ナトリウム濃度２０ｍＭ、「プロテインＳ−Ｃ４ｂ結合タンパク質複合体試料−５」の場合は塩化ナトリウム濃度１０ｍＭ、そして「プロテインＳ−Ｃ４ｂ結合タンパク質複合体試料−６」の場合は塩化ナトリウム濃度０ｍＭであった。
【０３２８】
▲２▼ この２５℃での１時間の反応の後、反応を行わせたマイクロプレートの各ウェルを、前記実施例１の（１）の▲３▼の洗浄液で３回ずつ洗浄した。
この操作により、固定化されたＣ４ｂ結合タンパク質に結合しなかったプロテインＳ等の成分を前記ウェルより除去した。（ＢＦ分離）
【０３２９】
▲３▼ 前記（２）のパーオキシダーゼ標識抗プロテインＳ・モノクローナル抗体試薬を、前記▲２▼で洗浄した後のマイクロプレートの各ウェルに１００μＬずつ分注した。
そして、これを室温で１時間静置して反応を行わせた。
【０３３０】
この操作により、マイクロプレートのウェルに固定化されたＣ４ｂ結合タンパク質に結合したプロテインＳに、パーオキシダーゼ標識抗プロテインＳ・モノクローナル抗体を結合させた。
【０３３１】
▲４▼ この室温、１時間の反応の後、反応を行わせたマイクロプレートの各ウェルを、前記の洗浄液で３回ずつ洗浄した。
この操作により、マイクロプレートに間接的に固定化されたプロテインＳに結合しなかったパーオキシダーゼ標識抗プロテインＳ・モノクローナル抗体等の成分を前記ウェルより除去した。（ＢＦ分離）
【０３３２】
▲５▼ その後、ＨＲＰ発色試薬〔３，３’，５，５’−テトラメチルベンジジン（ＴＭＢ）を含む；「ＴＭＢ Ｓｏｌｕａｂｌｅ Ｒｅａｇｅｎｔ」、Ｓｃｙ Ｔｅｋ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ社（米国）製〕を、前記▲４▼で洗浄した後のマイクロプレートの各ウェルに１００μＬずつ加え、室温で１５分間、発色反応を行わせた。
【０３３３】
▲６▼ この後、この反応を行わせたマイクロプレートの各ウェルに、発色停止試薬〔「ＴＭＢ Ｓｏｌｕａｂｌｅ Ｒｅａｇｅｎｔ」、Ｓｃｙ Ｔｅｋ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ社（米国）製〕を１００μＬずつ加え、撹拌することにより、発色反応を停止させた。
【０３３４】
▲７▼ このマイクロプレートの各ウェルの、４５０ｎｍにおける吸光度の測定を、ＥＩＡマイクロプレートリーダー（バイオラッド社製）により行った。
【０３３５】
▲８▼ そして、試料中のプロテインＳの測定値（濃度）を、次のようにして求めた。Ｂ．Ｄａｈｌｂｅａｃｋらの方法〔Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｊ．，２０９巻，８３７〜８４６頁，１９８３年〕に基づいて、ヒト血漿より調製した遊離状態のプロテインＳを標準物質とし、これを先の試料と同様にして前記の測定操作を行って吸光度を求め、試料と標準物質の両方の吸光度を比較することにより、測定を行った試料中のプロテインＳ濃度の算出を行った。
【０３３６】
▲９▼ なお、前記▲１▼〜▲８▼の測定操作を、各塩化ナトリウム濃度における検体希釈液（プロテインＳ−Ｃ４ｂ結合タンパク質複合体及びプロテインＳの濃度が０ｎＭの試料）についても行った。
【０３３７】
これらの測定の結果を、表４に示した。
【０３３８】
【表４】

【０３３９】
また、以上の測定の結果を、縦軸を試料中のプロテインＳの測定値〔濃度（ｎＭ）〕とし、横軸を試料とマイクロプレートのウェルに固定化されたＣ４ｂ結合タンパク質との反応を行わせた際の塩化ナトリウム濃度〔塩濃度（イオン強度）〕として表した図を、図１６及び図１７に示した。
【０３４０】
ここで、各塩化ナトリウム濃度における、プロテインＳ−Ｃ４ｂ結合タンパク質複合体の濃度が０．６７ｎＭの試料の結果が図１６であり、プロテインＳ−Ｃ４ｂ結合タンパク質複合体及びプロテインＳの濃度が０ｎＭ（検体希釈液）の試料の結果が図１７である。
【０３４１】
図１６において、「プロテインＳ−Ｃ４ｂ結合タンパク質複合体試料」の測定値を「◆」で表している。
また、図１７において、「プロテインＳ−Ｃ４ｂ結合タンパク質複合体及びプロテインＳの濃度が０ｎＭ（検体希釈液）の試料」の測定値を「◆」で表している。
【０３４２】
（５） 考察
【０３４３】
▲１▼ 前記（４）の▲１▼における試料とマイクロプレートのウェルに固定化されたＣ４ｂ結合タンパク質との反応を、例えば、２００ｍＭの塩化ナトリウム濃度で行った場合には、前記の図１６より明白なように、プロテインＳ−Ｃ４ｂ結合タンパク質複合体を試料として測定を行った時も、正の誤差が生じてしまっていることが分かる。
【０３４４】
つまり、試料中のプロテインＳの測定において、試料とマイクロプレートのウェルに固定化されたＣ４ｂ結合タンパク質との反応を２００ｍＭの塩化ナトリウム濃度で行った場合には、試料中に含有されるプロテインＳ−Ｃ４ｂ結合タンパク質複合体が解離してプロテインＳとＣ４ｂ結合タンパク質複合体をそれぞれ生じる反応が起こり、この解離により生じたプロテインＳもマイクロプレートのウェルに固定化されたＣ４ｂ結合タンパク質に結合してしまい、もともと試料中に含有されるプロテインＳに加えて、プロテインＳ−Ｃ４ｂ結合タンパク質複合体をもプロテインＳとして測り込んでしまい、試料中のプロテインＳに測定値に正の誤差が生じてしまうことが分かる。
【０３４５】
従って、測定対象物質であるプロテインＳと、そのリガンドであるＣ４ｂ結合タンパク質との結合反応を塩化ナトリウム濃度２００ｍＭで行わせることは、測定対象物質とそのリガンドとの複合体が解離してそれぞれ生じる反応が進む条件下であることが明白である。
【０３４６】
▲２▼ しかしながら、やはり上記の結果より、測定対象物質であるプロテインＳと、そのリガンドであるＣ４ｂ結合タンパク質との結合反応を、より低い塩濃度（イオン強度）で行うことにより、試料中に含まれていたプロテインＳ−Ｃ４ｂ結合タンパク質複合体が解離してプロテインＳとＣ４ｂ結合タンパク質をそれぞれ生じる反応を抑制することができることも分かる。
【０３４７】
例えば、測定対象物質であるプロテインＳと、そのリガンドであるＣ４ｂ結合タンパク質との結合反応を塩化ナトリウム濃度０ｍＭで行わせることにより、塩化ナトリウム濃度２００ｍＭで行わせた時に比べて、試料中に含まれていたプロテインＳ−Ｃ４ｂ結合タンパク質複合体の解離を明らかに抑制することができるようになる。
【０３４８】
▲３▼ 以上の結果より、試料中に含まれる測定対象物質と特異的結合物質との結合反応を、低い塩濃度（イオン強度）で行うことにより、測定対象物質とそのリガンドとの複合体が解離して測定対象物質とリガンドをそれぞれ生じる反応を抑制することができ、これにより、正誤差の発生を防いで、試料中の測定対象物質を正確に測定することができることを確認できた。
【０３４９】
なお、この検討結果より分かるように、測定対象物質と特異的結合物質との結合反応は、１５℃以上の反応温度で行う場合には、塩濃度（イオン強度）２０ｍＭ以下で行うことが正確性の点でより好ましく、更に１０ｍＭ以下で行うことが特に好ましい。
【０３５０】
〔実施例６〕 低い塩濃度における種々のｐＨでの、プロテインＳ−Ｃ４ｂ結合タンパク質複合体よりなる試料の、ＥＬＳＡ法・サンドイッチ法での測定
【０３５１】
ＥＬＳＡ法・サンドイッチ法による試料中のプロテインＳの測定方法（測定試薬）により、プロテインＳ−Ｃ４ｂ結合タンパク質複合体よりなる試料について測定を行う際の、試料とマイクロプレートのウェルに固定化されたＣ４ｂ結合タンパク質との反応を、低い塩濃度（イオン強度）における種々のｐＨにおいて行わせ測定を行った。
【０３５２】
（１） Ｃ４ｂ結合タンパク質固定化マイクロプレート試薬の調製
【０３５３】
前記の実施例１の（１）の記載の通りにして、「Ｃ４ｂ結合タンパク質固定化マイクロプレート試薬」を調製した。
【０３５４】
（２） パーオキシダーゼ標識抗プロテインＳ・モノクローナル抗体試薬の調製
【０３５５】
前記の実施例１の（２）の記載の通りにして、「パーオキシダーゼ標識抗プロテインＳ・モノクローナル抗体試薬」を調製した。
【０３５６】
（３） 試料の調製
【０３５７】
▲１▼ 検体希釈液の調製
ａ） 検体希釈液（ｐＨ８．１）の調製
２５％の「Ｂｌｏｃｋ Ａｃｅ」（商品名）（大日本製薬社製）、及び５ｍＭ塩化カルシウムを含む、１０ｍＭトリス（ヒドロキシメチル）アミノメタン緩衝液（ｐＨ８．１）〕を調製し、「検体希釈液（ｐＨ８．１）」とした。
【０３５８】
ｂ） 検体希釈液（ｐＨ７．１）の調製
２５％の「Ｂｌｏｃｋ Ａｃｅ」（商品名）（大日本製薬社製）、及び５ｍＭ塩化カルシウムを含む、１０ｍＭトリス（ヒドロキシメチル）アミノメタン緩衝液（ｐＨ７．１）〕を調製し、「検体希釈液（ｐＨ７．１）」とした。
【０３５９】
ｃ） 検体希釈液（ｐＨ６．４）の調製
２５％の「Ｂｌｏｃｋ Ａｃｅ」（商品名）（大日本製薬社製）、及び５ｍＭ塩化カルシウムを含む、１０ｍＭ ＭＥＳ緩衝液（ｐＨ６．４）〕を調製し、「検体希釈液（ｐＨ６．４）」とした。
【０３６０】
ｄ） 検体希釈液（ｐＨ５．５）の調製
２５％の「Ｂｌｏｃｋ Ａｃｅ」（商品名）（大日本製薬社製）、及び５ｍＭ塩化カルシウムを含む、１０ｍＭ ＭＥＳ緩衝液（ｐＨ５．５）〕を調製し、「検体希釈液（ｐＨ５．５）」とした。
【０３６１】
▲２▼ プロテインＳ−Ｃ４ｂ結合タンパク質複合体の調製
プロテインＳ−Ｃ４ｂ結合タンパク質複合体を、Ｂ．Ｄａｈｌｂｅａｃｋらの方法〔Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｊ．，２０９巻，８３７〜８４６頁，１９８３年〕に基づいて、ヒト血漿より調製した。
【０３６２】
これを、前記▲１▼の４種類の検体希釈液、すなわち「検体希釈液（ｐＨ８．１）」、「検体希釈液（ｐＨ７．１）」、「検体希釈液（ｐＨ６．４）」、又は「検体希釈液（ｐＨ５．５）」により、それぞれ希釈して、プロテインＳ−Ｃ４ｂ結合タンパク質複合体濃度が各々０．６７ｎＭであって、ｐＨが８．１であった「プロテインＳ−Ｃ４ｂ結合タンパク質複合体試料−１」、ｐＨが７．１であった「プロテインＳ−Ｃ４ｂ結合タンパク質複合体試料−２」、ｐＨが６．４であった「プロテインＳ−Ｃ４ｂ結合タンパク質複合体試料−３」、及びｐＨが５．５であった「プロテインＳ−Ｃ４ｂ結合タンパク質複合体試料−４」を調製した。
【０３６３】
なお、この４種類の「プロテインＳ−Ｃ４ｂ結合タンパク質複合体試料」は、いずれも、遊離状態のプロテインＳを含まないものである。
また、これらの４種類の各プロテインＳ−Ｃ４ｂ結合タンパク質複合体試料とも、塩濃度は０ｍＭであった。
そして、各ｐＨにおける検体希釈液を、プロテインＳの濃度及びプロテインＳ−Ｃ４ｂ結合タンパク質複合体の濃度が０ｎＭの試料とした。
【０３６４】
（４） 試料中のプロテインＳの測定
【０３６５】
前記（１）の「Ｃ４ｂ結合タンパク質固定化マイクロプレート試薬」、及び前記（２）の「パーオキシダーゼ標識抗プロテインＳ・モノクローナル抗体試薬」を用い、前記（３）で調製した各々の「プロテインＳ−Ｃ４ｂ結合タンパク質複合体試料」について、遊離状態のプロテインＳの測定を種々のｐＨで行った。
【０３６６】
▲１▼ 前記（３）で調製した、「プロテインＳ−Ｃ４ｂ結合タンパク質複合体試料−１」〜「プロテインＳ−Ｃ４ｂ結合タンパク質複合体試料−４」の４種類のプロテインＳ−Ｃ４ｂ結合タンパク質複合体試料、及び検体希釈液（プロテインＳ−Ｃ４ｂ結合タンパク質複合体及びプロテインＳの濃度が０ｎＭの試料）を、前記（２）で調製したＣ４ｂ結合タンパク質固定化マイクロプレート試薬のマイクロプレートのウェルに、１ウェル当たり１００μＬ分注した。
【０３６７】
そして、このマイクロプレートの各々をそれぞれ、２５℃で、１時間静置して反応を行わせた。
【０３６８】
なお、この試料とマイクロプレートのウェルに固定化されたＣ４ｂ結合タンパク質との反応は、各々の「プロテインＳ−Ｃ４ｂ結合タンパク質複合体試料」のｐＨで行われることになる。
【０３６９】
すなわち、「プロテインＳ−Ｃ４ｂ結合タンパク質複合体試料−１」の場合はｐＨ８．１、「プロテインＳ−Ｃ４ｂ結合タンパク質複合体試料−２」の場合はｐＨ７．１、「プロテインＳ−Ｃ４ｂ結合タンパク質複合体試料−３」の場合はｐＨ６．４、「プロテインＳ−Ｃ４ｂ結合タンパク質複合体試料−４」の場合はｐＨ５．５であった。
【０３７０】
▲２▼ この２５℃での１時間の反応の後、反応を行わせたマイクロプレートの各ウェルを、前記実施例１の（１）の▲３▼の洗浄液で３回ずつ洗浄した。
この操作により、固定化されたＣ４ｂ結合タンパク質に結合しなかったプロテインＳ等の成分を前記ウェルより除去した。（ＢＦ分離）
【０３７１】
▲３▼ 前記（２）のパーオキシダーゼ標識抗プロテインＳ・モノクローナル抗体試薬を、前記▲２▼で洗浄した後のマイクロプレートの各ウェルに１００μＬずつ分注した。
そして、これを室温で１時間静置して反応を行わせた。
【０３７２】
この操作により、マイクロプレートのウェルに固定化されたＣ４ｂ結合タンパク質に結合したプロテインＳに、パーオキシダーゼ標識抗プロテインＳ・モノクローナル抗体を結合させた。
【０３７３】
▲４▼ この室温、１時間の反応の後、反応を行わせたマイクロプレートの各ウェルを、前記の洗浄液で３回ずつ洗浄した。
この操作により、マイクロプレートに間接的に固定化されたプロテインＳに結合しなかったパーオキシダーゼ標識抗プロテインＳ・モノクローナル抗体等の成分を前記ウェルより除去した。（ＢＦ分離）
【０３７４】
▲５▼ その後、ＨＲＰ発色試薬〔３，３’，５，５’−テトラメチルベンジジン（ＴＭＢ）を含む；「ＴＭＢ Ｓｏｌｕａｂｌｅ Ｒｅａｇｅｎｔ」、Ｓｃｙ Ｔｅｋ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ社（米国）製〕を、前記▲４▼で洗浄した後のマイクロプレートの各ウェルに１００μＬずつ加え、室温で１５分間、発色反応を行わせた。
【０３７５】
▲６▼ この後、この反応を行わせたマイクロプレートの各ウェルに、発色停止試薬〔「ＴＭＢ Ｓｏｌｕａｂｌｅ Ｒｅａｇｅｎｔ」、Ｓｃｙ Ｔｅｋ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ社（米国）製〕を１００μＬずつ加え、撹拌することにより、発色反応を停止させた。
【０３７６】
▲７▼ このマイクロプレートの各ウェルの、４５０ｎｍにおける吸光度の測定を、ＥＩＡマイクロプレートリーダー（バイオラッド社製）により行った。
【０３７７】
▲８▼ そして、試料中のプロテインＳの測定値（濃度）を、次のようにして求めた。
Ｂ．Ｄａｈｌｂｅａｃｋらの方法〔Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｊ．，２０９巻，８３７〜８４６頁，１９８３年〕に基づいて、ヒト血漿より調製した遊離状態のプロテインＳを標準物質とし、これを先の試料と同様にして前記の測定操作を行って吸光度を求め、試料と標準物質の両方の吸光度を比較することにより測定を行った試料中のプロテインＳ濃度の算出を行った。
【０３７８】
▲９▼ なお、前記▲１▼〜▲８▼の測定操作を、各ｐＨにおける検体希釈液（プロテインＳ−Ｃ４ｂ結合タンパク質複合体及びプロテインＳの濃度が０ｎＭの試料）についても行った。
【０３７９】
これらの測定の結果を、表５に示した。
【０３８０】
【表５】

【０３８１】
また、以上の測定の結果を、縦軸を試料中のプロテインＳの測定値〔濃度（ｎＭ）〕とし、横軸を試料とマイクロプレートのウェルに固定化されたＣ４ｂ結合タンパク質との反応を行わせた際のｐＨとして表した図を、図１４及び図１５に示した。
【０３８２】
図１４は、各ｐＨにおける、プロテインＳ−Ｃ４ｂ結合タンパク質複合体の濃度が０．６７ｎＭの試料の結果を、前記の実施例４で行ったプロテインＳ−Ｃ４ｂ結合タンパク質複合体の濃度が０．６７ｎＭの試料の結果とともに示した図であり、図１４において、本実施例の「プロテインＳ−Ｃ４ｂ結合タンパク質複合体試料」の測定値を「○」で表している。
また、図１５は、プロテインＳ−Ｃ４ｂ結合タンパク質複合体及びプロテインＳの濃度が０ｎＭ（検体希釈液）の試料の結果を、前記の実施例４で行ったプロテインＳ−Ｃ４ｂ結合タンパク質複合体及びプロテインＳの濃度が０ｎＭ（検体希釈液）の試料の結果とともに示した図であり、この図１５において、本実施例の「各ｐＨにおけるプロテインＳ−Ｃ４ｂ結合タンパク質複合体及びプロテインＳの濃度が０ｎＭ（検体希釈液）の試料」の測定値を「○」で表している。
【０３８３】
（５） 考察
【０３８４】
▲１▼ 前記（４）の▲１▼における試料とマイクロプレートのウェルに固定化されたＣ４ｂ結合タンパク質との反応を、例えば、ｐＨ８．１で行った場合には、前記の図１４より明白なように、プロテインＳ−Ｃ４ｂ結合タンパク質複合体を試料として測定を行った時も、正の誤差が生じてしまっていることが分かる。
【０３８５】
つまり、試料中のプロテインＳの測定において、試料とマイクロプレートのウェルに固定化されたＣ４ｂ結合タンパク質との反応をｐＨ８．１で行った場合には、試料中に含有されるプロテインＳ−Ｃ４ｂ結合タンパク質複合体が解離してプロテインＳとＣ４ｂ結合タンパク質複合体をそれぞれ生じる反応が起こり、この解離により生じたプロテインＳもマイクロプレートのウェルに固定化されたＣ４ｂ結合タンパク質に結合してしまい、もともと試料中に含有されるプロテインＳに加えて、プロテインＳ−Ｃ４ｂ結合タンパク質複合体をもプロテインＳとして測り込んでしまい、試料中のプロテインＳに測定値に正の誤差が生じてしまうことが分かる。
【０３８６】
従って、測定対象物質であるプロテインＳと、そのリガンドであるＣ４ｂ結合タンパク質との結合反応をｐＨ８．１で行わせることは、測定対象物質とそのリガンドとの複合体が解離してそれぞれ生じる反応が進む条件下であることが明白である。
【０３８７】
▲２▼ しかしながら、やはり上記の結果より、測定対象物質であるプロテインＳと、そのリガンドであるＣ４ｂ結合タンパク質との結合反応を、より低いｐＨで行うことにより、試料中に含まれていたプロテインＳ−Ｃ４ｂ結合タンパク質複合体が解離してプロテインＳとＣ４ｂ結合タンパク質をそれぞれ生じる反応を抑制することができることも分かる。
【０３８８】
例えば、測定対象物質であるプロテインＳと、そのリガンドであるＣ４ｂ結合タンパク質との結合反応をｐＨ７．１以下で行わせることにより、ｐＨ８．１で行わせた時に比べて、試料中に含まれていたプロテインＳ−Ｃ４ｂ結合タンパク質複合体の解離を明らかに抑制することができるようになる。
【０３８９】
更に、前記の図１４より明らかなように、測定対象物質であるプロテインＳと、そのリガンドであるＣ４ｂ結合タンパク質との結合反応を塩化ナトリウム濃度０ｍＭで行わせた場合は、塩化ナトリウム濃度１００ｍＭで行わせた場合に比べて、試料中に含まれていたプロテインＳ−Ｃ４ｂ結合タンパク質複合体の解離を明らかに抑制することができるようになることが分かる。
【０３９０】
▲３▼ 以上の結果より、試料中に含まれる測定対象物質と特異的結合物質との結合反応を、低いｐＨ及び低い塩濃度（イオン強度）で行うことにより、測定対象物質とそのリガンドとの複合体が解離して測定対象物質とリガンドをそれぞれ生じる反応を抑制することができ、これにより、正誤差の発生を防いで、試料中の測定対象物質をより正確に測定することができることを確認できた。
【０３９１】
なお、この検討結果より分かるように、測定対象物質と特異的結合物質との結合反応は、１５℃以上の反応温度で行う場合には、ｐＨ７．１以下で行うことが正確性の点でより好ましく、更に低い塩濃度（イオン強度）で行うことが特に好ましい。
【０３９２】
【発明の効果】
本発明の試料中の測定対象物質の測定方法、及び本発明の試料中の測定対象物質の測定試薬は、測定対象物質が、この測定対象物質と、測定対象物質とそのリガンドとの複合体の両方の物質が試料中に共に含有されるものである場合においても、測定対象物質とそのリガンドとの複合体が解離して生じる測定対象物質の測り込みによる正誤差の発生を防ぐことができ、試料中の測定対象物質を正確に測定することができるという効果を有する測定方法、及び測定試薬である。
【図面の簡単な説明】
【図１】０℃で反応を行わせたときの、プロテインＳ−Ｃ４ｂ結合タンパク質複合体よりなる試料の、ＥＬＳＡ法・サンドイッチ法での測定結果を示した図である。
【図２】５℃で反応を行わせたときの、プロテインＳ−Ｃ４ｂ結合タンパク質複合体よりなる試料の、ＥＬＳＡ法・サンドイッチ法での測定結果を示した図である。
【図３】１０℃で反応を行わせたときの、プロテインＳ−Ｃ４ｂ結合タンパク質複合体よりなる試料の、ＥＬＳＡ法・サンドイッチ法での測定結果を示した図である。
【図４】１５℃で反応を行わせたときの、プロテインＳ−Ｃ４ｂ結合タンパク質複合体よりなる試料の、ＥＬＳＡ法・サンドイッチ法での測定結果を示した図である。
【図５】２０℃で反応を行わせたときの、プロテインＳ−Ｃ４ｂ結合タンパク質複合体よりなる試料の、ＥＬＳＡ法・サンドイッチ法での測定結果を示した図である。
【図６】２５℃で反応を行わせたときの、プロテインＳ−Ｃ４ｂ結合タンパク質複合体よりなる試料の、ＥＬＳＡ法・サンドイッチ法での測定結果を示した図である。
【図７】２９℃で反応を行わせたときの、プロテインＳ−Ｃ４ｂ結合タンパク質複合体よりなる試料の、ＥＬＳＡ法・サンドイッチ法での測定結果を示した図である。
【図８】３３℃で反応を行わせたときの、プロテインＳ−Ｃ４ｂ結合タンパク質複合体よりなる試料の、ＥＬＳＡ法・サンドイッチ法での測定結果を示した図である。
【図９】３７℃で反応を行わせたときの、プロテインＳ−Ｃ４ｂ結合タンパク質複合体よりなる試料の、ＥＬＳＡ法・サンドイッチ法での測定結果を示した図である。
【図１０】プロテインＳ−Ｃ４ｂ結合タンパク質複合体濃度が０ｎＭの試料について、各種温度で反応を行わせたときの、ＥＬＳＡ法・サンドイッチ法での測定結果を示した図である。
【図１１】プロテインＳ−Ｃ４ｂ結合タンパク質複合体濃度が０．２７ｎＭの試料について、各種温度で反応を行わせたときの、ＥＬＳＡ法・サンドイッチ法での測定結果を示した図である。
【図１２】プロテインＳ−Ｃ４ｂ結合タンパク質複合体濃度が２．７ｎＭの試料について、各種温度で反応を行わせたときの、ＥＬＳＡ法・サンドイッチ法での測定結果を示した図である。
【図１３】試料中のプロテインＳを本発明の測定方法、測定試薬により測定したときの添加回収試験の結果を示した図である。
【図１４】プロテインＳ−Ｃ４ｂ結合タンパク質複合体濃度が０．６７ｎＭの試料について、各種ｐＨで反応を行わせたときの、ＥＬＳＡ法・サンドイッチ法での測定結果を示した図である。
【図１５】プロテインＳ−Ｃ４ｂ結合タンパク質複合体濃度が０ｎＭの試料について、各種ｐＨで反応を行わせたときの、ＥＬＳＡ法・サンドイッチ法での測定結果を示した図である。
【図１６】プロテインＳ−Ｃ４ｂ結合タンパク質複合体濃度が０．６７ｎＭの試料について、各種塩濃度で反応を行わせたときの、ＥＬＳＡ法・サンドイッチ法での測定結果を示した図である。
【図１７】プロテインＳ−Ｃ４ｂ結合タンパク質複合体濃度が０ｎＭの試料について、各種塩濃度で反応を行わせたときの、ＥＬＳＡ法・サンドイッチ法での測定結果を示した図である。
【図１８】プロテインＳをＥＬＳＡ法・サンドイッチ法により測定するときの模式図である。
【図１９】間接凝集反応測定法により試料中の測定対象物質の測定を行ったときの凝集像を示した図である。[0001]
BACKGROUND OF THE INVENTION
The present invention relates to a measuring method and a measuring reagent capable of measuring only a substance that forms a complex with its ligand in a free state.
The present invention is particularly useful in the field of life science such as clinical examination, molecular biology, and medicine, the field of food sanitation, the field of environmental sanitation, and the like.
[0002]
[Prior art]
There are various substances that form a complex with the ligand, but various problems arise when measuring such substances.
Here, the ligand means a substance that specifically binds to a specific protein substance.
[0003]
The substance that forms a complex with the ligand will be described below using protein S as an example.
Protein S is mainly present in human blood, is a prosthetic factor (cofactor) of activated protein C, and is indispensable for the function of activated protein C in blood.
Activated protein C is a factor that plays a role in suppressing blood coagulation reaction by decomposing factor Va and factor VIIIa that promote blood coagulation in humans.
[0004]
Protein S specifically binds one-to-one with a C4b binding protein (complement factor 4b binding protein, C4bBP) to form a complex. That is, the C4b binding protein is a protein S ligand.
[0005]
This complex formation reaction between protein S and C4b binding protein is as shown below, but this reaction is a reversible reaction.
In human blood, since the molar concentration of C4b binding protein is usually smaller than that of protein S and the dissociation constant is small, only “protein S” and “protein S-C4b binding protein complex” exist. In other words, the equilibrium of the following reaction is completely to the right.
[0006]
(Note that in this specification, terms such as “measurement substance”, “ligand”, “protein S”, or “C4b binding protein” are bound to other substances unless otherwise specified. It means something that is in a free state.)
[0007]
[Chemical 1]

[0008]
As one of the methods for measuring this protein S, B. Dahlbeack et al. Showed the following method. [Thromb. Haemost. 79, pp. 767-772, 1998, and WO 98/23963]
[0009]
(1) First, human plasma as a sample is brought into contact with a microplate in which a C4b binding protein is immobilized in a well at room temperature, and the protein S in the sample is specifically bound to the C4b binding protein immobilized in the microplate. After binding, protein S is indirectly immobilized on the microplate by the binding of “protein S-C4b binding protein-microplate”, and then washed to remove non-immobilized components.
[0010]
(2) Thereafter, a peroxidase-labeled anti-protein S / mouse monoclonal antibody obtained by labeling peroxidase (POD) derived from horseradish on a mouse antibody against protein S (anti-protein S / mouse monoclonal antibody) is obtained as described in (1) above. The protein S was specifically bound by contacting the well of the microplate subjected to the above operation at room temperature, and "peroxidase-labeled anti-protein S / mouse monoclonal antibody-protein S-C4b binding protein-microplate" After the formation of the bond, washing is performed to remove the free peroxidase-labeled anti-protein S / mouse monoclonal antibody which has not been bonded.
[0011]
(3) 1,2-phenylenediamine (OPD) and hydrogen peroxide are added thereto, and a leuco dye is produced at room temperature by the oxidation catalytic action of the labeled peroxidase. By measuring the absorbance, the presence or absence or the concentration of protein S in the sample can be known. (Refer to Fig. 18)
[0012]
In this measurement method, the measurement target substance is “sandwiched” with the ligand of the measurement target substance immobilized on the carrier and the antibody against the measurement target substance labeled with an enzyme, and the measurement is performed on the support. An ELISA method (enzyme-linked) that performs measurement by “sandwiching” the measurement target substance with an antibody (or antigen) against the measurement target substance that has been immobilized and an antibody (or antigen) labeled with an enzyme. Although it can be considered as a modification of the sandwich method of immunosorbent assay (solid-phase enzyme immunoassay), Dahlbeack et al. referred to the above-described assay method as an ELSA method (enzyme-linked ligandsorbent assay).
[0013]
However, the present inventors have realized that the above measuring method has the following serious problems.
That is, not only protein S as a measurement target substance but also protein S-C4b binding protein complex is measured, and a positive error occurs in the measured value of protein S.
[0014]
Since the protein S-C4b binding protein complex can no longer bind to the C4b binding protein immobilized on the microplate, it should not be measured (no signal) by the method of Dahlbeack et al. .
[0015]
However, when a purified product of protein S-C4b binding protein complex was measured as a sample, a signal was generated and measured in the same manner as when a purified product of protein S was used as a sample.
[0016]
That is, when protein S in a sample was measured by the measurement method of Dahlbeack et al., The protein S-C4b binding protein complex contained in the sample was also measured, resulting in a positive error.
[0017]
The reason is considered to be as follows.
When protein S contained in the sample binds to the C4b binding protein immobilized on the well of the microplate, the concentration of protein S in the free state in the reaction solution decreases.
[0018]
Then, the equilibrium of the following reaction shifts to the left, the protein S-C4b binding protein complex also contained in the sample is dissociated, and one protein S and one C4b binding protein are generated.
[0019]
[Chemical 2]

[0020]
Here, protein S produced from the protein S-C4b binding protein complex is bound to and immobilized on the C4b binding protein immobilized on the microplate, and as a result, a signal is generated.
[0021]
From the above, since the protein S-C4b binding protein complex contained in the sample is measured as protein S, a positive error occurs when measuring protein S.
[0022]
As described above, the case where the protein S in the sample is measured by the ELSA method shown by the Dahlbeack et al. Has been described as an example. A method (principle) of measuring a measurement target substance in a sample by using a binding reaction with the target substance, and the measurement target substance is composed of the measurement target substance, the measurement target substance and its ligand. If both materials of the complex are contained together in the sample, the same problem can occur in either case.
[0023]
In other words, when measuring the measurement target substance in the sample, a reaction occurs in which the complex of the measurement target substance and its ligand is dissociated to generate the measurement target substance and the ligand, respectively. This is a problem that a positive error occurs in the measurement due to binding with a substance that specifically binds to the measurement target substance.
[0024]
[Problems to be solved by the invention]
An object of the present invention is to solve the problems of the above-described conventional measurement methods and reagents, that is, by using a binding reaction between a measurement target substance and a substance that specifically binds to the measurement target substance, In the method and measurement reagent for measuring the measurement target substance in the sample, the measurement target substance contains both the measurement target substance and a complex of the measurement target substance and its ligand in the sample. In this case, it is possible to prevent the occurrence of a positive error due to the measurement of the measurement target substance generated by dissociation of the complex of the measurement target substance and its ligand, and to accurately measure the measurement target substance in the sample. It is to provide a measuring method and a measuring reagent that can be used.
[0025]
[Means for Solving the Problems]
The present invention relates to a method for measuring a measurement target substance in a sample by using a binding reaction between the measurement target substance and a substance that specifically binds to the measurement target substance. When both the substance of the measurement target substance and its ligand complex are contained in the sample, the complex of the measurement target substance and its ligand dissociates and the measurement target substance and the ligand are separated. A method for measuring a substance to be measured in a sample, characterized in that a binding reaction between a substance to be measured and a substance that specifically binds to the substance to be measured is performed under a condition that suppresses each reaction that occurs.
[0026]
In the method for measuring a substance to be measured in the sample of the present invention, the temperature is kept constant as a condition for suppressing the reaction in which the complex of the substance to be measured and its ligand is dissociated to generate the substance to be measured and the ligand, respectively. The temperature may be within the range.
[0027]
At this time, the temperature within the predetermined range is preferably a temperature of 0 to 15 ° C.
[0028]
In particular, the temperature within a certain range is preferably a temperature of 0 to 10 ° C.
[0029]
In the method for measuring a substance to be measured in the sample of the present invention, the pH is kept constant as a condition for suppressing the reaction in which the complex of the substance to be measured and its ligand is dissociated to generate the substance to be measured and the ligand, respectively. It can be mentioned that the pH is within the range.
[0030]
At this time, the pH within the predetermined range is preferably pH 7.1 or lower.
[0031]
Further, in the method for measuring a substance to be measured in the sample of the present invention, the salt concentration is constant as a condition for suppressing the reaction in which the complex of the substance to be measured and its ligand is dissociated to generate the substance to be measured and the ligand, respectively. It can be mentioned that the concentration is within the range.
[0032]
At this time, the salt concentration within the certain range is preferably a concentration of 20 mM or less, particularly 10 mM or less.
[0033]
And in the measuring method of the measuring object substance in the sample of this invention, it is suitable that a measuring object substance is protein S.
[0034]
The present invention also provides a measurement reagent for measuring a measurement target substance in a sample using a binding reaction between the measurement target substance and a substance that specifically binds to the measurement target substance. When both the target substance and the complex of the target substance and its ligand are contained in the sample, the complex of the target substance and its ligand dissociates and the target substance Of the measurement target substance in the sample, wherein a binding reaction between the measurement target substance and a substance that specifically binds to the measurement target substance is performed under a condition that suppresses a reaction that generates a ligand and a ligand. It is a measuring reagent.
[0035]
In the measurement reagent of the measurement target substance in the sample of the present invention, the temperature is constant as a condition for suppressing the reaction in which the complex of the measurement target substance and its ligand is dissociated to generate the measurement target substance and the ligand, respectively. The temperature may be within the range.
[0036]
At this time, the temperature within the predetermined range is preferably a temperature of 0 to 15 ° C.
[0037]
In particular, the temperature within a certain range is preferably a temperature of 0 to 10 ° C.
[0038]
Furthermore, in the measurement reagent for the measurement target substance in the sample of the present invention, the pH is kept constant as a condition for suppressing the reaction in which the complex of the measurement target substance and its ligand is dissociated to generate the measurement target substance and the ligand, respectively. It can be mentioned that the pH is within the range.
[0039]
At this time, the pH within the predetermined range is preferably pH 7.1 or lower.
[0040]
In the measurement reagent for the measurement target substance in the sample of the present invention, the salt concentration is constant as a condition for suppressing the reaction in which the complex of the measurement target substance and its ligand is dissociated to generate the measurement target substance and the ligand, respectively. It can be mentioned that the concentration is within the range.
[0041]
At this time, the salt concentration within the certain range is preferably 20 mM or less, particularly 10 mM or less.
[0042]
In the measurement reagent for the substance to be measured in the sample of the present invention, the substance to be measured is preferably protein S.
[0043]
DETAILED DESCRIPTION OF THE INVENTION
The measuring method and the measuring reagent of the measuring target substance in the sample of the present invention are the measuring target substance under the condition that suppresses the reaction in which the complex of the measuring target substance and its ligand is dissociated to generate the measuring target substance and the ligand, respectively. And a substance that specifically binds to the substance to be measured (hereinafter also referred to as a specific binding substance).
[0044]
That is, the present invention is characterized in that the binding reaction [reaction formula (2)] between the substance to be measured and the specific binding substance is performed under the condition for suppressing the right-to-left dissociation reaction in the following reaction formula (1) To do.
[0045]
[Chemical 3]

[0046]
In the present invention, any method and means can be used without any limitation so long as the complex of the substance to be measured and its ligand can be dissociated to suppress the reaction that causes the substance to be measured and the ligand, respectively. be able to.
[0047]
For example, as a condition for suppressing the reaction in which the complex of the measurement target substance and its ligand is dissociated to generate the measurement target substance and the ligand, respectively, the temperature can be set within a certain range.
[0048]
At this time, the temperature within the predetermined range is preferably a temperature of 0 to 15 ° C.
In particular, the temperature within a certain range is preferably a temperature of 0 to 10 ° C.
[0049]
Moreover, as an example of the above-mentioned conditions, it can be mentioned that the pH is within a certain range.
[0050]
At this time, the pH within the predetermined range is preferably pH 7.1 or lower.
[0051]
Furthermore, as an example of the above conditions, the salt concentration (ionic strength) can be set to a concentration within a certain range.
[0052]
At this time, the salt concentration (ionic strength) within the certain range is preferably 20 mM or less, particularly 10 mM or less.
[0053]
In this way, the binding reaction between the measurement target substance and the specific binding substance is performed under the condition that suppresses the reaction in which the complex of the measurement target substance and its ligand is dissociated to generate the measurement target substance and the ligand, respectively. Thus, the following can be achieved.
[0054]
In addition, in the measurement reagent, the measurement target substance and the specific binding substance are thus suppressed under the conditions that suppress the reaction in which the complex of the measurement target substance and its ligand is dissociated to generate the measurement target substance and the ligand, respectively. The following can be achieved by selecting and adjusting the components of the reagent so as to cause a binding reaction with:
[0055]
That is, during measurement, the measurement target substance contained in the sample binds to the specific binding substance, thereby reducing the concentration of the measurement target substance in the free state in the measurement reaction system. The equilibrium shifts to the left, and it is possible to prevent the complex of the measurement target substance and its ligand from dissociating and generating the measurement target substance.
[0056]
[Formula 4]

[0057]
As a result, only the substance to be measured originally contained in the sample is bound to the specific binding substance by the following reaction, and detection is performed to dissociate the complex of the substance to be measured and its ligand. Measurement of the measurement target substance in the sample can be performed accurately by preventing measurement of the measurement target substance.
[0058]
[Chemical formula 5]

[0059]
In the method for measuring a substance to be measured in the sample of the present invention and the reagent for measuring the substance to be measured in the sample of the present invention, the sample is a substance that may contain the substance to be measured, and is measured. It may contain a complex of the target substance and its ligand.
[0060]
Examples of this sample include biological samples (samples derived from humans, animals, plants, etc.), foods, beverages, environmental samples, and the like.
[0061]
Examples of biological samples include blood, serum, plasma, saliva, sweat, urine, feces, semen, tears, cerebrospinal fluid, ascites, amniotic fluid, etc .; liver, heart, brain, bone, hair, skin, nails And extracts of organs such as muscles and nerve tissues, tissues, cells, etc .; fecal extracts or suspensions, extracts of fungal bodies, plant extracts, and the like.
[0062]
Examples of foods include extracts or suspensions of meat, seafood, vegetables, fruits, processed foods, and the like.
[0063]
Examples of the beverage include tap water, well water, and milk.
Examples of the environmental sample include soil or an extract or suspension such as air, seawater, river water, lake water, and the like.
[0064]
In the measuring method and measuring reagent of the present invention, the measurement target substance is a substance whose presence or presence or concentration (concentration) in the sample is to be measured. ”And“ complex of the substance to be measured and its ligand ”are substances that may be contained in the sample together.
[0065]
Examples of the substance to be measured include a substance that reflects the state of mind and body, a marker substance for a disease, a substance that indicates the safety and nutrition of food or beverage, a substance that indicates an environmental condition, and the like.
[0066]
Specific examples of the measurement target substance include substances related to blood coagulation / fibrinolysis systems.
An example of this is shown below. The brackets indicate the ligand.
Protein S [C4b binding protein] and the like.
[0067]
There may also be mentioned hormones.
An example of this is shown below. The brackets indicate the ligand.
Total thyroxine (T4) [thyroid hormone binding protein such as T4 binding globulin, prealbumin or albumin], free thyroxine (FT4) [thyroid hormone binding protein such as T4 binding globulin, prealbumin or albumin], free triiodo silo Nin (FT3) [thyroid hormone binding protein such as T4 binding globulin, prealbumin, or albumin], reverse triiodothyronine [thyroid hormone binding protein such as T4 binding globulin], insulin-like growth factor (IGF I, IGF II) ) [IGF binding protein (IGF-BP)], corticosterone [corticosteroid binding protein (CBG)], sex hormone binding globulin (SHBG) [albumin or testosterone] and the like.
[0068]
And electrolyte can be mentioned.
An example of this is shown below. The parentheses are the ligands.
Iron (transferrin), copper (ceruloplasmin), calcium (protein), iodine (protein), etc.
[0069]
Furthermore, substances related to immune reactions such as antigens and antibodies can be mentioned.
An example of this is shown below. The parentheses are the ligands.
Complement C1q [immunocomplex of immunoglobulin and its antigen] and the like.
[0070]
In the present invention, there are a method and a reagent for measuring a substance to be measured in a sample using a binding reaction between the substance to be measured and a specific binding substance. This is a known immunological measuring method or immunity. Can be applied, for example, indirect aggregation reaction measurement methods such as latex agglutination or erythrocyte agglutination, latex turbidimetry, immunoturbidimetry, enzyme immunization Labeled immunoassay methods such as measurement methods or luminescent immunoassay methods, immunochromatography methods, ELSA methods described by Dahlbeack et al., Or those described in JP-A-9-229936 and JP-A-10-132919 A carrier having a coated surface on which a specific binding substance for the test substance is fixed and a specific binding substance for the test substance are fixed. Particles may be mentioned measuring method and reagent application of the method of using a.
[0071]
In the present invention, in the method and measurement reagent for measuring a measurement target substance in a sample using the binding reaction between the measurement target substance and a specific binding substance, a complex of the measurement target substance and its ligand The binding reaction between the measurement target substance and the specific binding substance is performed under the condition that suppresses the reaction that causes dissociation to generate the measurement target substance and the ligand, respectively.
[0072]
As a binding reaction between a measurement target substance and a specific binding substance in the method for measuring a measurement target substance in a sample of the present invention and a measurement reagent for the measurement target substance in the sample, an antigen-antibody reaction (immunity of an antigen and an antibody) Reaction), the reaction between a substance consisting mainly of protein and its ligand, the reaction between sugar and lectin, the reaction between nucleotide chain and complementary nucleotide chain, or the reaction between receptor and substance, and this measurement A reaction between substances (specific binding substances) that have specific affinity for and bind to the target substance can be mentioned.
[0073]
In the method for measuring a measurement target substance in a sample of the present invention and a measurement reagent kit for the measurement target substance in the sample, the binding reaction between the measurement target substance and the specific binding substance is performed by combining a plurality of types. May be used.
[0074]
For example, when the specific binding substance is an antibody against the substance to be measured and the measurement is performed using an antigen-antibody reaction (immune reaction) between this antibody and the substance to be measured, the above-mentioned antibody in a free state, a microtiter plate, etc. The antibody immobilized on a particle carrier such as a carrier or latex particle, or the antibody bound to and labeled with an enzyme, a fluorescent substance, a radioisotope, a luminescent substance, a luminescent reaction-related substance, or a particle And the like, and the binding reaction (antigen-antibody reaction, immune reaction) between the measurement target substance and the ligand is performed under conditions that suppress the reaction that causes the complex of the measurement target substance and its ligand to dissociate and generate the measurement target substance and the ligand, respectively. Make it.
[0075]
In addition, the measurement target substance in the sample is an antibody, and the specific binding substance is an antigen for the antibody that is the measurement target substance, and an antigen-antibody reaction (immune reaction) between this antigen and the measurement target substance is utilized. When performing measurement, the antigen in the free state, the carrier made of a container such as a microtiter plate, or the antigen immobilized on a particle carrier such as latex particles, or an enzyme, fluorescent substance, radioisotope, luminescent substance, luminescence The binding reaction (antigen-antibody reaction, immune reaction) between the measurement target substance and the antigen or the like that is bound to the reaction-related substance or particle is labeled with the complex of the measurement target substance and its ligand. The measurement is performed under conditions that suppress the reaction that causes the measurement target substance and the ligand, respectively.
[0076]
Furthermore, when the specific binding substance is a ligand for the substance to be measured in the sample and the measurement is performed using the specific binding reaction between this ligand and the substance to be measured, a carrier comprising a container such as a microtiter plate. Alternatively, the ligand immobilized on a particle carrier such as latex particles, or the ligand bound to an enzyme, a fluorescent substance, a radioisotope, a luminescent substance, a luminescent reaction-related substance, or a particle, and the like, and a measurement target A specific binding reaction with a substance is performed under conditions that suppress a reaction in which a complex of the measurement target substance and its ligand (ligand of the same or different type from the ligand) is dissociated to generate the measurement target substance and the ligand, respectively. .
[0077]
Then, in the binding reaction between the measurement target substance in the sample and a substance that specifically binds to this measurement target substance (specific binding substance), a substance that competes with the measurement target substance (competitive substance; for example, the measurement target substance itself, When measurement is performed using competition between a measurement target substance or part or all derivatives of the measurement target substance) and the measurement target substance, the measurement target substance or the competition substance and the specific binding substance The specific binding reaction is performed under conditions that suppress the reaction in which the complex of the measurement target substance and its ligand is dissociated to generate the measurement target substance and the ligand, respectively.
[0078]
According to the present invention, when the measurement target substance in the sample is measured using the binding reaction between the measurement target substance and the specific binding substance, the complex of the measurement target substance and its ligand is once dissociated. The measurement reaction system is measured by allowing the measurement target substance and the specific binding substance to undergo a binding reaction under conditions that suppress the reaction that causes the measurement target substance and the ligand, respectively, and then removing by performing a washing operation. When the complex of the target substance and its ligand no longer exists, the specific binding substance (same or different from the above specific binding substance) is further added to the measurement target substance bound to the specific binding substance. Is not required to be performed under conditions that suppress the reaction in which the complex of the substance to be measured and its ligand is dissociated to generate the substance to be measured and the ligand, respectively.
[0079]
Although it is a reagent for measuring a substance to be measured in a sample of the present invention, a component necessary for measurement of the substance to be measured in a sample such as a specific binding substance and a complex of the substance to be measured and its ligand are dissociated. It is a reagent composed of components for suppressing the reaction that causes the substance to be measured and the ligand, respectively.
[0080]
This measuring reagent of the present invention may be composed of a plurality of components separated from each other.
[0081]
◎ Explanation when the measurement of the present invention is applied to the indirect agglutination measurement method
[0082]
The case where the measurement according to the present invention is applied to an indirect agglutination reaction measurement method in which measurement is performed by agglutination formation of carrier particles, such as a latex agglutination reaction measurement method and an erythrocyte agglutination reaction measurement method, will be described with reference to the following examples.
[0083]
An example of this measurement procedure is shown below.
[0084]
(1) Prepare a measurement container in which a substance that specifically binds to the substance to be measured (first specific binding substance; for example, antibody, antigen, ligand, etc.) is immobilized in the solution storage part, and this first specific binding A certain amount of sample is added and brought into contact with the solution storage portion of the measurement container on which the substance is immobilized.
Thereby, the binding reaction between the measurement target substance in the sample and the first specific binding substance immobilized on the solution storage portion of the measurement container is performed.
[0085]
At this time, the measurement is performed under conditions that suppress the reaction in which the complex of the measurement target substance and its ligand contained in the sample is dissociated to generate the measurement target substance and the ligand, respectively.
[0086]
(For example, the binding reaction between the measurement target substance and the first specific binding substance immobilized on the solution storage portion of the measurement container is performed at a temperature within a certain range. Reagents with components such that the binding reaction with the first specific binding substance immobilized on the solution storage portion of the measurement container is carried out at a pH within a certain range or a salt concentration (ionic strength) within a certain range. Etc.)
[0087]
(2) Simultaneously with this addition / contact or within a certain period of time, the substance specifically binds to the substance to be measured and is the same as the first specific binding substance immobilized on the solution storage portion of the measurement container or A fixed amount of a particle carrier on which a different substance (second specific binding substance; for example, antibody, antigen, ligand, etc.) is immobilized is added to and brought into contact with the solution housing portion.
[0088]
(3) Then, after stirring for a certain period of time with a mixer or the like, the sample is allowed to stand, and when the measurement target substance is present in the sample, “solution containing portion of measurement container—first specific binding substance—measurement target substance” -"Second specific binding substance-particle carrier" bond is formed.
[0089]
Also at this time, the reaction is performed under conditions that suppress the reaction in which the complex of the measurement target substance and its ligand is dissociated to generate the measurement target substance and the ligand, respectively.
[0090]
(For example, the binding reaction between the measurement target substance immobilized through the first specific binding substance on the solution storage portion of the measurement container and the second specific binding substance immobilized on the particle carrier is constant. Alternatively, the measurement target substance immobilized on the solution storage portion of the measurement container via the first specific binding substance and the second specific binding immobilized on the particle carrier. (Use of a reagent having a component such that the binding reaction with a substance is performed at a pH within a certain range or at a salt concentration (ionic strength) within a certain range.)
[0091]
(4) After standing, the image in the solution storage part of the particle carrier on which the second specific binding substance is immobilized is determined by visual observation or measured with a measuring device such as a microplate reader within a certain time. If it can be detected, it is determined that the measurement target substance exists in the sample, and if the aggregated image cannot be detected, it is determined that the measurement target substance does not exist in the sample, thereby measuring the measurement target substance in the sample.
[0092]
In this measurement, the inner wall of the solution container of the measurement container and the particle carrier are passed through the measurement target substance in the sample, “the inner wall of the measurement container solution storage part—the first specific binding substance—the measurement target substance—the second specific binding. By binding to “substance-particle carrier”, an aggregated image of the particle carrier on which the second specific binding substance is immobilized can be obtained.
[0093]
The substance to be measured in the sample binds to both the first specific binding substance immobilized on the inner wall of the solution storage portion of the measurement container and the second specific binding substance immobilized on the particle carrier. A bond can be formed, and an agglomerated image (an image spreading at the bottom of the inner wall surface of the solution storage portion of the measurement container, a positive image) reflecting the amount of the substance to be measured in the sample can be obtained.
[0094]
This is shown in FIG.
[0095]
On the other hand, when the measurement target substance does not exist in the sample, the binding of “first specific binding substance-measurement target substance-second specific binding substance” is not formed, that is, “the measurement container solution containing portion” Since the bond of “inner wall—first specific binding substance—measurement target substance—second specific binding substance—particle carrier” is not formed, the particle carrier on which the second specific binding substance is immobilized is the solution containing portion of the measurement container. It rolls (slides) down on the inner wall surface, and an agglomerated image is not obtained, and an image converged on the bottom (negative image) is generated.
[0096]
This is shown in FIG.
[0097]
Therefore, only the measurement target substance in the sample can be selectively measured.
[0098]
Confirm the amount of the substance to be measured contained in the sample by obtaining the aggregation value, which is the maximum dilution factor that gives an aggregated image of the particle carrier when each of the diluted samples is measured. Can do.
[0099]
The aggregation value may be measured according to a conventional method. For example, first, a sample is added to a solution storage portion such as a well of a measurement container (such as a microplate) on which a first specific binding substance is immobilized. A dilution series is prepared by diluting stepwise with a sample dilution solution such as a buffer solution.
[0100]
At this time, the measurement is performed under conditions that suppress the reaction in which the complex of the measurement target substance and its ligand is dissociated to generate the measurement target substance and the ligand, respectively.
[0101]
Next, the particle carrier on which the antibody of the second specific binding substance is immobilized is added to each solution housing part, and the mixture is stirred.
[0102]
Also at this time, the reaction is performed under conditions that suppress the reaction in which the complex of the measurement target substance and its ligand is dissociated to generate the measurement target substance and the ligand, respectively.
[0103]
Thereafter, it is allowed to stand to determine or measure the presence / absence of aggregation by the particle carrier on which the second specific binding substance is immobilized, and the maximum dilution factor at which an aggregated image is obtained is adopted as the aggregation value. .
[0104]
Further, a sample diluted with a predetermined dilution factor can be measured according to the present invention, and the presence or absence of a substance to be measured in the sample can be qualitatively determined from the presence or absence of aggregation at this time.
[0105]
In the measurement of the measurement target substance in the sample according to the present invention, magnetic particles are used as the particle carrier for immobilizing the second specific binding substance, and the magnetic force is applied to the particle carrier to which the second specific binding substance is immobilized. A measurement method as described in JP-A-4-216466 and JP-A-4-242167, which can generate an aggregated image in a short time by applying the action, can also be applied.
[0106]
In the measurement of the measurement target substance in the sample according to the present invention, the sample is first mixed with the particle carrier on which the second specific binding substance is immobilized, and then the first specific binding substance is immobilized thereon. A second specific binding substance produced by this binding by adding to the solution storage part of the measuring container and bringing it into contact to form a bond of “first specific binding substance-measuring substance-second specific binding substance” It is also possible to measure a measurement target substance in a sample by detecting an aggregated image by agglomeration of a particle carrier on which is immobilized.
[0107]
In this case, mixing the particle carrier with the sample and reacting them, and adding and bringing them into contact with the solution storage part of the measurement container causes the complex of the substance to be measured and its ligand to dissociate. And the ligand are allowed to occur under conditions that inhibit the reaction that produces each.
[0108]
Further, in the measurement of the measurement target substance in the sample according to the present invention, the particle carrier on which the second specific binding substance is immobilized in advance is present in the solution storage portion of the measurement container on which the first specific binding substance is immobilized. In addition, a sample is added to and brought into contact with the solution storage portion of the measurement container to form a bond of “first specific binding substance-measurement target substance-second specific binding substance”, which is generated by this binding. The substance to be measured in the sample can also be measured by detecting an aggregated image by aggregation of the particle carrier on which the second specific binding substance is immobilized.
[0109]
In this case, adding the sample to the solution storage part of the measurement container in which the particle carrier is present, bringing the sample into contact, and reacting them, the complex of the measurement target substance and its ligand dissociates and the measurement target substance and the ligand are respectively separated. The reaction is performed under conditions that inhibit the reaction that occurs.
[0110]
When the measurement target substance in the sample according to the present invention is measured by the indirect agglutination reaction measurement method, the type, material, shape, etc. of the measurement container are not particularly limited as long as it can accommodate the solution. Can be used.
[0111]
This can be used without problems for containers generally used for measurement in indirect agglutination reaction measurement methods such as particle agglutination reaction measurement method using erythrocytes or gelatin particles or latex agglutination reaction measurement method.
[0112]
For example, a test tube, a microplate (microtiter plate) or a tray made of glass, polystyrene, polyvinyl chloride, polymethacrylate, or the like can be used.
[0113]
In addition, it is desirable that the bottom surface of the solution storage portion (such as a well of the microplate) of the measurement container has an inclined shape from the center to the periphery of the bottom, such as U-type, V-type, or UV-type.
[0114]
Any particle carrier can be used without particular limitation as long as it is a particle carrier generally used in indirect agglutination reaction measurement methods such as particle agglutination reaction measurement method or latex agglutination reaction measurement method.
[0115]
For example, animal erythrocytes such as sheep erythrocytes, particle carriers made of organic polymer substances such as liposomes, latex, gelatin, polyacrylamide, microcapsules or emulsion, particle carriers made of inorganic polymer substances such as glass, silica gel, carbon or bentonite Or other artificial carriers can be mentioned.
[0116]
In addition, a magnetic particle carrier prepared by coating the polymer particle carrier with a ferromagnetic material or dispersing the ferromagnetic material at the time of particle molding may be used.
[0117]
These particle carriers preferably have a particle diameter in the range of 0.01 to 100 μm, particularly preferably 0.5 to 10 μm.
[0118]
In addition, the specific gravity of these particle carriers is preferably in the range of 1 to 10, particularly preferably 1 to 2.
[0119]
A known method such as a physical adsorption method or a chemical binding method can be used as a method for immobilizing a specific binding substance on the inner wall surface or particle carrier of the solution storage portion of the measurement container.
[0120]
In the case of the physical adsorption method, a specific binding substance dissolved in a buffer solution or the like is added to the solution storage part of the measurement container and brought into contact with the inner wall surface according to a known method, or the specific binding substance and the particle carrier are buffered. It can be carried out by mixing and contacting in a solution such as a liquid.
[0121]
For example, a specific binding substance dissolved in a buffer solution or the like is added to the solution storage portion of the measurement container and brought into contact with the inner wall surface, or the specific binding substance and the particle carrier are mixed and brought into contact in a solution such as a buffer solution. From about 2 ° C. to about 40 ° C. for about 10 minutes to about 1 day.
[0122]
In addition, when the chemical binding method is used, the Japanese Society of Clinical Pathology, “Special Issue on Clinical Pathology No. 53, Immunoassay for Clinical Examination—Technology and Applications”, Clinical Pathology Publications, 1983, Japan Biochemical Society In accordance with a known method described in ed. “Shinsei Kagaku Kenkyu Koza 1 Protein IV”, Tokyo Kagaku Dojin, 1991, etc., glutaraldehyde, carbodiimide, imide are used as the inner wall surface of the solution storage portion of the measurement container or the particle carrier and the specific binding substance Mixing and contacting with a divalent cross-linking reagent such as ester or maleimide, the inner wall surface of the solution storage part of the measuring vessel, the particle carrier, and the specific binding substance, each amino group, carboxyl group, SH group, aldehyde group or hydroxyl group Immobilization can be carried out by reacting with the above.
[0123]
Further, if it is necessary to carry out treatment to suppress non-specific reaction, the inner wall surface or particle carrier of the solution storage part of the measurement container on which the specific binding substance is immobilized, bovine serum albumin (BSA), casein, Blocking treatment (masking treatment) may be carried out by a known method such as contact with a protein such as gelatin, ovalbumin or a salt thereof, a surfactant, skim milk powder or the like.
[0124]
Various aqueous solvents can be used for the dispersion medium for suspending the particle carrier on which the specific binding substance is immobilized, or the diluted solution of the sample.
[0125]
For example, an aqueous solvent such as purified water, physiological saline, or various buffers such as tris (hydroxymethyl) aminomethane buffer, phosphate buffer, or phosphate buffered saline can be used. In addition, about pH of this buffer solution, it is preferable to exist in the range of pH 3-12.
[0126]
In addition, a dispersion medium for suspending a particle carrier on which a specific binding substance is immobilized, or a diluted solution of a sample includes proteins such as BSA, human serum albumin, casein or a salt thereof, various salts such as sodium chloride, and various sugars. , Various animal sera such as skim milk powder, normal rabbit serum, various preservatives such as sodium azide or various surfactants such as nonionic surfactant, amphoteric surfactant or anionic surfactant It can be used by appropriately adding.
[0127]
And the density | concentration at the time of adding these is although it does not specifically limit, 0.001 to 10% (W / V) is preferable, and 0.01 to 5% (W / V) is especially preferable.
[0128]
These surfactants include sorbitan fatty acid ester, glycerin fatty acid ester, decaglycerin fatty acid ester, polyoxyethylene sorbitan fatty acid ester, polyoxyethylene glycerin fatty acid ester, polyethylene glycol fatty acid ester, polyoxyethylene alkyl ether, polyoxy Amphoteric, such as ethylene phytosterol, phytostanol, polyoxyethylene polyoxypropylene alkyl ether, polyoxyethylene alkylphenyl ether, nonionic surfactant such as polyoxyethylene castor oil, hydrogenated castor oil or polyoxyethylene lanolin, betaine acetate Surfactants or shades such as polyoxyethylene alkyl ether sulfate or polyoxyethylene alkyl ether acetate It can be given on surfactants or the like.
[0129]
◎ Explanation when the measurement of the present invention is applied to a measurement method using a labeling substance
[0130]
The case where the measurement of the present invention is applied to a measurement method using a labeling substance such as an ELISA method or an ELSA method will be described below with reference to examples.
[0131]
It is possible to detect and measure a labeling substance bound to a substance that specifically binds to the measurement target substance (specific binding substance) or a labeling substance bound to a substance that competes with the measurement target substance (competitive substance). Immunoassay using a labeling substance such as enzyme immunoassay, fluorescence immunoassay, radioimmunoassay, or luminescence immunoassay, or sandwich method such as ELSA method, competitive method, or homogeneous system It can carry out by methods, such as a method (homogeneous system method).
[0132]
When measurement is performed by a measurement method using these labeling substances, it can be performed according to the procedure of a known method. An example of measurement by the sandwich method is shown below.
[0133]
(1) A solid phase carrier on which a substance that specifically binds to the substance to be measured (first specific binding substance; for example, antibody, antigen, ligand, etc.) is prepared, and the first specific phase of this solid phase carrier is prepared. A certain amount of sample is added to the portion where the binding substance is immobilized and brought into contact for a certain period of time.
[0134]
Thereby, when the measurement target substance exists in the sample, a bond of “solid phase carrier-first specific binding substance-measurement target substance” is formed.
[0135]
At this time, the bond formation reaction is performed under conditions that suppress the reaction in which the complex of the measurement target substance and its ligand contained in the sample is dissociated to generate the measurement target substance and the ligand, respectively.
[0136]
(For example, the binding reaction between the substance to be measured and the first specific binding substance immobilized on the solid phase carrier is performed at a temperature within a certain range. Alternatively, the substance to be measured and the solid phase carrier are performed. And the like, using a reagent having a component such that the binding reaction with the first specific binding substance immobilized on is performed at a pH within a certain range or a salt concentration (ionic strength) within a certain range. )
[0137]
(2) A substance that specifically binds to a substance to be measured and that is immobilized on the solid phase carrier simultaneously with this addition / contact, within a certain period of time, or after washing, Immobilize the first specific binding substance of this solid phase carrier with a certain amount of the same or different substance (second specific binding substance; for example, antibody, antigen, ligand, etc.) bound to a labeling substance such as an enzyme. Add to the part and contact for a certain time.
[0138]
By this operation, when the measurement target substance is present in the sample, a bond of “solid phase carrier-first specific binding substance-measurement target substance-second specific binding substance-labeled substance” is formed.
[0139]
Also in this case, the binding is performed under the condition that suppresses the reaction in which the complex of the measurement target substance and its ligand contained in the sample is dissociated and generates the measurement target substance and the ligand, respectively, except when washing is performed. Allow the formation reaction to take place.
[0140]
(For example, the binding reaction between the measurement target substance immobilized on the solid phase carrier via the first specific binding substance and the second specific binding substance bound with the labeling substance is performed at a temperature within a certain range. Alternatively, the binding reaction between the measurement target substance immobilized on the solid phase carrier via the first specific binding substance and the second specific binding substance bound with the labeling substance is within a certain range. (This is performed using a reagent of a component that is performed at a pH within the range or a salt concentration (ionic strength) within a certain range.)
[0141]
[When washing is performed, the complex of the measurement target substance and its ligand contained in the sample has been washed away and does not exist in the measurement reaction system. It is not necessary to cause the bond formation reaction to be carried out under conditions that suppress the reaction in which the complex of the compound dissociates to generate a measurement target substance and a ligand, respectively. ]
[0142]
(3) Next, unbound “second specific binding substance bound with a labeling substance” not bound to the solid phase carrier is washed and separated. (B / F separation)
[0143]
(4) Then, by detecting the labeled substance bound to the solid phase carrier by the binding of “solid phase carrier-first specific binding substance-measuring substance-second specific binding substance-labeling substance”, Measure the target substance.
[0144]
In this measurement, the solid phase carrier and the labeling substance bind to the “solid phase carrier-first specific binding substance-measuring target substance-second specific binding substance-labeling substance” via the measurement target substance in the sample. Therefore, by measuring the amount of the labeling substance bound to the solid phase carrier, the presence / absence or amount of the measurement target substance contained in the sample can be measured.
[0145]
The detection of the labeling substance bound to the solid phase carrier by the binding of “solid phase carrier-first specific binding substance-measuring substance-second specific binding substance-labeling substance” is the enzyme immunoassay or ELSA In the method of measuring using an enzyme as a labeling substance, such as a method, in the measurement reagent, the substrate is reacted with the labeled enzyme under the optimum conditions, and the amount of the reaction product is measured by measuring the absorbance of the reaction product, etc. Measurement is performed by an optical method or the like.
[0146]
In a method of measuring using a fluorescent substance as a labeling substance such as a fluorescent immunoassay, and in a measurement reagent, the measurement is performed by measuring the fluorescence intensity of the labeled fluorescent substance.
[0147]
In a method of measuring using a radioactive substance as a labeling substance, such as a radioimmunoassay, and a measurement reagent, the measurement is performed by measuring the radiation dose of the labeled radioactive substance.
[0148]
Measurement is performed by measuring the amount of luminescence in a luminescence reaction system involving a labeling substance in a method for measuring using a substance related to the luminescence reaction as a labeling substance, such as a luminescence immunoassay, and a measuring reagent.
[0149]
In any case, the labeling substance can be detected according to a known method of measurement using the labeling substance.
[0150]
When the measurement target substance in the sample of the present invention is measured using a labeling substance, the sample is first mixed with a second specific binding substance bound with a labeling substance such as an enzyme, and then contacted. The first specific binding substance of the solid phase carrier on which the first specific binding substance is immobilized is added to the portion where the first specific binding substance is immobilized and brought into contact with the solid phase carrier, “solid phase carrier-first specific binding substance-substance to be measured-second It is also possible to measure the presence or absence or amount of the substance to be measured in the sample by forming a bond of “specific binding substance-labeling substance” and measuring the amount of the labeling substance bound to the solid phase carrier by this binding. it can.
[0151]
In this case, the sample is mixed with the second specific binding substance to which the labeling substance is bound, brought into contact with the sample, and then the mixture is placed on the portion of the solid phase carrier on which the first specific binding substance is immobilized. When the reaction is carried out by adding and contacting, the reaction is carried out under conditions that suppress the reaction in which the complex of the substance to be measured and its ligand contained in the sample is dissociated to produce the substance to be measured and the ligand, respectively.
[0152]
Further, when the measurement target substance in the sample of the present invention is measured using a labeling substance, a labeling substance such as an enzyme is previously bound on the solid phase carrier on which the first specific binding substance is immobilized. The sample was added to and contacted with this solid phase carrier in the presence of a bispecific binding substance, and “solid phase carrier-first specific binding substance-measuring object-second specific binding substance-labeling substance” The presence or amount of the substance to be measured in the sample can also be measured by forming a bond and measuring the labeled substance bound to the solid phase carrier by this bond.
[0153]
Here, when the sample is added to, contacted with, and reacted with the solid phase carrier in which the second specific binding substance to which the labeling substance has been bound is present, the measurement target substance contained in the sample and its ligand are included. The reaction is carried out under conditions that suppress the reactions that dissociate the complex and produce the measurement target substance and the ligand, respectively.
[0154]
And when measuring the substance to be measured in the sample of the present invention using a labeling substance, each of the two types of enzymes described in JP-A-1-123148, which catalyzes a series of successive reactions, is described. Using two types of enzyme labeling substances bound to an insoluble carrier together with a substance that specifically binds to the substance to be measured (specific binding substance), these are passed through the substance to be measured having two or more specific binding sites. It is also possible to perform measurement by applying to a method for measuring a substance having a specific binding site by a homogeneous system (homogeneous system), in which the amount of a substance to be measured is obtained by a continuous enzyme reaction in close proximity.
[0155]
For example, an insoluble carrier such as a latex particle bound with a first specific binding substance and glucose oxidase, and an insoluble carrier such as a latex particle bound with a second specific binding substance and peroxidase are prepared, and a substance to be measured is added to these. A sample presumed to be mixed and glucose are mixed and brought into contact with each other, and the amount of hydrogen peroxide generated from glucose oxidase and peroxidase in close proximity via the substance to be measured is changed to 4-aminoantipyrine or the like and phenol derivative or aniline derivative or the like. It is also possible to measure with a homogenous system (homogeneous system) by measuring with the Trinder reaction system to be used and measuring the substance to be measured contained in the sample.
[0156]
Here, the sample is mixed and contacted with an insoluble carrier such as latex particles bound with the first specific binding substance and glucose oxidase, and an insoluble carrier such as latex particles bound with the second specific binding substance and peroxidase. When the reaction is performed, the reaction is performed under conditions that suppress the reaction in which the complex of the measurement target substance and its ligand contained in the sample is dissociated to generate the measurement target substance and the ligand, respectively.
[0157]
Alternatively, when the measurement target substance in the sample of the present invention is measured using a labeling substance, the solid phase carrier on which the first specific binding substance is immobilized, or the second specific binding substance not bound to the labeling substance , And a substance that specifically binds to a second specific binding substance to which a labeling substance such as an enzyme is bound, "solid phase carrier-first specific binding substance-measurement substance-second specific binding substance" The presence / absence or amount of the substance to be measured in the sample is determined by measuring the labeling substance bound to the solid phase carrier by forming a bond of “substance specifically binding to the second specific binding substance-labeling substance” Can also be measured.
[0158]
Here, when a sample is added to and contacted with the portion of the solid phase carrier on which the first specific binding substance is immobilized, and when a second specific binding substance is further added to, contacted with, the reaction. The reaction is performed under a condition that suppresses the reaction in which the complex of the measurement target substance and its ligand contained in the sample is dissociated to generate the measurement target substance and the ligand, respectively.
[0159]
Furthermore, by adding an excessive amount of the second specific binding substance bound with a labeling substance such as an enzyme, and then separately quantifying the amount of the second specific binding substance bound with the labeling substance. The amount of the substance to be measured in the sample can also be measured.
[0160]
In the measurement of the substance to be measured in the sample according to the present invention, a substance made of a magnetic substance or a substance containing a magnetic substance is used as a solid phase carrier, and a magnetic force is applied to this substance to magnetically separate B / F separation. It can also be done.
[0161]
When the measurement target substance in the sample of the present invention is measured using a labeling substance, the solid phase carrier may be of any type, material, shape, etc. as long as it can immobilize a specific binding substance. It can be used without any particular limitation.
[0162]
This is the case for carriers generally used for measurement in enzyme immunoassay, fluorescence immunoassay, radioimmunoassay, luminescence immunoassay, or immunoassay using a labeling substance such as ELSA. Can be used without problems.
[0163]
For example, it is made of materials such as polystyrene, polycarbonate, polyvinyl toluene, polypropylene, polyethylene, polyvinyl chloride, nylon, polymethacrylate, polyacrylamide, latex, liposome, gelatin, agarose, cellulose, sepharose, glass, metal, ceramics or magnetic material. Solid phase carriers such as particles, microcapsules, beads, microplates, test tubes, sticks or test pieces can be used.
[0164]
Further, a magnetic solid phase carrier prepared by coating the solid phase carrier with a ferromagnetic material or containing a ferromagnetic material at the time of solid phase carrier molding can be used.
[0165]
As a method of binding the labeling substance to the specific binding substance or the substance to be measured, a known method such as a chemical binding method can be used.
[0166]
When this chemical binding method is used, the Japanese Society of Clinical Pathology “Special Issue on Extraordinary Clinic No. 53: Immunoassay for Clinical Examination—Technology and Applications”, Clinical Pathology Publications, 1983, Japan Biochemical Society In accordance with a known method described in “Shinsei Kagaku Kenkyu Ken 1 Protein IV”, Tokyo Kagaku Dojin, 1991, etc., label substances such as enzymes, fluorescent substances or radioactive substances, specific binding substances or substances to be measured, etc. Mixing, bringing into contact with a divalent cross-linking reagent such as aldehyde, carbodiimide, imide ester or maleimide, each amino group, carboxy group, SH group, aldehyde group or hydroxyl group of the labeling substance, specific binding substance or measurement target substance, etc. Bonding can be performed by reacting with the above.
[0167]
As a method for immobilizing a specific binding substance, a measurement target substance or the like on the solid phase carrier, a known method such as a physical adsorption method or a chemical binding method can be used.
[0168]
In the case of the physical adsorption method, according to a known method, a specific binding substance or a substance to be measured dissolved in a buffer solution or the like is added to and brought into contact with the portion to be immobilized on the solid phase carrier, or specific binding is performed. The substance or the substance to be measured and the solid phase carrier can be mixed and brought into contact with each other in a solution such as a buffer solution.
[0169]
For example, a specific binding substance or a measurement target substance dissolved in a buffer solution or the like is added to and brought into contact with a portion to be immobilized on the solid phase carrier, or a specific binding substance or a measurement target substance and the solid phase carrier are contacted. Mixing and contacting in a solution such as a buffer solution is performed at about 2 ° C. to about 40 ° C. for about 10 minutes to about 1 day.
[0170]
In addition, when the chemical binding method is used, the Japanese Society of Clinical Pathology, “Special Issue on Clinical Pathology No. 53, Immunoassay for Clinical Examination—Technology and Applications”, Clinical Pathology Publications, 1983, Japan Biochemical Society In accordance with a known method described in ed. “Shinsei Kagaku Kenkyu Ken 1 Protein IV”, Tokyo Kagaku Dojin, 1991, etc., a solid phase carrier or a portion to be immobilized on a solid phase carrier and a specific binding substance or a substance to be measured , Glutaraldehyde, carbodiimide, imide ester or maleimide, etc., mixed with, and brought into contact with, a solid phase carrier, a part to be immobilized on a solid phase carrier, a specific binding substance, or a substance to be measured, etc. Immobilization can be carried out by reacting with an amino group, carboxyl group, SH group, aldehyde group, hydroxyl group or the like.
[0171]
Furthermore, if it is necessary to carry out treatment to suppress non-specific reaction, this immobilized part of the solid phase carrier on which the specific binding substance or the substance to be measured is immobilized is replaced with BSA, casein, gelatin, A blocking treatment (masking treatment) may be carried out by a known method such as contact with a protein such as ovalbumin or a salt thereof, a surfactant, skimmed milk powder or the like to coat.
[0172]
Various aqueous solvents can be used for a solution that dissolves a specific binding substance or a substance to be measured or the like to which a labeling substance is bound, or a diluted solution of a sample.
[0173]
For example, an aqueous solvent such as purified water, physiological saline, or various buffers such as tris (hydroxymethyl) aminomethane buffer, phosphate buffer, or phosphate buffered saline can be used. In addition, about pH of this buffer solution, it is preferable to exist in the range of pH 3-12.
[0174]
In addition, a solution that dissolves a specific binding substance or a substance to be measured or the like to which a labeling substance is bound, or a diluted sample solution include proteins such as BSA, human serum albumin, casein or a salt thereof, and various salts such as sodium chloride. , Various sugars, skim milk powder, various animal sera such as normal rabbit serum, various preservatives such as sodium azide, various surfactants such as nonionic surfactant, amphoteric surfactant or anionic surfactant An agent or the like can be added as appropriate.
[0175]
And the density | concentration at the time of adding these is although it does not specifically limit, 0.001 to 10% (W / V) is preferable, and 0.01 to 5% (W / V) is especially preferable.
[0176]
These surfactants include sorbitan fatty acid ester, glycerin fatty acid ester, decaglycerin fatty acid ester, polyoxyethylene sorbitan fatty acid ester, polyoxyethylene glycerin fatty acid ester, polyethylene glycol fatty acid ester, polyoxyethylene alkyl ether, polyoxy Amphoteric, such as ethylene phytosterol, phytostanol, polyoxyethylene polyoxypropylene alkyl ether, polyoxyethylene alkylphenyl ether, nonionic surfactant such as polyoxyethylene castor oil, hydrogenated castor oil or polyoxyethylene lanolin, betaine acetate Surfactants or shades such as polyoxyethylene alkyl ether sulfates or polyoxyethylene alkyl ether acetates It can be given on surfactants or the like.
[0177]
Examples of the labeling substance include peroxidase (POD), alkaline phosphatase (ALP), β-galactosidase, urease, catalase, glucose oxidase, lactate dehydrogenase or α-amylase when the measurement is performed by enzyme immunoassay. When the enzyme is performed by a fluorescent immunoassay, a fluorescent substance such as fluorescein isothiocyanate, tetramethylrhodamine isothiocyanate, substituted rhodamine isothiocyanate or dichlorotriazine isothiocyanate is used. A radioactive substance such as iodine 125 or iodine 131 can be used.
[0178]
Further, when the measurement is performed by a luminescence immunoassay, acridinium ester, alkaline phosphatase, peroxidase, glucose oxidase or the like is used as a labeling substance, and acridinium ester, dioxetane compound, luminol-hydrogen peroxide- POD or NADH-FMNH ₂ -The labeling substance bound to the solid phase carrier can be detected by a luciferase system or the like.
[0179]
【Example】
Hereinafter, the present invention will be further described with reference to Examples and Reference Examples. In addition, this invention is not limited by these.
[0180]
[Example 1] Measurement of a sample comprising a protein S-C4b binding protein complex at various temperatures by the ELSA method / sandwich method
[0181]
C4b immobilized on the sample and the well of the microplate when measuring a protein S-C4b binding protein complex sample by the measurement method (measurement reagent) of protein S in the sample by the ELSA method / sandwich method The reaction with the binding protein was carried out at various temperatures for measurement.
[0182]
(1) Preparation of C4b binding protein-immobilized microplate reagent
[0183]
(1) C4b binding protein The method of Dahlbeack et al. [Biochem. J. et al. 209, 847-856, 1983].
[0184]
{Circle around (2)} The prepared C4b binding protein was dissolved in a carbonate buffer (50 mM sodium bicarbonate (pH 9.6)) to a concentration of 2.5 μg / mL.
100 μL per well was added to each well of a 96-well-microplate (“MODULE PLATE F8” (trade name); manufactured by NUNK), and allowed to stand overnight at 4 ° C. to obtain a C4b binding protein microplate. To the wells.
[0185]
(3) Each well of this microplate was washed 3 times with a washing solution [50 mM phosphate buffered saline (pH 7.4) containing 0.05% Tween 20], followed by blocking solution [“Block Ace "(Trade name) (Dainippon Pharmaceutical Co., Ltd.) dissolved in pure water to a concentration of 25%" was added at 250 μL per well, and the mixture was allowed to stand at 4 ° C overnight, followed by blocking. It was washed again with a washing solution.
By the above operation, a C4b binding protein-immobilized microplate reagent was prepared.
[0186]
(2) Preparation of peroxidase-labeled anti-protein S / monoclonal antibody reagent
[0187]
(1) The present inventors prepared monoclonal antibodies according to a conventional method using purified free protein S as an immunizing antigen.
A hybridoma producing a monoclonal antibody that specifically binds to a site other than the binding site of protein S to the C4b binding protein was screened to obtain a mouse / mouse hybridoma (strain 9H6).
[0188]
5 mg of mouse anti-protein S monoclonal antibody produced from this hybridoma (9H6 strain) was dissolved in 0.5 mL of sodium phosphate buffer (pH 7.5).
To this, 0.01 mL of N, N-dimethylformamide in which 0.6 mg of S-acetylmercaptosuccinic anhydride was dissolved was added and incubated at room temperature for 30 minutes.
[0189]
(2) Next, 0.02 mL of 0.1 M EDTA aqueous solution, 0.1 mL of 1 M tris (hydroxymethyl) aminomethane buffer (pH 7.0), and 1 M hydroxylamine hydrochloride buffer (pH 7.0) were added thereto. ) 0.1 mL was added and incubated at 30 ° C. for 30 minutes.
Thereafter, this was subjected to gel filtration with a Sephadex G-25 column, which had been equilibrated with 0.1 M sodium phosphate buffer (pH 6.0) containing 5 mM EDTA, and mercapto-succinylated mouse anti-protein S. -A monoclonal antibody was obtained.
[0190]
(3) 2 mg of peroxidase (POD or HRP) [derived from horseradish; manufactured by Toyobo Co., Ltd.] was dissolved in 0.3 mL of 0.1 M sodium phosphate buffer (pH 7.0).
30 μL of N, N-dimethylformamide in which 0.25 mg of N-succimidyl-6-maleimidohexanoic acid was dissolved was added thereto and incubated at 30 ° C. for 60 minutes.
[0191]
Thereafter, this was subjected to gel filtration with a Sephadex G-25 column which had been equilibrated with 0.1 M sodium phosphate buffer (pH 6.0) to obtain maleimidated peroxidase.
[0192]
(4) 2.3 mg of the mercapto-succinylated mouse anti-protein S monoclonal antibody prepared in (2) above was added to 0.25 mL of 0.1 M sodium phosphate buffer (pH 6.0) containing 5 mM EDTA. Dissolved.
To this was added 1.8 mg of the maleimidated peroxidase prepared in (3) above and dissolved in 0.25 mL of 0.1 M sodium phosphate buffer (pH 6.0).
[0193]
This mixture was incubated at 30 ° C. for 20 hours, and then subjected to gel filtration with an ultragel AcA34 column equilibrated with 0.1 M sodium phosphate buffer (pH 6.5) to obtain mouse anti-protein S / monoclonal antibody. Peroxidase-labeled anti-protein S monoclonal antibody labeled with peroxidase was obtained.
[0194]
(5) Peroxidase-labeled anti-protein S / monoclonal antibody obtained in (4) above was diluted with a sample diluent [25% “Block Ace” (trade name) (Dainippon Pharmaceutical Co., Ltd.), 0.1M sodium chloride, And 10 mM Tris (hydroxymethyl) aminomethane buffer (pH 7.5) containing 5 mM calcium chloride] was diluted to 1 μg / mL to prepare a peroxidase-labeled anti-protein S / monoclonal antibody reagent.
[0195]
(3) Sample preparation
[0196]
◎ Preparation of protein S-C4b binding protein complex
Protein S-C4b binding protein complex The method of Dahlbeack et al. [Biochem. J. et al. 209, 837-846, 1983].
[0197]
This was diluted with the above-mentioned specimen diluent, and two types of “protein S-C4b binding protein complex samples” having protein S-C4b binding protein complex concentrations of 0.27 nM and 2.7 nM were prepared. .
[0198]
These three types of “protein S-C4b binding protein complex samples” do not contain protein S in a free state.
Moreover, pH of these three “protein S sample-C4b binding protein complex samples” was 7.5 and the salt concentration was 100 mM.
[0199]
The sample dilution was used as a sample having a protein S concentration and a protein S-C4b binding protein complex concentration of 0 nM.
[0200]
(4) Measurement of protein S in the sample
[0201]
By using the “C4b binding protein-immobilized microplate reagent” prepared in (1) and the “peroxidase-labeled anti-protein S / monoclonal antibody reagent” prepared in (2) above, free protein in the sample S can be measured. Using this reagent, the “protein S-C4b binding protein complex sample” prepared in the above (3) was measured at various temperatures.
[0202]
(1) Concentrations of the protein S-C4b binding protein complex prepared in (3) above are 0.27 nM and 2.7 nM, and sample dilutions (protein S-C4b binding protein complex and A sample having a protein S concentration of 0 nM) was dispensed into a microplate well of the C4b-binding protein-immobilized microplate reagent prepared in (2) above at 100 μL per well.
This operation was performed on nine microplates.
[0203]
Then, each of the microplates was allowed to stand for 1 hour at nine temperatures of 0 ° C, 5 ° C, 10 ° C, 15 ° C, 20 ° C, 25 ° C, 29 ° C, 33 ° C, or 37 ° C. The reaction was performed.
[0204]
(2) After the reaction at each temperature for 1 hour, each well of the microplate subjected to the reaction was washed three times with the washing solution (3) in (1).
By this operation, components such as protein S that did not bind to the immobilized C4b binding protein were removed from the well. (BF separation)
[0205]
(3) 100 μL of the peroxidase-labeled anti-protein S / monoclonal antibody reagent prepared in (2) above was dispensed into each well of the microplate after washing in (2) above.
And this was left still at room temperature for 1 hour, and reaction was performed.
[0206]
By this operation, peroxidase-labeled anti-protein S / monoclonal antibody was bound to protein S bound to the C4b binding protein immobilized on the well of the microplate.
[0207]
(4) After the reaction at room temperature for 1 hour, each well of the microplate subjected to the reaction was washed with the washing solution three times.
By this operation, components such as peroxidase-labeled anti-protein S / monoclonal antibody that did not bind to protein S indirectly immobilized on the microplate were removed from the wells. (BF separation)
[0208]
(5) Thereafter, an HRP coloring reagent [including 3,3 ′, 5,5′-tetramethylbenzidine (TMB); “TMB Soluble Reagent”, manufactured by Scy Tek Laboratories (USA)] is used in the above (4). After washing, 100 μL was added to each well of the microplate, and a color reaction was performed at room temperature for 15 minutes.
[0209]
(6) Thereafter, a color-development reagent (“TMB Soluble Reagent”, manufactured by Scy Tek Laboratories (USA)) was added in an amount of 100 μL to each well of the microplate subjected to this reaction, and the color reaction was performed. Was stopped.
[0210]
(7) The absorbance at 450 nm of each well of the microplate was measured with an EIA microplate reader (Bio-Rad).
[0211]
(8) The measured value (concentration) of protein S in the sample was determined as follows.
B. The method of Dahlbeack et al. [Biochem. J. et al. 209, 837-846, 1983], using free protein S prepared from human plasma as a standard substance, and performing the above measurement operation in the same manner as in the previous sample, to determine the absorbance. The protein S concentration in the measured sample was calculated by comparing the absorbance of both the sample and the standard substance.
[0212]
(9) The measurement operations of (1) to (8) are also performed for the sample diluent prepared in (3) (sample with protein S-C4b binding protein complex and protein S concentration of 0 nM). It was.
[0213]
The results of these measurements are shown in Table 1.
[0214]
[Table 1]

[0215]
Further, the results of these measurements, the vertical axis represents the measured value of protein S in the sample (absorbance difference at 450 nm), and the horizontal axis represents the concentration of protein S-C4b binding protein complex in the sample, It was shown in FIGS.
[0216]
Here, when the reaction between the sample and the C4b binding protein immobilized on the well of the microplate was performed at 0 ° C., the reaction was performed at FIG. 1, 5 ° C., and at FIG. 2, 10 ° C. Fig. 3, when performed at 15 ° C Fig. 4, when performed at 20 ° C Fig. 5, when performed at 25 ° C Fig. 6, when performed at 29 ° C FIG. 7 shows the results when the test was performed at 33 ° C., and FIG. 9 shows the test when the test was performed at 37 ° C.
[0217]
In these figures, the measurement value of the “protein S-C4b binding protein complex sample” is represented by “♦”.
[0218]
In addition, the vertical axis indicates the measurement value of protein S in the sample [concentration (nM)], and the horizontal axis indicates the reaction between the sample and the C4b binding protein immobilized on the well of the microplate. The figure represented as the temperature at the time of making was shown in FIGS. 10-12.
[0219]
Here, the results of the sample with the protein S-C4b binding protein complex and the protein S concentration of 0 nM (sample dilution liquid) are shown in FIG. 10, and the concentration of the protein S-C4b binding protein complex is 0.27 nM. FIG. 11 shows the result of FIG. 11, and FIG. 12 shows the result of the sample of 2.7M.
10 to 12, the measurement value of the “protein S-C4b binding protein complex sample” is represented by “♦”.
[0220]
(5) Discussion
[0221]
{Circle around (1)} Protein S can only bind one-to-one with its ligand, C4b binding protein.
Therefore, the protein S-C4b binding protein complex cannot further bind to the C4b binding protein.
[0222]
Therefore, the protein S-C4b binding protein complex contained in the sample is no longer bound to the C4b binding protein immobilized on the well of the microplate even in the measurement by the ELSA method / sandwich method in (4) above. Since it cannot, it will not be indirectly immobilized on the microplate, no color development will occur and no increase in absorbance should be seen.
[0223]
However, for example, when the reaction between the sample in (1) of (4) and the C4b binding protein immobilized on the well of the microplate is performed at 37 ° C., as is clear from FIG. It can be seen that absorbance was also generated when measurement was performed using the protein S-C4b binding protein complex as a sample.
[0224]
That is, in the measurement of protein S in the sample, when the reaction between the sample and the C4b binding protein immobilized on the well of the microplate was performed at 37 ° C., the protein S-C4b binding protein contained in the sample A reaction occurs in which the complex is dissociated to form a protein S and a C4b binding protein complex, respectively, and the protein S generated by the dissociation also binds to the C4b binding protein immobilized on the well of the microplate. It can be seen that, in addition to the protein S contained in the protein S, the protein S-C4b binding protein complex is also measured as the protein S, and a positive error occurs in the measured value of the protein S in the sample.
[0225]
Therefore, when the binding reaction between the protein S as the measurement target substance and the C4b binding protein as the ligand is performed at 37 ° C., the reactions generated by the dissociation of the complex between the measurement target substance and the ligand proceed. It is clear that it is under conditions.
[0226]
{Circle around (2)} When the reaction between the sample and the C4b binding protein immobilized on the well of the microplate is performed at a temperature of 20 ° C. or higher, the same can be said as when the reaction was performed at 37 ° C.
This is clear from the results shown in Table 1 and each figure.
[0227]
That is, in the sample containing the protein S-C4b binding protein complex at a concentration of 0.27 nM or 2.7 nM and not containing protein S, both are fixed to the well of the sample and the microplate. When the temperature when the reaction with the C4b binding protein is performed is less than 20 ° C., the measured value (absorbance difference, concentration) of protein S is zero (or almost zero), In the case of 20 ° C. or higher, a measured value of protein S having a higher absorbance difference (or concentration) is obtained as the temperature increases.
[0228]
That is, at a temperature lower than 20 ° C., the reaction in which the protein S-C4b binding protein complex contained in the sample is dissociated to produce protein S and C4b binding protein can be suppressed. The protein S-C4b binding protein complex contained in the sample was dissociated to produce protein S and C4b binding protein, respectively, and it was confirmed that a positive error occurred in the measurement of protein S in the sample. .
[0229]
(3) From the above results, the complex of the measurement target substance and its ligand is dissociated and measured by performing the binding reaction between the measurement target substance contained in the sample and the specific binding substance at less than 20 ° C. It was possible to suppress reactions that generate the target substance and the ligand, respectively, thereby preventing the occurrence of a positive error and confirming that the target substance in the sample can be accurately measured.
[0230]
As can be seen from the results of this examination, the binding reaction between the substance to be measured and the specific binding substance is preferably carried out at 0 ° C. to 15 ° C. in terms of accuracy, and further carried out at 0 ° C. to 10 ° C. Is particularly preferred.
[0231]
[Example 2] Addition / recovery test when protein S in a sample is measured by the measurement method and reagent of the present invention
[0232]
When the measurement method and measurement reagent of the present invention are applied to the measurement of protein S in a sample by the ELSA method / sandwich method, it is confirmed whether or not the amount of protein S added to the sample can be accurately measured. A test (addition recovery test) was conducted to confirm the accuracy of.
[0233]
(1) Preparation of C4b binding protein-immobilized microplate reagent
[0234]
A “C4b-binding protein-immobilized microplate reagent” was prepared as described in Example 1 (1).
[0235]
(2) Preparation of peroxidase-labeled anti-protein S / monoclonal antibody reagent
[0236]
“Peroxidase-labeled anti-protein S / monoclonal antibody reagent” was prepared as described in Example 1 (2).
[0237]
(3) Sample preparation
[0238]
(1) Preparation of protein S
Protein S, B. The method of Dahlbeack et al. [Biochem. J. et al. 209, 837-846, 1983].
A sample having a protein S concentration and a protein S-C4b binding protein complex concentration of 0 nM was used as a specimen dilution.
[0239]
(2) Preparation of protein S-added plasma sample
Protein S-deficient plasma, that is, plasma with a protein S concentration of 0 nM is prepared, and protein S concentrations of 5 nM, 10 nM, 20 nM, and 40 nM are prepared by adding protein S of (1) above. did.
For protein S-deficient plasma, an affinity column (9H6-Sepharose) to which the mouse anti-protein S / monoclonal antibody prepared in (2) of Example 1 was bound was prepared, normal human plasma was passed through this column, and the column was passed. The collected plasma was collected.
The affinity column (9H6-Sepharose) was prepared by binding mouse anti-protein S / monoclonal antibody to CNBr activated Sepharose (manufactured by Amersham Pharmacia Biotech) according to the instruction manual.
[0240]
(4) Measurement of protein S in the sample
[0241]
Using the “C4b-binding protein-immobilized microplate reagent” in (1) and the “peroxidase-labeled anti-protein S / monoclonal antibody reagent” in (2), the four types of “Protein S” prepared in (3) above are used. With respect to “added plasma sample” and “protein S deficient plasma sample”, protein S in the sample was measured.
[0242]
In addition, description of (4) of the said Example 1 except having changed the sample in this way, and having performed reaction of the sample and the C4b binding protein fix | immobilized by the well of the microplate only at 4 degreeC. The measurement operation was performed as follows.
[0243]
(5) Measurement results
[0244]
The measurement results are shown in FIG.
In this figure, the horizontal axis represents the protein S concentration (nM) contained in the measured sample, and the vertical axis represents the protein S concentration measurement value (nM) obtained by the measurement.
[0245]
This result shows that the amount of protein S added to protein S-deficient plasma can be measured correctly.
From this, it was confirmed that the measurement method and the measurement reagent of the present invention can accurately measure the substance to be measured in the sample.
[0246]
[Example 3] Addition / recovery test when protein S in a sample is measured by the measuring method and measuring reagent of the present invention
[0247]
When the measurement method and measurement reagent of the present invention are applied to the measurement of protein S in a sample by the ELSA method / sandwich method, it is confirmed whether or not the amount of protein S added to the sample can be accurately measured. A test (addition recovery test) was conducted to confirm the accuracy of.
[0248]
(1) Preparation of C4b binding protein-immobilized microplate reagent
[0249]
A “C4b-binding protein-immobilized microplate reagent” was prepared as described in Example 1 (1).
[0250]
(2) Preparation of peroxidase-labeled anti-protein S / monoclonal antibody reagent
[0251]
“Peroxidase-labeled anti-protein S / monoclonal antibody reagent” was prepared as described in Example 1 (2).
[0252]
(3) Sample preparation
[0253]
(1) Preparation of protein S
Protein S, B. The method of Dahlbeack et al. [Biochem. J. et al. 209, 837-846, 1983].
A sample having a protein S concentration and a protein S-C4b binding protein complex concentration of 0 nM was used as a specimen dilution.
[0254]
▲ 2 ▼ Preparation of plasma samples of healthy subjects with protein S
The healthy human plasma having a protein S concentration of 117 nM and the protein S of the above-mentioned (1) having a concentration of 133 nM, 267 nM, 400 nM, 533 nM, 667 nM, 800 nM, 933 nM, 1067 nM and 1200 nM were mixed at a ratio of 1: 1. Types of protein S supplemented plasma samples were prepared.
Here, the theoretical values of protein S concentration in these nine plasma samples are 125 nM, 192 nM, 259 nM, 325 nM, 392 nM, 259 nM, 525 nM, 592 nM and 659 nM, respectively.
[0255]
(3) Preparation of plasma samples of pregnant women with protein S
Pregnant woman plasma of 33 weeks gestation having a protein S concentration of 48 nM and protein S of the above-mentioned (1) at a concentration of 27 nM, 53 nM, 80 nM, 107 nM, 133 nM, 160 nM, 160 nM, 187 nM and 213 nM are mixed at a ratio of 1: 1, Eight kinds of protein S-added plasma samples were prepared.
Here, the theoretical values of the protein S concentration in these eight types of plasma samples are 38 nM, 51 nM, 64 nM, 78 nM, 91 nM, 104 nM, 118 nM, and 131 nM, respectively.
[0256]
(4) Measurement of protein S in the sample
[0257]
Using the “C4b-binding protein-immobilized microplate reagent” in (1) and the “peroxidase-labeled anti-protein S / monoclonal antibody reagent” in (2), nine types of “Protein S” prepared in (3) above are used. The protein S in each sample was measured for “additional healthy human plasma samples” and eight types of “protein S-added pregnant woman plasma samples”.
[0258]
In addition, description of (4) of the said Example 1 except having changed the sample in this way, and having performed reaction of the sample and the C4b binding protein fix | immobilized by the well of the microplate only at 4 degreeC. The measurement operation was performed as follows.
[0259]
(5) Measurement results
[0260]
The measurement results are shown in Table 2.
[0261]
[Table 2]

[0262]
As is clear from Table 2, the recovery rate of protein S is high in both cases of healthy human plasma and pregnant woman plasma when the concentration of added protein S is high, and the amount of protein S added to the sample can be measured correctly. I understand that.
This also confirms that the measurement method and the measurement reagent of the present invention can accurately measure the substance to be measured in the sample.
[0263]
[Example 4] Measurement of samples of protein S-C4b binding protein complex at various pH values by ELSA method and sandwich method
[0264]
C4b immobilized on the sample and the well of the microplate when measuring a protein S-C4b binding protein complex sample by the measurement method (measurement reagent) of protein S in the sample by the ELSA method / sandwich method The reaction with the binding protein was carried out at various pH and measured.
[0265]
(1) Preparation of C4b binding protein-immobilized microplate reagent
[0266]
A “C4b-binding protein-immobilized microplate reagent” was prepared as described in Example 1 (1).
[0267]
(2) Preparation of peroxidase-labeled anti-protein S / monoclonal antibody reagent
[0268]
“Peroxidase-labeled anti-protein S / monoclonal antibody reagent” was prepared as described in Example 1 (2).
[0269]
(3) Sample preparation
[0270]
(1) Preparation of sample diluent
a) Preparation of specimen diluent (pH 8.6)
25% “Block Ace” (trade name) (Dainippon Pharmaceutical Co., Ltd.), 10 mM Tris (hydroxymethyl) aminomethane buffer (pH 8.6) containing 0.1 M sodium chloride and 5 mM calcium chloride In this case, the sample dilution solution (pH 8.6) was obtained.
[0271]
b) Preparation of specimen diluent (pH 7.6)
25% “Block Ace” (trade name) (Dainippon Pharmaceutical Co., Ltd.), 0.1 mM sodium chloride, and 10 mM tris (hydroxymethyl) aminomethane buffer (pH 7.6) containing 5 mM calcium chloride In this case, the sample dilution solution (pH 7.6) was obtained.
[0272]
c) Preparation of specimen diluent (pH 7.1)
25% “Block Ace” (trade name) (Dainippon Pharmaceutical Co., Ltd.), 0.1 M sodium chloride, and 10 mM tris (hydroxymethyl) aminomethane buffer (pH 7.1) containing 5 mM calcium chloride In this case, the sample dilution solution (pH 7.1) was obtained.
[0273]
d) Preparation of specimen diluent (pH 6.8)
25% “Block Ace” (trade name) (manufactured by Dainippon Pharmaceutical Co., Ltd.), 10 mM MES buffer (pH 6.8) containing 0.1 M sodium chloride, and 5 mM calcium chloride] (PH 6.8) ".
[0274]
e) Preparation of specimen diluent (pH 6.3)
25% “Block Ace” (trade name) (Dainippon Pharmaceutical Co., Ltd.), 10 mM MES buffer (pH 6.3) containing 0.1 M sodium chloride and 5 mM calcium chloride] (PH 6.3) ".
[0275]
f) Preparation of specimen diluent (pH 5.5)
25% “Block Ace” (trade name) (manufactured by Dainippon Pharmaceutical Co., Ltd.), 10 mM MES buffer (pH 5.5) containing 0.1 M sodium chloride and 5 mM calcium chloride] (PH 5.5) ".
[0276]
(2) Preparation of protein S-C4b binding protein complex
Protein S-C4b binding protein complex The method of Dahlbeack et al. [Biochem. J. et al. 209, 837-846, 1983].
[0277]
The six types of specimen diluents of the above (1), ie, “sample diluent (pH 8.6)”, “sample diluent (pH 7.6)”, “sample diluent (pH 7.1)”, “ The protein S-C4b-binding protein complex concentrations were respectively diluted with “sample dilution solution (pH 6.8)”, “sample dilution solution (pH 6.3)”, or “sample dilution solution (pH 5.5)”. “Protein S-C4b binding protein complex sample-1” having a pH of 8.6 and “Protein S-C4b binding protein complex sample-2” having a pH of 7.6 “Protein S-C4b binding protein complex sample-3” having a pH of 7.1, “Protein S-C4b binding protein complex sample-4” having a pH of 6.8, pH of 6.3 "Protein S-C4b If protein complex sample -5 ", and pH was prepared was 5.5" protein S-C4b binding protein complex samples -6 ".
[0278]
All of the six types of “protein S-C4b binding protein complex samples” do not contain protein S in a free state.
In addition, the salt concentration of each of these six types of protein S-C4b binding protein complex samples was 100 mM.
The sample dilution at each pH was used as a sample having a protein S concentration and a protein S-C4b binding protein complex concentration of 0 nM.
[0279]
(4) Measurement of protein S in the sample
[0280]
Using each of the “C4b-binding protein-immobilized microplate reagent” in (1) and the “peroxidase-labeled anti-protein S / monoclonal antibody reagent” in (2), each “protein S- For the “C4b binding protein complex sample”, free protein S was measured at various pHs.
[0281]
(1) Six types of protein S-C4b binding protein complexes from “Protein S-C4b binding protein complex sample-1” to “Protein S-C4b binding protein complex sample-6” prepared in (3) above The sample and the sample diluent (sample having a protein S-C4b binding protein complex and protein S concentration of 0 nM) are added to the well of the microplate of the C4b binding protein-immobilized microplate reagent prepared in (2) above. Dispense 100 μL per well.
[0282]
And each of this microplate was left still at 25 degreeC for 1 hour, and reaction was performed.
[0283]
The reaction between the sample and the C4b binding protein immobilized on the well of the microplate is performed at the pH of each “protein S-C4b binding protein complex sample”.
[0284]
That is, in the case of “Protein S-C4b binding protein complex sample-1”, pH 8.6, in the case of “Protein S-C4b binding protein complex sample-2”, pH 7.6, “Protein S-C4b binding protein complex” In the case of “body sample-3”, pH 6.8 in the case of “protein S-C4b binding protein complex sample-4”, and pH 6. in the case of “protein S-C4b binding protein complex sample-5”. 3. In the case of “Protein S-C4b binding protein complex sample-6”, the pH was 5.5.
[0285]
(2) After the reaction at 25 ° C. for 1 hour, each well of the microplate subjected to the reaction was washed three times with the washing solution of (1) (3) in Example 1.
By this operation, components such as protein S that did not bind to the immobilized C4b binding protein were removed from the well. (BF separation)
[0286]
(3) 100 μL of the peroxidase-labeled anti-protein S / monoclonal antibody reagent (2) was dispensed into each well of the microplate after the washing in (2).
And this was left still at room temperature for 1 hour, and reaction was performed.
[0287]
By this operation, peroxidase-labeled anti-protein S / monoclonal antibody was bound to protein S bound to the C4b binding protein immobilized on the well of the microplate.
[0288]
(4) After the reaction at room temperature for 1 hour, each well of the microplate subjected to the reaction was washed with the washing solution three times.
By this operation, components such as peroxidase-labeled anti-protein S / monoclonal antibody that did not bind to protein S indirectly immobilized on the microplate were removed from the wells. (BF separation)
[0289]
(5) Thereafter, an HRP coloring reagent [including 3,3 ′, 5,5′-tetramethylbenzidine (TMB); “TMB Soluble Reagent”, manufactured by Scy Tek Laboratories (USA)] is used in the above (4). After washing, 100 μL was added to each well of the microplate, and a color reaction was performed at room temperature for 15 minutes.
[0290]
(6) Thereafter, a color-development reagent (“TMB Soluble Reagent”, manufactured by Scy Tek Laboratories (USA)) was added in an amount of 100 μL to each well of the microplate subjected to this reaction, and the color reaction was performed. Was stopped.
[0291]
(7) The absorbance at 450 nm of each well of the microplate was measured with an EIA microplate reader (Bio-Rad).
[0292]
(8) The measured value (concentration) of protein S in the sample was determined as follows.
B. The method of Dahlbeack et al. [Biochem. J. et al. 209, 837-846, 1983], using free protein S prepared from human plasma as a standard substance, and performing the above measurement operation in the same manner as in the previous sample, to determine the absorbance. The protein S concentration in the measured sample was calculated by comparing the absorbance of both the sample and the standard substance.
[0293]
{Circle around (9)} The measurement operations {circle around (1)} to {circle around (8)} were also carried out for the sample diluent (sample with a protein S-C4b binding protein complex and protein S concentration of 0 nM) at each pH.
[0294]
The results of these measurements are shown in Table 3.
[0295]
[Table 3]

[0296]
In addition, the vertical axis indicates the measured value of protein S in the sample [concentration (nM)], and the horizontal axis indicates the reaction between the sample and the C4b binding protein immobilized on the well of the microplate. The figure represented as pH at the time of letting was shown in FIG.14 and FIG.15.
[0297]
FIG. 14 shows the results of the sample with the protein S-C4b binding protein complex concentration of 0.67 nM at each pH, and the results of the sample with the protein S-C4b binding protein complex concentration of Example 7 of 0.67 nM. In FIG. 14, the measurement value of the “protein S-C4b binding protein complex sample” in this example is represented by “♦”.
FIG. 15 shows the results of the sample with the protein S-C4b binding protein complex and the protein S concentration of 0 nM (specimen dilution), and the concentrations of the protein S-C4b binding protein complex and protein S in Example 6 are as follows. FIG. 15 shows the results of a sample of 0 nM (specimen diluent). In FIG. 15, the “protein S-C4b binding protein complex and protein S concentration at each pH is 0 nM (specimen diluent)” in this example. The measured value of “Sample” is represented by “♦”.
[0298]
(5) Discussion
[0299]
(1) When the reaction between the sample in (1) of (4) and the C4b binding protein immobilized on the well of the microplate is carried out at pH 8.6, for example, it is clear from FIG. Thus, it can be seen that a positive error has also occurred when the measurement was performed using the protein S-C4b binding protein complex as a sample.
[0300]
That is, in the measurement of protein S in the sample, when the reaction between the sample and the C4b binding protein immobilized on the well of the microplate is performed at pH 8.6, the protein S-C4b binding contained in the sample A reaction occurs in which the protein complex dissociates to generate protein S and a C4b binding protein complex, respectively, and the protein S generated by the dissociation also binds to the C4b binding protein immobilized on the well of the microplate, and is originally a sample. It can be seen that in addition to protein S contained therein, protein S-C4b binding protein complex is also measured as protein S, resulting in a positive error in the measured value of protein S in the sample.
[0301]
Therefore, when the binding reaction between the protein S as the measurement target substance and the C4b binding protein as the ligand is performed at pH 8.6, the reaction caused by the dissociation of the complex between the measurement target substance and the ligand is caused. It is clear that the conditions are advanced.
[0302]
(2) However, from the above results, however, the protein S contained in the sample can be obtained by performing the binding reaction between the protein S as the measurement target substance and the C4b binding protein as the ligand at a lower pH. It can also be seen that the reaction of dissociating the C4b binding protein complex to produce protein S and C4b binding protein, respectively, can be suppressed.
[0303]
For example, by allowing the binding reaction between protein S, which is a measurement target substance, and C4b binding protein, which is its ligand, to be performed at pH 7.1 or lower, it is contained in the sample compared to when it is performed at pH 8.6. Dissociation of the protein S-C4b binding protein complex can be clearly suppressed.
[0304]
(3) From the above results, the complex of the measurement target substance and its ligand is dissociated by performing the binding reaction between the measurement target substance contained in the sample and the specific binding substance at a low pH, and the measurement target. It was possible to suppress the reaction that caused each of the substance and the ligand, thereby preventing the occurrence of a positive error and confirming that the measurement target substance in the sample can be accurately measured.
[0305]
As can be seen from the results of this study, when the binding reaction between the measurement target substance and the specific binding substance is performed at a reaction temperature of 15 ° C. or higher, it is particularly preferable in terms of accuracy to be performed at pH 7.1 or lower. preferable.
[0306]
[Example 5] Measurement of samples of protein S-C4b-binding protein complex at various salt concentrations (ionic strength) by ELSA method / sandwich method
[0307]
C4b immobilized on the sample and the well of the microplate when measuring a protein S-C4b binding protein complex sample by the measurement method (measurement reagent) of protein S in the sample by the ELSA method / sandwich method The reaction with the binding protein was carried out at various salt concentrations (ionic strength) for measurement.
[0308]
(1) Preparation of C4b binding protein-immobilized microplate reagent
[0309]
A “C4b-binding protein-immobilized microplate reagent” was prepared as described in Example 1 (1).
[0310]
(2) Preparation of peroxidase-labeled anti-protein S / monoclonal antibody reagent
[0311]
“Peroxidase-labeled anti-protein S / monoclonal antibody reagent” was prepared as described in Example 1 (2).
[0312]
(3) Sample preparation
[0313]
(1) Preparation of sample diluent
a) Preparation of specimen diluent (200 mM)
25% “Block Ace” (trade name) (manufactured by Dainippon Pharmaceutical Co., Ltd.), 10 mM tris (hydroxymethyl) aminomethane buffer (pH 7.4) containing 200 mM sodium chloride and 5 mM calcium chloride] This was referred to as “specimen dilution solution (200 mM)”.
[0314]
b) Preparation of specimen diluent (100 mM)
25% “Block Ace” (trade name) (Dainippon Pharmaceutical Co., Ltd.), 10 mM Tris (hydroxymethyl) aminomethane buffer (pH 7.4) containing 100 mM sodium chloride and 5 mM calcium chloride] This was referred to as “specimen dilution solution (100 mM)”.
[0315]
c) Preparation of specimen diluent (50 mM)
25% “Block Ace” (trade name) (Dainippon Pharmaceutical Co., Ltd.), 50 mM sodium chloride, and 10 mM tris (hydroxymethyl) aminomethane buffer (pH 7.4) containing 5 mM calcium chloride] This was designated as “sample dilution solution (50 mM)”.
[0316]
d) Preparation of sample diluent (20 mM)
25% “Block Ace” (trade name) (produced by Dainippon Pharmaceutical Co., Ltd.), 25 mM sodium chloride, and 10 mM tris (hydroxymethyl) aminomethane buffer (pH 7.4) containing 5 mM calcium chloride] This was referred to as “specimen dilution solution (20 mM)”.
[0317]
e) Preparation of specimen diluent (10 mM)
25% “Block Ace” (trade name) (manufactured by Dainippon Pharmaceutical Co., Ltd.), 10 mM tris (hydroxymethyl) aminomethane buffer (pH 7.4) containing 12.5 mM sodium chloride and 5 mM calcium chloride And “specimen diluent (10 mM)”.
[0318]
f) Preparation of sample diluent (0 mM)
25% “Block Ace” (trade name) (manufactured by Dainippon Pharmaceutical Co., Ltd.) and 10 mM Tris (hydroxymethyl) aminomethane buffer (pH 7.4) containing 5 mM calcium chloride] were prepared. (0 mM) ”.
[0319]
(2) Preparation of protein S-C4b binding protein complex
Protein S-C4b binding protein complex The method of Dahlbeack et al. [Biochem. J. et al. 209, 837-846, 1983].
[0320]
The six types of specimen diluents of (1) above, ie, “sample diluent (200 mM)”, “sample diluent (100 mM)”, “sample diluent (50 mM)”, “sample diluent (20 mM)”. ”,“ Sample Diluent (10 mM) ”or“ Sample Diluent (0 mM) ”, the protein S-C4b binding protein complex concentration was 0.67 nM and the sodium chloride concentration was 200 mM. “Protein S-C4b binding protein complex sample-1”, “Protein S-C4b binding protein complex sample-2” having a sodium chloride concentration of 100 mM, “Protein S-C4b having a sodium chloride concentration of 50 mM” Binding protein complex sample-3 ”,“ Protein S-C4b binding protein complex sample with sodium chloride concentration of 20 mM— "Sodium chloride concentration was 10mM" protein S-C4b binding protein complex sample -5 ", and sodium chloride concentration was prepared" protein S-C4b binding protein complex samples -6 "was 0 mM.
[0321]
All of the six types of “protein S-C4b binding protein complex samples” do not contain protein S in a free state.
In addition, the pH of each of these six types of protein S-C4b binding protein complex samples was 7.4.
The sample dilution at each sodium chloride concentration was used as a sample having a protein S concentration and a protein S-C4b binding protein complex concentration of 0 nM.
[0322]
(4) Measurement of protein S in the sample
[0323]
Using each of the “C4b-binding protein-immobilized microplate reagent” in (1) and the “peroxidase-labeled anti-protein S / monoclonal antibody reagent” in (2), each “protein S- With respect to the “C4b binding protein complex sample”, free protein S was measured at various salt concentrations (ionic strength).
[0324]
(1) Six types of protein S-C4b binding protein complexes from “Protein S-C4b binding protein complex sample-1” to “Protein S-C4b binding protein complex sample-6” prepared in (3) above The sample and sample diluent (protein S-C4b binding protein complex and sample having a protein S concentration of 0 nM) are added to the well of the microplate of the C4b binding protein-immobilized microplate reagent prepared in (2) above. 100 μL was dispensed per unit.
[0325]
And each of this microplate was left still at 25 degreeC for 1 hour, and reaction was performed.
[0326]
The reaction between the sample and the C4b binding protein immobilized on the well of the microplate is performed at the salt concentration (ionic strength) of each “protein S-C4b binding protein complex sample”.
[0327]
That is, in the case of “Protein S-C4b binding protein complex sample-1”, the sodium chloride concentration is 200 mM, in the case of “Protein S-C4b binding protein complex sample-2”, the sodium chloride concentration is 100 mM, and “Protein S-C4b binding”. In the case of “protein complex sample-3”, sodium chloride concentration of 50 mM, in the case of “protein S-C4b binding protein complex sample-4”, sodium chloride concentration of 20 mM, “protein S-C4b binding protein complex sample-5” In this case, the sodium chloride concentration was 10 mM, and in the case of “Protein S-C4b binding protein complex sample-6”, the sodium chloride concentration was 0 mM.
[0328]
(2) After the reaction at 25 ° C. for 1 hour, each well of the microplate subjected to the reaction was washed three times with the washing solution of (1) (3) in Example 1.
By this operation, components such as protein S that did not bind to the immobilized C4b binding protein were removed from the well. (BF separation)
[0329]
(3) 100 μL of the peroxidase-labeled anti-protein S / monoclonal antibody reagent (2) was dispensed into each well of the microplate after the washing in (2).
And this was left still at room temperature for 1 hour, and reaction was performed.
[0330]
By this operation, peroxidase-labeled anti-protein S / monoclonal antibody was bound to protein S bound to the C4b binding protein immobilized on the well of the microplate.
[0331]
(4) After the reaction at room temperature for 1 hour, each well of the microplate subjected to the reaction was washed with the washing solution three times.
By this operation, components such as peroxidase-labeled anti-protein S / monoclonal antibody that did not bind to protein S indirectly immobilized on the microplate were removed from the wells. (BF separation)
[0332]
(5) Thereafter, an HRP coloring reagent [including 3,3 ′, 5,5′-tetramethylbenzidine (TMB); “TMB Soluble Reagent”, manufactured by Scy Tek Laboratories (USA)] is used in the above (4). After washing, 100 μL was added to each well of the microplate, and a color reaction was performed at room temperature for 15 minutes.
[0333]
(6) Thereafter, a color-development reagent (“TMB Soluble Reagent”, manufactured by Scy Tek Laboratories (USA)) was added in an amount of 100 μL to each well of the microplate subjected to this reaction, and the color reaction was performed. Was stopped.
[0334]
(7) The absorbance at 450 nm of each well of the microplate was measured with an EIA microplate reader (Bio-Rad).
[0335]
(8) The measured value (concentration) of protein S in the sample was determined as follows. B. The method of Dahlbeack et al. [Biochem. J. et al. 209, 837-846, 1983], using free protein S prepared from human plasma as a standard substance, and performing the above measurement operation in the same manner as in the previous sample, to determine the absorbance. The protein S concentration in the measured sample was calculated by comparing the absorbance of both the sample and the standard substance.
[0336]
{Circle around (9)} The measurement operations {circle around (1)} to {circle around (8)} were also carried out for the sample diluents (samples with a protein S-C4b binding protein complex and protein S concentration of 0 nM) at each sodium chloride concentration.
[0337]
The results of these measurements are shown in Table 4.
[0338]
[Table 4]

[0339]
In addition, the vertical axis indicates the measured value of protein S in the sample [concentration (nM)], and the horizontal axis indicates the reaction between the sample and the C4b binding protein immobilized on the well of the microplate. The figure expressed as sodium chloride concentration [salt concentration (ionic strength)] at the time of mixing was shown in FIGS.
[0340]
Here, the results of the sample with the protein S-C4b binding protein complex concentration of 0.67 nM at each sodium chloride concentration are shown in FIG. 16, and the protein S-C4b binding protein complex and protein S concentrations are 0 nM (specimen). FIG. 17 shows the result of the diluted sample.
[0341]
In FIG. 16, the measured value of “protein S-C4b binding protein complex sample” is represented by “♦”.
In FIG. 17, the measurement value of “a sample having a protein S-C4b binding protein complex and protein S concentration of 0 nM (specimen diluent)” is represented by “♦”.
[0342]
(5) Discussion
[0343]
(1) When the reaction between the sample in (1) of (4) and the C4b binding protein immobilized on the well of the microplate is carried out at a sodium chloride concentration of 200 mM, for example, from FIG. As is clear, it can be seen that a positive error has also occurred when the protein S-C4b binding protein complex is measured as a sample.
[0344]
That is, in the measurement of protein S in the sample, when the reaction between the sample and the C4b binding protein immobilized on the well of the microplate is performed at a sodium chloride concentration of 200 mM, protein S- contained in the sample A reaction occurs in which the C4b binding protein complex dissociates to generate protein S and a C4b binding protein complex, respectively, and the protein S generated by the dissociation also binds to the C4b binding protein immobilized on the well of the microplate, In addition to the protein S originally contained in the sample, the protein S-C4b binding protein complex is also measured as the protein S, and it is understood that a positive error occurs in the measured value of the protein S in the sample. .
[0345]
Therefore, when the binding reaction between protein S, which is a measurement target substance, and C4b binding protein, which is its ligand, is performed at a sodium chloride concentration of 200 mM, the reaction that occurs when the complex of the measurement target substance and its ligand is dissociated. It is clear that this is a condition where
[0346]
(2) However, based on the above results, it is included in the sample by performing the binding reaction between the protein S as the measurement target substance and the C4b binding protein as its ligand at a lower salt concentration (ionic strength). It can also be seen that the protein S-C4b binding protein complex that had been released can be dissociated to inhibit the reactions that produce protein S and C4b binding protein, respectively.
[0347]
For example, by causing the binding reaction between protein S as a measurement target substance and C4b binding protein as its ligand to be performed at a sodium chloride concentration of 0 mM, it is contained in the sample compared to when it is performed at a sodium chloride concentration of 200 mM. Dissociation of the protein S-C4b binding protein complex that has been present can be clearly suppressed.
[0348]
(3) From the above results, the complex of the measurement target substance and its ligand can be obtained by performing the binding reaction between the measurement target substance and the specific binding substance contained in the sample at a low salt concentration (ionic strength). It was confirmed that the reaction of dissociating and generating a measurement target substance and a ligand can be suppressed, thereby preventing the occurrence of a positive error and accurately measuring the measurement target substance in the sample.
[0349]
As can be seen from the results of this study, when the binding reaction between the substance to be measured and the specific binding substance is carried out at a reaction temperature of 15 ° C. or higher, it is accurate to carry out at a salt concentration (ionic strength) of 20 mM or lower. It is more preferable at this point, and it is especially preferable to carry out at 10 mM or less.
[0350]
[Example 6] Measurement of a sample composed of a protein S-C4b binding protein complex at various pH at low salt concentration by ELSA / sandwich method
[0351]
C4b immobilized on the sample and the well of the microplate when measuring a protein S-C4b binding protein complex sample by the measurement method (measurement reagent) of protein S in the sample by the ELSA method / sandwich method The reaction with the binding protein was carried out at various pH at low salt concentration (ionic strength) and the measurement was performed.
[0352]
(1) Preparation of C4b binding protein-immobilized microplate reagent
[0353]
A “C4b-binding protein-immobilized microplate reagent” was prepared as described in Example 1 (1).
[0354]
(2) Preparation of peroxidase-labeled anti-protein S / monoclonal antibody reagent
[0355]
“Peroxidase-labeled anti-protein S / monoclonal antibody reagent” was prepared as described in Example 1 (2).
[0356]
(3) Sample preparation
[0357]
(1) Preparation of sample diluent
a) Preparation of specimen diluent (pH 8.1)
25% “Block Ace” (trade name) (manufactured by Dainippon Pharmaceutical Co., Ltd.) and 10 mM tris (hydroxymethyl) aminomethane buffer (pH 8.1) containing 5 mM calcium chloride] (PH 8.1) ".
[0358]
b) Preparation of specimen diluent (pH 7.1)
25% “Block Ace” (trade name) (manufactured by Dainippon Pharmaceutical Co., Ltd.) and 10 mM tris (hydroxymethyl) aminomethane buffer (pH 7.1) containing 5 mM calcium chloride] (PH 7.1) ”.
[0359]
c) Preparation of specimen diluent (pH 6.4)
25% “Block Ace” (trade name) (manufactured by Dainippon Pharmaceutical Co., Ltd.) and 10 mM MES buffer (pH 6.4) containing 5 mM calcium chloride] were prepared, and “sample dilution solution (pH 6.4)” was prepared. It was.
[0360]
d) Preparation of specimen diluent (pH 5.5)
25% “Block Ace” (trade name) (manufactured by Dainippon Pharmaceutical Co., Ltd.) and 10 mM MES buffer (pH 5.5) containing 5 mM calcium chloride] were prepared, and “sample dilution solution (pH 5.5)” was prepared. It was.
[0361]
(2) Preparation of protein S-C4b binding protein complex
Protein S-C4b binding protein complex The method of Dahlbeack et al. [Biochem. J. et al. 209, 837-846, 1983].
[0362]
These are the four types of specimen diluents of the above (1), ie, “sample diluent (pH 8.1)”, “sample diluent (pH 7.1)”, “sample diluent (pH 6.4)”, or “Protein S-C4b binding protein”, each diluted with “Sample Diluent (pH 5.5)” and having a protein S-C4b binding protein complex concentration of 0.67 nM and a pH of 8.1. Complex Sample-1 ”,“ Protein S-C4b Binding Protein Complex Sample-2 ”with pH 7.1,“ Protein S-C4b Binding Protein Complex Sample-3 ”with pH 6.4 And “Protein S-C4b binding protein complex sample-4” having a pH of 5.5.
[0363]
The four types of “protein S-C4b binding protein complex samples” do not contain protein S in a free state.
In addition, the salt concentration of each of these four types of protein S-C4b binding protein complex samples was 0 mM.
The sample dilution at each pH was used as a sample having a protein S concentration and a protein S-C4b binding protein complex concentration of 0 nM.
[0364]
(4) Measurement of protein S in the sample
[0365]
Using each of the “C4b-binding protein-immobilized microplate reagent” in (1) and the “peroxidase-labeled anti-protein S / monoclonal antibody reagent” in (2), each “protein S- For the “C4b binding protein complex sample”, free protein S was measured at various pHs.
[0366]
(1) Four types of protein S-C4b binding protein complexes “Protein S-C4b binding protein complex sample-1” to “Protein S-C4b binding protein complex sample-4” prepared in (3) above. The sample and the sample diluent (sample having a protein S-C4b binding protein complex and protein S concentration of 0 nM) are added to the well of the microplate of the C4b binding protein-immobilized microplate reagent prepared in (2) above. Dispense 100 μL per well.
[0367]
And each of this microplate was left still at 25 degreeC for 1 hour, and reaction was performed.
[0368]
The reaction between the sample and the C4b binding protein immobilized on the well of the microplate is performed at the pH of each “protein S-C4b binding protein complex sample”.
[0369]
That is, in the case of “Protein S-C4b binding protein complex sample-1”, pH 8.1, in the case of “Protein S-C4b binding protein complex sample-2”, pH 7.1, “Protein S-C4b binding protein complex” In the case of “body sample-3”, the pH was 6.4, and in the case of “protein S-C4b binding protein complex sample-4”, the pH was 5.5.
[0370]
(2) After the reaction at 25 ° C. for 1 hour, each well of the microplate subjected to the reaction was washed three times with the washing solution of (1) (3) in Example 1.
By this operation, components such as protein S that did not bind to the immobilized C4b binding protein were removed from the well. (BF separation)
[0371]
(3) 100 μL of the peroxidase-labeled anti-protein S / monoclonal antibody reagent (2) was dispensed into each well of the microplate after the washing in (2).
And this was left still at room temperature for 1 hour, and reaction was performed.
[0372]
By this operation, peroxidase-labeled anti-protein S / monoclonal antibody was bound to protein S bound to the C4b binding protein immobilized on the well of the microplate.
[0373]
(4) After the reaction at room temperature for 1 hour, each well of the microplate subjected to the reaction was washed with the washing solution three times.
By this operation, components such as peroxidase-labeled anti-protein S / monoclonal antibody that did not bind to protein S indirectly immobilized on the microplate were removed from the wells. (BF separation)
[0374]
(5) Thereafter, an HRP coloring reagent [including 3,3 ′, 5,5′-tetramethylbenzidine (TMB); “TMB Soluble Reagent”, manufactured by Scy Tek Laboratories (USA)] is used in the above (4). After washing, 100 μL was added to each well of the microplate, and a color reaction was performed at room temperature for 15 minutes.
[0375]
(6) Thereafter, a color-development reagent (“TMB Soluble Reagent”, manufactured by Scy Tek Laboratories (USA)) was added in an amount of 100 μL to each well of the microplate subjected to this reaction, and the color reaction was performed. Was stopped.
[0376]
(7) The absorbance at 450 nm of each well of the microplate was measured with an EIA microplate reader (Bio-Rad).
[0377]
(8) The measured value (concentration) of protein S in the sample was determined as follows.
B. The method of Dahlbeack et al. [Biochem. J. et al. 209, 837-846, 1983], using free protein S prepared from human plasma as a standard substance, and performing the above measurement operation in the same manner as in the previous sample, to determine the absorbance. The protein S concentration in the measured sample was calculated by comparing the absorbance of both the sample and the standard substance.
[0378]
{Circle around (9)} The measurement operations {circle around (1)} to {circle around (8)} were also carried out for the sample diluent (sample with a protein S-C4b binding protein complex and protein S concentration of 0 nM) at each pH.
[0379]
The results of these measurements are shown in Table 5.
[0380]
[Table 5]

[0381]
In addition, the vertical axis indicates the measured value of protein S in the sample [concentration (nM)], and the horizontal axis indicates the reaction between the sample and the C4b binding protein immobilized on the well of the microplate. The figure represented as pH at the time of letting was shown in FIG.14 and FIG.15.
[0382]
FIG. 14 shows the results of a sample with a protein S-C4b binding protein complex concentration of 0.67 nM at each pH, and the protein S-C4b binding protein complex concentration of 0.67 nM performed in Example 4 above. FIG. 14 shows the measurement value of the “protein S-C4b binding protein complex sample” in this example with “◯”.
Further, FIG. 15 shows the results of the protein S-C4b binding protein complex and the protein S concentration of 0 nM (specimen diluent), and the results of the protein S-C4b binding protein complex and protein obtained in Example 4 above. FIG. 15 is a diagram showing the results of a sample having an S concentration of 0 nM (specimen dilution solution). In FIG. 15, in this example, “the protein S-C4b binding protein complex and protein S concentration at each pH are 0 nM ( The measured value of the “sample (diluted solution) sample” is indicated by “◯”.
[0383]
(5) Discussion
[0384]
(1) When the reaction of the sample in (1) of (4) and the C4b binding protein immobilized on the well of the microplate is performed at pH 8.1, for example, it is clear from FIG. Thus, it can be seen that a positive error has also occurred when the protein S-C4b binding protein complex is measured as a sample.
[0385]
That is, in the measurement of protein S in the sample, when the reaction between the sample and the C4b binding protein immobilized on the well of the microplate is performed at pH 8.1, the protein S-C4b binding contained in the sample The protein complex is dissociated to generate a protein S and a C4b binding protein complex, respectively, and the protein S generated by the dissociation also binds to the C4b binding protein immobilized on the well of the microplate, and is originally a sample. It can be seen that in addition to protein S contained therein, protein S-C4b binding protein complex is also measured as protein S, resulting in a positive error in the measured value of protein S in the sample.
[0386]
Therefore, when the binding reaction between protein S, which is a measurement target substance, and C4b binding protein, which is its ligand, is performed at pH 8.1, the reaction that occurs when the complex of the measurement target substance and its ligand is dissociated. It is clear that the conditions are advanced.
[0387]
(2) However, from the above results, however, the protein S contained in the sample can be obtained by performing the binding reaction between the protein S as the measurement target substance and the C4b binding protein as the ligand at a lower pH. It can also be seen that the reaction of dissociating the C4b binding protein complex to produce protein S and C4b binding protein, respectively, can be suppressed.
[0388]
For example, by allowing the binding reaction between protein S as a measurement target substance and its C4b binding protein as its ligand to be performed at pH 7.1 or lower, it is contained in the sample compared to when it is performed at pH 8.1. Dissociation of the protein S-C4b binding protein complex can be clearly suppressed.
[0389]
Furthermore, as is clear from FIG. 14 above, when the binding reaction between protein S, which is a substance to be measured, and C4b binding protein, which is its ligand, is performed at a sodium chloride concentration of 0 mM, it is performed at a sodium chloride concentration of 100 mM. It can be seen that the dissociation of the protein S-C4b binding protein complex contained in the sample can be clearly suppressed as compared with the case where the sample is mixed.
[0390]
(3) From the above results, the binding reaction between the measurement target substance and the specific binding substance contained in the sample is carried out at a low pH and a low salt concentration (ionic strength). It is possible to suppress the reaction in which the complex dissociates and generate the target substance and ligand, respectively, thereby confirming that the target substance in the sample can be measured more accurately by preventing the occurrence of positive errors. did it.
[0390]
As can be seen from the results of this study, when the binding reaction between the measurement target substance and the specific binding substance is performed at a reaction temperature of 15 ° C. or higher, it is more accurate in terms of accuracy to be performed at pH 7.1 or lower. It is preferable to carry out at a lower salt concentration (ionic strength).
[0392]
【The invention's effect】
The measuring method of the measurement target substance in the sample of the present invention and the measurement reagent of the measurement target substance in the sample of the present invention are the measurement target substance, a complex of the measurement target substance, the measurement target substance and its ligand. Even when both substances are contained together in the sample, it is possible to prevent the occurrence of a positive error due to measurement of the measurement target substance generated by dissociation of the complex of the measurement target substance and its ligand, A measuring method and a measuring reagent having an effect of being able to accurately measure a substance to be measured in a sample.
[Brief description of the drawings]
BRIEF DESCRIPTION OF DRAWINGS FIG. 1 is a diagram showing the measurement results of a sample comprising a protein S-C4b binding protein complex by ELSA / sandwich method when the reaction is carried out at 0 ° C.
FIG. 2 is a diagram showing the results of measurement by a ELSA method / sandwich method of a sample comprising a protein S-C4b binding protein complex when the reaction is carried out at 5 ° C.
FIG. 3 is a diagram showing the measurement results of a sample comprising a protein S-C4b binding protein complex by the ELSA method / sandwich method when the reaction is carried out at 10 ° C. FIG.
FIG. 4 is a diagram showing the results of measurement by a ELSA method / sandwich method of a sample comprising a protein S-C4b binding protein complex when the reaction is carried out at 15 ° C.
FIG. 5 is a diagram showing the results of measurement by a ELSA method / sandwich method of a sample comprising a protein S-C4b binding protein complex when the reaction is carried out at 20 ° C.
FIG. 6 is a diagram showing the measurement results of a sample comprising a protein S-C4b binding protein complex by the ELSA method / sandwich method when the reaction is carried out at 25 ° C.
FIG. 7 is a diagram showing the results of measurement by a ELSA method / sandwich method of a sample comprising a protein S-C4b binding protein complex when the reaction is carried out at 29 ° C.
FIG. 8 is a diagram showing the measurement results of a sample comprising a protein S-C4b binding protein complex by the ELSA method / sandwich method when the reaction is carried out at 33 ° C.
FIG. 9 is a diagram showing the results of measurement by an ELSA method / sandwich method of a sample comprising a protein S-C4b binding protein complex when the reaction is carried out at 37 ° C.
FIG. 10 is a diagram showing the results of measurement by ELSA method / sandwich method when a sample having a protein S-C4b binding protein complex concentration of 0 nM is reacted at various temperatures.
FIG. 11 is a diagram showing the results of measurement by ELSA method / sandwich method when a sample having a protein S-C4b binding protein complex concentration of 0.27 nM is reacted at various temperatures.
FIG. 12 is a diagram showing the results of measurement by ELSA method / sandwich method when a sample having a protein S-C4b binding protein complex concentration of 2.7 nM is reacted at various temperatures.
FIG. 13 is a view showing the results of an addition recovery test when protein S in a sample is measured by the measurement method and the measurement reagent of the present invention.
FIG. 14 is a diagram showing the results of measurement by ELSA method / sandwich method when a sample having a protein S-C4b binding protein complex concentration of 0.67 nM is reacted at various pHs.
FIG. 15 is a diagram showing the results of measurement by ELSA method / sandwich method when a sample having a protein S-C4b binding protein complex concentration of 0 nM is reacted at various pHs.
FIG. 16 is a diagram showing the results of measurement by ELSA method / sandwich method when a sample having a protein S-C4b binding protein complex concentration of 0.67 nM is reacted at various salt concentrations.
FIG. 17 is a diagram showing the results of measurement by ELSA method / sandwich method when a sample having a protein S-C4b binding protein complex concentration of 0 nM is reacted at various salt concentrations.
FIG. 18 is a schematic diagram when protein S is measured by the ELSA method / sandwich method.
FIG. 19 is a diagram showing an agglomerated image when a measurement target substance in a sample is measured by an indirect agglutination measurement method.

Claims (4)

Utilizing conjugation reaction with a substance that specifically binds to protein S and protein S, it impinges on the measurement of protein S in the sample, be a temperature of a temperature 0 to 15 ° C., the pH pH 5.5 A binding reaction between protein S and a substance that specifically binds to protein S is performed under at least one condition selected from a pH of ~ 7.1 or a salt concentration of 0 to 20 mM. A method for preventing the occurrence of a positive error in the measurement of protein S in a sample. At least one condition selected from setting the temperature to 0 to 15 ° C., setting the pH to pH 5.5 to pH 7.1, or setting the salt concentration to 0 to 20 mM is protein S. The method for preventing the occurrence of a positive error in the measurement of protein S in a sample according to claim 1, which is a condition for suppressing a reaction in which a complex of C4b binding protein is dissociated to produce protein S and C4b binding protein , respectively. . The method for preventing the occurrence of a positive error in the measurement of protein S in a sample according to claim 1 or 2 , wherein the temperature is 0 to 10 ° C. The method for preventing the occurrence of a positive error in the measurement of protein S in a sample according to any one of claims 1 to 3 , wherein the salt concentration is 0 to 10 mM .

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