JP5888670B2 - Culture substrate for inducing osteoblast differentiation, method for inducing osteoblast differentiation, and method for producing osteoblast - Google Patents
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Landscapes
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Description
本発明は、骨芽細胞分化誘導用培養基材、骨芽細胞分化誘導方法、骨芽細胞製造方法及び前記製造方法によって得られた骨芽細胞に関する。本発明によれば、間葉系幹細胞から骨芽細胞を誘導することができる。 The present invention relates to a culture substrate for inducing osteoblast differentiation, an osteoblast differentiation inducing method, an osteoblast production method, and an osteoblast obtained by the production method. According to the present invention, osteoblasts can be induced from mesenchymal stem cells.
骨芽細胞は、骨組織において骨形成を行う細胞であり、タンパク質等を産生及び分泌して、骨基質をつくる。具体的には、骨芽細胞は、生体内でコラーゲンなどの基質タンパク質を分泌し、そこにMatrix Vesicleと呼ばれる基質小胞を作製する。そして、この基質小胞の周囲にリン酸カルシウムが沈着して、骨の基質が完成し、骨芽細胞は、最終的には、この基質の中で骨細胞となる。 Osteoblasts are cells that form bone in bone tissue and produce and secrete proteins and the like to create a bone matrix. Specifically, osteoblasts secrete matrix proteins such as collagen in vivo and produce matrix vesicles called Matrix Vesicles there. Then, calcium phosphate is deposited around the matrix vesicles to complete the bone matrix, and the osteoblasts eventually become bone cells in the matrix.
この骨芽細胞は、間葉系幹細胞から分化するものであり、非特許文献1には、間葉系幹細胞にデキサメタゾン、β−グリセロリン酸、及びアスコルビン酸を作用させることにより分化誘導できることが開示されている(非特許文献1)。また、特許文献1は、(+)−トランス−4−(1−アミノエチル)−1−(4−ピリジルカルバモイル)シクロヘキサン等のRhoキナーゼ阻害活性を有する化合物と骨誘導因子を併用することにより、間葉系細胞が骨芽細胞に分化誘導されることを開示している。更に、特許文献2には、カルシウム拮抗薬が、間葉系細胞を骨芽細胞に分化誘導することが開示されている(特許文献2)。 This osteoblast is differentiated from mesenchymal stem cells, and Non-Patent Document 1 discloses that differentiation can be induced by allowing dexamethasone, β-glycerophosphate, and ascorbic acid to act on mesenchymal stem cells. (Non-Patent Document 1). Patent Document 1 discloses that by using a compound having a Rho kinase inhibitory activity such as (+)-trans-4- (1-aminoethyl) -1- (4-pyridylcarbamoyl) cyclohexane and an osteoinductive factor in combination, It discloses that mesenchymal cells are induced to differentiate into osteoblasts. Furthermore, Patent Document 2 discloses that a calcium antagonist induces differentiation of mesenchymal cells into osteoblasts (Patent Document 2).
しかしながら、前記の化合物による骨芽細胞の分化誘導活性、特に初期分化誘導活性は、十分なものではなかった。また、デキサメタゾンや(+)−トランス−4−(1−アミノエチル)−1−(4−ピリジルカルバモイル)シクロヘキサンは、本来生体内に存在するものではなく、得られた骨芽細胞へのこれらの合成された化合物の影響については、十分には調べられていなかった。更に、間葉系幹細胞を骨芽細胞に分化する際に、10%程度のウシの胎児血清などを用いて培養を行っており、ウシ血清中にプリオンなどの人獣共通感染症の病原体が存在する可能性も考えられた。 However, the osteoblast differentiation-inducing activity, particularly the early differentiation-inducing activity by the above-mentioned compounds has not been sufficient. Further, dexamethasone and (+)-trans-4- (1-aminoethyl) -1- (4-pyridylcarbamoyl) cyclohexane are not originally present in the living body, and these are not present in the obtained osteoblasts. The effects of the synthesized compounds have not been fully investigated. Furthermore, when differentiating mesenchymal stem cells into osteoblasts, culture is performed using about 10% bovine fetal serum, etc., and pathogens of zoonotic diseases such as prions are present in bovine serum. The possibility of doing was also considered.
本発明の目的は、従来法と比較して、効率的且つ強力に骨芽細胞を分化誘導する方法を提供することであり、特には、初期分化誘導が可能な方法を提供することである。また、低濃度の血清存在下、又は血清非存在下において、間葉系幹細胞を骨芽細胞に分化させることのできる骨芽細胞分化誘導方法、又は骨芽細胞製造方法を提供することである。更に、前記製造方法によって製造された骨芽細胞を提供することである。 An object of the present invention is to provide a method for inducing differentiation of osteoblasts more efficiently and powerfully than the conventional method, and in particular, to provide a method capable of inducing initial differentiation. Another object of the present invention is to provide an osteoblast differentiation induction method or an osteoblast production method capable of differentiating mesenchymal stem cells into osteoblasts in the presence or absence of serum at a low concentration. Furthermore, it is providing the osteoblast manufactured by the said manufacturing method.
本発明者は、効率的且つ強力に間葉系幹細胞を骨芽細胞に分化させることのできる骨芽細胞分化誘導方法、又は骨芽細胞製造方法について、鋭意研究した結果、驚くべきことに、魚類由来コラーゲンで被覆された細胞培養基材と、間葉系幹細胞とを接触させることにより、間葉系幹細胞を骨芽細胞に分化させることができることを見出した。
本発明は、こうした知見に基づくものである。
As a result of earnest research on an osteoblast differentiation induction method or an osteoblast production method capable of efficiently and powerfully differentiating mesenchymal stem cells into osteoblasts, the present inventors have surprisingly found that fish It was found that mesenchymal stem cells can be differentiated into osteoblasts by contacting the cell culture substrate coated with the derived collagen with mesenchymal stem cells.
The present invention is based on these findings.
すなわち、本発明は、
[1]魚類由来コラーゲンが被覆された、間葉系幹細胞との接触面を有する、骨芽細胞分化誘導用培養基材、
[2]前記魚類由来コラーゲンが、テラピア鱗由来のコラーゲンである、[1]に記載の骨芽細胞分化誘導用培養基材、
[3]前記間葉系幹細胞が、骨髄間葉系幹細胞、脂肪組織由来間葉系幹細胞、滑膜組織由来間葉系幹細胞、歯髄由来間葉系幹細胞、歯胚由来間葉系幹細胞、耳介軟骨膜由来間葉系幹細胞、末梢血由来間葉系幹細胞、臍帯血由来間葉系幹細胞、靭帯由来間葉系幹細胞、腱由来間葉系幹細胞、ES細胞由来間葉系幹細胞、又はiPS細胞由来間葉系幹細胞である、[1]又は[2]に記載の骨芽細胞分化誘導用培養基材、
[4]前記間葉系幹細胞が、ヒト由来である、[1]〜[3]のいずれかに記載の骨芽細胞分化誘導用培養基材、
[5]前記被覆された第1の魚類由来コラーゲン以外の第2のコラーゲン少なくとも1つが被覆された間葉系幹細胞との接触面を有する、[1]〜[4]のいずれかに記載の骨芽細胞分化誘導用培養基材、
[6]前記第2のコラーゲンが、哺乳類由来コラーゲン、鳥類由来コラーゲン、爬虫類由来コラーゲン、両生類由来コラーゲン、魚類由来コラーゲン、無脊椎動物由来コラーゲン及びそれらの組み合わせからなる群から選択されるコラーゲンである、[1]〜[5]のいずれかに記載の、骨芽細胞分化誘導用培養基材、
[7][1]〜[6]のいずれかに記載の骨芽細胞分化誘導用培養基材を含む、骨芽細胞分化誘導キット、
[8]骨芽細胞分化誘導因子を更に含む、[7]に記載の骨芽細胞分化誘導キット、
[9]魚類由来コラーゲンで被覆された細胞培養基材と、間葉系幹細胞とを接触させる魚類由来コラーゲン接触工程を含む、骨芽細胞分化誘導方法、
[10]前記間葉系幹細胞が、骨髄間葉系幹細胞、脂肪組織由来間葉系幹細胞、滑膜組織由来間葉系幹細胞、歯髄由来間葉系幹細胞、歯胚由来間葉系幹細胞、耳介軟骨膜由来間葉系幹細胞、末梢血由来間葉系幹細胞、臍帯血由来間葉系幹細胞、靭帯由来間葉系幹細胞、腱由来間葉系幹細胞、ES細胞由来間葉系幹細胞、又はiPS細胞由来間葉系幹細胞である、[9]に記載の骨芽細胞分化誘導方法、
[11]前記間葉系幹細胞が、ヒト由来である、[9]又は[10]に記載の骨芽細胞分化誘導方法、
[12]前記被覆された第1の魚類由来コラーゲン以外の第2のコラーゲン少なくとも1つが被覆された細胞培養基材と、間葉系幹細胞とを接触させる第2コラーゲン接触工程を更に含む、[9]〜[11]のいずれかに記載の骨芽細胞分化誘導方法、
[13]前記第2のコラーゲンが、哺乳類由来コラーゲン、鳥類由来コラーゲン、爬虫類由来コラーゲン、両生類由来コラーゲン、魚類由来コラーゲン、無脊椎動物由来コラーゲン、及びそれらの組み合わせからなる群から選択されるコラーゲンである、[9]〜[12]のいずれかに記載の骨芽細胞分化誘導方法、
[14]前記間葉系幹細胞を骨芽細胞分化誘導因子に接触させる骨芽細胞分化誘導因子接触工程を更に含む、[9]〜[13]のいずれかに記載の骨芽細胞分化誘導方法、
[15]前記第1の魚類由来コラーゲンが、テラピア鱗由来のコラーゲンである、[9]〜[14]のいずれかに記載の骨芽細胞分化誘導方法、
[16]前記接触工程が、5%以下の血清の存在下、又は血清の非存在下で行われる、[9]〜[15]のいずれかに記載の骨芽細胞分化誘導方法、
[17]魚類由来コラーゲンで被覆された細胞培養基材によって、間葉系幹細胞を培養する魚類由来コラーゲン培養工程を含む、骨芽細胞製造方法、
[18]前記間葉系幹細胞が、骨髄間葉系幹細胞、脂肪組織由来間葉系幹細胞、滑膜組織由来間葉系幹細胞、歯髄由来間葉系幹細胞、歯胚由来間葉系幹細胞、耳介軟骨膜由来間葉系幹細胞、末梢血由来間葉系幹細胞、臍帯血由来間葉系幹細胞、靭帯由来間葉系幹細胞、腱由来間葉系幹細胞、ES細胞由来間葉系幹細胞、又はiPS細胞由来間葉系幹細胞である、[17]に記載の骨芽細胞製造方法、
[19]前記間葉系幹細胞が、ヒト由来である、[17]又は[18]に記載の骨芽細胞製造方法、
[20]前記細胞培養基材が、前記被覆された第1の魚類由来コラーゲン以外の第2のコラーゲン少なくとも1つが被覆された間葉系幹細胞との接触面を有する、[17]〜[19]のいずれかに記載の骨芽細胞製造方法、
[21]前記第2のコラーゲンが、哺乳類由来コラーゲン、鳥類由来コラーゲン、爬虫類由来コラーゲン、両生類由来コラーゲン、魚類由来コラーゲン、無脊椎動物由来コラーゲン、及びそれらの組み合わせからなる群から選択されるコラーゲンである、[17]〜[20]のいずれかに記載の骨芽細胞製造方法、
[22]前記間葉系幹細胞の培養培地が、5%以下の血清を含む培地又は無血清培地である、[17]〜[21]のいずれかに記載の骨芽細胞製造方法、
[23]前記間葉系幹細胞の培養培地が、骨芽細胞分化誘導因子を含む培地である、[17]〜[20]のいずれかに記載の骨芽細胞製造方法、
[24]前記魚類由来コラーゲンが、テラピア鱗由来のコラーゲンである、[17]〜[23]のいずれかに記載の骨芽細胞製造方法、
[25][17]〜[24]のいずれかに記載の骨芽細胞製造方法により得られる骨芽細胞、
[26]骨芽細胞分化誘導のための、魚類由来コラーゲンの細胞培養基材への使用、
[27]骨芽細胞の製造のための、魚類由来コラーゲンの細胞培養基材への使用、
に関する。
That is, the present invention
[1] A culture substrate for inducing osteoblast differentiation, having a contact surface with mesenchymal stem cells coated with fish-derived collagen,
[2] The culture substrate for osteoblast differentiation induction according to [1], wherein the fish-derived collagen is collagen derived from tilapia scales,
[3] The mesenchymal stem cells are bone marrow mesenchymal stem cells, adipose tissue-derived mesenchymal stem cells, synovial tissue-derived mesenchymal stem cells, dental pulp-derived mesenchymal stem cells, tooth germ-derived mesenchymal stem cells, auricles Peritoneal membrane-derived mesenchymal stem cell, peripheral blood-derived mesenchymal stem cell, umbilical cord blood-derived mesenchymal stem cell, ligament-derived mesenchymal stem cell, tendon-derived mesenchymal stem cell, ES cell-derived mesenchymal stem cell, or iPS cell-derived The culture substrate for inducing osteoblast differentiation according to [1] or [2], which is a mesenchymal stem cell,
[4] The culture substrate for inducing osteoblast differentiation according to any one of [1] to [3], wherein the mesenchymal stem cells are derived from human,
[5] The bone according to any one of [1] to [4], which has a contact surface with a mesenchymal stem cell coated with at least one second collagen other than the coated first fish-derived collagen. Culture substrate for blast differentiation induction,
[6] The second collagen is a collagen selected from the group consisting of mammal-derived collagen, avian-derived collagen, reptile-derived collagen, amphibian-derived collagen, fish-derived collagen, invertebrate-derived collagen, and combinations thereof. The culture substrate for inducing osteoblast differentiation according to any one of [1] to [5],
[7] An osteoblast differentiation induction kit comprising the osteoblast differentiation induction culture substrate according to any one of [1] to [6],
[8] The osteoblast differentiation inducing kit according to [7], further comprising an osteoblast differentiation inducing factor,
[9] A method for inducing osteoblast differentiation comprising a fish-derived collagen contact step in which a cell culture substrate coated with fish-derived collagen is contacted with a mesenchymal stem cell,
[10] The mesenchymal stem cells are bone marrow mesenchymal stem cells, adipose tissue-derived mesenchymal stem cells, synovial tissue-derived mesenchymal stem cells, dental pulp-derived mesenchymal stem cells, tooth germ-derived mesenchymal stem cells, auricles Peritoneal membrane-derived mesenchymal stem cell, peripheral blood-derived mesenchymal stem cell, umbilical cord blood-derived mesenchymal stem cell, ligament-derived mesenchymal stem cell, tendon-derived mesenchymal stem cell, ES cell-derived mesenchymal stem cell, or iPS cell-derived The osteoblast differentiation induction method according to [9], which is a mesenchymal stem cell,
[11] The osteoblast differentiation inducing method according to [9] or [10], wherein the mesenchymal stem cells are derived from humans.
[12] The method further includes a second collagen contact step in which a cell culture substrate coated with at least one second collagen other than the coated first fish-derived collagen is contacted with a mesenchymal stem cell. ] The osteoblast differentiation inducing method according to any one of [11] to [11],
[13] The second collagen is a collagen selected from the group consisting of mammal-derived collagen, avian-derived collagen, reptile-derived collagen, amphibian-derived collagen, fish-derived collagen, invertebrate-derived collagen, and combinations thereof. [9] The method for inducing differentiation of osteoblasts according to any one of [9] to [12],
[14] The osteoblast differentiation inducing method according to any one of [9] to [13], further comprising an osteoblast differentiation inducing factor contact step of contacting the mesenchymal stem cell with an osteoblast differentiation inducing factor,
[15] The osteoblast differentiation induction method according to any one of [9] to [14], wherein the first fish-derived collagen is tilapia scale-derived collagen,
[16] The osteoblast differentiation inducing method according to any one of [9] to [15], wherein the contact step is performed in the presence of 5% or less of serum or in the absence of serum,
[17] An osteoblast production method comprising a fish-derived collagen culturing step of culturing mesenchymal stem cells with a cell culture substrate coated with fish-derived collagen,
[18] The mesenchymal stem cells are bone marrow mesenchymal stem cells, adipose tissue-derived mesenchymal stem cells, synovial tissue-derived mesenchymal stem cells, dental pulp-derived mesenchymal stem cells, tooth germ-derived mesenchymal stem cells, auricles Peritoneal membrane-derived mesenchymal stem cell, peripheral blood-derived mesenchymal stem cell, umbilical cord blood-derived mesenchymal stem cell, ligament-derived mesenchymal stem cell, tendon-derived mesenchymal stem cell, ES cell-derived mesenchymal stem cell, or iPS cell-derived The osteoblast production method according to [17], which is a mesenchymal stem cell,
[19] The osteoblast production method according to [17] or [18], wherein the mesenchymal stem cell is derived from a human.
[20] The cell culture substrate has a contact surface with mesenchymal stem cells coated with at least one second collagen other than the coated first fish-derived collagen. [17] to [19] An osteoblast production method according to any one of
[21] The second collagen is a collagen selected from the group consisting of mammal-derived collagen, avian-derived collagen, reptile-derived collagen, amphibian-derived collagen, fish-derived collagen, invertebrate-derived collagen, and combinations thereof. [17] to [20], the osteoblast production method according to any one of
[22] The osteoblast production method according to any one of [17] to [21], wherein the culture medium of the mesenchymal stem cells is a medium containing 5% or less serum or a serum-free medium,
[23] The method for producing osteoblasts according to any one of [17] to [20], wherein the culture medium for mesenchymal stem cells is a medium containing an osteoblast differentiation factor.
[24] The osteoblast production method according to any one of [17] to [23], wherein the fish-derived collagen is collagen derived from tilapia scales,
[25] Osteoblasts obtained by the osteoblast production method according to any one of [17] to [24],
[26] Use of fish-derived collagen as a cell culture substrate for induction of osteoblast differentiation,
[27] Use of fish-derived collagen as a cell culture substrate for the production of osteoblasts,
About.
本発明の骨芽細胞分化誘導方法、又は骨芽細胞製造方法によれば、効率的且つ強力に間葉系幹細胞を骨芽細胞に分化させることができる。特には、骨芽細胞の初期分化誘導を強力に引き起こすことが可能である。また、低濃度の血清存在下、又は血清非存在下において、間葉系幹細胞を骨芽細胞に分化させることができる。 According to the osteoblast differentiation inducing method or the osteoblast production method of the present invention, mesenchymal stem cells can be efficiently and strongly differentiated into osteoblasts. In particular, it is possible to strongly induce early differentiation induction of osteoblasts. In addition, mesenchymal stem cells can be differentiated into osteoblasts in the presence or absence of serum at a low concentration.
〔1〕骨芽細胞分化誘導用培養基材
本発明の骨芽細胞分化誘導用培養基材は、魚類由来コラーゲンが被覆された、間葉系幹細胞との接触面を有するものである。
(魚類由来コラーゲン)
本発明の骨芽細胞分化誘導用培養基材に用いる魚類由来コラーゲンは、I型コラーゲンであれば、特に限定されるものではない。例えば、魚類の種類としては、テラピア、ゴンズイ、ラベオ・ロヒータ、カトラ、コイ、雷魚、ピラルク、タイ、ヒラメ、サメ、及びサケなどを挙げることができるが、後述の変性温度の観点から、水温の高い川、湖沼、又は海に生息する魚類が好ましい。このような魚類として、具体的には、オレオクロミス属の魚類を挙げる事ができ、特にはテラピアが好ましい。オレオクロミス属の魚類からは、変性温度が比較的高いコラーゲンを取得でき、例えば日本や中国で食用として養殖されているナイルテラピア(Oreochromis niloticus)は入手が容易であり、大量のコラーゲンを取得することができる。
[1] Culture substrate for inducing osteoblast differentiation The culture substrate for inducing osteoblast differentiation of the present invention has a contact surface with mesenchymal stem cells coated with fish-derived collagen.
(Fish-derived collagen)
The fish-derived collagen used for the culture substrate for inducing osteoblast differentiation of the present invention is not particularly limited as long as it is type I collagen. For example, the types of fish include tilapia, gonzui, rabeo rojita, katra, carp, thunderfish, piraluk, thailand, flounder, shark, and salmon. Fish that live in high rivers, lakes, or seas are preferred. Specific examples of such fish include fish of the genus Oreochromis, with tilapia being particularly preferred. Collagen with a relatively high denaturation temperature can be obtained from fish of the genus Oreochromis. For example, Nile tilapia (Oreochromis niloticus), which is cultivated for food in Japan and China, is easily available, and a large amount of collagen can be obtained. it can.
魚類由来コラーゲンを取得する魚の部位も、限定されるものではない。例えば、鱗、皮、骨、軟骨、ひれ、及び臓器等を挙げることができるが、鱗が好ましい。鱗は、魚臭の原因となる脂質が少ないからである。また、魚類の鱗由来のコラーゲンは、他のコラーゲンと比較して線維化しやすく、線維形成速度が著しく速いからである。 The part of the fish from which fish-derived collagen is obtained is not limited. For example, scales, skin, bones, cartilage, fins, organs and the like can be mentioned, but scales are preferred. This is because the scale has few lipids that cause fishy odor. Moreover, collagen derived from fish scales is more likely to be fibrillated than other collagens, and the fiber formation rate is significantly faster.
魚類のI型コラーゲンは、分子量約10万のポリペプチド鎖が3本集まって「3重らせん構造」を作っており、分子量は約30万である。長さ300nmで、直径1.5nmの1本の硬い棒のような形態をしている。魚類のI型コラーゲンが特異な「3重らせん構造」を作るのは、ポリペプチド鎖のアミノ酸の配列が関与している。ポリペプチド鎖は3個のアミノ酸が並んだユニット「G−X−Y」のつながりからできている。Gはグリシンを表し、Xはプロリン、そしてYはヒドロキシプロリンであることが多い。ヒドロキシプロリンは、通常のタンパク質に含まれておらず、コラーゲンに特有のアミノ酸であるが、ヒドロキシプロリンの水酸基と水和水との水素結合によって3重らせん構造が安定すると考えられている。 Fish type I collagen has a “triple helix structure” made up of three polypeptide chains having a molecular weight of about 100,000, and has a molecular weight of about 300,000. It is shaped like one hard bar with a length of 300 nm and a diameter of 1.5 nm. It is the amino acid sequence of the polypeptide chain that forms the unique “triple helix structure” of fish type I collagen. The polypeptide chain is made up of a series of units “GXY” in which three amino acids are arranged. G often represents glycine, X is proline, and Y is often hydroxyproline. Hydroxyproline is not contained in ordinary proteins and is an amino acid unique to collagen, but it is believed that the triple helix structure is stabilized by hydrogen bonding between the hydroxyl group of hydroxyproline and hydrated water.
コラーゲンは、温度が上昇すると3本のポリペプチドからなる「3重らせん構造」が解けて、3本のポリペプチドがばらばらになり、ゼラチンとなる。コラーゲンからゼラチンへの変化を変性と呼び、一度変性が起きると、再び温度を低下させても「3重らせん構造」に戻すことは困難である。コラーゲンの変性温度は、通常そのコラーゲンが由来する生物の棲息温度より、若干高い程度であり、従って、水中に生息している魚類の鱗のコラーゲンの変性温度は、それほど高くない。 When the temperature rises, the “triple helical structure” composed of three polypeptides is dissolved, and the three polypeptides are separated into gelatin. The change from collagen to gelatin is called denaturation. Once denaturation occurs, it is difficult to return to the “triple helical structure” even if the temperature is lowered again. The denaturation temperature of collagen is usually slightly higher than the inhabitant temperature of the organism from which the collagen is derived. Therefore, the denaturation temperature of fish scales inhabiting fish is not so high.
本発明に用いる魚類由来コラーゲンは、その変性温度によって、限定されるものではないが、変性温度の高い魚類由来コラーゲンが好ましく、具体的には20℃以上が好ましく、25℃以上がより好ましく、28℃以上が更に好ましく、30℃以上が最も好ましい。本発明の骨芽細胞分化誘導方法において、魚類由来コラーゲンと間葉系幹細胞とを接触させる温度は、37℃前後のことが多く、「3重らせん構造」が破壊されたゼラチンでは、間葉系幹細胞の骨芽細胞への分化誘導は起こらないと考えられるからである。
しかしながら、変性温度が20℃未満の魚類由来コラーゲンであっても、間葉系幹細胞との接触を20℃未満で行うことにより、コラーゲンの変性を起こさずに、間葉系幹細胞を骨芽細胞へ分化させることができる。
The fish-derived collagen used in the present invention is not limited by its denaturation temperature, but fish-derived collagen having a high denaturation temperature is preferred, specifically 20 ° C or higher, more preferably 25 ° C or higher, and 28 More preferably, it is 30 ° C. or higher. In the osteoblast differentiation inducing method of the present invention, the temperature at which fish-derived collagen and mesenchymal stem cells are brought into contact is often around 37 ° C., and gelatin in which the “triple helix structure” is destroyed is mesenchymal. This is because it is considered that differentiation induction of stem cells into osteoblasts does not occur.
However, even with fish-derived collagen having a denaturation temperature of less than 20 ° C., contact with mesenchymal stem cells at less than 20 ° C. allows the mesenchymal stem cells to become osteoblasts without causing collagen denaturation. Can be differentiated.
本発明に用いるコラーゲンの変性温度は、International Journal of Biological Macromolecules,32,199(2003)に記載の方法に従って、CD分光計(Jasco model 725 spectrometer)を使用してコラーゲン水溶液の温度を段階的に上昇させることによって求める。即ち、コラーゲン水溶液をpH3の希塩酸で希釈し、0.03wt%となるように調整し、光路長1mmの石英セルに入れる。セルの温度を1℃/minで上昇させ、221nmにおける旋光度を0.2℃ごとに測定する。各温度における旋光度を温度に対してプロットすると、旋光度の値がコラーゲン螺旋の値からランダムコイルの値へと急激に変化する変性曲線が得られる。それらの旋光度値の中間値を与える温度、すなわち、螺旋率(Helicity;%)が50%になるときの温度を変性温度とする。 The denaturation temperature of collagen used in the present invention is increased stepwise by using a CD spectrometer (Jasco model 725 spectrometer) according to the method described in International Journal of Biological Macromolecules, 32, 199 (2003). Seek by letting That is, the collagen aqueous solution is diluted with dilute hydrochloric acid having a pH of 3, adjusted to 0.03 wt%, and placed in a quartz cell having an optical path length of 1 mm. The cell temperature is increased at 1 ° C./min, and the optical rotation at 221 nm is measured every 0.2 ° C. When the optical rotation at each temperature is plotted against temperature, a denaturation curve is obtained in which the value of optical rotation changes rapidly from the value of the collagen helix to the value of the random coil. The temperature that gives an intermediate value of the optical rotation values, that is, the temperature at which the helix (%) becomes 50% is defined as the denaturation temperature.
魚類由来コラーゲンの取得方法は、コラーゲンの3重らせん構造が破壊されない方法であれば、特に限定されないが、例えば、前記特許文献3に開示された取得方法によって得ることができる。以下に、代表例として、鱗由来のコラーゲンの製造方法について説明する。 The method for obtaining fish-derived collagen is not particularly limited as long as the triple helix structure of collagen is not destroyed. For example, it can be obtained by the obtaining method disclosed in Patent Document 3. Below, the manufacturing method of the collagen derived from a scale is demonstrated as a typical example.
まず、集めた鱗から魚皮や鰭などの不要物を水洗により取り除く。必要に応じて、メタノール、エタノール、イソプロパノールなどのアルコール類やアセトンなどの親水性有機溶剤、界面活性剤、塩化ナトリウムなどの塩類、水酸化ナトリウムなどのアルカリ溶液などを用いて、鱗表面に付着したコラーゲン以外のたんぱく質や脂質など、臭気の原因とされている物質を鱗から除去してもよい。 First, remove unnecessary items such as fish skin and sea bream from the collected scales with water. If necessary, adhere to the scale surface using alcohols such as methanol, ethanol and isopropanol, hydrophilic organic solvents such as acetone, surfactants, salts such as sodium chloride, alkaline solutions such as sodium hydroxide, etc. Substances that cause odor, such as proteins and lipids other than collagen, may be removed from the scales.
更に、脱灰処理溶液中で、1〜48時間、攪拌羽根を用いて緩やかに攪拌し、鱗に含まれる無機成分(リン酸カルシウム)を除去する。処理溶液は、無機成分を溶解できればよく、塩酸やリン酸などの無機酸、酢酸、クエン酸などの有機酸、エチレンジアミン4酢酸などの水溶液を用いればよいが、汎用的に利用されている塩酸や酢酸が好ましく用いられる。使用量は、特に制限する必要はなく、脱灰終了後の鱗を水洗すれば良い。 Furthermore, in the decalcification treatment solution, the mixture is gently stirred using a stirring blade for 1 to 48 hours to remove the inorganic component (calcium phosphate) contained in the scale. The treatment solution only needs to be able to dissolve inorganic components, and may be an inorganic acid such as hydrochloric acid or phosphoric acid, an organic acid such as acetic acid or citric acid, or an aqueous solution such as ethylenediaminetetraacetic acid. Acetic acid is preferably used. The amount used is not particularly limited, and the scale after decalcification may be washed with water.
このようにして夾雑物を除去した鱗を、プロテアーゼを添加した酸性溶液中で2時間〜72時間、攪拌羽根などを用いて緩やかに攪拌することでコラーゲン分子間の架橋が切断されて可溶化したコラーゲンが抽出される。この抽出工程以降の操作は、コラーゲンの変性を防ぐため、変性温度以下、望ましくは変性温度−5℃以下で行うべきである。 The scales from which contaminants were removed in this manner were solubilized by gradual stirring using an agitating blade or the like in an acidic solution to which protease was added for 2 to 72 hours, thereby breaking the cross-links between collagen molecules. Collagen is extracted. The operation after this extraction step should be performed at a denaturation temperature or lower, preferably at a denaturation temperature of −5 ° C. or lower in order to prevent collagen denaturation.
プロテアーゼの種類は、酸性溶液中で高い活性を有する、ペプシン、プロクターゼ、パパインなどが好ましく用いられる。溶液のpHは、プロテアーゼの活性が高くなる範囲を用いればよく、一般に2〜5程度である。プロテアーゼの使用量は、特に限定する必要はないが、通常は魚鱗の乾燥重量に対して1〜15%程度であり、鱗が均一に攪拌できる程度の液量となるように濃度を決定すれば良い。使用する酸は、特に制限されないが、塩酸や酢酸、クエン酸、リンゴ酸など、生物に対して安全性の高いものから選ぶことが望ましく、特に塩酸や酢酸が好ましく用いられる。このような方法により、コラーゲン分子の両末端に存在する非螺旋領域(テロペプチド)が分解されたコラーゲン(アテロコラーゲン)を抽出することができる。 As the type of protease, pepsin, proctase, papain and the like having high activity in an acidic solution are preferably used. The pH of the solution may be in a range where the protease activity is high, and is generally about 2 to 5. The amount of protease used is not particularly limited, but is usually about 1 to 15% with respect to the dry weight of fish scales, and if the concentration is determined so that the scale can be uniformly stirred. good. The acid to be used is not particularly limited, but is preferably selected from those having high safety for living organisms such as hydrochloric acid, acetic acid, citric acid and malic acid, and hydrochloric acid and acetic acid are particularly preferably used. By such a method, collagen (atelocollagen) in which non-helical regions (telopeptides) present at both ends of the collagen molecule are decomposed can be extracted.
このようにして可溶化したコラーゲンは、遠心分離、濾過などによって可溶化していない魚鱗残渣と分離する。魚鱗残渣は、プロテアーゼを添加した酸性溶液中で処理することで、再度、可溶化したコラーゲンを抽出することができるため、2〜4回程度繰り返して収率を高めてもよい。 Collagen solubilized in this way is separated from unscaled fish scale residue by centrifugation, filtration or the like. The fish scale residue can be extracted again by solubilizing collagen by treating it in an acidic solution to which a protease is added. Therefore, the yield may be increased by repeating it about 2 to 4 times.
このようにして得られたコラーゲン溶液には、プロテアーゼやコラーゲン以外のたんぱく質、ゼラチン(変性コラーゲン)などを含むため、必要に応じて精製する。精製方法について述べると、可溶化したコラーゲン溶液に、塩化ナトリウムなどの塩類を加え、塩濃度を上昇させることで、コラーゲンを析出させる。例えば、可溶化したコラーゲン水溶液中に塩化ナトリウムを終濃度1Mになるように添加し、5分〜24時間程度静置することで、コラーゲンが析出する。 The collagen solution thus obtained contains a protein other than protease, collagen, gelatin (denatured collagen) and the like, and thus is purified as necessary. As for the purification method, collagen is precipitated by adding a salt such as sodium chloride to the solubilized collagen solution and increasing the salt concentration. For example, sodium chloride is added to a solubilized collagen aqueous solution so as to have a final concentration of 1 M, and the mixture is allowed to stand for about 5 minutes to 24 hours, whereby collagen is precipitated.
水酸化ナトリウムなどを添加して、pHを中性以上にすることでも析出することができる。例えば、pH7〜9程度になるまで水酸化ナトリウム溶液を添加し、5分〜24時間程度静置することで、コラーゲンが析出する。このようなコラーゲンの析出は、溶液が白濁することで容易に確認できる。 Precipitation can also be achieved by adding sodium hydroxide or the like to bring the pH to neutral or higher. For example, a sodium hydroxide solution is added until pH becomes about 7-9, and collagen is deposited by leaving still for about 5 minutes to 24 hours. Such collagen precipitation can be easily confirmed by the cloudiness of the solution.
析出したコラーゲンは遠心分離や濾過など、一般的な固液分離方法により回収し、これを酸性溶液中で緩やかに攪拌して再溶解する。例えば、pH2〜4程度の塩酸溶液中で1〜48時間程度ゆるやかに攪拌すればよい。このようにして、コラーゲンを精製することができ、繰り返すことで更に純度を高めることができる。精製工程で使用した塩類は、透析膜などを用いて純水に対して脱塩することで除去することができる。 The precipitated collagen is collected by a general solid-liquid separation method such as centrifugation or filtration, and this is gently dissolved in an acidic solution and redissolved. For example, it may be gently stirred for about 1 to 48 hours in a hydrochloric acid solution having a pH of about 2 to 4. In this way, collagen can be purified, and the purity can be further increased by repetition. The salts used in the purification step can be removed by desalting against pure water using a dialysis membrane or the like.
細胞を培養する際、細菌などが共存することは重大な問題となるため、得られたコラーゲン溶液は、ろ過滅菌などコラーゲンの構造を壊さない方法で無菌化して用いることが望ましい。 Since coexistence of bacteria and the like becomes a serious problem when cells are cultured, the obtained collagen solution is preferably used after being sterilized by a method that does not destroy the structure of collagen such as filtration sterilization.
(細胞培養基材)
前記魚類由来コラーゲンを被覆する細胞培養基材は、通常細胞培養用に使用される基材であれば、限定されることなく使用することが可能である。材質としては、ガラス、多孔質体(例えば、ポリカーボネート)、又はプラスチック(例えばポリスチレン、又はポリプロピレン)の基材を使用することができ、形状としては、フラスコ、シャーレ、マルチカルチャープレート(例えば6ウェルマルチカルチャープレート、12ウェルマルチカルチャープレートなど)、又はビーズなどの形状の基材を使用することができる。但し、コラーゲン溶液が親水性であるため、親水性の材質基材あるいは親水化処理を施した表面を有する基材が好ましい。
(Cell culture substrate)
The cell culture substrate that coats the fish-derived collagen can be used without limitation as long as it is a substrate that is usually used for cell culture. As a material, a substrate of glass, a porous body (for example, polycarbonate), or plastic (for example, polystyrene or polypropylene) can be used, and as a shape, a flask, a petri dish, a multi-culture plate (for example, a 6-well multi-plate) A substrate in the form of a culture plate, a 12-well multi-culture plate, or the like) or a bead can be used. However, since the collagen solution is hydrophilic, a hydrophilic material substrate or a substrate having a hydrophilized surface is preferable.
(間葉系幹細胞との接触面)
間葉系幹細胞との接触面は、細胞培養基材の中で魚類由来コラーゲンが被覆される部分である。例えば、フラスコの細胞培養面、シャーレの細胞培養面、マルチカルチャープレートのウェルの底面、ビーズの表面、又は多孔質体の表面などを挙げることができる。これらの部分を、魚類由来コラーゲンを用いて被覆し、間葉系幹細胞との接触面として用いる。
(Contact surface with mesenchymal stem cells)
The contact surface with the mesenchymal stem cells is a portion of the cell culture substrate that is coated with fish-derived collagen. Examples thereof include a cell culture surface of a flask, a cell culture surface of a petri dish, a bottom surface of a well of a multiculture plate, a bead surface, or a porous body surface. These parts are coated with fish-derived collagen and used as a contact surface with mesenchymal stem cells.
(細胞培養基材へのコラーゲンの被覆)
前記細胞培養基材への魚類コラーゲンの被覆は、常法に従って行うことができる。
コラーゲンを溶解する溶液のpHは、コラーゲンの等電点以下であるpH2〜5が好ましい。溶液の酸源は特に制限されないが、塩酸、酢酸、クエン酸、又はリンゴ酸など、生物に対して安全性の高いものから選ぶことが好ましく、乾燥時に気化する塩酸や酢酸がより好ましい。pHについては、低すぎるとコラーゲンの構造を破壊する場合があり、また高すぎると溶解性が低下し、増粘、ゲル化する場合がある。
(Coating of cell culture substrate with collagen)
The cell culture substrate can be coated with fish collagen according to a conventional method.
The pH of the solution for dissolving collagen is preferably 2 to 5 which is lower than the isoelectric point of collagen. The acid source of the solution is not particularly limited, but is preferably selected from those that are highly safe for living organisms, such as hydrochloric acid, acetic acid, citric acid, or malic acid, and more preferably hydrochloric acid or acetic acid that vaporizes during drying. If the pH is too low, the structure of the collagen may be destroyed. If the pH is too high, the solubility may be reduced, resulting in thickening or gelation.
使用するコーティング溶液のコラーゲン濃度は、特に限定されないが、一般的には0.01〜1重量%であり、より好ましくは0.03〜0.3重量%である。濃度が低いと、1回のコーティングで基材を被覆できるコラーゲン量が少なくなる。濃度が高いと、基材を被覆するコラーゲン量を増やすことができるが、厚みが増すだけである。本発明の効果を発揮するのは、表層部分が主であるため、被覆したコラーゲンの厚さが増しても、コラーゲン量に見合った効果を期待できない。 Although the collagen concentration of the coating solution to be used is not particularly limited, it is generally 0.01 to 1% by weight, more preferably 0.03 to 0.3% by weight. When the concentration is low, the amount of collagen that can be coated on the substrate with a single coating decreases. Higher concentrations can increase the amount of collagen that covers the substrate, but only increase the thickness. The effect of the present invention is exerted mainly on the surface layer portion, so even if the thickness of the coated collagen increases, an effect commensurate with the amount of collagen cannot be expected.
コーティング方法としては、酸性溶液を用いて適度な濃度に調整したコラーゲン溶液を、あわ立たないようにディシュなどの細胞培養基材上に流し込み、基材上に均一に塗り広げた後、余剰のコラーゲンを除去する。これを乾燥させることで、基材上に線維化したコラーゲンが均一に被覆される。これは魚鱗由来コラーゲン特有の現象であり、従来から使用されている哺乳類由来のコラーゲンでは達成されない。 As a coating method, a collagen solution adjusted to an appropriate concentration using an acidic solution is poured onto a cell culture substrate such as a dish so that it does not become irritated. Remove. By drying this, the fibrillated collagen is uniformly coated on the substrate. This is a phenomenon peculiar to fish scale-derived collagen, and cannot be achieved by conventionally used collagen derived from mammals.
細菌が混入することは細胞培養時に重大な問題となるため、コラーゲンの被覆作業は、清浄な無菌基材を用い、クリーンルームやクリーンベンチなどの無菌環境で行うことが望ましい。必要に応じて、エチレンオキサイドやUV照射など、コラーゲンの構造を壊さない滅菌工程を加えてもよい。
コーティング及び乾燥時の温度について言えば、変性温度以下、望ましくは変性温度−5℃以下で行う。変性温度を上回る温度で処理すると、基材間結合やコラーゲン線維を形成する前にコラーゲンが変性することにより線維化機能が失われ、コラーゲンとしての特性を発揮できない場合がある。
乾燥時間は湿度などにより異なるが、クリーンベンチ内のような通風下であれば、5分〜2時間程度で乾燥する。乾燥が不十分な場合は、コラーゲンの線維化や基材との接着が不十分となる場合があり、細胞培養液を添加したとき、被膜の再溶解や剥離などにより本発明の効果を十分発揮しない場合がある。十分乾燥し、線維化した状態であれば、数ヶ月保存してもその効果を発揮することができる。保存は変性温度以下の温度、望ましくは冷蔵保存が好ましい。
Since contamination with bacteria becomes a serious problem during cell culture, it is desirable to perform the collagen coating operation in a sterile environment such as a clean room or a clean bench using a clean sterile substrate. As needed, you may add the sterilization process which does not destroy the structure of collagen, such as ethylene oxide and UV irradiation.
Speaking of the temperature during coating and drying, it is carried out at a modification temperature or lower, preferably at a modification temperature of -5 ° C or lower. When the treatment is performed at a temperature higher than the denaturation temperature, the fibrosis function may be lost due to the denaturation of the collagen before the formation of the bonds between the base materials and the collagen fibers, and the characteristics as collagen may not be exhibited.
Although the drying time varies depending on the humidity and the like, it is dried in about 5 minutes to 2 hours under ventilation such as in a clean bench. Insufficient drying may result in inadequate collagen fibrillation and adhesion to the substrate, and when the cell culture solution is added, the effect of the present invention is fully exerted by re-dissolution or peeling of the coating. May not. If it is in a sufficiently dry and fibrotic state, it can exert its effect even after being stored for several months. Storage is preferably at a temperature lower than the denaturation temperature, preferably refrigerated storage.
本発明の骨芽細胞分化誘導用培養基材は、前記被覆された第1の魚類由来コラーゲン以外の第2のコラーゲン少なくとも1つが被覆された間葉系幹細胞との接触面を有してもよい。すなわち、本発明の骨芽細胞分化誘導用培養基材は、異なる由来のコラーゲンが被覆された複合材料とすることも可能である。 The culture substrate for inducing osteoblast differentiation of the present invention may have a contact surface with a mesenchymal stem cell coated with at least one second collagen other than the coated first fish-derived collagen. . That is, the culture substrate for inducing osteoblast differentiation according to the present invention can be a composite material coated with collagen of different origin.
(第2のコラーゲン)
前記第2のコラーゲンは、被覆された第1の魚類由来コラーゲンと由来の異なるものであれば、特に制限されるものではなく、例えば第1の魚類由来コラーゲン以外の魚類由来コラーゲンを用いることも可能である。第2のコラーゲンとして、具体的には、哺乳類由来コラーゲン(例えば、ウシ由来コラーゲン、ブタ由来コラーゲン、ヒツジ由来コラーゲン、ヤギ由来コラーゲン、又はサル由来コラーゲン)、鳥類由来コラーゲン(例えば、ニワトリ由来コラーゲン、ガチョウ由来コラーゲン、アヒル由来コラーゲン、又はダチョウ由来コラーゲン)、爬虫類由来コラーゲン(例えば、ワニ由来コラーゲン)、両生類由来コラーゲン(例えば、カエル由来コラーゲン)、魚類由来コラーゲン(例えば、テラピア由来コラーゲン、タイ由来コラーゲン、ヒラメ由来コラーゲン、サメ由来コラーゲン、又はサケ由来コラーゲン)、無脊椎動物由来コラーゲン(例えば、クラゲ由来コラーゲン)、及びそれらの組み合わせを挙げることができる。第2のコラーゲンの組み合わせとしては、哺乳類由来コラーゲン及び鳥類由来コラーゲンを組み合わせてもよく、由来の異なる哺乳類由来コラーゲン同士、例えばウシ由来コラーゲン及びブタ由来コラーゲンを組み合わせてもよい。また、第2のコラーゲンは、従来公知の方法に従って製造することができる。
(Second collagen)
The second collagen is not particularly limited as long as it is different from the coated first fish-derived collagen. For example, fish-derived collagen other than the first fish-derived collagen can be used. It is. Specific examples of the second collagen include mammal-derived collagen (eg, bovine-derived collagen, pig-derived collagen, sheep-derived collagen, goat-derived collagen, or monkey-derived collagen), avian-derived collagen (eg, chicken-derived collagen, goose Derived collagen, duck-derived collagen, or ostrich-derived collagen), reptile-derived collagen (eg, crocodile-derived collagen), amphibian-derived collagen (eg, frog-derived collagen), fish-derived collagen (eg, tilapia-derived collagen, Thai-derived collagen, flounder Derived collagen, shark-derived collagen, or salmon-derived collagen), invertebrate-derived collagen (eg, jellyfish-derived collagen), and combinations thereof. As a combination of the second collagen, mammal-derived collagen and avian-derived collagen may be combined, or mammal-derived collagens having different origins, for example, bovine-derived collagen and pig-derived collagen may be combined. The second collagen can be produced according to a conventionally known method.
(第2のコラーゲンの細胞培養基材への被覆)
第2のコラーゲンは、第1の魚類由来コラーゲンと同じように、細胞培養基材の間葉系細胞との接触面に被覆することができる。第1の魚類由来コラーゲン及び第2のコラーゲンを混合して、接触面に被覆してもよく、また別々に順番に接触面に被覆してもよい。また、第1の魚類由来コラーゲンと、第2のコラーゲンとを同じ接触面に被覆してもよく、異なる接触面に被覆してもよい。
例えば、第1の魚類由来コラーゲン及び第2のコラーゲンを、異なる接触面に被覆する場合、マルチカルチャープレートのウェルの底面を2つ以上に分割して、第1の魚類由来コラーゲン及び第2のコラーゲンをそれぞれ、被覆してもよい。また、マルチカルチャープレートのウェルの底面に第1の魚類由来コラーゲンを被覆し、ビーズの表面に第2のコラーゲンを被覆して、マルチカルチャープレート及びビーズを組み合わせて、細胞培養基材として用いてもよい。
(Coating of second collagen on cell culture substrate)
Similar to the first fish-derived collagen, the second collagen can be coated on the contact surface of the cell culture substrate with the mesenchymal cells. The first fish-derived collagen and the second collagen may be mixed and coated on the contact surface, or may be separately coated on the contact surface in order. In addition, the first fish-derived collagen and the second collagen may be coated on the same contact surface or different contact surfaces.
For example, when the first fish-derived collagen and the second collagen are coated on different contact surfaces, the bottom surface of the well of the multiculture plate is divided into two or more, and the first fish-derived collagen and the second collagen are separated. Each may be coated. Alternatively, the bottom of the well of the multiculture plate may be coated with the first fish-derived collagen, the surface of the bead may be coated with the second collagen, and the multiculture plate and beads may be combined and used as a cell culture substrate. Good.
(間葉系幹細胞)
魚類由来コラーゲンで被覆された細胞培養基材と接触させる間葉系幹細胞としては、髄骨芽細胞に分化誘導することのできる細胞であれば、限定されないが、例えば、骨髄間葉系幹細胞、脂肪組織由来間葉系幹細胞、滑膜組織由来間葉系幹細胞、歯髄由来間葉系幹細胞、歯胚由来間葉系幹細胞、耳介軟骨膜由来間葉系幹細胞、末梢血由来間葉系幹細胞、臍帯血由来間葉系幹細胞、靭帯由来間葉系幹細胞、腱由来間葉系幹細胞、ES細胞由来間葉系幹細胞、又はiPS細胞由来間葉系幹細胞を挙げることができる。また、前記間葉系幹細胞の由来する動物種も、特に限定されず、哺乳類としては、例えばヒト、サル、イヌ、ネコ、ブタ、ヒツジ、ヤギ、ウシ、ウマ、ウサギ、モルモット、ラット、及びマウスを挙げることができる。また、鳥類としては、ニワトリ、ウズラ、アヒル、ガチョウ、ダチョウ、及びホロホロチョウを挙げることができ、爬虫類としては、ワニ、カメ、及びトカゲを挙げることができ、両生類としては、カエル、及びイモリを挙げることができ、魚類としては、テラピア、タイ、ヒラメ、サメ、及びサケを挙げることができる。更に、無脊椎動物としては、カニ、貝類、クラゲ、及びエビを挙げることができる。
前記間葉系幹細胞は骨芽細胞、脂肪細胞、筋細胞、又は軟骨細胞などの間葉系に属する細胞への分化能を持つ細胞であり、骨、血管、又は心筋を構成することのできる細胞となるものである。
(Mesenchymal stem cells)
The mesenchymal stem cells to be brought into contact with the cell culture substrate coated with fish-derived collagen are not limited as long as they can be induced to differentiate into medulloblasts. For example, bone marrow mesenchymal stem cells, fat Tissue-derived mesenchymal stem cells, synovial tissue-derived mesenchymal stem cells, dental pulp-derived mesenchymal stem cells, tooth embryo-derived mesenchymal stem cells, auricular perichondrium-derived mesenchymal stem cells, peripheral blood-derived mesenchymal stem cells, umbilical cord Examples include blood-derived mesenchymal stem cells, ligament-derived mesenchymal stem cells, tendon-derived mesenchymal stem cells, ES cell-derived mesenchymal stem cells, or iPS cell-derived mesenchymal stem cells. The animal species from which the mesenchymal stem cells are derived is not particularly limited, and examples of mammals include humans, monkeys, dogs, cats, pigs, sheep, goats, cows, horses, rabbits, guinea pigs, rats, and mice. Can be mentioned. Birds can include chickens, quails, ducks, geese, ostriches and guinea fowls. Reptiles can include crocodiles, turtles and lizards. Amphibians include frogs and newts. Fish can include tilapia, Thailand, flounder, shark, and salmon. In addition, examples of invertebrates include crabs, shellfish, jellyfish, and shrimps.
The mesenchymal stem cells are cells capable of differentiating into cells belonging to the mesenchymal system such as osteoblasts, adipocytes, myocytes, or chondrocytes, and can constitute bone, blood vessels, or myocardium It will be.
前記間葉系幹細胞は、株化細胞を用いてもよく、また、常法に従って調整することも可能であり、更には市販されている細胞を用いることもできる。また、生体から分離した間葉系幹細胞(例えば、骨髄間葉系幹細胞、脂肪組織由来間葉系幹細胞、滑膜組織由来間葉系幹細胞、歯髄由来間葉系幹細胞、歯胚由来間葉系幹細胞、耳介軟骨膜由来間葉系幹細胞、末梢血由来間葉系幹細胞、臍帯血由来間葉系幹細胞、靭帯由来間葉系幹細胞、腱由来間葉系幹細胞、ES細胞由来間葉系幹細胞、又はiPS細胞由来間葉系幹細胞)を、本発明の骨芽細胞分化誘導方法により骨芽細胞に分化誘導することができる。この場合、生体から採取された細胞は、常法に従って結合組織等を除去して調製することが好ましい。更に、生体から採取された細胞は、初代培養細胞を用いることが好ましい。継代して用いることも可能であるが、継代数は少ないほうが好ましく、10回以下が好ましく、5回以下が更に好ましく、2回以下であることが、最も好ましい。 The mesenchymal stem cell may be a cell line, can be prepared according to a conventional method, and a commercially available cell can also be used. In addition, mesenchymal stem cells (eg, bone marrow mesenchymal stem cells, adipose tissue-derived mesenchymal stem cells, synovial tissue-derived mesenchymal stem cells, dental pulp-derived mesenchymal stem cells, tooth germ-derived mesenchymal stem cells) , Auricular perichondrium-derived mesenchymal stem cells, peripheral blood-derived mesenchymal stem cells, umbilical cord blood-derived mesenchymal stem cells, ligament-derived mesenchymal stem cells, tendon-derived mesenchymal stem cells, ES cells-derived mesenchymal stem cells, or iPS cell-derived mesenchymal stem cells) can be induced to differentiate into osteoblasts by the osteoblast differentiation inducing method of the present invention. In this case, the cells collected from the living body are preferably prepared by removing connective tissue and the like according to a conventional method. Furthermore, it is preferable to use primary cultured cells as cells collected from a living body. Although it is possible to use after passage, the number of passages is preferably small, preferably 10 times or less, more preferably 5 times or less, and most preferably 2 times or less.
(骨芽細胞)
本発明の方法により分化誘導される骨芽細胞は、骨組織において骨形成を行う細胞であり、細胞質は好塩基性を示し、アルカリホスファターゼ活性を有している。また、骨芽細胞はアンドロゲンとエストロゲンのレセプターを持っていてもよく、アンドロゲンは骨芽細胞の活動性を低下させ、エストロゲンは骨芽細胞を刺激する。間葉系幹細胞から、骨芽細胞への分化誘導は、アルカリホスファターゼの活性を測定することによって確認することができる。アルカリホスファターゼの測定は、後述の実施例に示すように、常法に従って行うことができる。
(Osteoblast)
Osteoblasts that are induced to differentiate by the method of the present invention are cells that form bone in bone tissue, the cytoplasm is basophile, and has alkaline phosphatase activity. Osteoblasts may also have androgen and estrogen receptors, androgen reduces osteoblast activity, and estrogen stimulates osteoblasts. Differentiation induction from mesenchymal stem cells into osteoblasts can be confirmed by measuring the activity of alkaline phosphatase. The measurement of alkaline phosphatase can be performed according to a conventional method as shown in Examples described later.
〔2〕骨芽細胞分化誘導キット及び骨芽細胞製造装置
本発明の骨芽細胞分化誘導キットは、骨芽細胞分化誘導用培養基材を含む。骨芽細胞分化誘導用培養基材は、魚類由来コラーゲンが被覆された、間葉系幹細胞との接触面を有するものである。具体的には、本発明の前記骨芽細胞分化誘導用培養基材を含むことができる。また、前記骨芽細胞分化誘導方法〔1〕に記載の魚類由来コラーゲン、及び細胞培養基材を用いて、「細胞培養基材へのコラーゲンの被覆」に記載の方法、及び公知の方法に従って、骨芽細胞分化誘導用培養基材を製造することが可能である。
前記間葉系細胞との接触面には、魚類由来コラーゲンが被覆されているが、具体的にはフラスコ、又はシャーレの細胞培養面、マルチカルチャープレートのウェルの底面、ビーズの表面、又は多孔質体の表面などであり、間葉系細胞が接触することのできるものである。
[2] Osteoblast differentiation induction kit and osteoblast production apparatus The osteoblast differentiation induction kit of the present invention includes a culture substrate for inducing osteoblast differentiation. The culture substrate for inducing osteoblast differentiation has a contact surface with mesenchymal stem cells coated with fish-derived collagen. Specifically, the culture substrate for inducing osteoblast differentiation of the present invention can be included. Further, using the fish-derived collagen according to the osteoblast differentiation induction method [1] and a cell culture substrate, according to the method described in “Coating of collagen on a cell culture substrate” and a known method, It is possible to produce a culture substrate for inducing osteoblast differentiation.
The contact surface with the mesenchymal cells is coated with fish-derived collagen, specifically, a flask or petri dish cell culture surface, a bottom surface of a multiculture plate well, a bead surface, or a porous surface It is the surface of the body and can be contacted by mesenchymal cells.
また、本発明の骨芽細胞分化誘導キットは、骨芽細胞分化誘導因子を含んでもよい。骨芽細胞分化誘導因子としては、デキサメタゾン、FK−506又はシクロスポリン等の免疫抑制剤、BMP2、BMP4、BMP5、BMP6、BMP7又はBMP9等の骨形成タンパク質(BMP:Bone Morphogenic Proteins)、TGFβ等の骨形成液性因子を挙げることができる。本発明の骨芽細胞分化誘導キットは、これらの骨芽細胞分化誘導因子から選択される1種又は2種以上を含むことができる。
また、本発明の骨芽細胞分化誘導キットは、間葉系幹細胞からの骨芽細胞の分化誘導用であることを明記した使用説明書を含んでもよい。間葉系幹細胞からの骨芽細胞の分化誘導用である旨の記載は、キットの容器等に付されていてもよい。
Moreover, the osteoblast differentiation inducing kit of the present invention may contain an osteoblast differentiation inducing factor. Examples of osteoblast differentiation inducers include dexamethasone, immunosuppressive agents such as FK-506 or cyclosporine, bone morphogenetic proteins (BMP: Bone Morphogenic Proteins) such as BMP2, BMP4, BMP5, BMP6, BMP7 or BMP9, bones such as TGFβ Mention may be made of forming liquid factors. The osteoblast differentiation inducing kit of the present invention can contain one or more selected from these osteoblast differentiation inducing factors.
In addition, the osteoblast differentiation induction kit of the present invention may include an instruction manual specifying that it is for induction of osteoblast differentiation from mesenchymal stem cells. The statement that it is for inducing differentiation of osteoblasts from mesenchymal stem cells may be attached to the container of the kit.
本発明の骨芽細胞製造装置は、骨芽細胞分化誘導用培養基材を含むものである。骨芽細胞分化誘導用培養基材は、魚類由来コラーゲンが被覆された、間葉系幹細胞との接触面を有するものであり、本発明の骨芽細胞分化誘導キットに含まれるものと同じものを用いることができる。
また、本発明の骨芽細胞製造装置は、細胞培養用のCO2インキュベータを含んでもよい。CO2インキュベータ中で、骨芽細胞分化誘導用培養基材を用いて、間葉系幹細胞からの骨芽細胞を製造することができる。
The osteoblast production apparatus of the present invention includes a culture substrate for inducing osteoblast differentiation. The culture substrate for inducing osteoblast differentiation has a contact surface with mesenchymal stem cells coated with fish-derived collagen and is the same as that contained in the osteoblast differentiation inducing kit of the present invention. Can be used.
Moreover, the osteoblast production apparatus of the present invention may include a CO 2 incubator for cell culture. Osteoblasts from mesenchymal stem cells can be produced using a culture substrate for inducing osteoblast differentiation in a CO 2 incubator.
〔3〕骨芽細胞分化誘導方法
本発明の骨芽細胞分化誘導方法は、魚類由来コラーゲンで被覆された細胞培養基材と、間葉系幹細胞とを接触させる工程(以下、魚類コラーゲン接触工程と称することがある)を含むことを特徴とするものである。
本発明の骨芽細胞分化誘導方法においては、前記骨芽細胞分化誘導用培養基材に記載の魚類由来コラーゲン、及び細胞培養基材を用いることができ、そして細胞培養基材に魚類由来コラーゲンを、前記「細胞培養基材へのコラーゲンの被覆」の記載、及び公知の方法にしたがって被覆することができる。しかしながら、魚類由来コラーゲンが被覆された細胞培養基材は、特に骨芽細胞分化誘導用の用途に限定されたものを用いる必要はない。
また、骨芽細胞分化誘導方法に用いる間葉系幹細胞も、骨芽細胞分化誘導用培養基材に記載の間葉系幹細胞を用いることができ、分化誘導される骨芽細胞の特徴は、前記のとおりである。
[3] Osteoblast differentiation inducing method The osteoblast differentiation inducing method of the present invention comprises a step of contacting a cell culture substrate coated with fish-derived collagen and a mesenchymal stem cell (hereinafter referred to as a fish collagen contact step). In some cases).
In the osteoblast differentiation inducing method of the present invention, the fish-derived collagen described in the culture substrate for osteoblast differentiation induction and the cell culture substrate can be used, and the fish-derived collagen is used as the cell culture substrate. The coating can be performed according to the description in the above-mentioned “Coating of collagen on cell culture substrate” and known methods. However, it is not necessary to use a cell culture substrate coated with fish-derived collagen that is specifically limited to the use for inducing osteoblast differentiation.
Further, the mesenchymal stem cells used in the osteoblast differentiation induction method can also use the mesenchymal stem cells described in the culture substrate for osteoblast differentiation induction. It is as follows.
(接触)
骨芽細胞分化誘導方法において、前記細胞培養基材と、間葉系幹細胞との接触に用いる培地は、間葉系幹細胞が維持できる培地であれば限定されないが、通常その間葉系幹細胞の培養に用いる培地を用いればよい。例えば、MEM培地、α−MEM培地、又はDMEM培地等の公知の培地を、培養する細胞に合わせて適宜選んで用いることができる。
接触時間は、間葉系幹細胞の骨芽細胞への分化誘導が起きる限りにおいて、限定されないが、実質的には、下限は10分以上であり、好ましくは1時間以上であり、より好ましくは1日以上である。接触時間の上限も限定されないが、30日以下であり、好ましくは15日以下であり、より好ましくは7日以下である。
接触温度は、間葉系幹細胞の最適な培養温度に従って、適宜決定することができる。例えば、哺乳類の間葉系幹細胞の場合、30℃〜40℃であり、35℃〜37℃が好ましい。しかしながら、培養温度よりも高い温度、又は低い温度で接触させることも可能である。例えば、変性温度が低い魚類由来コラーゲンを用いた場合、培養温度よりも低い接触温度で、細胞培養基材と、間葉系幹細胞との接触を行い、最適な培養温度に上昇させて、間葉系幹細胞の培養を行うことも可能である。
(contact)
In the osteoblast differentiation induction method, the medium used for contacting the cell culture substrate and mesenchymal stem cells is not limited as long as it is a medium that can maintain mesenchymal stem cells, but is usually used for culturing mesenchymal stem cells. What is necessary is just to use the culture medium to be used. For example, a known medium such as a MEM medium, an α-MEM medium, or a DMEM medium can be appropriately selected and used according to the cells to be cultured.
The contact time is not limited as long as differentiation induction of mesenchymal stem cells into osteoblasts occurs, but the lower limit is substantially 10 minutes or more, preferably 1 hour or more, more preferably 1 More than a day. The upper limit of the contact time is not limited, but is 30 days or less, preferably 15 days or less, and more preferably 7 days or less.
The contact temperature can be appropriately determined according to the optimal culture temperature for mesenchymal stem cells. For example, in the case of mammalian mesenchymal stem cells, it is 30 ° C to 40 ° C, preferably 35 ° C to 37 ° C. However, it is also possible to contact at a temperature higher or lower than the culture temperature. For example, when fish-derived collagen with a low denaturation temperature is used, the cell culture substrate is contacted with the mesenchymal stem cells at a contact temperature lower than the culture temperature, and the mesenchyme is raised to the optimal culture temperature. It is also possible to culture stem cell.
通常、骨芽細胞分化誘導は、10〜15%程度の血清の存在下で行う。本発明の骨芽細胞分化誘導方法においても、10〜15%程度の血清の存在下で分化誘導を行うことが可能であるが、低濃度の血清の存在下、又は血清の非存在下でも骨芽細胞分化誘導を行うことが可能である。間葉系幹細胞から骨芽細胞分化誘導する場合の、血清中の様々な因子の影響を排除するためには、低濃度の血清の存在下で接触させるのが好ましい。例えば、10%以下の血清存在下が好ましく、5%以下の血清存在下がより好ましく、3%以下の血清存在下が更に好ましく、血清非存在下が最も好ましい。
骨芽細胞分化誘導において用いることのできる血清は、哺乳動物の血清であれば、特に限定されないが、ヒト、ウシ、ウマ、ヒツジ、又はヤギなどの血清を用いることができる。しかしながら、間葉系幹細胞を生体から分離した場合、その間葉系幹細胞を採取した個体の血清を用いることが最も好ましい。その個体自体の血清を用いることにより、ウシなどの血清に含まれる可能性のある人畜共通感染症の病原体との接触を防ぐことが可能である。
Usually, osteoblast differentiation is induced in the presence of about 10 to 15% serum. In the osteoblast differentiation inducing method of the present invention, differentiation can be induced in the presence of about 10 to 15% serum, but bone can be obtained even in the presence of low-concentration serum or in the absence of serum. It is possible to induce blast differentiation. In order to eliminate the influence of various factors in serum when osteoblast differentiation is induced from mesenchymal stem cells, it is preferable to contact in the presence of a low concentration of serum. For example, the presence of 10% or less of serum is preferable, the presence of 5% or less of serum is more preferable, the presence of 3% or less of serum is more preferable, and the absence of serum is most preferable.
The serum that can be used in the induction of osteoblast differentiation is not particularly limited as long as it is mammalian serum, but serum from humans, cows, horses, sheep, goats, and the like can be used. However, when the mesenchymal stem cells are separated from the living body, it is most preferable to use the serum of the individual from which the mesenchymal stem cells are collected. By using the serum of the individual itself, it is possible to prevent contact with pathogens of zoonotic diseases that may be contained in the serum of cattle and the like.
(骨芽細胞分化誘導因子)
本発明の骨芽細胞分化誘導方法は、前記間葉系幹細胞を骨芽細胞分化誘導因子に接触させる工程(以下、骨芽細胞分化誘導因子接触工程と称することがある)を、含むことができる。骨芽細胞分化誘導因子接触工程は、魚類コラーゲン接触工程と同時に行ってもよく、魚類コラーゲン接触工程の前又は後に行ってもよい。骨芽細胞分化誘導因子接触工程は、骨芽細胞分化誘導因子を、間葉系幹細胞が含まれている培地に添加することによって行うことができる。
骨芽細胞分化誘導因子は、間葉系幹細胞を骨芽細胞に分化誘導できる限り、限定されるものではないが、例えば、デキサメタゾン、FK−506又はシクロスポリン等の免疫抑制剤、BMP2、BMP4、BMP5、BMP6、BMP7又はBMP9等の骨形成タンパク質(BMP:Bone Morphogenic Proteins)、TGFβ等の骨形成液性因子を挙げることができる。これらの骨芽細胞分化誘導因子から選択される1種又は2種以上を、培地に添加することにより、骨芽細胞分化誘導因子接触工程を行うことができる。
骨芽細胞分化誘導因子の濃度は、用いる骨芽細胞分化誘導因子の種類に応じて、適宜決めることができる。例えば、デキサメタゾンを用いる場合、1〜100nMの濃度で用いることができ、特には10nMが好ましい。
(Osteoblast differentiation factor)
The osteoblast differentiation inducing method of the present invention can include a step of bringing the mesenchymal stem cells into contact with an osteoblast differentiation inducing factor (hereinafter sometimes referred to as an osteoblast differentiation inducing factor contact step). . The osteoblast differentiation inducing factor contact step may be performed simultaneously with the fish collagen contact step, or may be performed before or after the fish collagen contact step. The osteoblast differentiation inducer contact step can be performed by adding an osteoblast differentiation inducer to a medium containing mesenchymal stem cells.
The osteoblast differentiation-inducing factor is not limited as long as it can induce differentiation of mesenchymal stem cells into osteoblasts. For example, an immunosuppressant such as dexamethasone, FK-506 or cyclosporine, BMP2, BMP4, BMP5 , BMP6, BMP7, BMP9 and other bone morphogenetic proteins (BMP: Bone Morphogenic Proteins) and TGFβ and other osteogenic fluid factors. By adding one or more selected from these osteoblast differentiation inducing factors to the medium, the osteoblast differentiation inducing factor contact step can be performed.
The concentration of the osteoblast differentiation inducing factor can be appropriately determined according to the type of osteoblast differentiation inducing factor used. For example, when dexamethasone is used, it can be used at a concentration of 1 to 100 nM, and 10 nM is particularly preferable.
本発明の骨芽細胞分化誘導方法においては、第1の魚類由来コラーゲン以外の第2のコラーゲン少なくとも1つが被覆された細胞培養基材と、間葉系幹細胞とを接触させる第2コラーゲン接触工程を更に含んでもよい。
第2コラーゲン接触工程において用いる第2のコラーゲンとしては、本発明の骨芽細胞分化誘導用培養基材に記載の第2のコラーゲンを用いることができる。また、第2のコラーゲンの細胞培養基材への被覆も、本発明の骨芽細胞分化誘導用培養基材に記載の方法に従って、被覆することができる。
In the osteoblast differentiation inducing method of the present invention, a second collagen contact step of contacting a cell culture substrate coated with at least one second collagen other than the first fish-derived collagen with a mesenchymal stem cell is performed. Further, it may be included.
As the second collagen used in the second collagen contact step, the second collagen described in the osteoblast differentiation induction culture substrate of the present invention can be used. The coating of the second collagen on the cell culture substrate can also be performed according to the method described in the culture substrate for inducing osteoblast differentiation of the present invention.
本発明の骨芽細胞分化誘導方法における魚類コラーゲン接触工程、第2コラーゲン接触工程、及び骨芽細胞分化誘導因子接触工程は、同時に行ってもよく、別々に行ってもよい。それぞれの工程を別に行う場合、3つの工程を別に行ってもよく、2つの工程を同時に行い、もう1つの工程を別に行うこともできる。
それぞれの工程を行う順番も、特に限定されないが、魚類コラーゲン接触工程により、骨芽細胞の初期分化誘導が強く惹起されるため、魚類コラーゲン接触工程、及び第2コラーゲン接触工程を別に行う場合は、魚類コラーゲン接触工程を行い、次に2コラーゲン接触工程を行うことが好ましい。第2コラーゲン接触工程により、魚類コラーゲン接触工程により分化した骨芽細胞が、更に分化誘導されるからである。
The fish collagen contact step, the second collagen contact step, and the osteoblast differentiation inducer contact step in the osteoblast differentiation inducing method of the present invention may be performed simultaneously or separately. When performing each process separately, three processes may be performed separately, two processes may be performed simultaneously, and another process may be performed separately.
The order of performing each step is not particularly limited, but the fish collagen contact step strongly induces the initial differentiation of osteoblasts, so when performing the fish collagen contact step and the second collagen contact step separately, It is preferred to perform the fish collagen contact step and then the 2 collagen contact step. This is because the osteoblasts differentiated by the fish collagen contact step are further induced to differentiate by the second collagen contact step.
本発明の骨芽細胞分化誘導用培養基材は、上述の本発明の骨芽細胞分化誘導方法に使用することができる。 The culture substrate for inducing osteoblast differentiation of the present invention can be used in the above-described method for inducing osteoblast differentiation of the present invention.
〔4〕骨芽細胞製造方法及び骨芽細胞
本発明の骨芽細胞製造方法は、魚類由来コラーゲンで被覆された細胞培養基材によって、間葉系幹細胞を培養する工程を含むことを特徴とするものである。
前記骨芽細胞分化誘導方法を用いて、骨芽細胞を製造することができる。すなわち、本発明の骨芽細胞製造方法においては、前記骨芽細胞分化誘導用培養基材に記載の魚類由来コラーゲン、及び細胞培養基材を用いることができ、そして細胞培養基材に魚類由来コラーゲンを、前記「細胞培養基材へのコラーゲンの被覆」の記載にしたがって被覆することができる。しかしながら、魚類由来コラーゲンが被覆された細胞培養基材は、特に骨芽細胞分化誘導用の用途に限定されたものを用いる必要はない。
また、骨芽細胞分化誘導方法に用いる間葉系幹細胞も、骨芽細胞分化誘導用培養基材に記載の間葉系幹細胞を用いることができる。
[4] Osteoblast production method and osteoblast The osteoblast production method of the present invention includes a step of culturing mesenchymal stem cells with a cell culture substrate coated with fish-derived collagen. Is.
Osteoblasts can be produced using the osteoblast differentiation induction method. That is, in the osteoblast production method of the present invention, the fish-derived collagen described in the culture substrate for osteoblast differentiation induction and the cell culture substrate can be used, and the fish-derived collagen is used as the cell culture substrate. Can be coated according to the description in “Coating of cell culture substrate with collagen”. However, it is not necessary to use a cell culture substrate coated with fish-derived collagen that is specifically limited to the use for inducing osteoblast differentiation.
The mesenchymal stem cells described in the culture substrate for inducing osteoblast differentiation can also be used as the mesenchymal stem cells used in the osteoblast differentiation inducing method.
(培養)
本発明の骨芽細胞製造方法における培地は、用いる間葉系幹細胞、例えば骨髄間葉系幹細胞、脂肪組織由来間葉系幹細胞、滑膜組織由来間葉系幹細胞、歯髄由来間葉系幹細胞、歯胚由来間葉系幹細胞、耳介軟骨膜由来間葉系幹細胞、末梢血由来間葉系幹細胞、臍帯血由来間葉系幹細胞、靭帯由来間葉系幹細胞、腱由来間葉系幹細胞、ES細胞由来間葉系幹細胞、又はiPS細胞由来間葉系幹細胞に合わせて、適宜選択することができる。例えば、骨髄間葉系幹細胞の場合、MEM培地、α−MEM培地、又はDMEM培地等を用いることができる。また、前記の培地には、抗生物質等を添加してもよい。
(culture)
The medium in the osteoblast production method of the present invention is a mesenchymal stem cell to be used, for example, bone marrow mesenchymal stem cell, adipose tissue-derived mesenchymal stem cell, synovial tissue-derived mesenchymal stem cell, dental pulp-derived mesenchymal stem cell, tooth Embryonic-derived mesenchymal stem cells, auricular perichondrium-derived mesenchymal stem cells, peripheral blood-derived mesenchymal stem cells, umbilical cord blood-derived mesenchymal stem cells, ligament-derived mesenchymal stem cells, tendon-derived mesenchymal stem cells, ES cells A mesenchymal stem cell or an iPS cell-derived mesenchymal stem cell can be appropriately selected. For example, in the case of bone marrow mesenchymal stem cells, MEM medium, α-MEM medium, DMEM medium, or the like can be used. Moreover, you may add antibiotics etc. to the said culture medium.
培養時間は、間葉系幹細胞の骨芽細胞への分化誘導が起きる限りにおいて、限定されないが、1日〜30日であり、好ましくは1日〜14日であり、より好ましくは3日〜10日である。
培養温度は、間葉系幹細胞の最適な培養温度に従って、適宜決定することができるが、哺乳類の間葉系幹細胞の場合、30℃〜40℃が好ましく、35℃〜37℃がより好ましい。しかしながら、変性温度が低い魚類由来コラーゲンを用いた場合、間葉系幹細胞の培養の最適温度よりも低い温度で培養することも可能である。また、培養は、3〜10%のCO2存在下で行うことが好ましく、5%CO2存在下で行うことがより好ましい。
The culture time is not limited as long as differentiation induction of mesenchymal stem cells into osteoblasts occurs, but it is 1 to 30 days, preferably 1 to 14 days, more preferably 3 to 10 days. Day.
The culture temperature can be appropriately determined according to the optimal culture temperature for mesenchymal stem cells, but in the case of mammalian mesenchymal stem cells, it is preferably 30 ° C to 40 ° C, more preferably 35 ° C to 37 ° C. However, when fish-derived collagen having a low denaturation temperature is used, it can be cultured at a temperature lower than the optimum temperature for culturing mesenchymal stem cells. The culture is preferably performed in the presence of 3 to 10% CO 2, and more preferably in the presence of 5% CO 2 .
通常、間葉系幹細胞の培養は、10〜15%程度の血清の存在下で行い、骨芽細胞を製造する。本発明の骨芽細胞製造方法においても、10〜15%程度の血清の存在下で骨芽細胞を製造することが可能であるが、低濃度の血清の存在下、又は血清の非存在下でも骨芽細胞の製造を行うことが可能である。間葉系幹細胞から骨芽細胞を製造する場合の、血清中の様々な因子の影響を排除するためには、低濃度の血清の存在下で製造するのが好ましい。例えば、10%以下の血清存在下が好ましく、5%以下の血清存在下がより好ましく、3%以下の血清存在下が更に好ましく、血清非存在下が最も好ましい。
骨芽細胞の製造において用いることのできる血清は、哺乳動物の血清であれば、特に限定されないが、ヒト、ウシ、ウマ、ヒツジ、又はヤギなどの血清を用いることができる。しかしながら、間葉系幹細胞を生体から分離した場合、その間葉系幹細胞を採取した個体の血清を用いることが最も好ましい。その個体自体の血清を用いることにより、ウシなどの血清に含まれる可能性のある人畜共通感染症の病原体との接触を防ぐことが可能である。
Usually, mesenchymal stem cells are cultured in the presence of about 10 to 15% serum to produce osteoblasts. In the osteoblast production method of the present invention, it is possible to produce osteoblasts in the presence of about 10 to 15% serum, but even in the presence of a low concentration of serum or in the absence of serum. It is possible to produce osteoblasts. In order to eliminate the influence of various factors in serum when producing osteoblasts from mesenchymal stem cells, it is preferable to produce them in the presence of a low concentration of serum. For example, the presence of 10% or less of serum is preferable, the presence of 5% or less of serum is more preferable, the presence of 3% or less of serum is more preferable, and the absence of serum is most preferable.
The serum that can be used in the production of osteoblasts is not particularly limited as long as it is mammalian serum, but serum from humans, cows, horses, sheep, goats, and the like can be used. However, when the mesenchymal stem cells are separated from the living body, it is most preferable to use the serum of the individual from which the mesenchymal stem cells are collected. By using the serum of the individual itself, it is possible to prevent contact with pathogens of zoonotic diseases that may be contained in the serum of cattle and the like.
(骨芽細胞分化誘導因子)
本発明の骨芽細胞製造方法において、培養用の培地に骨芽細胞分化誘導因子を含むことができる。骨芽細胞分化誘導因子は、培養の開始から添加してもよく、培養の途中で添加してもよい。
骨芽細胞分化誘導因子は、間葉系幹細胞を骨芽細胞に分化誘導できる限り、限定されるものではないが、例えば、デキサメタゾン、FK−506又はシクロスポリン等の免疫抑制剤、BMP2、BMP4、BMP5、BMP6、BMP7又はBMP9等の骨形成タンパク質(BMP:Bone Morphogenic Proteins)、TGFβ等の骨形成液性因子を挙げることができる。これらの骨芽細胞分化誘導因子から選択される1種又は2種以上を、培地に添加することにより、骨芽細胞分化誘導因子接触工程を行うことができる。
骨芽細胞分化誘導因子の濃度は、用いる骨芽細胞分化誘導因子の種類に応じて、適宜決めることができる。例えば、デキサメタゾンを用いる場合、1〜100nMの濃度で用いることができ、特には10nMが好ましい。
(Osteoblast differentiation factor)
In the osteoblast production method of the present invention, an osteoblast differentiation inducing factor can be included in the culture medium. The osteoblast differentiation inducing factor may be added from the start of the culture or may be added during the culture.
The osteoblast differentiation-inducing factor is not limited as long as it can induce differentiation of mesenchymal stem cells into osteoblasts. For example, an immunosuppressant such as dexamethasone, FK-506 or cyclosporine, BMP2, BMP4, BMP5 , BMP6, BMP7, BMP9 and other bone morphogenetic proteins (BMP: Bone Morphogenic Proteins) and TGFβ and other osteogenic fluid factors. By adding one or more selected from these osteoblast differentiation inducing factors to the medium, the osteoblast differentiation inducing factor contact step can be performed.
The concentration of the osteoblast differentiation inducing factor can be appropriately determined according to the type of osteoblast differentiation inducing factor used. For example, when dexamethasone is used, it can be used at a concentration of 1 to 100 nM, and 10 nM is particularly preferable.
本発明の骨芽細胞製造方法においては、細胞培養基材が前記被覆された第1の魚類由来コラーゲン以外の第2のコラーゲン少なくとも1つが被覆された間葉系幹細胞との接触面を有してもよい。すなわち、本発明の骨芽細胞製造方法においては、第2のコラーゲンが被覆された細胞培養基材による培養を、更に行ってもよい。
第2のコラーゲンとしては、本発明の骨芽細胞分化誘導用培養基材に記載の第2のコラーゲンを用いることができる。また、第2のコラーゲンの細胞培養基材への被覆も、本発明の骨芽細胞分化誘導用培養基材に記載の方法に従って、被覆することができる。
In the osteoblast production method of the present invention, the cell culture substrate has a contact surface with a mesenchymal stem cell coated with at least one second collagen other than the coated first fish-derived collagen. Also good. That is, in the osteoblast production method of the present invention, culture using a cell culture substrate coated with the second collagen may be further performed.
As the second collagen, the second collagen described in the culture substrate for inducing osteoblast differentiation of the present invention can be used. The coating of the second collagen on the cell culture substrate can also be performed according to the method described in the culture substrate for inducing osteoblast differentiation of the present invention.
第2のコラーゲンが被覆された細胞培養基材による培養は、第1の魚類由来コラーゲンが被覆された細胞培養基材による培養と同時に行ってもよく、別々に行ってもよい。第1の魚類由来コラーゲン及び第2のコラーゲンが、同じ接触面に被覆された細胞培養基材を用いる場合は、それぞれの培養は同時に行われる。一方、第1の魚類由来コラーゲン及び第2のコラーゲンが異なる接触面に被覆されている場合は、それぞれの培養は、同時に行うこともでき、また別々に行うこともできる。培養を同時に行う場合は、例えばマルチカルチャープレートのウェルの底面に第1の魚類由来コラーゲンを被覆し、ビーズの表面に第2のコラーゲンを被覆して、マルチカルチャープレート及びビーズを組み合わせた、細胞培養基材を用いればよい。更に、それぞれの培養は、骨芽細胞分化誘導因子の存在下で行ってもよく、骨芽細胞分化誘導因子の非存在下で行ってもよい。 The culture using the cell culture substrate coated with the second collagen may be performed simultaneously with the culture using the cell culture substrate coated with the first fish-derived collagen, or may be performed separately. When the cell culture substrate in which the first fish-derived collagen and the second collagen are coated on the same contact surface is used, each culture is performed simultaneously. On the other hand, when the first fish-derived collagen and the second collagen are coated on different contact surfaces, the respective cultures can be performed simultaneously or separately. When culturing at the same time, for example, cell culture in which the first fish-derived collagen is coated on the bottom of the well of the multiculture plate, the second collagen is coated on the surface of the bead, and the multiculture plate and beads are combined. A substrate may be used. Furthermore, each culture may be performed in the presence of an osteoblast differentiation inducing factor or in the absence of an osteoblast differentiation inducing factor.
本発明の骨芽細胞分化誘導用培養基材は、上述の本発明の骨芽細胞製造方法に使用することができる。 The culture substrate for inducing osteoblast differentiation of the present invention can be used in the above-described method for producing osteoblasts of the present invention.
(骨芽細胞)
本発明の骨芽細胞は、本発明の製造方法により得ることのできる骨芽細胞であり、骨組織において骨形成を行うことができる。前記骨芽細胞は、間葉系幹細胞から、骨芽前駆細胞に分化し、更に骨芽細胞へと分化されたものである。また、骨芽細胞の細胞質は好塩基性を示し、アルカリホスファターゼ活性を有している。更に、本発明の骨芽細胞は、アンドロゲンとエストロゲンのレセプターを持っていてもよい。アンドロゲンは骨芽細胞の活動性を低下させ、エストロゲンは骨芽細胞を刺激するものである。
(Osteoblast)
The osteoblast of the present invention is an osteoblast that can be obtained by the production method of the present invention, and can perform bone formation in bone tissue. The osteoblasts are differentiated from mesenchymal stem cells into osteoprogenitor cells and further differentiated into osteoblasts. The cytoplasm of osteoblasts is basophil and has alkaline phosphatase activity. Furthermore, the osteoblasts of the present invention may have androgen and estrogen receptors. Androgens reduce osteoblast activity and estrogens stimulate osteoblasts.
〔5〕魚類由来コラーゲンの使用
本発明の魚類由来コラーゲンの使用は、骨芽細胞分化誘導、又は骨芽細胞の製造を目的とするものである。具体的には、細胞培養基材に使用するものであり、より具体的には、細胞培養基材に被覆するものである。魚類由来コラーゲンとしては、前記前記骨芽細胞分化誘導方法〔1〕に記載の魚類由来コラーゲンを用いることができる。また、細胞培養基材への魚類由来コラーゲンの被覆は、前記骨芽細胞分化誘導方法〔1〕の「細胞培養基材へのコラーゲンの被覆」に記載の方法及び公知の方法に従って、行うことが可能である。
更に、魚類由来コラーゲンは、本発明の骨芽細胞分化誘導キットの製造に使用することができる。また、本明細書は本発明の骨芽細胞分化誘導キットの使用を開示している。
[5] Use of fish-derived collagen The use of fish-derived collagen of the present invention is intended to induce osteoblast differentiation or produce osteoblasts. Specifically, it is used for a cell culture substrate, and more specifically, a cell culture substrate is coated. As the fish-derived collagen, the fish-derived collagen described in the osteoblast differentiation inducing method [1] can be used. The cell culture substrate is coated with fish-derived collagen according to the method described in “Coating of cell culture substrate with collagen” in the osteoblast differentiation induction method [1] and a known method. Is possible.
Furthermore, fish-derived collagen can be used for the production of the osteoblast differentiation induction kit of the present invention. The present specification also discloses the use of the osteoblast differentiation inducing kit of the present invention.
以下、実施例によって本発明を具体的に説明するが、これらは本発明の範囲を限定するものではない。 EXAMPLES Hereinafter, the present invention will be specifically described by way of examples, but these do not limit the scope of the present invention.
《アルカリホスファターゼ活性の測定》
実施例で得られた骨芽細胞のアルカリホスファターゼの測定は以下のように行った。
細胞をPBS(−)(pH7.4)で洗浄後、スクレイパーで回収し、200μLの100mM Tris−HCl(pH7.5)、5mM MgCl2、0.2%Triton X−100に懸濁して超音波破砕した。破砕後、6,000gで10分間遠心して上清を回収した。上清20μL(適宜100mM Tris−HCl(pH7.5),5mM MgCl2にて希釈)を使用し、LabAssay ALP(Wako)を用いてアルカリホスファターゼ活性を測定した。
<Measurement of alkaline phosphatase activity>
Measurement of alkaline phosphatase in osteoblasts obtained in the examples was performed as follows.
The cells were washed with PBS (−) (pH 7.4), collected with a scraper, suspended in 200 μL of 100 mM Tris-HCl (pH 7.5), 5 mM MgCl 2 , 0.2% Triton X-100, and ultrasonicated. It was crushed. After crushing, the supernatant was collected by centrifugation at 6,000 g for 10 minutes. 20 μL of supernatant (appropriately diluted with 100 mM Tris-HCl (pH 7.5), 5 mM MgCl 2 ) was used, and alkaline phosphatase activity was measured using LabAssay ALP (Wako).
《製造例1:魚類由来コラーゲンの製造》
テラピアの鱗からのコラーゲンの製造方法を以下に記載する。
テラピアの鱗を水で十分洗浄し、更に10%塩化ナトリウム溶液で十分洗浄し、鰭などの夾雑物を除去した後、室温にて乾燥した。含水率は18.5%であった。
このテラピア鱗1kgをpH2の塩酸溶液9kgに分散し、1Mの塩酸溶液を添加しながらpHを2に保った状態で、25℃、2時間穏やかに攪拌し、鱗に含まれる無機成分を溶出した。これをザルにあげて、十分水洗した後、総重量が4kgとなるようにpH2の塩酸溶液を添加した。
<< Production Example 1: Production of fish-derived collagen >>
A method for producing collagen from tilapia scales is described below.
The tilapia scales were thoroughly washed with water and further washed with a 10% sodium chloride solution to remove impurities such as wrinkles, and then dried at room temperature. The water content was 18.5%.
1 kg of this tilapia scale was dispersed in 9 kg of a hydrochloric acid solution of pH 2 and gently stirred at 25 ° C. for 2 hours with the pH kept at 2 while adding a 1M hydrochloric acid solution to elute the inorganic components contained in the scale. . This was raised to a colander and washed thoroughly with water, and then a hydrochloric acid solution having a pH of 2 was added so that the total weight was 4 kg.
これに、ペプシン(和光純薬 1:10000)24gを添加し、攪拌羽根を用いて25℃、24時間、穏やかに攪拌して、鱗からコラーゲンを溶出した。これをザルにあげて、鱗残渣と分離した後、更に遠心分離(10000G、60min)により上澄を回収して微細な鱗残渣と分離した。これに、ペプシンを0.5g添加し、25℃、24時間保持した。 To this, 24 g of pepsin (Wako Pure Chemicals 1: 10000) was added and gently stirred at 25 ° C. for 24 hours using a stirring blade to elute collagen from the scales. This was raised to a monkey and separated from the scale residue, and the supernatant was further collected by centrifugation (10000 G, 60 min) to separate it from the fine scale residue. To this, 0.5 g of pepsin was added and held at 25 ° C. for 24 hours.
得られた溶液(2.4kg)を0.45μmのメンブレンフィルターでろ過した後、終濃度が1.0Mになるように塩化ナトリウムを加えて緩やかに攪拌した。25℃、30min静置して塩析した後、遠心分離(10000G,20min)により上澄を除去し、コラーゲンの沈殿物を回収した。この沈殿物にpH2の塩酸溶液400mLを加え、5℃、24時間緩やかに攪拌して溶解した。この塩析精製工程を3回繰り返し、コラーゲン塩酸水溶液を得た。 The obtained solution (2.4 kg) was filtered through a 0.45 μm membrane filter, and then sodium chloride was added to the final concentration of 1.0 M and gently stirred. After salting out by standing at 25 ° C. for 30 min, the supernatant was removed by centrifugation (10000 G, 20 min), and the collagen precipitate was recovered. 400 mL of pH 2 hydrochloric acid solution was added to the precipitate and dissolved by gently stirring at 5 ° C. for 24 hours. This salting-out purification process was repeated three times to obtain a collagen hydrochloric acid aqueous solution.
《製造例2:魚鱗由来のコラーゲンで被覆した細胞培養基材の製造》
前記製造例1で得られたテラピア鱗由来のコラーゲン溶液を、pH3の0.01M酢酸溶液を用いて0.3wt%に希釈した。アイスプレート上で、ポリスチレン製12ウェル細胞培養プレート(FALCON社製)に、前記コラーゲン溶液500μLを薄く広げて、25℃で60分静置した。余分なコラーゲン溶液を除去し、クリーンベンチ内で25℃、60分間乾燥した。
テラピア鱗由来コラーゲンの被覆されたウェルの表面を、位相差顕微鏡で観察した写真を図4Aに示す。50〜200nm程度の太さのコラーゲン線維が、基材と接合し、均一に被覆されていた。
<< Production Example 2: Production of Cell Culture Substrate Coated with Fish Scale Collagen >>
The collagen solution derived from tilapia scale obtained in Production Example 1 was diluted to 0.3 wt% using a 0.01 M acetic acid solution having a pH of 3. On an ice plate, 500 μL of the collagen solution was spread thinly on a polystyrene 12-well cell culture plate (manufactured by FALCON) and allowed to stand at 25 ° C. for 60 minutes. Excess collagen solution was removed and dried in a clean bench at 25 ° C. for 60 minutes.
FIG. 4A shows a photograph of the surface of a well coated with tilapia scale-derived collagen, observed with a phase contrast microscope. Collagen fibers having a thickness of about 50 to 200 nm were bonded to the substrate and uniformly coated.
《比較製造例1:豚由来のコラーゲンで被覆した細胞培養基材の製造》
テラピア鱗由来のコラーゲン溶液(0.3wt%)に代えて、豚由来のコラーゲン(新田ゼラチン製、Cellmatrix Type I−C)溶液(0.03wt%、)を使用したことを除いては、製造例2の操作を繰り返し、豚由来のコラーゲンを被覆したウェルを作成した。
豚由来コラーゲンの被覆されたウェルの表面を、位相差顕微鏡で観察した写真を図4Bに示す。コラーゲン線維は見られず、いくつかの凝集体が見られた。
<< Comparative Production Example 1: Production of cell culture substrate coated with porcine-derived collagen >>
Manufactured except that instead of tilapia scale collagen solution (0.3 wt%), porcine collagen (Nitta Gelatin, Cellmatrix Type I-C) solution (0.03 wt%) was used. The operation of Example 2 was repeated to create a well coated with porcine collagen.
FIG. 4B shows a photograph of the surface of a well coated with porcine collagen, observed with a phase contrast microscope. No collagen fibers were seen and some aggregates were seen.
《実施例1及び比較例1:ヒト骨髄由来間葉系幹細胞からの骨芽細胞への分化》
本実施例では、製造例1で得られた魚類由来コラーゲンで被覆された細胞培養プレートを用いて、ヒト骨髄由来間葉系幹細胞からの骨芽細胞への分化を行った。
(1)実施例1
ヒト骨髄由来間葉系幹細胞(hMSC;Lonza,Lot.No.6F3974)を1.0×104cells/wellで、魚類由来コラーゲンで被覆された細胞培養プレートに播種した。培地は、15%FBS添加α−MEMを用い、37℃、5%CO2雰囲気下で、20時間培養を行った。細胞を回収し、アルカリホスファターゼの活性を測定した。結果を図1に示す。
なお、回収した細胞は、Quant−iTTM Pico GreenR ds DNA assay kit(invitrogen社)を用いてDNA量を定量し、測定したDNA量によりアルカリホスファターゼの活性を補正した。
<< Example 1 and Comparative Example 1: Differentiation of human bone marrow-derived mesenchymal stem cells into osteoblasts >>
In this example, differentiation from human bone marrow-derived mesenchymal stem cells into osteoblasts was performed using the cell culture plate coated with fish-derived collagen obtained in Production Example 1.
(1) Example 1
Human bone marrow-derived mesenchymal stem cells (hMSC; Lonza, Lot. No. 6F3974) were seeded at 1.0 × 10 4 cells / well on a cell culture plate coated with fish-derived collagen. As the medium, α-MEM supplemented with 15% FBS was used and cultured at 37 ° C. in a 5% CO 2 atmosphere for 20 hours. Cells were harvested and alkaline phosphatase activity was measured. The results are shown in FIG.
The collected cells were quantified using a Quant-iT ™ Pico Green R ds DNA assay kit (Invitrogen), and the activity of alkaline phosphatase was corrected based on the measured DNA amount.
(2)比較例1
比較例として、比較製造例1で得られた豚由来のコラーゲンで被覆された細胞培養プレート、又はコラーゲンを被覆していない細胞培養プレートを用いて、骨髄由来間葉系幹細胞を骨芽細胞へ分化を試みた。
魚鱗由来のコラーゲンを被覆した細胞培養プレートに代えて、豚由来のコラーゲンで被覆した細胞培養プレート、又はコラーゲンを被覆していない細胞培養プレートを用いたことを除いては、前記実施例1の操作を繰り返した。結果を図1に示す。
(2) Comparative Example 1
As a comparative example, the bone marrow-derived mesenchymal stem cells are differentiated into osteoblasts using the cell culture plate coated with porcine-derived collagen obtained in Comparative Production Example 1 or the cell culture plate not coated with collagen. Tried.
The operation of Example 1 except that instead of the cell culture plate coated with fish scale-derived collagen, a cell culture plate coated with pig-derived collagen or a cell culture plate not coated with collagen was used. Was repeated. The results are shown in FIG.
図1に示すように、豚由来コラーゲン被覆プレート又は非被覆プレートで培養したヒト骨髄由来間葉系幹細胞は、アルカリホスファターゼの活性が非常に低かった。一方、テラピアの鱗由来のコラーゲンを被覆したプレートによって培養したヒト骨髄由来間葉系幹細胞は、アルカリホスファターゼの活性が高く、テラピアの鱗由来のコラーゲンを被覆したプレートと接触することによって、ヒト骨髄由来間葉系幹細胞は骨芽細胞へ分化した。 As shown in FIG. 1, human bone marrow-derived mesenchymal stem cells cultured on porcine-derived collagen-coated plates or uncoated plates had very low alkaline phosphatase activity. On the other hand, human bone marrow-derived mesenchymal stem cells cultured with a plate coated with tilapia scale-derived collagen have high alkaline phosphatase activity, and contact with a plate coated with tilapia scale-derived collagen leads to human bone marrow. Mesenchymal stem cells differentiated into osteoblasts.
《実施例2及び比較例2:ヒト骨髄由来間葉系幹細胞からの骨芽細胞への分化》
本実施例では、魚類由来コラーゲンで被覆された細胞培養プレートを用いて、3%又は15%のFBS存在下における、ヒト骨髄由来間葉系幹細胞からの骨芽細胞への分化を行った。
(1)実施例2
ヒト骨髄由来間葉系幹細胞(hMSC;Lonza,Lot.No.6F3974)を1.0×104cells/wellで、プレートに播種した。15%FBS添加α−MEMを用い、37℃、5%CO2雰囲気下で、20時間前培養した。
培地を除去し、3%FBS又は15%FBSを含むα−MEM培地に交換した。37℃、5%CO2雰囲気下で、7日間培養した。3日後及び7日後に細胞を回収し、アルカリホスファターゼの活性を測定した。結果を図2A及びB(Dex−3%及びDex−15%)に示す。
なお、回収した細胞について、Quant−iTTM Pico GreenR ds DNA assay kit(invitrogen社)を用いてDNA量を定量し、測定したDNA量によりアルカリホスファターゼの活性を補正した。また、図3A(Dex−3%及びDex−15%)に培養開始3日、7日、及び10日の細胞の増殖をDNA量により示した。
<< Example 2 and Comparative Example 2: Differentiation of human bone marrow-derived mesenchymal stem cells into osteoblasts >>
In this example, differentiation from human bone marrow-derived mesenchymal stem cells into osteoblasts was performed in the presence of 3% or 15% FBS using a cell culture plate coated with fish-derived collagen.
(1) Example 2
Human bone marrow-derived mesenchymal stem cells (hMSC; Lonza, Lot. No. 6F3974) were seeded on a plate at 1.0 × 10 4 cells / well. Pre-culture was performed for 20 hours at 37 ° C. in a 5% CO 2 atmosphere using 15% FBS-added α-MEM.
The medium was removed and replaced with α-MEM medium containing 3% FBS or 15% FBS. The cells were cultured for 7 days under an atmosphere of 37 ° C. and 5% CO 2 . Cells were collected after 3 days and 7 days, and the activity of alkaline phosphatase was measured. The results are shown in FIGS. 2A and B (Dex-3% and Dex-15%).
Note that the collected cells was quantified the amount of DNA using the Quant-iT TM Pico Green R ds DNA assay kit (invitrogen , Inc.) were corrected alkaline phosphatase activity by measuring the amount of DNA. FIG. 3A (Dex-3% and Dex-15%) shows the proliferation of cells on the 3rd, 7th, and 10th days from the start of culture, based on the amount of DNA.
(2)比較例2
比較例として、比較製造例1で得られた豚由来のコラーゲンで被覆された細胞培養プレート、又はコラーゲンを被覆していない細胞培養プレートを用いて、骨髄由来間葉系幹細胞を骨芽細胞へ分化を試みた。
魚鱗由来のコラーゲンを被覆した細胞培養プレートに代えて、豚由来のコラーゲンで被覆した細胞培養プレート、又はコラーゲンを被覆していない細胞培養プレートを用いたことを除いては、前記実施例2の操作を繰り返した。結果を図2A及びB(Dex−3%及びDex−15%)に示す。
なお、回収した細胞について、Quant−iTTM Pico GreenR ds DNA assay kit(invitrogen社)を用いてDNA量を定量し、測定したDNA量によりアルカリホスファターゼの活性を補正した。また、図3B及びC(Dex−3%及びDex−15%)に培養開始3日、7日、及び10日の細胞の増殖をDNA量により示した。
(2) Comparative Example 2
As a comparative example, the bone marrow-derived mesenchymal stem cells are differentiated into osteoblasts using the cell culture plate coated with porcine-derived collagen obtained in Comparative Production Example 1 or the cell culture plate not coated with collagen. Tried.
The procedure of Example 2 was used except that a cell culture plate coated with pig-derived collagen or a cell culture plate not coated with collagen was used instead of the cell culture plate coated with fish scale-derived collagen. Was repeated. The results are shown in FIGS. 2A and B (Dex-3% and Dex-15%).
Note that the collected cells was quantified the amount of DNA using the Quant-iT TM Pico Green R ds DNA assay kit (invitrogen , Inc.) were corrected alkaline phosphatase activity by measuring the amount of DNA. 3B and C (Dex-3% and Dex-15%) show the proliferation of cells on the 3rd, 7th, and 10th days from the start of culture according to the amount of DNA.
図2Aに示すように、豚由来コラーゲン被覆プレート又は非被覆プレートで培養したヒト骨髄由来間葉系幹細胞は、血清濃度3%および15%のいずれも骨芽細胞分化誘導3日後のアルカリホスファターゼの活性が非常に低かった。一方、テラピアの鱗由来のコラーゲンを被覆したプレートによって培養したヒト骨髄由来間葉系幹細胞は、血清濃度3%および15%のいずれも骨芽細胞分化誘導3日後のアルカリホスファターゼの活性が高く、テラピアの鱗由来のコラーゲンを被覆したプレートと接触することによって、ヒト骨髄由来間葉系幹細胞は骨芽細胞へ分化した。
また、図2Bに示すように、豚由来コラーゲン被覆プレート又は非被覆プレートで培養したヒト骨髄由来間葉系幹細胞は、特に血清濃度3%で骨芽細胞分化誘導7日後のアルカリホスファターゼの活性が非常に低かった。一方、テラピアの鱗由来のコラーゲンを被覆したプレートによって培養したヒト骨髄由来間葉系幹細胞は、特に血清濃度3%で骨芽細胞分化誘導7日後のアルカリホスファターゼの活性が高く、テラピアの鱗由来のコラーゲンを被覆したプレートと接触することによって、ヒト骨髄由来間葉系幹細胞は骨芽細胞へ分化した。
As shown in FIG. 2A, human bone marrow-derived mesenchymal stem cells cultured on porcine-derived collagen-coated plates or uncoated plates showed alkaline phosphatase activity 3 days after induction of osteoblast differentiation at both serum concentrations of 3% and 15%. Was very low. On the other hand, human bone marrow-derived mesenchymal stem cells cultured on a plate coated with collagen derived from tilapia scales have high alkaline phosphatase activity 3 days after induction of osteoblast differentiation at both serum concentrations of 3% and 15%. The human bone marrow-derived mesenchymal stem cells differentiated into osteoblasts by contacting with a plate coated with collagen derived from human scales.
As shown in FIG. 2B, human bone marrow-derived mesenchymal stem cells cultured on porcine-derived collagen-coated plates or uncoated plates have particularly high alkaline phosphatase activity 7 days after induction of osteoblast differentiation at a serum concentration of 3%. It was low. On the other hand, human bone marrow-derived mesenchymal stem cells cultured on a plate coated with collagen derived from tilapia scales have particularly high alkaline phosphatase activity 7 days after osteoblast differentiation induction at a serum concentration of 3%. The human bone marrow-derived mesenchymal stem cells differentiated into osteoblasts by contact with the collagen-coated plate.
《実施例3及び比較例3:ヒト骨髄由来間葉系幹細胞からの骨芽細胞への分化》
本実施例では、魚類由来コラーゲンで被覆された細胞培養プレート及び骨芽細胞分化誘導因子(デキサメタゾン)を用いて、ヒト骨髄由来間葉系幹細胞からの骨芽細胞への分化を行った。
(1)実施例3
ヒト骨髄由来間葉系幹細胞(hMSC;Lonza,Lot.No.6F3974)を1.0×104cells/wellで、プレートに播種した。15%FBS添加α−MEMを用い、37℃、5%CO2雰囲気下で、20時間培養した。
培地を除去し、3%FBS又は15%FBS、及び10nM デキサメタゾン、50μg/mL L−アスコルビン酸、10mM β−グリセロリン酸を含むα−MEM培地に交換した。37℃、5%CO2雰囲気下で、7日間培養した。3日後及び7日後に細胞を回収し、アルカリホスファターゼの活性を測定した。結果を図2A及びB(Dex+3%及びDex+15%)に示す。
なお、回収した細胞について、Quant−iTTM Pico GreenR ds DNA assay kit(invitrogen社)を用いてDNA量を定量し、測定したDNA量によりアルカリホスファターゼの活性を補正した。また、図3A(Dex+3%及びDex+15%)に培養開始3日、7日、及び10日の細胞の増殖をDNA量により示した。
<< Example 3 and Comparative Example 3: Differentiation of Human Bone Marrow-Derived Mesenchymal Stem Cells into Osteoblasts >>
In this example, differentiation from human bone marrow-derived mesenchymal stem cells into osteoblasts was performed using a cell culture plate coated with fish-derived collagen and an osteoblast differentiation inducing factor (dexamethasone).
(1) Example 3
Human bone marrow-derived mesenchymal stem cells (hMSC; Lonza, Lot. No. 6F3974) were seeded on a plate at 1.0 × 10 4 cells / well. Using α-MEM containing 15% FBS, the cells were cultured for 20 hours at 37 ° C. in a 5% CO 2 atmosphere.
The medium was removed and replaced with α-MEM medium containing 3% FBS or 15% FBS and 10 nM dexamethasone, 50 μg / mL L-ascorbic acid, 10 mM β-glycerophosphate. The cells were cultured for 7 days under an atmosphere of 37 ° C. and 5% CO 2 . Cells were collected after 3 days and 7 days, and the activity of alkaline phosphatase was measured. The results are shown in FIGS. 2A and B (Dex + 3% and Dex + 15%).
Note that the collected cells was quantified the amount of DNA using the Quant-iT TM Pico Green R ds DNA assay kit (invitrogen , Inc.) were corrected alkaline phosphatase activity by measuring the amount of DNA. In addition, FIG. 3A (Dex + 3% and Dex + 15%) shows the proliferation of cells on the 3rd, 7th, and 10th days from the start of culture according to the amount of DNA.
(2)比較例3
比較例として、比較製造例1で得られた豚由来のコラーゲンで被覆された細胞培養プレート、又はコラーゲンを被覆していない細胞培養プレートを用いて、骨髄由来間葉系幹細胞の骨芽細胞への分化を試みた。
魚鱗由来のコラーゲンを被覆した細胞培養プレートに代えて、豚由来のコラーゲンで被覆した細胞培養プレート、又はコラーゲンを被覆していない細胞培養プレートを用いたことを除いては、前記実施例3の操作を繰り返した。結果を図2A及びBに示す。
なお、回収した細胞について、Quant−iTTM Pico GreenR ds DNA assay kit(invitrogen社)を用いてDNA量を定量し、測定したDNA量によりアルカリホスファターゼの活性を補正した。また、図3B及びC(Dex+3%及びDex+15%)に培養開始3日、7日、及び10日の細胞の増殖をDNA量により示した。
(2) Comparative Example 3
As a comparative example, using a cell culture plate coated with porcine collagen obtained in Comparative Production Example 1 or a cell culture plate not coated with collagen, bone marrow-derived mesenchymal stem cells were transformed into osteoblasts. Tried differentiation.
The procedure of Example 3 was used except that a cell culture plate coated with pig-derived collagen or a cell culture plate not coated with collagen was used instead of the cell culture plate coated with fish scale-derived collagen. Was repeated. The results are shown in FIGS.
Note that the collected cells was quantified the amount of DNA using the Quant-iT TM Pico Green R ds DNA assay kit (invitrogen , Inc.) were corrected alkaline phosphatase activity by measuring the amount of DNA. Also, in FIGS. 3B and C (Dex + 3% and Dex + 15%), the proliferation of cells on the 3rd, 7th, and 10th days from the start of culture was shown by the amount of DNA.
図2Aに示すように、豚由来コラーゲン被覆プレート又は非被覆プレートで培養したヒト骨髄由来間葉系幹細胞は、血清濃度3%および15%のいずれも骨芽細胞分化誘導3日後のアルカリホスファターゼの活性が非常に低かった。一方、テラピアの鱗由来のコラーゲンを被覆したプレートによって培養したヒト骨髄由来間葉系幹細胞は、血清濃度3%および15%のいずれも骨芽細胞分化誘導3日後のアルカリホスファターゼの活性が高かった。
また、図2Bに示すように、豚由来コラーゲン被覆プレート又は非被覆プレートで培養したヒト骨髄由来間葉系幹細胞は、血清濃度3%および15%のいずれも骨芽細胞分化誘導7日後のアルカリホスファターゼの活性が非常に低かった。一方、テラピアの鱗由来のコラーゲンを被覆したプレートによって培養したヒト骨髄由来間葉系幹細胞は、血清濃度3%および15%のいずれも骨芽細胞分化誘導7日後のアルカリホスファターゼの活性が高かった。
As shown in FIG. 2A, human bone marrow-derived mesenchymal stem cells cultured on porcine-derived collagen-coated plates or uncoated plates showed alkaline phosphatase activity 3 days after induction of osteoblast differentiation at both serum concentrations of 3% and 15%. Was very low. On the other hand, human bone marrow-derived mesenchymal stem cells cultured on a plate coated with tilapia scale-derived collagen had high alkaline phosphatase activity 3 days after induction of osteoblast differentiation at both serum concentrations of 3% and 15%.
In addition, as shown in FIG. 2B, human bone marrow-derived mesenchymal stem cells cultured on porcine-derived collagen-coated plates or uncoated plates are alkaline phosphatase 7 days after induction of osteoblast differentiation at both serum concentrations of 3% and 15%. The activity of was very low. On the other hand, human bone marrow-derived mesenchymal stem cells cultured on a plate coated with tilapia scale-derived collagen had high alkaline phosphatase activity 7 days after induction of osteoblast differentiation at both serum concentrations of 3% and 15%.
(実施例2及び3の結果)
図2Aに示すように、3%FBS存在下又は15%FBS存在下(実施例2)において、魚類由来コラーゲン被覆細胞培養プレートとの接触により、培養開始3日後のヒト骨髄由来間葉系幹細胞のアルカリホスファターゼの活性が上昇しており、ヒト骨髄由来間葉系幹細胞は骨芽細胞へ分化したことが確認された。特に、3%FBS存在下でのアルカリホスファターゼの活性の上昇が大きかった。しかしながら、豚由来コラーゲン被覆プレート又は非被覆プレートとの接触では、ヒト骨髄由来間葉系幹細胞のアルカリホスファターゼの活性は、3%FBS存在下又は15%FBS存在下においても実施例2の1/6以下であり、骨芽細胞への分化は確認できなかった。
更に骨芽細胞分化誘導因子であるデキサメタゾンを添加した実施例3においても、培養開始3日後及び7日後に、魚類由来コラーゲン被覆細胞培養プレートとの接触により、ヒト骨髄由来間葉系幹細胞のアルカリホスファターゼの活性が上昇した(図2A及びB)。デキサメタゾンを添加しない場合と同じように、3%FBS存在下でのアルカリホスファターゼの活性の上昇が大きかった。しかしながら、デキサメタゾンを添加した場合においても、豚由来コラーゲン被覆プレート又は非被覆プレートとの接触では、ヒト骨髄由来間葉系幹細胞のアルカリホスファターゼの活性の上昇は少なく、3日後においても実施例3の1/6以下であり、7日後において、若干アルカリホスファターゼの活性が上昇したのみであった。
すなわち、本発明の方法によれば、魚類由来コラーゲン被覆細胞培養プレートとの接触の初期段階で、ヒト骨髄由来間葉系幹細胞は骨芽細胞への強力な初期分化誘導が起こることがわかった。豚由来のコラーゲンで被覆した細胞培養プレートでは、骨芽細胞への分化は、観察されなかった。更に、魚類由来コラーゲン被覆細胞培養プレートとの接触による間葉系幹細胞の骨芽細胞への分化は、代表的な骨芽細胞分化誘導因子であるデキサメタゾンと比較しても強いものであった。
なお、図3に示すように、細胞の増殖(DNA量)は、魚類由来コラーゲン被覆細胞培養プレート、豚由来コラーゲン被覆プレート又は非被覆プレートのいずれを用いた場合においても、大きな差は見られなかった。従って、魚類由来コラーゲン被覆細胞培養プレートとの接触によるヒト骨髄由来間葉系幹細胞は骨芽細胞へ分化は、細胞の増殖とは関係なく起きているものであると考えられる。
(Results of Examples 2 and 3)
As shown in FIG. 2A, in the presence of 3% FBS or 15% FBS (Example 2), human bone marrow-derived mesenchymal stem cells 3 days after the start of culture by contact with a fish-derived collagen-coated cell culture plate. Alkaline phosphatase activity was elevated, confirming that human bone marrow-derived mesenchymal stem cells differentiated into osteoblasts. In particular, the increase in the activity of alkaline phosphatase in the presence of 3% FBS was large. However, when contacted with a porcine-derived collagen-coated plate or an uncoated plate, the activity of alkaline phosphatase in human bone marrow-derived mesenchymal stem cells is 1/6 of Example 2 even in the presence of 3% FBS or 15% FBS. It was as follows, and differentiation into osteoblasts could not be confirmed.
Further, in Example 3 to which dexamethasone, which is an osteoblast differentiation inducing factor, was added, alkaline phosphatase of human bone marrow-derived mesenchymal stem cells was contacted with the fish-derived collagen-coated cell culture plate 3 days and 7 days after the start of culture. Activity increased (FIGS. 2A and B). As in the case where dexamethasone was not added, the increase in alkaline phosphatase activity in the presence of 3% FBS was large. However, even when dexamethasone is added, the activity of alkaline phosphatase of human bone marrow-derived mesenchymal stem cells is small in contact with porcine-derived collagen-coated plates or non-coated plates, and even after 3 days, 1 of Example 3 The activity of alkaline phosphatase was only slightly increased after 7 days.
That is, according to the method of the present invention, it was found that human bone marrow-derived mesenchymal stem cells are strongly induced to differentiate into osteoblasts at the initial stage of contact with the fish-derived collagen-coated cell culture plate. No differentiation into osteoblasts was observed in cell culture plates coated with porcine collagen. Furthermore, differentiation of mesenchymal stem cells into osteoblasts by contact with a fish-derived collagen-coated cell culture plate was stronger than that of dexamethasone, which is a typical osteoblast differentiation inducing factor.
As shown in FIG. 3, there is no significant difference in cell proliferation (DNA amount) when using any of the fish-derived collagen-coated cell culture plate, pig-derived collagen-coated plate, or uncoated plate. It was. Therefore, it is considered that differentiation of human bone marrow-derived mesenchymal stem cells by contact with a fish-derived collagen-coated cell culture plate occurs regardless of cell proliferation.
《実施例4及び比較例4:骨分化マーカー遺伝子の発現》
本実施例では、実施例1におけるヒト骨髄由来間葉系幹細胞の骨芽細胞へ分化を、骨分化マーカー遺伝子のmRNAの検出によって確認した。
(1)実施例4
ヒト骨髄由来間葉系幹細胞(hMSC;Lonza,Lot.No.6F3974)を1.0×104cells/wellで、製造例2で得られたプレートに播種した。培地は、15%FBS含有α−MEMを用い、37℃、5%CO2雰囲気下、20時間前培養を行った。細胞からRNeasy Micro Kit(QIAGEN社)を用い、添付のプロトコールに従ってトータルRNAを回収した。Transcriptor First Strand cDNA Synthesis Kit(Roche)を用いて、得られたトータルRNAからcDNAを合成した。合成されたcDNAを鋳型として、bone morohogenetic protein 2(BMP2)、及びOsteopontin(SPP1)の発現を、THUNDERBIRD SYBR qPCR Mix(TOYOBO)を用い、リアルタイムPCRで測定した。用いたプライマーは、以下のとおりである。なお、骨芽細胞の分化において発現が変動しないGlyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase(GAPDH)を、コントロールとして測定した。結果を図5A及びBに示す。
<< Example 4 and Comparative Example 4: Expression of bone differentiation marker gene >>
In this example, the differentiation of human bone marrow-derived mesenchymal stem cells in Example 1 into osteoblasts was confirmed by detection of the bone differentiation marker gene mRNA.
(1) Example 4
Human bone marrow-derived mesenchymal stem cells (hMSC; Lonza, Lot. No. 6F3974) were seeded at 1.0 × 10 4 cells / well on the plate obtained in Production Example 2. As the medium, α-MEM containing 15% FBS was used and precultured at 37 ° C. in a 5% CO 2 atmosphere for 20 hours. Total RNA was recovered from the cells using RNeasy Micro Kit (QIAGEN) according to the attached protocol. Using Transcriptor First Strand cDNA Synthesis Kit (Roche), cDNA was synthesized from the obtained total RNA. Using the synthesized cDNA as a template, the expression of bone morohogenetic protein 2 (BMP2) and Osteopontin (SPP1) was measured by real-time PCR using THUNDERBIRD SYBR qPCR Mix (TOYOBO). The primers used are as follows. In addition, Glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase (GAPDH) whose expression does not change during osteoblast differentiation was measured as a control. The results are shown in FIGS.
BMP2
Forward primer:5’- TCA AGC CAA ACA CAA ACA GC -3’
Reverse primer:5’- ACG TCT GAA CAA TGG CAT GA -3’
増幅されるPCR産物の長さは、200bpである。
Osteopontin (SPP1)
Forward primer:5’- TTC GCA GAC CTG ACA TCC AGT ACC C -3’
Reverse primer:5’- GGG GAT GGC CTT GTA TGC ACC ATT C -3’
増幅されるPCR産物の長さは、98bpである。
GAPDH
Forward primer:5’- CAT GGA GAA GGC TGG GGC TCA TTT G -3’
Reverse primer:5’- GTT CAC ACC CAT GAC GAA CAT GGG G -3’
増幅されるPCR産物の長さは、97bpである。
BMP2
Forward primer: 5'-TCA AGC CAA ACA CAA ACA GC -3 '
Reverse primer: 5'- ACG TCT GAA CAA TGG CAT GA -3 '
The length of the amplified PCR product is 200 bp.
Osteopontin (SPP1)
Forward primer: 5'- TTC GCA GAC CTG ACA TCC AGT ACC C -3 '
Reverse primer: 5'- GGG GAT GGC CTT GTA TGC ACC ATT C -3 '
The length of the amplified PCR product is 98 bp.
GAPDH
Forward primer: 5'-CAT GGA GAA GGC TGG GGC TCA TTT G -3 '
Reverse primer: 5'- GTT CAC ACC CAT GAC GAA CAT GGG G -3 '
The length of the amplified PCR product is 97 bp.
(2)比較例4
比較例として、比較製造例1で得られた豚由来のコラーゲンで被覆された細胞培養プレート、又はコラーゲンを被覆していない細胞培養プレートを用いて、BMP2及びSPP1の発現を確認した。
魚鱗由来のコラーゲンを被覆した細胞培養プレートに代えて、豚由来のコラーゲンで被覆した細胞培養プレート、又はコラーゲンを被覆していない細胞培養プレートを用いたことを除いては、前記実施例4の操作を繰り返した。結果を図5A及びBに示す。
(2) Comparative Example 4
As comparative examples, the expression of BMP2 and SPP1 was confirmed using the cell culture plate coated with porcine collagen obtained in Comparative Production Example 1 or the cell culture plate not coated with collagen.
The operation of Example 4 except that a cell culture plate coated with pig-derived collagen or a cell culture plate not coated with collagen was used instead of the cell culture plate coated with fish scale-derived collagen. Was repeated. The results are shown in FIGS.
図5に示すように、豚コラーゲン被膜プレート及び被膜無プレートに比べて、テラピアコラーゲン被膜プレートで培養したhMSCにおけるBMP2及びSPP1の遺伝子発現は、培養(接触)20時間において、極めて高かった。すなわち、ヒト骨髄由来間葉系幹細胞は、テラピアの鱗由来のコラーゲンを被覆したプレートとの接触の初期に、骨芽細胞へ分化した。 As shown in FIG. 5, gene expression of BMP2 and SPP1 in hMSCs cultured on tilapia collagen-coated plates was extremely high at 20 hours of culture (contact) compared to porcine collagen-coated plates and non-coated plates. That is, human bone marrow-derived mesenchymal stem cells differentiated into osteoblasts at the beginning of contact with a plate coated with collagen derived from tilapia scales.
《実施例5及び比較例5:骨分化マーカー遺伝子の発現》
本実施例では、実施例2及び3におけるヒト骨髄由来間葉系幹細胞の骨芽細胞へ分化を、骨分化マーカー遺伝子のmRNAの検出によって確認した。
ヒト骨髄由来間葉系幹細胞(hMSC;Lonza,Lot.No.6F3974)を1.0×104cells/wellで、製造例2で得られたプレートに播種した。培地は、15%FBS含有α−MEMを用い、37℃、5%CO2雰囲気下、20時間前培養を行った。培地を除去し、骨分化誘導因子(10nM デキサメタゾン),50μg/mL L−アスコルビン酸及び10mM β−グリセロリン酸を添加したもの及び骨分化誘導因子を添加していない3%FBS又は15%FBS含有α−MEMに置換した。3日目に細胞を回収し、細胞からRNeasy Micro Kit(QIAGEN社)を用い、添付のプロトコールに従ってトータルRNAを回収した。Transcriptor First Strand cDNA Synthesis Kit(Roche)を用いて、得られたトータルRNAからcDNAを合成した。合成されたcDNAを鋳型として、bone morohogenetic protein 2(BMP2)、及びOsteopontin(SPP1)の発現を、THUNDERBIRD SYBR qPCR Mix(TOYOBO)を用い、リアルタイムPCRで測定した。プライマーは、前記実施例4に記載のプライマーを用いた。結果を図6A及びBに示す。
<< Example 5 and Comparative Example 5: Expression of a bone differentiation marker gene >>
In this example, the differentiation of human bone marrow-derived mesenchymal stem cells in Examples 2 and 3 into osteoblasts was confirmed by detection of mRNA of a bone differentiation marker gene.
Human bone marrow-derived mesenchymal stem cells (hMSC; Lonza, Lot. No. 6F3974) were seeded at 1.0 × 10 4 cells / well on the plate obtained in Production Example 2. As the medium, α-MEM containing 15% FBS was used and precultured at 37 ° C. in a 5% CO 2 atmosphere for 20 hours. The medium was removed, bone differentiation-inducing factor (10 nM dexamethasone), 50 μg / mL L-ascorbic acid and 10 mM β-glycerophosphate added, and bone differentiation-inducing factor-free 3% FBS or α containing 15% FBS -Replaced with MEM. Cells were collected on the third day, and total RNA was collected from the cells using RNeasy Micro Kit (QIAGEN) according to the attached protocol. Using Transcriptor First Strand cDNA Synthesis Kit (Roche), cDNA was synthesized from the obtained total RNA. Using the synthesized cDNA as a template, the expression of bone morohogenetic protein 2 (BMP2) and Osteopontin (SPP1) was measured by real-time PCR using THUNDERBIRD SYBR qPCR Mix (TOYOBO). The primer described in Example 4 was used as the primer. The results are shown in FIGS. 6A and B.
(2)比較例5
比較例として、比較製造例1で得られた豚由来のコラーゲンで被覆された細胞培養プレート、又はコラーゲンを被覆していない細胞培養プレートを用いて、BMP2及びSPP1の発現を確認した。
魚鱗由来のコラーゲンを被覆した細胞培養プレートに代えて、豚由来のコラーゲンで被覆した細胞培養プレート、又はコラーゲンを被覆していない細胞培養プレートを用いたことを除いては、前記実施例4の操作を繰り返した。結果を図6A及びBに示す。
(2) Comparative Example 5
As comparative examples, the expression of BMP2 and SPP1 was confirmed using the cell culture plate coated with porcine collagen obtained in Comparative Production Example 1 or the cell culture plate not coated with collagen.
The operation of Example 4 except that a cell culture plate coated with pig-derived collagen or a cell culture plate not coated with collagen was used instead of the cell culture plate coated with fish scale-derived collagen. Was repeated. The results are shown in FIGS. 6A and B.
図6に示すように、テラピアの鱗由来のコラーゲンを被覆したプレートとの培養(接触)の初期と比較するとBMP2及びSPP1のmRNAの発現は減少した。しかしながら、豚由来コラーゲン被覆プレート又は非被覆プレートで培養したヒト骨髄由来間葉系幹細胞と比較して、テラピアの鱗由来のコラーゲンを被覆したプレートによって培養したヒト骨髄由来間葉系幹細胞は、BMP2及びSPP1のmRNAの発現が高かった。特に、3%FBS存在下で培養した場合、MP2及びSPP1のmRNAの発現が高かった。 As shown in FIG. 6, the expression of BMP2 and SPP1 mRNA decreased compared to the initial stage of culture (contact) with a plate coated with collagen derived from tilapia scales. However, compared to human bone marrow-derived mesenchymal stem cells cultured on porcine-derived collagen-coated plates or uncoated plates, human bone marrow-derived mesenchymal stem cells cultured on plates coated with tilapia scale-derived collagen are BMP2 and The expression of SPP1 mRNA was high. In particular, when cultured in the presence of 3% FBS, the expression of MP2 and SPP1 mRNA was high.
BMP2及びOsteopontinは骨芽細胞への分化の初期段階で高発現する遺伝子であることから、魚類由来コラーゲン被膜培養プレートとの接触初期段階で、hMSCは骨芽細胞へ分化することが骨分化マーカー遺伝子の発現からも示された。 Since BMP2 and Osteopontin are genes that are highly expressed in the early stage of differentiation into osteoblasts, it is a bone differentiation marker gene that hMSCs differentiate into osteoblasts at the initial stage of contact with the fish-derived collagen-coated culture plate. It was also shown from the expression of.
《製造例3:魚鱗由来のコラーゲンで被覆した細胞培養基材の製造》
本製造例では、テラピア由来のコラーゲンを塩酸で希釈し、骨芽細胞分化誘導用培養基材を製造した。
テラピア鱗由来のコラーゲン溶液(0.3重量%/0.01M HCl)500μLを、ポリスチレン製12ウェル細胞培養プレート(FALCON社製)に薄く広げて、25℃で60分静置した。余分なコラーゲン溶液を除去し、クリーンベンチ内で25℃、60分間乾燥した。
<< Production Example 3: Production of Cell Culture Substrate Coated with Fish Scale Collagen >>
In this production example, collagen from tilapia was diluted with hydrochloric acid to produce a culture substrate for inducing osteoblast differentiation.
500 μL of tilapia scale-derived collagen solution (0.3 wt% / 0.01 M HCl) was thinly spread on a polystyrene 12-well cell culture plate (manufactured by FALCON) and allowed to stand at 25 ° C. for 60 minutes. Excess collagen solution was removed and dried in a clean bench at 25 ° C. for 60 minutes.
《比較製造例2:豚由来のコラーゲンで被覆した細胞培養基材の製造》
本比較製造例では、豚由来のコラーゲンを塩酸で希釈し、0.3wt%の濃度で被覆し、細胞培養基材を製造した。
テラピア鱗由来のコラーゲン溶液(0.3wt%)に代えて、豚由来のコラーゲン(新田ゼラチン製、Cellmatrix Type I−C)溶液(0.3wt%、)を使用したことを除いては、製造例3の操作を繰り返し、豚由来のコラーゲンを被覆したウェルを作成した。
<< Comparative Production Example 2: Production of Cell Culture Substrate Coated with Pig-derived Collagen >>
In this comparative production example, pig-derived collagen was diluted with hydrochloric acid and coated at a concentration of 0.3 wt% to produce a cell culture substrate.
Manufactured except that instead of tilapia scale collagen solution (0.3 wt%), porcine collagen (Nitta Gelatin, Cellmatrix Type I-C) solution (0.3 wt%) was used. The operation of Example 3 was repeated to produce wells coated with porcine collagen.
《実施例6及び比較例6:ヒト骨髄由来間葉系幹細胞からの骨芽細胞への分化》
本実施例では、製造例3で得られた魚類由来コラーゲンで被覆された細胞培養プレートを用いて、ヒト骨髄由来間葉系幹細胞からの骨芽細胞への分化を行った。
(1)実施例6
製造例2で得られたプレートに代えて製造例3で得られたプレートを用いたこと、15%FBS含有α−MEMに代えて10%FBS添加D−MEM(high−glucose)を用いたこと、を除いては、実施例1の操作を繰り返した。結果を図7Aに示す。
<< Example 6 and Comparative Example 6: Differentiation of human bone marrow-derived mesenchymal stem cells into osteoblasts >>
In this example, differentiation from human bone marrow-derived mesenchymal stem cells into osteoblasts was performed using the cell culture plate coated with fish-derived collagen obtained in Production Example 3.
(1) Example 6
The plate obtained in Production Example 3 was used in place of the plate obtained in Production Example 2, and D-MEM (high-glucose) added with 10% FBS was used instead of α-MEM containing 15% FBS. Except for, the operation of Example 1 was repeated. The results are shown in FIG. 7A.
(2)比較例6
比較例として、比較製造例2で得られた豚由来のコラーゲンで被覆された細胞培養プレート、又はコラーゲンを被覆していない細胞培養プレートを用いて、骨髄由来間葉系幹細胞を骨芽細胞へ分化を試みた。
製造例3で得られたプレートに代えて、比較製造例2で得られたプレート又はコラーゲンを被覆していない細胞培養プレートを用いたことを除いては、実施例6の操作を繰り返した。結果を図7Aに示す。
(2) Comparative Example 6
As a comparative example, bone marrow-derived mesenchymal stem cells are differentiated into osteoblasts using the cell culture plate coated with porcine-derived collagen obtained in Comparative Production Example 2 or the cell culture plate not coated with collagen. Tried.
The procedure of Example 6 was repeated except that the plate obtained in Comparative Production Example 2 or the cell culture plate not coated with collagen was used in place of the plate obtained in Production Example 3. The results are shown in FIG. 7A.
図7Aに示すように、豚由来コラーゲン被覆プレート又は非被覆プレートで培養したヒト骨髄由来間葉系幹細胞は、アルカリホスファターゼの活性が非常に低かった。一方、テラピアの鱗由来のコラーゲンを被覆したプレートによって培養したヒト骨髄由来間葉系幹細胞は、アルカリホスファターゼの活性が高く、テラピアの鱗由来のコラーゲンを被覆したプレートと接触することによって、ヒト骨髄由来間葉系幹細胞は骨芽細胞へ分化した。 As shown in FIG. 7A, human bone marrow-derived mesenchymal stem cells cultured on porcine-derived collagen-coated plates or uncoated plates had very low alkaline phosphatase activity. On the other hand, human bone marrow-derived mesenchymal stem cells cultured with a plate coated with tilapia scale-derived collagen have high alkaline phosphatase activity, and contact with a plate coated with tilapia scale-derived collagen leads to human bone marrow. Mesenchymal stem cells differentiated into osteoblasts.
《実施例7及び比較例7:ヒト骨髄由来間葉系幹細胞からの骨芽細胞への分化》
本実施例では、魚類由来コラーゲンで被覆された細胞培養プレートを用いて、3%FBS存在下における、ヒト骨髄由来間葉系幹細胞からの骨芽細胞への分化を行った。
(1)実施例7
製造例2で得られたプレートに代えて製造例3で得られたプレートを用いたこと、15%FBS含有α−MEMに代えて10%FBS添加D−MEM(high−glucose)を用いたこと、3%又は15%FBSを含むα−MEM培地に代えて3%FBSを含むD−MEM(high−glucose)培地を用いたことを除いては、実施例2の操作を繰り返した。細胞の回収は3日後に行った。結果を図7B(Dex(−))に示す。
<< Example 7 and Comparative Example 7: Differentiation of human bone marrow-derived mesenchymal stem cells into osteoblasts >>
In this example, differentiation from human bone marrow-derived mesenchymal stem cells into osteoblasts was performed in the presence of 3% FBS using a cell culture plate coated with fish-derived collagen.
(1) Example 7
The plate obtained in Production Example 3 was used in place of the plate obtained in Production Example 2, and D-MEM (high-glucose) added with 10% FBS was used instead of α-MEM containing 15% FBS. The procedure of Example 2 was repeated except that D-MEM (high-glucose) medium containing 3% FBS was used instead of α-MEM medium containing 3% or 15% FBS. Cells were collected after 3 days. The results are shown in FIG. 7B (Dex (−)).
(2)比較例7
比較例として、比較製造例2で得られた豚由来のコラーゲンで被覆された細胞培養プレート、又はコラーゲンを被覆していない細胞培養プレートを用いて、骨髄由来間葉系幹細胞を骨芽細胞へ分化を試みた。
製造例3で得られたプレートに代えて、比較製造例2で得られたプレート又はコラーゲンを被覆していない細胞培養プレートを用いたことを除いては、実施例7の操作を繰り返した。結果を図7B(Dex(−))に示す。
(2) Comparative Example 7
As a comparative example, bone marrow-derived mesenchymal stem cells are differentiated into osteoblasts using the cell culture plate coated with porcine-derived collagen obtained in Comparative Production Example 2 or the cell culture plate not coated with collagen. Tried.
The procedure of Example 7 was repeated except that the plate obtained in Comparative Production Example 2 or the cell culture plate not coated with collagen was used in place of the plate obtained in Production Example 3. The results are shown in FIG. 7B (Dex (−)).
《実施例8及び比較例8:ヒト骨髄由来間葉系幹細胞からの骨芽細胞への分化》
本実施例では、魚類由来コラーゲンで被覆された細胞培養プレート及び骨芽細胞分化誘導因子(デキサメタゾン)を用いて、ヒト骨髄由来間葉系幹細胞からの骨芽細胞への分化を行った。
(1)実施例8
製造例2で得られたプレートに代えて製造例3で得られたプレートを用いたこと、15%FBS含有α−MEMに代えて10%FBS添加D−MEM(high−glucose)を用いたこと、3%又は15%FBSを含むα−MEM培地に代えて3%FBSを含むD−MEM(high−glucose)培地を用いたことを除いては、実施例3の操作を繰り返した。細胞の回収は3日後に行った。結果を図7B(Dex(+))に示す。
<< Example 8 and Comparative Example 8: Differentiation of human bone marrow-derived mesenchymal stem cells into osteoblasts >>
In this example, differentiation from human bone marrow-derived mesenchymal stem cells into osteoblasts was performed using a cell culture plate coated with fish-derived collagen and an osteoblast differentiation inducing factor (dexamethasone).
(1) Example 8
The plate obtained in Production Example 3 was used in place of the plate obtained in Production Example 2, and D-MEM (high-glucose) added with 10% FBS was used instead of α-MEM containing 15% FBS. The procedure of Example 3 was repeated except that a D-MEM (high-glucose) medium containing 3% FBS was used instead of the α-MEM medium containing 3% or 15% FBS. Cells were collected after 3 days. The results are shown in FIG. 7B (Dex (+)).
(2)比較例8
比較例として、比較製造例2で得られた豚由来のコラーゲンで被覆された細胞培養プレート、又はコラーゲンを被覆していない細胞培養プレートを用いて、骨髄由来間葉系幹細胞の骨芽細胞への分化を試みた。
製造例3で得られたプレートに代えて、比較製造例2で得られたプレート又はコラーゲンを被覆していない細胞培養プレートを用いたことを除いては、実施例8の操作を繰り返した。結果を図7B(Dex(+))に示す。
(2) Comparative Example 8
As a comparative example, bone marrow-derived mesenchymal stem cells to osteoblasts were obtained using the cell culture plate coated with porcine collagen obtained in Comparative Production Example 2 or the cell culture plate not coated with collagen. Tried differentiation.
The procedure of Example 8 was repeated except that the plate obtained in Comparative Production Example 2 or the cell culture plate not coated with collagen was used in place of the plate obtained in Production Example 3. The results are shown in FIG. 7B (Dex (+)).
(実施例7及び8の結果)
図7(B)に示すように、3%FBS存在下(実施例)において、魚類由来コラーゲン被覆細胞培養プレートとの接触により、培養開始3日後のヒト骨髄由来間葉系幹細胞のアルカリホスファターゼの活性が上昇しており、ヒト骨髄由来間葉系幹細胞は骨芽細胞へ分化したことが確認された。しかしながら、豚由来コラーゲン被覆プレートとの接触では実施例7の1/2以下、非被覆プレートとの接触では、ヒト骨髄由来間葉系幹細胞のアルカリホスファターゼの活性は実施例7の1/5以下であった。
更に骨芽細胞分化誘導因子であるデキサメタゾンを添加した実施例8においても、培養開始3日後に、魚類由来コラーゲン被覆細胞培養プレートとの接触により、ヒト骨髄由来間葉系幹細胞のアルカリホスファターゼの活性が上昇した(図7B)。豚由来コラーゲン被覆プレート又は非被覆プレートとの接触では、ヒト骨髄由来間葉系幹細胞のアルカリホスファターゼの活性の上昇は少なく、3日後においてもそれぞれ実施例8の約1/2、および1/5以下であった。
すなわち、本発明の方法によれば、魚類由来コラーゲン被覆細胞培養プレートとの接触の初期段階で、ヒト骨髄由来間葉系幹細胞は骨芽細胞への強力な初期分化誘導が起こることがわかった。豚由来のコラーゲンで被覆した細胞培養プレートでは、骨芽細胞への分化は、観察されなかった。更に、魚類由来コラーゲン被覆細胞培養プレートとの接触による間葉系幹細胞の骨芽細胞への分化は、代表的な骨芽細胞分化誘導因子であるデキサメタゾンと比較しても強いものであった。
(Results of Examples 7 and 8)
As shown in FIG. 7B, the activity of alkaline phosphatase of human bone marrow-derived mesenchymal stem cells 3 days after the start of culture by contact with a fish-derived collagen-coated cell culture plate in the presence of 3% FBS (Example). It was confirmed that human bone marrow-derived mesenchymal stem cells differentiated into osteoblasts. However, the contact with swine-derived collagen-coated plates is less than 1/2 of Example 7, and the contact with uncoated plates is that the activity of alkaline phosphatase of human bone marrow-derived mesenchymal stem cells is less than 1/5 of Example 7. there were.
Furthermore, also in Example 8 to which dexamethasone, an osteoblast differentiation inducing factor, was added, alkaline phosphatase activity of human bone marrow-derived mesenchymal stem cells was brought into contact with the fish-derived collagen-coated cell culture plate 3 days after the start of culture. Increased (FIG. 7B). In contact with the porcine-derived collagen-coated plate or non-coated plate, the increase in the activity of alkaline phosphatase of human bone marrow-derived mesenchymal stem cells was small, and about 3 times less than or about 1/5 of Example 8 after 3 days Met.
That is, according to the method of the present invention, it was found that human bone marrow-derived mesenchymal stem cells are strongly induced to differentiate into osteoblasts at the initial stage of contact with the fish-derived collagen-coated cell culture plate. No differentiation into osteoblasts was observed in cell culture plates coated with porcine collagen. Furthermore, differentiation of mesenchymal stem cells into osteoblasts by contact with a fish-derived collagen-coated cell culture plate was stronger than that of dexamethasone, which is a typical osteoblast differentiation inducing factor.
《実施例9及び比較例9:骨分化マーカー遺伝子の発現》
本実施例では、実施例6におけるヒト骨髄由来間葉系幹細胞の骨芽細胞へ分化を、骨分化マーカー遺伝子(BMP2及びSPP1)のmRNAの検出によって確認した。
(1)実施例9
製造例2で得られたプレートに代えて製造例3で得られたプレートを用いたこと、15%FBS含有α−MEMに代えて10%FBS含有D−MEM(high−glucose)を用いたことを除いては、実施例4の操作を繰り返した。結果を図8A及びB(Day0)に示す。
<< Example 9 and Comparative Example 9: Expression of a bone differentiation marker gene >>
In this example, the differentiation of human bone marrow-derived mesenchymal stem cells into osteoblasts in Example 6 was confirmed by detection of mRNA of bone differentiation marker genes (BMP2 and SPP1).
(1) Example 9
The plate obtained in Production Example 3 was used instead of the plate obtained in Production Example 2, and D-MEM (high-glucose) containing 10% FBS was used instead of α-MEM containing 15% FBS. Except for, the operation of Example 4 was repeated. The results are shown in FIGS. 8A and B (Day 0).
(2)比較例9
製造例3で得られたプレートに代えて、比較製造例2で得られたプレート又はコラーゲンを被覆していない細胞培養プレートを用いたことを除いては、実施例9の操作を繰り返した。結果を図8A及びB(Day0)に示す。
(2) Comparative Example 9
The procedure of Example 9 was repeated except that the plate obtained in Comparative Production Example 2 or the cell culture plate not coated with collagen was used in place of the plate obtained in Production Example 3. The results are shown in FIGS. 8A and B (Day 0).
図8に示すように、豚コラーゲン被膜プレートおよび被膜無プレートに比べて、テラピアコラーゲン被膜プレートで培養したhMSCにおけるBMP2およびSPP1の遺伝子発現は、培養(接触)20時間において、極めて高かった。すなわち、ヒト骨髄由来間葉系幹細胞は、テラピアの鱗由来のコラーゲンを被覆したプレートとの接触の初期に、骨芽細胞へ分化した。 As shown in FIG. 8, gene expression of BMP2 and SPP1 in hMSCs cultured on tilapia collagen-coated plates was extremely high at 20 hours of culture (contact) compared to porcine collagen-coated plates and non-coated plates. That is, human bone marrow-derived mesenchymal stem cells differentiated into osteoblasts at the beginning of contact with a plate coated with collagen derived from tilapia scales.
《実施例10及び比較例10:骨分化マーカー遺伝子の発現》
本実施例では、実施例7及び8におけるヒト骨髄由来間葉系幹細胞の骨芽細胞へ分化を、骨分化マーカー遺伝子のmRNAの検出によって確認した。
(1)実施例10
製造例2で得られたプレートに代えて製造例3で得られたプレートを用いたこと、3%又は15%FBS含有α−MEMに代えて3%FBS含有D−MEM(high−glucose)を用いたこと、細胞の回収を3日目及び7日目に行ったことを除いては、実施例5(実施例3の10nMデキサメサゾン添加)の操作を繰り返した。結果を図8A及びB(Day3及びDay7)に示す。
<< Example 10 and Comparative Example 10: Expression of bone differentiation marker gene >>
In this example, the differentiation of human bone marrow-derived mesenchymal stem cells in Examples 7 and 8 into osteoblasts was confirmed by detection of mRNA of the bone differentiation marker gene.
(1) Example 10
The plate obtained in Production Example 3 was used instead of the plate obtained in Production Example 2, and 3% or 15% FBS-containing α-MEM was used instead of 3% FBS-containing D-MEM (high-glucose). The procedure of Example 5 (addition of 10 nM dexamethasone of Example 3) was repeated except that it was used and the cells were collected on the third and seventh days. The results are shown in FIGS. 8A and 8B (Day 3 and Day 7).
(2)比較例10
比較例として、比較製造例2で得られた豚由来のコラーゲンで被覆された細胞培養プレート、又はコラーゲンを被覆していない細胞培養プレートを用いて、BMP2及びSPP1の発現を確認した。
魚鱗由来のコラーゲンを被覆した細胞培養プレートに代えて、豚由来のコラーゲンで被覆した細胞培養プレート、又はコラーゲンを被覆していない細胞培養プレートを用いたことを除いては、前記実施例10の操作を繰り返した。結果を図8A及びB(Day3及びDay7)に示す。
(2) Comparative Example 10
As comparative examples, the expression of BMP2 and SPP1 was confirmed using the cell culture plate coated with porcine collagen obtained in Comparative Production Example 2 or the cell culture plate not coated with collagen.
The procedure of Example 10 was used except that a cell culture plate coated with pig-derived collagen or a cell culture plate not coated with collagen was used instead of the cell culture plate coated with fish scale-derived collagen. Was repeated. The results are shown in FIGS. 8A and 8B (Day 3 and Day 7).
図8A及びBに示すように、テラピアの鱗由来のコラーゲンを被覆したプレートとの培養(接触)の初期と比較するとBMP2及びSPP1のmRNAの発現は減少した。 As shown in FIGS. 8A and 8B, the expression of BMP2 and SPP1 mRNA decreased compared to the initial stage of culture (contact) with a plate coated with collagen derived from tilapia scales.
BMP2およびSPP1は骨芽細胞への分化の初期段階で高発現する遺伝子であることから、魚類由来コラーゲン被膜培養プレートとの接触初期段階で、hMSCは骨芽細胞へ分化することが骨分化マーカー遺伝子の発現からも示された。 Since BMP2 and SPP1 are genes that are highly expressed in the early stage of differentiation into osteoblasts, it is a bone differentiation marker gene that hMSCs differentiate into osteoblasts at the initial stage of contact with the fish-derived collagen-coated culture plate. It was also shown from the expression of.
本発明の骨芽細胞分化誘導方法を用いて、間葉系幹細胞から骨芽細胞を誘導することができる。また、本発明の骨芽細胞製造方法を用いて、間葉系幹細胞から骨芽細胞を製造することができる。
更に、本発明によれば、骨芽細胞分化誘導キット及び骨芽細胞製造装置を製造することができる。
Osteoblasts can be induced from mesenchymal stem cells using the osteoblast differentiation inducing method of the present invention. In addition, osteoblasts can be produced from mesenchymal stem cells using the osteoblast production method of the present invention.
Furthermore, according to the present invention, an osteoblast differentiation induction kit and an osteoblast production apparatus can be produced.
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