JP2010004796A - Differentiation inhibitor, differentiation inhibitory base material, and differentiation inhibiting method and use of the method - Google Patents
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Abstract
Description
本発明は、レクチンを用いることにより、幹細胞の分化抑制を可能にする技術に関する。 The present invention relates to a technique that enables suppression of stem cell differentiation by using a lectin.
幹細胞は他の体細胞とは異なり、様々な細胞に分化できる「多能性」と多能性を維持したまま増殖できる「自己複製能」とを兼ね備えた細胞であり、適切なフィードバックのもとに分化と自己抑制を繰り返しながら組織・臓器の発生、修復、維持に関わっている。そのため、幹細胞を利用した研究は、発生・分化に関するメカニズム解明や、自己の組織・臓器を用いた再生医療などにおいて、非常に重要な役割を担っている。 Unlike other somatic cells, stem cells are cells that have both “pluripotency” that can differentiate into various cells and “self-renewal ability” that can proliferate while maintaining pluripotency. It is involved in the generation, repair, and maintenance of tissues and organs while repeating differentiation and self-inhibition. Therefore, research using stem cells plays a very important role in elucidating the mechanisms related to development and differentiation, and in regenerative medicine using own tissues and organs.
幹細胞は、その出現時期により胚性幹細胞、胎児性幹細胞、成体幹細胞に分類されるが、中でも、身体のあらゆる細胞へと分化する能力を持つ胚性幹細胞（ＥＳ細胞）は、細胞ソースとして無限の可能性を秘めており、その活用が大いに期待されている。また、最近、体細胞に初期化を起こす特定因子を導入することでＥＳ細胞に似た多分化能を持たせた人工多能性幹細胞（ｉＰＳ細胞）の樹立法が発見された。ｉＰＳ細胞は、患者自身の細胞を用いた免疫拒絶の無い移植用組織の作製、薬の評価、病気の解明への利用など、様々なジャンルへの応用が期待されており、幹細胞培養技術を中心とした周辺技術の急速な発展が求められている。 Stem cells are classified into embryonic stem cells, fetal stem cells, and adult stem cells, depending on the time of their appearance. Among them, embryonic stem cells (ES cells) that have the ability to differentiate into any cell in the body are infinite as cell sources. It has potential and is expected to be used greatly. Recently, a method for establishing an induced pluripotent stem cell (iPS cell) having a pluripotency similar to that of an ES cell by introducing a specific factor that causes reprogramming into a somatic cell has been discovered. iPS cells are expected to be applied to a variety of genres, such as preparation of transplanted tissues without immune rejection using patient's own cells, evaluation of drugs, elucidation of diseases, etc. The rapid development of peripheral technology is required.
幹細胞は、その様々な目的での使用において、未分化性状態のまま培養することが必要となる。すなわち、細胞の分化を抑制する技術が非常に重要である。従来、未分化性を維持したまま増殖させる培養法として、胚性幹細胞（ＥＳ細胞）においては、マウス由来の線維芽細胞をフィーダー細胞として用いた共培養や、白血病抑制因子（Ｌｅｕｋｅｍｉａ Ｉｎｈｉｂｉｔｏｒｙ Ｆａｃｔｏｒ， ＬＩＦ）を培地へ添加する方法が行われている。 Stem cells need to be cultured in an undifferentiated state for use for various purposes. That is, a technique for suppressing cell differentiation is very important. Conventionally, as embryonic stem cells (ES cells) as a culture method for proliferation while maintaining undifferentiation, co-culture using mouse-derived fibroblasts as feeder cells, leukemia inhibitory factor (LIF), LIF ) Is added to the medium.
しかし、フィーダー細胞を用いる場合、その事前の調製が非常に煩雑である。また、医療用途における利用を目的としたヒトＥＳ細胞の培養では、異種動物由来のフィーダー細胞を用いると、細菌やウイルス、未知の病原体などの影響を排除することができないため、それらによる感染の危険性を伴う。 However, when using feeder cells, the preparation in advance is very complicated. In addition, when culturing human ES cells for use in medical applications, if feeder cells derived from different animals are used, the effects of bacteria, viruses, unknown pathogens, etc. cannot be excluded. Accompanying sex.
一方、ＬＩＦの培地への添加については、霊長類のＥＳ細胞では、その顕著な未分化性維持効果が見られないことが報告されている（非特許文献１）。 On the other hand, with regard to the addition of LIF to the medium, it has been reported that primate ES cells do not show a remarkable undifferentiated maintenance effect (Non-patent Document 1).
ヒトＥＳ細胞の培養において、フィーダー細胞を用いない方法としては、マウス線維芽細胞由来成分や血清代替物を用いる方法等が報告されているが（非特許文献２〜４）、含有成分不明の血清や高価なサイトカイン等を使用するため、好ましい方法とは言えない。
In the culture of human ES cells, methods using mouse fibroblast-derived components and serum substitutes have been reported as methods that do not use feeder cells (Non-Patent
そのため、異種動物フィーダー細胞や血清の非存在下において、低コストで簡便かつ効率的に幹細胞を培養できる手法の開発が望まれている。 Therefore, it is desired to develop a technique capable of culturing stem cells easily and efficiently at low cost in the absence of heterologous animal feeder cells and serum.
本発明の課題は、異種動物由来のフィーダー細胞や血清の非存在下で簡便かつ効率的に、細胞を未分化状態のまま培養し得る手法を提供することである。 An object of the present invention is to provide a technique capable of culturing cells in an undifferentiated state simply and efficiently in the absence of feeder cells derived from different animals or serum.
本発明者らは、上記課題解決のために鋭意検討を行い、レクチンを用いることによる分化抑制手法を見出して、本発明を完成させた。 The present inventors diligently studied to solve the above problems, and found a differentiation suppression technique using lectins, and completed the present invention.
本発明の要旨は以下の通りである。
１．レクチンを有効成分として含有する分化抑制剤。
２．レクチンをコードする核酸を有効成分として含有する分化抑制剤。
３．前記レクチンが、当該レクチン遺伝子のノックダウンにより、アルカリフォスファターゼ活性を低下させるレクチンであることを特徴とする１又は２記載の分化抑制剤。
４．前記レクチンがガラクトース結合性レクチンであることを特徴とする３記載の分化抑制剤。
５．前記レクチンがガレクチンであることを特徴とする４記載の分化抑制剤。
６．前記ガレクチンがガレクチン１、ガレクチン２、ガレクチン３、ガレクチン７、ガレクチン９、ガレクチン１２のいずれかであることを特徴とする５記載の分化抑制剤。
７．レクチンが固定化されていることを特徴とする分化抑制培養基材。
８．前記レクチンが、当該レクチン遺伝子のノックダウンにより、アルカリフォスファターゼ活性を低下させるレクチンであることを特徴とする７記載の分化抑制培養基材。
９．前記レクチンがガラクトース結合性レクチンであることを特徴とする８記載の分化抑制培養基材。
１０．前記レクチンがガレクチンであることを特徴とする９記載の分化抑制培養基材。
１１．前記ガレクチンがガレクチン１、ガレクチン２、ガレクチン３、ガレクチン７、ガレクチン９、ガレクチン１２のいずれかであることを特徴とする１０記載の分化抑制培養基材。
１２．レクチンと細胞とを接触させることを特徴とする分化抑制方法。
１３．１乃至６いずれか記載の分化抑制剤を用いることにより、レクチンと細胞とを接触させることを特徴とする分化抑制方法。
１４．７乃至１１いずれか記載の分化抑制培養基材を用いることにより、レクチンと細胞とを接触させることを特徴とする分化抑制方法。
１５．前記細胞は胚性幹細胞であることを特徴とする１２乃至１４いずれか記載の分化抑制方法。
１６．レクチンの分化抑制のための使用。
The gist of the present invention is as follows.
1. A differentiation inhibitor containing lectin as an active ingredient.
2. A differentiation inhibitor containing a nucleic acid encoding lectin as an active ingredient.
3. 3. The differentiation inhibitor according to 1 or 2, wherein the lectin is a lectin that reduces alkaline phosphatase activity by knocking down the lectin gene.
4). 4. The differentiation inhibitor according to 3, wherein the lectin is a galactose-binding lectin.
5). 5. The differentiation inhibitor according to 4, wherein the lectin is a galectin.
6). 6. The differentiation inhibitor according to 5, wherein the galectin is any one of
7). A differentiation-suppressing culture substrate characterized in that a lectin is immobilized.
8). 8. The differentiation-suppressing culture substrate according to 7, wherein the lectin is a lectin that reduces alkaline phosphatase activity by knocking down the lectin gene.
9. 9. The differentiation-suppressing culture substrate according to 8, wherein the lectin is a galactose-binding lectin.
10. 10. The differentiation-suppressing culture substrate according to 9, wherein the lectin is a galectin.
11. 11. The differentiation-suppressing culture substrate according to 10, wherein the galectin is any one of
12 A method for inhibiting differentiation, comprising contacting a lectin and a cell.
13. A differentiation inhibiting method comprising contacting a lectin and a cell by using the differentiation inhibiting agent according to any one of 13.1 to 6.
14.7 thru | or 11, the differentiation suppression method characterized by making a lectin and a cell contact by using the differentiation suppression culture base material in any one of.
15. 15. The method for inhibiting differentiation according to any one of 12 to 14, wherein the cell is an embryonic stem cell.
16. Use for inhibiting lectin differentiation.
本発明により、異種動物由来因子の影響を受けず、非常に簡便かつ効率的に、細胞の未分化状態を維持することが可能になる。 According to the present invention, it becomes possible to maintain the undifferentiated state of cells very easily and efficiently without being affected by factors derived from different animals.
以下、発明を実施するための最良の形態により、本発明を詳説する。
１．本発明の分化抑制剤
本発明の分化抑制剤は、レクチンを有効成分として含有することを特徴とする。ここでいうレクチンとは、糖と特異的に結合するタンパク質のことを指し、細胞膜複合糖質（糖タンパク質や糖脂質）と結合するものの他、小胞体やゴルジ体等との結合能を有し、糖タンパク質品質管理に関わる細胞内レクチンも含む。
Hereinafter, the present invention will be described in detail according to the best mode for carrying out the invention.
1. Differentiation inhibitor of the present invention The differentiation inhibitor of the present invention is characterized by containing a lectin as an active ingredient. The lectin here refers to a protein that specifically binds to sugar, and has the ability to bind to endoplasmic reticulum and Golgi, etc. in addition to those that bind to cell membrane complex carbohydrates (glycoproteins and glycolipids). Also includes intracellular lectins involved in glycoprotein quality control.
本発明におけるレクチンとしては、当該レクチン遺伝子をノックダウンした際に、アルカリフォスファターゼ活性を低下させるレクチンを用いることができ、ガラクトース結合性レクチンであることが好ましい。そのようなレクチンとしては、例えばＰＮＡ（ピーナッツレクチン）、ＥＣＡ（デイゴマメレクチン）、ＳＢＡ（ダイズレクチン）、Ａｌｌｏ Ａ（カブトムシレクチン）等が例示され、ガラクトースを含む糖鎖構造の認識部位を有する人工レクチンであってもよい。 As the lectin in the present invention, a lectin that reduces alkaline phosphatase activity when the lectin gene is knocked down can be used, and a galactose-binding lectin is preferable. Examples of such lectins include PNA (peanut lectin), ECA (day pea lectin), SBA (soybean lectin), Allo A (beetle beetle lectin), etc. It may be a lectin.
かかるレクチンの中でも、特にガレクチンファミリーに属するレクチンであることが好ましく、殊にガレクチン１、ガレクチン２、ガレクチン３、ガレクチン７、ガレクチン９及びガレクチン１２が例示され、ガレクチン７が最も好ましい。
Among such lectins, lectins belonging to the galectin family are particularly preferable, and
なお、本発明におけるレクチンとは、天然型レクチンの他、天然に生ずる変異体、人工的な変異（すなわち、１個以上のアミノ酸残基において、置換、欠失、付加、修飾、挿入など）を施したもの、あるいはそれらの一部のドメインや一部のペプチドフラグメントを包含するものとする。 The lectin in the present invention includes naturally occurring lectins, naturally occurring mutants, and artificial mutations (that is, substitution, deletion, addition, modification, insertion, etc. in one or more amino acid residues). It is intended to include those that have been applied, or partial domains and partial peptide fragments thereof.
本発明の分化抑制剤は、レクチンをコードする核酸を有効成分とするものであってもよい。コードする核酸（塩基配列）には、特に限定はなく、上記した本発明で使用されるレクチンをコードする任意の核酸を使用することができる。例えば、NCBIデータベースのAccession Number NM 001042507に示された配列が挙げられ、更にこれらの塩基配列に１又は数個の塩基の置換、欠失、付加、修飾、挿入などを有する塩基配列も包含される。 The differentiation inhibitor of the present invention may contain a nucleic acid encoding lectin as an active ingredient. The nucleic acid (base sequence) to be encoded is not particularly limited, and any nucleic acid that encodes the lectin used in the present invention can be used. For example, NCBI database Accession Number NM [0010] Examples include the sequences shown in 001042507, and further include base sequences having substitution, deletion, addition, modification, insertion, or the like of one or several bases in these base sequences.
また、本発明におけるレクチンをコードする核酸には、上記した塩基配列の相補鎖に、ストリンジェントな条件下でハイブリダイズする塩基配列を有する核酸も含まれる。「ストリンジェントなハイブリダイゼーション条件」とは、例えばナトリウム濃度に関し、約15〜約50mM、好ましくは約19〜約40mM、より好ましくは約19〜約20mMで、温度については約35〜約85℃、好ましくは約50〜約70℃、より好ましくは約60〜約65℃の条件を示し、典型的な「ストリンジェントなハイブリダイゼーション条件」下とは、例えば、6×SSC(1×SSCの組成:150mM 塩化ナトリウム、15mM クエン酸ナトリウム、pH7.0)、0.5% SDS、5×デンハルト、100mg/ml ニシン精子DNAを含む溶液中、プローブとともに65℃で一晩保温するという条件が挙げられる。 Moreover, the nucleic acid encoding the lectin in the present invention includes a nucleic acid having a base sequence that hybridizes to a complementary strand of the above base sequence under stringent conditions. “Stringent hybridization conditions” refers to, for example, about 15 to about 50 mM, preferably about 19 to about 40 mM, more preferably about 19 to about 20 mM with respect to sodium concentration, and about 35 to about 85 ° C. for temperature. Preferably, the condition is about 50 to about 70 ° C., more preferably about 60 to about 65 ° C., and under typical `` stringent hybridization conditions '' is, for example, 6 × SSC (composition of 1 × SSC: The conditions include incubation in a solution containing 150 mM sodium chloride, 15 mM sodium citrate, pH 7.0), 0.5% SDS, 5 × Denhardt, 100 mg / ml herring sperm DNA at 65 ° C. overnight.
かかる本発明分化抑制剤の有効成分となる核酸の合成は、当業者であれば、開示された配列情報に基づいて、適宜既存技術を用いて行うことができる。
２．本発明の分化抑制培養基材
本発明の分化抑制培養基材は、レクチンが固定化されていることを特徴とする。
A person skilled in the art can synthesize a nucleic acid as an active ingredient of the agent for inhibiting differentiation of the present invention based on the disclosed sequence information.
2. Differentiation-inhibiting culture substrate of the present invention The differentiation-inhibiting culture substrate of the present invention is characterized in that a lectin is immobilized.
本発明におけるレクチンとしては、当該レクチン遺伝子をノックダウンした際に、アルカリフォスファターゼ活性を低下させるレクチンを用いることができ、ガラクトース結合性レクチンであることが好ましい。そのようなレクチンとしては、例えばＰＮＡ（ピーナッツレクチン）、ＥＣＡ（デイゴマメレクチン）、ＳＢＡ（ダイズレクチン）、Ａｌｌｏ Ａ（カブトムシレクチン）等が例示され、ガラクトースを含む糖鎖構造の認識部位を有する人工レクチンであってもよい。 As the lectin in the present invention, a lectin that reduces alkaline phosphatase activity when the lectin gene is knocked down can be used, and a galactose-binding lectin is preferable. Examples of such lectins include PNA (peanut lectin), ECA (day pea lectin), SBA (soybean lectin), Allo A (beetle beetle lectin), etc. It may be a lectin.
かかるレクチンの中でも、特にガレクチンファミリーに属するレクチンであることが好ましく、殊にガレクチン１、ガレクチン２、ガレクチン３、ガレクチン７、ガレクチン９及びガレクチン１２が例示され、ガレクチン７が最も好ましい。
Among such lectins, lectins belonging to the galectin family are particularly preferable, and
なお、本発明におけるレクチンとは、天然型レクチンの他、天然に生ずる変異体、人工的な変異（すなわち、１個以上のアミノ酸残基において、置換、欠失、付加、修飾、挿入など）を施したもの、あるいはそれらの一部のドメインや一部のペプチドフラグメントを包含するものとする。 The lectin in the present invention includes naturally occurring lectins, naturally occurring mutants, and artificial mutations (that is, substitution, deletion, addition, modification, insertion, etc. in one or more amino acid residues). It is intended to include those that have been applied, or partial domains and partial peptide fragments thereof.
本発明におけるレクチンを固定化する基材としては、用途に応じていかなる形状の基材であってもよいが、例えばシャーレ、フラスコ、プレート、キュベット、フィルム、ファイバー、ビーズや多孔質体など、従来から細胞培養に用いられている基材が例示される。これらの基材は、ガラス、石英等の無機材料、ポリスチレン、ポリプロピレン、ポリエチレン等の有機材料のいずれからなっていてもよいが、滅菌可能な材料であることが好ましい。なお、これらの基材は、細胞の接着性や増殖能を向上させるための、いかなる表面コーティング処理が施されていても良い。 The base material for immobilizing the lectin in the present invention may be a base material of any shape depending on the application. For example, petri dishes, flasks, plates, cuvettes, films, fibers, beads, porous bodies, etc. The base material currently used for cell culture is illustrated. These base materials may be made of any of inorganic materials such as glass and quartz, and organic materials such as polystyrene, polypropylene, and polyethylene, but are preferably sterilizable materials. These substrates may be subjected to any surface coating treatment for improving cell adhesion and proliferation ability.
本発明におけるレクチンを固定化する方法としては、基材に単純に吸着させる方法、基材に共有結合させる方法、レクチンと特異的に結合する糖鎖高分子や抗体を吸着させた基材にレクチンを固定化する方法等が例示されるが、レクチンと基材とが接着する方法であればいかなる方法であってもよい。
３．本発明の分化抑制方法
本発明の分化抑制方法は、レクチンと対象となる細胞とを接触させることを特徴とする。
Examples of the method for immobilizing lectins in the present invention include a method of simply adsorbing to a base material, a method of covalently binding to a base material, a lectin on a base material on which a sugar chain polymer or antibody that specifically binds to the lectin is adsorbed. A method for immobilizing lysine is exemplified, but any method may be used as long as the lectin and the base material are adhered.
3. Method for inhibiting differentiation of the present invention The method for inhibiting differentiation of the present invention is characterized in that a lectin is brought into contact with a target cell.
本発明の分化抑制方法は、全ての幹細胞、脱分化した細胞が対象細胞となり得る。かかる細胞の例としては、哺乳類の胚性幹細胞、人工多能性幹細胞、造血幹細胞、神経幹細胞、間葉系幹細胞等が挙げられ、中でも、霊長類の胚性幹細胞および人工多能性幹細胞が好ましい。 In the differentiation inhibiting method of the present invention, all stem cells and dedifferentiated cells can be target cells. Examples of such cells include mammalian embryonic stem cells, induced pluripotent stem cells, hematopoietic stem cells, neural stem cells, mesenchymal stem cells, etc., among which primate embryonic stem cells and induced pluripotent stem cells are preferred. .
レクチンと対象となる細胞とを接触させる方法としては、本発明の分化抑制剤を添加する方法および本発明の分化抑制培養基材を用いる方法が例示されるが、レクチンと細胞とを接触させ得る方法であれば、他の手段によるものであってもよい。また、各々の方法を組み合わせたものであってもよい。 Examples of the method for bringing a lectin into contact with a target cell include a method for adding the differentiation inhibitor of the present invention and a method using the differentiation-suppressing culture substrate of the present invention, but the lectin and the cell can be contacted. As long as it is a method, it may be by other means. Moreover, what combined each method may be used.
本発明の分化抑制剤は、任意の細胞培養基本培地に添加して使用することができる。動物細胞基本培地としては、ダルベッコ改変イーグル培地（ＤＭＥＭ）、グラスゴーＭＥＭ（ＧＭＥＭ）、ＲＰＭＩ１６４０などが例示されるが、これらに限定されるものではない。さらに、これらの基礎培地に血清または血清代替物を添加して用いてもよい。これら血清や血清代替物としての各種増殖因子等は当業者に周知である。 The differentiation inhibitor of the present invention can be used by adding to any cell culture basal medium. Examples of the animal cell basal medium include Dulbecco's modified Eagle medium (DMEM), Glasgow MEM (GMEM), and RPMI 1640, but are not limited thereto. Further, serum or serum replacement may be added to these basal media. These sera and various growth factors as serum substitutes are well known to those skilled in the art.
本発明分化抑制剤における核酸のベクターへの導入は、適宜ベクターに核酸を結合して行うことができる。なお、ベクターへの導入に際して、核酸の機能を損なわない限りにおいて、例えば制限酵素断片の連結、又は、核酸の末端領域の一部を切断してベクターへの導入を行ったとしても、当業者であれば本発明分化抑制方法の目的が達成されることは容易である。 Introduction of the nucleic acid into the vector in the differentiation inhibitor of the present invention can be performed by appropriately binding the nucleic acid to the vector. In addition, as long as the function of the nucleic acid is not impaired upon introduction into the vector, for example, ligation of restriction enzyme fragments or cleavage into a part of the terminal region of the nucleic acid may be carried out by those skilled in the art. If there is, it is easy to achieve the object of the differentiation suppression method of the present invention.
かかるベクターとしては、本発明分化抑制方法を適用する対象の細胞で発現するベクターである限りにおいて特に限定されず、目的の細胞に合わせて適宜選択して使用することができる。また、かかる本発明分化抑制剤の有効成分となる核酸の細胞への導入は、当業者であれば、適宜既存技術を用いて行うことができる。 Such a vector is not particularly limited as long as it is a vector that is expressed in a target cell to which the differentiation inhibiting method of the present invention is applied, and can be appropriately selected and used according to the target cell. In addition, introduction of a nucleic acid, which is an active ingredient of the differentiation inhibitor of the present invention, into cells can be performed by those skilled in the art using existing techniques as appropriate.
本発明の分化抑制培養基材を使用する方法としては、例えば、ポリスチレンディッシュにレクチンをコートし、その培養器上で細胞を培養する方法、多孔質ビーズにレクチンをコートし、それらを添加した培養器上で細胞を培養する方法等が例示され、この時、培養液として、更に、本発明分化抑制剤を添加したものを用いてもよい。 Examples of the method of using the differentiation-suppressing culture substrate of the present invention include a method in which a lectin is coated on a polystyrene dish and cells are cultured on the incubator, a culture in which porous beads are coated with a lectin and added thereto Examples include a method of culturing cells on a vessel, and at this time, a culture solution further added with the differentiation inhibitor of the present invention may be used.
本発明分化抑制方法で使用する培養基材は、複数の異なる細胞の集団から幹細胞、殊に胚性幹細胞、人工多能性幹細胞のスクリーニングに使用することも可能である。例えば、胚性幹細胞と、多分化能を失った他の細胞の混合溶液を本発明分化抑制培養基材に導入することで、胚性幹細胞を本発明分化抑制培養基材に捕捉させ、多分化能を失った他の細胞は除去することができ、かつ、その工程に続いて胚性幹細胞を培養することができる。 The culture substrate used in the differentiation suppression method of the present invention can also be used for screening stem cells, particularly embryonic stem cells and induced pluripotent stem cells, from a plurality of different cell populations. For example, by introducing a mixed solution of embryonic stem cells and other cells that have lost pluripotency into the differentiation-suppressed culture substrate of the present invention, the embryonic stem cells are captured on the differentiation-suppressed culture substrate of the present invention, and multidifferentiation is achieved. Other cells that have lost their ability can be removed and embryonic stem cells can be cultured following the process.
また、本発明分化抑制方法で使用する培養基材は、幹細胞、殊に胚性幹細胞、人工多能性幹細胞の取得効率の向上にも有用である。特に、作製効率の低い人工多能性幹細胞の作製に関し、例えば、分化万能性獲得に必要な任意の遺伝子を導入した後の培養において、本発明分化抑制培養基材を用いることで、人工多能性幹細胞の取得効率を高めることが可能である。 Moreover, the culture substrate used in the method for inhibiting differentiation of the present invention is also useful for improving the acquisition efficiency of stem cells, particularly embryonic stem cells and induced pluripotent stem cells. In particular, regarding the production of induced pluripotent stem cells with low production efficiency, for example, in the culture after introducing any gene necessary for obtaining pluripotency, the induced pluripotency is obtained by using the differentiation-suppressing culture substrate of the present invention. It is possible to increase the acquisition efficiency of sex stem cells.
本発明分化抑制方法により培養した幹細胞、好ましくは胚性幹細胞の未分化程度は、細胞膜状に存在するアルカリフォスファターゼ（ＡＬＰ）活性を測定することにより確認することができる。未分化な胚性幹細胞ではＡＬＰの活性が維持され、分化すると減少することが知られている（Ｗｉｌｌｉａｍｓら、Ｎａｔｕｒｅ、３３６、ｐ６８４、１９９８年）。 The degree of undifferentiation of stem cells, preferably embryonic stem cells, cultured by the method for inhibiting differentiation of the present invention can be confirmed by measuring alkaline phosphatase (ALP) activity present in the form of a cell membrane. It is known that ALP activity is maintained in undifferentiated embryonic stem cells and decreases upon differentiation (Williams et al., Nature, 336, p684, 1998).
ＡＬＰ活性は、例えば、ＡＬＰ染色法によって検出することができる。培養器上の細胞に、基質としてリン酸エステル塩とジアゾニウム塩を含む反応溶液を添加する。細胞膜上に存在するアルカリフォスファターゼにより、リン酸エステルが加水分解され、次いでジアゾニウム塩とカップリング反応することによりアゾ色素が生じ、ＡＬＰ活性部位に色素が沈殿する。染色されたコロニー数を計測することにより細胞の未分化度合を定量することができる。 ALP activity can be detected by, for example, ALP staining. A reaction solution containing a phosphate ester salt and a diazonium salt as a substrate is added to the cells on the incubator. The alkaline phosphatase present on the cell membrane hydrolyzes the phosphate ester, and then reacts with the diazonium salt to produce an azo dye, which precipitates at the ALP active site. The number of undifferentiated cells can be quantified by counting the number of stained colonies.
以下、実施例により本発明を具体的に説明する。ただし、本発明は以下の記述に限定されるものではない。 Hereinafter, the present invention will be described specifically by way of examples. However, the present invention is not limited to the following description.
「ＲＮＡｉによるガレクチン発現の抑制」
配列番号１〜７に記載された配列およびそれと相補的な配列をステムループ型ｓｉＲＮＡ発現プラスミド（ｐＳｉｌｅｎｃｅｒ−Ｈ１ｐｕｒｏ（Ａｍｂｉｏｎ）に組み込み、常法によりｓｉＲＮＡ発現ベクターを作製した。陰性対象として、配列番号１〜７に記載された配列に代えて、ＥＧＦＰ配列（配列番号８に記載された塩基配列およびそれと相補的な配列からなる）を連結したプラスミドを使用した。
"Repression of galectin expression by RNAi"
The sequence described in SEQ ID NOs: 1 to 7 and a sequence complementary thereto were incorporated into a stem-loop siRNA expression plasmid (pSilencer-H1puro (Ambion)) to prepare a siRNA expression vector by a conventional method. Instead of the sequence described in -7, a plasmid in which an EGFP sequence (consisting of a base sequence described in SEQ ID NO: 8 and a sequence complementary thereto) was used was used.
「ＲＮＡｉベクターの細胞への導入」
上記ｓｉＲＮＡ発現ベクターをリポフェクション法によりマウスＥＳ細胞に導入した後、導入後１日目からピューロマイシン（２μｇ／ｍｌ）を含む培地で２４時間培養し、セレクションを行った。セレクション後、細胞を回収し、１×１０４ｃｅｌｌｓ／６ｃｍ ｄｉｓｈでまき直して５日間培養を行った。
“Introduction of RNAi vectors into cells”
After the siRNA expression vector was introduced into mouse ES cells by the lipofection method, selection was performed by culturing in a medium containing puromycin (2 μg / ml) for 24 hours from the first day after introduction. After selection, the cells were collected, rewound with 1 × 10 4 cells / 6 cm dish, and cultured for 5 days.
「アルカリフォスファターゼ染色」
培養後、ＢＣＩＰ−ＮＢＴ溶液キット（ナカライテスク社製）を用いてアルカリフォスファターゼ染色を行い、アルカリフォスファターゼ陽性コロニー数の割合（５０コロニー中の陽性率）を算出することで未分化性を評価した。
"Alkaline phosphatase staining"
After culturing, alkaline phosphatase staining was performed using a BCIP-NBT solution kit (manufactured by Nacalai Tesque), and the ratio of the number of alkaline phosphatase positive colonies (positive rate in 50 colonies) was calculated to evaluate undifferentiation.
結果、ガレクチンがマウスＥＳ細胞の未分化性維持に関与していることが示唆された。 As a result, it was suggested that galectin is involved in maintaining undifferentiated state of mouse ES cells.
本発明は、異種動物由来因子の影響を受けず、また、非常に簡便かつ効率的に、幹細胞の未分化状態を維持した培養を可能とするため、医療・バイオテクノロジーに関わる広範な技術に使用でき、特に、細胞移植療法や薬物の探索への利用に有用である。 The present invention is not affected by heterogeneous animal-derived factors, and can be used in a wide range of technologies related to medical and biotechnology in order to enable culturing that maintains the undifferentiated state of stem cells in a very simple and efficient manner. In particular, it is useful for cell transplantation therapy and drug discovery.
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-
2008
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