JP6687183B2 - Assay reagent and assay method for thrombin-antithrombin complex - Google Patents
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Description
本発明は、生体試料中のトロンビン（Ｔ）・アンチトロンビン（ＡＴ）複合体(ＴＡＴ)を測定する試薬および方法に関する。 The present invention relates to reagents and methods for measuring thrombin (T) / antithrombin (AT) complex (TAT) in a biological sample.
トロンビン・アンチトロンビン複合体(ＴＡＴ)は血液凝固が進行するときに血液中に産生されるタンパク質複合体で、血液中のＴＡＴの定量は播種性血管内凝固症候群（ＤＩＣ）等の血栓症の診断にとって有用である。しかしながら、ＴＡＴの存在量は遊離アンチトロンビンの存在量の約１００，０００分の１であるため、測定が容易ではない。
現在主流のＴＡＴ定量法は、シーメンス社のエンザイグノスト（登録商標）ＴＡＴ ｍｉｃｒｏ等の酵素免疫測定法(ＥＬＩＳＡ)を用いる試薬キット、およびＬＳＩメディエンス社のステイシア（登録商標） ＣＬＥＩＡ ＴＡＴ等の化学発光酵素免疫測定法(ＣＬＥＩＡ)を用いる試薬キットを用いる方法があるが、いずれも固相・液相分離(Ｂ／Ｆ分離)が必要な測定法で、煩雑な洗浄作業が要り、手作業あるいは専用機器が必要である。
Thrombin-antithrombin complex (TAT) is a protein complex that is produced in blood when blood coagulation progresses. Quantification of TAT in blood is diagnostic of thrombosis such as disseminated intravascular coagulation (DIC). Useful for. However, the abundance of TAT is about 1 / 100,000 of the abundance of free antithrombin, and therefore it is not easy to measure.
At present, the mainstream TAT assay method is a reagent kit using an enzyme immunoassay (ELISA) such as Enzygnost (registered trademark) TAT micro from Siemens, and chemiluminescent enzyme immunoassay such as Staceia (registered trademark) CLEIA TAT from LSI Medience. There is a method that uses a reagent kit that uses the measurement method (CLEIA), but both methods require solid-phase / liquid-phase separation (B / F separation) and require complicated washing work, and manual or dedicated equipment is required. is necessary.
特許文献１〜４には、Ｂ／Ｆ分離が不要なラテックス凝集法を用いる試薬系が報告されたが、いずれも体外で合成したＴＡＴをバッファーで希釈することで作製したサンプルの測定であり、ラテックス凝集法を用いて、ヒト検体中のＴＡＴを正確に濃度測定可能な試薬の報告は無い。また、これらの文献はいずれも、抗体の特異性に依存してＴＡＴ測定試薬の構築をしているか、添加剤によってその交差反応性による影響を回避しているものである。特許文献５は、交差反応性を有さない抗体を使用するサンドイッチ測定法によるＴＡＴ測定について開示しているが、臨床的に利用するためには十分な感度ではない。
従って、測定が簡便なラテックス凝集法において、高感度・高精度に生体試料中のＴＡＴを測定する試薬及び方法が求められていた。
Patent Documents 1 to 4 have reported a reagent system using a latex agglutination method that does not require B / F separation, but all of them are measurements of a sample prepared by diluting TAT synthesized in vitro with a buffer, There is no report of a reagent capable of accurately measuring the concentration of TAT in a human sample using the latex agglutination method. Further, in all of these documents, the TAT measurement reagent is constructed depending on the specificity of the antibody, or the influence of its cross-reactivity is avoided by an additive. Patent Document 5 discloses TAT measurement by a sandwich measurement method using an antibody having no cross-reactivity, but the sensitivity is not sufficient for clinical use.
Therefore, there has been a demand for a reagent and a method for measuring TAT in a biological sample with high sensitivity and high accuracy in the latex agglutination method which is easy to measure.
本発明者らは、Ｂ／Ｆ分離が不要なラテックス凝集法を用い、ヒト検体中のＴＡＴを正確に濃度測定可能な試薬を報告した（特許文献６，７）が、臨床応用のためにはさらなる改善の余地があった。 The present inventors reported a reagent capable of accurately measuring the concentration of TAT in a human sample by using a latex agglutination method that does not require B / F separation (Patent Documents 6 and 7), but for clinical application There was room for further improvement.
図１に記載されたように、ラテックス凝集法によるＴＡＴの測定では、アンチトロンビン側に結合してＴＡＴを認識する抗体、およびトロンビン側に結合してＴＡＴを認識する抗体の２種類の抗体が使用される。そして、原理的にはＴＡＴが存在するときのみに両抗体が結合してラテックス凝集が起こり、ＴＡＴの定量が可能となる。
しかしながら、特許文献６，７で用いられているようなＴＡＴのアンチトロンビン部分に反応してＴＡＴに対する反応がアンチトロンビンに対する反応の１００倍以上のモノク
ローナル抗体を用いても、ＤＩＣの治療などで用いられるアンチトロンビン製剤中の物質の影響で非特異的な反応が生じ、不正確な測定結果となることがあることが本発明者らの検討によってわかった。これはおそらくアンチトロンビン製剤中に変性したアンチトロンビンの多量体が存在することに起因すると考えられる。このようなアンチトロンビン多量体は通常のアンチトロンビンに比べよりＴＡＴを形成した際のアンチトロンビンの構造に近いと考えられ、さらに多量体を形成していることにより、ＴＡＴに対する反応性がアンチトロンビンに対する反応性の１００倍以上のモノクローナル抗体によって認識され、それ単独で凝集が生じ、これが非特異反応として本反応に上乗せされてしまうと考えられた。このようなアンチトロンビン多量体による非特異的反応はＢ／Ｆ分離が可能な測定法では生じない問題であり、本発明者が初めて発見したラテックス凝集法を用いたＴＡＴ測定試薬に特有の問題である。
なお、従来ラテックス凝集法によるＴＡＴ測定試薬におけるアンチトロンビンの影響回避法としては特許文献１、２のような方法が知られているが、アンチトロンビン製剤により非特異的凝集が引き起こされること、およびその回避策については何ら示唆されていない。
したがって、本発明の課題は、Ｂ／Ｆ分離や洗浄作業を必須としないラテックス凝集法を用いた、生体試料中のＴＡＴの測定試薬および測定方法において、アンチトロンビンの影響を回避して正確にＴＡＴの測定を行うことのできる試薬及び方法を提供することである。
As shown in FIG. 1, in measuring TAT by the latex agglutination method, two kinds of antibodies, an antibody that binds to the antithrombin side to recognize TAT and an antibody that binds to the thrombin side to recognize TAT, are used. To be done. In principle, both antibodies bind to each other and latex agglutination occurs only when TAT is present, so that TAT can be quantified.
However, even if a monoclonal antibody that reacts with the antithrombin portion of TAT as used in Patent Documents 6 and 7 is 100 times or more than the reaction with antithrombin, it can be used in the treatment of DIC and the like. It was found by the study of the present inventors that a non-specific reaction may occur due to the influence of substances in the antithrombin preparation, resulting in inaccurate measurement results. This is probably due to the presence of modified antithrombin multimers in the antithrombin formulation. It is considered that such an antithrombin multimer is closer to the structure of antithrombin when TAT is formed, as compared with normal antithrombin, and by forming the multimer, the reactivity to TAT is higher than that of antithrombin. It was considered that the antibody was recognized by a monoclonal antibody having a reactivity 100 times or more, and that the agglutination was caused by itself, and this was added to this reaction as a non-specific reaction. Such a non-specific reaction due to the antithrombin multimer is a problem that does not occur in a measurement method capable of B / F separation, and is a problem peculiar to the TAT measurement reagent using the latex agglutination method that was first discovered by the present inventor. is there.
As a method for avoiding the influence of antithrombin in a TAT measurement reagent by the conventional latex agglutination method, methods such as Patent Documents 1 and 2 are known, but non-specific agglutination is caused by an antithrombin preparation, and No workaround is suggested.
Therefore, an object of the present invention is to accurately measure TAT while avoiding the influence of antithrombin in a reagent and a method for measuring TAT in a biological sample using a latex agglutination method that does not require B / F separation and washing work. It is to provide a reagent and a method capable of measuring
この課題を解決するために鋭意検討した結果、本発明者は、ＴＡＴのアンチトロンビン部分に反応し、ＴＡＴに反応するモノクローナル抗体を吸着したラテックス粒子と抗トロンビンモノクローナル抗体を吸着したラテックス粒子を用いた凝集反応の検出値から、ＴＡＴのアンチトロンビン部分に反応し、ＴＡＴに反応するモノクローナル抗体を吸着したラテックス粒子のみの凝集反応の検出値を差し引くことで、アンチトロンビンの影響を回避して正確なＴＡＴの測定値が得られることを見出し、本発明を完成させた。 As a result of extensive studies to solve this problem, the present inventor has used latex particles that have adsorbed a monoclonal antibody that reacts with the antithrombin portion of TAT and that reacts with TAT and anti-thrombin monoclonal antibody. By subtracting the detection value of the agglutination reaction of only the latex particles which have reacted with the antithrombin portion of TAT and which has the TAT-reactive monoclonal antibody from the detection value of the agglutination reaction, the effect of antithrombin can be avoided and accurate TAT can be obtained. It was found that the measurement value of 10 was obtained, and the present invention was completed.
すなわち、本発明は以下を提供する。
[１] 被検者由来の血液試料中のトロンビン・アンチトロンビン複合体（ＴＡＴ）をラテックス凝集法によって測定するための試薬であって、該試薬が、ラテックス粒子に結合した第１抗ＴＡＴ抗体を含む第１の試薬と、それぞれラテックス粒子に結合した、第１抗ＴＡＴ抗体および第２抗ＴＡＴ抗体を含む第２の試薬とを含み、前記試料を第２の試薬と反応させたときに検出される値から前記試料を第１の試薬と反応させたときに検出される値を差し引くことにより、試料中に含まれるＴＡＴの値を測定することを特徴とする、ＴＡＴ測定試薬。
[２] 被検者由来の血液試料中のトロンビン・アンチトロンビン複合体（ＴＡＴ）をラテックス凝集法によって測定するための試薬であって、該試薬が、ラテックス粒子に結合した第１抗ＴＡＴ抗体を含む第１の試薬と、ラテックス粒子に結合した第２抗ＴＡＴ抗体を含む第２の試薬とを含み、前記試料を前記第１の試薬と反応させ、次いで前記第２の試薬と反応させ、前記試料を第２の試薬と反応させたときに検出される値から前記試料を第１の試薬と反応させたときに検出される値を差し引くことにより、試料中に含まれるＴＡＴの値を測定することを特徴とする、ＴＡＴ測定試薬。
[３] 前記被検者由来の血液試料が、アンチトロンビン製剤を投与された患者由来の試料である、[１]又は[２]に記載のＴＡＴ測定試薬。
[４] 前記第１抗ＴＡＴ抗体がアンチトロンビン側に結合してＴＡＴを認識する抗体であり、前記第２抗ＴＡＴ抗体がトロンビン側に結合してＴＡＴを認識する抗体である、[１]乃至[３]のいずれか一項に記載のＴＡＴ測定試薬。
[５] 前記第１抗ＴＡＴ抗体が、ＴＡＴに対する反応性が遊離アンチトロンビンに対する反応性の１００倍以上である抗体である、[４]に記載のＴＡＴ測定試薬。
[６] 被検者由来の血液試料中のトロンビン・アンチトロンビン複合体（ＴＡＴ）をラテックス凝集法によって測定する方法であって、
ラテックス粒子に結合した第１抗ＴＡＴ抗体を含む第１の試薬、および、それぞれラテックス粒子に結合した第１抗ＴＡＴ抗体および第２抗ＴＡＴ抗体を含む第２の試薬のそれぞれに試料を反応させる工程、並びに、
試料を第２の試薬と反応させたときに検出される値から試料を第１の試薬と反応させたときに検出される値を差し引くことによりＴＡＴの値を測定する工程、
を含むことを特徴とする、ＴＡＴ測定方法。
[７] 被検者由来の血液試料中のトロンビン・アンチトロンビン複合体（ＴＡＴ）をラテックス凝集法によって測定する方法であって、
試料を、ラテックス粒子に結合した第１抗ＴＡＴ抗体を含む第１の試薬、次いで、ラテックス粒子に結合した第２抗ＴＡＴ抗体を含む第２の試薬に反応させる工程、並びに、
試料を第２の試薬と反応させたときに検出される値から試料を第１の試薬と反応させたときに検出される値を差し引くことによりＴＡＴの値を測定する工程、
を含むことを特徴とする、ＴＡＴ測定方法。
[８] 前記被検者がアンチトロンビン製剤を投与された患者である、[６]又は[７]に記載のＴＡＴ測定方法。
[９] 前記第１抗ＴＡＴ抗体が、アンチトロンビン側に結合してＴＡＴを認識する抗体であって、ＴＡＴに対する反応性が遊離アンチトロンビンに対する反応性の１００倍以上である抗体であり、前記第２抗ＴＡＴ抗体が、トロンビン側に結合してＴＡＴを認識する抗体である、[６]乃至[８]のいずれか一項に記載のＴＡＴ測定方法。
That is, the present invention provides the following.
[1] A reagent for measuring a thrombin-antithrombin complex (TAT) in a blood sample from a subject by a latex agglutination method, the reagent comprising a first anti-TAT antibody bound to latex particles. A first reagent comprising a first reagent and a second reagent comprising a first anti-TAT antibody and a second anti-TAT antibody, each bound to latex particles, the reagent being detected when the sample is reacted with the second reagent. A TAT measuring reagent, wherein the value of TAT contained in the sample is measured by subtracting the value detected when the sample is reacted with the first reagent from the measured value.
[2] A reagent for measuring a thrombin-antithrombin complex (TAT) in a blood sample from a subject by a latex agglutination method, the reagent comprising a first anti-TAT antibody bound to latex particles. A first reagent comprising a second reagent comprising a second anti-TAT antibody bound to latex particles, the sample being reacted with the first reagent and then with the second reagent; The value of TAT contained in the sample is measured by subtracting the value detected when the sample is reacted with the first reagent from the value detected when the sample is reacted with the second reagent. A TAT measuring reagent characterized in that
[3] The TAT measurement reagent according to [1] or [2], wherein the blood sample derived from the subject is a sample derived from a patient to which an antithrombin preparation is administered.
[4] The first anti-TAT antibody is an antibody that binds to the antithrombin side to recognize TAT, and the second anti-TAT antibody is an antibody that binds to the thrombin side to recognize TAT, [1] to The TAT measurement reagent according to any one of [3].
[5] The TAT measurement reagent according to [4], wherein the first anti-TAT antibody is an antibody whose reactivity with TAT is 100 times or more that of free antithrombin.
[6] A method for measuring a thrombin-antithrombin complex (TAT) in a blood sample from a subject by a latex agglutination method,
Reacting a sample with each of a first reagent containing a first anti-TAT antibody bound to latex particles and a second reagent containing a first anti-TAT antibody and a second anti-TAT antibody bound to latex particles, respectively , And
Measuring the value of TAT by subtracting the value detected when the sample is reacted with the first reagent from the value detected when the sample is reacted with the second reagent,
A method for measuring TAT, comprising:
[7] A method for measuring a thrombin-antithrombin complex (TAT) in a blood sample from a subject by a latex agglutination method,
Reacting a sample with a first reagent comprising a first anti-TAT antibody bound to latex particles, and then a second reagent comprising a second anti-TAT antibody bound to latex particles, and
Measuring the value of TAT by subtracting the value detected when the sample is reacted with the first reagent from the value detected when the sample is reacted with the second reagent,
A method for measuring TAT, comprising:
[8] The TAT measurement method according to [6] or [7], wherein the subject is a patient to whom an antithrombin preparation is administered.
[9] The first anti-TAT antibody is an antibody that binds to the antithrombin side and recognizes TAT, wherein the reactivity with TAT is 100 times or more the reactivity with free antithrombin, and 2. The TAT measuring method according to any one of [6] to [8], wherein the anti-TAT antibody is an antibody that recognizes TAT by binding to the thrombin side.
本発明によれば、ラテックス凝集法の試薬により、生体試料中の微量なＴＡＴをアンチトロンビンの影響を回避しつつ、正確に測定（定量）することが可能である。これにより、アンチトロンビン製剤投与患者血漿でも正確にラテックス凝集法によるＴＡＴ測定が可能になり、ＤＩＣの治療にも用いられるアンチトロンビン製剤の投与がなされた患者検体中のＴＡＴを正確に測定できることは診断上有用である。 According to the present invention, a trace amount of TAT in a biological sample can be accurately measured (quantified) while avoiding the influence of antithrombin using a reagent for the latex agglutination method. As a result, it is possible to accurately measure TAT by the latex agglutination method even in the plasma of patients to which antithrombin preparations are administered, and it is diagnosed that TAT in patient specimens to which antithrombin preparations used for the treatment of DIC have been accurately measured. Above useful.
本発明のＴＡＴ測定試薬は、
被検者由来の血液試料中のＴＡＴをラテックス凝集法によって測定するための試薬であって、該試薬がラテックス粒子に結合した第１抗ＴＡＴ抗体を含む第１の試薬と、それぞれラテックス粒子に結合した第１抗ＴＡＴ抗体および第２抗ＴＡＴ抗体を含む第２の試薬とを含み、前記試料を第２の試薬と反応させたときに検出される値から前記試料を第１の試薬と反応させたときに検出される値を差し引くことにより、試料中に含まれるＴＡＴの値を測定することを特徴とする。
The TAT measuring reagent of the present invention is
A reagent for measuring TAT in a blood sample from a subject by a latex agglutination method, wherein the reagent comprises a first reagent containing a first anti-TAT antibody bound to latex particles, and bound to the latex particles, respectively. A second reagent containing a first anti-TAT antibody and a second anti-TAT antibody, and reacting the sample with the first reagent based on a value detected when the sample is reacted with the second reagent. The value of TAT contained in the sample is measured by subtracting the value detected at that time.
以下に、本発明のＴＡＴ測定試薬の一例を、実施の一態様として記載するが、本願発明の範囲はこれに限定されるものではない。
本発明のＴＡＴ測定試薬は、生体試料中のＴＡＴを測定するための、２種類のＴＡＴ抗
体をそれぞれ結合させたラテックス粒子を用いた、サンドイッチ系でのラテックス凝集法による免疫測定試薬である。
Hereinafter, an example of the TAT measuring reagent of the present invention will be described as an embodiment, but the scope of the present invention is not limited thereto.
The TAT measuring reagent of the present invention is an immunoassay reagent for measuring TAT in a biological sample by a latex agglutination method in a sandwich system using latex particles to which two kinds of TAT antibodies are bound respectively.
本発明に使用することができる抗体は、例えば、アンチトロンビン側に結合してＴＡＴを認識する抗体とトロンビン側に結合してＴＡＴを認識する抗体を組み合わせて使用することができる。
第１抗ＴＡＴ抗体としては、アンチトロンビン側に結合してＴＡＴを認識することができる抗体であればよい。ＴＡＴに対する反応性と遊離アンチトロンビンに対する反応性に少なくとも１００倍以上の差を有する抗体が好ましく用いられる。第１抗ＴＡＴ抗体のＴＡＴに対する反応性は遊離アンチトロンビンに対する反応性より少なくとも１００倍以上であればよく、２００倍以上がより好ましく、１，０００倍以上であることがさらに好ましく、１０，０００倍以上であることが特に好ましい。交差反応性は少ないほどよいので上限は特にないが、例えば、１００，０００倍未満、または５０，０００倍未満であってもよい。
該抗体を調製するにあたっては、ヒト以外の動物に対して、遊離アンチトロンビンを免疫したものであっても、ＴＡＴを免疫したものであってもよく、アンチトロンビン側に結合してＴＡＴを認識することができる抗体であれば、本発明に使用することができる。
As the antibody that can be used in the present invention, for example, an antibody that binds to the antithrombin side to recognize TAT and an antibody that binds to the thrombin side to recognize TAT can be used in combination.
The first anti-TAT antibody may be any antibody that can bind to the antithrombin side and recognize TAT. Antibodies having a difference of at least 100 times or more in reactivity to TAT and reactivity to free antithrombin are preferably used. The reactivity of the first anti-TAT antibody with respect to TAT may be at least 100 times or more than that with free antithrombin, more preferably 200 times or more, further preferably 1,000 times or more, and more preferably 10,000 times. The above is particularly preferable. The lower the cross-reactivity, the better, so there is no particular upper limit, but it may be less than 100,000 times or less than 50,000 times, for example.
In preparing the antibody, an animal other than human may be immunized with free antithrombin or TAT, and may bind to the antithrombin side to recognize TAT. Any antibody capable of being used can be used in the present invention.
ここで、本発明においてアンチトロンビン側に結合するとは、試料中に最も多く存在している遊離した状態のアンチトロンビンが、遊離トロンビンと結合して複合体（ＴＡＴ）を形成している状態のアンチトロンビンに結合することを意味する。従って、複合体を形成した時の構造を有するアンチトロンビンを複合体型構造アンチトロンビン、複合体を形成していない時の構造を有するアンチトロンビンを遊離型構造アンチトロンビン（遊離アンチトロンビン）と称した場合、アンチトロンビン側に結合するとは、複合体型構造アンチトロンビンに結合することを意味する。
遊離型構造アンチトロンビンは、複合体型構造アンチトロンビンと異なる構造を有する。それは、遊離型構造アンチトロンビンは、遊離トロンビンと結合して複合体を形成することによってその構造が変化した状態で存在するためである。
Here, in the present invention, binding to the antithrombin side means that the antithrombin in the free state, which is most present in the sample, binds to the free thrombin to form a complex (TAT). Means to bind thrombin. Therefore, when the antithrombin having the structure when the complex is formed is called the complex type antithrombin, and the antithrombin having the structure when the complex is not formed is called the free type antithrombin (free antithrombin). , Binding to the antithrombin side means binding to the complex-type structure antithrombin.
The free structure antithrombin has a structure different from that of the complex structure antithrombin. This is because free structure antithrombin exists in a state in which its structure is changed by binding with free thrombin to form a complex.
生体内におけるＴＡＴとＴＡＴを形成していない遊離アンチトロンビンの存在割合は健常人の測定値幅を参考として１：６０，０００〜１：１１０，０００の間と考えられるが、一般的には約１：１００，０００で存在していると考えられる。また、敗血症や肝疾患患者においてその存在割合が変化する場合が知られているが、遊離アンチトロンビン量が少なくなる場合でも１：５０，０００程度であるとされている。従って、第１抗体が遊離アンチトロンビンにも反応性を示すとＴＡＴの定量が困難になる。そこで、ＴＡＴを定量するには、遊離アンチトロンビンへの反応性が低い抗体を使用する必要があり、そのために、ＴＡＴに対する反応性が遊離アンチトロンビンに対する反応性の１００倍以上の抗体を用いる。 The ratio of TAT and free antithrombin that does not form TAT in the living body is considered to be between 1: 60,000 and 1: 110,000 with reference to the measurement value range of a healthy person, but it is generally about 1 : It is considered that it exists at 100,000. Further, it is known that the abundance ratio changes in patients with sepsis and liver disease, but it is said to be about 1: 50,000 even when the amount of free antithrombin decreases. Therefore, if the first antibody also reacts with free antithrombin, it becomes difficult to quantify TAT. Therefore, in order to quantify TAT, it is necessary to use an antibody having low reactivity with free antithrombin, and therefore, an antibody having 100 times or more reactivity with TAT as compared with free antithrombin is used.
本発明において、「ＴＡＴに対する反応性が遊離アンチトロンビンに対する反応性の１００倍以上」とは、各抗原に対する親和性の比が１００倍以上である場合や、後述の、間接阻害ＥＬＩＳＡで評価したときの、一定割合の阻害率を示すのに必要な抗原量の比が１００倍以上である場合などが挙げられる。 In the present invention, "reactivity to TAT is 100 times or more of reactivity to free antithrombin" means that the affinity ratio to each antigen is 100 times or more, or when evaluated by an indirect inhibition ELISA described below. And the case where the ratio of the amount of antigen required to exhibit a certain rate of inhibition is 100 times or more.
ＴＡＴに対する反応性が、遊離アンチトロンビンに対する反応性の１００倍以上である抗体（第１抗体）は後述の実施例に記載された方法で得ることができるが、以下に第１抗体を間接阻害ＥＬＩＳＡで評価またはスクリーニングする場合について説明する。
まず、アンチトロンビン側に結合してＴＡＴを認識する抗体（第１抗体の候補抗体）を用意する。このような抗体は、後述のハイブリドーマによるモノクローナル抗体産生法等により抗体を得たのち、結合部位がアンチトロンビン側である、ＴＡＴを認識する抗体を
選択すればよい。もちろん、あらかじめ、結合部位がアンチトロンビン側である、ＴＡＴを認識する抗体が存在する場合はそれを以下の評価系に供すればよい。
An antibody (first antibody) having a reactivity with TAT that is 100 times or more higher than the reactivity with free antithrombin can be obtained by the method described in Examples below, and the following is an indirect inhibition ELISA for the first antibody. Described below is the case of evaluation or screening.
First, an antibody that binds to the antithrombin side and recognizes TAT (first antibody candidate antibody) is prepared. For such an antibody, after obtaining an antibody by a method for producing a monoclonal antibody using a hybridoma described below or the like, an antibody that recognizes TAT having a binding site on the antithrombin side may be selected. Of course, when an antibody that recognizes TAT having a binding site on the antithrombin side is present in advance, it may be provided to the following evaluation system.
すなわち、候補抗体と一定量（例えば、０．１、０．５、１、５、１０、５０μｇ／ｍＬ）のＴＡＴ、又はＴＡＴの反応を阻害し得る抗原を含む溶液とを十分な時間（例えば、１２時間）反応させる。次いで、前記反応液をＴＡＴを固定化した基材と一定時間反応させる。その後、洗浄操作を行った後、標識２次抗体を用いて基材上のＴＡＴに結合した抗体の量（抗体残存率）を測定する。 That is, a candidate antibody and a solution containing a certain amount (for example, 0.1, 0.5, 1, 5, 10, 50 μg / mL) of TAT or an antigen capable of inhibiting the reaction of TAT for a sufficient time (for example, React for 12 hours). Then, the reaction solution is reacted with the substrate on which TAT is immobilized for a certain period of time. Then, after performing a washing operation, the amount of the antibody bound to TAT on the substrate (antibody residual rate) is measured using the labeled secondary antibody.
例えば、まず、該抗体の反応を阻害する抗原が存在しない条件で、一定量のＴＡＴをプレート等の基材に固相する。基材に固相する抗原（ＴＡＴ）の量は、当業者であれば、使用する抗原の分注量と評価対象の抗体の種類との関係を考慮して、適宜設定することができる。
該抗体の反応を阻害する抗原が存在しない条件で、各濃度（例えば０．０４〜１μｇ／ｍＬ）の上記第１抗体の候補抗体を、上記ＴＡＴを固定化した基材と一定時間反応させる。その後、洗浄操作を行った後、標識２次抗体（抗マウスＩｇＧ−ＨＲＰ）を用いて、基材上のＴＡＴに結合した抗体の量を測定する。吸光度が１．０付近（表１の記載方法だと１０００）となる抗体濃度を決定する。この抗体濃度を、抗原による阻害時の抗体濃度とすることができる（表３；反応時濃度（μｇ／ｍＬ））。
次に上記方法で決定した濃度の候補抗体と一定量（例えば、０．１、０．５、１、５、１０、５０μｇ／ｍＬ）のＴＡＴまたは遊離アンチトロンビンを含む溶液とを十分な時間（例えば、１２時間）反応させる。次いで、前記反応液をＴＡＴを固定化した基材と一定時間反応させる。その後、洗浄操作を行った後、標識２次抗体（抗マウスＩｇＧ−ＨＲＰ）を用いて基材上のＴＡＴに結合した抗体の量（抗体残存率）を測定する。
なお、抗体残存率は、抗原による吸収が未実施の時に得られる検出値を１００％として算出できる。
For example, first, a fixed amount of TAT is immobilized on a substrate such as a plate under the condition that no antigen that inhibits the reaction of the antibody is present. The amount of the antigen (TAT) immobilized on the base material can be appropriately set by those skilled in the art in consideration of the relationship between the amount of the antigen to be used and the type of the antibody to be evaluated.
Under the condition that there is no antigen that inhibits the reaction of the antibody, the candidate antibody of the first antibody at each concentration (for example, 0.04 to 1 μg / mL) is reacted with the substrate on which the TAT is immobilized for a certain period of time. Then, after performing a washing operation, the amount of the antibody bound to TAT on the substrate is measured using a labeled secondary antibody (anti-mouse IgG-HRP). The antibody concentration at which the absorbance is around 1.0 (1000 according to the method described in Table 1) is determined. This antibody concentration can be used as the antibody concentration at the time of inhibition by the antigen (Table 3; concentration at reaction (μg / mL)).
Next, the concentration of the candidate antibody determined by the above method and a solution containing a fixed amount (for example, 0.1, 0.5, 1, 5, 10, 50 μg / mL) of TAT or free antithrombin for a sufficient time ( For example, it is allowed to react for 12 hours. Then, the reaction solution is reacted with the substrate on which TAT is immobilized for a certain period of time. Then, after performing a washing operation, the amount of the antibody bound to TAT on the substrate (antibody residual rate) is measured using a labeled secondary antibody (anti-mouse IgG-HRP).
The antibody residual rate can be calculated by setting the detection value obtained when the absorption by the antigen is not carried out to 100%.
抗体の遊離アンチトロンビンに対する反応性が高い場合はＴＡＴに結合できる抗体の量が減るため、標識２次抗体によって検出される抗体の量が少なくなり（抗体残存率が低くなり）、一方、抗体が遊離アンチトロンビンに対する反応性が低い場合はＴＡＴに結合できる抗体が多く残るため、標識２次抗体によって検出される抗体の量が多くなる（抗体残存率が高くなる）。
この抗体残存率を、最初にＴＡＴと抗体とを反応させた（阻害反応をＴＡＴで行った）後に、反応液を固体化ＴＡＴと反応させたときの抗体残存率と比較する。
When the antibody has high reactivity to free antithrombin, the amount of antibody that can bind to TAT is reduced, and thus the amount of antibody detected by the labeled secondary antibody is low (the antibody residual rate is low). When the reactivity to free antithrombin is low, a large amount of the antibody capable of binding to TAT remains, so that the amount of the antibody detected by the labeled secondary antibody increases (the antibody residual rate increases).
This antibody residual rate is compared with the antibody residual rate when TAT and the antibody are first reacted (inhibition reaction is performed with TAT) and then the reaction solution is reacted with solidified TAT.
そして、例えば、遊離アンチトロンビンを５０μｇ／ｍＬ加えて阻害反応させたときの抗体残存率が５０％であった場合、同じ抗体残存率を示すのに必要なＴＡＴの量を上記のＴＡＴで阻害したときの結果から算出する。ＴＡＴで阻害したときに、抗体残存率５０％を達成するのに必要なＴＡＴ阻害抗原の量が０．５０μｇ／ｍＬ未満であれば、ＴＡＴに対する反応性が遊離アンチトロンビンに対する反応性の１００倍以上とすることができる。
このようにして選択された抗体を第1抗体として選択することができる。なお、第1抗体は、モノクローナル抗体の場合、ＴＡＴに対する親和性（Ｋｄ）が１０−８以下であることが好ましいが、当業者であればＴＡＴに対する親和性の値を参考としてラテックス試薬に適した抗体の選択を適宜することが可能である。
Then, for example, when the antibody residual ratio when the inhibitory reaction was performed by adding 50 μg / mL of free antithrombin was 50%, the TAT was used to inhibit the amount of TAT required to exhibit the same antibody residual ratio. It is calculated from the result. When the amount of TAT-inhibiting antigen required to achieve a residual antibody rate of 50% when it is inhibited by TAT is less than 0.50 μg / mL, the reactivity to TAT is 100 times or more than the reactivity to free antithrombin. Can be
The antibody thus selected can be selected as the first antibody. In the case of a monoclonal antibody, it is preferable that the first antibody has an affinity (Kd) for TAT of 10 −8 or less, but those skilled in the art will refer to the affinity value for TAT as a reference and suitable for a latex reagent. It is possible to select the antibody appropriately.
第１抗ＴＡＴ抗体として、アンチトロンビン側に結合してＴＡＴを認識することができる抗体を選択した場合、第２抗ＴＡＴ抗体としては、トロンビン側に結合してＴＡＴを認識することができる抗体であればよく、トロンビンに対して特異的に反応する抗体を使用することができる。試料中において、遊離トロンビンはほとんど存在しないため、遊離ト
ロンビンに対して交差反応性を有する抗体であっても利用できることが多い。当業者であれば、適宜選択して使用することができる。
該抗体を調製するにあたっては、ヒト以外の動物に対して、遊離トロンビンを免疫したものであっても、ＴＡＴを免疫したものであってもよく、トロンビン側に結合してＴＡＴを認識することができる抗体であれば、本発明に使用することができる。
ここで、本発明においてトロンビン側に結合するとは、試料中に存在している遊離した状態のトロンビンが、アンチトロンビンに結合して複合体（ＴＡＴ）を形成している状態のトロンビンに結合することを意味する。従って、複合体を形成した時の構造を有するトロンビンを複合体型構造トロンビン、複合体を形成していない時の構造を有するトロンビンを遊離型構造トロンビンと称した場合、トロンビン側に結合するとは、複合体型構造トロンビンに結合することを意味する。
遊離型構造トロンビンは、複合体型構造トロンビンと異なる構造を有する可能性が考えられる。それは、遊離型構造トロンビンは、アンチトロンビンと結合して複合体を形成することによってその構造が変化した状態で存在することによる。
When an antibody capable of binding to the antithrombin side to recognize TAT is selected as the first anti-TAT antibody, an antibody capable of binding to the thrombin side to recognize TAT is selected as the second anti-TAT antibody. It suffices to use an antibody that specifically reacts with thrombin. Since there is almost no free thrombin in the sample, even an antibody having cross-reactivity to free thrombin can often be used. Those skilled in the art can appropriately select and use it.
In preparing the antibody, an animal other than human may be immunized with free thrombin or immunized with TAT. It may bind to the thrombin side to recognize TAT. Any antibody that can be used can be used in the present invention.
Here, in the present invention, to bind to the thrombin side means that free thrombin existing in a sample binds to antithrombin to form a complex (TAT). Means Therefore, when a thrombin having a structure when a complex is formed is referred to as a complex-type structure thrombin, and a thrombin having a structure when not forming a complex is referred to as a free-form thrombin, it means that it binds to the thrombin side. Somatic structure means binding to thrombin.
It is possible that the free structure thrombin may have a structure different from that of the complex structure thrombin. This is because free structure thrombin exists in a state in which its structure is changed by binding with antithrombin to form a complex.
第２抗ＴＡＴ抗体としては、トロンビン側に結合してＴＡＴを認識する抗体であれば特に制限されない。モノクローナル抗体の場合、ＴＡＴに対する親和性（Ｋｄ）が１０−８以下であることが好ましいが、当業者であればＴＡＴに対する親和性の値を参考としてラテックス試薬に適した抗体の選択を適宜することが可能である。抗体を選択する方法については、第１抗ＴＡＴ抗体と同様にして作製した抗体を使用することができる。 The second anti-TAT antibody is not particularly limited as long as it is an antibody that recognizes TAT by binding to the thrombin side. In the case of a monoclonal antibody, the affinity (Kd) for TAT is preferably 10 −8 or less, but those skilled in the art should appropriately select an antibody suitable for a latex reagent with reference to the affinity value for TAT. Is possible. As a method for selecting an antibody, an antibody prepared in the same manner as the first anti-TAT antibody can be used.
また、本発明に使用する抗体として、例えば、ＴＡＴに特異的に結合する抗体、即ちトロンビンやアンチトロンビンには反応しないが、ＴＡＴにのみ特異的に反応する抗体であって、エピトープが異なる２種類の抗体を組み合わせて使用することもできる。 As the antibody used in the present invention, for example, an antibody that specifically binds to TAT, that is, an antibody that does not react with thrombin or antithrombin, but specifically reacts only with TAT, and has two different epitopes It is also possible to use the antibodies in combination.
上記の第１抗ＴＡＴ抗体及び第２抗ＴＡＴ抗体は、ポリクローナル抗体又はモノクローナル抗体のいずれも使用することができる。これらの抗体は、当業者であれば、公知の手法に従って取得することができる。
抗体作製用に免疫原を免疫する動物としては、ヒツジ、ウマ、ヤギ、ウサギ、マウス、ラット等が使用可能であり、特にポリクローナル抗体作製にはウサギ、ヤギなどが好ましい。また、ハイブリドーマ細胞を作製する公知の方法によりモノクローナル抗体を得ることも可能であり、この場合はマウス、ラット或いはウサギ等が好ましい。ハイブリドーマ及びモノクローナル抗体の調製は、定法、例えば、続生化学実験講座（日本生化学会編）又は免疫生化学研究法（日本生化学会編）に記載の方法に従って行うことができる。
As the above-mentioned first anti-TAT antibody and second anti-TAT antibody, either a polyclonal antibody or a monoclonal antibody can be used. Those skilled in the art can obtain these antibodies according to known methods.
As an animal to be immunized with an immunogen for antibody production, sheep, horse, goat, rabbit, mouse, rat or the like can be used, and particularly rabbit or goat is preferable for polyclonal antibody production. It is also possible to obtain a monoclonal antibody by a known method for producing hybridoma cells, in which case mouse, rat, rabbit or the like is preferable. The hybridoma and the monoclonal antibody can be prepared according to a conventional method, for example, the method described in the seminar on biochemistry experiments (edited by the Japanese Biochemical Society) or the immunobiochemical research method (edited by the Japanese Biochemical Society).
免疫原としては、上述したように、ＴＡＴを使用してもよいし、ビトロネクチンが結合したＶＴＡＴを免疫原として作製した抗体を本願発明の使用することもできる。また、第１抗体の場合はアンチトロンビンを、第２抗体の場合にはトロンビンを使用してもよい。
これらの免疫原は、生体から採取された試料を原料として精製されたＴＡＴを使用してもよいし、遊離トロンビンと遊離アンチトロンビンを混合してｉｎｖｉｔｒｏで合成したＴＡＴを使用してもよい。合成ＴＡＴとしては、例えば、生物製剤として入手可能なトロンビンとアンチトロンビンを試験管内でインキュベートして得られるＴＡＴでもよいし、大腸菌や哺乳動物細胞、バキュロウイルスを感染させた昆虫細胞等、既知の翻訳発現系を使用して発現させたものを回収して精製したものを免疫原として使用してもよい。
また、立体構造の違いを部分的なペプチドのみで免疫させることが可能である場合、具体的に抗体の結合部位を特定して抗体を作製したい場合には第１抗体の場合はアンチトロンビン、第２抗体の場合はトロンビンの部分ペプチドを用いて作製することもできる。その場合の抗原としてのペプチド配列の選択やペプチド断片の合成方法、免疫方法は既知の方法を使用することができる。
As described above, TAT may be used as the immunogen, or an antibody prepared using vitronectin-bound VTAT as the immunogen can be used in the present invention. Alternatively, antithrombin may be used for the first antibody and thrombin for the second antibody.
As these immunogens, TAT purified from a sample collected from a living body may be used, or TAT synthesized in vitro by mixing free thrombin and free antithrombin may be used. The synthetic TAT may be, for example, TAT obtained by incubating thrombin and antithrombin, which are available as biologics, in vitro, or known translations such as Escherichia coli, mammalian cells, insect cells infected with baculovirus, etc. What was expressed using an expression system, what was recovered, and what was purified may be used as an immunogen.
In addition, when it is possible to immunize with a partial peptide only due to the difference in three-dimensional structure, when it is desired to specifically specify the binding site of the antibody to prepare the antibody, in the case of the first antibody, antithrombin, In the case of 2 antibodies, it can also be prepared using a partial peptide of thrombin. In this case, known methods can be used for selecting a peptide sequence as an antigen, synthesizing a peptide fragment, and immunizing.
本発明で使用される抗体には、抗体フラグメントが含まれる。前記抗体フラグメントは、所望の抗体のフラグメントであって、しかも、もとの抗体と同じ反応性を有する抗体フラグメントである。本発明で用いることのできる抗体フラグメントには、例えば、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ’）2、又はＦｖ等が含まれる。これらのフラグメントは、例えば、抗体を常法によりタンパク質分解酵素によって消化し、続いて、タンパク質の分離・精製の常法に従って得ることができる。これらは、そのままラテックス粒子に固相して使用することができるが、Ｆａｂ’フラグメントやＦ（ａｂ’）2フラグメントに調製したものをラテックス粒子に固相することができる。抗体のＦｃフラグメントに対する非特異反応を回避する観点から、Ｆａｂ’やＦ（ａｂ’）2がより好ましい。 The antibodies used in the present invention include antibody fragments. The antibody fragment is a fragment of the desired antibody and has the same reactivity as the original antibody. Antibody fragments that can be used in the present invention include, for example, Fab, Fab ′, F (ab ′) 2 or Fv. These fragments can be obtained, for example, by digesting an antibody with a proteolytic enzyme according to a conventional method, and subsequently according to a conventional method for separating and purifying a protein. These can be used by being solid-phased on latex particles as they are, but Fab 'fragments or F (ab') 2 fragments prepared can be solid-phased on latex particles. Fab ′ and F (ab ′) 2 are more preferable from the viewpoint of avoiding nonspecific reaction of the Fc fragment of the antibody.
本発明で使用する抗体は、まず、ハイブリドーマによるモノクローナル抗体産生法などによりＴＡＴ抗体（候補抗体）を得て、その後、ＴＡＴ抗体（候補抗体）の中から、上記のような手法及び基準で、第１抗体および第２抗体を選択することにより得ることができる。 The antibody used in the present invention is obtained by first obtaining a TAT antibody (candidate antibody) by a method for producing a monoclonal antibody using a hybridoma, and then selecting the TAT antibody (candidate antibody) from It can be obtained by selecting the first antibody and the second antibody.
第１抗体と第２抗体の組み合わせはラテックス凝集法においてＴＡＴの測定が可能であれば特に制限されないが、血漿などの生体試料中に含まれるマトリクス（バックグラウンド）の影響が最少の抗体組み合わせを選出することが好ましい。
ＴＡＴ測定試薬に求められる感度は、健常人と患者とを明確に区別できる基準値、或いはその２倍の濃度を測定できることが必要であるため、本発明の試薬は生体試料中の１０〜１５ｎｇ／ｍＬのＴＡＴを定量できる試薬であることが好ましく、３〜４ｎｇ／ｍＬのＴＡＴを定量できる試薬であることがより好ましく、１ｎｇ／ｍＬ程度の濃度でも定量できる試薬であることがさらに好ましい。
The combination of the first antibody and the second antibody is not particularly limited as long as TAT can be measured by the latex agglutination method, but an antibody combination that is minimally affected by the matrix (background) contained in a biological sample such as plasma is selected. Preferably.
The sensitivity required for the TAT measuring reagent is required to be able to measure a reference value capable of clearly distinguishing between a healthy person and a patient, or twice the concentration thereof. Therefore, the reagent of the present invention contains 10 to 15 ng / A reagent that can quantify TAT of mL is preferable, a reagent that can quantify TAT of 3 to 4 ng / mL is more preferable, and a reagent that can quantify even at a concentration of about 1 ng / mL is even more preferable.
上記の第１抗ＴＡＴ抗体および第２抗ＴＡＴ抗体を結合させるラテックス粒子はラテックス凝集反応に使用し得るものであれば特に制限されないが、平均粒子径が０．０５μｍ〜０．５μｍであることが好ましく、０．２〜０．４μｍであることがより好ましい。
使用するラテックス粒子の種類は、１種類のラテックス粒子のみを使用してもよいし、複数種のラテックス粒子を使用してもよい。例えば、粒子径の異なるラテックス粒子を組み合わせて使用することができる。ラテックス粒子は単一粒径で製造することは実質的に困難であることから、粒子全体の平均粒子径として規定される。従って、平均粒子径０．０５μｍ〜０．５μｍという場合、当該範囲に含まれないラテックス粒子を含む場合であっても、本発明に該当する場合がある。当業者にとって、粒径が異なるラテックス粒子が含まれることは常識の範囲内であり、当業者であれば、その粒径の分布に大きく偏りの無い粒子群を含む溶液を使用してラテックス試薬の構築することが可能である。
なお、この平均粒子径は、公知の方法で測定することが可能であり、例えば、透過型電子顕微鏡装置を用いた画像解析により算出される。
The latex particles for binding the first anti-TAT antibody and the second anti-TAT antibody are not particularly limited as long as they can be used in the latex agglutination reaction, but the average particle diameter is 0.05 μm to 0.5 μm. It is more preferably 0.2 to 0.4 μm.
As the type of latex particles to be used, only one type of latex particles may be used, or a plurality of types of latex particles may be used. For example, latex particles having different particle sizes can be used in combination. Since it is substantially difficult to produce latex particles with a single particle size, it is defined as the average particle size of all particles. Therefore, when the average particle size is 0.05 μm to 0.5 μm, the present invention may be applicable even when the latex particles not included in the range are included. For those skilled in the art, it is within the common sense that latex particles having different particle diameters are included, and those skilled in the art can use a solution containing a particle group in which the distribution of the particle diameter is not largely biased, and the latex reagent It is possible to build.
The average particle diameter can be measured by a known method, and is calculated, for example, by image analysis using a transmission electron microscope device.
本発明に係るラテックス粒子としては、通常この分野で用いられているものであれば特に限定はされないが、例えば、スチレン、塩化ビニル、アクリロニトリル、酢酸ビニル、アクリル酸エステル、メタクリル酸エステル等のビニル系モノマーを重合させてなる単一重合体（例えば、ポリスチレン、メタクリル酸重合体、アクリル酸重合体等）からなる粒子、ブタジエン系共重合体（例えば、スチレン−ブタジエン共重合体、メチルメタクリレート−ブタジエン共重合体、アクリロニトリル−ブタジエン共重合体等）からなる粒子、それ以外の共重合体（例えば、スチレン−スチレンスルホン酸塩共重合体、メタクリル酸エステル共重合体、アクリル酸エステル共重合体、塩化ビニル−アクリル酸エステル共重合体等）からなる粒子を挙げられる。官能基としてカルボキシル基、１級アミノ基、カルバモイル基（−ＣＯＮＨ2）、水酸基、アルデヒド基等を有し、かつ、基体が上記有機系微粒子からなる粒子を挙げられる。 The latex particles according to the present invention are not particularly limited as long as they are usually used in this field, but for example, vinyl type such as styrene, vinyl chloride, acrylonitrile, vinyl acetate, acrylic acid ester, and methacrylic acid ester. Particles of a homopolymer obtained by polymerizing a monomer (for example, polystyrene, methacrylic acid polymer, acrylic acid polymer, etc.), butadiene-based copolymer (for example, styrene-butadiene copolymer, methylmethacrylate-butadiene copolymer) Copolymers, particles made of acrylonitrile-butadiene copolymer, etc., other copolymers (for example, styrene-styrene sulfonate copolymer, methacrylic acid ester copolymer, acrylic acid ester copolymer, vinyl chloride- Acrylic ester copolymer etc.) That. Particles having a carboxyl group, a primary amino group, a carbamoyl group (—CONH 2 ), a hydroxyl group, an aldehyde group or the like as a functional group and having a substrate made of the above organic fine particles can be mentioned.
ラテックス粒子に抗体を固相する方法としては、公知の方法に準じて行えばよく、例えば、抗体とラテックス粒子とを緩衝液中で懸濁させ、２５℃で１時間反応させた後、遠心分離、ブロッキング処理等、通常この分野で行われる処理により得ることができる。また、抗体とラテックス粒子とを化学結合により固相する方法や、ビオチン−アビジン反応により抗体を固相する方法も選択できる。
ラテックス粒子に抗体を結合させる際には、抗体が、上記のＴＡＴに対する反応性および特異性を維持できる条件で行う。抗体とラテックス粒子をどのように固相させて試薬の調製を行うかは、当業者であれば適宜設計することができる。
The antibody may be immobilized on the latex particles by a known method. For example, the antibody and the latex particles may be suspended in a buffer solution, reacted at 25 ° C. for 1 hour, and then centrifuged. , Blocking treatment, etc., which are usually performed in this field. Further, a method in which the antibody and the latex particles are solid-phased by a chemical bond or a method in which the antibody is solid-phased by a biotin-avidin reaction can be selected.
When the antibody is bound to the latex particles, it is performed under the condition that the antibody can maintain the reactivity and specificity for the above TAT. Those skilled in the art can appropriately design how to solidify the antibody and the latex particles to prepare the reagent.
本発明のＴＡＴ測定法は、ラテックス粒子に結合した、アンチトロンビン側に結合してＴＡＴを認識する抗体であってＴＡＴに対する反応性が遊離アンチトロンビンに対する反応性の１００倍以上である抗体（第１抗ＴＡＴ抗体）を含む第１の試薬に試料を反応させる工程（第１工程）、ラテックス粒子に結合した前記第１抗ＴＡＴ抗体、およびラテックス粒子に結合した、トロンビン側に結合してＴＡＴを認識する抗体（第２抗ＴＡＴ抗体）を含む第２の試薬に試料を反応させる工程（第２工程）、並びに試料を第２の試薬と反応させたときに検出される値から試料を第１の試薬と反応させたときに検出される値を差し引くことによりＴＡＴの値を測定する工程（第３工程）、を含む。 The TAT assay method of the present invention is an antibody that binds to latex particles and binds to the antithrombin side to recognize TAT, and the reactivity with TAT is 100 times or more than the reactivity with free antithrombin (first Reacting a sample with a first reagent containing anti-TAT antibody) (first step), recognizing TAT by binding to the first anti-TAT antibody bound to latex particles and bound to thrombin bound to latex particles The second reagent containing the antibody (second anti-TAT antibody) that reacts the sample with the second reagent (second step), and the first value of the sample from the value detected when the sample is reacted with the second reagent. Measuring the value of TAT by subtracting the value detected when reacting with the reagent (third step).
なお、試料を独立の反応系で第１の試薬および第２の試薬それぞれに反応させる場合は、第１工程と第２工程はいずれを先に行ってもよく、同時に行ってもよい。この場合は、第２の試薬は、２種類のラテックス粒子にそれぞれ２種類の抗体を結合させたものでもよいし、１種類のラテックス粒子に２種類の抗体を結合させたものでもよい。
それぞれ独立の反応系で検出された、試料を第２の試薬と反応させたときの検出値から試料を第１の試薬と反応させたときの検出値を差し引き、得られた値に基づいてＴＡＴの値が算出される。これにより、アンチトロンビンによる非特異凝集の影響が除かれたＴＡＴの正確な量を測定することができる。
When the sample is reacted with each of the first reagent and the second reagent in an independent reaction system, either the first step or the second step may be performed first or may be performed simultaneously. In this case, the second reagent may be one in which two types of antibodies are bound to two types of latex particles, or one type of latex particles may be bound to two types of antibodies.
The detected value when the sample was reacted with the first reagent was subtracted from the detected value when the sample was reacted with the second reagent, which was detected by each independent reaction system, and the TAT was calculated based on the obtained value. Is calculated. This makes it possible to measure an accurate amount of TAT from which the influence of non-specific aggregation due to antithrombin has been removed.
一方、他の態様として、試料をまず第１抗ＴＡＴ抗体を結合したラテックス粒子と反応させて検出値を測定し、次いで、同じ反応系に第２抗ＴＡＴ抗体を結合したラテックス粒子を加えて、試料を第１抗ＴＡＴ抗体及び第２抗ＴＡＴ抗体と反応させて検出値を測定し、後者から前者を差し引き、得られた値に基づいてＴＡＴの値を算出することも可能である。 On the other hand, as another embodiment, the sample is first reacted with the latex particles bound with the first anti-TAT antibody to measure the detection value, and then the latex particles bound with the second anti-TAT antibody are added to the same reaction system, It is also possible to react the sample with the first anti-TAT antibody and the second anti-TAT antibody, measure the detection value, subtract the former from the latter, and calculate the TAT value based on the obtained value.
本発明の試薬に適用することのできる被検試料は、ＴＡＴを含有する可能性のある被検試料である限り、特に限定されるものではないが、生体試料であることが好ましく、哺乳動物由来の試料であることがより好ましく、ヒト由来の試料であることが更に好ましい。生体由来の試料としては、血清、血漿が特に好適に使用できる。好ましくは、アンチトロンビン製剤を投与された被検者由来の血液試料であって、更に好ましくはアンチトロンビン製剤を投与された被検者由来の血漿である。
アンチトロンビン製剤としては、献血ノンスロン（登録商標）５００注射用、献血ノンスロン（登録商標）１５００注射用（日本製薬）、アンスロビン（登録商標）Ｐ５００注射用、アンスロビン（登録商標）Ｐ１５００注射用（化学及血清療法研究所）、ノイアート（登録商標）静注用５００単位、ノイアート（登録商標）静注用１５００単位（日本血液製剤機構）、アコアラン（登録商標）静注用６００（協和発酵キリン）が例示される。
The test sample that can be applied to the reagent of the present invention is not particularly limited as long as it is a test sample that may contain TAT, but is preferably a biological sample, which is derived from a mammal. Is more preferable, and a human-derived sample is still more preferable. Serum and plasma can be particularly preferably used as the biological sample. A blood sample derived from a subject administered with the antithrombin preparation is preferable, and plasma derived from a subject administered with the antithrombin preparation is more preferable.
As antithrombin preparations, blood donation nonthrone (registered trademark) 500 injection, blood donation nonthrone (registered trademark) 1500 injection (Nippon Pharmaceutical), anthrobin (registered trademark) P500 injection, anthrobin (registered trademark) P1500 injection (chemical and Serum therapy laboratory), 500 units for Neuart (registered trademark) intravenous injection, 1500 units for Neuart (registered trademark) intravenous injection (Japan Blood Products Organization), 600 for Acoalan (registered trademark) intravenous injection (Kyowa Hakko Kirin) To be done.
反応温度は１０〜５０℃であることが好ましく、２０〜４０℃であることがより好ましい。反応時間は適宜決定することができ、例えば汎用自動分析機では１０〜１５分間の反応時間で測定することができる。なお、当業者であれば、光学機器あるいは汎用自動分析機を用いた分析において、公知の方法に従って、反応温度、反応時間、測定波長、測定時間、試薬構成、ラテックス濃度、ラテックス固定化する抗体濃度、各種添加剤濃度を適宜
決定することができる。
The reaction temperature is preferably 10 to 50 ° C, more preferably 20 to 40 ° C. The reaction time can be appropriately determined, and for example, a general-purpose automatic analyzer can measure the reaction time of 10 to 15 minutes. In addition, those skilled in the art, in the analysis using an optical instrument or a general-purpose automatic analyzer, according to known methods, reaction temperature, reaction time, measurement wavelength, measurement time, reagent composition, latex concentration, antibody concentration for latex immobilization The concentrations of various additives can be appropriately determined.
本発明に用いられるラテックス粒子の濃度は、ラテックス凝集法による免疫学的測定試薬に適用できる濃度であれば特に限定されるものではないが、ＴＡＴを測定するために必要な反応時のラテックス粒子の濃度は０．００５ｗ／ｖ％〜０．２ｗ／ｖ％が好ましく、０．０１ｗ／ｖ％〜０．１ｗ／ｖ％であることがより好ましい。 The concentration of the latex particles used in the present invention is not particularly limited as long as it can be applied to an immunological measurement reagent by the latex agglutination method, but the concentration of the latex particles at the time of reaction necessary for measuring TAT is not limited. The concentration is preferably 0.005 w / v% to 0.2 w / v%, more preferably 0.01 w / v% to 0.1 w / v%.
本発明の試薬は、抗体を固定化したラテックス粒子以外にも、ラテックス凝集法による免疫学的測定試薬に添加可能な添加剤、例えば、緩衝液、凝集促進剤、非特異反応抑制剤、増感剤などを更に含有することができる。本発明の試薬に添加可能な増感剤としては、アルギン酸ナトリウムやアルギン酸プロピレングリコールなどが挙げられる。また、本発明の試薬に添加可能な凝集促進剤としては、水溶性高分子やタンパク質が好適に用いられる。例えば、デキストランやデキストラン硫酸、ポリビニルアルコール、ポリエチレングリコール、ポリビニルピロリドンなどの水溶性高分子や、ウシ血清アルブミンなどのアルブミン類、γ−グロブリンなどのグロブリン類が挙げられる。 The reagent of the present invention is, in addition to latex particles having an antibody immobilized thereon, an additive that can be added to an immunological measurement reagent by a latex agglutination method, for example, a buffer solution, an agglutination promoter, a non-specific reaction inhibitor, and a sensitizer. Agents and the like can be further contained. Examples of the sensitizer that can be added to the reagent of the present invention include sodium alginate and propylene glycol alginate. Further, as the aggregation promoter that can be added to the reagent of the present invention, a water-soluble polymer or protein is preferably used. Examples thereof include water-soluble polymers such as dextran and dextran sulfate, polyvinyl alcohol, polyethylene glycol, and polyvinylpyrrolidone, albumins such as bovine serum albumin, and globulins such as γ-globulin.
前記緩衝液としては、例えば、ｐＨ５．８〜６．６に緩衝能を有する緩衝液を使用することができる。６．０〜６．４であることがより好ましく、６．１〜６．３であることがさらに好ましく、６．１５〜６．２５であることが特に好ましい。１試薬系であれば、試薬のｐＨが上記範囲に調整されていればよいし、２試薬系であれば、混合したときにｐＨが上記範囲になるように構成されていればよい。例えば、緩衝液成分を主体とした試薬１と、抗体を固相したラテックス粒子を含む試薬２から構成される場合に、試薬１のｐＨが上記範囲に調整されており、両試薬を混合したときに、混合液のｐＨが上記範囲になるような態様が挙げられる。
ｐＨはｐＨ調節剤によって調節されてもよいが、緩衝液により調整されることが好ましい。トリス緩衝液、ビス−トリス緩衝液、リン酸緩衝液、又はグッド緩衝液などが好適に使用され、反応時の緩衝液濃度は１０〜５００ｍｍｏｌ／Ｌであることが好ましく、２０〜２００ｍｍｏｌ／Ｌであることがより好ましい。
As the buffer solution, for example, a buffer solution having a buffer capacity at pH 5.8 to 6.6 can be used. It is more preferably 6.0 to 6.4, further preferably 6.1 to 6.3, and particularly preferably 6.15 to 6.25. In the case of a one-reagent system, the pH of the reagent may be adjusted to the above range, and in the case of a two-reagent system, the pH may be adjusted to fall within the above range when mixed. For example, in the case where the reagent 1 is composed mainly of a buffer component and the reagent 2 containing latex particles having an antibody solid phase, the pH of the reagent 1 is adjusted to the above range and both reagents are mixed. In addition, a mode in which the pH of the mixed solution falls within the above range can be mentioned.
The pH may be adjusted by a pH adjusting agent, but is preferably adjusted by a buffer solution. A Tris buffer solution, a bis-Tris buffer solution, a phosphate buffer solution, a Good's buffer solution, or the like is preferably used, and the buffer solution concentration during the reaction is preferably 10 to 500 mmol / L, and preferably 20 to 200 mmol / L. More preferably.
本発明の試薬に添加可能な非特異反応抑制剤としては、非特異反応の原因物質に対する抗体やレセプター、トリス緩衝液、リン酸緩衝液、グリシン緩衝液、ホウ酸緩衝液、クエン酸緩衝液、酢酸緩衝液又はグッド緩衝液などの緩衝液類、ＥＤＴＡ、ＣｙＤＴＡ、ＤＴＰＡ、ＥＧＴＡ、ＮＴＡ、ＮＴＰなどのキレート剤、塩化ナトリウム、塩化カリウム、硫酸ナトリウム、硫酸カルシウム、硫酸マグネシウム、炭酸カルシウム、炭酸ナトリウムなどの塩類、脂肪酸ジエタノールアミド、ポリオキシエチレンアルキルエーテル、ポリオキシエチレンアルキルフェニルエーテル、脂肪酸ソルビタンエステル、アルキルポリグルコシド、アルキルモノグリセリルエーテル、ポリオキシエチレンソルビタン脂肪酸エステル、脂肪酸アルカノールアミド、アルキルグリコシドなどの非イオン性界面活性剤が挙げられる。 As the non-specific reaction inhibitor that can be added to the reagent of the present invention, an antibody or a receptor against a substance causing a non-specific reaction, Tris buffer, phosphate buffer, glycine buffer, borate buffer, citrate buffer, Buffers such as acetate buffer or Good's buffer, chelating agents such as EDTA, CyDTA, DTPA, EGTA, NTA, NTP, sodium chloride, potassium chloride, sodium sulfate, calcium sulfate, magnesium sulfate, calcium carbonate, sodium carbonate, etc. , Fatty acid diethanolamide, polyoxyethylene alkyl ether, polyoxyethylene alkylphenyl ether, fatty acid sorbitan ester, alkyl polyglucoside, alkyl monoglyceryl ether, polyoxyethylene sorbitan fatty acid ester, fatty acid alkanolamide, Nonionic surfactants such as Rukirugurikoshido the like.
ラテックス粒子の凝集の度合いは、例えば吸光度を用いて測定し、予め求めておいた標準品の検量線からその濃度を求めることにより、検体中のＴＡＴ濃度を定量することができる。本発明では、ダブルカイネティック法を使用し、試料と第１の試薬混合時に生じる吸光度変化量とさらに第２の試薬を添加した後に生じた吸光度変化量とから、目的とする成分の量と比例関係を有する吸光度変化量を求め、予め標準液を用いた検量線から、目的とする成分の量を測定することができる。なお、吸光度の測定波長は、通常は３４０ｎｍ〜１０００ｎｍ、好ましくは５００ｎｍ〜９００ｎｍで測定すればよい。ラテックス凝集反応を測光する時間は、ラテックス凝集反応が生じている時間を時間当たりの変化速度、あるいは一定時間の変化量によって測光することができる。例えば、吸光度を測定する場合、ラテックス凝集反応が始まってから３０秒後から５分後の時間当たりの吸光度変化速
度、あるいは一定時間の吸光度変化量によって測光することができる。
The degree of aggregation of the latex particles is measured by using, for example, the absorbance, and the TAT concentration in the sample can be quantified by obtaining the concentration from the calibration curve of the standard product obtained in advance. In the present invention, the double kinetic method is used, and the amount of change in absorbance that occurs when the sample and the first reagent are mixed and the amount of change in absorbance that occurs after addition of the second reagent are proportional to the amount of the target component. The amount of change in absorbance having a relationship can be obtained, and the amount of the target component can be measured in advance from a calibration curve using a standard solution. The measurement wavelength of the absorbance may be usually 340 nm to 1000 nm, preferably 500 nm to 900 nm. As for the time for measuring the latex agglutination reaction, the time during which the latex agglutination reaction is occurring can be measured by the rate of change per hour or the amount of change over a certain period of time. For example, when measuring the absorbance, photometry can be performed by the absorbance change rate per unit time from 30 seconds to 5 minutes after the start of the latex agglutination reaction, or the amount of change in the absorbance for a certain period of time.
本発明の試薬は、標準物質として使用し得るＴＡＴを含んでもよい。ＴＡＴは生体から精製されたＴＡＴでもよいし、遺伝子組み換えなどで合成されたＴＡＴでもよい。合成ＴＡＴとしては、例えば、生物製剤として入手可能なトロンビンとアンチトロンビンを試験管内でインキュベートして得ることができる。また、大腸菌や哺乳動物細胞、バキュロウイルスを感染させた昆虫細胞等において、既知の翻訳発現系を使用して発現させたものを回収して精製したものを混合してＴＡＴを合成することもできる。 The reagent of the present invention may contain TAT which can be used as a standard substance. The TAT may be TAT purified from a living body or TAT synthesized by genetic recombination. The synthetic TAT can be obtained, for example, by incubating thrombin and antithrombin, which are available as biologics, in a test tube. In addition, TAT can also be synthesized by mixing purified Escherichia coli, mammalian cells, insect cells infected with baculovirus, etc., which have been expressed using a known translation expression system, and purified. .
実施例１ 合成ＴＡＴの調製
市販のヒトトロンビン製剤（日本血液製剤機構製）とアンチトロンビン製剤（日本血液製剤機構製）をＰＢＳ（ダルベッコＰＢＳ（−）粉末「ニッスイ（日水製薬株式会社製）」、を９．６ｇ／Ｌで溶解）で希釈し、１：３のモル比で混合後、３７℃で３０分間反応させた。３０分後、ＤＦＰ（フルオロリン酸ジイソプロピル、和光純薬社製）を０．７５ｍＭになるように添加し反応を停止した。
得られた反応物には未反応のトロンビン、アンチトロンビンが含まれるため、予め５００ｍＭのＮａＣｌを含む５０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ緩衝液（ｐＨ７．４）で平衡化したＨｉｌｏａｄ ２６／６０ Ｓｕｐｅｒｄｅｘ ２００ ＨＲ（ＧＥヘルスケア社製）によって精製した。
ＴＡＴ画分はＳＤＳ−ＰＡＧＥで確認した後、回収した。得られたＴＡＴは０．５％のＢＳＡを含む生理食塩水で希釈し、ＣＬＥＩＡ試薬（ステイシア(登録商標) ＣＬＥＩＡ
ＴＡＴ、ＬＳＩメディエンス社製）を用いて値付けした。これを合成ＴＡＴとして使用した。
Example 1 Preparation of Synthetic TAT Commercially available human thrombin formulation (manufactured by Japan Blood Products Organization) and antithrombin formulation (manufactured by Japan Blood Products Organization) were used as PBS (Dulbecco PBS (-) powder "Nissui (Nissui Pharmaceutical Co., Ltd.)". Was dissolved in 9.6 g / L), mixed at a molar ratio of 1: 3, and reacted at 37 ° C. for 30 minutes. After 30 minutes, DFP (diisopropyl fluorophosphate, manufactured by Wako Pure Chemical Industries, Ltd.) was added at 0.75 mM to stop the reaction.
Since the obtained reaction product contains unreacted thrombin and antithrombin, Hiload 26/60 Superdex 200 HR (GE Health) pre-equilibrated with 50 mM Tris-HCl buffer (pH 7.4) containing 500 mM NaCl. Purified by CARE).
The TAT fraction was confirmed by SDS-PAGE and then collected. The obtained TAT was diluted with a physiological saline solution containing 0.5% BSA, and the CLEIA reagent (Staceia (registered trademark) CLEIA) was diluted.
TAT, manufactured by LSI Medience Co., Ltd.). This was used as synthetic TAT.
実施例２ 抗ＴＡＴ抗体の調製
細胞融合法は、安藤民衛・岩崎辰夫/著「単クローン抗体/ハイブリドーマとＥＬＩＳＡ」（講談社）に従って実施した。
実施例１で調製した合成ＴＡＴ ５０μｇをフロインド完全アジュバント（ＤＩＦＣＯ社製）と混合し、投与抗原とした。
ＢＡＬＢ／ｃマウス（メス、４週令）に２週間間隔で３回投与し、４回目の投与は半量の２５μｇを静注した。
１週間後、脾臓よりリンパ球を分離し、ミエローマ細胞Ｐ３ｘ６３−Ａｇ．８と混合した後、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ４０００、メルク社製）を用いて細胞融合を実施した。
ＨＡＴ選択培地によりハイブリドーマを選択し、１週間後目的の抗体を産生しているハイブリドーマを合成ＴＡＴに対する結合活性を指標にスクリーニングした。すなわち、０．０５Ｍ炭酸緩衝液（ｐＨ９．５）で合成ＴＡＴをそれぞれ０．２μｇ／ｍＬに希釈し、イムノプレート（Ｍａｘｉｓｏｒｐ、ＮＵＮＣ社製）に５０μＬ／ウェル添加した。４℃、Ｏｖｅｒ Ｎｉｇｈｔで反応後、０．０５％ Ｔｗｅｅｎ−２０を含むＰＢＳで３回洗浄し、１．０％ＢＳＡを含むＰＢＳを各ウェルに１００μＬ添加しブロッキングを行った。
次に、培養上清各ウェルに５０μＬ添加し、３７℃で１時間反応させた後、０．０５％
Ｔｗｅｅｎ−２０を含むＰＢＳで３回洗浄した。ペルオキシダーゼ標識抗マウスイムノグロブリン抗体（Ｄａｋｏ社製）を、０．０５％ Ｔｗｅｅｎ−２０を含むＰＢＳで１０００倍に希釈し、各ウェルに５０μＬ添加した。
３７℃、１時間反応後、同様に５回洗浄しｏ−フェニレンジアミン溶液（和光純薬社製）を各ウェル５０μＬ添加した。室温で５〜１０分間反応後、２Ｎ硫酸溶液で反応を停止した。
プレート分光光度計（ＥＬ３１２ｅ、ＢＩＯ−ＴＥＫ ＩＮＳＴＲＵＭＥＮＴＳ社製）
で４９２ｎｍの吸光度を測定した。合成ＴＡＴとの反応が良好な抗体を産生している細胞を選択し、限界希釈法によりクローニングを行った。１０日後、スクリーニングを行い、合成ＴＡＴと反応する抗体を産生するハイブリドーマを取得した。
Example 2 Preparation of anti-TAT antibody The cell fusion method was performed according to Tamie Ando and Tatsuo Iwasaki / "Monoclonal antibody / Hybridoma and ELISA" (Kodansha).
50 μg of the synthetic TAT prepared in Example 1 was mixed with Freund's complete adjuvant (manufactured by DIFCO) and used as an administration antigen.
BALB / c mice (female, 4 weeks old) were administrated three times at 2-week intervals, and the fourth administration was intravenously administered with half the dose of 25 μg.
One week later, lymphocytes were separated from the spleen, and myeloma cells P3x63-Ag. After mixing with 8, cell fusion was performed using polyethylene glycol (PEG4000, manufactured by Merck).
Hybridomas were selected using HAT selection medium, and after 1 week, the hybridomas producing the desired antibody were screened using the binding activity to synthetic TAT as an index. That is, each synthetic TAT was diluted to 0.2 μg / mL with 0.05 M carbonate buffer (pH 9.5), and 50 μL / well was added to an immunoplate (Maxisorp, manufactured by NUNC). After reaction at 4 ° C. and Over Night, the plate was washed 3 times with PBS containing 0.05% Tween-20, and 100 μL of PBS containing 1.0% BSA was added to each well for blocking.
Next, 50 μL of culture supernatant was added to each well and reacted at 37 ° C. for 1 hour.
The cells were washed 3 times with PBS containing Tween-20. A peroxidase-labeled anti-mouse immunoglobulin antibody (manufactured by Dako) was diluted 1000 times with PBS containing 0.05% Tween-20, and 50 μL was added to each well.
After reacting at 37 ° C. for 1 hour, the plate was similarly washed 5 times, and 50 μL of an o-phenylenediamine solution (manufactured by Wako Pure Chemical Industries, Ltd.) was added to each well. After reacting at room temperature for 5 to 10 minutes, the reaction was stopped with a 2N sulfuric acid solution.
Plate spectrophotometer (EL312e, manufactured by BIO-TEK INSTRUMENTS)
Absorbance was measured at 492 nm. Cells producing an antibody having a good reaction with synthetic TAT were selected and cloned by the limiting dilution method. Ten days later, screening was performed to obtain a hybridoma that produces an antibody that reacts with the synthetic TAT.
実施例３ 抗トロンビン抗体の調製
実施例２と同様の方法で免疫抗原をトロンビンとして、抗トロンビン抗体を得た。トロンビンに対して特異的に反応する抗体を選択し、このうちの１クローンを抗トロンビン抗体（Ｔ−１）として使用した。
Example 3 Preparation of antithrombin antibody In the same manner as in Example 2, antithrombin antibody was obtained by using the immunogen as thrombin. An antibody that specifically reacts with thrombin was selected, and one clone was used as an antithrombin antibody (T-1).
実施例４ 間接阻害ＥＬＩＳＡによる抗体特異性の評価
間接阻害ＥＬＩＳＡ法によって、各抗体の反応性の評価を行った。間接阻害ＥＬＩＳＡ法による反応系の模式図を図２に示す。
評価しようとする０．０４〜０．４μｇ／ｍＬの濃度のＴＡＴを認識する抗体（抗ＴＡＴ抗体）候補を阻害抗原（プロトロンビン（エンザイムリサーチ社製）、トロンビン、アンチトロンビン、合成ＴＡＴ）と混合し、インキュベートした。一部阻害された該抗体候補を一次抗体として、９６ウェルプレートに固相化した合成ＴＡＴと結合させた。さらにペルオキシダーゼ標識抗マウスイムノグロブリン抗体（Ｄａｋｏ社製）を二次抗体として結合させ、発色基質を添加し吸光度を測定した。また、発色の変化率から、抗体の残存率を計算した。
特定の抗体（ＴＡＴ−５）について、各阻害抗原を用いた時の吸光度を表１に、吸光度から計算された抗体の残存率を表２に示した。
例えば、ＴＡＴの阻害抗原濃度が１０μｇ／ｍＬの時の残存率は、２８５／１０６６×１００＝２６．７（％）となる。各抗体の各抗原濃度について残存率を算出した。なお、表中において、Ｐｒｏ−Ｔはプロトロンビンを、Ｔはトロンビンを、ＡＴはアンチトロンビンを示す。
Example 4 Evaluation of antibody specificity by indirect inhibition ELISA The reactivity of each antibody was evaluated by the indirect inhibition ELISA method. A schematic diagram of the reaction system by the indirect inhibition ELISA method is shown in FIG.
An antibody (anti-TAT antibody) candidate that recognizes TAT at a concentration of 0.04 to 0.4 μg / mL to be evaluated is mixed with an inhibitory antigen (prothrombin (manufactured by Enzyme Research), thrombin, antithrombin, synthetic TAT). , Incubated. The partially blocked antibody candidate was used as a primary antibody to bind to synthetic TAT immobilized on a 96-well plate. Further, a peroxidase-labeled anti-mouse immunoglobulin antibody (manufactured by Dako) was bound as a secondary antibody, a chromogenic substrate was added, and the absorbance was measured. In addition, the residual rate of the antibody was calculated from the rate of change in color development.
Regarding the specific antibody (TAT-5), the absorbance when each inhibitory antigen was used is shown in Table 1, and the antibody residual rate calculated from the absorbance is shown in Table 2.
For example, when the inhibitory antigen concentration of TAT is 10 μg / mL, the residual rate is 285/1066 × 100 = 26.7 (%). The residual rate was calculated for each antigen concentration of each antibody. In the table, Pro-T is prothrombin, T is thrombin, and AT is antithrombin.
また、アンチトロンビン ５０ μｇ／ｍＬで阻害をかけた時の残存率と同等の阻害率となるＴＡＴ抗原量を算出し比較することで、アンチトロンビンに対するＴＡＴの反応性差（倍率）を求めた。この違いが大きければ、アンチトロンビンと比較しＴＡＴに対する特異性が強いこと意味する。計算はＴＡＴの阻害曲線（阻害抗原添加濃度対数-残存率％）を描き、スプライン関数を用いておこなった。
例えば、ＴＡＴ−５の場合、アンチトロンビン ５０ μｇ／ｍＬの残存率は、７４．０％でありその残存率と同様となるＴＡＴ抗原量は１．１４４ μｇ／ｍＬである。すなわち、反応性の差は５０／１．１４４＝４４倍となる。（図３）。
In addition, the reactivity difference (magnification) of TAT with respect to antithrombin was calculated by calculating and comparing the amount of TAT antigen that gives an inhibition rate equivalent to the residual rate when the inhibition was applied with antithrombin at 50 μg / mL. If this difference is large, it means that the specificity for TAT is higher than that of antithrombin. The calculation was performed using a spline function by drawing an inhibition curve of TAT (inhibitory antigen addition concentration logarithm-residual rate%).
For example, in the case of TAT-5, the residual rate of antithrombin 50 μg / mL is 74.0%, and the amount of TAT antigen that is similar to the residual rate is 1.144 μg / mL. That is, the difference in reactivity is 50 / 1.144 = 44 times. (Figure 3).
その他、抗体クローン２７種類について上記倍率の計算を行った。添加ＴＡＴとアンチトロンビンの量の違い（倍率）が１００倍以上となる抗体は１３種類、１０００倍以上となる抗体は7種類、１００００倍以上となる抗体は２種類存在した。５種類の抗体について、表３に示す。 In addition, the above magnification was calculated for 27 kinds of antibody clones. There were 13 kinds of antibodies having 100 times or more difference in the amount of added TAT and antithrombin, 7 kinds of antibodies having 1000 times or more, and 2 kinds of antibodies having 10,000 times or more. Table 3 shows the five types of antibodies.
実施例５ アンチトロンビン製剤添加血漿における効果
試薬１：１００ｍＭ Ｂｉｓ−ｔｒｉｓ（同仁化学社製） ｐＨ６．２、７００ｍＭ ＮａＣｌ（和光純薬社製）、０．０５％ エマルゲン１５０（花王社製）、０．２０％ アルギン酸ナトリウム（和光純薬社製）、０．１５％ ＢＳＡ（シグマアルドリッチ社製）を試薬１として用いた。
試薬２：ＴＡＴに対する反応性がアンチトロンビンに対する反応性の１００倍以上であるＴＡＴのアンチトロンビン側に反応するマウスモノクローナル抗体（ＴＡＴ−１）を吸着したポリスチレンラテックス粒子と、抗トロンビンマウスモノクローナル抗体を吸着したポリスチレンラテックス粒子を、各抗体感作粒子が７００ｎｍにおける吸光度が１．０になるように０．０５％アジ化ナトリウム溶液で希釈し混合したもの（試薬２Ａ）、もしくはＴＡＴに対する反応性がアンチトロンビンに対する反応性の１００倍以上であるＴＡＴのアンチトロンビン側に反応するマウスモノクローナル抗体を吸着したポリスチレンラテックス粒子のみを７００ｎｍにおける吸光度が１．０になるように０．０５％アジ化ナトリウム溶液で希釈し混合したもの（試薬２Ｂ）をそれぞれ試薬２として用いた。
サンプル：アンチトロンビン製剤としてノイアート静注用５００単位（日本血液製剤機構社製）を０．３３または０．６６単位／ｍＬになるように添加した正常ヒトプール血漿またはアンチトロンビン製剤未添加の正常ヒトプール血漿をそれぞれ測定した。
測定機器：ＳＴＡＣＩＡ（ＬＳＩメディエンス社製）
パラメータ：サンプル量１２μＬ、試薬１ ９０μＬ、試薬２ ９０μＬ、主波長７００ｎｍに設定し、試薬２添加後の１分当たりの吸光度変化量をΔＡｂｓ／ｍｉｎとして測定した。
Example 5 Effect on plasma added with antithrombin preparation Reagent 1: 100 mM Bis-tris (manufactured by Dojindo Chemical Co., Ltd.) pH 6.2, 700 mM NaCl (manufactured by Wako Pure Chemical Industries, Ltd.), 0.05% Emulgen 150 (manufactured by Kao Corporation), 0 20% sodium alginate (manufactured by Wako Pure Chemical Industries, Ltd.) and 0.15% BSA (manufactured by Sigma-Aldrich) were used as reagent 1.
Reagent 2: Adhesion of polystyrene latex particles adsorbed with mouse monoclonal antibody (TAT-1) that reacts with the antithrombin side of TAT, which has 100 times or more reactivity with antithrombin, with antithrombin mouse monoclonal antibody. Polystyrene latex particles prepared by mixing and diluting each antibody-sensitized particle with 0.05% sodium azide solution so that the absorbance at 700 nm is 1.0 (reagent 2A), or the reactivity to TAT is antithrombin. The polystyrene latex particles adsorbed with the mouse monoclonal antibody that reacts with the antithrombin side of TAT, which has a reactivity 100 times higher than that of TAT, are diluted with 0.05% sodium azide solution so that the absorbance at 700 nm is 1.0. Mixed It was used as the reagent 2 (reagent 2B), respectively.
Sample: Normal human pool plasma to which 500 units of Neuart intravenous injection (manufactured by Japan Blood Products Organization) was added as an antithrombin preparation to 0.33 or 0.66 units / mL or normal human pool plasma to which no antithrombin preparation was added. Was measured respectively.
Measuring equipment: STACIA (manufactured by LSI Medience)
Parameters: sample amount 12 μL, reagent 1 90 μL, reagent 2 90 μL, main wavelength 700 nm, and change in absorbance per minute after addition of reagent 2 was measured as ΔAbs / min.
結果・考察
結果を表４および図４に示す。試薬２Ａのみの結果ではアンチトロンビン製剤の濃度依存的な凝集が生じたが、試薬２Ｂの結果を差し引くことでその影響が大幅に軽減され、アンチトロンビン製剤の影響を受けることなくＴＡＴを定量できることがわかった。
Results / Discussion The results are shown in Table 4 and FIG. Concentration-dependent aggregation of the antithrombin preparation occurred in the result of the reagent 2A alone, but the effect was significantly reduced by subtracting the result of the reagent 2B, and TAT can be quantified without being affected by the antithrombin preparation. all right.
実施例６ 非特異凝集を生じる実検体における効果
試薬１：実施例５と同様
試薬２：実施例５の試薬２Ａ、２Ｂを用いた。
対照法：Ｂ／Ｆ分離を行うステイシアＣＬＥＩＡ ＴＡＴ（ＬＳＩメディエンス社製）を対照法として測定した。
サンプル：非特異が反応が認められたことから、アンチトロンビン製剤が投与されたと推定されるクエン酸Ｎａ血漿２検体（非特異１、２）と通常のクエン酸Ｎａ血漿２検体（通常１、２）を用いた。
標準品：ＴＡＴキャリブレーター（ＬＳＩメディエンス）により値付けを行った。
測定機器・パラメータ：実施例５と同様に行った。試薬２Ａのみの結果から算出したΔＡｂｓ／ｍｉｎと（試薬２Ａ−試薬２Ｂ）の結果から算出したΔＡｂｓ／ｍｉｎそれぞれの結果からＴＡＴ濃度を算出した。
Example 6 Effect on actual sample causing non-specific aggregation Reagent 1: Same as Example 5 Reagent 2: Reagents 2A and 2B of Example 5 were used.
Control method: Stacia CLEIA TAT (manufactured by LSI Medience) for B / F separation was measured as a control method.
Sample: 2 samples of Na citrate plasma presumed to have been administered with antithrombin formulation (non-specific 1, 2) and 2 samples of normal Na citrate plasma (usually 1, 2 because non-specific reaction was observed) ) Was used.
Standard product: TAT calibrator (LSI Medience) was used for pricing.
Measurement equipment / parameters: The same as in Example 5. The TAT concentration was calculated from the results of ΔAbs / min calculated from the results of only reagent 2A and ΔAbs / min calculated from the results of (reagent 2A-reagent 2B).
結果・考察
結果を図５に示す。非特異１、２について試薬２Ａのみの結果では対照法と大きな乖離を生じたが、試薬２Ｂの結果を差し引くことで対照法と近い測定値となった。また、非特異反応のない検体については差し引きの有無で測定値に変化はなく対照法と測定値が一致していた。したがって、本発明の方法により、簡便にアンチトロンビン製剤の影響を受け
ることなくＴＡＴを定量できることがわかった。
Results / Discussion Results are shown in FIG. With respect to non-specific 1 and 2, the reagent 2A alone resulted in a large difference from the control method, but by subtracting the result of the reagent 2B, the measured value was close to that of the control method. In addition, for the sample with no nonspecific reaction, the measured value did not change with or without the subtraction, and the measured value was in agreement with the control method. Therefore, it was found that the method of the present invention can easily quantify TAT without being affected by the antithrombin preparation.
Claims (7)
ラテックス粒子に結合した第１抗ＴＡＴ抗体を含む第１の試薬、および、それぞれラテックス粒子に結合した第１抗ＴＡＴ抗体および第２抗ＴＡＴ抗体を含む第２の試薬のそれぞれに試料を反応させる工程、並びに、
試料を第２の試薬と反応させたときに検出される値から試料を第１の試薬と反応させたときに検出される値を差し引くことによりＴＡＴの値を測定する工程、
を含むことを特徴とする、ＴＡＴ測定方法。 A method for measuring a thrombin-antithrombin complex (TAT) in a blood sample from a subject administered with an antithrombin preparation by a latex agglutination method, comprising:
Reacting a sample with each of a first reagent containing a first anti-TAT antibody bound to latex particles and a second reagent containing a first anti-TAT antibody and a second anti-TAT antibody bound to latex particles, respectively , And
Measuring the value of TAT by subtracting the value detected when the sample is reacted with the first reagent from the value detected when the sample is reacted with the second reagent,
A method for measuring TAT, comprising:
試料を、ラテックス粒子に結合した第１抗ＴＡＴ抗体を含む第１の試薬、次いで、ラテックス粒子に結合した第２抗ＴＡＴ抗体を含む第２の試薬に反応させる工程、並びに、
試料を第２の試薬と反応させたときに検出される値から試料を第１の試薬と反応させたときに検出される値を差し引くことによりＴＡＴの値を測定する工程、
を含むことを特徴とする、ＴＡＴ測定方法。 A method for measuring a thrombin-antithrombin complex (TAT) in a blood sample from a subject administered with an antithrombin preparation by a latex agglutination method, comprising:
Reacting a sample with a first reagent comprising a first anti-TAT antibody bound to latex particles, and then a second reagent comprising a second anti-TAT antibody bound to latex particles, and
Measuring the value of TAT by subtracting the value detected when the sample is reacted with the first reagent from the value detected when the sample is reacted with the second reagent,
A method for measuring TAT, comprising:
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