JP6822668B2 - Method for Embryoid Body Formation of Pluripotent Stem Cell and Composition for Embryoid Body Formation of Pluripotent Stem Cell - Google Patents
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Description
本発明は多能性幹細胞の胚様体形成方法および多能性幹細胞の胚様体形成用組成物に関する。 The present invention relates to a method for forming an embryoid body of pluripotent stem cells and a composition for forming an embryoid body of pluripotent stem cells.
コラーゲンは、真皮、靭帯、腱、骨および軟骨などを構成するタンパク質の1つであって、多細胞生物の細胞外マトリクスの主成分である。研究が進むにつれて、コラーゲンが様々な生理機能を有していることが明らかになり、現在も、コラーゲン分子の新たな生理機能を見出すための研究や、コラーゲン分子の新たな用途を見出すための研究が進められている。 Collagen is one of the proteins that make up the dermis, ligaments, tendons, bones, cartilage, etc., and is the main component of the extracellular matrix of multicellular organisms. As research progressed, it became clear that collagen has various physiological functions, and even now, research for discovering new physiological functions of collagen molecules and research for discovering new uses for collagen molecules. Is underway.
現在までの研究によって、1つのコラーゲン分子は3つのポリペプチド鎖によって構成されており、これら3つのポリペプチド鎖が螺旋構造を形成することによって、1つのコラーゲン分子が形成されていることが明らかになっている。 Studies to date have revealed that one collagen molecule is composed of three polypeptide chains, and that these three polypeptide chains form a helical structure to form one collagen molecule. It has become.
螺旋構造を形成するための各ポリペプチド鎖内の領域は、トリプルヘリカルドメインと呼ばれ、当該トリプルヘリカルドメインは、特徴的なアミノ酸配列を有している。具体的に、トリプルヘリカルドメインは、「Gly−X−Y」にて示されるアミノ酸配列が繰り返し連続して出現するという特徴的なアミノ酸配列を有している。なお、上述した3つのアミノ酸からなるアミノ酸配列において、グリシン以外のアミノ酸、つまりXおよびYは、様々なアミノ酸であり得る。 The region within each polypeptide chain for forming a helical structure is called a triple helical domain, and the triple helical domain has a characteristic amino acid sequence. Specifically, the triple helical domain has a characteristic amino acid sequence in which the amino acid sequence represented by "Gly-XY" appears repeatedly and continuously. In the amino acid sequence consisting of the above-mentioned three amino acids, amino acids other than glycine, that is, X and Y can be various amino acids.
コラーゲン分子のアミノ末端および/またはカルボキシル末端(換言すれば、コラーゲン分子を構成している各ポリペプチド鎖のアミノ末端およびカルボキシル末端)には、コラーゲンの主たる抗原部位であるテロペプチドが存在する。当該テロペプチドは、コラーゲン分子を構成する各ポリペプチド鎖内において、上述したトリプルヘリカルドメインよりもアミノ末端側および/またはカルボキシル末端側に存在している。 At the amino terminus and / or the carboxyl terminus of the collagen molecule (in other words, the amino terminus and the carboxyl terminus of each polypeptide chain constituting the collagen molecule), telopeptide, which is the main antigen site of collagen, is present. The terror peptide is present in each polypeptide chain constituting the collagen molecule on the amino-terminal side and / or the carboxyl-terminal side of the triple helical domain described above.
プロテアーゼなどの酵素を用いて処理することによりコラーゲン分子からテロペプチドを部分的に切除すると、コラーゲン分子の抗原性を低く抑えられることが知られている。このようなテロペプチドが部分的に切除されたコラーゲン分子をアテロコラーゲンと呼ぶ。 It is known that the antigenicity of a collagen molecule can be suppressed to a low level by partially excising the terror peptide from the collagen molecule by treating it with an enzyme such as a protease. A collagen molecule in which such a terror peptide is partially excised is called atelocollagen.
現在までの研究によって、コラーゲン、アテロコラーゲン、および、プロテアーゼによるこれらの分解物、が様々な生理機能を有していることが明らかになり、当該生理機能に基づいたコラーゲン、アテロコラーゲン、および、プロテアーゼによるこれらの分解物の様々な用途が開発されている(例えば、特許文献1および2参照)。 Studies to date have revealed that collagen, atelocollagen, and these degradation products by proteases have various physiological functions, and collagen, atelocollagen, and these by proteases based on the physiological functions. Various uses have been developed for the degradation products of (see, for example, Patent Documents 1 and 2).
特許文献1では、コラーゲンまたはアテロコラーゲンをプロテアーゼ(例えば、ペプシンおよびアクチニダインなど)で処理した分解物を、止血用の医療用材料として用いる技術が開示されている。更に具体的に、特許文献1では、まず、キハダマグロの皮部に対してペプシン処理を施して、アテロコラーゲンを含有している水溶液を取得し、更に、当該水溶液に塩化ナトリウムを加えることによって、アテロコラーゲンを沈殿および回収している。なお、アテロコラーゲンを沈殿物として回収する際に、塩化ナトリウムは、上清と共に除去されることになる。そして、特許文献1では、沈殿物として回収されたアテロコラーゲンに対してアクチニダインによる分解処理を施して分解物を得、当該分解物を、止血用の医療用材料として用いている。 Patent Document 1 discloses a technique for using a decomposition product of collagen or atelocollagen treated with a protease (for example, pepsin and actinidine) as a medical material for hemostasis. More specifically, in Patent Document 1, first, the skin of yellowfin tuna is treated with pepsin to obtain an aqueous solution containing atelocollagen, and further, sodium chloride is added to the aqueous solution to obtain atelocollagen. Precipitated and recovered. When recovering atelocollagen as a precipitate, sodium chloride will be removed together with the supernatant. Then, in Patent Document 1, the atelocollagen recovered as a precipitate is subjected to a decomposition treatment with actinidyne to obtain a decomposition product, and the decomposition product is used as a medical material for hemostasis.
一方、特許文献2では、コラーゲンまたはアテロコラーゲンをプロテアーゼで処理した分解物を、動脈硬化症および動脈硬化症に起因する疾患の予防または治療のための組成物として用いる技術が開示されている。更に具体的に、特許文献2では、ミネラルを除去した後のコラーゲンをプロテアーゼによって分解して得られるコラーゲンの分解物を、動脈硬化症および動脈硬化症に起因する疾患の予防または治療のための組成物として用いる技術が開示されている。 On the other hand, Patent Document 2 discloses a technique in which collagen or a degradation product obtained by treating atelocollagen with a protease is used as a composition for prevention or treatment of arteriosclerosis and diseases caused by arteriosclerosis. More specifically, in Patent Document 2, the decomposition product of collagen obtained by decomposing collagen after removing minerals by protease is used as a composition for prevention or treatment of arteriosclerosis and diseases caused by arteriosclerosis. The technology used as a thing is disclosed.
上述したように、コラーゲンおよびアテロコラーゲンをプロテアーゼによって分解する場合には、塩濃度が低い条件下にて分解することが一般的である。そして、このような塩濃度が低い条件下におけるコラーゲンの分解物またはアテロコラーゲンの分解物のアミノ酸配列は既に決定されており、そのアミノ酸配列は、非特許文献1などに開示されている。 As described above, when collagen and atelocollagen are decomposed by protease, they are generally decomposed under conditions of low salt concentration. The amino acid sequence of the collagen decomposition product or the atelocollagen decomposition product under such a low salt concentration condition has already been determined, and the amino acid sequence is disclosed in Non-Patent Document 1 and the like.
ところで、胚性幹細胞(ES細胞)をin vitroで種々の細胞に分化誘導させる方法として、ES細胞の胚様体を形成させ、当該胚様体を目的の細胞へと分化誘導させる方法が広く用いられている(例えば、特許文献3、非特許文献3、非特許文献4および非特許文献5等)。ES細胞の胚様体を得る方法としては、ハンギングドロップ法(例えば、非特許文献6)や、超親水性処理培養皿を使用した培養方法(例えば、非特許文献4)が一般的である。 By the way, as a method for inducing differentiation of embryonic stem cells (ES cells) into various cells in vitro, a method of forming an embryoid body of ES cells and inducing differentiation of the embryoid body into a target cell is widely used. (For example, Patent Document 3, Non-Patent Document 3, Non-Patent Document 4, Non-Patent Document 5, etc.). As a method for obtaining an embryoid body of ES cells, a hanging drop method (for example, Non-Patent Document 6) and a culture method using a superhydrophilic treated culture dish (for example, Non-Patent Document 4) are generally used.
上述したように、コラーゲン、アテロコラーゲン、および、これらの分解物の生理機能に関する研究が進んでいるが、これらの生理機能の全てが解明されているわけではない。 As mentioned above, research on the physiological functions of collagen, atelocollagen, and their decomposition products is progressing, but not all of these physiological functions have been elucidated.
これらが有する新たな生理機能を見出すことは、医療分野、食品分野、化粧品分野および基礎研究分野などの様々な分野の発展に大きく寄与できるものと考えられる。 It is considered that finding new physiological functions possessed by these can greatly contribute to the development of various fields such as medical field, food field, cosmetics field and basic research field.
本発明は、上記従来の問題点に鑑みなされたものであって、その目的は、新規な生理機能を有するコラーゲンの分解物またはアテロコラーゲンの分解物の利用を提供することにある。 The present invention has been made in view of the above-mentioned conventional problems, and an object of the present invention is to provide a decomposition product of collagen or a decomposition product of atelocollagen having a novel physiological function.
本発明者らは、上記課題に鑑み鋭意検討した結果、特定の構造を有するコラーゲンの分解物またはアテロコラーゲンの分解物を、多能性幹細胞の胚様体を形成させる場合の足場材料として使用し得ることを見出した。そして、この新規知見に基づいて、本発明を完成するに至った。 As a result of diligent studies in view of the above problems, the present inventors can use a decomposition product of collagen having a specific structure or a decomposition product of atelocollagen as a scaffold material for forming an embryoid body of pluripotent stem cells. I found that. Then, based on this new finding, the present invention has been completed.
つまり、上記の課題を解決するために、本発明の一実施形態に係る胚様体形成方法は、多能性幹細胞の胚様体を形成させる方法であって、多能性幹細胞を、コラーゲンの分解物またはアテロコラーゲンの分解物と共に培養する工程を包含し、当該分解物は、上記コラーゲンまたはアテロコラーゲンのトリプルヘリカルドメインの少なくとも一部分を含んでいることを特徴としている。 That is, in order to solve the above-mentioned problems, the embryoid body forming method according to the embodiment of the present invention is a method for forming an embryoid body of pluripotent stem cells, and the pluripotent stem cells are made of collagen. Including the step of culturing with a degradation product or a degradation product of atelocollagen, the degradation product is characterized by containing at least a part of the triple helical domain of the collagen or atelocollagen.
本発明の一実施形態に係る胚様体形成方法では、上記分解物は、以下(A)〜(C)のコラーゲンの分解物またはアテロコラーゲンの分解物の内の少なくとも1種類以上を含有しているものであり得る:
(A)上記コラーゲンまたはアテロコラーゲンのトリプルヘリカルドメイン内の下記(1)にて示されるアミノ酸配列の、X1とX2との間の化学結合、X2とGとの間の化学結合、GとX3との間の化学結合、X4とGとの間の化学結合、または、X6とGとの間の化学結合が切断された、コラーゲンの分解物またはアテロコラーゲンの分解物;
(B)上記コラーゲンまたはアテロコラーゲンのトリプルヘリカルドメイン内の下記(2)にて示されるアミノ酸配列の、X1とX2との間の化学結合、X2とGとの間の化学結合、GとX3との間の化学結合、X4とGとの間の化学結合、X6とGとの間の化学結合、GとX7との間の化学結合、または、X14とGとの間の化学結合が切断された、コラーゲンの分解物またはアテロコラーゲンの分解物;
(C)上記コラーゲンまたはアテロコラーゲンのトリプルヘリカルドメインのアミノ末端の下記(3)にて示されるアミノ酸配列の、Y1とY2との間の化学結合が切断された、コラーゲンの分解物またはアテロコラーゲンの分解物;
(1)−G−X1−X2−G−X3−X4−G−X5−X6−G−;
(2)−G−X1−X2−G−X3−X4−G−X5−X6−G−X7−X8−G−X9−X10−G−X11−X12−G−X13−X14−G−;
(3)−Y1−Y2−Y3−G−Y4−Y5−G−Y6−Y7−G−Y8−Y9−G−;
(但し、Gは、グリシンであり、X1〜X14およびY1〜Y9は、任意のアミノ酸である)。In the embryoid body forming method according to the embodiment of the present invention, the above-mentioned decomposition products contain at least one of the following collagen decomposition products (A) to (C) or atelocollagen decomposition products. Can be:
(A) of the amino acid sequence represented by the following (1) in the triple helical domain of the collagen or atelocollagen, a chemical bond between X 1 and X 2, the chemical bond between X 2 and G, and G chemical bond between X 3, a chemical bond between X 4 and G, or a chemical bond between X 6 and G is disconnected, decomposition product or decomposition product of the atelocollagen of collagen;
(B) the amino acid sequence represented by the following (2) in the triple helical domain of the collagen or atelocollagen, a chemical bond between X 1 and X 2, the chemical bond between X 2 and G, and G chemical bond between X 3, a chemical bond between X 4 and G, chemical bond between X 6 and G, chemical bond between G and X 7, or, between X 14 and G Degradation of collagen or atelocollagen with broken chemical bonds between;
(C) the amino acid sequence represented by the following (3) to the amino terminus of a triple helical domain of the collagen or atelocollagen, a chemical bond between Y 1 and Y 2 is disconnected, the collagen degradation product or atelocollagen Decomposition;
(1) -G-X 1- X 2- G-X 3- X 4- G-X 5- X 6 -G-;
(2) -G-X 1- X 2- G-X 3- X 4- G-X 5- X 6- G-X 7- X 8- G-X 9- X 10- G-X 11- X 12- G-X 13- X 14 -G-;
(3) -Y 1- Y 2- Y 3- G-Y 4- Y 5- G-Y 6- Y 7- G-Y 8- Y 9 -G-;
(However, G is glycine, and X 1 to X 14 and Y 1 to Y 9 are arbitrary amino acids).
本発明の一実施形態に係る胚様体形成方法では、上記(1)または(2)にて示されるアミノ酸配列は、上記トリプルヘリカルドメインのアミノ末端のアミノ酸配列であることが好ましい。 In the embryoid body formation method according to the embodiment of the present invention, the amino acid sequence shown in (1) or (2) above is preferably the amino acid sequence at the amino terminus of the triple helical domain.
本発明の一実施形態に係る胚様体形成方法では、上記(1)〜(3)の何れかにて示されるアミノ酸配列における切断が、上記コラーゲンまたはアテロコラーゲンのα1鎖内およびα2鎖内の少なくとも一方で行われていることが好ましい。 In the embryoid body formation method according to the embodiment of the present invention, the cleavage in the amino acid sequence represented by any of the above (1) to (3) is at least within the α1 chain and the α2 chain of the collagen or atelocollagen. On the other hand, it is preferable that it is performed.
本発明の一実施形態に係る胚様体形成用組成物は、コラーゲンの分解物またはアテロコラーゲンの分解物を含有している多能性幹細胞の胚様体形成用組成物であって、上記分解物は、上記コラーゲンまたはアテロコラーゲンのトリプルヘリカルドメインの少なくとも一部分を含んでいることを特徴としている。 The composition for forming an embryoid body according to an embodiment of the present invention is a composition for forming an embryoid body of pluripotent stem cells containing a decomposition product of collagen or a decomposition product of atelocollagen, and the above-mentioned decomposition product. Is characterized by containing at least a portion of the triple helical domain of the collagen or atelocollagen.
本発明の一実施形態に係る胚様体形成用組成物では、上記分解物は、以下(A)〜(C)のコラーゲンの分解物またはアテロコラーゲンの分解物の内の少なくとも1種類以上を含有しているものであり得る:
(A)上記コラーゲンまたはアテロコラーゲンのトリプルヘリカルドメイン内の下記(1)にて示されるアミノ酸配列の、X1とX2との間の化学結合、X2とGとの間の化学結合、GとX3との間の化学結合、X4とGとの間の化学結合、または、X6とGとの間の化学結合が切断された、コラーゲンの分解物またはアテロコラーゲンの分解物;
(B)上記コラーゲンまたはアテロコラーゲンのトリプルヘリカルドメイン内の下記(2)にて示されるアミノ酸配列の、X1とX2との間の化学結合、X2とGとの間の化学結合、GとX3との間の化学結合、X4とGとの間の化学結合、X6とGとの間の化学結合、GとX7との間の化学結合、または、X14とGとの間の化学結合が切断された、コラーゲンの分解物またはアテロコラーゲンの分解物;
(C)上記コラーゲンまたはアテロコラーゲンのトリプルヘリカルドメインのアミノ末端の下記(3)にて示されるアミノ酸配列の、Y1とY2との間の化学結合が切断された、コラーゲンの分解物またはアテロコラーゲンの分解物;
(1)−G−X1−X2−G−X3−X4−G−X5−X6−G−;
(2)−G−X1−X2−G−X3−X4−G−X5−X6−G−X7−X8−G−X9−X10−G−X11−X12−G−X13−X14−G−;
(3)−Y1−Y2−Y3−G−Y4−Y5−G−Y6−Y7−G−Y8−Y9−G−;
(但し、Gは、グリシンであり、X1〜X14およびY1〜Y9は、任意のアミノ酸である)。In the composition for forming an embryoid body according to an embodiment of the present invention, the above-mentioned decomposition product contains at least one of the following decomposition products of collagen (A) to (C) or decomposition products of atelocollagen. Can be:
(A) of the amino acid sequence represented by the following (1) in the triple helical domain of the collagen or atelocollagen, a chemical bond between X 1 and X 2, the chemical bond between X 2 and G, and G chemical bond between X 3, a chemical bond between X 4 and G, or a chemical bond between X 6 and G is disconnected, decomposition product or decomposition product of the atelocollagen of collagen;
(B) the amino acid sequence represented by the following (2) in the triple helical domain of the collagen or atelocollagen, a chemical bond between X 1 and X 2, the chemical bond between X 2 and G, and G chemical bond between X 3, a chemical bond between X 4 and G, chemical bond between X 6 and G, chemical bond between G and X 7, or, between X 14 and G Degradation of collagen or atelocollagen with broken chemical bonds between;
(C) the amino acid sequence represented by the following (3) to the amino terminus of a triple helical domain of the collagen or atelocollagen, a chemical bond between Y 1 and Y 2 is disconnected, the collagen degradation product or atelocollagen Decomposition;
(1) -G-X 1- X 2- G-X 3- X 4- G-X 5- X 6 -G-;
(2) -G-X 1- X 2- G-X 3- X 4- G-X 5- X 6- G-X 7- X 8- G-X 9- X 10- G-X 11- X 12- G-X 13- X 14 -G-;
(3) -Y 1- Y 2- Y 3- G-Y 4- Y 5- G-Y 6- Y 7- G-Y 8- Y 9 -G-;
(However, G is glycine, and X 1 to X 14 and Y 1 to Y 9 are arbitrary amino acids).
本発明の一実施形態に係る胚様体形成用組成物では、上記(1)または(2)にて示されるアミノ酸配列は、上記トリプルヘリカルドメインのアミノ末端のアミノ酸配列であることが好ましい。 In the composition for embryoid body formation according to one embodiment of the present invention, the amino acid sequence shown in (1) or (2) above is preferably the amino acid sequence at the amino terminus of the triple helical domain.
本発明の一実施形態に係る胚様体形成用組成物では、上記(1)〜(3)の何れかにて示されるアミノ酸配列における切断が、上記コラーゲンまたはアテロコラーゲンのα1鎖内およびα2鎖内の少なくとも一方で行われていることが好ましい。 In the composition for forming an embryoid body according to an embodiment of the present invention, the cleavage in the amino acid sequence represented by any of (1) to (3) above is within the α1 chain and the α2 chain of the collagen or atelocollagen. It is preferable that at least one of the above is performed.
本発明によれば、多能性幹細胞の胚様体を容易に形成させることができるという効果を奏する。また、本発明によれば、従来の胚様体形成方法と比較して、より短期間で胚様体を形成させることができるという効果を奏する。 According to the present invention, there is an effect that the embryoid body of pluripotent stem cells can be easily formed. Further, according to the present invention, it is possible to form an embryoid body in a shorter period of time as compared with a conventional method for forming an embryoid body.
以下、本発明の実施の形態について、詳細に説明する。ただし、本発明はこれに限定されるものではなく、記述した範囲内で種々の変形を加えた態様で実施できるものである。なお、本明細書において特記しない限り、数値範囲を表す「A〜B」は、「A以上、B以下」を意味する。 Hereinafter, embodiments of the present invention will be described in detail. However, the present invention is not limited to this, and can be carried out in a mode in which various modifications are added within the range described. Unless otherwise specified in the present specification, "A to B" representing a numerical range means "A or more and B or less".
〔1.胚様体形成方法〕
本発明の一実施形態に係る胚様体形成方法(以下、「本実施形態の胚様体形成方法」ともいう。)は、多能性幹細胞の胚様体を形成させる方法であって、多能性幹細胞を、コラーゲンの分解物またはアテロコラーゲンの分解物と共に培養する培養工程を包含する構成である。[1. Embryoid body formation method]
The embryoid body forming method according to one embodiment of the present invention (hereinafter, also referred to as “embryoid body forming method of the present embodiment”) is a method for forming an embryoid body of pluripotent stem cells, and is polymorphic. It is a configuration including a culture step of culturing a pluripotent stem cell together with a degradation product of collagen or a degradation product of atelocollagen.
ここで、本明細書において、上記「多能性幹細胞」は、胎盤以外のすべての細胞に分化可能な分化多能性と、自己複製能とを有する細胞である。そのような多能性幹細胞としては、例えば、胚性幹細胞(ES細胞)、核移植により得られるクローン胚由来の胚性幹細胞(核移植ES細胞;ntES細胞)、人工多能性幹細胞(iPS細胞)、胚性生殖細胞(EG細胞)、生体組織に由来する多能性幹細胞(Muse細胞(Multilineage-differentiating Stress Enduring cells))などを挙げることができるが、これらに限定されない。また、上記「多能性幹細胞」としては、例えば、ヒト、カニクイザルなどの霊長類、マウスなどに由来するものが挙げられるが、これらに限定されない。 Here, in the present specification, the above-mentioned "pluripotent stem cell" is a cell having pluripotency capable of differentiating into all cells other than placenta and self-renewal ability. Examples of such pluripotent stem cells include embryonic stem cells (ES cells), embryonic stem cells derived from cloned embryos obtained by nuclear transplantation (nuclear transplanted ES cells; ntES cells), and induced pluripotent stem cells (iPS cells). ), Embryonic stem cells (EG cells), pluripotent stem cells (Multilineage-differentiating Stress Enduring cells) derived from living tissues, and the like, but are not limited thereto. In addition, examples of the above-mentioned "pluripotent stem cells" include, but are not limited to, those derived from humans, primates such as cynomolgus monkeys, and mice.
本明細書において、上記「胚様体」は、多能性幹細胞から形成された球状の細胞塊であって、適切な分化誘導条件下で種々の細胞へ分化する能力を有しているものをいう。「胚様体」は、エンブリオイド・ボディー(Embryoid Body:EB)とも称される。本明細書における「胚様体」には、多能性幹細胞から胚様体が形成される途中の細胞の凝集体である「胚様体様細胞凝集体」も包含される。本明細書において、「胚様体」は、多能性マーカー(例えば、Nanog、OCT3/4(Octamer-binding transcription factor 3/4)、TRA−1−60、SSEA−3(stage-specific embryonic antigen-3)など)を発現していてもよく、また分化マーカー(例えば、SOX1(SRY (sex determining region Y)-box 1)、SOX7(SRY (sex determining region Y)-box 7)、SOX17(SRY (sex determining region Y)-box 17)、HNF-3β(Hepatocyte Nuclear Factor 3β)/FoxA2(forkhead box protein A2)、GATA4(GATA binding protein 4)、GATA6(GATA binding protein 6)、Otx2(Orthodenticle homeobox 2)、CXCR4(Chemokine (C-X-C Motif) Receptor 4)、GSC(goosecoid)など)を発現していてもよい。「胚様体」は、三胚葉(外胚葉、内胚葉、中胚葉)全てに分化できる能力を有していることが好ましい。三胚葉全てに分化できる能力を有している胚様体は、目的の細胞への分化誘導に好適に用いることができる。 In the present specification, the above-mentioned "embryoid body" is a spherical cell mass formed from pluripotent stem cells and having an ability to differentiate into various cells under appropriate differentiation-inducing conditions. Say. The "embryoid body" is also referred to as the Embryoid Body (EB). The "embryoid body" in the present specification also includes an "embryoid body-like cell aggregate" which is an aggregate of cells in the process of forming an embryoid body from pluripotent stem cells. As used herein, the term "embryonic body" refers to pluripotency markers (eg, Nanog, OCT3 / 4 (Octamer-binding transcription factor 3/4), TRA-1-60, SSEA-3 (stage-specific embryonic antigen). -3), etc.) may be expressed, and differentiation markers (for example, SOX1 (SRY (sex determining region Y) -box 1), SOX7 (SRY (sex determining region Y) -box 7), SOX17 (SRY)) may be expressed. (sex determining region Y) -box 17), HNF-3β (Hepatocyte Nuclear Factor 3β) / FoxA2 (forkhead box protein A2), GATA4 (GATA binding protein 4), GATA6 (GATA binding protein 6), Octx2 (Orthodenticle homeobox 2) ), CXCR4 (Chemokine (CXC Motif) Receptor 4), GSC (goosecoid), etc.) may be expressed. The "embryoid body" preferably has the ability to differentiate into all three germ layers (ectoderm, endoderm, mesoderm). An embryoid body having the ability to differentiate into all three germ layers can be suitably used for inducing differentiation into a target cell.
また、「胚様体」の大きさは特に制限されないが、最長径が、50〜1000μmであることが好ましく、100〜500μmであることがより好ましい。「胚様体」の形は特に制限されないが、球形、略球形、楕円形、略楕円形等であることが好ましい。 The size of the "embryoid body" is not particularly limited, but the longest diameter is preferably 50 to 1000 μm, more preferably 100 to 500 μm. The shape of the "embryoid body" is not particularly limited, but is preferably spherical, substantially spherical, elliptical, substantially elliptical, or the like.
本実施形態の胚様体形成方法によって胚様体が形成されたことは、肉眼または顕微鏡下で球状の細胞塊の存在を確認することによって確認することができる。本実施形態の胚様体形成方法によって得られた胚様体が種々の細胞へ分化する能力を有していることは、当該胚様体を、公知の適切な分化誘導条件(例えば、公知の、血液細胞への分化誘導条件、神経細胞への分化誘導条件など)で培養し、胚様体由来の細胞が目的の細胞へと分化したことを確認することによって、確認することができる。胚様体由来の細胞が目的の細胞へと分化したことは、分化した細胞の形態、遺伝子発現などを公知の手法を用いて確認することによって、確認することができる。 The formation of the embryoid body by the embryoid body forming method of the present embodiment can be confirmed by confirming the presence of spherical cell clusters with the naked eye or under a microscope. The ability of the embryoid body obtained by the embryoid body forming method of the present embodiment to differentiate into various cells means that the embryoid body is subjected to known appropriate differentiation-inducing conditions (for example, known known conditions). , Conditions for inducing differentiation into blood cells, conditions for inducing differentiation into nerve cells, etc.), and it can be confirmed by confirming that the embryoid body-derived cells have differentiated into the target cells. It can be confirmed that the embryoid body-derived cells have differentiated into the target cells by confirming the morphology, gene expression, etc. of the differentiated cells by using a known method.
本実施形態の胚様体形成方法において、上記「コラーゲンの分解物またはアテロコラーゲンの分解物」は、コラーゲンまたはアテロコラーゲンのトリプルヘリカルドメインの少なくとも一部分を含んでいる構成である。つまり、上記分解物は、コラーゲンまたはアテロコラーゲンのトリプルヘリカルドメインの全体を含んでいてもよいし、トリプルヘリカルドメインの一部分を含んでいてもよい。「コラーゲンの分解物またはアテロコラーゲンの分解物」については、後段で詳細に説明する。 In the embryoid body formation method of the present embodiment, the above-mentioned "collagen decomposition product or atelocollagen decomposition product" is a configuration containing at least a part of the triple helical domain of collagen or atelocollagen. That is, the degradation product may contain the entire triple helical domain of collagen or atelocollagen, or may contain a portion of the triple helical domain. "Collagen decomposition product or atelocollagen decomposition product" will be described in detail later.
以下に、本実施形態の胚様体形成方法について詳細に説明する。 The embryoid body formation method of the present embodiment will be described in detail below.
(1−1.培養工程)
培養工程は、多能性幹細胞を、コラーゲンの分解物またはアテロコラーゲンの分解物と共に培養する工程である。「多能性幹細胞を、コラーゲンの分解物またはアテロコラーゲンの分解物と共に培養する」とは、コラーゲンの分解物またはアテロコラーゲンの分解物が多能性幹細胞と接触可能に存在している環境中で多能性幹細胞を培養することを意味している。例えば、一実施形態において、コラーゲンの分解物またはアテロコラーゲンの分解物を用いて内面をコートした培養容器を用いて、多能性幹細胞を培養してもよい。また、他の実施形態において、コラーゲンの分解物またはアテロコラーゲンの分解物を含有しているゲル組成物上で多能性幹細胞を培養してもよい。コラーゲンの分解物またはアテロコラーゲンの分解物は、多能性幹細胞と当該多能性幹細胞を培養するための培養容器の内面との接触を妨げるように存在していることが好ましい。これにより、多能性幹細胞の胚様体を効率よく形成することができる。多能性幹細胞を培養するための培養容器は、細胞培養に通常用いられる容器を使用することができる。培養容器は、ディッシュ型のものであってもよく、プレート型、ボトル型のものであってもよい。(1-1. Culture step)
The culturing step is a step of culturing pluripotent stem cells together with a degradation product of collagen or a degradation product of atelocollagen. "Culturing pluripotent stem cells with collagen degradation products or atelocollagen degradation products" means pluripotency in an environment in which collagen degradation products or atelocollagen degradation products are present in contact with pluripotent stem cells. It means culturing sex stem cells. For example, in one embodiment, pluripotent stem cells may be cultured using a culture vessel whose inner surface is coated with a degradation product of collagen or a degradation product of atelocollagen. In other embodiments, pluripotent stem cells may be cultured on a gel composition containing a degradation product of collagen or a degradation product of atelocollagen. The collagen degradation product or the atelocollagen degradation product preferably exists so as to prevent contact between the pluripotent stem cells and the inner surface of the culture vessel for culturing the pluripotent stem cells. As a result, the embryoid body of pluripotent stem cells can be efficiently formed. As the culture vessel for culturing pluripotent stem cells, a vessel usually used for cell culture can be used. The culture container may be a dish type, a plate type, or a bottle type.
本実施形態の胚様体形成方法に使用するコラーゲンの分解物またはアテロコラーゲンの分解物の量は特に限定されない。 The amount of collagen degradation product or atelocollagen degradation product used in the embryoid body formation method of the present embodiment is not particularly limited.
一実施形態において、コラーゲンの分解物またはアテロコラーゲンの分解物を用いて内面をコートした培養容器を用いて、多能性幹細胞を培養する場合は、2mg/mL〜20mg/mL、好ましくは3mg/mL〜16mg/mL、より好ましくは5mg/mL〜15mg/mL、あるいは5mg/mL〜20mg/mL、好ましくは8mg/mL〜16mg/mLのコラーゲンの分解物またはアテロコラーゲンの分解物を含有している水溶液を調製し、当該分解物の水溶液を用いて、培養容器の内面をコートすることができる。培養容器の内面のコートは、多能性幹細胞の培養を開始する前に行えばよい。上記分解物の水溶液における上記分解物の濃度が2mg/mL以上であれば、胚様体を均一に形成することができる。また、上記分解物の水溶液における上記分解物の濃度が20mg/mL以下であれば、再現性が良好となる。これに対して、上記分解物の水溶液における上記分解物の濃度が2mg/mL未満である場合は、胚様体の形成が不均一になる場合がある。また、上記分解物の水溶液における上記分解物の濃度が20mg/mLよりも高い場合は、粘性が高くなり再現性が不良となる場合がある。 In one embodiment, when pluripotent stem cells are cultured using a culture vessel whose inner surface is coated with a decomposition product of collagen or a decomposition product of atelocollagen, 2 mg / mL to 20 mg / mL, preferably 3 mg / mL. An aqueous solution containing ~ 16 mg / mL, more preferably 5 mg / mL ~ 15 mg / mL, or 5 mg / mL ~ 20 mg / mL, preferably 8 mg / mL ~ 16 mg / mL collagen degradation products or atelocollagen degradation products. Can be prepared and the inner surface of the culture vessel can be coated with the aqueous solution of the decomposition product. The inner surface of the culture vessel may be coated before starting the culture of pluripotent stem cells. When the concentration of the decomposed product in the aqueous solution of the decomposed product is 2 mg / mL or more, the embryoid body can be uniformly formed. Further, when the concentration of the decomposed product in the aqueous solution of the decomposed product is 20 mg / mL or less, the reproducibility is good. On the other hand, when the concentration of the decomposition product in the aqueous solution of the decomposition product is less than 2 mg / mL, the formation of embryoid bodies may become non-uniform. Further, when the concentration of the decomposed product in the aqueous solution of the decomposed product is higher than 20 mg / mL, the viscosity may become high and the reproducibility may be poor.
他の実施形態において、コラーゲンの分解物またはアテロコラーゲンの分解物を含有しているゲル組成物上で多能性幹細胞を培養する場合は、最終濃度として、2mg/mL〜15mg/mLまたは5mg/mL〜15mg/mLのコラーゲンの分解物またはアテロコラーゲンの分解物が、ゲル組成物中に含有されていることが好ましく、5mg/mL〜12mg/mLまたは5mg/mL〜11mg/mLのコラーゲンの分解物またはアテロコラーゲンの分解物が、ゲル組成物中に含有されていることがより好ましい。7mg/mL〜10mg/mLまたは8mg/mL〜10mg/mLのコラーゲンの分解物またはアテロコラーゲンの分解物が、ゲル組成物中に含有されていることがよりさらに好ましい。ゲル組成物中に含有されている上記分解物の濃度が、最終濃度として2mg/mL以上であれば、胚様体を均一に形成することができる。また、ゲル組成物中に含有されている上記分解物の濃度が、最終濃度として15mg/mL以下であれば、再現性が良好となる。これに対して、ゲル組成物中に含有されている上記分解物の濃度が、最終濃度として2mg/mL未満である場合は、胚様体の形成が不均一になる場合がある。また、ゲル組成物中に含有されている上記分解物の濃度が、最終濃度として15mg/mLよりも高い場合は、粘性が高くなり再現性が不良となる場合がある。 In other embodiments, when pluripotent stem cells are cultured on a gel composition containing a degradation product of collagen or atelocollagen, the final concentration is 2 mg / mL to 15 mg / mL or 5 mg / mL. It is preferable that a decomposition product of collagen of ~ 15 mg / mL or a decomposition product of atelocollagen is contained in the gel composition, and a decomposition product of collagen of 5 mg / mL to 12 mg / mL or 5 mg / mL to 11 mg / mL or It is more preferable that the decomposition product of atelocollagen is contained in the gel composition. It is even more preferred that a degradation product of 7 mg / mL to 10 mg / mL or 8 mg / mL to 10 mg / mL collagen or atelocollagen degradation product is contained in the gel composition. When the concentration of the above-mentioned decomposition products contained in the gel composition is 2 mg / mL or more as the final concentration, embryoid bodies can be uniformly formed. Further, when the concentration of the decomposed product contained in the gel composition is 15 mg / mL or less as the final concentration, the reproducibility is good. On the other hand, when the concentration of the decomposition product contained in the gel composition is less than 2 mg / mL as the final concentration, the formation of embryoid bodies may become non-uniform. Further, when the concentration of the above-mentioned decomposed product contained in the gel composition is higher than 15 mg / mL as the final concentration, the viscosity may be high and the reproducibility may be poor.
コラーゲンの分解物またはアテロコラーゲンの分解物を含有しているゲル組成物は、例えば、コラーゲンの分解物またはアテロコラーゲンの分解物を、濃縮培養液(例えば、5倍濃縮DMEMなど)と再構成用緩衝液(50mM 水酸化ナトリウム、260mM 炭酸水素ナトリウム、200mM HEPES)と混合し、この混合液を培養皿に添加して、37℃のCO2インキュベーター内で30分間程度静置することによって作製することができる。A gel composition containing a decomposition product of collagen or a decomposition product of atelocollage can be prepared by, for example, combining a decomposition product of collagen or a decomposition product of atelocollagen with a concentrated culture solution (for example, 5-fold concentrated DMEM) and a buffer solution for reconstruction. It can be prepared by mixing with (50 mM sodium hydroxide, 260 mM sodium hydrogen carbonate, 200 mM HEPES), adding this mixed solution to a culture dish, and allowing it to stand in a CO 2 incubator at 37 ° C. for about 30 minutes. ..
培養工程において用いる培地は、多能性幹細胞の培地であれば特に制限されない。このような培地としては、使用する多能性幹細胞の種類に応じて適宜選択することができる。例えば、多能性幹細胞の増殖維持に用いられる公知の培養培地を用いることができる。このような培養培地は、基本培地に、非必須アミノ酸、ピルビン酸ナトリウム、2−メルカプトエタノール、ウシ胎児血清、グルタミン、ヌクレオシド、LIFなどを添加して調製することができる。 The medium used in the culturing step is not particularly limited as long as it is a medium for pluripotent stem cells. Such a medium can be appropriately selected depending on the type of pluripotent stem cells used. For example, a known culture medium used for maintaining the growth of pluripotent stem cells can be used. Such a culture medium can be prepared by adding non-essential amino acids, sodium pyruvate, 2-mercaptoethanol, fetal bovine serum, glutamine, nucleoside, LIF and the like to the basal medium.
基本培地としては、従来公知の動物細胞用の培地を用いることができる。例えば、Ham’s F12培地、α−MEM培地、DMEM培地、RPMI−1640培地などが挙げられる。これらの基本培地は、単独で使用されても、複数を混合して使用されてもよい。 As the basal medium, a conventionally known medium for animal cells can be used. For example, Ham's F12 medium, α-MEM medium, DMEM medium, RPMI-1640 medium and the like can be mentioned. These basal media may be used alone or in combination of two or more.
基本培地には、血清が含有されていてもよいし、または含有されていなくてもよい。また、基本培地は、血清の代わりに人工血清代替物を含んでいてもよい。そのような人工血清代替物としては、例えば、KnockOut(登録商標)Serum Replacement(インビトロジェン製)を挙げることができる。 The basal medium may or may not contain serum. In addition, the basal medium may contain an artificial serum substitute instead of serum. Such artificial serum replacements include, for example, KnockOut® Serum Replacement (manufactured by Invitrogen).
また、基本培地には、白血病抑制因子(leukemia inhibitory factor:LIF)が含有されていてもよいし、または含有されていなくてもよい。ここで、LIFは、通常、マウスES細胞の未分化状態を維持するために培養培地に添加される。従って、マウスES細胞から胚様体を形成する場合は、通常は、LIF非存在下において胚様体の形成が行われる。しかし、本実施形態の胚様体形成方法によれば、驚くべきことに、胚様体形成用培地としてLIFを含有している培地を用いた場合であっても、LIFを含有していない培地を用いた場合と同様に、マウスES細胞から胚様体を形成することができる。 In addition, the basal medium may or may not contain a leukemia inhibitory factor (LIF). Here, LIF is usually added to the culture medium in order to maintain the undifferentiated state of mouse ES cells. Therefore, when the embryoid body is formed from mouse ES cells, the embryoid body is usually formed in the absence of LIF. However, according to the embryoid body formation method of the present embodiment, surprisingly, even when a medium containing LIF is used as the medium for forming embryoid bodies, a medium containing no LIF is used. The embryoid body can be formed from mouse ES cells in the same manner as in the case of using.
培養工程では、多能性幹細胞をフィーダー細胞と共培養させてもよく、フィーダー細胞が存在していなくてもよい。フィーダー細胞としては、多能性幹細胞の維持培養においてフィーダー細胞として通常用いられる細胞を使用することができる。例えば、マウス胎児由来線維芽細胞(mouse embryonic fibroblast:MEF)などを挙げることができる。フィーダー細胞を使用する場合は、多能性幹細胞の培養を開始する少なくとも1日前に、フィーダー細胞を播種しておくことが好ましい。 In the culturing step, pluripotent stem cells may be co-cultured with the feeder cells, and the feeder cells may not be present. As the feeder cells, cells usually used as feeder cells in the maintenance culture of pluripotent stem cells can be used. For example, mouse embryonic fibroblast (MEF) and the like can be mentioned. When feeder cells are used, it is preferable to seed the feeder cells at least 1 day before starting the culture of pluripotent stem cells.
多能性幹細胞の播種密度は、特に限定されないが、培地1mlあたり、1×103個〜1×106個であることが好ましく、2×103個〜5×105個であることがより好ましく、5×103個〜5×104個であることがさらに好ましい。一般に、播種数が極端に少ない場合は、細胞の生存率が低下しやすく、また胚様体を形成しにくくなる。一方、播種数が極端に多い場合は、不均一で大きな胚様体を形成しやすくなる。これらの場合、分化誘導する際に、再現性などの問題が生じやすい。播種密度は、多能性幹細胞の種類により適宜最適な密度を決めればよく、何ら限定されるものではない。The seeding density of pluripotent stem cells is not particularly limited, but is preferably 1 × 10 3 to 1 × 10 6 per 1 ml of medium, and is preferably 2 × 10 3 to 5 × 10 5. More preferably, the number is 5 × 10 3 to 5 × 10 4 . In general, when the number of seeds is extremely small, the viability of cells tends to decrease and it becomes difficult to form embryoid bodies. On the other hand, when the number of seeds is extremely large, uneven and large embryoid bodies are likely to be formed. In these cases, problems such as reproducibility are likely to occur when inducing differentiation. The seeding density may be appropriately determined depending on the type of pluripotent stem cells, and is not limited in any way.
培養工程における培養条件としては、通常の細胞培養が行われる条件であればよい。培養温度は、例えば、30℃〜40℃、好ましくは37℃である。培養は、CO2含有空気の雰囲気下で行われ、CO2濃度は、例えば、2%〜5%、好ましくは5%である。培養期間は、どのような品質の胚様体を形成したいかに応じて適宜設定することができる。例えば、培養期間が長くなるほど、より大きい胚様体を形成することができる。培養期間は、使用する多能性幹細胞の種類により異なるが、短くとも1日間以上であることが好ましく、3日間以上であることがより好ましく、5日間以上であることがさらに好ましい。また、長くとも20日間以下であることが好ましく、15日間以下であることがより好ましく、10日間以下であることがさらに好ましい。培養日数が短いと、胚様体のサイズが不均一で安定しにくい。一方、培養日数が長くなるに従い、胚様体の品質が低下しやすくなり、不均一な分化を起こしやすくなる。これら培養日数は、細胞の播種数により適宜最適な期間を決めればよく、何ら限定されるものではない。The culture conditions in the culture step may be any conditions under which normal cell culture is performed. The culture temperature is, for example, 30 ° C to 40 ° C, preferably 37 ° C. The culture is carried out in an atmosphere of CO 2- containing air, and the CO 2 concentration is, for example, 2% to 5%, preferably 5%. The culture period can be appropriately set depending on what kind of quality embryoid body is desired to be formed. For example, the longer the culture period, the larger embryoid bodies can be formed. The culture period varies depending on the type of pluripotent stem cells used, but is preferably at least 1 day, more preferably 3 days or more, and even more preferably 5 days or more. Further, it is preferably 20 days or less at the longest, more preferably 15 days or less, and further preferably 10 days or less. When the culture period is short, the embryoid body size is uneven and difficult to stabilize. On the other hand, as the number of culture days increases, the quality of the embryoid body tends to deteriorate, and heterogeneous differentiation tends to occur. The optimum number of days for culturing may be appropriately determined depending on the number of seeded cells, and is not limited in any way.
従来のES細胞の胚様体を得る方法では、例えば、マウスのES細胞を用いた場合は、胚様体を得るまでに長期間(例えば、ハンギングドロップ法では、短くとも7日程度)を要する。これに対して、本実施形態の胚様体形成方法では、例えば、マウスのES細胞を用いた場合は、後述する実施例に示したとおり、培養開始後1日目には胚様体が形成される。 In the conventional method for obtaining an embryoid body of ES cells, for example, when mouse ES cells are used, it takes a long time (for example, about 7 days at the shortest in the hanging drop method) to obtain an embryoid body. .. On the other hand, in the embryoid body formation method of the present embodiment, for example, when mouse ES cells are used, embryoid bodies are formed on the first day after the start of culture, as shown in Examples described later. Will be done.
そして、従来のES細胞の胚様体を得る方法では、再現性が悪く、熟練を要していたが、本実施形態の胚様体形成方法では、一般的な細胞培養の手法によって、基本的な培養技術を有している研究者では容易に胚様体を形成することができる。 The conventional method for obtaining an embryoid body of ES cells has poor reproducibility and requires skill. However, in the method for forming an embryoid body of the present embodiment, a general cell culture method is used. A researcher who has various culture techniques can easily form an embryoid body.
また、本実施形態の胚様体形成方法は、単なる胚様体のみならず、外胚葉、内胚葉および/または中胚葉に分化する能力を有する胚様体を形成することができるという点でも優れている。このような利点は本発明者らによって初めて見出されたものである。後述の実施例においても、本実施形態の胚様体形成方法によれば、これまでに観察されていないような胚様体が形成されることが示されている。また、実施例では、得られた胚様体が分化マーカーを発現することも示されている。 In addition, the embryoid body formation method of the present embodiment is also excellent in that it can form not only an embryoid body but also an embryoid body having an ability to differentiate into an ectoderm, an endoderm and / or a mesoderm. ing. Such an advantage was first discovered by the present inventors. Also in the examples described later, it is shown that the embryoid body formation method of the present embodiment forms embryoid bodies that have not been observed so far. It has also been shown in the Examples that the resulting embryoid body expresses a differentiation marker.
培養工程では、培養期間中に培地交換を行ってもよい。培地交換を行う場合は、毎日または2〜5日に一度、培地交換を行えばよい。適切な頻度で培地交換を行うことによって、良好な培養環境を保つことができる。従来のハンギングドロップ法、または超親水性処理培養皿では、通常、細胞に負担なく培地交換をすることができない。また、培地交換する間に細胞を吸引廃棄する危険性が高くなる。これに対して、本実施形態の胚様体形成方法では、細胞に負担をかけることなく培地交換をすることが可能である。また、培地交換の間に細胞を吸引廃棄する危険性が低い。 In the culturing step, the medium may be exchanged during the culturing period. When the medium is changed, the medium may be changed every day or once every 2 to 5 days. A good culture environment can be maintained by exchanging the medium at an appropriate frequency. With the conventional hanging drop method or the superhydrophilic treatment culture dish, it is usually not possible to exchange the medium without burdening the cells. In addition, there is a high risk of aspirating and discarding cells during medium replacement. On the other hand, in the embryoid body formation method of the present embodiment, it is possible to exchange the medium without imposing a burden on the cells. Also, there is less risk of aspirating and discarding cells during medium replacement.
(1−2.その他の工程)
本実施形態の胚様体形成方法は、上述した培養工程以外の工程を更に包含していてもよい。例えば、形成された胚様体の質を確認する確認工程を更に包含していてもよい。ここで、上記「胚様体の質」とは、胚様体の未分化および/または分化の程度、胚様体の分化能、胚様体の大きさ(胚様体の直径)、胚様体の形が意図される。すなわち、当該確認工程は、胚様体の質を確認するために、例えば、胚様体の未分化および/または分化の程度を確認する工程であってもよく、胚様体の分化能を確認する工程であってもよく、胚様体の大きさ(例えば、直径)を確認する工程であってもよく、胚様体の形(例えば、球形)を確認する工程であってもよい。(1-2. Other processes)
The embryoid body formation method of the present embodiment may further include steps other than the above-mentioned culture step. For example, it may further include a confirmation step of confirming the quality of the formed embryoid body. Here, the above-mentioned "embryoid body quality" refers to the degree of undifferentiation and / or differentiation of the embryoid body, the differentiation potential of the embryoid body, the size of the embryoid body (diameter of the embryoid body), and the embryo-like body. The shape of the body is intended. That is, the confirmation step may be, for example, a step of confirming the degree of undifferentiation and / or differentiation of the embryoid body in order to confirm the quality of the embryoid body, and confirm the differentiation ability of the embryoid body. It may be a step of confirming the size (for example, diameter) of the embryoid body, or a step of confirming the shape of the embryoid body (for example, spherical shape).
胚様体の未分化および/または分化の程度は、例えば、胚様体における公知の分化マーカー、未分化マーカーなどの発現を遺伝子レベルまたはタンパク質レベルで確認することによって確認することができる。 The degree of undifferentiation and / or differentiation of the embryoid body can be confirmed, for example, by confirming the expression of known differentiation markers, undifferentiated markers, etc. in the embryoid body at the gene level or the protein level.
また、胚様体の分化能は、例えば、胚様体を公知の適切な分化誘導条件(例えば、公知の、血液細胞への分化誘導条件、神経細胞への分化誘導条件など)で培養し、胚様体由来の細胞が目的の細胞へと分化したことを確認することによって、確認することができる。 Further, for the differentiation ability of the embryoid body, for example, the embryoid body is cultured under known appropriate differentiation-inducing conditions (for example, known conditions for inducing differentiation into blood cells, conditions for inducing differentiation into nerve cells, etc.). This can be confirmed by confirming that the embryoid body-derived cells have differentiated into the cells of interest.
また、胚様体の大きさと形とは、例えば、胚様体の直径と形とを位相差顕微鏡下で測定することによって確認することができる。 Further, the size and shape of the embryoid body can be confirmed, for example, by measuring the diameter and shape of the embryoid body under a phase-contrast microscope.
上記確認工程は、上述した培養工程の途中で行ってもよく、培養工程後に行ってもよい。培養工程の途中で上記確認工程を行うことによって、培養期間を適切に調整することができる。 The above confirmation step may be performed during the above-mentioned culturing step, or may be performed after the culturing step. By performing the above confirmation step in the middle of the culturing step, the culturing period can be appropriately adjusted.
また、本実施形態の胚様体形成方法は、培養工程後に、胚様体を回収する回収工程を更に包含していてもよい。 In addition, the embryoid body forming method of the present embodiment may further include a recovery step of recovering the embryoid body after the culture step.
以下に、本実施形態の胚様体形成方法において使用する「コラーゲンの分解物またはアテロコラーゲンの分解物」について詳細に説明する。 The "collagen decomposition product or atelocollagen decomposition product" used in the embryoid body formation method of the present embodiment will be described in detail below.
<コラーゲンの分解物またはアテロコラーゲンの分解物>
本実施形態の胚様体形成方法において、上記「コラーゲンの分解物またはアテロコラーゲンの分解物」(以下、単に「分解物」ともいう場合がある。)は、コラーゲンまたはアテロコラーゲンのトリプルヘリカルドメインの少なくとも一部分を含んでいる構成である。つまり、上記分解物は、コラーゲンまたはアテロコラーゲンのトリプルヘリカルドメインの全体を含んでいてもよいし、トリプルヘリカルドメインの一部分を含んでいてもよい。<Collagen decomposition product or atelocollagen decomposition product>
In the embryoid body formation method of the present embodiment, the above-mentioned "collagen decomposition product or atelocollagen decomposition product" (hereinafter, may be simply referred to as "decomposition product") is at least a part of the triple helical domain of collagen or atelocollagen. It is a configuration that includes. That is, the degradation product may contain the entire triple helical domain of collagen or atelocollagen, or may contain a portion of the triple helical domain.
更に具体的には、上記分解物は、以下(A)〜(C)のコラーゲンの分解物またはアテロコラーゲンの分解物の内の少なくとも1種類以上を含有しているものである:
(A)上記コラーゲンまたはアテロコラーゲンのトリプルヘリカルドメイン内の下記(1)にて示されるアミノ酸配列の、X1とX2との間の化学結合、X2とGとの間の化学結合、GとX3との間の化学結合、X4とGとの間の化学結合、または、X6とGとの間の化学結合が切断された、コラーゲンの分解物またはアテロコラーゲンの分解物;
(B)上記コラーゲンまたはアテロコラーゲンのトリプルヘリカルドメイン内の下記(2)にて示されるアミノ酸配列の、X1とX2との間の化学結合、X2とGとの間の化学結合、GとX3との間の化学結合、X4とGとの間の化学結合、X6とGとの間の化学結合、GとX7との間の化学結合、または、X14とGとの間の化学結合が切断された、コラーゲンの分解物またはアテロコラーゲンの分解物;
(C)上記コラーゲンまたはアテロコラーゲンのトリプルヘリカルドメインのアミノ末端の下記(3)にて示されるアミノ酸配列の、Y1とY2との間の化学結合が切断された、コラーゲンの分解物またはアテロコラーゲンの分解物;
(1)−G−X1−X2−G−X3−X4−G−X5−X6−G−(配列番号1);
(2)−G−X1−X2−G−X3−X4−G−X5−X6−G−X7−X8−G−X9−X10−G−X11−X12−G−X13−X14−G−(配列番号14);
(3)−Y1−Y2−Y3−G−Y4−Y5−G−Y6−Y7−G−Y8−Y9−G−(配列番号13);
(但し、Gは、グリシンであり、X1〜X14およびY1〜Y9は、任意のアミノ酸である)。More specifically, the above-mentioned decomposition product contains at least one of the following (A) to (C) collagen decomposition products or atelocollagen decomposition products:
(A) of the amino acid sequence represented by the following (1) in the triple helical domain of the collagen or atelocollagen, a chemical bond between X 1 and X 2, the chemical bond between X 2 and G, and G chemical bond between X 3, a chemical bond between X 4 and G, or a chemical bond between X 6 and G is disconnected, decomposition product or decomposition product of the atelocollagen of collagen;
(B) the amino acid sequence represented by the following (2) in the triple helical domain of the collagen or atelocollagen, a chemical bond between X 1 and X 2, the chemical bond between X 2 and G, and G chemical bond between X 3, a chemical bond between X 4 and G, chemical bond between X 6 and G, chemical bond between G and X 7, or, between X 14 and G Degradation of collagen or atelocollagen with broken chemical bonds between;
(C) the amino acid sequence represented by the following (3) to the amino terminus of a triple helical domain of the collagen or atelocollagen, a chemical bond between Y 1 and Y 2 is disconnected, the collagen degradation product or atelocollagen Decomposition;
(1) -G-X 1- X 2- G-X 3- X 4- G-X 5- X 6 -G- (SEQ ID NO: 1);
(2) -G-X 1- X 2- G-X 3- X 4- G-X 5- X 6- G-X 7- X 8- G-X 9- X 10- G-X 11- X 12- G-X 13- X 14 -G- (SEQ ID NO: 14);
(3) -Y 1- Y 2- Y 3- G-Y 4- Y 5- G-Y 6- Y 7- G-Y 8- Y 9 -G- (SEQ ID NO: 13);
(However, G is glycine, and X 1 to X 14 and Y 1 to Y 9 are arbitrary amino acids).
以下に、各構成について詳細に説明する。 Each configuration will be described in detail below.
分解物の材料になるコラーゲンおよびアテロコラーゲンは特に限定されず、周知のコラーゲンおよびアテロコラーゲンであればよい。 The collagen and atelocollagen used as materials for the decomposition products are not particularly limited, and may be any well-known collagen or atelocollagen.
分解物の材料になるコラーゲンとしては、哺乳類(例えば、ウシ、ブタ、ウサギ、ヒト、ラットまたはマウスなど)、鳥類(例えば、ニワトリなど)、または、魚類(例えば、サメ、コイ、ウナギ、マグロ(例えば、キハダマグロ)、ティラピア、タイ、サケなど)のコラーゲンを用いることができる。 Collagen used as a material for decomposition products includes mammals (eg, cows, pigs, rabbits, humans, rats or mice), birds (eg, chickens), or fish (eg, salmon, carp, eels, tuna). For example, collagen of yellowfin tuna), tilapia, tie, salmon, etc.) can be used.
更に具体的には、分解物の材料になるコラーゲンとしては、上記哺乳類または鳥類の真皮、腱、骨または筋膜などに由来するコラーゲン、あるいは、上記魚類の皮膚または鱗などに由来するコラーゲンを用いることができる。 More specifically, as the collagen used as the material of the decomposition product, collagen derived from the dermis, tendon, bone or fascia of the mammal or bird, or collagen derived from the skin or scale of the fish is used. be able to.
分解物の材料になるアテロコラーゲンとしては、上記哺乳類、鳥類または魚類のコラーゲンをプロテアーゼ(例えば、ペプシンなど)によって処理して得られる、コラーゲン分子のアミノ末端および/またはカルボキシル末端からテロペプチドが部分的に除去されているアテロコラーゲンを用いることができる。 As the atelocollagen used as a material for the decomposition product, terror peptides are partially produced from the amino-terminal and / or carboxyl-terminal of the collagen molecule obtained by treating the above-mentioned mammalian, bird or fish collagen with a protease (for example, pepsin). The removed atelocollagen can be used.
これらのなかでは、ニワトリ、ブタ、ウシ、ヒトまたはラットのコラーゲンまたはアテロコラーゲンを分解物の材料として好ましく用いることができ、ブタ、ウシまたはヒトのコラーゲンまたはアテロコラーゲンを分解物の材料として更に好ましく用いることができる。 Among these, chicken, porcine, bovine, human or rat collagen or atelocollagen can be preferably used as the decomposition product material, and porcine, bovine or human collagen or atelocollagen can be more preferably used as the decomposition product material. it can.
また、分解物の材料として魚類のコラーゲンまたはアテロコラーゲンを用いることにより、材料を簡便に、安全に、かつ大量に入手可能であり、ヒトに対してより安全なコラーゲンの分解物またはアテロコラーゲンの分解物を実現することができる。 Further, by using fish collagen or atelocollagen as the material of the decomposition product, the material can be easily, safely and in large quantities, and the decomposition product of collagen or the decomposition product of atelocollagen which is safer for humans can be obtained. It can be realized.
なお、分解物の材料として魚類のコラーゲンまたはアテロコラーゲンを用いる場合には、サメ、コイ、ウナギ、マグロ(例えば、キハダマグロ)、ティラピア、タイまたはサケのコラーゲンまたはアテロコラーゲンを用いることが好ましく、マグロ、ティラピア、タイまたはサケのコラーゲンまたはアテロコラーゲンを用いることが更に好ましい。 When fish collagen or atelocollagen is used as the material for the decomposition products, it is preferable to use shark, carp, eel, tuna (for example, yellowfin tuna), tilapia, Thai or salmon collagen or atelocollagen, and tuna, tilapia, etc. It is more preferred to use tilapia or salmon collagen or atelocollagen.
分解物の材料としてアテロコラーゲンを用いる場合、熱による変性温度が、好ましくは15℃以上、より好ましくは20℃以上であるアテロコラーゲンを用いることが好ましい。例えば、分解物の材料として魚類のアテロコラーゲンを用いる場合、マグロ(例えば、キハダマグロ)、ティラピアまたはコイなどのアテロコラーゲンは熱変性温度が25℃以上であるので、これらのアテロコラーゲンを用いることが好ましい。 When atelocollagen is used as the material of the decomposition product, it is preferable to use atelocollagen having a heat denaturation temperature of preferably 15 ° C. or higher, more preferably 20 ° C. or higher. For example, when fish atelocollagen is used as a material for decomposition products, it is preferable to use atelocollagen such as tuna (for example, yellowfin tuna), tilapia or carp because the heat denaturation temperature is 25 ° C. or higher.
上記構成であれば、分解物の変性温度を、好ましくは15℃以上、より好ましくは20℃以上に調節することができる。その結果、上記構成であれば、貯蔵時の安定性、利用時の安定性に優れた分解物を実現することができる。 With the above configuration, the denaturation temperature of the decomposition product can be adjusted to preferably 15 ° C. or higher, more preferably 20 ° C. or higher. As a result, with the above configuration, it is possible to realize a decomposed product having excellent stability during storage and stability during use.
分解物の材料になるコラーゲンおよびアテロコラーゲンは、周知の方法によって入手することができる。例えば、哺乳類、鳥類または魚類のコラーゲンに富んだ組織をpH2〜4程度の酸性溶液に投入することによって、コラーゲンを溶出することができる。更に、当該溶出液にペプシンなどのプロテアーゼを添加して、コラーゲン分子のアミノ末端および/またはカルボキシル末端のテロペプチドを部分的に除去する。更に、当該溶出液に塩化ナトリウムなどの塩を加えることによって、アテロコラーゲンを沈殿させることができる。 Collagen and atelocollagen, which are materials for decomposition products, can be obtained by well-known methods. For example, collagen can be eluted by putting collagen-rich tissues of mammals, birds or fish into an acidic solution having a pH of about 2 to 4. Furthermore, a protease such as pepsin is added to the eluate to partially remove the amino-terminal and / or carboxyl-terminal terror peptides of the collagen molecule. Further, atelocollagen can be precipitated by adding a salt such as sodium chloride to the eluate.
上記「コラーゲンの分解物またはアテロコラーゲンの分解物」は、以下(A)〜(C)のコラーゲンの分解物またはアテロコラーゲンの分解物の内の少なくとも1種類以上を含有しているものである:
(A)上記コラーゲンまたはアテロコラーゲンのトリプルヘリカルドメイン内の下記(1)にて示されるアミノ酸配列の、X1とX2との間の化学結合、X2とGとの間の化学結合、GとX3との間の化学結合、X4とGとの間の化学結合、または、X6とGとの間の化学結合が切断された、コラーゲンの分解物またはアテロコラーゲンの分解物;
(B)上記コラーゲンまたはアテロコラーゲンのトリプルヘリカルドメイン内の下記(2)にて示されるアミノ酸配列の、X1とX2との間の化学結合、X2とGとの間の化学結合、GとX3との間の化学結合、X4とGとの間の化学結合、X6とGとの間の化学結合、GとX7との間の化学結合、または、X14とGとの間の化学結合が切断された、コラーゲンの分解物またはアテロコラーゲンの分解物;
(C)上記コラーゲンまたはアテロコラーゲンのトリプルヘリカルドメインのアミノ末端の下記(3)にて示されるアミノ酸配列の、Y1とY2との間の化学結合が切断された、コラーゲンの分解物またはアテロコラーゲンの分解物;
(1)−G−X1−X2−G−X3−X4−G−X5−X6−G−;
(2)−G−X1−X2−G−X3−X4−G−X5−X6−G−X7−X8−G−X9−X10−G−X11−X12−G−X13−X14−G−;
(3)−Y1−Y2−Y3−G−Y4−Y5−G−Y6−Y7−G−Y8−Y9−G−;
(但し、Gは、グリシンであり、X1〜X14およびY1〜Y9は、任意のアミノ酸である)。The above-mentioned "collagen decomposition product or atelocollagen decomposition product" contains at least one of the following (A) to (C) collagen decomposition products or atelocollagen decomposition products:
(A) of the amino acid sequence represented by the following (1) in the triple helical domain of the collagen or atelocollagen, a chemical bond between X 1 and X 2, the chemical bond between X 2 and G, and G chemical bond between X 3, a chemical bond between X 4 and G, or a chemical bond between X 6 and G is disconnected, decomposition product or decomposition product of the atelocollagen of collagen;
(B) the amino acid sequence represented by the following (2) in the triple helical domain of the collagen or atelocollagen, a chemical bond between X 1 and X 2, the chemical bond between X 2 and G, and G chemical bond between X 3, a chemical bond between X 4 and G, chemical bond between X 6 and G, chemical bond between G and X 7, or, between X 14 and G Degradation of collagen or atelocollagen with broken chemical bonds between;
(C) the amino acid sequence represented by the following (3) to the amino terminus of a triple helical domain of the collagen or atelocollagen, a chemical bond between Y 1 and Y 2 is disconnected, the collagen degradation product or atelocollagen Decomposition;
(1) -G-X 1- X 2- G-X 3- X 4- G-X 5- X 6 -G-;
(2) -G-X 1- X 2- G-X 3- X 4- G-X 5- X 6- G-X 7- X 8- G-X 9- X 10- G-X 11- X 12- G-X 13- X 14 -G-;
(3) -Y 1- Y 2- Y 3- G-Y 4- Y 5- G-Y 6- Y 7- G-Y 8- Y 9 -G-;
(However, G is glycine, and X 1 to X 14 and Y 1 to Y 9 are arbitrary amino acids).
本明細書において「トリプルヘリカルドメイン」とは、「Gly−X−Y」(XおよびYは任意のアミノ酸)にて示されるアミノ酸配列が、少なくとも3個以上、より好ましくは少なくとも80個以上、より好ましくは少なくとも300個以上、連続するアミノ酸配列を含むドメインであって、螺旋構造の形成に寄与するドメインを意図する。 As used herein, the term "triple helical domain" means that the amino acid sequence represented by "Gly-XY" (X and Y are arbitrary amino acids) is at least 3 or more, more preferably at least 80 or more. A domain containing at least 300 consecutive amino acid sequences is preferably intended, which contributes to the formation of a helical structure.
本明細書において、上記「コラーゲンの分解物またはアテロコラーゲンの分解物」は、コラーゲンまたはアテロコラーゲンのトリプルヘリカルドメイン内の上記(1)〜(3)の何れか1つにて示されるアミノ酸配列内の任意の1箇所が切断された分解物であってもよい。上記「コラーゲンの分解物またはアテロコラーゲンの分解物」は、コラーゲンまたはアテロコラーゲンのトリプルヘリカルドメインよりもC末端側の部分の全体を含んでいるものであってもよいし、または一部分を含んでいるものであってもよい。「コラーゲンの分解物またはアテロコラーゲンの分解物」がコラーゲンまたはアテロコラーゲンのトリプルヘリカルドメインよりもC末端側の部分の一部分を含んでいる場合は、コラーゲンまたはアテロコラーゲンのトリプルヘリカルドメインよりもC末端側の部分を、3アミノ酸以上、5アミノ酸以上、10アミノ酸以上含んでいてもよい。例えば、ニワトリI型コラーゲンのC末端配列の配列情報は、S. Kunii et al., Journal of Biological Chemistry, Vol.285, No.23, pp.17465-17470, June4, 2010に記載されている。 In the present specification, the above-mentioned "collagen decomposition product or atelocollagen decomposition product" is any one in the amino acid sequence shown by any one of the above (1) to (3) in the triple helical domain of collagen or atelocollagen. It may be a decomposition product in which one part of the above is cut. The above-mentioned "collagen decomposition product or atelocollagen decomposition product" may include the entire C-terminal portion of collagen or atelocollagen triple helical domain, or may contain a part thereof. There may be. If the "collagen degradation product or atelocollagen degradation product" contains a part of the C-terminal part of collagen or atelocollagen triple helical domain, the C-terminal part of collagen or atelocollagen triple helical domain is included. It may contain 3, 3 amino acids or more, 5 amino acids or more, and 10 amino acids or more. For example, sequence information of the C-terminal sequence of chicken type I collagen is described in S. Kunii et al., Journal of Biological Chemistry, Vol.285, No.23, pp.17465-17470, June4, 2010.
一実施形態において、上記「コラーゲンの分解物またはアテロコラーゲンの分解物」は、上記(A)〜(C)のコラーゲンの分解物またはアテロコラーゲンの分解物の内の少なくとも1種類以上を含有するものであればよい。すなわち、上記「コラーゲンの分解物またはアテロコラーゲンの分解物」は、上記(A)〜(C)のコラーゲンの分解物またはアテロコラーゲンの分解物の内の1種類を単独で含有するものであってもよく、上記(A)〜(C)のコラーゲンの分解物またはアテロコラーゲンの分解物の内の1種類以上を組み合せて含有するものであってもよい。 In one embodiment, the "collagen decomposition product or atelocollagen decomposition product" may contain at least one of the collagen decomposition products (A) to (C) or atelocollagen decomposition products. Just do it. That is, the above-mentioned "collagen decomposition product or atelocollagen decomposition product" may contain one of the collagen decomposition products (A) to (C) or the atelocollagen decomposition product alone. , One or more of the above-mentioned (A) to (C) collagen decomposition products or atelocollagen decomposition products may be contained in combination.
トリプルヘリカルドメイン内で化学結合の切断が生じているポリペプチド鎖は、コラーゲンまたはアテロコラーゲンを構成する複数種類のポリペプチド鎖のうちの何れのポリペプチド鎖であってもよい。 The polypeptide chain in which the chemical bond is cleaved in the triple helical domain may be any of collagen or a plurality of types of polypeptide chains constituting atelocollagen.
例えば、化学結合の切断が生じているポリペプチド鎖は、α1鎖もしくはα2鎖のうちの何れであってもよい。 For example, the polypeptide chain in which the chemical bond is cleaved may be either an α1 chain or an α2 chain.
化学結合の切断が生じているポリペプチド鎖は、上述したポリペプチド鎖のなかではα1鎖またはα2鎖の少なくとも両方であることが好ましい。 The polypeptide chain in which the chemical bond is cleaved is preferably at least both the α1 chain and the α2 chain among the above-mentioned polypeptide chains.
化学結合の切断が生じているポリペプチド鎖は、上述したポリペプチド鎖のなかではα1鎖であることが更に好ましい。 It is more preferable that the polypeptide chain in which the chemical bond is cleaved is an α1 chain among the above-mentioned polypeptide chains.
コラーゲンの分解物またはアテロコラーゲンの分解物を酵素処理によって作製すれば、容易に特定のポリペプチド鎖のみで切断を生じさせることができる。 If a collagen degradation product or an atelocollagen degradation product is prepared by enzyme treatment, cleavage can easily occur only with a specific polypeptide chain.
コラーゲンの分解物またはアテロコラーゲンの分解物は、3つのポリペプチド鎖が螺旋構造を形成しているものであってもよい。あるいは、コラーゲンの分解物またはアテロコラーゲンの分解物は、3つのポリペプチド鎖が螺旋構造を形成していないもの、または、3つのポリペプチド鎖が部分的に螺旋構造を形成していないものであってもよい。なお、3つのポリペプチド鎖が螺旋構造を形成しているか否かは、公知の方法(例えば、円偏光二色スペクトル)によって確認することができる。 The degradation product of collagen or the degradation product of atelocollagen may be one in which three polypeptide chains form a spiral structure. Alternatively, the collagen degradation or atelocollagen degradation is one in which the three polypeptide chains do not form a helical structure, or one in which the three polypeptide chains do not partially form a helical structure. May be good. Whether or not the three polypeptide chains form a spiral structure can be confirmed by a known method (for example, circular dichroism spectrum).
コラーゲンの分解物またはアテロコラーゲンの分解物は、基本的に3つのポリペプチド鎖を含んでいるが、3つのポリペプチド鎖のうちの1つのポリペプチド鎖にて化学結合の切断が生じていてもよいし、3つのポリペプチド鎖のうちの2つのポリペプチド鎖にて化学結合の切断が生じていてもよいし、3つのポリペプチド鎖の全てにて化学結合の切断が生じていてもよい。 A degradation product of collagen or a degradation product of atelocollagen basically contains three polypeptide chains, but a chemical bond may be cleaved in one of the three polypeptide chains. However, the chemical bond may be cleaved in two of the three polypeptide chains, or the chemical bond may be cleaved in all three polypeptide chains.
3つのポリペプチド鎖が螺旋構造を形成している場合には、複数の螺旋構造体によって、網目状の会合体が形成されていてもよいし、線維状の会合体が形成されていてもよい。 When the three polypeptide chains form a spiral structure, the plurality of spiral structures may form a network-like aggregate or a fibrous aggregate. ..
本明細書において、網目状とは、水素結合または静電的相互作用、ファンデルワールス結合などによって分子が連なって立体的な網目をつくり、当該網目の間に隙間ができている構造を意図する。本明細書において、線維状とは、水素結合または静電的相互作用、ファンデルワールス結合などによって分子が連なって形成された略直線状の構造を意図する。また、本明細書において、会合体とは、同種の分子が共有結合によらないで2分子以上が相互作用して結合し、1つの構造単位となっているものを意図する。網目状または線維状の会合体が形成されているか否かは、電子顕微鏡にて観察することによって確認することができる。 In the present specification, the network means a structure in which molecules are connected to form a three-dimensional network by hydrogen bonds, electrostatic interactions, van der Waals bonds, etc., and gaps are formed between the networks. .. As used herein, fibrous means a substantially linear structure formed by connecting molecules by hydrogen bonds, electrostatic interactions, van der Waals bonds, or the like. Further, in the present specification, an aggregate is intended to be an aggregate in which two or more molecules of the same type interact and bind to each other without a covalent bond to form one structural unit. Whether or not a reticulated or fibrous aggregate is formed can be confirmed by observing with an electron microscope.
コラーゲンの分解物またはアテロコラーゲンの分解物は、架橋構造を有するものであってもよい。例えば、ポリペプチド鎖とポリペプチド鎖とが、螺旋構造と螺旋構造とが、または、ポリペプチド鎖と螺旋構造とが、架橋剤によって架橋されていてもよい。 The decomposition product of collagen or the decomposition product of atelocollagen may have a crosslinked structure. For example, the polypeptide chain and the polypeptide chain, the spiral structure and the spiral structure, or the polypeptide chain and the spiral structure may be crosslinked by a cross-linking agent.
上記架橋構造は、周知の架橋方法によって形成することができる。例えば、化学架橋する方法、熱処理により架橋する方法、紫外線など放射線照射により架橋する方法などが挙げられる。 The crosslinked structure can be formed by a well-known crosslinking method. For example, a method of chemically cross-linking, a method of cross-linking by heat treatment, a method of cross-linking by irradiation with radiation such as ultraviolet rays, and the like can be mentioned.
化学架橋に用いる架橋剤としては、例えば、1−エチル−3−(3−ジメチルアミノプロピル)カルボジイミド塩酸塩などの水溶性カルボジイミド化合物、エピクロロヒドリン、ビスエポキシジエチレングリコールなどのジエポキシ化合物、NaBH4などが挙げられる。Examples of the cross-linking agent used for chemical cross-linking include water-soluble carbodiimide compounds such as 1-ethyl-3- (3-dimethylaminopropyl) carbodiimide hydrochloride, diepoxy compounds such as epichlorohydrin and bisepoxydiethylene glycol, and NaBH 4. Can be mentioned.
架橋剤の濃度は、コラーゲンの分解物またはアテロコラーゲンの分解物に対して、好ましくは10−3〜10質量%である。好ましくは、5〜40℃にて、3〜48時間、コラーゲンの分解物またはアテロコラーゲンの分解物と架橋剤とを接触させることにより、架橋構造を形成することができる。The concentration of the cross-linking agent is preferably 10-3 to 10% by mass with respect to the decomposition product of collagen or the decomposition product of atelocollagen. Preferably, a crosslinked structure can be formed by contacting the collagen decomposition product or the atelocollagen decomposition product with the crosslinking agent at 5 to 40 ° C. for 3 to 48 hours.
紫外線により架橋する場合、コラーゲンの分解物またはアテロコラーゲンの分解物に、例えば、室温にて、紫外線ランプなどにより紫外線を3〜48時間程度照射することによって、架橋構造を形成することができる。 When cross-linked by ultraviolet rays, a cross-linked structure can be formed by irradiating the decomposed product of collagen or the decomposed product of atelocollagen with ultraviolet rays, for example, at room temperature for about 3 to 48 hours with an ultraviolet lamp or the like.
熱架橋する場合は、コラーゲンの分解物またはアテロコラーゲンの分解物を、減圧下にて、好ましくは110〜160℃程度の温度で、3〜48時間程度加熱することによって、架橋構造を形成することができる。 In the case of thermal cross-linking, a cross-linked structure can be formed by heating the decomposed product of collagen or the decomposed product of atelocollagen under reduced pressure, preferably at a temperature of about 110 to 160 ° C. for about 3 to 48 hours. it can.
架橋構造を有するコラーゲンの分解物またはアテロコラーゲンの分解物は、耐コラゲナーゼ性、および、強度が向上しているという利点を有している。 A decomposition product of collagen having a crosslinked structure or a decomposition product of atelocollagen has the advantages of improved collagenase resistance and strength.
コラーゲンの分解物またはアテロコラーゲンの分解物は、必要に応じて、所望の化学修飾を施されていてもよい。化学修飾の種類としては、例えば、アシル化、ミリスチル化、ポリエチレングリコール修飾などを挙げることができる。 The degradation product of collagen or the degradation product of atelocollagen may be subjected to the desired chemical modification, if necessary. Examples of the type of chemical modification include acylation, myristylation, and polyethylene glycol modification.
例えば、アシル化の一種であるサクシニル化を施した分解物は、コラーゲンの分解物またはアテロコラーゲンの分解物と無水コハク酸とを、リン酸緩衝液などの中性pHの溶媒中で反応させて得ることができる。サクシニル化することにより、中性pHの溶媒に対する分解物の溶解度を向上させることができる。 For example, the succinylated decomposition product, which is a kind of acylation, is obtained by reacting a collagen decomposition product or an atelocollagen decomposition product with succinic anhydride in a solvent having a neutral pH such as a phosphate buffer solution. be able to. By succinylation, the solubility of the decomposition product in a solvent having a neutral pH can be improved.
また、ポリエチレングリコール修飾を施した分解物は、塩化シアヌルで活性化したポリエチレングリコールと、コラーゲンの分解物またはアテロコラーゲンの分解物とを反応させることにより、得ることができる。 Further, the decomposition product modified with polyethylene glycol can be obtained by reacting polyethylene glycol activated with cyanuric chloride with a decomposition product of collagen or a decomposition product of atelocollagen.
上述したコラーゲンの分解物またはアテロコラーゲンの分解物では、上述したトリプルヘリカルドメイン内の下記(1)にて示されるアミノ酸配列の、X1とX2との間の化学結合、X2とGとの間の化学結合、GとX3との間の化学結合、X4とGとの間の化学結合、または、X6とGとの間の化学結合が切断された、コラーゲンの分解物またはアテロコラーゲンの分解物が含まれている;
(1)−G−X1−X2−G−X3−X4−G−X5−X6−G−:
(但し、Gは、グリシンであり、X1〜X6は、任意のアミノ酸である)。In the above-mentioned decomposition product of collagen or atelocollagen, the chemical bond between X 1 and X 2 and the chemical bond between X 2 and G of the amino acid sequence shown in the following (1) in the above-mentioned triple helical domain. chemical bonding between the chemical bond between G and X 3, the chemical bond between X 4 and G, or a chemical bond between X 6 and G is disconnected, degradation product of collagen or atelocollagen Contains decomposition products of;
(1) -G-X 1- X 2- G-X 3- X 4- G-X 5- X 6 -G-:
(However, G is glycine, and X 1 to X 6 are arbitrary amino acids).
また、上述したコラーゲンの分解物またはアテロコラーゲンの分解物では、上述したトリプルヘリカルドメイン内の下記(2)にて示されるアミノ酸配列の、X1とX2との間の化学結合、X2とGとの間の化学結合、GとX3との間の化学結合、X4とGとの間の化学結合、X6とGとの間の化学結合、GとX7との間の化学結合、または、X14とGとの間の化学結合が切断された、コラーゲンの分解物またはアテロコラーゲンの分解物が含まれている;
(2)−G−X1−X2−G−X3−X4−G−X5−X6−G−X7−X8−G−X9−X10−G−X11−X12−G−X13−X14−G−:
(但し、Gは、グリシンであり、X1〜X14は、任意のアミノ酸である)。Further, in the above-mentioned decomposition product of collagen or atelocollagen, the chemical bond between X 1 and X 2 of the amino acid sequence shown in the following (2) in the above-mentioned triple helical domain, X 2 and G. Chemical bond between G and X 3 , chemical bond between X 4 and G, chemical bond between X 6 and G, chemical bond between G and X 7 or a chemical bond between X 14 and G is disconnected, it contains decomposition product or decomposition product of atelocollagen of collagen;
(2) -G-X 1- X 2- G-X 3- X 4- G-X 5- X 6- G-X 7- X 8- G-X 9- X 10- G-X 11- X 12- G-X 13- X 14 -G-:
(However, G is glycine, and X 1 to X 14 are arbitrary amino acids).
また、上述したコラーゲンの分解物またはアテロコラーゲンの分解物では、上述したトリプルヘリカルドメインのアミノ末端の下記(3)にて示されるアミノ酸配列の、Y1とY2との間の化学結合が切断された、コラーゲンの分解物またはアテロコラーゲンの分解物が含まれている;
(3)−Y1−Y2−Y3−G−Y4−Y5−G−Y6−Y7−G−Y8−Y9−G−(但し、Gは、グリシンであり、Y1〜Y9は、任意のアミノ酸である)。Further, in the above-mentioned collagen decomposition product or atelocollagen decomposition product, the chemical bond between Y 1 and Y 2 of the amino acid sequence shown in the following (3) at the amino terminus of the above-mentioned triple helical domain is cleaved. It also contains collagen degradation or atelocollagen degradation;
(3) -Y 1- Y 2- Y 3- G-Y 4- Y 5- G-Y 6- Y 7- G-Y 8- Y 9 -G- (However, G is glycine and Y 1 to Y 9 are arbitrary amino acids).
上記(1)または(2)にて示されるアミノ酸配列のトリプルヘリカルドメイン内における位置は、特に限定されない。例えば、上記(1)または(2)にて示されるアミノ酸配列は、トリプルヘリカルドメインの内部に存在していてもよいが、トリプルヘリカルドメインのアミノ末端に存在していることが好ましい(換言すれば、上記(1)または(2)にて示されるアミノ酸配列の中の最もアミノ末端側に配置されている「G」が、トリプルヘリカルドメインの中の最もアミノ末端側に配置されている「G」と一致することが好ましい)。 The position of the amino acid sequence shown in (1) or (2) above in the triple helical domain is not particularly limited. For example, the amino acid sequence shown in (1) or (2) above may be present inside the triple helical domain, but is preferably present at the amino terminus of the triple helical domain (in other words). , The "G" located on the most amino-terminal side of the amino acid sequence shown in (1) or (2) above is the "G" located on the most amino-terminal side of the triple helical domain. It is preferable to match with).
上記(1)または(2)にて示されるアミノ酸配列がトリプルヘリカルドメインの内部に存在している場合、当該(1)または(2)にて示されるアミノ酸配列の具体的な位置は特に限定されない。当該(1)または(2)にて示されるアミノ酸配列のアミノ末端側に、1個以上、5個以上、10個以上、50個以上、100個以上、150個以上、200個以上、250個以上または300個以上の「Gly−X−Y」(XおよびYは任意のアミノ酸)が連続するアミノ酸配列が存在していてもよい。また、当該(1)または(2)にて示されるアミノ酸配列のカルボキシル末端側に、1個以上、5個以上、10個以上、50個以上、100個以上、150個以上、200個以上、250個以上または300個以上の「Gly−X−Y」(XおよびYは任意のアミノ酸)が連続するアミノ酸配列が存在していてもよい。 When the amino acid sequence shown in (1) or (2) above exists inside the triple helical domain, the specific position of the amino acid sequence shown in (1) or (2) is not particularly limited. .. 1 or more, 5 or more, 10 or more, 50 or more, 100 or more, 150 or more, 200 or more, 250 on the amino-terminal side of the amino acid sequence shown in (1) or (2). There may be an amino acid sequence in which more than or more than 300 "Gly-XY" (X and Y are arbitrary amino acids) are continuous. Further, on the carboxyl-terminal side of the amino acid sequence shown in (1) or (2), 1 or more, 5 or more, 10 or more, 50 or more, 100 or more, 150 or more, 200 or more, There may be an amino acid sequence in which 250 or more or 300 or more "Gly-XY" (X and Y are arbitrary amino acids) are continuous.
トリプルヘリカルドメイン内の当該(1)または(2)にて示されるアミノ酸配列以外の部分(すなわち、上記(1)または(2)にて示されるアミノ酸配列がトリプルヘリカルドメインの内部に存在している場合は、当該(1)または(2)にて示されるアミノ酸配列のアミノ末端側および/またはカルボキシル末端側。上記(1)または(2)にて示されるアミノ酸配列がトリプルヘリカルドメインのアミノ末端に存在している場合は、当該(1)または(2)にて示されるアミノ酸配列のカルボキシル末端側)は切断されていなくてもよく、または1箇所以上が切断されていてもよい。 A part of the triple helical domain other than the amino acid sequence shown in (1) or (2) (that is, the amino acid sequence shown in (1) or (2) above exists inside the triple helical domain. In the case, the amino acid sequence shown in (1) or (2) is on the amino-terminal side and / or the carboxyl-terminal side. The amino acid sequence shown in (1) or (2) above is at the amino-terminal side of the triple helical domain. If it is present, the (carboxyl-terminal side of the amino acid sequence shown in (1) or (2)) may not be cleaved, or one or more of them may be cleaved.
上記X1〜X6の各々は、任意のアミノ酸であり得、アミノ酸の種類は特に限定されない。また、X1〜X6の各々は、少なくとも一部が同じ種類のアミノ酸であってもよいし、全てが異なる種類のアミノ酸であってもよい。Each of the above X 1 to X 6 can be any amino acid, and the type of amino acid is not particularly limited. Further, each of X 1 to X 6 may be at least a part of the same type of amino acid, or may be all different types of amino acids.
例えば、X1〜X6の各々は、グリシン、アラニン、バリン、ロイシン、イソロイシン、セリン、スレオニン、チロシン、システイン、メチオニン、アスパラギン酸、アスパラギン、グルタミン酸、グルタミン、アルギニン、リシン、ヒスチジン、フェニルアラニン、チロシン、トリプトファン、ヒドロキシプロリン、ヒドロキシリシンのうちの何れであってもよい。For example, each of X 1 to X 6 includes glycine, alanine, valine, leucine, isoleucine, serine, threonine, tyrosine, cysteine, methionine, aspartic acid, aspartic acid, glutamic acid, glutamine, arginine, lysine, histidine, phenylalanine, tyrosine, It may be any of tryptophan, hydroxyproline and hydroxylysine.
更に具体的には、X1〜X6のうち、X1、X3およびX5が同じアミノ酸であり、その他が別のアミノ酸であってもよい。More specifically, among X 1 to X 6 , X 1 , X 3 and X 5 may be the same amino acid, and the others may be different amino acids.
更に具体的には、X1〜X6のうち、X1、X3およびX5からなる群から選択される少なくとも1つがプロリンであり、その他が任意のアミノ酸であってもよい。More specifically, of X 1 to X 6 , at least one selected from the group consisting of X 1 , X 3 and X 5 is proline, and the others may be arbitrary amino acids.
更に具体的には、X1がプロリンであり、X2〜X6が任意のアミノ酸であってもよい。More specifically, X 1 may be proline and X 2 to X 6 may be arbitrary amino acids.
更に具体的には、X1およびX3がプロリンであり、X2、X4〜X6が任意のアミノ酸であってもよい。More specifically, X 1 and X 3 may be proline, and X 2 , X 4 to X 6 may be arbitrary amino acids.
更に具体的には、X1、X3およびX5がプロリンであり、X2、X4およびX6が任意のアミノ酸であってもよい。More specifically, X 1 , X 3 and X 5 may be proline and X 2 , X 4 and X 6 may be arbitrary amino acids.
更に具体的には、X1、X3およびX5がプロリンであり、X2が側鎖に硫黄原子を含むアミノ酸(例えば、システインまたはメチオニン)または側鎖に水酸基を含むアミノ酸(例えば、ヒドロキシプロリン、ヒドロキシリシンまたはセリン)であり、X4およびX6が任意のアミノ酸であってもよい。More specifically, X 1 , X 3 and X 5 are prolines, and X 2 is an amino acid containing a sulfur atom in the side chain (eg, cysteine or methionine) or an amino acid containing a hydroxyl group in the side chain (eg, hydroxyproline). , hydroxy lysine or serine), X 4 and X 6 may be any amino acid.
更に具体的には、X1、X3およびX5がプロリンであり、X2が側鎖に硫黄原子を含むアミノ酸(例えば、システインまたはメチオニン)であり、X4が脂肪族の側鎖を有するアミノ酸(例えば、グリシン、アラニン、バリン、ロイシンまたはイソロイシン)または側鎖に水酸基を含むアミノ酸(例えば、ヒドロキシプロリン、ヒドロキシリシンまたはセリン)であり、X6が任意のアミノ酸であってもよい。More specifically, X 1 , X 3 and X 5 are prolins, X 2 is an amino acid containing a sulfur atom in the side chain (eg, cysteine or methionine), and X 4 has an aliphatic side chain. amino acids (e.g., glycine, alanine, valine, leucine or isoleucine) containing a hydroxyl group or a side chain (e.g., hydroxyproline, hydroxylysine or serine) is, X 6 may be any amino acid.
更に具体的には、X1、X3およびX5がプロリンであり、X2が側鎖に硫黄原子を含むアミノ酸(例えば、システインまたはメチオニン)であり、X4が脂肪族の側鎖を有するアミノ酸(例えば、グリシン、アラニン、バリン、ロイシンまたはイソロイシン)または側鎖に水酸基を含むアミノ酸(例えば、ヒドロキシプロリン、ヒドロキシリシンまたはセリン)であり、X6が側鎖に塩基を含むアミノ酸(例えば、アルギニン、リシンまたはヒスチジン)であってもよい。More specifically, X 1 , X 3 and X 5 are proline, X 2 is an amino acid containing a sulfur atom in the side chain (eg, cysteine or methionine), and X 4 has an aliphatic side chain. amino acids (e.g., glycine, alanine, valine, leucine or isoleucine) amino acids containing a hydroxyl group or a side chain (e.g., hydroxyproline, hydroxylysine or serine), the amino acid X 6 comprises a base on its side chain (e.g., arginine , Ricin or histidine).
更に具体的には、X1、X3およびX5がプロリンであり、X2がメチオニンであり、X4がアラニンまたはセリンであり、X6がアルギニンであってもよい。More specifically, X 1 , X 3 and X 5 may be proline, X 2 may be methionine, X 4 may be alanine or serine, and X 6 may be arginine.
上記(2)にて示されるアミノ酸配列では、X1〜X6の各々は、上述したX1〜X6と同じ構成であり得る。X7〜X14の具体的な構成について、以下に説明する。In the amino acid sequence shown in the above (2), each of X 1 to X 6 may be the same configuration as the X 1 to X 6 described above. The specific configurations of X 7 to X 14 will be described below.
上記X7〜X14の各々は、任意のアミノ酸であり得、アミノ酸の種類は特に限定されない。また、X7〜X14の各々は、少なくとも一部が同じ種類のアミノ酸であってもよいし、全てが異なる種類のアミノ酸であってもよい。Each of the above X 7 to X 14 can be any amino acid, and the type of amino acid is not particularly limited. Further, each of X 7 to X 14 may be at least a part of the same type of amino acid, or may be all different types of amino acids.
例えば、X7〜X14の各々は、グリシン、アラニン、バリン、ロイシン、イソロイシン、セリン、スレオニン、チロシン、システイン、メチオニン、アスパラギン酸、アスパラギン、グルタミン酸、グルタミン、アルギニン、リシン、ヒスチジン、フェニルアラニン、チロシン、トリプトファン、ヒドロキシプロリン、ヒドロキシリシンのうちの何れであってもよい。For example, each of X 7 to X 14 includes glycine, alanine, valine, leucine, isoleucine, serine, threonine, tyrosine, cysteine, methionine, aspartic acid, aspartic acid, glutamic acid, glutamine, arginine, lysine, histidine, phenylalanine, tyrosine, It may be any of tryptophan, hydroxyproline and hydroxylysine.
更に具体的には、X7〜X14のうち、X8、X9、X10、X12およびX13が同じアミノ酸であり、その他が別のアミノ酸であってもよい。More specifically, among X 7 to X 14 , X 8 , X 9 , X 10 , X 12 and X 13 may be the same amino acid, and the others may be different amino acids.
更に具体的には、X7〜X14のうち、X8、X9、X10、X12およびX13からなる群から選択される少なくとも1つがプロリンまたはヒドロキシプロリンであり、その他が任意のアミノ酸であってもよい。More specifically, of X 7 to X 14 , at least one selected from the group consisting of X 8 , X 9 , X 10 , X 12 and X 13 is proline or hydroxyproline, and the others are arbitrary amino acids. It may be.
更に具体的には、X7〜X14のうち、X8がプロリンまたはヒドロキシプロリンであり、その他が任意のアミノ酸であってもよい。More specifically, among the X 7 ~X 14, X 8 is proline or hydroxyproline, others may be any amino acid.
更に具体的には、X7〜X14のうち、X8およびX9がプロリンまたはヒドロキシプロリンであり、その他が任意のアミノ酸であってもよい。More specifically, among the X 7 ~X 14, X 8 and X 9 is proline or hydroxyproline, others may be any amino acid.
更に具体的には、X7〜X14のうち、X8、X9およびX10がプロリンまたはヒドロキシプロリンであり、その他が任意のアミノ酸であってもよい。More specifically, among X 7 to X 14 , X 8 , X 9 and X 10 may be proline or hydroxyproline, and the others may be arbitrary amino acids.
更に具体的には、X7〜X14のうち、X8、X9、X10およびX12がプロリンまたはヒドロキシプロリンであり、その他が任意のアミノ酸であってもよい。More specifically, among the X 7 to X 14, a X 8, X 9, X 10 and X 12 is proline or hydroxyproline, others may be any amino acid.
更に具体的には、X7〜X14のうち、X8、X9、X10、X12およびX13がプロリンまたはヒドロキシプロリンであり、その他が任意のアミノ酸であってもよい。More specifically, of X 7 to X 14 , X 8 , X 9 , X 10 , X 12 and X 13 may be proline or hydroxyproline, and the others may be arbitrary amino acids.
更に具体的には、X7〜X14のうち、X8、X9、X10、X12およびX13がプロリンまたはヒドロキシプロリンであり、X7が脂肪族の側鎖を有するアミノ酸(例えば、グリシン、アラニン、バリン、ロイシンまたはイソロイシン)であり、その他が任意のアミノ酸であってもよい。More specifically, of X 7 to X 14 , X 8 , X 9 , X 10 , X 12 and X 13 are proline or hydroxyproline, and X 7 is an amino acid having an aliphatic side chain (for example, Glycine, alanine, valine, leucine or isoleucine), and others may be any amino acids.
更に具体的には、X7〜X14のうち、X8、X9、X10、X12およびX13がプロリンまたはヒドロキシプロリンであり、X7およびX11が脂肪族の側鎖を有するアミノ酸(例えば、グリシン、アラニン、バリン、ロイシンまたはイソロイシン)であり、その他が任意のアミノ酸であってもよい。More specifically, among the X 7 to X 14, a X 8, X 9, X 10 , X 12 and X 13 is proline or hydroxyproline, an amino acid X 7 and X 11 has a side chain aliphatic (For example, glycine, alanine, valine, leucine or isoleucine), and others may be any amino acids.
更に具体的には、X7〜X14のうち、X8、X9、X10、X12およびX13がプロリンまたはヒドロキシプロリンであり、X7およびX11が脂肪族の側鎖を有するアミノ酸(例えば、グリシン、アラニン、バリン、ロイシンまたはイソロイシン)であり、X14が親水性でありかつ非解離性の側鎖を有するアミノ酸(セリン、スレオニン、アスパラギンまたはグルタミン)であってもよい。More specifically, among the X 7 to X 14, a X 8, X 9, X 10 , X 12 and X 13 is proline or hydroxyproline, an amino acid X 7 and X 11 has a side chain aliphatic (For example, glycine, alanine, valine, leucine or isoleucine), and X 14 may be an amino acid (serine, threonine, asparagine or glutamine) having a hydrophilic and non-dissociative side chain.
更に具体的には、X7〜X14のうち、X8、X9、X10、X12およびX13がプロリンまたはヒドロキシプロリンであり、X7がロイシンであり、X11がアラニンであり、X14がグルタミンであってもよい。More specifically, of X 7 to X 14 , X 8 , X 9 , X 10 , X 12 and X 13 are proline or hydroxyproline, X 7 is leucine, and X 11 is alanine. X 14 may be glutamine.
上記(3)にて示されるアミノ酸配列は、トリプルヘリカルドメインのアミノ末端に位置している。つまり、Y3とY4との間に位置しているGは、トリプルヘリカルドメイン内の最もアミノ末端側に位置しているグリシンを示している。そして、Y1、Y2およびY3は、コラーゲンまたはアテロコラーゲンを構成する複数種類のポリペプチド鎖内において、トリプルヘリカルドメインよりもアミノ末端側に位置しているアミノ酸を示している。The amino acid sequence shown in (3) above is located at the amino terminus of the triple helical domain. That is, G located between Y 3 and Y 4 indicates glycine located on the most amino-terminal side in the triple helical domain. Then, Y 1 , Y 2 and Y 3 indicate amino acids located on the amino-terminal side of the triple helical domain in a plurality of types of polypeptide chains constituting collagen or atelocollagen.
また、当該(3)にて示されるアミノ酸配列のカルボキシル末端側に、1個以上、5個以上、10個以上、50個以上、100個以上、150個以上、200個以上、250個以上または300個以上の「Gly−X−Y」(XおよびYは任意のアミノ酸)が連続するアミノ酸配列が存在していてもよい。 Further, on the carboxyl-terminal side of the amino acid sequence shown in (3), 1 or more, 5 or more, 10 or more, 50 or more, 100 or more, 150 or more, 200 or more, 250 or more or There may be an amino acid sequence in which 300 or more "Gly-XY" (X and Y are arbitrary amino acids) are continuous.
トリプルヘリカルドメイン内の当該(3)にて示されるアミノ酸配列以外の部分(すなわち、上記(3)にて示されるアミノ酸配列のカルボキシル末端側)は切断されていなくてもよく、または1箇所以上が切断されていてもよい。 The part of the triple helical domain other than the amino acid sequence shown in (3) (that is, the carboxyl-terminal side of the amino acid sequence shown in (3) above) may not be cleaved, or one or more parts may be cleaved. It may be disconnected.
上記Y1〜Y9の各々は、任意のアミノ酸であり得、アミノ酸の種類は特に限定されない。また、Y1〜Y9の各々は、少なくとも一部が同じ種類のアミノ酸であってもよいし、全てが異なる種類のアミノ酸であってもよい。Each of the above Y 1 to Y 9 can be any amino acid, and the type of amino acid is not particularly limited. Further, each of Y 1 to Y 9 may be at least a part of the same type of amino acid, or may be all different types of amino acids.
例えば、Y1〜Y9の各々は、グリシン、アラニン、バリン、ロイシン、イソロイシン、セリン、スレオニン、チロシン、システイン、メチオニン、アスパラギン酸、アスパラギン、グルタミン酸、グルタミン、アルギニン、リシン、ヒスチジン、フェニルアラニン、チロシン、トリプトファン、ヒドロキシプロリン、ヒドロキシリシンのうちの何れであってもよい。For example, each of Y 1 to Y 9 is glycine, alanine, valine, leucine, isoleucine, serine, threonine, tyrosine, cysteine, methionine, aspartic acid, aspartic acid, glutamic acid, glutamine, arginine, lysine, histidine, phenylalanine, tyrosine, It may be any of tryptophan, hydroxyproline and hydroxylysine.
更に具体的には、Y3がプロリンであり、Y1およびY2が任意のアミノ酸であってもよい。More specifically, Y 3 may be proline and Y 1 and Y 2 may be arbitrary amino acids.
更に具体的には、Y3がプロリンであり、Y1およびY2が脂肪族の側鎖を有するアミノ酸(例えば、グリシン、アラニン、バリン、ロイシンまたはイソロイシン)または側鎖に水酸基を含むアミノ酸(ヒドロキシプロリン、ヒドロキシリシンまたはセリン)であってもよい。More specifically, Y 3 is proline and Y 1 and Y 2 are amino acids having an aliphatic side chain (eg, glycine, alanine, valine, leucine or isoleucine) or amino acids having a hydroxyl group in the side chain (hydroxy). It may be proline, hydroxylycine or serine).
更に具体的には、Y3がプロリンであり、Y1がアラニンまたはセリンであり、Y2がバリンであってもよい。More specifically, Y 3 may be proline, Y 1 may be alanine or serine, and Y 2 may be valine.
このとき、Y4〜Y9の具体的な構成は、特に限定されないが、Y4とX1とが同じアミノ酸であり、Y5とX2とが同じアミノ酸であり、Y6とX3とが同じアミノ酸であり、Y7とX4とが同じアミノ酸であり、Y8とX5とが同じアミノ酸であり、Y9とX6とが同じアミノ酸であってもよい。At this time, the specific composition of Y 4 to Y 9 is not particularly limited, but Y 4 and X 1 are the same amino acids, Y 5 and X 2 are the same amino acids, and Y 6 and X 3 are May be the same amino acid, Y 7 and X 4 may be the same amino acid, Y 8 and X 5 may be the same amino acid, and Y 9 and X 6 may be the same amino acid.
従来のコラーゲン、および、アテロコラーゲンは、ヒトの体温に近い温度では溶け難い。一方、本発明の一実施形態に用いるコラーゲンの分解物またはアテロコラーゲンの分解物は、ヒトの体温に近い温度でも液体状であり得る。 Conventional collagen and atelocollagen are difficult to melt at temperatures close to human body temperature. On the other hand, the decomposition product of collagen or the decomposition product of atelocollagen used in one embodiment of the present invention can be in a liquid state even at a temperature close to human body temperature.
また、本発明の一実施形態に用いるコラーゲンの分解物またはアテロコラーゲンの分解物は、従来のコラーゲンの分解物またはアテロコラーゲンの分解物と比較して、ゲル化し始める濃度が高い。 Further, the collagen decomposition product or the atelocollagen decomposition product used in one embodiment of the present invention has a higher concentration at which gelation begins than the conventional collagen decomposition product or the atelocollagen decomposition product.
本発明の一実施形態に用いるコラーゲンの分解物またはアテロコラーゲンの分解物には、コラーゲンまたはアテロコラーゲンのトリプルヘリカルドメイン内の上記(1)にて示されるアミノ酸配列の、X1とX2との間の化学結合、X2とGとの間の化学結合、GとX3との間の化学結合、X4とGとの間の化学結合、または、X6とGとの間の化学結合が切断された、コラーゲンの分解物またはアテロコラーゲンの分解物が含まれている。The decomposition product or decomposition product of atelocollagen collagen used in an embodiment of the present invention, the amino acid sequence shown in the above (1) in the triple helical domain of collagen or atelocollagen, between X 1 and X 2 A chemical bond, a chemical bond between X 2 and G, a chemical bond between G and X 3 , a chemical bond between X 4 and G, or a chemical bond between X 6 and G is broken. It contains a decomposition product of collagen or a decomposition product of atelocollagen.
本発明の一実施形態に用いるコラーゲンの分解物またはアテロコラーゲンの分解物には、コラーゲンまたはアテロコラーゲンのトリプルヘリカルドメイン内の上記(2)にて示されるアミノ酸配列の、X1とX2との間の化学結合、X2とGとの間の化学結合、GとX3との間の化学結合、X4とGとの間の化学結合、X6とGとの間の化学結合、GとX7との間の化学結合、または、X14とGとの間の化学結合が切断された、コラーゲンの分解物またはアテロコラーゲンの分解物が含まれている。The decomposition product or decomposition product of atelocollagen collagen used in an embodiment of the present invention, the amino acid sequence shown in the above (2) in the triple helical domain of collagen or atelocollagen, between X 1 and X 2 Chemical bond, chemical bond between X 2 and G, chemical bond between G and X 3 , chemical bond between X 4 and G, chemical bond between X 6 and G, G and X It contains a degradation product of collagen or a degradation product of atelocollagen in which the chemical bond between 7 or the chemical bond between X 14 and G is broken.
また、本発明の一実施形態に用いるコラーゲンの分解物またはアテロコラーゲンの分解物には、コラーゲンまたはアテロコラーゲンのトリプルヘリカルドメインのアミノ末端の上記(3)にて示されるアミノ酸配列の、Y1とY2との間の化学結合が切断された、コラーゲンの分解物またはアテロコラーゲンの分解物が含まれている。Further, the collagen decomposition product or the atelocollagen decomposition product used in one embodiment of the present invention includes Y 1 and Y 2 of the amino acid sequence shown in (3) above at the amino terminus of the triple helical domain of collagen or atelocollagen. It contains a degradation product of collagen or a degradation product of atelocollagen in which the chemical bond between and is broken.
上記切断は、適宜所望の方法によって行うことができる。 The above-mentioned cutting can be appropriately performed by a desired method.
例えば、既に切断されている状態のコラーゲンまたはアテロコラーゲンを、化学合成法によって作製することが可能である。なお、化学合成法としては、一般的な周知の化学合成法を用いることが可能である。 For example, collagen or atelocollagen in an already cleaved state can be produced by a chemical synthesis method. As the chemical synthesis method, a general well-known chemical synthesis method can be used.
また、既に切断されている状態のコラーゲンまたはアテロコラーゲンをコードするDNAを周知のタンパク質発現ベクターに挿入する。そして、当該タンパク質発現ベクターを所望の宿主(例えば、大腸菌、酵母、昆虫細胞、動物細胞など)に導入した後、当該宿主内で、既に切断されている状態のコラーゲンまたはアテロコラーゲンの発現を誘導する。これによって、既に切断されている状態のコラーゲンまたはアテロコラーゲンを作製することも可能である。 In addition, DNA encoding already cleaved collagen or atelocollagen is inserted into a well-known protein expression vector. Then, after introducing the protein expression vector into a desired host (for example, Escherichia coli, yeast, insect cells, animal cells, etc.), the expression of collagen or atelocollagen in a already cleaved state is induced in the host. This also makes it possible to produce collagen or atelocollagen that has already been cleaved.
また、コラーゲンまたはアテロコラーゲンを酵素(例えば、プロテアーゼ(例えば、システインプロテアーゼ))によって分解することによって上記切断を行うことも可能である。 It is also possible to perform the above cleavage by degrading collagen or atelocollagen with an enzyme (eg, protease (eg, cysteine protease)).
上記切断を行う方法の詳細については、後述する。 The details of the cutting method will be described later.
(I.コラーゲンの分解物またはアテロコラーゲンの分解物の製造方法)
コラーゲンの分解物またはアテロコラーゲンの分解物の製造方法は、
A)コラーゲンまたはアテロコラーゲンのトリプルヘリカルドメイン内の下記(1)にて示されるアミノ酸配列の、X1とX2との間の化学結合、X2とGとの間の化学結合、GとX3との間の化学結合、X4とGとの間の化学結合、または、X6とGとの間の化学結合を切断する、切断工程、または、
B)コラーゲンまたはアテロコラーゲンのトリプルヘリカルドメイン内の下記(2)にて示されるアミノ酸配列の、X1とX2との間の化学結合、X2とGとの間の化学結合、GとX3との間の化学結合、X4とGとの間の化学結合、X6とGとの間の化学結合、GとX7との間の化学結合、または、X14とGとの間の化学結合を切断する、切断工程、または、
C)コラーゲンまたはアテロコラーゲンのトリプルヘリカルドメインのアミノ末端の下記(3)にて示されるアミノ酸配列の、Y1とY2との間の化学結合を切断する、切断工程、を含む製造方法である:
(1)−G−X1−X2−G−X3−X4−G−X5−X6−G−;
(2)−G−X1−X2−G−X3−X4−G−X5−X6−G−X7−X8−G−X9−X10−G−X11−X12−G−X13−X14−G−;
(3)−Y1−Y2−Y3−G−Y4−Y5−G−Y6−Y7−G−Y8−Y9−G−;
(但し、Gは、グリシンであり、X1〜X14およびY1〜Y9は、任意のアミノ酸である)。(I. Method for producing a decomposition product of collagen or a decomposition product of atelocollagen)
The method for producing collagen decomposition products or atelocollagen decomposition products is as follows.
The amino acid sequence represented by A) below in the triple helical domain of collagen or atelocollagen (1), the chemical bond between X 1 and X 2, the chemical bond between X 2 and G, G and X 3 chemical bonding, between the chemical binding, X 4 and G between or to cut the chemical bond between X 6 and G, the cutting process, or
The amino acid sequence represented by the following (2) B) in the triple helical domain of collagen or atelocollagen, a chemical bond between X 1 and X 2, the chemical bond between X 2 and G, G and X 3 chemical bond between the chemical bond between X 4 and G, chemical bond between X 6 and G, chemical bond between G and X 7, or, between X 14 and G Breaking chemical bonds, cutting steps, or
C) A production method comprising a cleavage step of cleaving the chemical bond between Y 1 and Y 2 of the amino acid sequence shown in (3) below at the amino terminus of the triple helical domain of collagen or atelocollagen:
(1) -G-X 1- X 2- G-X 3- X 4- G-X 5- X 6 -G-;
(2) -G-X 1- X 2- G-X 3- X 4- G-X 5- X 6- G-X 7- X 8- G-X 9- X 10- G-X 11- X 12- G-X 13- X 14 -G-;
(3) -Y 1- Y 2- Y 3- G-Y 4- Y 5- G-Y 6- Y 7- G-Y 8- Y 9 -G-;
(However, G is glycine, and X 1 to X 14 and Y 1 to Y 9 are arbitrary amino acids).
また、コラーゲンの分解物またはアテロコラーゲンの分解物の製造方法は、以下の切断工程を含む製造方法であってもよい。つまり、
D)コラーゲンまたはアテロコラーゲンのトリプルヘリカルドメイン内の下記(1)にて示されるアミノ酸配列の、X1とX2との間の化学結合、X2とGとの間の化学結合、GとX3との間の化学結合、X4とGとの間の化学結合、および、X6とGとの間の化学結合から選択される何れか1つの化学結合を切断する、切断工程、または、
E)コラーゲンまたはアテロコラーゲンのトリプルヘリカルドメイン内の下記(2)にて示されるアミノ酸配列の、X1とX2との間の化学結合、X2とGとの間の化学結合、GとX3との間の化学結合、X4とGとの間の化学結合、X6とGとの間の化学結合、GとX7との間の化学結合、および、X14とGとの間の化学結合から選択される何れか1つの化学結合を切断する、切断工程、または、
F)コラーゲンまたはアテロコラーゲンのトリプルヘリカルドメインのアミノ末端の下記(3)にて示されるアミノ酸配列の、Y1とY2との間の化学結合を切断する、切断工程:
(1)−G−X1−X2−G−X3−X4−G−X5−X6−G−:
(2)−G−X1−X2−G−X3−X4−G−X5−X6−G−X7−X8−G−X9−X10−G−X11−X12−G−X13−X14−G−:
(3)−Y1−Y2−Y3−G−Y4−Y5−G−Y6−Y7−G−Y8−Y9−G−:
(但し、Gは、グリシンであり、X1〜X14およびY1〜Y9は、任意のアミノ酸である)。Further, the method for producing the decomposed product of collagen or the decomposed product of atelocollagen may be a production method including the following cutting steps. In other words
D) the amino acid sequence represented by the following (1) in the triple helical domain of collagen or atelocollagen, a chemical bond between X 1 and X 2, the chemical bond between X 2 and G, G and X 3 chemical bond, chemical bond between X 4 and G, and disconnects any one chemical bond selected from a chemical bond between X 6 and G between the cutting step or,
The amino acid sequence represented by the following (2) in the triple helical domain of E) collagen or atelocollagen, a chemical bond between X 1 and X 2, the chemical bond between X 2 and G, G and X 3 chemical bond between the chemical bond between X 4 and G, chemical bond between X 6 and G, chemical bond between G and X 7, and, between X 14 and G A cutting step, or a cutting step, that cleaves any one of the chemical bonds selected from the chemical bonds
F) Cleavage step of cleaving the chemical bond between Y 1 and Y 2 of the amino acid sequence shown in (3) below at the amino terminus of the triple helical domain of collagen or atelocollagen:
(1) -G-X 1- X 2- G-X 3- X 4- G-X 5- X 6 -G-:
(2) -G-X 1- X 2- G-X 3- X 4- G-X 5- X 6- G-X 7- X 8- G-X 9- X 10- G-X 11- X 12- G-X 13- X 14 -G-:
(3) -Y 1- Y 2- Y 3- G-Y 4- Y 5- G-Y 6- Y 7- G-Y 8- Y 9 -G-:
(However, G is glycine, and X 1 to X 14 and Y 1 to Y 9 are arbitrary amino acids).
以下に、各構成について詳細に説明する。なお、コラーゲンの分解物またはアテロコラーゲンの分解物自体については既に説明したので、ここでは、その説明を省略する。 Each configuration will be described in detail below. Since the decomposition product of collagen or the decomposition product of atelocollagen itself has already been described, the description thereof will be omitted here.
上記切断工程は、(1)〜(3)にて示されるアミノ酸配列の特定の箇所の化学結合を切断する工程であればよく、具体的な構成は特に限定されない。 The cutting step may be any step as long as it is a step of cutting a chemical bond at a specific portion of the amino acid sequence shown in (1) to (3), and the specific configuration is not particularly limited.
上記切断工程は、実際にトリプルヘリカルドメイン内の化学結合を切断して、コラーゲンの分解物またはアテロコラーゲンの分解物を作製する工程であってもよい(例えば、酵素法)。 The above-mentioned cleavage step may be a step of actually cleaving the chemical bond in the triple helical domain to prepare a decomposition product of collagen or a decomposition product of atelocollagen (for example, an enzymatic method).
また、既にトリプルヘリカルドメイン内の化学結合が切断されているコラーゲンの分解物またはアテロコラーゲンの分解物を作製する工程(例えば、化学合成法、組み換えタンパク質の発現)を本願における「切断工程」の概念に含めることもできる。 In addition, the step of producing a degradation product of collagen or a degradation product of atelocollagen in which the chemical bond in the triple helical domain has already been cleaved (for example, a chemical synthesis method, expression of a recombinant protein) is incorporated into the concept of "cleaving step" in the present application. It can also be included.
以下に、上述した切断工程の詳細を説明する。 The details of the cutting process described above will be described below.
(I−i.酵素法に基づく切断工程)
酵素法に基づく切断工程を採用する場合には、例えば、以下のように切断工程を構成することができる。(Ii. Cutting step based on enzymatic method)
When the cutting step based on the enzymatic method is adopted, for example, the cutting step can be configured as follows.
上記切断工程は、コラーゲンまたはアテロコラーゲンを酵素(例えば、プロテアーゼ(例えば、システインプロテアーゼ))によって分解することによって行うことが可能である。 The cleavage step can be performed by degrading collagen or atelocollagen with an enzyme (eg, protease (eg, cysteine protease)).
上記酵素としては特に限定されないが、例えば、システインプロテアーゼを用いることが好ましい。 The enzyme is not particularly limited, but for example, cysteine protease is preferably used.
システインプロテアーゼとしては、塩基性アミノ酸量よりも酸性アミノ酸量の方が多いシステインプロテアーゼ、酸性領域の水素イオン濃度において活性であるシステインプロテアーゼを用いることが好ましい。 As the cysteine protease, it is preferable to use a cysteine protease having a larger amount of acidic amino acids than a basic amino acid amount, or a cysteine protease that is active at a hydrogen ion concentration in an acidic region.
このようなシステインプロテアーゼとしては、カテプシンB[EC 3.4.22.1]、パパイン[EC 3.4.22.2]、フィシン[EC 3.4.22.3]、アクチニダイン[EC 3.4.22.14]、カテプシンL[EC 3.4.22.15]、カテプシンH[EC 3.4.22.16]、カテプシンS[EC 3.4.22.27]、ブロメライン[EC 3.4.22.32]、カテプシンK[EC 3.4.22.38]、アロライン、カルシウム依存性プロテアーゼなどを挙げることが可能である。 Examples of such cysteine proteases include cathepsin B [EC 3.4.22.1.], Papain [EC 3.4.22.2], ficin [EC 3.4.22.3], and actinidyne [EC 3. 4.22.14], cathepsin L [EC 3.4.22.15], cathepsin H [EC 3.4.22.16], cathepsin S [EC 3.4.22.27], bromelain [EC 3] 4.22.32], cathepsin K [EC 3.4.22.38], bromelain, calcium-dependent proteases and the like.
これらの中では、パパイン、フィシン、アクチニダイン、カテプシンK、アロラインまたはブロメラインを用いることが好ましく、パパイン、フィシン、アクチニダイン、カテプシンKを用いることが更に好ましい。 Among these, papain, ficin, actinidyne, cathepsin K, alloline or bromelain are preferably used, and papain, ficin, actinidyne and cathepsin K are even more preferred.
上述した酵素は、公知の方法によって入手することができる。例えば、化学合成による酵素の作製;細菌、真菌、各種動植物の細胞または組織からの酵素の抽出;遺伝子工学的手段による酵素の作製;などによって入手することができる。勿論、市販の酵素を用いることも可能である。 The above-mentioned enzymes can be obtained by known methods. For example, it can be obtained by producing an enzyme by chemical synthesis; extracting an enzyme from cells or tissues of bacteria, fungi, various animals and plants; producing an enzyme by genetic engineering means; and the like. Of course, it is also possible to use a commercially available enzyme.
コラーゲンまたはアテロコラーゲンを酵素(例えば、プロテアーゼ)によって分解することによって切断工程を行う場合には、例えば、以下の(i)〜(iii)の方法にしたがって切断工程を行うことができる。以下の(i)〜(iii)の方法は、あくまでも切断工程の一例であって、本発明は、これら(i)〜(iii)の方法に限定されない。 When the cleavage step is performed by decomposing collagen or atelocollagen with an enzyme (for example, protease), the cleavage step can be performed according to the following methods (i) to (iii), for example. The following methods (i) to (iii) are merely examples of cutting steps, and the present invention is not limited to these methods (i) to (iii).
なお、以下の(i)および(ii)の方法は、(1)または(2)にて示されるアミノ酸配列の特定の箇所の化学結合を切断するために用いられる方法の一例であり、以下の(iii)の方法は、(3)にて示されるアミノ酸配列の特定の箇所の化学結合を切断するために用いられる方法の一例である。 The following methods (i) and (ii) are examples of methods used for cleaving a chemical bond at a specific portion of the amino acid sequence shown in (1) or (2), and are described below. The method (iii) is an example of a method used for cleaving a chemical bond at a specific portion of the amino acid sequence shown in (3).
(i)高濃度の塩の存在下にて、コラーゲンまたはアテロコラーゲンと、酵素とを接触させる方法。 (I) A method of contacting collagen or atelocollagen with an enzyme in the presence of a high concentration of salt.
(ii)高濃度の塩と接触させた後の酵素と、コラーゲンまたはアテロコラーゲンとを接触させる方法。 (Ii) A method of contacting collagen or atelocollagen with an enzyme after contact with a high concentration salt.
(iii)低濃度の塩の存在下にて、コラーゲンまたはアテロコラーゲンと、酵素とを接触させる方法。 (Iii) A method of contacting collagen or atelocollagen with an enzyme in the presence of a low concentration of salt.
上述した(i)の方法の具体例としては、例えば、高濃度の塩を含む水溶液中で、コラーゲンまたはアテロコラーゲンと、酵素とを接触させる方法を挙げることができる。 Specific examples of the method (i) described above include a method of contacting collagen or atelocollagen with an enzyme in an aqueous solution containing a high concentration of salt.
上述した(ii)の方法の具体例としては、例えば、高濃度の塩を含む水溶液と酵素とを予め接触させ、その後、当該酵素と、コラーゲンまたはアテロコラーゲンとを接触させる方法を挙げることができる。 Specific examples of the above-mentioned method (ii) include, for example, a method in which an aqueous solution containing a high-concentration salt is brought into contact with an enzyme in advance, and then the enzyme is brought into contact with collagen or atelocollagen.
上述した(iii)の方法の具体例としては、例えば、低濃度の塩を含む水溶液中で、コラーゲンまたはアテロコラーゲンと、酵素とを接触させる方法を挙げることができる。 Specific examples of the above-mentioned method (iii) include a method in which collagen or atelocollagen is brought into contact with an enzyme in an aqueous solution containing a low-concentration salt.
上記水溶液の具体的な構成としては特に限定されないが、例えば、水を用いることが可能である。 The specific composition of the aqueous solution is not particularly limited, but for example, water can be used.
上記塩の具体的な構成としては特に限定されないが、塩化物を用いることが好ましい。塩化物としては、特に限定されないが、例えば、NaCl、KCl、LiClまたはMgCl2を用いることが可能である。The specific composition of the salt is not particularly limited, but it is preferable to use chloride. The chloride is not particularly limited, but for example, NaCl, KCl, LiCl or MgCl 2 can be used.
上記高濃度の塩を含む水溶液における塩の濃度は特に限定されないが、高いほど好ましいといえる。例えば、当該濃度は、200mM以上であることが好ましく、500mM以上であることがより好ましく、1000mM以上であることがより好ましく、1500mM以上であることがより好ましく、2000mM以上であることが最も好ましい。 The concentration of the salt in the aqueous solution containing the high-concentration salt is not particularly limited, but it can be said that the higher the concentration, the more preferable. For example, the concentration is preferably 200 mM or more, more preferably 500 mM or more, more preferably 1000 mM or more, more preferably 1500 mM or more, and most preferably 2000 mM or more.
上記高濃度の塩を含む水溶液における塩の濃度の上限値は、特に限定されないが、例えば2500mMであり得る。塩の濃度が2500mMよりも高くなると、タンパク質の多くが塩析してしまい、その結果、酵素によるコラーゲンまたはアテロコラーゲンの分解効率が低下する傾向を示す。一方、塩の濃度が2500mM以下であれば、酵素によるコラーゲンまたはアテロコラーゲンの分解効率を高くすることができる。 The upper limit of the salt concentration in the aqueous solution containing the high-concentration salt is not particularly limited, but may be, for example, 2500 mM. When the salt concentration is higher than 2500 mM, most of the proteins are salted out, and as a result, the efficiency of enzymatic decomposition of collagen or atelocollagen tends to decrease. On the other hand, when the salt concentration is 2500 mM or less, the enzymatic decomposition efficiency of collagen or atelocollagen can be increased.
したがって、上記高濃度の塩を含む水溶液における塩の濃度は、200mM以上2500mM以下であることが好ましく、500mM以上2500mM以下であることがより好ましく、1000mM以上2500mM以下であることがより好ましく、1500mM以上2500mM以下であることがより好ましく、2000mM以上2500mM以下であることが最も好ましい。 Therefore, the salt concentration in the aqueous solution containing the high-concentration salt is preferably 200 mM or more and 2500 mM or less, more preferably 500 mM or more and 2500 mM or less, more preferably 1000 mM or more and 2500 mM or less, and more preferably 1500 mM or more. It is more preferably 2500 mM or less, and most preferably 2000 mM or more and 2500 mM or less.
上記高濃度の塩を含む水溶液における塩の濃度が高いほど、酵素によるコラーゲンまたはアテロコラーゲンの切断箇所の特異性を上げることができる。その結果、本発明の一実施形態に用いるコラーゲンの分解物またはアテロコラーゲンの分解物を、より均一で、かつ、生理活性が高いものにすることができる。 The higher the salt concentration in the aqueous solution containing the high-concentration salt, the higher the specificity of the cut portion of collagen or atelocollagen by the enzyme. As a result, the collagen decomposition product or the atelocollagen decomposition product used in one embodiment of the present invention can be made more uniform and have high physiological activity.
上記低濃度の塩を含む水溶液における塩の濃度は特に限定されないが、低いほど好ましいといえる。例えば、当該濃度は、200mMよりも低いことが好ましく、150mM以下であることがより好ましく、100mM以下であることがより好ましく、50mM以下であることがより好ましく、略0mMであることが最も好ましい。 The concentration of the salt in the aqueous solution containing the low-concentration salt is not particularly limited, but it can be said that the lower the concentration, the more preferable. For example, the concentration is preferably lower than 200 mM, more preferably 150 mM or less, more preferably 100 mM or less, more preferably 50 mM or less, and most preferably approximately 0 mM.
上記水溶液(例えば、水)に溶解させるコラーゲンまたはアテロコラーゲンの量は特に限定されないが、例えば、1000重量部〜10000重量部の水溶液に対して、1重量部のコラーゲンまたはアテロコラーゲンを溶解させることが好ましい。 The amount of collagen or atelocollagen to be dissolved in the above aqueous solution (for example, water) is not particularly limited, but for example, it is preferable to dissolve 1 part by weight of collagen or atelocollagen in 1000 parts by weight to 10,000 parts by weight of the aqueous solution.
上記構成であれば、水溶液に対して酵素が加えられた場合、当該酵素とコラーゲンまたはアテロコラーゲンとを効率よく接触させることができる。そして、その結果、コラーゲンまたはアテロコラーゲンを酵素(例えば、プロテアーゼ)によって効率よく分解することができる。 With the above configuration, when an enzyme is added to an aqueous solution, the enzyme can be efficiently brought into contact with collagen or atelocollagen. As a result, collagen or atelocollagen can be efficiently decomposed by an enzyme (for example, protease).
上記水溶液に加える酵素の量は特に限定されないが、例えば、100重量部のコラーゲンまたはアテロコラーゲンに対して、10重量部〜20重量部の酵素を加えることが好ましい。 The amount of the enzyme added to the aqueous solution is not particularly limited, but for example, it is preferable to add 10 parts by weight to 20 parts by weight of the enzyme with respect to 100 parts by weight of collagen or atelocollagen.
上記構成であれば、水溶液中の酵素の濃度が高いので、コラーゲンまたはアテロコラーゲンを酵素(例えば、プロテアーゼ)によって効率よく分解することができる。 With the above configuration, since the concentration of the enzyme in the aqueous solution is high, collagen or atelocollagen can be efficiently decomposed by the enzyme (for example, protease).
水溶液中でコラーゲンまたはアテロコラーゲンと酵素とを接触させるときの他の条件(例えば、水溶液のpH、温度、接触時間など)も特に限定されず、適宜、設定することができるが以下の範囲であることが好ましい。 Other conditions (for example, pH, temperature, contact time, etc. of the aqueous solution) when contacting collagen or atelocollagen with the enzyme in the aqueous solution are not particularly limited and can be appropriately set, but the range is as follows. Is preferable.
1)水溶液のpHは、pH2.0〜7.0が好ましく、pH2.5〜6.5が更に好ましい。水溶液のpHを上述した範囲に保つために、水溶液に対して周知のバッファーを加えることが可能である。上記pHであれば、水溶液中にコラーゲンまたはアテロコラーゲンを均一に溶解することができ、その結果、酵素反応を効率よく進めることができる。 1) The pH of the aqueous solution is preferably pH 2.0 to 7.0, and more preferably pH 2.5 to 6.5. A well-known buffer can be added to the aqueous solution to keep the pH of the aqueous solution in the above range. At the above pH, collagen or atelocollagen can be uniformly dissolved in the aqueous solution, and as a result, the enzymatic reaction can be efficiently promoted.
2)温度は特に限定されず、用いる酵素に応じて温度を選択すればよい。例えば、当該温度は、15℃〜40℃であることが好ましく、20℃〜35℃であることがより好ましい。 2) The temperature is not particularly limited, and the temperature may be selected according to the enzyme to be used. For example, the temperature is preferably 15 ° C to 40 ° C, more preferably 20 ° C to 35 ° C.
3)接触時間は特に限定されず、酵素の量、および/または、コラーゲンまたはアテロコラーゲンの量に応じて接触時間を選択すればよい。例えば、当該時間は、1時間〜60日間であることが好ましく、1日間〜7日間であることがより好ましく、3日間〜7日間であることが更に好ましい。 3) The contact time is not particularly limited, and the contact time may be selected according to the amount of enzyme and / or the amount of collagen or atelocollagen. For example, the time is preferably 1 hour to 60 days, more preferably 1 day to 7 days, and even more preferably 3 to 7 days.
なお、水溶液中でコラーゲンまたはアテロコラーゲンと酵素とを接触させた後、必要に応じて、pHを再調整する工程、酵素を失活させる工程、および、不純物を除去する工程からなる群より選択される少なくとも1つの工程を経てもよい。 It is selected from the group consisting of a step of adjusting the pH, a step of inactivating the enzyme, and a step of removing impurities, if necessary, after contacting collagen or atelocollagen with the enzyme in an aqueous solution. At least one step may be performed.
また、上記不純物を除去する工程は、物質を分離するための一般的な方法によって行うことができる。上記不純物を除去する工程は、例えば、透析、塩析、ゲル濾過クロマトグラフィー、など電点沈殿、イオン交換クロマトグラフィー、または、疎水性相互作用クロマトグラフィーなどによって行うことができる。 In addition, the step of removing the impurities can be performed by a general method for separating substances. The step of removing the impurities can be performed by, for example, dialysis, salting out, gel filtration chromatography, or the like, electrical point precipitation, ion exchange chromatography, or hydrophobic interaction chromatography.
上述したように、切断工程は、コラーゲンまたはアテロコラーゲンを酵素によって分解することによって行うことが可能である。このとき、分解されるコラーゲンまたはアテロコラーゲンは、生体組織中に含有された状態のものであってもよい。つまり、切断工程は、生体組織と酵素とを接触させることによって行うことも可能である。 As described above, the cutting step can be performed by enzymatically degrading collagen or atelocollagen. At this time, the collagen or atelocollagen to be decomposed may be in a state of being contained in the living tissue. That is, the cutting step can also be performed by bringing the biological tissue into contact with the enzyme.
生体組織としては、特に限定されず、その例として哺乳類または鳥類の真皮、腱、骨または筋膜、あるいは、魚類の皮膚または鱗を用いることができる。 The living tissue is not particularly limited, and examples thereof include the dermis, tendons, bones or fascia of mammals or birds, or the skin or scales of fish.
高い生理活性を維持し、かつ、多量にコラーゲンの分解物またはアテロコラーゲンの分解物を得るという観点からは、生体組織として真皮を用いることが好ましい。 From the viewpoint of maintaining high physiological activity and obtaining a large amount of collagen decomposition products or atelocollagen decomposition products, it is preferable to use the dermis as a biological tissue.
生体組織として真皮を用いる場合、酸性条件下で真皮と酵素とを接触させることが好ましい。例えば、上記酸性条件としては、好ましくはpH2.5〜6.5、更に好ましくはpH2.5〜5.0、更に好ましくはpH2.5〜4.0、最も好ましくはpH2.5〜3.5である。 When the dermis is used as a living tissue, it is preferable to bring the dermis into contact with an enzyme under acidic conditions. For example, the acidic conditions are preferably pH 2.5 to 6.5, more preferably pH 2.5 to 5.0, still more preferably pH 2.5 to 4.0, and most preferably pH 2.5 to 3.5. Is.
より具体的に、コラーゲンの分解物またはアテロコラーゲンの分解物の製造方法は、上記切断工程では、上記システインプロテアーゼと真皮とを接触させることによって、該真皮に含まれるコラーゲンと、上記システインプロテアーゼとを接触させることが好ましい。 More specifically, in the method for producing a decomposition product of collagen or a decomposition product of atelocollagen, in the cutting step, the cysteine protease is brought into contact with the dermis to bring the collagen contained in the dermis into contact with the cysteine protease. It is preferable to let it.
また、上記(1)または(2)にて示されるアミノ酸配列を有するコラーゲンの分解物またはアテロコラーゲンの分解物の製造方法は、上記切断工程では、200mM以上の濃度の塩の存在下にて、真皮と、システインプロテアーゼとを接触させることが好ましい。 In addition, the method for producing a degradation product of collagen or a degradation product of atelocollagen having the amino acid sequence shown in (1) or (2) above is the dermis in the presence of a salt having a concentration of 200 mM or more in the above-mentioned cleavage step. And cysteine protease are preferably brought into contact with each other.
また、上記(1)、(2)または(3)にて示されるアミノ酸配列を有するコラーゲンの分解物またはアテロコラーゲンの分解物の製造方法は、上記切断工程では、200mM以上の濃度の塩と接触させた後のシステインプロテアーゼと、真皮とを接触させることが好ましい。 Further, in the method for producing a degradation product of collagen or a degradation product of atelocollagen having the amino acid sequence shown in the above (1), (2) or (3), in the above cutting step, the decomposition product is brought into contact with a salt having a concentration of 200 mM or more. It is preferable to bring the subsequent cysteine protease into contact with the dermis.
また、上記(3)にて示されるアミノ酸配列を有するコラーゲンの分解物またはアテロコラーゲンの分解物の製造方法は、上記切断工程では、200mMよりも低い濃度の塩の存在下にて、真皮と、システインプロテアーゼとを接触させることが好ましい。 Further, in the method for producing a degradation product of collagen having the amino acid sequence shown in (3) above or a degradation product of atelocollagen, in the above-mentioned cleavage step, in the presence of a salt having a concentration lower than 200 mM, the dermis and cysteine Contact with protease is preferred.
(I−ii.化学合成法)
化学合成法に基づく切断工程を採用する場合には、例えば、以下のように切断工程を構成することができる。(I-iii. Chemical synthesis method)
When the cutting step based on the chemical synthesis method is adopted, for example, the cutting step can be configured as follows.
まず、周知のデータベースから、コラーゲンまたはアテロコラーゲンを構成する各ポリペプチド鎖のアミノ酸配列の情報を入手する。なお、当該ポリペプチド鎖は、コラーゲンまたはアテロコラーゲンのタイプに応じて適宜選択すればよく、1種類のポリペプチド鎖であってもよく、複数の種類のポリペプチド鎖であってもよい。 First, information on the amino acid sequence of each polypeptide chain constituting collagen or atelocollagen is obtained from a well-known database. The polypeptide chain may be appropriately selected depending on the type of collagen or atelocollagen, and may be one type of polypeptide chain or a plurality of types of polypeptide chains.
次いで、上記ポリペプチドの中から、切断されるべき化学結合を含むポリペプチド鎖および切断されるべき化学結合の位置を決定するとともに、当該化学結合が切断されたと想定したときの、所望のポリペプチド鎖のアミノ酸配列を決定する。 Next, from the above-mentioned polypeptides, the polypeptide chain containing the chemical bond to be cleaved and the position of the chemical bond to be cleaved are determined, and the desired polypeptide is assumed to be cleaved. Determine the amino acid sequence of the chain.
最後に、決定されたアミノ酸配列にしたがって、所望のポリペプチド鎖を周知の化学合成法によって合成する。 Finally, the desired polypeptide chain is synthesized by a well-known chemical synthesis method according to the determined amino acid sequence.
以上のようにして、切断工程を実施することができる。 As described above, the cutting step can be carried out.
コラーゲンの分解物またはアテロコラーゲンの分解物の製造方法は、上述した切断工程以外の工程を含むことも可能である。 The method for producing a decomposition product of collagen or a decomposition product of atelocollagen can also include a step other than the above-mentioned cutting step.
例えば、コラーゲンの分解物またはアテロコラーゲンの分解物の製造方法は、所望のポリペプチド鎖を周知の化学合成法によって合成した後で、合成されたポリペプチド鎖を精製する工程を含んでいてもよい。なお、当該精製は、適宜、周知のカラムを用いて行えばよい。 For example, a method for producing a degradation product of collagen or a degradation product of atelocollagen may include a step of synthesizing a desired polypeptide chain by a well-known chemical synthesis method and then purifying the synthesized polypeptide chain. The purification may be carried out using a well-known column as appropriate.
コラーゲンの分解物またはアテロコラーゲンの分解物の製造方法は、所望のポリペプチド鎖と、他のポリペプチド鎖とを混合する工程を含んでいてもよい。なお、他のポリペプチド鎖としては特に限定されず、同様に化学結合が切断されているポリペプチド鎖であってもよいし、化学結合が切断されていないポリペプチド鎖であってもよい。 The method for producing a degradation product of collagen or a degradation product of atelocollagen may include a step of mixing a desired polypeptide chain with another polypeptide chain. The other polypeptide chain is not particularly limited, and may be a polypeptide chain in which a chemical bond is similarly cleaved, or a polypeptide chain in which a chemical bond is not cleaved.
(I−iii.組み換えタンパク質の発現に基づく切断工程)
組み換えタンパク質の発現に基づく切断工程を採用する場合には、例えば、以下のように切断工程を構成することができる。(I-iii. Cleavage step based on expression of recombinant protein)
When the cleavage step based on the expression of the recombinant protein is adopted, for example, the cleavage step can be configured as follows.
まず、周知のデータベースから、コラーゲンまたはアテロコラーゲンを構成する各ポリペプチド鎖のアミノ酸配列の情報を入手する。なお、当該ポリペプチド鎖は、コラーゲンまたはアテロコラーゲンのタイプに応じて適宜選択すればよく、1種類のポリペプチド鎖であってもよく、複数の種類のポリペプチド鎖であってもよい。 First, information on the amino acid sequence of each polypeptide chain constituting collagen or atelocollagen is obtained from a well-known database. The polypeptide chain may be appropriately selected depending on the type of collagen or atelocollagen, and may be one type of polypeptide chain or a plurality of types of polypeptide chains.
次いで、上記ポリペプチドの中から、切断されるべき化学結合を含むポリペプチド鎖および切断されるべき化学結合の位置を決定するとともに、当該化学結合が切断されたと想定したときの、所望のポリペプチド鎖のアミノ酸配列およびDNA配列を決定する。 Next, from the above-mentioned polypeptides, the polypeptide chain containing the chemical bond to be cleaved and the position of the chemical bond to be cleaved are determined, and the desired polypeptide is assumed to be cleaved. The amino acid sequence and DNA sequence of the strand are determined.
次いで、所望のポリペプチド鎖をコードするDNAを周知のタンパク質発現ベクターに挿入する。そして、当該タンパク質発現ベクターを所望の宿主(例えば、大腸菌、酵母、昆虫細胞、動物細胞など)に導入した後、当該宿主内で、化学結合が切断された後のポリペプチド鎖を発現させる。 The DNA encoding the desired polypeptide chain is then inserted into a well-known protein expression vector. Then, after introducing the protein expression vector into a desired host (for example, Escherichia coli, yeast, insect cells, animal cells, etc.), the polypeptide chain after the chemical bond is cleaved is expressed in the host.
以上のようにして、切断工程を実施することができる。 As described above, the cutting step can be carried out.
コラーゲンの分解物またはアテロコラーゲンの分解物の製造方法は、上述した切断工程以外の工程を含むことも可能である。 The method for producing a decomposition product of collagen or a decomposition product of atelocollagen can also include a step other than the above-mentioned cutting step.
例えば、コラーゲンの分解物またはアテロコラーゲンの分解物の製造方法は、宿主内で、所望のポリペプチド鎖を発現させた後で、発現したポリペプチド鎖を精製する工程を含んでいてもよい。なお、当該精製は、適宜、周知のカラムを用いて行えばよい。 For example, a method for producing a degradation product of collagen or a degradation product of atelocollagen may include a step of expressing a desired polypeptide chain in a host and then purifying the expressed polypeptide chain. The purification may be carried out using a well-known column as appropriate.
コラーゲンの分解物またはアテロコラーゲンの分解物の製造方法は、所望のポリペプチド鎖と、他のポリペプチド鎖とを混合する工程を含んでいてもよい。なお、他のポリペプチド鎖としては特に限定されず、同様に化学結合が切断されているポリペプチド鎖であってもよいし、化学結合が切断されていないポリペプチド鎖であってもよい。 The method for producing a degradation product of collagen or a degradation product of atelocollagen may include a step of mixing a desired polypeptide chain with another polypeptide chain. The other polypeptide chain is not particularly limited, and may be a polypeptide chain in which a chemical bond is similarly cleaved, or a polypeptide chain in which a chemical bond is not cleaved.
〔2.胚様体形成用組成物〕
本発明の一実施形態に係る胚様体形成用組成物(以下、「本実施形態の胚様体形成用組成物」ともいう。)は、多能性幹細胞の胚様体形成用組成物であって、コラーゲンの分解物またはアテロコラーゲンの分解物を主成分として含み、上記分解物は、上記コラーゲンまたはアテロコラーゲンのトリプルヘリカルドメインの少なくとも一部分を含んでいるものである。つまり、上記分解物は、コラーゲンまたはアテロコラーゲンのトリプルヘリカルドメインの全体を含んでいてもよいし、トリプルヘリカルドメインの一部分を含んでいてもよい。上記「多能性幹細胞」、上記「胚様体」、および上記「コラーゲンの分解物またはアテロコラーゲンの分解物」については、上記「1.胚様体形成方法」の項で説明したとおりであるので、ここでは説明は省略する。[2. Composition for embryoid body formation]
The embryoid body-forming composition according to an embodiment of the present invention (hereinafter, also referred to as “embryoid body-forming composition of the present embodiment”) is a composition for embryoid body formation of pluripotent stem cells. The decomposition product of collagen or the decomposition product of atelocollagen is contained as a main component, and the decomposition product contains at least a part of the triple helical domain of the collagen or the atelocollagen. That is, the degradation product may contain the entire triple helical domain of collagen or atelocollagen, or may contain a portion of the triple helical domain. The above-mentioned "pluripotent stem cell", the above-mentioned "embryoid body", and the above-mentioned "collagen decomposition product or atelocollagen decomposition product" are as described in the above-mentioned "1. Embryoid body formation method". , The description is omitted here.
本実施形態の胚様体形成用組成物中には、胚様体形成活性を有する主成分として、コラーゲンの分解物またはアテロコラーゲンの分解物が含まれている。本実施形態の胚様体形成用組成物中に含まれる、コラーゲンの分解物またはアテロコラーゲンの分解物の量は特に限定されない。例えば、本実施形態の胚様体形成用組成物中に、コラーゲンの分解物またはアテロコラーゲンの分解物が、0.1重量%以上含まれていてもよいが、その中でも50重量%以上含まれていることが好ましく、更に90重量%以上含まれていることがより好ましく、100重量%含まれていることが最も好ましい。 The composition for embryoid body formation of the present embodiment contains a decomposition product of collagen or a decomposition product of atelocollagen as a main component having embryoid body formation activity. The amount of collagen decomposition products or atelocollagen decomposition products contained in the embryoid body-forming composition of the present embodiment is not particularly limited. For example, the composition for embryoid body formation of the present embodiment may contain a decomposition product of collagen or a decomposition product of atelocollagen in an amount of 0.1% by weight or more, and among them, 50% by weight or more is contained. It is more preferable that the content is 90% by weight or more, and 100% by weight is most preferable.
本実施形態の胚様体形成用組成物を用いて培養容器の内面をコートする場合は、本実施形態の胚様体形成用組成物を水等で希釈し、最終濃度として、2mg/mL〜20mg/mL、好ましくは3mg/mL〜16mg/mL、より好ましくは5mg/mL〜15mg/mL、あるいは5mg/mL〜20mg/mL、好ましくは8mg/mL〜16mg/mLのコラーゲンの分解物またはアテロコラーゲンの分解物を含有している溶液を調製し、当該溶液を用いて、培養容器の内面をコートすることができる。上記溶液における上記分解物の濃度が2mg/mL以上であれば、胚様体を均一に形成することができる。また、上記溶液における上記分解物の濃度が20mg/mL以下であれば、再現性が良好となる。これに対して、上記溶液における上記分解物の濃度が2mg/mL未満である場合は、胚様体の形成が不均一になる場合がある。また、上記溶液における上記分解物の濃度が20mg/mLよりも高い場合は、粘性が高くなり再現性が不良となる場合がある。 When the inner surface of the culture vessel is coated with the composition for forming an embryo-like body of the present embodiment, the composition for forming an embryo-like body of the present embodiment is diluted with water or the like, and the final concentration is 2 mg / mL or more. 20 mg / mL, preferably 3 mg / mL to 16 mg / mL, more preferably 5 mg / mL to 15 mg / mL, or 5 mg / mL to 20 mg / mL, preferably 8 mg / mL to 16 mg / mL collagen degradation or atelocollagen A solution containing the decomposition product of the above can be prepared, and the inner surface of the culture vessel can be coated with the solution. When the concentration of the decomposition product in the solution is 2 mg / mL or more, embryoid bodies can be uniformly formed. Further, when the concentration of the decomposition product in the solution is 20 mg / mL or less, the reproducibility is good. On the other hand, when the concentration of the decomposition product in the solution is less than 2 mg / mL, the formation of embryoid bodies may become non-uniform. Further, when the concentration of the decomposition product in the solution is higher than 20 mg / mL, the viscosity may be high and the reproducibility may be poor.
また、本実施形態の胚様体形成用組成物には、コラーゲンの分解物またはアテロコラーゲンの分解物以外の成分が添加されていてもよい。これらの成分としては特に限定されず、適宜、所望の成分を添加することができる。例えば、コラーゲンの分解物またはアテロコラーゲンの分解物を、濃縮培養液(例えば、5倍濃縮DMEMなど)と再構成用緩衝液(50mM 水酸化ナトリウム、260mM 炭酸水素ナトリウム、200mM HEPES)と混合して、ゲル化組成物としてもよい。この場合、コラーゲンの分解物またはアテロコラーゲンの分解物は、ゲル化組成物中に最終濃度として、2〜15mg/mL含まれていてもよく、5〜15mg/mL含まれていてもよく、5〜12mg/mL含まれていることが好ましく、7〜10mg/mL含まれていることがより好ましい。ゲル組成物中に含有されている上記分解物の濃度が、最終濃度として2mg/mL以上であれば、胚様体を均一に形成することができる。また、ゲル組成物中に含有されている上記分解物の濃度が、最終濃度として15mg/mL以下であれば、再現性が良好となる。これに対して、ゲル組成物中に含有されている上記分解物の濃度が、最終濃度として2mg/mL未満である場合は、胚様体の形成が不均一になる場合がある。また、ゲル組成物中に含有されている上記分解物の濃度が、最終濃度として15mg/mLよりも高い場合は、粘性が高くなり再現性が不良となる場合がある。 In addition, a component other than a decomposition product of collagen or a decomposition product of atelocollagen may be added to the composition for embryoid body formation of the present embodiment. These components are not particularly limited, and desired components can be added as appropriate. For example, a collagen degradation product or atelocollagen degradation product is mixed with a concentrated culture solution (for example, 5-fold concentrated DMEM, etc.) and a reconstitution buffer solution (50 mM sodium hydroxide, 260 mM sodium hydrogen carbonate, 200 mM HEPES). It may be a gelling composition. In this case, the decomposition product of collagen or the decomposition product of atelocollagen may be contained in the gelation composition as a final concentration of 2 to 15 mg / mL, 5 to 15 mg / mL, or 5 to 15 mg / mL. It is preferably contained at 12 mg / mL, more preferably at 7 to 10 mg / mL. When the concentration of the above-mentioned decomposition products contained in the gel composition is 2 mg / mL or more as the final concentration, embryoid bodies can be uniformly formed. Further, when the concentration of the decomposed product contained in the gel composition is 15 mg / mL or less as the final concentration, the reproducibility is good. On the other hand, when the concentration of the decomposition product contained in the gel composition is less than 2 mg / mL as the final concentration, the formation of embryoid bodies may become non-uniform. Further, when the concentration of the above-mentioned decomposed product contained in the gel composition is higher than 15 mg / mL as the final concentration, the viscosity may be high and the reproducibility may be poor.
上述したとおり、本発明の一実施形態に用いるコラーゲンの分解物またはアテロコラーゲンの分解物は、従来のコラーゲンの分解物またはアテロコラーゲンの分解物と比較して、ゲル化し始める濃度が高い。それ故に、従来のコラーゲンの分解物またはアテロコラーゲンの分解物がゲル化する濃度と同じ濃度の本発明の一実施形態に用いるコラーゲンの分解物またはアテロコラーゲンの分解物を、常温にて安定して保存できる。それ故に、本実施形態の胚様体形成用組成物は、常温にて安定して保存できる。 As described above, the collagen decomposition product or the atelocollagen decomposition product used in one embodiment of the present invention has a higher concentration at which gelation begins than the conventional collagen decomposition product or the atelocollagen decomposition product. Therefore, the collagen decomposition product or the atelocollagen decomposition product used in one embodiment of the present invention having the same concentration as the conventional collagen decomposition product or the atelocollagen decomposition product gelling can be stably stored at room temperature. .. Therefore, the composition for embryoid body formation of the present embodiment can be stably stored at room temperature.
本実施形態の胚様体形成用組成物を用いれば、多能性幹細胞の胚様体を容易に形成させることができる。また、本実施形態の胚様体形成用組成物を用いれば、従来の胚様体形成方法と比較して、より短期間で胚様体を形成させることができる。 By using the embryoid body forming composition of the present embodiment, the embryoid body of pluripotent stem cells can be easily formed. Further, by using the composition for forming an embryoid body of the present embodiment, an embryoid body can be formed in a shorter period of time as compared with a conventional method for forming an embryoid body.
本実施形態の胚様体形成用組成物は、由来動物、由来部位およびN末端(アミノ末端)切断部位に関わらず、上述した本実施形態の胚様体形成方法において使用することができる。 The composition for embryoid body formation of the present embodiment can be used in the embryoid body forming method of the present embodiment described above regardless of the origin animal, the origin site and the N-terminal (amino terminal) cleavage site.
本発明は上述した各実施形態に限定されるものではなく、請求項に示した範囲で種々の変更が可能であり、異なる実施形態にそれぞれ開示された技術的手段を適宜組み合わせて得られる実施形態についても本発明の技術的範囲に含まれる。さらに、各実施形態にそれぞれ開示された技術的手段を組み合わせることにより、新しい技術的特徴を形成することができる。 The present invention is not limited to the above-described embodiments, and various modifications can be made within the scope of the claims, and the embodiments obtained by appropriately combining the technical means disclosed in the different embodiments. Is also included in the technical scope of the present invention. Furthermore, new technical features can be formed by combining the technical means disclosed in each embodiment.
以下、本発明を実施例により具体的に説明するが、本発明は実施例によって限定されるものではない。 Hereinafter, the present invention will be specifically described with reference to Examples, but the present invention is not limited to Examples.
<1.ブタ由来のα1鎖の切断における、塩濃度の影響>
塩化ナトリウムの濃度が0mM、200mM、1000mM、1500mMまたは2000mMである50mM クエン酸緩衝液(pH3.0)を準備した。なお、当該水溶液の溶媒としては、水を用いた。<1. Effect of salt concentration on porcine-derived α1 chain cleavage>
A 50 mM citrate buffer (pH 3.0) having a sodium chloride concentration of 0 mM, 200 mM, 1000 mM, 1500 mM or 2000 mM was prepared. Water was used as the solvent for the aqueous solution.
アクチニダインを活性化するため、10mM ジチオスレイトールを含む50mM リン酸緩衝液(pH6.5)に対し、アクチニダインを溶解し、90分間、25℃にて静置した。なお、アクチニダインとしては、周知の方法にて精製したものを利用した(例えば、非特許文献2参照)。 To activate actinidyne, actinidyne was dissolved in 50 mM phosphate buffer (pH 6.5) containing 10 mM dithiothreitol and allowed to stand at 25 ° C. for 90 minutes. As the actinidine, a product purified by a well-known method was used (see, for example, Non-Patent Document 2).
次いで、塩を含む50mM クエン酸緩衝液(pH3.0)に対し、ブタ由来のI型コラーゲンを溶解した。アクチニダインを含む水溶液と、ブタ由来のI型コラーゲンを含む当該溶液と、を10日間以上、20℃にて接触させて、I型コラーゲンの分解物を作製した。なお、ブタ由来のI型コラーゲンは、周知の方法に基づいて精製した(例えば、非特許文献2参照)。 Then, type I collagen derived from pig was dissolved in 50 mM citrate buffer (pH 3.0) containing a salt. An aqueous solution containing actinidyne and the solution containing porcine-derived type I collagen were contacted at 20 ° C. for 10 days or longer to prepare a decomposition product of type I collagen. Type I collagen derived from pigs was purified based on a well-known method (see, for example, Non-Patent Document 2).
上述した分解物をポリアクリルアミドゲル電気泳動にかけ、I型コラーゲンの分解物を分離した。 The above-mentioned decomposition products were subjected to polyacrylamide gel electrophoresis to separate the decomposition products of type I collagen.
次いで、I型コラーゲンの分解物を、常法によりPVDF(Polyvinylidene Difluoride)膜へ転写した。そして、PVDF膜へ転写されたα1鎖の分解物のアミノ末端のアミノ酸配列を、エドマン分解法によって決定した。 Then, the decomposition product of type I collagen was transferred to the PVDF (Polyvinylidene Difluoride) membrane by a conventional method. Then, the amino acid sequence of the amino terminal of the degradation product of the α1 chain transferred to the PVDF membrane was determined by the Edman degradation method.
なお、実際のエドマン分析は、アプロサイエンス株式会社、または、近畿大学医学部分析機器共同研究室に依頼して、周知の方法にしたがって行った。 The actual Edman analysis was performed according to a well-known method by requesting Approscience Co., Ltd. or Kinki University School of Medicine Analytical Instruments Joint Laboratory.
表1に、塩濃度が0mM、200mM、1000mM、1500mMまたは2000mMの場合のα1鎖の分解物のアミノ末端およびその近傍のアミノ酸配列を示す。 Table 1 shows the amino acid sequences of the amino terminus of the α1 chain degradation product and its vicinity when the salt concentration is 0 mM, 200 mM, 1000 mM, 1500 mM or 2000 mM.
表1に示すように、塩濃度が異なると、α1鎖内の切断箇所が異なることが明らかになった。より具体的には、塩濃度が低いと(例えば、0mM)、トリプルヘリカルドメインの外側で切断が生じ、塩濃度が高いと(例えば、200mM以上)、トリプルヘリカルドメインの内側で切断が生じることが明らかになった。 As shown in Table 1, it was clarified that the cleavage sites in the α1 chain differed when the salt concentration was different. More specifically, low salt concentrations (eg, 0 mM) can result in cleavage outside the triple helical domain, and high salt concentrations (eg, 200 mM and above) can result in cleavage inside the triple helical domain. It was revealed.
塩濃度が高いときの切断箇所は、本発明者が見出した新規な切断箇所であった。 The cutting site when the salt concentration was high was a novel cutting site found by the present inventor.
<2.ラットおよびニワトリ由来のα1鎖の切断における、塩濃度の影響>
塩化ナトリウムの濃度が0mM、2000mMである50mM クエン酸緩衝液(pH3.0)を準備した。なお、当該水溶液の溶媒としては、水を用いた。<2. Effect of salt concentration on cleavage of α1 chains from rats and chickens>
A 50 mM citrate buffer (pH 3.0) having a sodium chloride concentration of 0 mM and 2000 mM was prepared. Water was used as the solvent for the aqueous solution.
アクチニダインを活性化するため、10mM ジチオスレイトールを含む50mM リン酸緩衝液(pH6.5)に対し、アクチニダインを溶解し、90分間、25℃にて静置した。 To activate actinidyne, actinidyne was dissolved in 50 mM phosphate buffer (pH 6.5) containing 10 mM dithiothreitol and allowed to stand at 25 ° C. for 90 minutes.
次いで、塩を含む50mM クエン酸緩衝液(pH3.0)に対し、ラット尾部由来のI型コラーゲン、または、ニワトリ皮部由来のI型コラーゲンを溶解した。アクチニダインを含む水溶液と、ラット尾部由来のI型コラーゲン、または、ニワトリ皮部由来のI型コラーゲンと、を10日間以上、20℃にて接触させて、I型コラーゲンの分解物を作製した。なお、アクチニダインとしては、上述した<1>の実施例にて用いたものと同じものを用いた。また、ラット尾部由来のI型コラーゲン、および、ニワトリ皮部由来のI型コラーゲンは、周知の方法に基づいて精製した(例えば、非特許文献2参照)。 Then, type I collagen derived from the rat tail or type I collagen derived from the chicken skin was dissolved in 50 mM citrate buffer (pH 3.0) containing a salt. An aqueous solution containing actinidyne and type I collagen derived from the rat tail or type I collagen derived from the chicken skin were brought into contact with each other for 10 days or more at 20 ° C. to prepare a decomposition product of type I collagen. As the actinidine, the same one used in the above-mentioned Example <1> was used. In addition, type I collagen derived from the rat tail and type I collagen derived from the chicken skin were purified based on a well-known method (see, for example, Non-Patent Document 2).
上述した分解物をポリアクリルアミドゲル電気泳動にかけ、I型コラーゲンの分解物を分離した。 The above-mentioned decomposition products were subjected to polyacrylamide gel electrophoresis to separate the decomposition products of type I collagen.
次いで、I型コラーゲンの分解物を、常法によりPVDF(Polyvinylidene Difluoride)膜へ転写した。そして、PVDF膜へ転写されたα1鎖の分解物のアミノ末端のアミノ酸配列を、エドマン分解法によって決定した。 Then, the decomposition product of type I collagen was transferred to the PVDF (Polyvinylidene Difluoride) membrane by a conventional method. Then, the amino acid sequence of the amino terminal of the degradation product of the α1 chain transferred to the PVDF membrane was determined by the Edman degradation method.
なお、実際のエドマン分析は、アプロサイエンス株式会社、または、近畿大学医学部分析機器共同研究室に依頼して、周知の方法にしたがって行った。 The actual Edman analysis was performed according to a well-known method by requesting Approscience Co., Ltd. or Kinki University School of Medicine Analytical Instruments Joint Laboratory.
表2に、塩濃度が0mMおよび2000mMの場合のラット由来のα1鎖の分解物のアミノ末端およびその近傍のアミノ酸配列、および、未分解であるラット由来のα1鎖の部分構造(塩濃度の欄が「−」であるデータを参照)を示す。 Table 2 shows the amino acid sequences of the amino terminus of the α1 chain degradation product derived from rats when the salt concentration is 0 mM and 2000 mM and its vicinity, and the partial structure of the α1 chain derived from undegraded rats (salt concentration column). Refer to the data in which is "-").
表3に、塩濃度が0mMおよび2000mMの場合のニワトリ由来のα1鎖の分解物のアミノ末端およびその近傍のアミノ酸配列、および、未分解であるニワトリ由来のα1鎖の部分構造(塩濃度の欄が「−」であるデータを参照)を示す。 Table 3 shows the amino acid sequences of the amino terminus of the α1 chain degradation product derived from chickens when the salt concentration is 0 mM and 2000 mM and its vicinity, and the partial structure of the α1 chain derived from undegraded chickens (salt concentration column). Refer to the data in which is "-").
表2および3に示すように、異なる種に由来するα1鎖であっても、塩濃度が低いと、(例えば、0mM)、トリプルヘリカルドメインの外側で切断が生じ、塩濃度が高いと、トリプルヘリカルドメインの内側で切断が生じやすいことが明らかになった。 As shown in Tables 2 and 3, even in α1 chains derived from different species, low salt concentration (eg, 0 mM) causes cleavage outside the triple helical domain, and high salt concentration results in triple. It was revealed that cutting is likely to occur inside the helical domain.
塩濃度が高いときの切断箇所は、本発明者が見出した新規な切断箇所であった。 The cutting site when the salt concentration was high was a novel cutting site found by the present inventor.
なお、塩濃度が2000mMの場合、分解物中に含まれる、配列番号24にて示すアミノ酸配列のアミノ末端を有する分解物の量と、配列番号5にて示すアミノ酸配列のアミノ末端を有する分解物の量と、の比率が、反応時間、反応pH、反応温度などの条件で異なった。 When the salt concentration is 2000 mM, the amount of the decomposition product having the amino terminus of the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 24 and the decomposition product having the amino terminus of the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 5 contained in the decomposition product The ratio of to the amount of was different depending on the conditions such as reaction time, reaction pH, and reaction temperature.
塩が添加されていない溶液、MgCl2の濃度が500mMである水溶液、および、KClの濃度が200mMである水溶液を準備した。なお、当該水溶液の溶媒としては、水を用いた。
A salt-free solution, an aqueous solution having a MgCl 2 concentration of 500 mM, and an aqueous solution having a KCl concentration of 200 mM were prepared. Water was used as the solvent for the aqueous solution.
上記水溶液の各々に対し、アクチニダインと、ブタ由来のI型コラーゲンとを混合した後、10日以上、20℃にて反応させて、I型コラーゲンの分解物を作製した。なお、アクチニダインとしては、上述した<1>の実施例にて用いたものと同じものを用いた。また、ブタ由来のI型コラーゲンは、周知の方法に基づいて精製した(例えば、非特許文献2参照)。 Actinidyne and porcine-derived type I collagen were mixed with each of the above aqueous solutions and then reacted at 20 ° C. for 10 days or more to prepare a decomposition product of type I collagen. As the actinidine, the same one used in the above-mentioned Example <1> was used. In addition, type I collagen derived from pigs was purified based on a well-known method (see, for example, Non-Patent Document 2).
上述した分解物の各々をポリアクリルアミドゲル電気泳動にかけ、α1鎖の分解物を分離した。 Each of the above-mentioned decomposition products was subjected to polyacrylamide gel electrophoresis to separate the decomposition products of α1 chain.
次いで、I型コラーゲンの分解物を、常法によりPVDF(Polyvinylidene Difluoride)膜へ転写した。そして、PVDF膜へ転写されたα1鎖の分解物のアミノ末端のアミノ酸配列を、エドマン分解法によって決定した。 Then, the decomposition product of type I collagen was transferred to the PVDF (Polyvinylidene Difluoride) membrane by a conventional method. Then, the amino acid sequence of the amino terminal of the degradation product of the α1 chain transferred to the PVDF membrane was determined by the Edman degradation method.
なお、実際のエドマン分析は、アプロサイエンス株式会社、または、近畿大学医学部分析機器共同研究室に依頼して、周知の方法にしたがって行った。 The actual Edman analysis was performed according to a well-known method by requesting Approscience Co., Ltd. or Kinki University School of Medicine Analytical Instruments Joint Laboratory.
表4に、塩濃度0mMである水溶液を用いた場合、MgCl2の濃度が500mMである水溶液を用いた場合、および、KClの濃度が200mMである水溶液を用いた場合のブタ由来のα1鎖の分解物のアミノ末端およびその近傍のアミノ酸配列、および、未分解であるブタ由来のα1鎖の部分構造(塩濃度の欄が「−」であるデータを参照)を示す。Table 4 shows the α1 chains derived from pigs when an aqueous solution having a salt concentration of 0 mM was used, when an aqueous solution having a MgCl 2 concentration of 500 mM was used, and when an aqueous solution having a KCl concentration of 200 mM was used. The amino acid sequences at and near the amino end of the degradation product and the partial structure of the undegraded porcine-derived α1 chain (see data in which the salinity column is "-") are shown.
表4に示すように、異なる種類の塩であっても、塩濃度が低いと(例えば、0mM)、トリプルヘリカルドメインの外側で切断が生じ、塩濃度が高いと(例えば、200mM KCl、500mM MgCl2)、トリプルヘリカルドメインの内側で切断が生じることが明らかになった。なお、200mM KClと500mM MgCl2の場合、分解物中に含まれる、配列番号2にて示すアミノ酸配列のアミノ末端を有する分解物の量と、配列番号9にて示すアミノ酸配列のアミノ末端を有する分解物の量と、の比率が、反応時間、反応pH、反応温度などの条件で異なった。As shown in Table 4, even with different types of salts, low salt concentrations (eg 0 mM) cause cleavage outside the triple helical domain, and high salt concentrations (eg 200 mM KCl, 500 mM MgCl). 2 ), it became clear that cleavage occurs inside the triple helical domain. In the case of 200 mM KCl and 500 mM MgCl 2 , the amount of the degradation product having the amino terminus of the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 2 and the amino terminus of the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 9 are included in the degradation product. The ratio with the amount of the decomposition product was different depending on the conditions such as reaction time, reaction pH, and reaction temperature.
異なる種類の塩を用いた場合の切断箇所は、本発明者が見出した新規な切断箇所であった。 The cutting site when different types of salts were used was a novel cutting site found by the present inventor.
本実施例では、システインプロテアーゼの一種であるカテプシンKを用いて、高塩濃度条件下におけるα1鎖の切断箇所を検討した。以下に、試験方法および試験結果を説明する。
In this example, cathepsin K, which is a kind of cysteine protease, was used to examine the cleavage site of α1 chain under high salt concentration conditions. The test method and test results will be described below.
塩化ナトリウムの濃度が2000mMである50mM クエン酸緩衝液(pH3.0)を準備した。なお、当該水溶液の溶媒としては、水を用いた。 A 50 mM citrate buffer (pH 3.0) having a sodium chloride concentration of 2000 mM was prepared. Water was used as the solvent for the aqueous solution.
カテプシンKを活性化するため、10mM ジチオスレイトールを含む50mM リン酸緩衝液(pH6.5)に対し、カテプシンKを溶解し、45分間、25℃にて静置した。なお、カテプシンKとしては、市販のものを利用した。 To activate cathepsin K, cathepsin K was dissolved in 50 mM phosphate buffer (pH 6.5) containing 10 mM dithiothreitol and allowed to stand at 25 ° C. for 45 minutes. As the cathepsin K, a commercially available product was used.
次いで、塩を含む50mM クエン酸緩衝液(pH3.0)に対し、ニワトリ由来のI型コラーゲン、または、ブタ由来のI型コラーゲンを溶解した。カテプシンKを含む水溶液と、ニワトリ由来のI型コラーゲン、または、ブタ由来のI型コラーゲンを含む当該溶液と、を10日間以上、20℃にて接触させて、I型コラーゲンの分解物を作製した。なお、ニワトリ由来のI型コラーゲン、および、ブタ由来のI型コラーゲンは、周知の方法に基づいて精製した(例えば、非特許文献2参照)。 Then, type I collagen derived from chicken or type I collagen derived from pig was dissolved in 50 mM citrate buffer (pH 3.0) containing a salt. A decomposition product of type I collagen was prepared by contacting an aqueous solution containing cathepsin K with a chicken-derived type I collagen or a pig-derived type I collagen-containing solution at 20 ° C. for 10 days or longer. .. In addition, chicken-derived type I collagen and pig-derived type I collagen were purified based on a well-known method (see, for example, Non-Patent Document 2).
上述した分解物をポリアクリルアミドゲル電気泳動にかけ、I型コラーゲンの分解物を分離した。 The above-mentioned decomposition products were subjected to polyacrylamide gel electrophoresis to separate the decomposition products of type I collagen.
次いで、I型コラーゲンの分解物を、常法によりPVDF(Polyvinylidene Difluoride)膜へ転写した。そして、PVDF膜へ転写されたα1鎖の分解物のアミノ末端のアミノ酸配列を、エドマン分解法によって決定した。 Then, the decomposition product of type I collagen was transferred to the PVDF (Polyvinylidene Difluoride) membrane by a conventional method. Then, the amino acid sequence of the amino terminal of the degradation product of the α1 chain transferred to the PVDF membrane was determined by the Edman degradation method.
なお、実際のエドマン分析は、アプロサイエンス株式会社、または、近畿大学医学部分析機器共同研究室に依頼して、周知の方法にしたがって行った。 The actual Edman analysis was performed according to a well-known method by requesting Approscience Co., Ltd. or Kinki University School of Medicine Analytical Instruments Joint Laboratory.
表5に、ブタ由来のα1鎖の分解物のアミノ末端およびその近傍のアミノ酸配列、および、未分解であるブタ由来のα1鎖の部分構造(塩濃度の欄が「−」であるデータを参照)を示す。 Refer to Table 5 for the amino acid sequences of the amino terminus of the α1 chain degradation product derived from pigs and their vicinity, and the partial structure of the α1 chain derived from pigs that has not been degraded (the column of salinity is “-”. ) Is shown.
表5に示すように、システインプロテアーゼの一種であるカテプシンKであっても、塩濃度が高いと、トリプルヘリカルドメインの内側で切断が生じることが明らかになった。 As shown in Table 5, it was revealed that even cathepsin K, which is a kind of cysteine protease, cleaves inside the triple helical domain when the salt concentration is high.
また、表5に示すように、システインプロテアーゼの一種であるカテプシンKの場合には、複数種類の切断箇所が確認された。 Further, as shown in Table 5, in the case of cathepsin K, which is a kind of cysteine protease, a plurality of types of cleavage sites were confirmed.
なお、ニワトリ由来のI型コラーゲンの分解物の場合、ニワトリ由来のα1鎖の分解物は、下記配列番号11および12に対応するニワトリ由来のα1鎖の分解物と、下記配列番号10におけるアミノ末端から数えて10番目の「S」と11番目の「G」との間の化学結合が切断されたものに対応するニワトリ由来のα1鎖の分解物と、が確認された。 In the case of the decomposition product of type I collagen derived from chicken, the decomposition product of α1 chain derived from chicken is the decomposition product of α1 chain derived from chicken corresponding to the following SEQ ID NOs: 11 and 12 and the amino terminal in the following SEQ ID NO: 10. A chicken-derived α1 chain degradation product corresponding to the broken chemical bond between the 10th “S” and the 11th “G” was confirmed.
透析チューブにアクチニダインを入れ、当該アクチニダインを、塩化ナトリウムの濃度が2000mMである透析外液に対して透析した。その後、透析外液を蒸留水に変えて透析を続けてアクチニダインを得た。なお、アクチニダインとしては、周知の方法にて精製したものを利用した(例えば、非特許文献2参照)。アクチニダインを活性化するため、10mM ジチオスレイトールを含む50mM リン酸緩衝液(pH6.5)に対し、アクチニダインを溶解し、90分間、25℃にて静置した。
Actinidyne was placed in a dialysis tube, and the actinidyne was dialyzed against a dialysis external solution having a sodium chloride concentration of 2000 mM. Then, the external dialysis solution was changed to distilled water, and dialysis was continued to obtain actinidine. As the actinidine, a product purified by a well-known method was used (see, for example, Non-Patent Document 2). To activate actinidyne, actinidyne was dissolved in 50 mM phosphate buffer (pH 6.5) containing 10 mM dithiothreitol and allowed to stand at 25 ° C. for 90 minutes.
次いで、塩を含む50mM クエン酸緩衝液(pH3.0)に対し、ブタ由来のI型コラーゲンを溶解した。アクチニダインを含む水溶液と、ブタ由来のI型コラーゲンと、を3日間以上、20℃にて接触させて、I型コラーゲンの分解物を作製した。また、ブタ由来のI型コラーゲンは、周知の方法に基づいて精製した(例えば、非特許文献2参照)。 Then, type I collagen derived from pig was dissolved in 50 mM citrate buffer (pH 3.0) containing a salt. An aqueous solution containing actinidyne and type I collagen derived from pigs were brought into contact with each other for 3 days or more at 20 ° C. to prepare a decomposition product of type I collagen. In addition, type I collagen derived from pigs was purified based on a well-known method (see, for example, Non-Patent Document 2).
上述した分解物をポリアクリルアミドゲル電気泳動にかけ、I型コラーゲンの分解物を分離した。 The above-mentioned decomposition products were subjected to polyacrylamide gel electrophoresis to separate the decomposition products of type I collagen.
次いで、I型コラーゲンの分解物を、常法によりPVDF(Polyvinylidene Difluoride)膜へ転写した。そして、PVDF膜へ転写されたα1鎖の分解物のアミノ末端のアミノ酸配列を、エドマン分解法によって決定した。 Then, the decomposition product of type I collagen was transferred to the PVDF (Polyvinylidene Difluoride) membrane by a conventional method. Then, the amino acid sequence of the amino terminal of the degradation product of the α1 chain transferred to the PVDF membrane was determined by the Edman degradation method.
なお、実際のエドマン分析は、アプロサイエンス株式会社、または、近畿大学医学部分析機器共同研究室に依頼して、周知の方法にしたがって行った。 The actual Edman analysis was performed according to a well-known method by requesting Approscience Co., Ltd. or Kinki University School of Medicine Analytical Instruments Joint Laboratory.
表6に、透析塩濃度が2000mMの場合のブタ由来のα1鎖の分解物のアミノ末端およびその近傍のアミノ酸配列、および、未分解であるブタ由来のα1鎖の部分構造(塩濃度の欄が「−」であるデータを参照)を示す。 Table 6 shows the amino acid sequences of the amino terminus of the α1 chain degradation product derived from pigs when the dialysis salt concentration is 2000 mM and its vicinity, and the partial structure of the undegraded α1 chain derived from pigs (the column of salt concentration is shown. Refer to the data that is "-").
表6に示すように、透析塩濃度が高いと、トリプルヘリカルドメインの外側あるいは内側で切断が生じることが明らかになった。なお、2000mMの場合、分解物中に含まれる、配列番号26にて示すアミノ酸配列のアミノ末端を有する分解物の量と、配列番号27にて示すアミノ酸配列のアミノ末端を有する分解物の量と、配列番号15にて示すアミノ酸配列のアミノ末端を有する分解物の量と、の比率が、反応時間、反応pH、反応温度などの条件で異なった。 As shown in Table 6, it was revealed that high dialysis salt concentration causes cleavage outside or inside the triple helical domain. In the case of 2000 mM, the amount of the decomposition product having the amino end of the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 26 and the amount of the decomposition product having the amino end of the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 27 contained in the decomposition product. , The ratio of the amount of the decomposition product having the amino end of the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 15 was different depending on the conditions such as reaction time, reaction pH, and reaction temperature.
塩濃度が高いときの切断箇所は、本発明者が見出した新規な切断箇所が含まれていた。 The cut portion when the salt concentration was high included a novel cut portion found by the present inventor.
透析チューブにアクチニダインを入れ、当該アクチニダインを、塩化ナトリウムの濃度が2000mMである透析外液に対して透析した。その後、透析外液を蒸留水に変えて透析を続けてアクチニダインを得た。なお、アクチニダインとしては、周知の方法にて精製したものを利用した(例えば、非特許文献2参照)。アクチニダインを活性化するため、10mM ジチオスレイトールを含む50mM リン酸緩衝液(pH6.5)に対し、アクチニダインを溶解し、90分間、25℃にて静置した。
Actinidyne was placed in a dialysis tube, and the actinidyne was dialyzed against a dialysis external solution having a sodium chloride concentration of 2000 mM. Then, the external dialysis solution was changed to distilled water, and dialysis was continued to obtain actinidine. As the actinidine, a product purified by a well-known method was used (see, for example, Non-Patent Document 2). To activate actinidyne, actinidyne was dissolved in 50 mM phosphate buffer (pH 6.5) containing 10 mM dithiothreitol and allowed to stand at 25 ° C. for 90 minutes.
次いで、塩を含む50mM クエン酸緩衝液(pH3.5)に対し、ヒト由来のI型コラーゲンを溶解した。アクチニダインを含む水溶液と、ヒト由来のI型コラーゲンと、を10日間以上、20℃にて接触させて、I型コラーゲンの分解物を作製した。また、ヒト由来のI型コラーゲンは、周知の方法に基づいて精製した(例えば、非特許文献2参照)。 Then, human-derived type I collagen was dissolved in 50 mM citrate buffer (pH 3.5) containing a salt. An aqueous solution containing actinidyne and human-derived type I collagen were brought into contact with each other for 10 days or more at 20 ° C. to prepare a decomposition product of type I collagen. In addition, human-derived type I collagen was purified based on a well-known method (see, for example, Non-Patent Document 2).
上述した分解物をポリアクリルアミドゲル電気泳動にかけ、I型コラーゲンの分解物を分離した。 The above-mentioned decomposition products were subjected to polyacrylamide gel electrophoresis to separate the decomposition products of type I collagen.
次いで、I型コラーゲンの分解物を、常法によりPVDF(Polyvinylidene Difluoride)膜へ転写した。そして、PVDF膜へ転写されたα1鎖の分解物のアミノ末端のアミノ酸配列を、エドマン分解法によって決定した。 Then, the decomposition product of type I collagen was transferred to the PVDF (Polyvinylidene Difluoride) membrane by a conventional method. Then, the amino acid sequence of the amino terminal of the degradation product of the α1 chain transferred to the PVDF membrane was determined by the Edman degradation method.
なお、実際のエドマン分析は、アプロサイエンス株式会社、または、近畿大学医学部分析機器共同研究室に依頼して、周知の方法にしたがって行った。 The actual Edman analysis was performed according to a well-known method by requesting Approscience Co., Ltd. or Kinki University School of Medicine Analytical Instruments Joint Laboratory.
表7に示すように、透析塩濃度が高いと、トリプルヘリカルドメインの外側あるいは内側で切断が生じることが明らかになった。なお、2000mMの場合、分解物中に含まれる、配列番号29にて示すアミノ酸配列のアミノ末端を有する分解物の量と、配列番号30にて示すアミノ酸配列のアミノ末端を有する分解物の量と、配列番号16にて示すアミノ酸配列のアミノ末端を有する分解物の量と、の比率が、反応時間、反応pH、反応温度などの条件で異なった。 As shown in Table 7, it was revealed that high dialysis salt concentration causes cleavage outside or inside the triple helical domain. In the case of 2000 mM, the amount of the decomposition product having the amino end of the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 29 and the amount of the decomposition product having the amino end of the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 30 contained in the decomposition product. , The ratio of the amount of the decomposition product having the amino end of the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 16 was different depending on the conditions such as reaction time, reaction pH, and reaction temperature.
塩濃度が高いときの切断箇所は、本発明者が見出した新規な切断箇所が含まれていた。 The cut portion when the salt concentration was high included a novel cut portion found by the present inventor.
透析チューブにアクチニダインを入れ、当該アクチニダインを、塩化ナトリウムの濃度が2000mMである透析外液に対して透析した。その後、透析外液を蒸留水に変えて透析を続けてアクチニダインを得た。アクチニダインを活性化するため、10mM ジチオスレイトールを含む50mM リン酸緩衝液(pH6.5)に対し、アクチニダインを溶解し、90分間、25℃にて静置した。
Actinidyne was placed in a dialysis tube, and the actinidyne was dialyzed against a dialysis external solution having a sodium chloride concentration of 2000 mM. Then, the external dialysis solution was changed to distilled water, and dialysis was continued to obtain actinidine. To activate actinidyne, actinidyne was dissolved in 50 mM phosphate buffer (pH 6.5) containing 10 mM dithiothreitol and allowed to stand at 25 ° C. for 90 minutes.
次いで、塩を含む50mM クエン酸緩衝液(pH3.0)に対し、魚類(具体的には、キハダマグロ)由来のI型コラーゲンを溶解した。アクチニダインを含む水溶液と、魚類由来のI型コラーゲンと、を3日間以上、20℃にて接触させて、I型コラーゲンの分解物を作製した。なお、アクチニダインとしては、上述した<1>の実施例にて用いたものと同じものを用いた。また、魚類由来のI型コラーゲンは、周知の方法に基づいて精製した(例えば、非特許文献2参照)。 Next, type I collagen derived from fish (specifically, yellowfin tuna) was dissolved in 50 mM citrate buffer (pH 3.0) containing a salt. An aqueous solution containing actinidyne and type I collagen derived from fish were brought into contact with each other at 20 ° C. for 3 days or longer to prepare a decomposition product of type I collagen. As the actinidine, the same one used in the above-mentioned Example <1> was used. In addition, fish-derived type I collagen was purified based on a well-known method (see, for example, Non-Patent Document 2).
上述した分解物をポリアクリルアミドゲル電気泳動にかけ、I型コラーゲンの分解物を分離した。 The above-mentioned decomposition products were subjected to polyacrylamide gel electrophoresis to separate the decomposition products of type I collagen.
次いで、I型コラーゲンの分解物を、常法によりPVDF(Polyvinylidene Difluoride)膜へ転写した。そして、PVDF膜へ転写されたα1鎖(魚類由来のI型コラーゲン)の分解物のアミノ末端のアミノ酸配列を、エドマン分解法によって決定した。 Then, the decomposition product of type I collagen was transferred to the PVDF (Polyvinylidene Difluoride) membrane by a conventional method. Then, the amino acid sequence of the amino terminal of the degradation product of α1 chain (type I collagen derived from fish) transferred to the PVDF membrane was determined by the Edman degradation method.
なお、実際のエドマン分析は、アプロサイエンス株式会社、または、近畿大学医学部分析機器共同研究室に依頼して、周知の方法にしたがって行った。 The actual Edman analysis was performed by requesting Approscience Co., Ltd. or Kinki University School of Medicine Analytical Instruments Joint Laboratory according to a well-known method.
表8に、透析外液の塩濃度が2000mMの場合の、魚類由来のα1鎖の分解物のアミノ末端およびその近傍のアミノ酸配列を示す。なお、表8に示すように、α1鎖(魚類由来のI型コラーゲン)の分解物としては3種類検出され、これらの分解物の各々のアミノ末端のアミノ酸配列として、配列番号18、配列番号19および配列番号31に示すアミノ酸配列を同定することに成功した。 Table 8 shows the amino acid sequences of the amino terminus of the α1 chain degradation product derived from fish and its vicinity when the salt concentration of the dialysis external solution is 2000 mM. As shown in Table 8, three types of α1 chain (type I collagen derived from fish) degradation products were detected, and the amino acid sequences at the amino terminus of each of these degradation products were SEQ ID NO: 18 and SEQ ID NO: 19. And succeeded in identifying the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 31.
<4>と同様にカテプシンKを活性化するため、10mM ジチオスレイトールを含む50mM リン酸緩衝液(pH6.5)に対し、カテプシンKを溶解し、45分間、25℃にて静置した。
In order to activate cathepsin K in the same manner as in <4>, cathepsin K was dissolved in 50 mM phosphate buffer (pH 6.5) containing 10 mM dithiothreitol and allowed to stand at 25 ° C. for 45 minutes.
次いで、塩を含む50mM リン酸緩衝液(pH6.0)に対し、ヒト由来のI型コラーゲンを溶解した。カテプシンKを含む水溶液と、ヒト由来のI型コラーゲンと、を10日間以上、20℃にて接触させて、I型コラーゲンの分解物を作製した。なお、カテプシンKとしては、上述した<1>の実施例にて用いたものと同じものを用いた。また、ヒト由来のI型コラーゲンは、周知の方法に基づいて精製した(例えば、非特許文献2参照)。 Then, human-derived type I collagen was dissolved in 50 mM phosphate buffer (pH 6.0) containing a salt. An aqueous solution containing cathepsin K and human-derived type I collagen were brought into contact with each other for 10 days or more at 20 ° C. to prepare a decomposition product of type I collagen. As the cathepsin K, the same one used in the above-mentioned example <1> was used. In addition, human-derived type I collagen was purified based on a well-known method (see, for example, Non-Patent Document 2).
上述した分解物をポリアクリルアミドゲル電気泳動にかけ、I型コラーゲンの分解物を分離した。 The above-mentioned decomposition products were subjected to polyacrylamide gel electrophoresis to separate the decomposition products of type I collagen.
次いで、I型コラーゲンの分解物を、常法によりPVDF(Polyvinylidene Difluoride)膜へ転写した。そして、PVDF膜へ転写されたα2鎖(ヒト由来のI型コラーゲン)の分解物のアミノ末端のアミノ酸配列を、エドマン分解法によって決定した。 Then, the decomposition product of type I collagen was transferred to the PVDF (Polyvinylidene Difluoride) membrane by a conventional method. Then, the amino acid sequence of the amino terminal of the degradation product of α2 chain (type I collagen derived from human) transferred to the PVDF membrane was determined by the Edman degradation method.
なお、実際のエドマン分析は、アプロサイエンス株式会社、または、近畿大学医学部分析機器共同研究室に依頼して、周知の方法にしたがって行った。 The actual Edman analysis was performed according to a well-known method by requesting Approscience Co., Ltd. or Kinki University School of Medicine Analytical Instruments Joint Laboratory.
表9に、反応液の塩濃度が200mMの場合の、ヒト由来のα2鎖の分解物のアミノ末端およびその近傍のアミノ酸配列を示す。 Table 9 shows the amino acid sequences of the amino terminus of the α2 chain degradation product derived from humans and its vicinity when the salt concentration of the reaction solution is 200 mM.
透析チューブにアクチニダインを入れ、当該アクチニダインを、塩化ナトリウムの濃度が2000mMである透析外液に対して透析した。その後、透析外液を蒸留水に変えて透析を続けてアクチニダインを得た。アクチニダインを活性化するため、10mM ジチオスレイトールを含む50mM リン酸緩衝液(pH6.5)に対し、アクチニダインを溶解し、90分間、25℃にて静置した。
Actinidyne was placed in a dialysis tube, and the actinidyne was dialyzed against a dialysis external solution having a sodium chloride concentration of 2000 mM. Then, the external dialysis solution was changed to distilled water, and dialysis was continued to obtain actinidine. To activate actinidyne, actinidyne was dissolved in 50 mM phosphate buffer (pH 6.5) containing 10 mM dithiothreitol and allowed to stand at 25 ° C. for 90 minutes.
次いで、塩を含む50mM クエン酸緩衝液(pH3.0)に対し、ニワトリ由来のI型コラーゲンを溶解した。アクチニダインを含む水溶液と、ニワトリ由来のI型コラーゲンと、を7日間以上、20℃にて接触させて、I型コラーゲンの分解物を作製した。なお、アクチニダインとしては、上述した<1>の実施例にて用いたものと同じものを用いた。また、ニワトリ由来のI型コラーゲンは、周知の方法に基づいて精製した(例えば、非特許文献2参照)。 Next, type I collagen derived from chicken was dissolved in 50 mM citrate buffer (pH 3.0) containing a salt. An aqueous solution containing actinidyne and type I collagen derived from chicken were brought into contact with each other for 7 days or more at 20 ° C. to prepare a decomposition product of type I collagen. As the actinidine, the same one used in the above-mentioned Example <1> was used. In addition, chicken-derived type I collagen was purified based on a well-known method (see, for example, Non-Patent Document 2).
上述した分解物をポリアクリルアミドゲル電気泳動にかけ、I型コラーゲンの分解物を分離した。 The above-mentioned decomposition products were subjected to polyacrylamide gel electrophoresis to separate the decomposition products of type I collagen.
次いで、I型コラーゲンの分解物を、常法によりPVDF(Polyvinylidene Difluoride)膜へ転写した。そして、PVDF膜へ転写されたα2鎖(ニワトリ由来のI型コラーゲン)の分解物のアミノ末端のアミノ酸配列を、エドマン分解法によって決定した。 Then, the decomposition product of type I collagen was transferred to the PVDF (Polyvinylidene Difluoride) membrane by a conventional method. Then, the amino acid sequence of the amino terminal of the degradation product of α2 chain (type I collagen derived from chicken) transferred to the PVDF membrane was determined by the Edman degradation method.
なお、実際のエドマン分析は、アプロサイエンス株式会社、または、近畿大学医学部分析機器共同研究室に依頼して、周知の方法にしたがって行った。 The actual Edman analysis was performed according to a well-known method by requesting Approscience Co., Ltd. or Kinki University School of Medicine Analytical Instruments Joint Laboratory.
表10に、透析外液の塩濃度が2000mMの場合の、ニワトリ由来のα2鎖の分解物のアミノ末端およびその近傍のアミノ酸配列を示す。 Table 10 shows the amino acid sequences of the amino terminus of the α2 chain degradation product derived from chicken and its vicinity when the salt concentration of the dialysis external solution is 2000 mM.
<10.コラーゲンの分解物の胚様体形成能に関する試験1>
(培養皿)
上述したコラーゲンの分解物(上述の透析塩濃度2000mMにおける、ブタ由来のコラーゲンの分解物、すなわち、配列番号26および配列番号27にて示されるアミノ酸配列((1)、(2)および(3)にて示されるアミノ酸配列に相当)を有する分解物の混合物)と接触させた、市販の培養皿を試験に用いた。具体的には、35mm培養皿に10mg/mLのコラーゲンの分解物の水溶液を60μL添加して、培養皿に十分になじませて室温で5時間静置し、コラーゲン分解物コート培養皿とした。<10. Test on embryoid body formation ability of collagen degradation product 1>
(Culture dish)
The above-mentioned collagen degradation products (the above-mentioned collagen degradation products derived from pigs at a dialysis salt concentration of 2000 mM, that is, the amino acid sequences shown in SEQ ID NO: 26 and SEQ ID NO: 27 ((1), (2) and (3)). A commercially available culture dish contacted with a mixture of degradation products (corresponding to the amino acid sequence shown in) was used for the test. Specifically, 60 μL of an aqueous solution of a 10 mg / mL collagen decomposition product was added to a 35 mm culture dish, and the mixture was sufficiently blended into the culture dish and allowed to stand at room temperature for 5 hours to prepare a collagen decomposition product-coated culture dish.
また、10mg/mLのコラーゲンの分解物の水溶液を、5倍濃縮したDMEM培地(日水製薬社製)と再構成用緩衝液(50mM 水酸化ナトリウム、260mM 炭酸水素ナトリウム、200mM HEPES)とを混合し、この混合液を35mm培養皿に200μL添加して、培養皿に均一になるよう広げてコートして、37℃のインキュベーター内で30分間静置した。これを、コラーゲン分解物ゲル培養皿とした。 In addition, a 10 mg / mL aqueous solution of a decomposition product of collagen is mixed with a 5-fold concentrated DMEM medium (manufactured by Nissui Pharmaceutical Co., Ltd.) and a buffer solution for reconstruction (50 mM sodium hydroxide, 260 mM sodium hydrogen carbonate, 200 mM HEPES). Then, 200 μL of this mixed solution was added to a 35 mm culture dish, spread and coated uniformly on the culture dish, and allowed to stand in an incubator at 37 ° C. for 30 minutes. This was used as a collagen decomposition product gel culture dish.
また、35mm培養皿に0.1%ゼラチン溶液を1mL添加して、培養皿に十分になじませて室温で4時間静置した。4時間後にゼラチン溶液を除去して、ゼラチンコート培養皿とした。 In addition, 1 mL of 0.1% gelatin solution was added to a 35 mm culture dish, and the mixture was allowed to fully blend into the culture dish and allowed to stand at room temperature for 4 hours. After 4 hours, the gelatin solution was removed to prepare a gelatin-coated culture dish.
(マウスES細胞)
山梨大学生命環境学部生命工学科 若山照彦教授から譲渡されたマウスES細胞を使用した。このマウスES細胞は、GFP(green fluorescent protein)標識されており、GFPタンパク質をコードしている遺伝子が染色体中に挿入されているものである。(Mouse ES cells)
Mouse ES cells transferred from Professor Teruhiko Wakayama, Faculty of Life and Environmental Sciences, University of Yamanashi, were used. These mouse ES cells are labeled with GFP (green fluorescent protein), and the gene encoding the GFP protein is inserted into the chromosome.
(フィーダー細胞の調製)
マイトマイシン処理したマウス胎児由来線維芽細胞(Murine Embryonic Fibroblasts:MEF)(CMPMEFCF、DSファーマバイオメディカル製)を1×105個/mLに調製した。ゼラチンコート培養皿、コラーゲン分解物コート培養皿、コラーゲン分解物ゲル培養皿に、MEFをそれぞれ7×104個播種して、10%ウシ胎児血清を含むDMEM培地(KnockOutDMEM、サーモフィッシャーサイエンス製)を用いて、37℃、5%CO2の条件下にて1日間培養した。(Preparation of feeder cells)
Mitomycin-treated mouse embryo-derived fibroblasts (MEF) (CMPMEFCF, manufactured by DS Pharma Biomedical) were prepared at 1 × 10 5 cells / mL. 7 × 10 4 MEFs were seeded in each of a gelatin-coated culture dish, a collagen decomposition product-coated culture dish, and a collagen decomposition product gel culture dish, and a DMEM medium (KnockOutDMEM, manufactured by Thermo Fisher Science) containing 10% fetal bovine serum was applied. The cells were cultured for 1 day under the conditions of 37 ° C. and 5% CO 2 .
(胚様体の形成)
500U/mLの白血病抑制因子(Leukemia Inhibitory Factor:LIF、商品番号199−16051、和光純薬工業株式会社)および20%ウシ胎児血清を含むDMEM(KnockOutDMEM、サーモフィッシャーサイエンス製)(以下、「DMEM培地(LIF(+))」と称する。)を用いて、マウスES細胞2.5×104個/mLを調製した。あらかじめMEFを播種しておいたゼラチンコート培養皿、コラーゲン分解物コート培養皿、およびコラーゲン分解物ゲル培養皿に、マウスES細胞懸濁液2mLをそれぞれ播種して、DMEM培地(LIF(+))を用いて、37℃、5%CO2の条件下にて培養した(培養条件:MEF(+)且つLIF(+))。ゼラチンコート培養皿において培養したES細胞を本実験のコントロールとした。なお、実施例において、「MEF(+)」はMEF共存下での培養、「MEF(−)」はMEF非共存下での培養を示す。また、「LIF(+)」はLIF共存下での培養、「LIF(−)」はLIF非共存下での培養を示す。(Formation of embryoid body)
DMEM (KnockOutDMEM, manufactured by Thermo Fisher Science) containing 500 U / mL leukemia inhibitory factor (LIF, product number 199-16501, Wako Pure Chemical Industries, Ltd.) and 20% fetal bovine serum (hereinafter, "DMEM medium"). (LIF (+)) ”) was used to prepare 2.5 × 10 4 mouse ES cells / mL. 2 mL of mouse ES cell suspension was seeded in a gelatin-coated culture dish, a collagen degradation product-coated culture dish, and a collagen degradation product gel culture dish in which MEF had been seeded in advance, and DMEM medium (LIF (+)) was used. Was cultured under the conditions of 37 ° C. and 5% CO 2 (culture conditions: MEF (+) and LIF (+)). ES cells cultured in a gelatin-coated culture dish were used as controls for this experiment. In the examples, "MEF (+)" indicates culture in the presence of MEF, and "MEF (-)" indicates culture in the absence of MEF. Further, "LIF (+)" indicates culture in the coexistence of LIF, and "LIF (-)" indicates culture in the absence of LIF.
培養期間中は、毎日、新しいDMEM培地(LIF(+))と培地を交換した。 During the culture period, the medium was replaced with fresh DMEM medium (LIF (+)) every day.
培養開始3日後に、位相差顕微鏡下でES細胞の形態を観察した。各細胞の形態を、図1に示す。図1中、(a)は、ゼラチンコート培養皿において、MEF共存下(MEF(+))で、DMEM培地(LIF(+))を用いて3日間培養したES細胞の形態を示す図であり、(b)は、コラーゲン分解物コート培養皿において、MEF共存下(MEF(+))で、DMEM培地(LIF(+))を用いて3日間培養したES細胞の形態を示す図であり、(c)は、コラーゲン分解物ゲル培養皿において、MEF共存下(MEF(+))で、DMEM培地(LIF(+))を用いて3日間培養したES細胞の形態を示す図である。 Three days after the start of the culture, the morphology of ES cells was observed under a phase-contrast microscope. The morphology of each cell is shown in FIG. In FIG. 1, (a) is a diagram showing the morphology of ES cells cultured in a gelatin-coated culture dish in the presence of MEF (MEF (+)) using DMEM medium (LIF (+)) for 3 days. , (B) are diagrams showing the morphology of ES cells cultured for 3 days in DMEM medium (LIF (+)) in the presence of MEF (MEF (+)) in a collagen decomposition product-coated culture dish. (C) is a diagram showing the morphology of ES cells cultured in a collagen decomposition product gel culture dish in the presence of MEF (MEF (+)) for 3 days using DMEM medium (LIF (+)).
ゼラチンコート培養皿において培養した場合、MEFはゼラチンコート培養皿の底面に接着して伸展していた。その間にES細胞がコロニーを形成していた。一般的なES細胞の培養所見と同じ形態であった(図1の(a))。 When cultured in a gelatin-coated culture dish, the MEF adhered to and extended to the bottom surface of the gelatin-coated culture dish. During that time, ES cells were forming colonies. It had the same morphology as general ES cell culture findings ((a) in FIG. 1).
コラーゲン分解物コート培養皿において培養した場合、MEFはコラーゲン分解物コート培養皿の底面に接着していなかった。観察された細胞は浮遊した3次元細胞塊(胚様体)を形成しており、ゼラチンコート培養皿の一般的なES細胞の培養所見とはまったく異なる形態であった(図1の(b))。 When cultured in a collagen degradation product coated culture dish, the MEF did not adhere to the bottom surface of the collagen degradation product coated culture dish. The observed cells formed a floating three-dimensional cell mass (embryoid body), and had a completely different morphology from the general ES cell culture findings of a gelatin-coated culture dish (FIG. 1 (b)). ).
コラーゲン分解物ゲル培養皿において培養した場合、MEFはコラーゲン分解物ゲル培養皿の底面に接着していた。観察された細胞はコラーゲン分解物ゲルに接着して3次元細胞塊(胚様体)を形成していた。ゼラチンコート培養皿の一般的なES細胞の培養所見とはまったく異なる形態であった。コラーゲン分解物ゲルに接着している胚様体から細胞が伸展して別の胚様体に繋がっているようであった(図1の(c))。 When cultured in the collagen degradation product gel culture dish, the MEF was adhered to the bottom surface of the collagen degradation product gel culture dish. The observed cells adhered to the collagen degradation product gel to form a three-dimensional cell mass (embryoid body). The morphology was completely different from the general ES cell culture findings of the gelatin-coated culture dish. It seemed that cells extended from the embryoid body adhering to the collagen degradation product gel and connected to another embryoid body ((c) in FIG. 1).
コラーゲン分解物コート培養皿またはコラーゲン分解物ゲル培養皿において培養したES細胞の形態は、ゼラチンコート培養皿において培養したES細胞の形態とは全く異なっていた。ゼラチンコート培養皿において培養したES細胞は、一般的なES細胞のコロニーを形成しただけであったが、コラーゲン分解物コート培養皿において培養したES細胞は、LIF添加にも関わらず、浮遊した胚様体を形成した。つまり、コラーゲン分解物コート培養皿においてES細胞を培養することは、胚様体を形成させる新たな方法となりうることが示された。一方、コラーゲン分解物ゲル培養皿において培養したES細胞は、これまでに観察されていないような胚様体が、LIF存在下で形成された。具体的には、胚様体は、コラーゲン分解物ゲルに接着していることが示された。 The morphology of ES cells cultured in a collagen degradation product-coated culture dish or a collagen degradation product gel culture dish was completely different from the morphology of ES cells cultured in a gelatin-coated culture dish. The ES cells cultured in the gelatin-coated culture dish only formed colonies of general ES cells, whereas the ES cells cultured in the collagen degradation product-coated culture dish were floating embryos despite the addition of LIF. Formed a shape. That is, it was shown that culturing ES cells in a collagen decomposition product-coated culture dish can be a new method for forming embryoid bodies. On the other hand, in the ES cells cultured in the collagen degradation product gel culture dish, embryoid bodies that had not been observed so far were formed in the presence of LIF. Specifically, the embryoid body was shown to adhere to the collagen degradation product gel.
同様の実験を、LIFを含まず且つ20%ウシ胎児血清を含むDMEM培地(KnockOutDMEM、サーモフィッシャーサイエンス製)(以下、「DMEM培地(LIF(−))」と称する。)を用いて行った。具体的には、DMEM培地(LIF(−))を用いて、マウスES細胞2.5×104個/mLを調製した。あらかじめMEFを播種しておいたゼラチンコート培養皿、コラーゲン分解物コート培養皿、コラーゲン分解物ゲル培養皿に、マウスES細胞懸濁液2mLをそれぞれ播種して、DMEM培地(LIF(−))を用いて、37℃、5%CO2の条件下にて培養した(培養条件:MEF(+)且つLIF(−))。ゼラチンコート培養皿において培養したES細胞を本実験のコントロールとした。A similar experiment was performed using DMEM medium (KnockOutDMEM, manufactured by Thermo Fisher Scientific) (hereinafter referred to as "DMEM medium (LIF (-))") containing 20% fetal bovine serum without LIF. Specifically, DMEM medium (LIF (−)) was used to prepare 2.5 × 10 4 mouse ES cells / mL. 2 mL of mouse ES cell suspension was seeded in a gelatin-coated culture dish, a collagen degradation product-coated culture dish, and a collagen degradation product gel culture dish in which MEF had been seeded in advance, and DMEM medium (LIF (-)) was applied. The cells were cultured under the conditions of 37 ° C. and 5% CO 2 (culture conditions: MEF (+) and LIF (−)). ES cells cultured in a gelatin-coated culture dish were used as controls for this experiment.
培養期間中は、毎日、新しいDMEM培地(LIF(−))と培地を交換した。 During the culture period, the medium was replaced with fresh DMEM medium (LIF (−)) every day.
培養開始3日後に、位相差顕微鏡下でES細胞の形態を観察した。各細胞の形態を、図2に示す。図2中、(a)は、ゼラチンコート培養皿において、MEF共存下(MEF(+))で、DMEM培地(LIF(−))を用いて3日間培養したES細胞の形態を示す図であり、(b)は、コラーゲン分解物コート培養皿において、MEF共存下(MEF(+))で、DMEM培地(LIF(−))を用いて3日間培養したES細胞の形態を示す図であり、(c)は、コラーゲン分解物ゲル培養皿において、MEF共存下(MEF(+))で、DMEM培地(LIF(−))を用いて3日間培養したES細胞の形態を示す図である。 Three days after the start of the culture, the morphology of ES cells was observed under a phase-contrast microscope. The morphology of each cell is shown in FIG. In FIG. 2, (a) is a diagram showing the morphology of ES cells cultured in a gelatin-coated culture dish in the presence of MEF (MEF (+)) using DMEM medium (LIF (−)) for 3 days. , (B) are views showing the morphology of ES cells cultured in a collagen decomposition product-coated culture dish in the presence of MEF (MEF (+)) for 3 days using DMEM medium (LIF (−)). (C) is a diagram showing the morphology of ES cells cultured in a collagen decomposition product gel culture dish in the presence of MEF (MEF (+)) for 3 days using DMEM medium (LIF (−)).
ゼラチンコート培養皿において培養した場合、MEFはゼラチンコート培養皿の底面に接着して伸展していた。その間にES細胞がコロニーを形成していた。一般的なES細胞の培養所見と同じ形態であった(図2の(a))。 When cultured in a gelatin-coated culture dish, the MEF adhered to and extended to the bottom surface of the gelatin-coated culture dish. During that time, ES cells were forming colonies. It had the same morphology as general ES cell culture findings ((a) in FIG. 2).
コラーゲン分解物コート培養皿において培養した場合、MEFはコラーゲン分解物コート培養皿の底面に接着していなかった。観察された細胞は浮遊した3次元細胞塊(胚様体)を形成しており、ゼラチンコート培養皿の一般的なES細胞の培養所見とはまったく異なる形態であった(図2の(b))。 When cultured in a collagen degradation product coated culture dish, the MEF did not adhere to the bottom surface of the collagen degradation product coated culture dish. The observed cells formed a floating three-dimensional cell mass (embryoid body), and had a completely different morphology from the general ES cell culture findings of a gelatin-coated culture dish (FIG. 2 (b)). ).
コラーゲン分解物ゲル培養皿において培養した場合、MEFはコラーゲン分解物ゲル培養皿の底面に接着していた。観察された細胞はコラーゲン分解物ゲルに接着して3次元細胞塊(胚様体)を形成していた。ゼラチンコート培養皿の一般的なES細胞の培養所見とはまったく異なる形態であった。コラーゲン分解物ゲルに接着している胚様体から細胞が伸展して別の胚様体に繋がっているようであった(図2の(c))。 When cultured in the collagen degradation product gel culture dish, the MEF was adhered to the bottom surface of the collagen degradation product gel culture dish. The observed cells adhered to the collagen degradation product gel to form a three-dimensional cell mass (embryoid body). The morphology was completely different from the general ES cell culture findings of the gelatin-coated culture dish. It seemed that cells extended from the embryoid body adhering to the collagen degradation product gel and connected to another embryoid body ((c) in FIG. 2).
DMEM培地(LIF(−))を用いてコラーゲン分解物コート培養皿またはコラーゲン分解物ゲル培養皿において培養したES細胞の形態は、ゼラチンコート培養皿において培養したES細胞の形態とは全く異なっていた。しかし、DMEM培地(LIF(+))を用いてコラーゲン分解物コート培養皿またはコラーゲン分解物ゲル培養皿において培養したES細胞と比較して、形態学的な所見に明確な違いはなかった。ゼラチンコート培養皿において培養したES細胞は、一般的なES細胞のコロニーを形成しただけであったが、コラーゲン分解物コート培養皿において培養したES細胞は、LIFを添加していないにも関わらず、浮遊した胚様体を形成した。つまり、コラーゲン分解物コート培養皿においてES細胞を培養することは、胚様体を形成させる新たな方法となりうることが示された。一方、コラーゲン分解物ゲル培養皿において培養したES細胞は、これまでに観察されていないような胚様体が、LIF非存在下で形成された。具体的には、胚様体は、コラーゲン分解物ゲルに接着していることが示された。 The morphology of ES cells cultured in a collagen degradation product-coated culture dish or collagen degradation product gel culture dish using DMEM medium (LIF (-)) was completely different from the morphology of ES cells cultured in a gelatin-coated culture dish. .. However, there was no clear difference in morphological findings compared to ES cells cultured in collagen decomposition product coated culture dishes or collagen decomposition product gel culture dishes using DMEM medium (LIF (+)). The ES cells cultured in the gelatin-coated culture dish only formed colonies of general ES cells, whereas the ES cells cultured in the collagen degradation product-coated culture dish did not contain LIF. , Formed a floating embryonic body. That is, it was shown that culturing ES cells in a collagen decomposition product-coated culture dish can be a new method for forming embryoid bodies. On the other hand, in the ES cells cultured in the collagen decomposition product gel culture dish, embryoid bodies that had not been observed so far were formed in the absence of LIF. Specifically, the embryoid body was shown to adhere to the collagen degradation product gel.
<11.コラーゲンの分解物の胚様体形成能に関する試験2>
次に、ゼラチンコート培養皿、コラーゲン分解物コート培養皿またはコラーゲン分解物ゲル培養皿において培養したES細胞の未分化能を調べるため、細胞内在性のアルカリ性ホスファターゼ活性を調べた。<11. Test on embryoid body formation ability of collagen degradation product 2>
Next, in order to examine the undifferentiated ability of ES cells cultured in a gelatin-coated culture dish, a collagen decomposition product-coated culture dish, or a collagen decomposition product gel culture dish, the intracellular alkaline phosphatase activity was examined.
500U/mLのLIFおよび20%ウシ胎児血清を含むDMEM(KnockOutDMEM、サーモフィッシャーサイエンス製)(以下、「DMEM培地(LIF(+))」と称する。)を用いて、マウスES細胞2.5×104個/mLを調製した。あらかじめMEFを播種しておいたゼラチンコート培養皿、コラーゲン分解物コート培養皿、およびコラーゲン分解物ゲル培養皿に、マウスES細胞懸濁液2mLをそれぞれ播種して、DMEM培地(LIF(+))を用いて、37℃、5%CO2の条件下にて培養した(培養条件:MEF(+)且つLIF(+))。ゼラチンコート培養皿において培養したES細胞を本実験のコントロールとした。培養期間中は、毎日、新しいDMEM培地(LIF(+))と培地を交換した。Mouse ES cells 2.5 × using DMEM (KnockOutDMEM, manufactured by Thermo Fisher Scientific) containing 500 U / mL LIF and 20% fetal bovine serum (hereinafter referred to as “DMEM medium (LIF (+))”). 10 4 pieces / mL was prepared. 2 mL of mouse ES cell suspension was seeded in a gelatin-coated culture dish, a collagen degradation product-coated culture dish, and a collagen degradation product gel culture dish in which MEF had been seeded in advance, and DMEM medium (LIF (+)) was used. Was cultured under the conditions of 37 ° C. and 5% CO 2 (culture conditions: MEF (+) and LIF (+)). ES cells cultured in a gelatin-coated culture dish were used as controls for this experiment. During the culture period, the medium was replaced with fresh DMEM medium (LIF (+)) every day.
2日間培養後に、細胞の培養上清を取り除き、滅菌PBSで洗浄した。引き続き、細胞を固定するために4%パラホルムアルデヒド溶液を細胞が浸るまで加え、室温で30分間静置した。その後、滅菌蒸留水を細胞が浸るまで加えて洗浄する操作を2回繰り返した。洗浄液を取り除いた後、TRACP&ALP double-stain kit(商品コードMK300、タカラバイオ社製)付属のアルカリ性ホスファターゼ染色液を培養皿に250μL加えて37℃で45分間静置した。反応を停止させるため、染色液を取り除いて滅菌蒸留水で3回洗浄した。結果を図3に示す。 After culturing for 2 days, the culture supernatant of the cells was removed and washed with sterile PBS. Subsequently, a 4% paraformaldehyde solution was added to fix the cells until the cells were immersed, and the cells were allowed to stand at room temperature for 30 minutes. Then, the operation of adding sterile distilled water until the cells were immersed and washing was repeated twice. After removing the washing liquid, 250 μL of an alkaline phosphatase stain attached to a TRACP & ALP double-stain kit (product code MK300, manufactured by Takara Bio Inc.) was added to a culture dish and allowed to stand at 37 ° C. for 45 minutes. To stop the reaction, the stain was removed and washed 3 times with sterile distilled water. The results are shown in FIG.
図3は、MEF(+)且つLIF(+)の培養条件において2日間培養したES細胞の細胞内在性のアルカリ性ホスファターゼ活性を調べた結果を示す図であり、図3中、(a)は、ゼラチンコート培養皿において、MEF共存下(MEF(+))で、DMEM培地(LIF(+))を用いて2日間培養したES細胞のアルカリ性ホスファターゼ活性の有無を示す図であり、(b)は、コラーゲン分解物コート培養皿において、MEF共存下(MEF(+))で、DMEM培地(LIF(+))を用いて2日間培養したES細胞のアルカリ性ホスファターゼ活性の有無を示す図であり、(c)は、コラーゲン分解物ゲル培養皿において、MEF共存下(MEF(+))で、DMEM培地(LIF(+))を用いて2日間培養したES細胞のアルカリ性ホスファターゼ活性の有無を示す図である。 FIG. 3 is a diagram showing the results of examining the intracellular alkaline phosphatase activity of ES cells cultured for 2 days under MEF (+) and LIF (+) culture conditions, and FIG. 3 (a) is a diagram in FIG. It is a figure which shows the presence or absence of alkaline phosphatase activity of ES cells cultured for 2 days using DMEM medium (LIF (+)) in the presence of MEF (MEF (+)) in a gelatin-coated culture dish, FIG. , A graph showing the presence or absence of alkaline phosphatase activity in ES cells cultured for 2 days using DMEM medium (LIF (+)) in the presence of MEF (MEF (+)) in a collagen decomposition product-coated culture dish. c) is a diagram showing the presence or absence of alkaline phosphatase activity in ES cells cultured for 2 days in DMEM medium (LIF (+)) in the presence of MEF (MEF (+)) in a collagen decomposition product gel culture dish. is there.
コラーゲン分解物コート培養皿およびコラーゲン分解物ゲル培養皿において培養したES細胞から形成された胚様体は、ゼラチンコート培養皿において培養したES細胞のコロニーと同様にアルカリ性ホスファターゼ活性陽性であることが示された(図3の(a)〜(c))。一方、共培養しているMEFはアルカリ性ホスファターゼ活性陰性であった。これらの結果は、コラーゲン分解物コート培養皿およびコラーゲン分解物ゲル培養皿において培養したES細胞から形成された胚様体が未分化能を維持していることを示している。 It was shown that embryonic bodies formed from ES cells cultured in collagen-degraded product-coated culture dishes and collagen degradation product gel culture dishes were positive for alkaline phosphatase activity, similar to colonies of ES cells cultured in gelatin-coated culture dishes. ((A) to (c) in FIG. 3). On the other hand, the co-cultured MEF was negative for alkaline phosphatase activity. These results indicate that the embryoid bodies formed from ES cells cultured in the collagen degradation product coated culture dish and the collagen degradation product gel culture dish maintain the undifferentiated ability.
<12.コラーゲンの分解物の胚様体形成能に関する試験3>
MEFを播種している培養皿の代わりに、MEFを播種していない培養皿を用いて、同様の実験を、LIFを含み且つ20%ウシ胎児血清を含むDMEM培地(KnockOutDMEM、サーモフィッシャーサイエンス製)(以下、「DMEM培地(LIF(+))」と称する。)を用いて行った。具体的には、DMEM培地(LIF(+))を用いて、マウスES細胞2.5×104個/mLを調製した。MEFを播種していないゼラチンコート培養皿、コラーゲン分解物コート培養皿、コラーゲン分解物ゲル培養皿に、マウスES細胞懸濁液2mLをそれぞれ播種して、DMEM培地(LIF(+))を用いて、37℃、5%CO2の条件下にて培養した(培養条件:MEF(−)且つLIF(+))。ゼラチンコート培養皿において培養したES細胞を本実験のコントロールとした。<12. Test on embryoid body formation ability of collagen degradation product 3>
Using a culture dish not seeded with MEF instead of the culture dish seeded with MEF, a similar experiment was performed in DMEM medium containing LIF and 20% fetal bovine serum (KnockOutDMEM, Thermofisher Science). (Hereinafter referred to as "DMEM medium (LIF (+))"). Specifically, DMEM medium (LIF (+)) was used to prepare 2.5 × 10 4 mouse ES cells / mL. 2 mL of mouse ES cell suspension was seeded in a gelatin-coated culture dish, a collagen degradation product-coated culture dish, and a collagen degradation product gel culture dish in which MEF was not seeded, and DMEM medium (LIF (+)) was used. , 37 ° C., 5% CO 2 (culture conditions: MEF (−) and LIF (+)). ES cells cultured in a gelatin-coated culture dish were used as controls for this experiment.
培養期間中は、毎日、新しいDMEM培地(LIF(+))と培地を交換した。 During the culture period, the medium was replaced with fresh DMEM medium (LIF (+)) every day.
培養開始3日後に、位相差顕微鏡下でES細胞の形態を観察した。各細胞の形態を、図4に示す。図4中、(a)は、ゼラチンコート培養皿において、DMEM培地(LIF(+))を用いて3日間培養したES細胞の形態を示す図であり、(b)は、コラーゲン分解物コート培養皿において、DMEM培地(LIF(+))を用いて3日間培養したES細胞の形態を示す図であり、(c)は、コラーゲン分解物ゲル培養皿において、DMEM培地(LIF(+))を用いて3日間培養したES細胞の形態を示す図である。 Three days after the start of the culture, the morphology of ES cells was observed under a phase-contrast microscope. The morphology of each cell is shown in FIG. In FIG. 4, (a) is a diagram showing the morphology of ES cells cultured in a gelatin-coated culture dish in a DMEM medium (LIF (+)) for 3 days, and (b) is a collagen decomposition product-coated culture. It is a figure which shows the morphology of ES cells cultured for 3 days using DMEM medium (LIF (+)) in a dish, (c) is the DMEM medium (LIF (+)) in a collagen decomposition product gel culture dish. It is a figure which shows the morphology of the ES cell which was cultured for 3 days using.
ゼラチンコート培養皿において培養した場合、ES細胞が単層に広がり、コロニー形成している細胞と単一で接着している細胞とを区別して観察した。細胞突起を示す形態を示す細胞も存在していた。一般的なES細胞のMEF共存下且つLIF存在下の培養所見(図1(a))と比べてコロニーの数が少なく大きさが小さく、それぞれの細胞が判別できる程度の細胞間接着であることが示された(図4の(a))。 When cultured in a gelatin-coated culture dish, ES cells spread in a single layer, and colonized cells and single-adhered cells were observed separately. There were also cells showing a morphology showing cell processes. Compared to the culture findings (FIG. 1 (a)) of general ES cells in the presence of MEF and LIF, the number of colonies is smaller and the size is smaller, and the cell-cell adhesion is such that each cell can be distinguished. Was shown ((a) in FIG. 4).
コラーゲン分解物コート培養皿において培養した場合、観察されたES細胞は接着もしくは浮遊した3次元細胞塊(胚様体)を形成しており(図4の(b))、ゼラチンコート培養皿の一般的なES細胞の培養所見(図4の(a))とはまったく異なる形態であった。どちらかと言えば、浮遊している胚様体の割合が多かった。 When cultured in a collagen decomposition product-coated culture dish, the observed ES cells form an adherent or floating three-dimensional cell mass (embryoid body) ((b) in FIG. 4), which is a general gelatin-coated culture dish. The morphology was completely different from the typical ES cell culture findings ((a) in FIG. 4). If anything, the proportion of floating embryoid bodies was high.
コラーゲン分解物ゲル培養皿において培養した場合、観察されたES細胞はコラーゲン分解物ゲルに接着もしくは浮遊した3次元細胞塊(胚様体)を形成していた。ゼラチンコート培養皿の一般的なES細胞の培養所見とはまったく異なる形態であった。コラーゲン分解物ゲルに接着している胚様体の方が、浮遊している胚様体より比較的大きかった。(図4の(c))。 When cultured in a collagen degradation product gel culture dish, the observed ES cells formed a three-dimensional cell mass (embryoid body) adhering to or floating on the collagen degradation product gel. The morphology was completely different from the general ES cell culture findings of the gelatin-coated culture dish. The embryoid bodies adhering to the collagen degradation gel were relatively larger than the floating embryoid bodies. ((C) in FIG. 4).
MEF非共存下(MEF(−))で、DMEM培地(LIF(+))を用いてコラーゲン分解物コート培養皿またはコラーゲン分解物ゲル培養皿において培養したES細胞の形態は、ゼラチンコート培養皿において培養したES細胞の形態とは全く異なっていた。しかし、MEF共存下(MEF(+))で、DMEM培地(LIF(+))を用いてコラーゲン分解物コート培養皿またはコラーゲン分解物ゲル培養皿において培養したES細胞と比較して、MEF非共存下(MEF(−))で、DMEM培地(LIF(+))を用いてコラーゲン分解物コート培養皿またはコラーゲン分解物ゲル培養皿において培養したES細胞の形態は、大きさや形に多少の違いが観察されたが、明確な違いはなかった。MEF(−)且つLIF(+)の培養条件で、ゼラチンコート培養皿において培養したES細胞は、一般的なES細胞のコロニーを形成するか、あるいは単一の接着細胞であった。特筆すべきは、MEF(−)且つLIF(+)の培養条件でコラーゲン分解物コート培養皿において培養したES細胞は、MEFを共培養していないにも関わらず、胚様体を形成した。つまり、コラーゲン分解物コート培養皿においてES細胞を培養することは、胚様体を形成させる新たな方法となりうることが示された。同様に、MEF(−)且つLIF(+)の培養条件でコラーゲン分解物ゲル培養皿において培養したES細胞は、これまでに観察されていないような胚様体が、MEF非存在下で形成された。具体的には、MEF(−)且つLIF(+)の培養条件でコラーゲン分解物ゲル培養皿において培養したES細胞から形成された胚様体は、コラーゲン分解物ゲルに接着あるいは浮遊していることが示された。 The morphology of ES cells cultured in a collagen degradation product-coated culture dish or a collagen degradation product gel culture dish using DMEM medium (LIF (+)) in the absence of MEF (MEF (-)) is expressed in a gelatin-coated culture dish. The morphology of the cultured ES cells was completely different. However, in the presence of MEF (MEF (+)), MEF does not coexist as compared with ES cells cultured in a collagen degradation product coated culture dish or a collagen degradation product gel culture dish using DMEM medium (LIF (+)). The morphology of ES cells cultured below (MEF (-)) in a collagen degradation product-coated culture dish or collagen degradation product gel culture dish using DMEM medium (LIF (+)) is slightly different in size and shape. It was observed, but there was no clear difference. ES cells cultured in gelatin-coated culture dishes under MEF (−) and LIF (+) culture conditions formed colonies of common ES cells or were single adherent cells. It should be noted that the ES cells cultured in the collagen decomposition product-coated culture dish under the culture conditions of MEF (−) and LIF (+) formed embryoid bodies even though the MEF was not co-cultured. That is, it was shown that culturing ES cells in a collagen decomposition product-coated culture dish can be a new method for forming embryoid bodies. Similarly, in ES cells cultured in a collagen degradation product gel culture dish under MEF (-) and LIF (+) culture conditions, embryoid bodies that have not been observed so far are formed in the absence of MEF. It was. Specifically, the embryoid body formed from ES cells cultured in a collagen degradation product gel culture dish under MEF (-) and LIF (+) culture conditions adheres to or floats on the collagen degradation product gel. It has been shown.
<13.コラーゲンの分解物の胚様体形成能に関する試験4>
MEFを播種している培養皿の代わりに、MEFを播種していない培養皿を用いて、同様の実験を、LIFを含まない20%ウシ胎児血清を含むDMEM培地(KnockOutDMEM、サーモフィッシャーサイエンス製)(以下、「DMEM培地(LIF(−))」と称する。)を用いて行った。具体的には、DMEM培地(LIF(−))を用いて、マウスES細胞2.5×104個/mLを調製した。MEFを播種していないゼラチンコート培養皿、コラーゲン分解物コート培養皿、コラーゲン分解物ゲル培養皿に、マウスES細胞懸濁液2mLをそれぞれ播種して、DMEM培地(LIF(−))を用いて、37℃、5%CO2の条件下にて培養した(培養条件:MEF(−)且つLIF(−))。ゼラチンコート培養皿において培養したES細胞を本実験のコントロールとした。<13. Test on embryoid body formation ability of collagen degradation product 4>
Using a culture dish not seeded with MEF instead of the culture dish seeded with MEF, the same experiment was performed in DMEM medium containing 20% fetal bovine serum without LIF (KnockOutDMEM, manufactured by Thermo Fisher Science). (Hereinafter referred to as "DMEM medium (LIF (-))"). Specifically, DMEM medium (LIF (−)) was used to prepare 2.5 × 10 4 mouse ES cells / mL. 2 mL of mouse ES cell suspension was seeded in a gelatin-coated culture dish, a collagen degradation product-coated culture dish, and a collagen degradation product gel culture dish in which MEF was not seeded, and DMEM medium (LIF (-)) was used. , 37 ° C., 5% CO 2 (culture conditions: MEF (−) and LIF (−)). ES cells cultured in a gelatin-coated culture dish were used as controls for this experiment.
培養期間中は、毎日、新しいDMEM培地(LIF(−))と培地を交換した。 During the culture period, the medium was replaced with fresh DMEM medium (LIF (−)) every day.
培養開始3日後に、位相差顕微鏡下でES細胞の形態を観察した。各細胞の形態を、図5に示す。図5中、(a)は、ゼラチンコート培養皿において、DMEM培地(LIF(−))を用いて3日間培養したES細胞の形態を示す図であり、(b)は、コラーゲン分解物コート培養皿において、DMEM培地(LIF(−))を用いて3日間培養したES細胞の形態を示す図であり、(c)は、コラーゲン分解物ゲル培養皿において、DMEM培地(LIF(−))を用いて3日間培養したES細胞の形態を示す図である。 Three days after the start of the culture, the morphology of ES cells was observed under a phase-contrast microscope. The morphology of each cell is shown in FIG. In FIG. 5, (a) is a diagram showing the morphology of ES cells cultured in a gelatin-coated culture dish in a DMEM medium (LIF (−)) for 3 days, and (b) is a collagen decomposition product-coated culture. It is a figure which shows the morphology of ES cells cultured for 3 days using DMEM medium (LIF (−)) in a dish, (c) is the DMEM medium (LIF (−)) in a collagen decomposition product gel culture dish. It is a figure which shows the morphology of the ES cell which was cultured for 3 days using.
ゼラチンコート培養皿において培養した場合、ES細胞が単層に広がり、コロニー形成している細胞と単一で接着している細胞とを区別して観察した。細胞突起を示す形態を示す細胞も存在していた。一般的なES細胞のMEF共存下且つLIF存在下の培養所見(図1(a))と比べてコロニーの数が少なく大きさが小さく、それぞれの細胞が判別できる程度の細胞間接着であることが示された(図5の(a))。 When cultured in a gelatin-coated culture dish, ES cells spread in a single layer, and colonized cells and single-adhered cells were observed separately. There were also cells showing a morphology showing cell processes. Compared to the culture findings (FIG. 1 (a)) of general ES cells in the presence of MEF and LIF, the number of colonies is smaller and the size is smaller, and the cell-cell adhesion is such that each cell can be distinguished. Was shown ((a) in FIG. 5).
コラーゲン分解物コート培養皿において培養した場合、観察されたES細胞は接着もしくは浮遊した3次元細胞塊(胚様体)を形成しており(図5の(b))、ゼラチンコート培養皿の一般的なES細胞の培養所見(図5の(a))とはまったく異なる形態であった。どちらかと言えば、浮遊している胚様体の割合が多かった。 When cultured in a collagen-degraded product-coated culture dish, the observed ES cells form an adherent or floating three-dimensional cell mass (embryoid body) (FIG. 5 (b)), which is a general gelatin-coated culture dish. The morphology was completely different from the typical ES cell culture findings ((a) in FIG. 5). If anything, the proportion of floating embryoid bodies was high.
コラーゲン分解物ゲル培養皿において培養した場合、観察されたES細胞はコラーゲン分解物ゲルに接着もしくは浮遊した3次元細胞塊(胚様体)を形成していた。ゼラチンコート培養皿の一般的なES細胞の培養所見とはまったく異なる形態であった。コラーゲン分解物ゲルに接着している胚様体の方が、浮遊している胚様体より比較的大きかった。(図5の(c))。 When cultured in a collagen degradation product gel culture dish, the observed ES cells formed a three-dimensional cell mass (embryoid body) adhering to or floating on the collagen degradation product gel. The morphology was completely different from the general ES cell culture findings of the gelatin-coated culture dish. The embryoid bodies adhering to the collagen degradation gel were relatively larger than the floating embryoid bodies. ((C) in FIG. 5).
MEF非共存下(MEF(−))で、DMEM培地(LIF(−))を用いてコラーゲン分解物コート培養皿またはコラーゲン分解物ゲル培養皿において培養したES細胞の形態は、ゼラチンコート培養皿において培養したES細胞の形態とは全く異なっていた。しかし、MEF共存下(MEF(+))で、DMEM培地(LIF(+))を用いてコラーゲン分解物コート培養皿(図1(b))またはコラーゲン分解物ゲル培養皿(図1(c))において培養したES細胞と比較して、MEF非共存下(MEF(−))で、DMEM培地(LIF(−))を用いてコラーゲン分解物コート培養皿またはコラーゲン分解物ゲル培養皿において培養したES細胞の形態は、大きさや形に多少の違いが観察されたが、明確な違いはなかった。MEF(−)且つLIF(−)の培養条件で、ゼラチンコート培養皿において培養したES細胞は、一般的なES細胞のコロニーを形成するか、あるいは単一の接着細胞であった。特筆すべきは、MEF(−)且つLIF(−)の培養条件でコラーゲン分解物コート培養皿において培養したES細胞は、MEFを共培養していないにも関わらず、胚様体を形成した。つまり、コラーゲン分解物コート培養皿においてES細胞を培養することは、胚様体を形成させる新たな方法となりうることが示された。同様に、MEF(−)且つLIF(−)の培養条件でコラーゲン分解物ゲル培養皿において培養したES細胞は、これまでに観察されていないような胚様体が、MEF非存在下で形成された。具体的には、MEF(−)且つLIF(−)の培養条件でコラーゲン分解物ゲル培養皿において培養したES細胞から形成された胚様体は、コラーゲン分解物ゲルに接着あるいは浮遊していることが示された。 The morphology of ES cells cultured in a collagen degradation product-coated culture dish or a collagen degradation product gel culture dish using DMEM medium (LIF (-)) in the absence of MEF (MEF (-)) is expressed in a gelatin-coated culture dish. The morphology of the cultured ES cells was completely different. However, in the presence of MEF (MEF (+)), a collagen degradation product coated culture dish (FIG. 1 (b)) or a collagen degradation product gel culture dish (FIG. 1 (c)) using DMEM medium (LIF (+)). ) Was cultured in a collagen degradation product-coated culture dish or a collagen degradation product gel culture dish using DMEM medium (LIF (-)) in the absence of MEF (MEF (-)) as compared with the ES cells cultured in. The morphology of ES cells was slightly different in size and shape, but there was no clear difference. Under MEF (−) and LIF (−) culture conditions, ES cells cultured in gelatin-coated culture dishes either formed colonies of common ES cells or were single adherent cells. It should be noted that the ES cells cultured in the collagen decomposition product-coated culture dish under the culture conditions of MEF (-) and LIF (-) formed embryoid bodies even though the MEF was not co-cultured. That is, it was shown that culturing ES cells in a collagen decomposition product-coated culture dish can be a new method for forming embryoid bodies. Similarly, in ES cells cultured in a collagen degradation product gel culture dish under MEF (-) and LIF (-) culture conditions, embryoid bodies that have not been observed so far are formed in the absence of MEF. It was. Specifically, the embryoid body formed from ES cells cultured in a collagen degradation product gel culture dish under MEF (-) and LIF (-) culture conditions adheres to or floats on the collagen degradation product gel. It has been shown.
<14.コラーゲンの分解物の胚様体形成能に関する試験5>
次に、得られた胚様体がES細胞のみから成るか否かをGFP発現ES細胞を培養して確認した。具体的には、500U/mLのLIFおよび20%ウシ胎児血清を含むDMEM(KnockOutDMEM、サーモフィッシャーサイエンス製)(以下、「DMEM培地(LIF(+))」と称する。)を用いて、マウスES細胞2.5×104個/mLを調製した。あらかじめMEFを播種しておいたゼラチンコート培養皿、またはコラーゲン分解物ゲル培養皿に、マウスES細胞懸濁液2mLをそれぞれ播種して、DMEM培地(LIF(+))を用いて、37℃、5%CO2の条件下にて4日間培養した(培養条件:MEF(+)且つLIF(+))。ゼラチンコート培養皿において培養したES細胞を本実験のコントロールとした。<14. Test on embryoid body formation ability of collagen degradation product 5>
Next, it was confirmed by culturing GFP-expressing ES cells whether or not the obtained embryoid body consisted only of ES cells. Specifically, mouse ES using DMEM (KnockOutDMEM, manufactured by Thermo Fisher Scientific) containing 500 U / mL LIF and 20% fetal bovine serum (hereinafter referred to as "DMEM medium (LIF (+))"). Cells 2.5 × 10 4 cells / mL were prepared. 2 mL of mouse ES cell suspension was seeded in a gelatin-coated culture dish or a collagen decomposition product gel culture dish in which MEF had been seeded in advance, and the DMEM medium (LIF (+)) was used at 37 ° C. Cultured under 5% CO 2 conditions for 4 days (culture conditions: MEF (+) and LIF (+)). ES cells cultured in a gelatin-coated culture dish were used as controls for this experiment.
さらに、LIFを含まず20%ウシ胎児血清を含むDMEM(KnockOutDMEM、サーモフィッシャーサイエンス製)(以下、「DMEM培地(LIF(−))」と称する。)を用いて、マウスES細胞2.5×104個/mLを調製した。あらかじめMEFを播種しておいたコラーゲン分解物ゲル培養皿に、マウスES細胞懸濁液2mLを播種して、DMEM培地(LIF(−))を用いて、37℃、5%CO2の条件下にて4日間培養した(培養条件:MEF(+)且つLIF(−))。Further, using DMEM (KnockOutDMEM, manufactured by Thermo Fisher Scientific) containing 20% fetal bovine serum without LIF (hereinafter referred to as "DMEM medium (LIF (-))"), mouse ES cells 2.5 × 10 4 pieces / mL was prepared. 2 mL of mouse ES cell suspension was seeded in a collagen decomposition product gel culture dish in which MEF had been seeded in advance, and DMEM medium (LIF (-)) was used under the conditions of 37 ° C. and 5% CO 2 . (Culture conditions: MEF (+) and LIF (-)).
4日間培養後に、それぞれの培養条件で培養して得られた細胞の核を、Cellstain(登録商標)-Hoechst 33342 solution(品番H342、株式会社 同仁化学研究所)を用いて染色した。 After culturing for 4 days, the nuclei of cells obtained by culturing under the respective culture conditions were stained with Cellstain®-Hoechst 33342 solution (product number H342, Dojin Chemical Laboratory Co., Ltd.).
結果を図6〜図8に示す。図6は、MEF(+)且つLIF(+)の培養条件において、ゼラチンコート培養皿において4日間培養したES細胞を、顕微鏡下で観察した結果を示す図であり、(a)は、位相差顕微鏡下で観察したES細胞の形態を示す図であり、(b)は、(a)に示したES細胞のGFPの蛍光を蛍光顕微鏡下で観察した結果を示す図であり、(c)は、(a)に示したES細胞をHoechst 33342染色し、蛍光顕微鏡下で観察した結果を示す図であり、(d)は、(a)、(b)および(c)の画像を重ね合せた結果を示す図である。また、図7は、MEF(+)且つLIF(+)の培養条件においてコラーゲン分解物ゲル培養皿においてES細胞を4日間培養した後に得られた胚様体を、顕微鏡下で観察した結果を示す図であり、(a)は、位相差顕微鏡下で観察した胚様体の形態を示す図であり、(b)は、(a)に示した胚様体のGFPの蛍光を蛍光顕微鏡下で観察した結果を示す図であり、(c)は、(a)に示した胚様体をHoechst 33342染色し、蛍光顕微鏡下で観察した結果を示す図であり、(d)は、(a)、(b)および(c)の画像を重ね合せた結果を示す図である。また、図8は、MEF(+)且つLIF(−)の培養条件においてコラーゲン分解物ゲル培養皿においてES細胞を4日間培養した後に得られた胚様体を、顕微鏡下で観察した結果を示す図であり、(a)は、位相差顕微鏡下で観察した胚様体の形態を示す図であり、(b)は、(a)に示した胚様体のGFPの蛍光を蛍光顕微鏡下で観察した結果を示す図であり、(c)は、(a)に示した胚様体をHoechst 33342染色し、蛍光顕微鏡下で観察した結果を示す図であり、(d)は、(a)、(b)および(c)の画像を重ね合せた結果を示す図である。 The results are shown in FIGS. 6 to 8. FIG. 6 is a diagram showing the results of observing ES cells cultured in a gelatin-coated culture dish for 4 days under a microscope under MEF (+) and LIF (+) culture conditions, and FIG. 6A is a phase contrast diagram. It is a figure which shows the morphology of ES cell observed under a microscope, (b) is a figure which shows the result of observing the fluorescence of GFP of ES cell shown in (a) under a fluorescence microscope, and (c) is a figure which shows. , (A) is a diagram showing the results of staining the ES cells shown in (a) with Hoechst 33342 and observing them under a fluorescence microscope, and (d) is a superposition of the images of (a), (b) and (c). It is a figure which shows the result. In addition, FIG. 7 shows the results of observing the embryonic bodies obtained after culturing ES cells in a collagen degradation product gel culture dish for 4 days under the culture conditions of MEF (+) and LIF (+) under a microscope. It is a figure, (a) is a figure which shows the morphology of the embryo-like body observed under the phase-contrast microscope, (b) is the fluorescence of the GFP of the embryo-like body shown in (a) under the fluorescence microscope. It is a figure which shows the observation result, (c) is the figure which showed the result of having Hoechst 33342 stained the embryo-like body shown in (a), and observed under the fluorescence microscope, (d) is the figure which shows (a). It is a figure which shows the result of superimposing the images of (b) and (c). In addition, FIG. 8 shows the results of observing the embryonic bodies obtained after culturing ES cells in a collagen degradation product gel culture dish for 4 days under the culture conditions of MEF (+) and LIF (-) under a microscope. It is a figure, (a) is a figure which shows the morphology of the embryo-like body observed under the phase-contrast microscope, (b) is the fluorescence of the GFP of the embryo-like body shown in (a) under the fluorescence microscope. It is a figure which shows the observation result, (c) is the figure which showed the result of having Hoechst 33342 stained the embryo-like body shown in (a), and observed under the fluorescence microscope, (d) is the figure which shows (a). It is a figure which shows the result of superimposing the images of (b) and (c).
その結果、MEF(+)且つLIF(+)の培養条件においてゼラチンコート培養皿においてES細胞を培養した場合、GFP陽性のES細胞が単層に広がり、コロニー形成することが確認できた(図6の(a)〜(d))。 As a result, it was confirmed that when ES cells were cultured in a gelatin-coated culture dish under MEF (+) and LIF (+) culture conditions, GFP-positive ES cells spread in a single layer and formed colonies (FIG. 6). (A) to (d)).
また、MEF共存下(MEF(+))で、DMEM培地(LIF(+))またはDMEM培地(LIF(−))を用いて、ES細胞をコラーゲン分解物ゲル培養皿において培養した場合、観察されたGFP陽性のES細胞は、コラーゲン分解物ゲルに接着した3次元細胞塊(胚様体)を形成していた。ゼラチンコート培養皿の一般的なES細胞の培養所見とはまったく異なる形態であった。胚様体以外の細胞はGFP陰性であることから、胚様体以外の細胞はMEFであると推察された(図7の(a)〜(d)および図8の(a)〜(d))。また、図8の(a)中の破線で囲った箇所は、コラーゲンと、細胞からの分泌物であると推察された。 In addition, when ES cells are cultured in a collagen degradation product gel culture dish using DMEM medium (LIF (+)) or DMEM medium (LIF (-)) in the presence of MEF (MEF (+)), it is observed. The GFP-positive ES cells formed a three-dimensional cell mass (embryonic stem) adhering to the collagen degradation product gel. The morphology was completely different from the general ES cell culture findings of the gelatin-coated culture dish. Since the cells other than the embryoid body were GFP negative, it was inferred that the cells other than the embryoid body were MEF ((a) to (d) in FIG. 7 and (a) to (d) in FIG. 8). ). In addition, it was presumed that the part surrounded by the broken line in FIG. 8A was collagen and secretions from cells.
以上の結果から、培養液中のLIFの有無に関わらず、MEF共存下においてコラーゲン分解物ゲル培養皿において形成された胚様体は、ES細胞由来であることが示された。 From the above results, it was shown that the embryoid bodies formed in the collagen degradation product gel culture dish in the presence of MEF were derived from ES cells regardless of the presence or absence of LIF in the culture medium.
<15.コラーゲンの分解物の胚様体形成能に関する試験6>
(ヒトiPS細胞)
京都大学 山中伸弥教授の研究室が樹立したヒトiPS細胞(201B7株、RIKEN BRC)を使用した。該iPS細胞株は、染色体解析ですべての細胞が46XXで染色体異常は認められないものである。<15. Test on embryoid body formation ability of collagen degradation product 6>
(Human iPS cells)
Human iPS cells (201B7 strain, RIKEN BRC) established by Professor Shinya Yamanaka's laboratory at Kyoto University were used. In the iPS cell line, all cells were 46XX by chromosomal analysis and no chromosomal abnormality was observed.
(コラーゲン分解物コート培養皿の作製)
ブタ由来のコラーゲンの分解物を10mg/mLに調製し、6−well plateに50μLコートして3時間静置した。なお、コラーゲンの分解物としては上述したコラーゲンの分解物(塩濃度0mMにおける、ブタ由来のコラーゲンの分解物のうち、配列番号2にて示されるアミノ酸配列((3)にて示されるアミノ酸配列に相当)を有する分解物)を用いた。対照群1として、Vitronectin(サーモフィッシャーサイエンティフィック株式会社)をD−PBSで100倍に希釈したものを6−well plateの1ウエルに1mLを加え、1時間以上静置した。対照群2として、iMatrix511(株式会社ニッピ)を0.5μg/cm2になるようにコートした。(Preparation of collagen decomposition product coated culture dish)
A decomposition product of porcine-derived collagen was prepared at 10 mg / mL, coated with 50 μL on a 6-well plate, and allowed to stand for 3 hours. As the collagen decomposition product, the above-mentioned collagen decomposition product (among the collagen decomposition products derived from pigs at a salt concentration of 0 mM, the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 2 (the amino acid sequence shown in (3)) Decomposition product with equivalent) was used. As a control group 1, 1 mL of Vitronectin (Thermo Fisher Scientific Co., Ltd.) diluted 100-fold with D-PBS was added to 1 well of a 6-well plate, and the mixture was allowed to stand for 1 hour or more. As a control group 2, iMatrix 511 (Nippi Co., Ltd.) was coated at 0.5 μg / cm 2 .
(ヒトiPS細胞の胚様体形成)
ヒトiPS細胞はiPS細胞専用のNutriStem培地(コスモバイオ株式会社)を用いて1.0×105個に調整し、上記で作製した培養皿に播種した。培養は、37℃、5%CO2の条件下にて5日間行った。培養期間中は、毎日、新しいNutriStem培地と交換した。(Embryoid formation of human iPS cells)
Human iPS cells were adjusted to 1.0 × 10 5 cells using a NutriStem medium (Cosmo Bio Co., Ltd.) dedicated to iPS cells, and seeded in the culture dish prepared above. Culturing was carried out under the conditions of 37 ° C. and 5% CO 2 for 5 days. During the culture period, the medium was replaced with fresh NutriStem medium daily.
培養開始1日後および5日後に、位相差顕微鏡下でiPS細胞の形態を観察した。各細胞の形態を、図9および図10に示す。図9中、(a)は、コラーゲン分解物コート培養皿において、1日間培養したiPS細胞の形態を示す図であり、(b)は、Vitronectinコート培養皿において、1日間培養したiPS細胞の形態を示す図であり、(c)は、iMatrix511コート培養皿において、1日間培養したiPS細胞の形態を示す図である。図10中、(a)は、コラーゲン分解物コート培養皿において、5日間培養したiPS細胞の形態を示す図であり、(b)は、Vitronectinコート培養皿において、5日間培養したiPS細胞の形態を示す図であり、(c)は、iMatrix511コート培養皿において、5日間培養したiPS細胞の形態を示す図である。 The morphology of iPS cells was observed under a phase-contrast microscope 1 day and 5 days after the start of culturing. The morphology of each cell is shown in FIGS. 9 and 10. In FIG. 9, (a) is a diagram showing the morphology of iPS cells cultured for 1 day in a collagen decomposition product-coated culture dish, and (b) is a diagram showing the morphology of iPS cells cultured for 1 day in a Vitronectin-coated culture dish. (C) is a diagram showing the morphology of iPS cells cultured for 1 day in an iMatrix511 coated culture dish. In FIG. 10, (a) is a diagram showing the morphology of iPS cells cultured for 5 days in a collagen decomposition product-coated culture dish, and (b) is a diagram showing the morphology of iPS cells cultured for 5 days in a Vitronectin-coated culture dish. (C) is a diagram showing the morphology of iPS cells cultured for 5 days in an iMatrix511 coated culture dish.
コラーゲン分解物コート培養皿において培養した場合、1日培養後ではiPS細胞が集まっている様子が観察された。また5日培養後では胚様体を形成していた(図9の(a)および図10の(a))。 When cultured in a collagen decomposition product-coated culture dish, it was observed that iPS cells were gathered after 1-day culture. After culturing for 5 days, embryoid bodies were formed (FIG. 9 (a) and FIG. 10 (a)).
Vitronectinコート培養皿において培養した場合、一般的なiPS細胞の培養所見と同じ形態であった。つまり、1日培養後ではiPS細胞は培養皿底面に個々に接着し、単層培養の細胞形態であった。5日培養後ではiPS細胞は過増殖状態となり、培養皿底面の全てに接着していることが示された(図9の(b)および図10の(b))。 When cultured in a Vitronectin-coated culture dish, it had the same morphology as general iPS cell culture findings. That is, after culturing for one day, the iPS cells individually adhered to the bottom surface of the culture dish and were in the cell morphology of monolayer culture. After culturing for 5 days, the iPS cells became hyperproliferative and were shown to adhere to all of the bottom surface of the culture dish (FIG. 9 (b) and FIG. 10 (b)).
iMatrix511コート培養皿において培養した場合、iPS細胞は培養皿の底面に接着していた。培養1日後および培養5日後の観察像は、Vitronectinコート培養皿の一般的なiPS細胞の培養所見と同様な形態であった。 When cultured in the iMatrix511 coated culture dish, the iPS cells adhered to the bottom surface of the culture dish. The observation images 1 day after culturing and 5 days after culturing were similar to the general iPS cell culture findings of the Vitronectin-coated culture dish.
コラーゲン分解物コート培養皿において培養したiPS細胞の形態は、Vitronectinコート培養皿またはiMatrix511コート培養皿において培養したiPS細胞の形態とは全く異なっていた。Vitronectinコート培養皿において培養したiPS細胞は、一般的なiPS細胞の増殖を示しただけであったが、コラーゲン分解物コート培養皿において培養したiPS細胞は、LIFなどを添加しないにも関わらず、胚様体を形成した。つまり、コラーゲン分解物コート培養皿においてiPS細胞を培養することは、胚様体を形成させる新たな方法となりうることが示された。 The morphology of iPS cells cultured in collagen degradation coated dishes was quite different from the morphology of iPS cells cultured in Vitronectin-coated dishes or iMatrix511-coated dishes. The iPS cells cultured in the Vitronectin-coated culture dish only showed general iPS cell proliferation, but the iPS cells cultured in the collagen degradation product-coated culture dish did not add LIF or the like. Formed an embryoid body. That is, it was shown that culturing iPS cells in a collagen decomposition product-coated culture dish can be a new method for forming embryoid bodies.
<16.コラーゲンの分解物の胚様体形成能に関する試験7>
(塩基性線維芽細胞増殖因子を含まない培地でのiPS細胞の培養)
<15>と同様の実験を、塩基性線維芽細胞増殖因子(bFGF)を含まない培地を用いて培養12日目まで延長して胚様体の形態を観察した。すなわち、ヒトiPS細胞およびコラーゲン分解物としては、<15>と同様のものを用いた。<16. Test on embryoid body formation ability of collagen degradation product 7>
(Culturing iPS cells in a medium containing no basic fibroblast growth factor)
The same experiment as in <15> was extended to the 12th day of culture using a medium containing no basic fibroblast growth factor (bFGF), and the morphology of the embryoid body was observed. That is, as the human iPS cells and collagen degradation products, the same ones as in <15> were used.
(コラーゲン分解物コート培養皿の作製)
コラーゲン分解物を10mg/mLに調製し、6−well plateに50μLコートして3時間静置した。対照群として、プラスチック表面を2−メタクリロイルオキシエチルホスホリルコリンモノマーで加工したLipdure(日油株式会社)を用いた。iPS細胞はLipdure培養皿で培養すると、浮遊した胚様体を形成することが広く知られる。(Preparation of collagen decomposition product coated culture dish)
The collagen degradation product was prepared at 10 mg / mL, coated with 50 μL on a 6-well plate, and allowed to stand for 3 hours. As a control group, Lipdure (NOF CORPORATION) whose plastic surface was processed with 2-methacryloyloxyethyl phosphorylcholine monomer was used. It is widely known that iPS cells form floating embryoid bodies when cultured in Lipdure culture dishes.
(ヒトiPS細胞の胚様体形成)
ヒトiPS細胞はiPS細胞専用のNutriStem培地(コスモバイオ株式会社)を用いて3.0×105個に調整し、上記で作製した培養皿に播種した。培養は、37℃、5%CO2の条件下にて12日間行った。培養期間中は、培養4日目まで毎日、新しいNutriStem培地と半量交換した。培養5日目以降は、塩基性線維芽細胞増殖因子(bFGF)を含まないiPS細胞専用培地であるhiPS mediumを用いて隔日に半量交換した。(Embryoid formation of human iPS cells)
Human iPS cells were adjusted to 3.0 × 10 5 cells using a NutriStem medium (Cosmo Bio Co., Ltd.) dedicated to iPS cells, and seeded in the culture dish prepared above. Culturing was carried out under the conditions of 37 ° C. and 5% CO 2 for 12 days. During the culturing period, half the amount was replaced with fresh NutriStem medium every day until the 4th day of culturing. After the 5th day of culturing, half of the amount was exchanged every other day using hiPS medium, which is a medium for iPS cells containing no basic fibroblast growth factor (bFGF).
培養開始4日後および12日後に、位相差顕微鏡下でiPS細胞の形態を観察した。各細胞の4日後および12日後の形態を、それぞれ図11および図12に示す。図11中、(a)は、コラーゲン分解物コート培養皿において、4日間培養したiPS細胞の形態を示す図であり、(b)は、Lipidure培養皿において、4日間培養したiPS細胞の形態を示す図である。図12の(a)は、コラーゲン分解物コート培養皿において、12日間培養したiPS細胞の形態を示す図であり、図12の(b)は、Lipidure培養皿において、12日間培養したiPS細胞の形態を示す図である。 The morphology of iPS cells was observed under a phase-contrast microscope 4 days and 12 days after the start of culturing. The morphology of each cell after 4 and 12 days is shown in FIGS. 11 and 12, respectively. In FIG. 11, (a) is a diagram showing the morphology of iPS cells cultured for 4 days in a collagen decomposition product-coated culture dish, and (b) shows the morphology of iPS cells cultured for 4 days in a Lipidure culture dish. It is a figure which shows. FIG. 12 (a) is a diagram showing the morphology of iPS cells cultured for 12 days in a collagen decomposition product-coated culture dish, and FIG. 12 (b) is a diagram of iPS cells cultured for 12 days in a Lipidure culture dish. It is a figure which shows the form.
コラーゲン分解物コート培養皿において培養した場合、4日培養後ではiPS細胞が胚様体を形成する様子が観察された(図11の(a))。さらにbFGFを含まない専用培地で12日目まで培養した結果、胚様体が維持されていることが示された(図12の(a))。 When cultured in a collagen decomposition product-coated culture dish, the appearance of iPS cells forming embryoid bodies was observed after 4 days of culture (FIG. 11 (a)). Furthermore, as a result of culturing in a special medium containing no bFGF until the 12th day, it was shown that the embryoid body was maintained ((a) in FIG. 12).
Lipidure培養皿において4日間培養した場合、一般的なiPS細胞の培養所見と同じく浮遊した胚様体が示された(図11の(b))。さらにbFGFを含まない専用培地で12日目まで培養した結果、胚様体が巨大化していることが示された(図12の(b))。 When cultured in a Lipidure culture dish for 4 days, a floating embryoid body was shown as in the case of general iPS cell culture findings (FIG. 11 (b)). Furthermore, as a result of culturing in a special medium containing no bFGF until the 12th day, it was shown that the embryoid body became enormous ((b) in FIG. 12).
コラーゲン分解物コート培養皿を用いたヒトiPS細胞の胚様体形成は、Lipidure培養皿のヒトiPS細胞の胚様体形成と比べて、培養皿底面に接着していることから培地交換が容易であるという利点が明らかになった。Lipidure培養皿は培地交換する際に吸引による細胞の誤損出が起こりやすい。また、Lipidure培養皿から回収した胚様体は、培地交換での遠心作業中に胚様体同士が接触して巨大化することが危惧された。一方、コラーゲン分解物コート培養皿では、そのような問題が起こりにくいことが分かった。さらに、bFGFを含まない専用培地で培養してもコラーゲン分解物コート培養皿で形成したiPS細胞の胚様体は崩壊しないことが明らかになった。 The embryoid body formation of human iPS cells using a collagen decomposition product-coated culture dish is easier to exchange the medium because it adheres to the bottom surface of the culture dish as compared with the embryoid body formation of human iPS cells in a Lipidure culture dish. The advantage of having it became clear. The Lipidure culture dish is prone to accidental loss of cells due to suction when changing the medium. In addition, there was a concern that the embryoid bodies recovered from the Lipidure culture dish would come into contact with each other and become huge during the centrifugation operation in the medium exchange. On the other hand, it was found that such a problem is unlikely to occur in the collagen decomposition product coated culture dish. Furthermore, it was clarified that the embryoid bodies of iPS cells formed in the collagen degradation product-coated culture dish did not collapse even when cultured in a special medium containing no bFGF.
コラーゲン分解物コート培養皿において培養したヒトiPS細胞の胚様体は、Lipidure培養皿でのヒトiPS細胞と比較して、形態学的な所見に明確な違いは明確ではなかった。つまり、コラーゲン分解物コート培養皿においてヒトiPS細胞の胚様体を培養することは、胚様体を維持させる新たな方法となりうることが示された。 Embryoid bodies of human iPS cells cultured in collagen decomposition dish-coated culture dishes did not show a clear difference in morphological findings as compared with human iPS cells in Lipidure culture dishes. That is, it was shown that culturing the embryoid body of human iPS cells in a collagen decomposition product-coated culture dish can be a new method for maintaining the embryoid body.
<17.コラーゲンの分解物の胚様体の分化誘導に関する試験>
次に、コラーゲンの分解物を用いて得られたマウスES細胞の胚様体を、分化誘導できることを確認した。具体的には、LIFを含まないEB専用培地(DMEM培地に20%ウシ胎児血清、1mM MEM Sodium Pyruvate Solution、1/100希釈MEM Non Essential Amino Acid Solition、10μM β−メルカプトエタノールを添加した培地)(以下、「EB培地」と称する)を用いて、マウスES細胞5.0×104個/wellを調製した。次に、あらかじめ上記と同じ手法で調整した12−well plateのコラーゲン分解物コート培養皿、またはLipidure培養皿を用意し、マウスES細胞懸濁液をそれぞれ播種した。EB培地を用いて、37℃、5%CO2の条件下にて15日間培養した。培地は培養2日後以降、毎日、新しいEB培地に交換した。ゼラチンコート培養皿において培養した播種前のES細胞を本実験のコントロールとした。<17. Test on induction of embryoid body differentiation of collagen degradation products>
Next, it was confirmed that the embryoid body of mouse ES cells obtained by using a degradation product of collagen can be induced to differentiate. Specifically, EB-dedicated medium containing no LIF (20% fetal bovine serum, 1 mM MEM Sodium Pyruvate Solution, 1/100 diluted MEM Non Essential Amino Acid Solution, 10 μM β-mercaptoethanol added to DMEM medium) ( Hereinafter, referred to as “EB medium”) was used to prepare mouse ES cells 5.0 × 10 4 cells / well. Next, a 12-well plate collagen decomposition product-coated culture dish or a Lipidure culture dish prepared in advance by the same method as above was prepared, and mouse ES cell suspensions were seeded respectively. The cells were cultured in EB medium under the conditions of 37 ° C. and 5% CO 2 for 15 days. The medium was replaced with new EB medium every day after 2 days of culturing. ES cells before seeding cultured in a gelatin-coated culture dish were used as controls in this experiment.
(マウスES細胞の胚様体からのRNAの抽出)
15日間培養後に、それぞれの培養条件で培養して得られたマウスES細胞の胚様体を遠心により集め、それぞれのRNAを、total RNA精製用バッファーのLysis Buffer RA1(タカラバイオ株式会社)およびβ−メルカプトエタノールと混合し、さらに70%エタノールを加えてよく混ぜた。得られた溶液をRNA精製用スピンカラムにて遠心してゲルに吸着させ、洗浄し、さらにDNase処理してカラムから溶出させることで、各培養皿の胚様体のtotal RNAを精製した。(Extraction of RNA from mouse ES cell embryoid body)
After culturing for 15 days, embryoid bodies of mouse ES cells obtained by culturing under the respective culture conditions were collected by centrifugation, and the respective RNAs were collected in total RNA purification buffer Lysis Buffer RA1 (Takara Bio Co., Ltd.) and β. -Mixed with mercaptoethanol, further 70% ethanol was added and mixed well. The obtained solution was centrifuged on a spin column for RNA purification, adsorbed on a gel, washed, and further treated with DNase to elute from the column to purify the total RNA of embryoid bodies in each culture dish.
(マウスES細胞の胚様体からのRNAのcDNAの調製)
常法により、タカラバイオ株式会社製のPrimeScript RT Master Mix (Perfect Real Time)を用いて、total RNAを鋳型として、RT−PCR法によりcDNAを合成した。反応後のcDNA溶液は−20℃もしくは−80℃で次の実験まで保存した。(Preparation of RNA cDNA from mouse ES cell embryoid body)
By a conventional method, cDNA was synthesized by the RT-PCR method using total RNA as a template using PrimeScript RT Master Mix (Perfect Real Time) manufactured by Takara Bio Inc. The cDNA solution after the reaction was stored at −20 ° C. or −80 ° C. until the next experiment.
(マウスES細胞の胚様体のRNAの解析)
分化に与えるコラーゲン分解物を用いた培養の影響を調べるため、以下の3つの分化マーカーのRNA発現量を調べた。中内胚葉、内胚葉および中胚葉への分化に関与するGATA4(GATA Binding Protein 4)、内胚葉系の肝細胞に特異的なAFP(αフェトプロテイン)、心筋前駆細胞に特異的なNKX2.5(NK−2 transcription factor related,locus 5)のプライマーを用いて、RNA発現量を定量化した。上記で得られたcDNAを鋳型として、各プライマー、SYBR Fast qPCR Mixなどの試薬と適量の超純水などとを混合し、Thermal Cycler Dice Real Time System (タカラバイオ株式会社)を用いて、常法により定量RT−PCRを行った。(Analysis of embryoid body RNA of mouse ES cells)
In order to investigate the effect of culturing with collagen degradation products on differentiation, the RNA expression levels of the following three differentiation markers were examined. GATA4 (GATA Binding Protein 4) involved in mesoderm, endoderm and mesoderm differentiation, AFP (α-fetoprotein) specific to endoderm hepatocytes, NKX2.5 specific to myocardial progenitor cells The RNA expression level was quantified using the primers of NK-2 differentiation factor protected, locus 5). Using the cDNA obtained above as a template, each primer, a reagent such as SYBR Fast qPCR Mix, and an appropriate amount of ultrapure water are mixed, and using Thermal Cycler Dice Real Time System (Takara Bio Inc.), a conventional method is used. Quantitative RT-PCR was performed.
RT−PCRの結果から得られた発現量の最大値を100として、各マーカーの相対発現量をレーダーチャート化したものを図13に示す。コラーゲン分解物コート培養皿で形成したマウスES細胞の胚様体は、NKX2.5の相対発現量が低いがGATA4とAFPの相対発現量が高いことが明らかになった(図13の(a))。Lipidure培養皿で形成した胚様体のRNA相対発現量は、コラーゲン分解物コート培養皿の胚様体のそれと同様であった(図13の(b))。一方、コントロールであるゼラチンコート培養皿のマウスES細胞では、逆に、NKX2.5の相対発現量がGATA4およびAFPより高いことが示された(図13の(c))。つまり、コラーゲン分解物コート培養皿の胚様体は、Lipidure培養皿の胚様体と同様にES細胞の分化に大きく影響することが明らかになった。ゼラチンコート培養皿の細胞の結果と正反対になることは、胚様体特有の分化誘導に適していることを示している。 FIG. 13 shows a radar chart of the relative expression levels of each marker, with the maximum expression level obtained from the RT-PCR results as 100. It was revealed that the embryoid bodies of mouse ES cells formed in the collagen decomposition product coated culture dish had a low relative expression level of NKX2.5 but a high relative expression level of GATA4 and AFP (FIG. 13 (a)). ). The RNA relative expression level of the embryoid body formed in the Lipidure culture dish was similar to that of the embryoid body in the collagen decomposition product coated culture dish (FIG. 13 (b)). On the other hand, in the mouse ES cells of the control gelatin-coated culture dish, on the contrary, the relative expression level of NKX2.5 was shown to be higher than that of GATA4 and AFP (FIG. 13 (c)). That is, it was clarified that the embryoid body of the collagen decomposition product-coated culture dish has a great influence on the differentiation of ES cells as well as the embryoid body of the Lipidure culture dish. The opposite of the results of the cells in the gelatin-coated culture dish indicates that it is suitable for the induction of differentiation peculiar to the embryoid body.
ES細胞やiPS細胞の分化誘導は胚様体を経ることが必須で、胚様体形成後に適切な分化誘導条件を満たすことが重要である。よって、コラーゲン分解物コート培養皿の胚様体も十分に分化誘導する能力を有していることが証明された。従来法のLipidure培養皿の胚様体は浮遊しているので大きな凝集塊を形成しやすい。そのため、Lipidure培養皿でのES細胞およびiPS細胞の分化は、分化の質に大きく影響する。一方、コラーゲン分解物コート培養皿の胚様体は、分化の再現性および質を向上させることが可能となる。 Induction of differentiation of ES cells and iPS cells is essential through the embryoid body, and it is important to satisfy appropriate conditions for inducing differentiation after embryoid body formation. Therefore, it was proved that the embryoid body of the collagen decomposition product-coated culture dish also has a sufficient ability to induce differentiation. Since the embryoid body of the conventional Lipidure culture dish is floating, it is easy to form a large agglomerate. Therefore, the differentiation of ES cells and iPS cells in the Lipidure culture dish greatly affects the quality of differentiation. On the other hand, the embryoid body of the collagen decomposition product coated culture dish can improve the reproducibility and quality of differentiation.
<18.コラーゲンの分解物の胚様体形成能に関する試験8>
(培養皿)
上述したコラーゲンの分解物(ブタ皮部由来のI型コラーゲンの分解物(配列番号27)、あるいはラット腱由来のI型コラーゲンの分解物(配列番号24と配列番号5との混合物)、あるいはブタ皮部由来のI型コラーゲンの分解物(配列番号26))と接触させた、市販の培養皿を試験に用いた。具体的には、35mm培養皿にコラーゲン分解物の濃度(ブタ皮部由来のI型コラーゲンの分解物(配列番号27)は3.2mg/mLから9.6mg/mL、ラット腱由来のI型コラーゲンの分解物(配列番号24と配列番号5との混合物)は2.8mg/mLから8.4mg/mL、ブタ皮部由来のI型コラーゲンの分解物(配列番号26)は3.3mg/mL)を変えて添加し、培養皿に十分になじませて室温で5時間静置し、コラーゲン分解物コート培養皿とした。<18. Test on embryoid body formation ability of collagen degradation product 8>
(Culture dish)
The above-mentioned collagen degradation product (type I collagen degradation product derived from pig skin (SEQ ID NO: 27), or type I collagen degradation product derived from rat tendon (mixture of SEQ ID NO: 24 and SEQ ID NO: 5), or pig A commercially available culture dish in contact with a degradation product of type I collagen derived from the skin (SEQ ID NO: 26) was used for the test. Specifically, the concentration of collagen degradation product in a 35 mm culture dish (type I collagen degradation product derived from pig skin (SEQ ID NO: 27) is 3.2 mg / mL to 9.6 mg / mL, type I derived from rat tendon). Collagen degradation product (mixture of SEQ ID NO: 24 and SEQ ID NO: 5) is 2.8 mg / mL to 8.4 mg / mL, and type I collagen degradation product derived from pig skin (SEQ ID NO: 26) is 3.3 mg / mL. mL) was changed and added, and the mixture was sufficiently blended in a culture dish and allowed to stand at room temperature for 5 hours to prepare a collagen decomposition product-coated culture dish.
(マウスES細胞)
山梨大学生命環境学部生命工学科 若山照彦教授から譲渡されたマウスES細胞を使用した。このマウスES細胞は、GFP(green fluorescent protein)標識されており、GFPタンパク質をコードしている遺伝子が染色体中に挿入されているものである。(Mouse ES cells)
Mouse ES cells transferred from Professor Teruhiko Wakayama, Faculty of Life and Environmental Sciences, University of Yamanashi, were used. These mouse ES cells are labeled with GFP (green fluorescent protein), and the gene encoding the GFP protein is inserted into the chromosome.
(フィーダー細胞の調製)
マイトマイシン処理したマウス胎児由来線維芽細胞(Murine Embryonic Fibroblasts:MEF)(CMPMEFCF、DSファーマバイオメディカル製)を6.1×104個/mLに調製した。ゼラチンコート培養皿、アテロコラーゲンコート培養皿(ブタ腱由来ペプシン可溶化I型コラーゲン、COL 1、旭テクノグラス社製)、コラーゲン分解物コート培養皿に、MEFをそれぞれ1.2×105個播種して、10%ウシ胎児血清を含むDMEM培地(DMEM、日水製薬株式会社製)を用いて、37℃、5%CO2の条件下にて1日間培養した。(Preparation of feeder cells)
Mitomycin-treated mouse embryo-derived fibroblasts (MEF) (CMPMECFF, manufactured by DS Pharma Biomedical) were prepared at 6.1 × 10 4 cells / mL. 1.2 x 10 5 MEFs were sown in a gelatin-coated culture dish, an atelocollagen-coated culture dish (porcine tendon-derived pepsin-solubilized type I collagen, COL 1, manufactured by Asahi Technograss), and a collagen decomposition product-coated culture dish. Then, the cells were cultured in DMEM medium (DMEM, manufactured by Nissui Pharmaceutical Co., Ltd.) containing 10% bovine fetal serum under the conditions of 37 ° C. and 5% CO 2 for 1 day.
(胚様体の形成)
500U/mLの白血病抑制因子(Leukemia Inhibitory Factor:LIF)および20%ウシ胎児血清を含むDMEM(KnockOutDMEM、サーモフィッシャーサイエンス製)(以下、「DMEM培地(LIF(+))」と称する。)を用いて、マウスES細胞2.5×105個/mLを調製した。あらかじめMEFを播種しておいたゼラチンコート培養皿、アテロコラーゲンコート培養皿、コラーゲン分解物コート培養皿に、マウスES細胞をそれぞれ5.0×104個/cm2播種して、DMEM培地(LIF(+))を用いて、37℃、5%CO2の条件下にて培養した(培養条件:MEF(+)且つLIF(+))。ゼラチンコート培養皿およびアテロコラーゲンコート培養皿において培養したES細胞を本実験のコントロールとした。なお、実施例において、「MEF(+)」はMEF共存下での培養を示す。また、「LIF(+)」はLIF共存下での培養を示す。(Formation of embryoid body)
Using DMEM (KnockOutDMEM, manufactured by Thermo Fisher Science) containing 500 U / mL of Leukemia Inhibitory Factor (LIF) and 20% fetal bovine serum (hereinafter referred to as "DMEM medium (LIF (+))"). , 2.5 × 10 5 mouse ES cells / mL were prepared. 5.0 × 10 4 cells / cm 2 of mouse ES cells were seeded in each of a gelatin-coated culture dish, an atelocollagen-coated culture dish, and a collagen decomposition product-coated culture dish in which MEF had been seeded in advance, and the DMEM medium (LIF (LIF) +)) Was used to culture under the conditions of 37 ° C. and 5% CO 2 (culture conditions: MEF (+) and LIF (+)). ES cells cultured in a gelatin-coated culture dish and an atelocollagen-coated culture dish were used as controls in this experiment. In the examples, "MEF (+)" indicates culture in the coexistence of MEF. Further, "LIF (+)" indicates culture in the coexistence of LIF.
培養開始1日後に、位相差顕微鏡下でES細胞の形態を観察した。各細胞の形態を、図14に示す。図14中、(a)は、ゼラチンコート培養皿において、MEF共存下(MEF(+))で、DMEM培地(LIF(+))を用いて1日間培養したES細胞の形態を示す図であり、(b)は、アテロコラーゲンコート培養皿において、MEF共存下(MEF(+))で、DMEM培地(LIF(+))を用いて1日間培養したES細胞の形態を示す図であり、(c)は、コラーゲン分解物コート培養皿(ブタ皮部由来、配列番号27)において、MEF共存下(MEF(+))で、DMEM培地(LIF(+))を用いて1日間培養したES細胞の形態を示す図であり、(d)は、コラーゲン分解物コート培養皿(ラット腱由来、配列番号24と配列番号5との混合物)において、MEF共存下(MEF(+))で、DMEM培地(LIF(+))を用いて1日間培養したES細胞の形態を示す図であり、(e)は、コラーゲン分解物コート培養皿(ブタ皮部由来、配列番号26)において、MEF共存下(MEF(+))で、DMEM培地(LIF(+))を用いて1日間培養したES細胞の形態を示す図である。ゼラチンコート培養皿およびアテロコラーゲンコート培養皿において培養した場合、MEFはゼラチンコート培養皿の底面に接着して伸展していた。その間にES細胞がコロニーを形成していた。一般的なES細胞の培養所見と同じ形態であった(図14の(a)および(b))。 One day after the start of culturing, the morphology of ES cells was observed under a phase-contrast microscope. The morphology of each cell is shown in FIG. In FIG. 14, (a) is a diagram showing the morphology of ES cells cultured in a gelatin-coated culture dish in the presence of MEF (MEF (+)) for 1 day using DMEM medium (LIF (+)). , (B) are diagrams showing the morphology of ES cells cultured for 1 day in DMEM medium (LIF (+)) in the presence of MEF (MEF (+)) in an Atelocollagen-coated culture dish. ) Are ES cells cultured for 1 day in DMEM medium (LIF (+)) in a collagen decomposition product-coated culture dish (derived from pig skin, SEQ ID NO: 27) in the presence of MEF (MEF (+)). It is a figure which shows the morphology, (d) is a DMEM medium (from rat tendon, a mixture of SEQ ID NO: 24 and SEQ ID NO: 5) in the presence of MEF (MEF (+)) in a collagen decomposition product coated culture dish. It is a figure which shows the morphology of ES cells cultured for 1 day using LIF (+)), (e) is a collagen decomposition product coated culture dish (derived from the pig skin part, SEQ ID NO: 26) in the presence of MEF (MEF). (+)) Is a diagram showing the morphology of ES cells cultured for 1 day using DMEM medium (LIF (+)). When cultured in a gelatin-coated culture dish and an atelocollagen-coated culture dish, the MEF adhered to the bottom surface of the gelatin-coated culture dish and extended. During that time, ES cells were forming colonies. It had the same morphology as general ES cell culture findings (FIGS. 14 (a) and 14 (b)).
コラーゲン分解物コート培養皿において培養した場合、ES細胞は3次元細胞塊(胚様体)を形成しており、ゼラチンコート培養皿およびアテロコラーゲンコート培養皿の一般的なES細胞の培養所見とはまったく異なる形態であった(図14の(c)〜(e))。またMEFはコラーゲン分解物コート培養皿の底面に接着していたが、ゼラチンコート培養皿およびアテロコラーゲンコート培養皿のように底面全体に伸展せず、ES細胞の胚様体の底面で主にコラーゲンと接着していた。 When cultured in a collagen degradation product-coated culture dish, the ES cells form a three-dimensional cell mass (embryonic stem cell), which is completely different from the general ES cell culture findings of the gelatin-coated culture dish and the atelocollagen-coated culture dish. It had a different form ((c) to (e) in FIG. 14). In addition, MEF adhered to the bottom surface of the collagen decomposition product-coated culture dish, but did not extend to the entire bottom surface unlike the gelatin-coated culture dish and the atelocollagen-coated culture dish, and mainly with collagen on the bottom surface of the embryoid body of ES cells. It was glued.
コラーゲン分解物コート培養皿において培養したES細胞の形態は、ゼラチンコート培養皿およびアテロコラーゲンコート培養皿において培養したES細胞の形態とは全く異なっていた。ゼラチンコート培養皿およびアテロコラーゲンコート培養皿において培養したES細胞は、一般的なES細胞のコロニーを形成しただけであったが、コラーゲン分解物コート培養皿において培養したES細胞は、接着した胚様体を形成した。つまり、コラーゲン分解物の動物種(例えば、ブタ、ラット)、由来部位(例えば、皮部と腱)およびN末端切断部位(例えば、配列番号26、配列番号27、配列番号24、配列番号5)に関わらず、コラーゲン分解物コート培養皿においてES細胞を培養することは、胚様体を形成させる新たな方法となりうることが示された。 The morphology of ES cells cultured in collagen degradation-coated culture dishes was completely different from the morphology of ES cells cultured in gelatin-coated culture dishes and atelocollagen-coated culture dishes. The ES cells cultured in the gelatin-coated culture dish and the atelocollagen-coated culture dish only formed colonies of general ES cells, whereas the ES cells cultured in the collagen degradation product-coated culture dish formed adherent embryonic stem cells. Was formed. That is, animal species of collagen degradation products (eg, pigs, rats), origin sites (eg, skin and tendons) and N-terminal cleavage sites (eg, SEQ ID NO: 26, SEQ ID NO: 27, SEQ ID NO: 24, SEQ ID NO: 5). Regardless, culturing ES cells in a collagen degradation-coated dish has been shown to be a new way to form embryoid bodies.
<19.コラーゲンの分解物の胚様体形成能に関する試験9>
ゼラチンコート培養皿、アテロコラーゲンコート培養皿、コラーゲン分解物コート培養皿において培養したES細胞の未分化能を調べるため、細胞内在性のアルカリ性ホスファターゼ活性を調べた。<19. Test on embryoid body formation ability of collagen degradation product 9>
In order to examine the undifferentiated ability of ES cells cultured in a gelatin-coated culture dish, an atelocollagen-coated culture dish, and a collagen degradation product-coated culture dish, the intracellular alkaline phosphatase activity was examined.
(培養皿)
上述したコラーゲンの分解物(ブタ皮部由来のI型コラーゲンの分解物(配列番号27)、あるいはラット腱由来のI型コラーゲンの分解物(配列番号24と配列番号5との混合物)、あるいはブタ皮部由来のI型コラーゲンの分解物(配列番号26))と接触させた、市販の培養皿を試験に用いた。具体的には、35mm培養皿にコラーゲン分解物の濃度(ブタ皮部由来のI型コラーゲンの分解物(配列番号27)は3.2mg/mLから9.6mg/mL、ラット腱由来のI型コラーゲンの分解物(配列番号24と配列番号5との混合物)は2.8mg/mLから8.4mg/mL、ブタ皮部由来のI型コラーゲンの分解物(配列番号26)は3.3mg/mL)を変えて添加し、培養皿に十分になじませて室温で5時間静置し、コラーゲン分解物コート培養皿とした。(Culture dish)
The above-mentioned collagen degradation product (type I collagen degradation product derived from pig skin (SEQ ID NO: 27), or type I collagen degradation product derived from rat tendon (mixture of SEQ ID NO: 24 and SEQ ID NO: 5), or pig A commercially available culture dish in contact with a degradation product of type I collagen derived from the skin (SEQ ID NO: 26) was used for the test. Specifically, the concentration of collagen degradation product in a 35 mm culture dish (type I collagen degradation product derived from pig skin (SEQ ID NO: 27) is 3.2 mg / mL to 9.6 mg / mL, type I derived from rat tendon). Collagen degradation product (mixture of SEQ ID NO: 24 and SEQ ID NO: 5) is 2.8 mg / mL to 8.4 mg / mL, and type I collagen degradation product derived from pig skin (SEQ ID NO: 26) is 3.3 mg / mL. mL) was changed and added, and the mixture was sufficiently blended in a culture dish and allowed to stand at room temperature for 5 hours to prepare a collagen decomposition product-coated culture dish.
(胚様体の形成)
500U/mLのLIFおよび20%ウシ胎児血清を含むDMEM(KnockOutDMEM、サーモフィッシャーサイエンス製)(以下、「DMEM培地(LIF(+))」と称する。)を用いて、2.5×105個/mLを調製した。あらかじめMEFを播種しておいたゼラチンコート培養皿、アテロコラーゲンコート培養皿、コラーゲン分解物コート培養皿に、マウスES細胞をそれぞれ5.0×104個/cm2播種して、DMEM培地(LIF(+))を用いて、37℃、5%CO2の条件下にて培養した(培養条件:MEF(+)且つLIF(+))。ゼラチンコート培養皿およびアテロコラーゲンコート培養皿において培養したES細胞を本実験のコントロールとした。(Formation of embryoid body)
2.5 x 10 5 pieces using DMEM (KnockOutDMEM, manufactured by Thermo Fisher Scientific) containing 500 U / mL LIF and 20% fetal bovine serum (hereinafter referred to as "DMEM medium (LIF (+))"). / ML was prepared. 5.0 × 10 4 cells / cm 2 of mouse ES cells were seeded in each of a gelatin-coated culture dish, an atelocollagen-coated culture dish, and a collagen decomposition product-coated culture dish in which MEF had been seeded in advance, and the DMEM medium (LIF (LIF) +)) Was used to culture under the conditions of 37 ° C. and 5% CO 2 (culture conditions: MEF (+) and LIF (+)). ES cells cultured in a gelatin-coated culture dish and an atelocollagen-coated culture dish were used as controls in this experiment.
1日間培養後に、細胞の培養上清を取り除き、滅菌PBSで洗浄した。引き続き、細胞を固定するために4%パラホルムアルデヒド溶液を細胞が浸るまで加え、室温で30分間静置した。その後、滅菌蒸留水を細胞が浸るまで加えて洗浄する操作を2回繰り返した。洗浄液を取り除いた後、TRACP&ALP double-stain kit(商品コードMK300、タカラバイオ社製)付属のアルカリ性ホスファターゼ染色液を培養皿に加えて37℃で45分間静置した。反応を停止させるため、染色液を取り除いて滅菌蒸留水で3回洗浄した。結果を図15に示す。 After culturing for 1 day, the culture supernatant of the cells was removed and washed with sterile PBS. Subsequently, a 4% paraformaldehyde solution was added to fix the cells until the cells were immersed, and the cells were allowed to stand at room temperature for 30 minutes. Then, the operation of adding sterile distilled water until the cells were immersed and washing was repeated twice. After removing the washing liquid, the alkaline phosphatase stain attached to the TRACP & ALP double-stain kit (product code MK300, manufactured by Takara Bio Inc.) was added to the culture dish and allowed to stand at 37 ° C. for 45 minutes. To stop the reaction, the stain was removed and washed 3 times with sterile distilled water. The results are shown in FIG.
図15は、MEF(+)且つLIF(+)の培養条件において1日間培養したES細胞の細胞内在性のアルカリ性ホスファターゼ活性を調べた結果を示す図であり、図15中、(a)は、ゼラチンコート培養皿において、MEF共存下(MEF(+))で、DMEM培地(LIF(+))を用いて1日間培養したES細胞のアルカリ性ホスファターゼ染色の結果を示す図であり、(b)は、アテロコラーゲンコート培養皿において、MEF共存下(MEF(+))で、DMEM培地(LIF(+))を用いて1日間培養したES細胞のアルカリ性ホスファターゼ染色の結果を示す図であり、(c)は、コラーゲン分解物コート培養皿(ブタ皮部由来、配列番号27)において、MEF共存下(MEF(+))で、DMEM培地(LIF(+))を用いて1日間培養したES細胞のアルカリ性ホスファターゼ染色の結果を示す図であり、(d)は、コラーゲン分解物コート培養皿(ラット腱由来、配列番号24と配列番号5との混合物)において、MEF共存下(MEF(+))で、DMEM培地(LIF(+))を用いて1日間培養したES細胞のアルカリ性ホスファターゼ染色の結果を示す図であり、(e)は、コラーゲン分解物コート培養皿(ブタ皮部由来、配列番号26)において、MEF共存下(MEF(+))で、DMEM培地(LIF(+))を用いて1日間培養したES細胞のアルカリ性ホスファターゼ染色の結果を示す図である。 FIG. 15 is a diagram showing the results of examining the intracellular alkaline phosphatase activity of ES cells cultured for 1 day under MEF (+) and LIF (+) culture conditions, and FIG. 15A is a diagram showing the results of examining the intracellular alkaline phosphatase activity. It is a figure which shows the result of alkaline phosphatase staining of ES cells cultured for 1 day using DMEM medium (LIF (+)) in the presence of MEF (MEF (+)) in a gelatin-coated culture dish, (b) is a figure which shows. , A figure showing the results of alkaline phosphatase staining of ES cells cultured for 1 day using DMEM medium (LIF (+)) in the presence of MEF (MEF (+)) in an Atelocollagen coated culture dish, (c). Is alkaline of ES cells cultured for 1 day in DMEM medium (LIF (+)) in the presence of MEF (MEF (+)) in a collagen decomposition product coated culture dish (derived from pig skin, SEQ ID NO: 27). It is a figure which shows the result of phosphatase staining, (d) is a collagen decomposition product coated culture dish (derived from rat tendon, a mixture of SEQ ID NO: 24 and SEQ ID NO: 5) in the presence of MEF (MEF (+)). It is a figure which shows the result of alkaline phosphatase staining of ES cells cultured for 1 day using DMEM medium (LIF (+)), (e) is a collagen decomposition product coated culture dish (from pig skin part, SEQ ID NO: 26). It is a figure which shows the result of alkaline phosphatase staining of ES cells cultured for 1 day using DMEM medium (LIF (+)) in the presence of MEF (MEF (+)).
コラーゲン分解物コート培養皿おいて培養したES細胞から形成された胚様体は、ゼラチンコート培養皿およびアテロコラーゲンコート培養皿において培養したES細胞のコロニーと同様にアルカリ性ホスファターゼ活性陽性であることが示された(図15の(c)〜(e))。一方、共培養しているMEFはアルカリ性ホスファターゼ活性陰性であった。これらの結果は、コラーゲン分解物の動物種(例えば、ブタ、ラット)、由来部位(例えば、皮部と腱)およびN末端切断部位(例えば、配列番号26、配列番号27、配列番号24、配列番号5)に関わらず、コラーゲン分解物コート培養皿において培養したES細胞から形成された胚様体が未分化能を維持していることを示している。 Embryonic stems formed from ES cells cultured in collagen degradation-coated culture dishes were shown to be alkaline phosphatase activity-positive, similar to colonies of ES cells cultured in gelatin-coated culture dishes and atelocollagen-coated culture dishes. ((C) to (e) in FIG. 15). On the other hand, the co-cultured MEF was negative for alkaline phosphatase activity. These results show that the collagen degradation product species (eg, pigs, rats), origin sites (eg, skin and tendons) and N-terminal cleavage sites (eg, SEQ ID NO: 26, SEQ ID NO: 27, SEQ ID NO: 24, SEQ ID NO: Regardless of No. 5), it is shown that the embryoid bodies formed from ES cells cultured in the collagen decomposition product coated culture dish maintain the undifferentiated ability.
<20.コラーゲンの分解物の胚様体形成能に関する試験10>
次に、GFP発現ES細胞を培養して得られた胚様体がES細胞のみから成るか否かを確認した。<20. Test on embryoid body formation ability of collagen degradation product 10>
Next, it was confirmed whether or not the embryoid body obtained by culturing the GFP-expressing ES cells consisted only of ES cells.
(培養皿)
上述したコラーゲンの分解物(ブタ皮部由来のI型コラーゲンの分解物(配列番号27)、あるいはラット腱由来のI型コラーゲンの分解物(配列番号24と配列番号5との混合物)、あるいはブタ皮部由来のI型コラーゲンの分解物(配列番号26))と接触させた、市販の培養皿を試験に用いた。具体的には、35mm培養皿にコラーゲン分解物の濃度(ブタ皮部由来のI型コラーゲンの分解物(配列番号27)は3.2mg/mLから9.6mg/mL、ラット腱由来のI型コラーゲンの分解物(配列番号24と配列番号5との混合物)は2.8mg/mLから8.4mg/mL、ブタ皮部由来のI型コラーゲンの分解物(配列番号26)は3.3mg/mL)を変えて添加し、培養皿に十分になじませて室温で5時間静置し、コラーゲン分解物コート培養皿とした。(Culture dish)
The above-mentioned collagen degradation product (type I collagen degradation product derived from pig skin (SEQ ID NO: 27), or type I collagen degradation product derived from rat tendon (mixture of SEQ ID NO: 24 and SEQ ID NO: 5), or pig A commercially available culture dish in contact with a degradation product of type I collagen derived from the skin (SEQ ID NO: 26) was used for the test. Specifically, the concentration of collagen degradation product in a 35 mm culture dish (type I collagen degradation product derived from pig skin (SEQ ID NO: 27) is 3.2 mg / mL to 9.6 mg / mL, type I derived from rat tendon). Collagen degradation product (mixture of SEQ ID NO: 24 and SEQ ID NO: 5) is 2.8 mg / mL to 8.4 mg / mL, and type I collagen degradation product derived from pig skin (SEQ ID NO: 26) is 3.3 mg / mL. mL) was changed and added, and the mixture was sufficiently blended in a culture dish and allowed to stand at room temperature for 5 hours to prepare a collagen decomposition product-coated culture dish.
(胚様体の形成)
具体的には、500U/mLのLIFおよび20%ウシ胎児血清を含むDMEM(KnockOutDMEM、サーモフィッシャーサイエンス製)(以下、「DMEM培地(LIF(+))」と称する。)を用いて、2.5×105個/mLを調製した。あらかじめMEFを播種しておいたゼラチンコート培養皿、コラーゲン分解物コート培養皿に、マウスES細胞をそれぞれ5.0×104個/cm2播種して、DMEM培地(LIF(+))を用いて、37℃、5%CO2の条件下にて培養した(培養条件:MEF(+)且つLIF(+))。ゼラチンコート培養皿において培養したES細胞を本実験のコントロールとした。(Formation of embryoid body)
Specifically, using DMEM (KnockOutDMEM, manufactured by Thermo Fisher Scientific) containing 500 U / mL LIF and 20% fetal bovine serum (hereinafter referred to as "DMEM medium (LIF (+))"), 2. 5 × 10 5 pieces / mL was prepared. 5.0 × 10 4 cells / cm 2 of mouse ES cells were seeded in a gelatin-coated culture dish and a collagen degradation product-coated culture dish in which MEF had been seeded in advance, and DMEM medium (LIF (+)) was used. The cells were cultured under the conditions of 37 ° C. and 5% CO 2 (culture conditions: MEF (+) and LIF (+)). ES cells cultured in a gelatin-coated culture dish were used as controls for this experiment.
結果を図16〜図19に示す。図16は、MEF(+)且つLIF(+)の培養条件において、ゼラチンコート培養皿においてGFP遺伝子を内在したES細胞を1日間培養した後に得られたコロニーを、顕微鏡下で観察した結果を示す図であり、(a)は、位相差顕微鏡下で観察した上記コロニーの形態を示す図であり、(b)は、(a)に示した上記コロニーのGFPの蛍光を蛍光顕微鏡下で観察した結果を示す図であり、(c)は、(a)および(b)の画像を重ね合せた結果を示す図である。また、図17は、MEF(+)且つLIF(+)の培養条件においてコラーゲン分解物コート培養皿(ブタ皮部由来、配列番号27)においてGFP遺伝子を内在したES細胞を1日間培養した後に得られた胚様体を、顕微鏡下で観察した結果を示す図であり、(a)は、位相差顕微鏡下で観察した上記胚様体の形態を示す図であり、(b)は、(a)に示した上記胚様体のGFPの蛍光を蛍光顕微鏡下で観察した結果を示す図であり、(c)は、(a)および(b)の画像を重ね合せた結果を示す図である。また、図18は、MEF(+)且つLIF(+)の培養条件においてコラーゲン分解物コート培養皿(ラット腱由来、配列番号24と配列番号5との混合物)においてGFP遺伝子を内在したES細胞を1日間培養した後に得られた胚様体を、顕微鏡下で観察した結果を示す図であり、(a)は、位相差顕微鏡下で観察した上記胚様体の形態を示す図であり、(b)は、(a)に示した上記胚様体のGFPの蛍光を蛍光顕微鏡下で観察した結果を示す図であり、(c)は、(a)および(b)の画像を重ね合せた結果を示す図である。また、図19は、MEF(+)且つLIF(+)の培養条件においてコラーゲン分解物コート培養皿(ブタ皮部由来、配列番号26)においてGFP遺伝子を内在したES細胞を1日間培養した後に得られた胚様体を、顕微鏡下で観察した結果を示す図であり、(a)は、位相差顕微鏡下で観察した上記胚様体の形態を示す図であり、(b)は、(a)に示した上記胚様体のGFPの蛍光を蛍光顕微鏡下で観察した結果を示す図であり、(c)は、(a)および(b)の画像を重ね合せた結果を示す図である。 The results are shown in FIGS. 16 to 19. FIG. 16 shows the results of microscopic observation of colonies obtained after culturing ES cells containing the GFP gene in a gelatin-coated culture dish for 1 day under MEF (+) and LIF (+) culture conditions. It is a figure, (a) is a figure which shows the morphology of the said colony observed under a phase contrast microscope, (b) is a figure which observed the fluorescence of GFP of the said colony shown in (a) under a fluorescence microscope. It is a figure which shows the result, (c) is a figure which shows the result of superimposing the images of (a) and (b). In addition, FIG. 17 is obtained after culturing ES cells containing a GFP gene in a collagen decomposition product-coated culture dish (derived from pig skin, SEQ ID NO: 27) under MEF (+) and LIF (+) culture conditions for 1 day. It is a figure which shows the result of observing the embryoid body under a microscope, (a) is a figure which shows the morphology of the said embryoid body observed under a phase contrast microscope, and (b) is (a It is a figure which shows the result of observing the fluorescence of the GFP of the embryoid body shown in) under a fluorescence microscope, and (c) is a figure which shows the result of superimposing the images of (a) and (b). .. In addition, FIG. 18 shows ES cells containing a GFP gene in a collagen decomposition product-coated culture dish (derived from rat tendon, a mixture of SEQ ID NO: 24 and SEQ ID NO: 5) under MEF (+) and LIF (+) culture conditions. It is a figure which shows the result of observing the embryoid body obtained after culturing for one day under a microscope, and (a) is the figure which shows the morphology of the said embryoid body observed under a phase-contrast microscope. b) is a diagram showing the result of observing the fluorescence of the GFP of the embryoid body shown in (a) under a fluorescence microscope, and (c) is a diagram in which the images of (a) and (b) are superimposed. It is a figure which shows the result. Further, FIG. 19 is obtained after culturing ES cells containing a GFP gene for 1 day in a collagen decomposition product-coated culture dish (derived from pig skin, SEQ ID NO: 26) under MEF (+) and LIF (+) culture conditions. It is a figure which shows the result of observing the embryoid body under a microscope, (a) is a figure which shows the morphology of the said embryoid body observed under a phase contrast microscope, and (b) is (a It is a figure which shows the result of observing the fluorescence of the GFP of the embryoid body shown in) under a fluorescence microscope, and (c) is a figure which shows the result of superimposing the images of (a) and (b). ..
その結果、MEF(+)且つLIF(+)の培養条件においてゼラチンコート培養皿においてES細胞を培養した場合、GFP陽性のES細胞が単層に広がり、コロニー形成することが確認できた(図16の(a)〜(c))。 As a result, it was confirmed that when ES cells were cultured in a gelatin-coated culture dish under MEF (+) and LIF (+) culture conditions, GFP-positive ES cells spread in a single layer and formed colonies (FIG. 16). (A) to (c)).
また、MEF共存下(MEF(+))で、DMEM培地(LIF(+))を用いて、ES細胞をコラーゲン分解物コート培養皿において培養した場合、観察されたGFP陽性のES細胞は、コラーゲン分解物コートに接着した3次元細胞塊(胚様体)を形成していた。これは、ゼラチンコート培養皿の一般的なES細胞の培養所見とはまったく異なる形態であった。胚様体以外の細胞はGFP陰性であることから、胚様体以外の細胞はMEFであると推察された(図17の(a)〜(c)、図18の(a)〜(c)および図19の(a)〜(c))。 In addition, when ES cells were cultured in a collagen degradation product-coated culture dish using DMEM medium (LIF (+)) in the presence of MEF (MEF (+)), the observed GFP-positive ES cells were collagen. A three-dimensional cell mass (embryoid body) adhered to the decomposition product coat was formed. This was a completely different form from the general ES cell culture findings of the gelatin-coated culture dish. Since the cells other than the embryoid body were GFP negative, it was inferred that the cells other than the embryoid body were MEF ((a) to (c) in FIGS. 17 and (a) to (c) in FIGS. 18). And (a) to (c) of FIG.
以上の結果から、コラーゲン分解物の動物種(例えば、ブタ、ラット)、由来部位(例えば、皮部と腱)およびN末端切断部位(例えば、配列番号26、配列番号27、配列番号24、配列番号5)に関わらず、MEF共存下においてコラーゲン分解物コート培養皿において形成された胚様体は、ES細胞由来であることが示された。 From the above results, the animal species of collagen degradation products (eg, pigs, rats), origin sites (eg, skin and tendons) and N-terminal cleavage sites (eg, SEQ ID NO: 26, SEQ ID NO: 27, SEQ ID NO: 24, SEQ ID NO: Regardless of No. 5), the embryoid bodies formed in the collagen degradation product-coated culture dish in the presence of MEF were shown to be derived from ES cells.
<21.コラーゲンの分解物の胚様体形成能に関する試験11>
(培養皿)
上述したコラーゲンの分解物(ブタ皮部由来のI型コラーゲンの分解物(配列番号27)、あるいはラット腱由来のI型コラーゲンの分解物(配列番号24と配列番号5との混合物)、あるいはブタ皮部由来のI型コラーゲンの分解物(配列番号26))と接触させた、市販の培養皿を試験に用いた。具体的には、35mm培養皿にコラーゲン分解物の濃度(ブタ皮部由来のI型コラーゲンの分解物(配列番号27)は3.2mg/mLから9.6mg/mL、ラット腱由来のI型コラーゲンの分解物(配列番号24と配列番号5との混合物)は2.8mg/mLから8.4mg/mL、ブタ皮部由来のI型コラーゲンの分解物(配列番号26)は3.3mg/mL)を変えて添加し、培養皿に十分になじませて室温で5時間静置し、コラーゲン分解物コート培養皿とした。<21. Test on embryoid body formation ability of collagen degradation product 11>
(Culture dish)
The above-mentioned collagen degradation product (type I collagen degradation product derived from pig skin (SEQ ID NO: 27), or type I collagen degradation product derived from rat tendon (mixture of SEQ ID NO: 24 and SEQ ID NO: 5), or pig A commercially available culture dish in contact with a degradation product of type I collagen derived from the skin (SEQ ID NO: 26) was used for the test. Specifically, the concentration of collagen degradation product in a 35 mm culture dish (type I collagen degradation product derived from pig skin (SEQ ID NO: 27) is 3.2 mg / mL to 9.6 mg / mL, type I derived from rat tendon). Collagen degradation product (mixture of SEQ ID NO: 24 and SEQ ID NO: 5) is 2.8 mg / mL to 8.4 mg / mL, and type I collagen degradation product derived from pig skin (SEQ ID NO: 26) is 3.3 mg / mL. mL) was changed and added, and the mixture was sufficiently blended in a culture dish and allowed to stand at room temperature for 5 hours to prepare a collagen decomposition product-coated culture dish.
(胚様体の形成)
MEFを播種している培養皿の代わりに、MEFを播種していない培養皿を用いて、同様の実験を、LIFを含み且つ20%ウシ胎児血清を含むDMEM培地(KnockOutDMEM、サーモフィッシャーサイエンス製)(以下、「DMEM培地(LIF(+))」と称する。)を用いて行った。具体的には、DMEM培地(LIF(+))を用いて、を用いて、マウスES細胞2.5×105個/mLを調製した。MEFを播種していないゼラチンコート培養皿、アテロコラーゲンコート培養皿、コラーゲン分解物コート培養皿に、マウスES細胞をそれぞれ5.0×104個/cm2播種して、DMEM培地(LIF(+))を用いて、37℃、5%CO2の条件下にて培養した(培養条件:MEF(−)且つLIF(+))。ゼラチンコート培養皿およびアテロコラーゲンコート培養皿において培養したES細胞を本実験のコントロールとした。なお、実施例において、「MEF(−)」はMEF非共存下での培養を示す。また、「LIF(+)」はLIF共存下での培養を示す。(Formation of embryoid body)
Using a culture dish not seeded with MEF instead of the culture dish seeded with MEF, a similar experiment was performed in DMEM medium containing LIF and 20% fetal bovine serum (KnockOutDMEM, Thermofisher Science). (Hereinafter referred to as "DMEM medium (LIF (+))"). Specifically, using DMEM medium (LIF (+)), mouse ES cells 2.5 × 10 5 cells / mL were prepared. 5.0 × 10 4 cells / cm 2 of mouse ES cells were seeded in each of a gelatin-coated culture dish, an atelocollagen-coated culture dish, and a collagen decomposition product-coated culture dish in which MEF was not seeded, and the DMEM medium (LIF (+)) was seeded. ) Was cultured under the conditions of 37 ° C. and 5% CO 2 (culture conditions: MEF (−) and LIF (+)). ES cells cultured in a gelatin-coated culture dish and an atelocollagen-coated culture dish were used as controls in this experiment. In the examples, "MEF (-)" indicates culture in the absence of MEF. Further, "LIF (+)" indicates culture in the coexistence of LIF.
培養開始1日後に、位相差顕微鏡下でES細胞の形態を観察した。各細胞の形態を、図20に示す。図20中、(a)は、ゼラチンコート培養皿において、DMEM培地(LIF(+))を用いて1日間培養したES細胞の形態を示す図であり、(b)は、アテロコラーゲンコート培養皿において、DMEM培地(LIF(+))を用いて1日間培養したES細胞の形態を示す図であり、(c)は、コラーゲン分解物コート培養皿(ブタ皮部由来、配列番号27)において、DMEM培地(LIF(+))を用いて1日間培養したES細胞の形態を示す図であり、(d)は、コラーゲン分解物コート培養皿(ラット腱由来、配列番号24と配列番号5との混合物)において、DMEM培地(LIF(+))を用いて1日間培養したES細胞の形態を示す図であり、(e)は、コラーゲン分解物コート培養皿(ブタ皮部由来、配列番号26))において、DMEM培地(LIF(+))を用いて1日間培養したES細胞の形態を示す図である。 One day after the start of culturing, the morphology of ES cells was observed under a phase-contrast microscope. The morphology of each cell is shown in FIG. In FIG. 20, (a) is a diagram showing the morphology of ES cells cultured for 1 day using DMEM medium (LIF (+)) in a gelatin-coated culture dish, and (b) is a diagram showing the morphology of ES cells cultured in an atelocollagen-coated culture dish. , DMEM medium (LIF (+)) is a diagram showing the morphology of ES cells cultured for 1 day, in which (c) is a DMEM in a collagen decomposition product coated culture dish (derived from pig skin, SEQ ID NO: 27). It is a figure which shows the morphology of ES cell culture | culture | culture | culture | culture medium (LIF (+)) for 1 day, (d) is the collagen decomposition product coated culture dish (derived from rat tendon, the mixture of SEQ ID NO: 24 and SEQ ID NO: 5 ) Shows the morphology of ES cells cultured for 1 day using DMEM medium (LIF (+)), and (e) is a collagen decomposition product coated culture dish (derived from pig skin, SEQ ID NO: 26). It is a figure which shows the morphology of the ES cell which was cultured for 1 day using DMEM medium (LIF (+)).
ゼラチンコート培養皿およびアテロコラーゲンコート培養皿において培養した場合、ES細胞が単層に広がり、単一で接着している細胞を観察した。細胞突起を示す形態を示す細胞も存在していた。一般的なES細胞のMEF共存下且つLIF存在下の培養所見(図14の(a)および(b))と比べてそれぞれの細胞が判別できる程度の典型的な細胞間接着であることが示された(図20の(a)および(b))。 When cultured in a gelatin-coated culture dish and an atelocollagen-coated culture dish, ES cells spread in a single layer, and single adherent cells were observed. There were also cells showing a morphology showing cell processes. Compared with the culture findings of general ES cells in the presence of MEF and in the presence of LIF ((a) and (b) in FIG. 14), it is shown that the cell-cell adhesion is typical enough to distinguish each cell. ((A) and (b) in FIG. 20).
コラーゲン分解物コート培養皿において培養した場合、観察されたES細胞は接着もしくは浮遊した3次元細胞塊(胚様体)を形成しており(図20の(c)〜(e))、ゼラチンコート培養皿およびアテロコラーゲンコート培養皿の一般的なES細胞の培養所見(図14の(a)および(b))とはまったく異なる形態であった。 When cultured in a collagen decomposition product-coated culture dish, the observed ES cells formed adherent or floating three-dimensional cell clusters (embryonic stem cells) (FIGS. 20 (c) to (e)), and were gelatin-coated. The morphology was completely different from the general ES cell culture findings ((a) and (b) in FIGS. 14) of the culture dish and the atelocollagen-coated culture dish.
MEF非共存下(MEF(−))で、DMEM培地(LIF(+))を用いてコラーゲン分解物コート培養皿において培養したES細胞の形態は、コラーゲン分解物の動物種(例えば、ブタ、ラット)、由来部位(例えば、皮部と腱)およびN末端切断部位(例えば、配列番号26、配列番号27、配列番号24、配列番号5)に関わらず、ゼラチンコート培養皿およびアテロコラーゲンコート培養皿において培養したES細胞の形態とは全く異なっていた。しかし、MEF共存下(MEF(+))で、DMEM培地(LIF(+))を用いてコラーゲン分解物コート培養皿において培養したES細胞(図14の(c)〜(e))と比較して、MEF非共存下(MEF(−))で、DMEM培地(LIF(+))を用いてコラーゲン分解物コート培養皿において培養したES細胞(図20の(c)〜(e))の形態は、大きさや形、接着、浮遊などに多少の違いが観察されたが、コラーゲン分解物の動物種(例えば、ブタ、ラット)、由来部位(例えば、皮部と腱)およびN末端切断部位(例えば、配列番号26、配列番号27、配列番号24、配列番号5)に関わらず、明確な違いはなかった。 In the absence of MEF (MEF (-)), the morphology of ES cells cultured in a collagen degradation product-coated culture dish using DMEM medium (LIF (+)) is the morphology of collagen degradation product animal species (eg, pigs, rats). ), Origin sites (eg, skin and tendons) and N-terminal cleavage sites (eg, SEQ ID NO: 26, SEQ ID NO: 27, SEQ ID NO: 24, SEQ ID NO: 5) in gelatin-coated and atelocollagen-coated dishes. The morphology of the cultured ES cells was completely different. However, in comparison with ES cells ((c) to (e) in FIG. 14) cultured in a collagen decomposition product-coated culture dish using DMEM medium (LIF (+)) in the presence of MEF (MEF (+)). The forms of ES cells ((c) to (e) in FIG. 20) cultured in a collagen decomposition product-coated culture dish using DMEM medium (LIF (+)) in the absence of MEF (MEF (-)). Although some differences were observed in size, shape, adhesion, floating, etc., animal species of collagen degradation products (eg, pigs, rats), origin sites (eg, skin and tendons) and N-terminal cut sites (eg, skin and tendons) For example, there was no clear difference regardless of SEQ ID NO: 26, SEQ ID NO: 27, SEQ ID NO: 24, and SEQ ID NO: 5).
MEF(−)且つLIF(+)の培養条件で、ゼラチンコート培養皿およびアテロコラーゲンコート培養皿において培養したES細胞は、単一の接着細胞であった。特筆すべきは、コラーゲン分解物コート培養皿において培養したES細胞は、コラーゲン分解物の動物種(例えば、ブタ、ラット)、由来部位(例えば、皮部と腱)およびN末端切断部位(例えば、配列番号26、配列番号27、配列番号24、配列番号5)に関わらず、MEFを共培養していない条件下でも、胚様体を形成した。つまり、コラーゲン分解物コート培養皿においてES細胞を培養することは、コラーゲン分解物の動物種(例えば、ブタ、ラット)、由来部位(例えば、皮部と腱)およびN末端切断部位(例えば、配列番号26、配列番号27、配列番号24、配列番号5)に関わらず、胚様体を形成させる新たな方法となりうることが示された。 The ES cells cultured in the gelatin-coated culture dish and the atelocollagen-coated culture dish under the culture conditions of MEF (−) and LIF (+) were single adherent cells. Notably, ES cells cultured in collagen degradation-coated culture dishes include collagen degradation animal species (eg, pigs, rats), origin sites (eg, skin and tendons) and N-terminal cleavage sites (eg, eg). Regardless of SEQ ID NO: 26, SEQ ID NO: 27, SEQ ID NO: 24, SEQ ID NO: 5), embryoid bodies were formed even under the condition that MEF was not co-cultured. That is, culturing ES cells in a collagen degradation-coated culture dish means that the collagen degradation product animal species (eg, pigs, rats), origin sites (eg, skin and tendons) and N-terminal cleavage sites (eg, sequences) It has been shown that regardless of No. 26, SEQ ID NO: 27, SEQ ID NO: 24, SEQ ID NO: 5), it can be a new method for forming an embryoid body.
<22.コラーゲンの分解物の胚様体形成能に関する試験12>
次に、ゼラチンコート培養皿、アテロコラーゲンコート培養皿、コラーゲン分解物コート培養皿において培養したES細胞の未分化能を調べるため、細胞内在性のアルカリ性ホスファターゼ活性を調べた。<22. Test on embryoid body formation ability of collagen degradation product 12>
Next, in order to examine the undifferentiated ability of ES cells cultured in a gelatin-coated culture dish, an atelocollagen-coated culture dish, and a collagen degradation product-coated culture dish, the intracellular alkaline phosphatase activity was examined.
(培養皿)
上述したコラーゲンの分解物(ブタ皮部由来のI型コラーゲンの分解物(配列番号27)、あるいはラット腱由来のI型コラーゲンの分解物(配列番号24と配列番号5との混合物)、あるいはブタ皮部由来のI型コラーゲンの分解物(配列番号26))と接触させた、市販の培養皿を試験に用いた。具体的には、35mm培養皿にコラーゲン分解物の濃度(ブタ皮部由来のI型コラーゲンの分解物(配列番号27)は3.2mg/mLから9.6mg/mL、ラット腱由来のI型コラーゲンの分解物(配列番号24と配列番号5との混合物)は2.8mg/mLから8.4mg/mL、ブタ皮部由来のI型コラーゲンの分解物(配列番号26)は3.3mg/mL)を変えて添加し、培養皿に十分になじませて室温で5時間静置し、コラーゲン分解物コート培養皿とした。(Culture dish)
The above-mentioned collagen degradation product (type I collagen degradation product derived from pig skin (SEQ ID NO: 27), or type I collagen degradation product derived from rat tendon (mixture of SEQ ID NO: 24 and SEQ ID NO: 5), or pig A commercially available culture dish in contact with a degradation product of type I collagen derived from the skin (SEQ ID NO: 26) was used for the test. Specifically, the concentration of collagen degradation product in a 35 mm culture dish (type I collagen degradation product derived from pig skin (SEQ ID NO: 27) is 3.2 mg / mL to 9.6 mg / mL, type I derived from rat tendon). Collagen degradation product (mixture of SEQ ID NO: 24 and SEQ ID NO: 5) is 2.8 mg / mL to 8.4 mg / mL, and type I collagen degradation product derived from pig skin (SEQ ID NO: 26) is 3.3 mg / mL. mL) was changed and added, and the mixture was sufficiently blended in a culture dish and allowed to stand at room temperature for 5 hours to prepare a collagen decomposition product-coated culture dish.
(胚様体の形成)
500U/mLのLIFおよび20%ウシ胎児血清を含むDMEM(KnockOutDMEM、サーモフィッシャーサイエンス製)(以下、「DMEM培地(LIF(+))」と称する。)を用いて、2.5×105個/mLを調製した。MEFを播種していないゼラチンコート培養皿、アテロコラーゲンコート培養皿、コラーゲン分解物コート培養皿に、マウスES細胞をそれぞれ5.0×104個/cm2播種して、DMEM培地(LIF(+))を用いて、37℃、5%CO2の条件下にて培養した。ゼラチンコート培養皿およびアテロコラーゲンコート培養皿において培養したES細胞を本実験のコントロールとした。(Formation of embryoid body)
2.5 x 10 5 pieces using DMEM (KnockOutDMEM, manufactured by Thermo Fisher Scientific) containing 500 U / mL LIF and 20% fetal bovine serum (hereinafter referred to as "DMEM medium (LIF (+))"). / ML was prepared. 5.0 × 10 4 cells / cm 2 of mouse ES cells were seeded in each of a gelatin-coated culture dish, an atelocollagen-coated culture dish, and a collagen decomposition product-coated culture dish in which MEF was not seeded, and the DMEM medium (LIF (+)) was seeded. ) Was used for culturing under the conditions of 37 ° C. and 5% CO 2 . ES cells cultured in a gelatin-coated culture dish and an atelocollagen-coated culture dish were used as controls in this experiment.
1日間培養後に、細胞の培養上清を取り除き、滅菌PBSで洗浄した。引き続き、細胞を固定するために4%パラホルムアルデヒド溶液を細胞が浸るまで加え、室温で30分間静置した。その後、滅菌蒸留水を細胞が浸るまで加えて洗浄する操作を2回繰り返した。洗浄液を取り除いた後、TRACP&ALP double−stain kit(商品コードMK300、タカラバイオ社製)付属のアルカリ性ホスファターゼ染色液を培養皿に加えて37℃で45分間静置した。反応を停止させるため、染色液を取り除いて滅菌蒸留水で3回洗浄した。結果を図21に示す。 After culturing for 1 day, the culture supernatant of the cells was removed and washed with sterile PBS. Subsequently, a 4% paraformaldehyde solution was added to fix the cells until the cells were immersed, and the cells were allowed to stand at room temperature for 30 minutes. Then, the operation of adding sterile distilled water until the cells were immersed and washing was repeated twice. After removing the washing liquid, the alkaline phosphatase stain attached to the TRACP & ALP double-stain kit (product code MK300, manufactured by Takara Bio Inc.) was added to the culture dish and allowed to stand at 37 ° C. for 45 minutes. To stop the reaction, the stain was removed and washed 3 times with sterile distilled water. The results are shown in FIG.
図21は、MEF非共存下(MEF(−))且つLIF(+)の培養条件において1日間培養したES細胞の細胞内在性のアルカリ性ホスファターゼ活性を調べた結果を示す図であり、図21中、(a)は、ゼラチンコート培養皿において、MEF非共存下(MEF(−))で、DMEM培地(LIF(+))を用いて1日間培養したES細胞のアルカリ性ホスファターゼ活性染色の結果を示す図であり、(b)は、アテロコラーゲンコート培養皿において、MEF非共存下(MEF(−))で、DMEM培地(LIF(+))を用いて1日間培養したES細胞のアルカリ性ホスファターゼ活性染色の結果を示す図であり、(c)は、コラーゲン分解物コート培養皿(ブタ皮部由来、配列番号27)において、MEF非共存下(MEF(−))で、DMEM培地(LIF(+))を用いて1日間培養したES細胞のアルカリ性ホスファターゼ活性染色の結果を示す図であり、(d)は、コラーゲン分解物コート培養皿(ラット腱由来、配列番号24と配列番号5との混合物)において、MEF非共存下(MEF(−))で、DMEM培地(LIF(+))を用いて1日間培養したES細胞のアルカリ性ホスファターゼ活性染色の結果を示す図であり、(e)は、コラーゲン分解物コート培養皿(ブタ皮部由来、配列番号26)において、MEF非共存下(MEF(−))で、DMEM培地(LIF(+))を用いて1日間培養したES細胞のアルカリ性ホスファターゼ活性染色の結果を示す図である。 FIG. 21 is a diagram showing the results of examining the intracellular alkaline phosphatase activity of ES cells cultured for 1 day under MEF non-coexistence (MEF (−)) and LIF (+) culture conditions. , (A) show the results of alkaline phosphatase activity staining of ES cells cultured for 1 day in DMEM medium (LIF (+)) in a gelatin-coated culture dish in the absence of MEF (MEF (-)). FIG. 3 (b) shows alkaline phosphatase activity staining of ES cells cultured for 1 day in DMEM medium (LIF (+)) in a petri dish in an atelocollagen-coated culture dish in the absence of MEF (MEF (−)). It is a figure which shows the result, (c) is a DMEM medium (LIF (+)) in a collagen decomposition product coated culture dish (from the pig skin part, SEQ ID NO: 27) in the absence of MEF (MEF (−)). It is a figure which shows the result of alkaline phosphatase activity staining of ES cells cultured for 1 day using, (d) is a collagen decomposition product coated culture dish (derived from rat tendon, a mixture of SEQ ID NO: 24 and SEQ ID NO: 5). , MEF non-coexistence (MEF (−)), the result of alkaline phosphatase activity staining of ES cells cultured for 1 day using DMEM medium (LIF (+)), (e) is collagen degradation. Alkaline phosphatase activity staining of ES cells cultured for 1 day in DMEM medium (LIF (+)) in a petri dish (from pig skin, SEQ ID NO: 26) in the absence of MEF (MEF (-)). It is a figure which shows the result of.
MEF(−)且つLIF(+)の培養条件で、ゼラチンコート培養皿およびアテロコラーゲンコート培養皿において培養した単一のES細胞は、MEF(+)且つLIF(+)の培養条件のES細胞のコロニー(図15の(a)と(b))と同様にアルカリ性ホスファターゼ活性陽性であることが示された(図21の(a)と(b))。コラーゲン分解物コート培養皿おいてMEF(−)且つLIF(+)の培養条件で培養したES細胞から形成された接着および浮遊した胚様体は、MEF(+)且つLIF(+)の培養条件の接着した胚様体(図15の(c)〜(e))と同様にアルカリ性ホスファターゼ活性陽性であることが示された(図21の(c)〜(e))。これらの結果は、MEF非共存下でコラーゲン分解物コート培養皿において培養したES細胞から形成された胚様体もコラーゲン分解物の動物種(例えば、ブタ、ラット)、由来部位(例えば、皮部と腱)およびN末端切断部位(例えば、配列番号26、配列番号27、配列番号24、配列番号5)に関わらず、未分化能を維持していることを示している。 Single ES cells cultured in gelatin-coated and atelocollagen-coated dishes under MEF (-) and LIF (+) culture conditions are colonies of ES cells under MEF (+) and LIF (+) culture conditions. (Similar to (a) and (b) in FIG. 15, it was shown to be positive for alkaline phosphatase activity ((a) and (b) in FIG. 21). Adherent and floating embryoid bodies formed from ES cells cultured under MEF (-) and LIF (+) culture conditions in a collagen degradation-coated culture dish are MEF (+) and LIF (+) culture conditions. It was shown that the embryoid bodies to which the cells were adhered ((c) to (e) in FIG. 15) were positive for alkaline phosphatase activity ((c) to (e) in FIG. 21). These results show that embryoid bodies formed from ES cells cultured in a collagen degradation product-coated culture dish in the absence of MEF are also collagen degradation product animal species (eg, pigs, rats), origin sites (eg, skin). And tendon) and N-terminal cleavage sites (eg, SEQ ID NO: 26, SEQ ID NO: 27, SEQ ID NO: 24, SEQ ID NO: 5), indicating that the undifferentiated ability is maintained.
以上のことから、本実施例のコラーゲンの分解物は、マウスES細胞とヒトiPS細胞の胚様体形成能を有していることと、その後に必要とされる分化誘導に活用できることが明らかになった。本発明の一実施形態の方法によって得られた胚様体を適切な分化誘導培地で長期培養することにより、内胚葉、中胚葉、外胚葉に分化させることで、さらに神経組織、骨・軟骨組織、脂肪組織、筋肉組織などの再建が期待される。 From the above, it is clear that the collagen degradation product of this example has the ability to form embryoid bodies in mouse ES cells and human iPS cells, and can be utilized for the subsequent differentiation induction required. became. By long-term culturing the embryo-like body obtained by the method of one embodiment of the present invention in an appropriate differentiation-inducing medium, it is differentiated into endoderm, mesoderm, and ectoderm, and further neural tissue, bone / cartilage tissue. , Fat tissue, muscle tissue, etc. are expected to be reconstructed.
本発明は、再生医療に関わる産業において利用可能である。 The present invention can be used in industries related to regenerative medicine.
Claims (8)
多能性幹細胞を、コラーゲンの分解物またはアテロコラーゲンの分解物と共に培養する工程を包含し、
当該分解物は、上記コラーゲンまたはアテロコラーゲンのトリプルヘリカルドメインの少なくとも一部分としてアミノ末端に配列番号2、24、25、26または27にて示すアミノ酸配列を含んでおり、
上記分解物はさらに、上記配列番号2、24、25、26または27にて示すアミノ酸配列のカルボキシル末端側に、100個以上の「Gly−X−Y」(XおよびYは任意のアミノ酸)が連続するアミノ酸配列を含んでいることを特徴とする、胚様体形成方法。 A method of forming embryoid bodies of pluripotent stem cells
Including the step of culturing pluripotent stem cells with a degradation product of collagen or a degradation product of atelocollagen,
The degradation product contains the amino acid sequence set forth in SEQ ID NO: 2, 24, 25, 26 or 27 at the amino terminus as at least part of the triple helical domain of the collagen or atelocollagen .
The decomposition product further contains 100 or more "Gly-XY" (X and Y are arbitrary amino acids) on the carboxyl-terminal side of the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 2, 24, 25, 26 or 27. A method for forming an embryoid body, which comprises a continuous amino acid sequence .
(A)上記コラーゲンまたはアテロコラーゲンのトリプルヘリカルドメイン内の下記(1)にて示されるアミノ酸配列の、X1とX2との間の化学結合、X2とGとの間の化学結合、GとX3との間の化学結合、X4とGとの間の化学結合、または、X6とGとの間の化学結合が切断された、コラーゲンの分解物またはアテロコラーゲンの分解物;
(B)上記コラーゲンまたはアテロコラーゲンのトリプルヘリカルドメイン内の下記(2)にて示されるアミノ酸配列の、X1とX2との間の化学結合、X2とGとの間の化学結合、GとX3との間の化学結合、X4とGとの間の化学結合、X6とGとの間の化学結合、GとX7との間の化学結合、または、X14とGとの間の化学結合が切断された、コラーゲンの分解物またはアテロコラーゲンの分解物;
(C)上記コラーゲンまたはアテロコラーゲンのトリプルヘリカルドメインのアミノ末端の下記(3)にて示されるアミノ酸配列の、Y1とY2との間の化学結合が切断された、コラーゲンの分解物またはアテロコラーゲンの分解物;
(1)−G−X1−X2−G−X3−X4−G−X5−X6−G−;
(2)−G−X1−X2−G−X3−X4−G−X5−X6−G−X7−X8−G−X9−X10−G−X11−X12−G−X13−X14−G−;
(3)−Y1−Y2−Y3−G−Y4−Y5−G−Y6−Y7−G−Y8−Y9−G−;
(但し、Gは、グリシンであり、X1〜X14およびY1〜Y9は、任意のアミノ酸である)。 The decomposition product according to claim 1, wherein the decomposition product contains at least one of the following decomposition products of collagen (A) to (C) or decomposition products of atelocollagen. Embryoid body formation method:
(A) of the amino acid sequence represented by the following (1) in the triple helical domain of the collagen or atelocollagen, a chemical bond between X 1 and X 2, the chemical bond between X 2 and G, and G chemical bond between X 3, a chemical bond between X 4 and G, or a chemical bond between X 6 and G is disconnected, decomposition product or decomposition product of the atelocollagen of collagen;
(B) the amino acid sequence represented by the following (2) in the triple helical domain of the collagen or atelocollagen, a chemical bond between X 1 and X 2, the chemical bond between X 2 and G, and G chemical bond between X 3, a chemical bond between X 4 and G, chemical bond between X 6 and G, chemical bond between G and X 7, or, between X 14 and G Degradation of collagen or atelocollagen with broken chemical bonds between;
(C) the amino acid sequence represented by the following (3) to the amino terminus of a triple helical domain of the collagen or atelocollagen, a chemical bond between Y 1 and Y 2 is disconnected, the collagen degradation product or atelocollagen Decomposition;
(1) -G-X 1- X 2- G-X 3- X 4- G-X 5- X 6 -G-;
(2) -G-X 1- X 2- G-X 3- X 4- G-X 5- X 6- G-X 7- X 8- G-X 9- X 10- G-X 11- X 12- G-X 13- X 14 -G-;
(3) -Y 1- Y 2- Y 3- G-Y 4- Y 5- G-Y 6- Y 7- G-Y 8- Y 9 -G-;
(However, G is glycine, and X 1 to X 14 and Y 1 to Y 9 are arbitrary amino acids).
当該分解物は、上記コラーゲンまたはアテロコラーゲンのトリプルヘリカルドメインの少なくとも一部分としてアミノ末端に配列番号2、24、25、26または27にて示すアミノ酸配列を含んでおり、
上記分解物はさらに、上記配列番号2、24、25、26または27にて示すアミノ酸配列のカルボキシル末端側に、100個以上の「Gly−X−Y」(XおよびYは任意のアミノ酸)が連続するアミノ酸配列を含んでいることを特徴とする、胚様体形成用組成物。 A composition for embryoid body formation of pluripotent stem cells containing a degradation product of collagen or a degradation product of atelocollagen.
The degradation product contains the amino acid sequence set forth in SEQ ID NO: 2, 24, 25, 26 or 27 at the amino terminus as at least part of the triple helical domain of the collagen or atelocollagen .
The decomposition product further contains 100 or more "Gly-XY" (X and Y are arbitrary amino acids) on the carboxyl-terminal side of the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 2, 24, 25, 26 or 27. A composition for embryoid body formation, which comprises a continuous amino acid sequence .
(A)上記コラーゲンまたはアテロコラーゲンのトリプルヘリカルドメイン内の下記(1)にて示されるアミノ酸配列の、X1とX2との間の化学結合、X2とGとの間の化学結合、GとX3との間の化学結合、X4とGとの間の化学結合、または、X6とGとの間の化学結合が切断された、コラーゲンの分解物またはアテロコラーゲンの分解物;
(B)上記コラーゲンまたはアテロコラーゲンのトリプルヘリカルドメイン内の下記(2)にて示されるアミノ酸配列の、X1とX2との間の化学結合、X2とGとの間の化学結合、GとX3との間の化学結合、X4とGとの間の化学結合、X6とGとの間の化学結合、GとX7との間の化学結合、または、X14とGとの間の化学結合が切断された、コラーゲンの分解物またはアテロコラーゲンの分解物;
(C)上記コラーゲンまたはアテロコラーゲンのトリプルヘリカルドメインのアミノ末端の下記(3)にて示されるアミノ酸配列の、Y1とY2との間の化学結合が切断された、コラーゲンの分解物またはアテロコラーゲンの分解物;
(1)−G−X1−X2−G−X3−X4−G−X5−X6−G−;
(2)−G−X1−X2−G−X3−X4−G−X5−X6−G−X7−X8−G−X9−X10−G−X11−X12−G−X13−X14−G−;
(3)−Y1−Y2−Y3−G−Y4−Y5−G−Y6−Y7−G−Y8−Y9−G−;
(但し、Gは、グリシンであり、X1〜X14およびY1〜Y9は、任意のアミノ酸である)。 The decomposition product according to claim 5, wherein the decomposition product contains at least one of the following decomposition products of collagen (A) to (C) or decomposition products of atelocollagen. Composition for embryoid body formation:
(A) of the amino acid sequence represented by the following (1) in the triple helical domain of the collagen or atelocollagen, a chemical bond between X 1 and X 2, the chemical bond between X 2 and G, and G chemical bond between X 3, a chemical bond between X 4 and G, or a chemical bond between X 6 and G is disconnected, decomposition product or decomposition product of the atelocollagen of collagen;
(B) the amino acid sequence represented by the following (2) in the triple helical domain of the collagen or atelocollagen, a chemical bond between X 1 and X 2, the chemical bond between X 2 and G, and G chemical bond between X 3, a chemical bond between X 4 and G, chemical bond between X 6 and G, chemical bond between G and X 7, or, between X 14 and G Degradation of collagen or atelocollagen with broken chemical bonds between;
(C) the amino acid sequence represented by the following (3) to the amino terminus of a triple helical domain of the collagen or atelocollagen, a chemical bond between Y 1 and Y 2 is disconnected, the collagen degradation product or atelocollagen Decomposition;
(1) -G-X 1- X 2- G-X 3- X 4- G-X 5- X 6 -G-;
(2) -G-X 1- X 2- G-X 3- X 4- G-X 5- X 6- G-X 7- X 8- G-X 9- X 10- G-X 11- X 12- G-X 13- X 14 -G-;
(3) -Y 1- Y 2- Y 3- G-Y 4- Y 5- G-Y 6- Y 7- G-Y 8- Y 9 -G-;
(However, G is glycine, and X 1 to X 14 and Y 1 to Y 9 are arbitrary amino acids).
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