JP5881058B2 - 小動物の体脂肪測定方法 - Google Patents

Description

本発明は、小動物の体脂肪率又は体脂肪量を測定する方法に関する。

メタボリック症候群は主に過食、運動不足などの生活習慣が原因で生じる。メタボリック症候群は、動脈硬化や糖尿病、さらには心筋梗塞や脳卒中などを引き起こす重大な疾患である。そのため、メタボリック症候群に対する治療法については様々な研究がなされている。

メタボリック症候群に対する治療法の研究として、例えば薬剤をはじめ運動や機能性食品の摂取などによる効果について、人間だけでなくマウスやラットなどの小動物を対象にして広く調べられている。本発明者らは、これまでメタボリック症候群のマウスを対象にして、運動による治療効果を血中のコレステロール値や全身臓器のペルオキシゾーム増殖剤反応性受容体の発現などから検討を行ってきた。以上のような動物実験では、体脂肪率が指標として広く用いられている。実験用小動物の体脂肪率の測定は、人と同様にＣＴ（Ｃｏｍｐｕｔｅｄ Ｔｏｍｏｇｒａｐｈｙ、コンピュータ断層撮影）を用いた画像解析方法が最も利用されている。具体的には、ＣＴによる断層写真を用いて、胴体部分の面積に対して脂肪分が占める割合を求め、これを体脂肪率とする。この方法は客観的に分かり易く、臓器や血管などの脂肪も判断でき、小動物の体脂肪率を高精度に測定することができるという利点がある。

しかしながら、ＣＴを用いて小動物の体脂肪率を測定するには、該小動物に全身麻酔が必要となることや、測定から解析に至るまでに数時間を要すること、さらには小動物用の非常に高価なＣＴ機器を導入しなければならないなどの問題があった。

一方、ＣＴを用いずに体脂肪率を測定可能な技術もこれまでにいくつか提案されている。例えば特許文献１には、近赤外線スペクトル分析によって、生魚体の脂肪含有率を測定する方法について記載されている。また、特許文献２には、赤外分光法を用いて牛枝肉切開面の胸最長筋の脂肪含有量を測定する方法について開示されている。さらに、特許文献３には、近赤外線を用いて、主に人体に対して体脂肪率を測定する方法について開示されている。

特開２００７−９３５０６号公報 特開平９−１１９８９４号公報 特許第２６４８３７７号公報

上述したように、ＣＴを用いた従来の測定方法は簡便な方法とは言い難いものであった。一方、特許文献１〜３に開示されているような近赤外分光法によれば、脂肪由来のシグナルを迅速かつ物質特異的に得ることができるほか、その濃度（密度）情報も同時に得ることができる。しかしながら、近赤外分光法を用いた従来の測定方法では、小動物を測定対象としておらず、そのような従来技術をそのまま小動物に適用することは困難であった。

そこで本発明は、小動物の体脂肪率又は体脂肪量を簡単に測定できる方法を提供することを課題とする。

以下、本発明について説明する。

本発明は、小動物に近赤外線を照射する工程と、該近赤外線が小動物で反射されて生じた拡散反射光を受光する工程と、近赤外線の吸光度を用いた関係式から小動物の体脂肪率又は体脂肪量を算出する工程と、を有する、小動物の体脂肪測定方法である。

本発明による測定対象である「小動物」とは、マウスやラットなどの実験用小動物の外、手のひらに乗る程度の大きさの動物を含む概念である。

本発明の小動物の体脂肪測定方法において、コンピュータ断層撮影を用いて得られたサンプルの体脂肪率又は体脂肪量の測定結果を目的変数とし、該サンプルに近赤外線を照射するとともに該近赤外線がサンプルで反射されて生じた拡散反射光を受光して近赤外線の吸光度を求め、該吸光度を下記（１）式で正規化したものを説明変数として、重回帰分析を行って定数を決定した下記（２）式を上記関係式とすることが好ましい。
Ｚ（λ）＝｛Ｘ（λ）−ｘ_ａｖｅ．｝／σ （１）
上記（１）式において、Ｚ（λ）は波長λの時の正規化された吸光度、Ｘ（λ）は正規化する吸光度、ｘ_ａｖｅ．は上記拡散反射光のスペクトル全体の平均値、σは上記拡散反射光のスペクトル全体の標準偏差である。
Ｙ＝ａ_１ｘ_１＋ａ_２ｘ_２＋・・・＋ａ_ｎｘ_ｎ＋ｂ （２）
上記（２）式において、Ｙは小動物の体脂肪率又は体脂肪量、ｘ_１、・・・、ｘ_ｎは変数増加法で選択された波長での上記（１）式で正規化された近赤外線の吸光度、ａ_１、・・・、ａ_ｎ、ｂは上記重回帰分析により得られた定数である。

ここに「サンプル」とは、実際に体脂肪率又は体脂肪量を測定したい小動物と同じ種類の小動物の、実際に体脂肪率又は体脂肪量を測定したい小動物の部位と同じ部位を意味する。また、「コンピュータ断層撮影を用いて得られたサンプルの体脂肪率又は体脂肪量の測定結果」とは、以下の方法で測定された結果を意味する。すなわち、ＣＴ（コンピュータ断層撮影）による断層写真を用いて、撮影された部分の面積に対して脂肪分が占める割合を求め、これを体脂肪率とする。また、上記のようにして求めた体脂肪率とサンプルの体重とを掛け合わせものを体脂肪量とする。

本発明の小動物の体脂肪測定方法において、近赤外線を小動物に照射する前に、該小動物の近赤外線が照射される部位の毛を取り除いておくことが好ましい。

また、本発明の小動物の体脂肪測定方法において、小動物に照射する近赤外線の波長を１６００ｎｍ以上２４００ｎｍ以下とすることが好ましい。

本発明によれば、生体組織に対して全く侵襲性を持たないため、生きたまま小動物の体脂肪率又は体脂肪量を測定することができる。また、本発明によれば、麻酔を使用せずに小動物の体脂肪率又は体脂肪量を簡単に測定することができる。そのため、マウスやラットなどの実験用小動物に本発明を適用すれば、体脂肪率が指標となる疾患に対する研究を大幅に加速することができる。また、ＣＴを用いて得られた体脂肪率又は体脂肪量で測定値を校正することによって、極めて高精度に小動物の体脂肪率又は体脂肪量を測定することができる。

体脂肪測定装置１０の構成を概略的に示した図である。 体脂肪測定装置１０に備えられる情報処理手段１５の構成を概略的に示した図である。 小動物の体脂肪測定方法Ｓ１０の流れを概略的に示した図である。 図４（Ａ）は原スペクトルを示しており、図４（Ｂ）は補外処理を行った後に二次微分処理をしたスペクトルを示している。 実施例において得られた拡散反射光の正規化スペクトルを示した図である。 実施例において得られた解析結果を示した図である。 実施例において得られた解析結果を示した図である。 実施例において得られた解析結果を示した図である。

本発明の上記した作用及び利得は、次に説明する発明を実施するための形態から明らかにされる。以下、本発明を図面に示す実施形態に基づき説明する。ただし、本発明はこれら実施形態に限定されるものではない。なお、各図面は、図示と理解のしやすさの便宜上、簡略化して示している。

まず、本発明に用いることができる体脂肪測定装置について説明する。図１は、本発明に用いることができる体脂肪測定装置の一例について、その構成を概略的に示した図である。

図１に示した体脂肪測定装置１０は、光源１と、分光器２と、レンズ３と、検出器４、４と、を備えている。また、図示はしていないが、体脂肪測定装置１０は、後に詳述する情報処理手段１５も備えている。

体脂肪測定装置１０では、光源１として白色光Ｌ１を発するものを用いる。光源１としては、白色光を発するものであれば特に限定されず、公知の光源を用いることができる。

光源１から発せられた白色光Ｌ１は分光器２に入射し、分光器２からは近赤外光Ｌ２が出射される。このような分光器２としては、音響光学可変波長フィルター（以下、「ＡＯＴＦ」という。）を用いることができる。ＡＯＴＦによれば、近赤外域（ＮＩＲ）の波長帯域において、任意の波長のみを選択して出射することができる。近赤外光Ｌ２の波長は１２００ｎｍ以上２６００ｎｍ以下であることが好ましく、１６００ｎｍ以上２４００ｎｍ以下であることがより好ましい。近赤外光Ｌ２を上記波長領域とすることによって、ＣＨ_２伸縮などの脂肪族由来化合物のシグナルを検出しやすくなる。

分光器２から出射された近赤外光Ｌ２は、レンズ３に入射し、集光される。レンズ３としては、近赤外光Ｌ２を適切な範囲に集光できるものであれば特に限定されず、公知のレンズを用いることができる。

レンズ３によって集光された近赤外光Ｌ３は、体脂肪測定装置１０の出入光部１１から出射されて、測定対象である小動物５に照射される。近赤外光Ｌ３が照射される範囲は、例えば直径０．８ｍｍ以上１．０ｍｍ以下とすることができる。また、小動物５と体脂肪測定装置１０の出入光部１１との距離は、例えば０ｍｍ以上１５ｍｍ以下とすることができる。

小動物５に照射された近赤外光Ｌ３は反射して、拡散反射光Ｌ４が生成される。この拡散反射光Ｌ４は、体脂肪測定装置１０の出入光部１１から入射して検出部４が受光する。検出部４は、拡散反射光Ｌ４を検知できるものであれば特に限定されず、公知の検出器を用いることができる。

上述したようにして小動物５に近赤外線Ｌ３を照射し、拡散反射光Ｌ４を検出部４が受光した後、以下に説明する情報処理手段１５によって、小動物５の体脂肪量又は体脂肪率が算出される。

図２は、情報処理手段１５の構成を示す概念図である。情報処理手段１５は、検出部４から情報を取得して、小動物５の体脂肪率及び／又は体脂肪量を算出し、その演算結果を表示装置等（不図示）に送信可能な機器である。

図２に示したように情報処理手段１５は、受信手段１６、中央演算子１７、記憶手段１８、ＲＡＭ１９、及び送信手段２０を有して構成されている。

受信手段１６は、上記した検出部４からの情報Ｓ１を情報処理手段１５に適切に取り入れる機能を有する部材である。いわゆる入力ポート、入力コネクタ等もこれに含まれる。

中央演算子１７はいわゆるＣＰＵであり、後述する各種演算はこの中央演算子１７で演算することができる。また、中央演算子１７は、その他にも情報処理手段１５に含まれる各部材に接続されており、これらを制御することができるように構成されている。すなわち、中央演算子１７は、記憶媒体として機能する記憶手段１８に記憶された各種プログラムを実行し、これに基づいて小動物５の体脂肪率及び／又は体脂肪量を算出することができる。具体的にどのような演算が行われるかについては後で詳しく説明する。

記憶手段１８は、小動物５の体脂肪率及び／又は体脂肪量を算出するに際して根拠となる各種プログラムやデータが保存される記憶媒体として機能する部材である。また記憶手段１８には、プログラムの実行により得られた中間、最終の各種結果を保存することができてもよい。

ＲＡＭ１９は、中央演算子１７による演算の作業領域や一時的なデータの記憶手段として機能する部材である。ＲＡＭ１９は、ＳＲＡＭ、ＤＲＡＭ、フラッシュメモリ等で構成することができ、公知のＲＡＭと同様である。

送信手段２０は、得られた結果のうち表示装置等に対して出力すべき情報Ｓ２を適切に出力する機能を有する部材である。いわゆる出力ポート、出力コネクタ等もこれに含まれる。

上述した体脂肪測定装置１０を用いる場合を例にして、以下に本発明の小動物の体脂肪測定方法について説明する。図３は、本発明の小動物の体脂肪測定方法の一例である体脂肪測定方法Ｓ１０について、その流れを概略的に示した図である。

図３に示したように、体脂肪測定方法Ｓ１０は、照射工程Ｓ１１、受光工程Ｓ１２、及び演算工程Ｓ１３を有している。以下、これらの工程について説明する。

照射工程Ｓ１１は、測定対象である小動物５に近赤外線Ｌ３を照射する工程である。また、受光工程Ｓ１２は、照射工程Ｓ１１において小動物５に照射され、該小動物５によって反射された拡散反射光Ｌ４を検出器４、４で受光する工程である。小動物５に近赤外線Ｌ３を照射し、該小動物５によって反射された拡散反射光Ｌ４を受光するまでの過程は、体脂肪測定装置１０の説明において説明した通りである。

演算工程Ｓ１３は、照射工程Ｓ１１において小動物５に照射した近赤外線の吸光度を用いた関係式から小動物の体脂肪量又は体脂肪率を算出する工程である。

上記関係式は、ＣＴを用いて得られたサンプルの体脂肪率又は体脂肪量の測定結果を利用して作成したものであることが好ましい。ＣＴによれば、小動物の体脂肪率又は体脂肪量を高精度に測定することができる。高精度に測定された結果を参照して校正された関係式を作成し、該関係式を用いれば、近赤外分光法による本発明の測定方法でも小動物の体脂肪率又は体脂肪量を高精度に測定することができる。具体的には、以下のようにして関係式を作成することができる。

まず、複数のサンプルに対してＣＴを用いた従来の方法で体脂肪率を測定する。このとき、メタボリック症候群の小動物を用いたり、それぞれの小動物について様々な箇所で測定したりすることによって、様々なデータを収集しておくことが好ましい。

その後、ＣＴを用いて体脂肪率を測定したサンプルと同じサンプルについて、近赤外分光法を用いてスペクトル測定を行う。近赤外分光法による測定を行う際、体脂肪率をより正確に測定するという観点からは、測定箇所（近赤外線を照射する箇所）の毛を取り除いておくことが好ましい。毛があることによって、毛に反射された近赤外光も受光する場合があるからである。

上記のようにして、サンプルの体脂肪率をＣＴを用いて測定するとともに近赤外分光法によって測定した後、ＣＴを用いて算出された個々のサンプルの体脂肪率の変動に対して相関を有する近赤外スペクトルのシグナルを評価・確認し、検量線を作成して関係式を作成する。当該関係式は、より具体的には下記のように求めることができる。

まず、上記のようにしてＣＴを用いた方法、及び近赤外分光法によってサンプルの体脂肪率を測定する。その後、ＣＴ用いて得られたサンプルの体脂肪率の測定結果を目的変数とし、サンプルに近赤外線を照射するとともに該近赤外線がサンプルで反射されて生じた拡散反射光を受光して近赤外線の吸光度を求め、該吸光度を下記（１）式で正規化したものを説明変数として、重回帰分析を行う。こうして重回帰分析を行って定数が決定された下記（２）式を、上記関係式とすることができる。なお、体脂肪量についての関係式を作成する場合は、上記のようにして測定した体脂肪率とサンプルの体重から体脂肪量を算出し、上記と同様にして関係式を作成することができる。
Ｚ（λ）＝｛Ｘ（λ）−ｘ_ａｖｅ．｝／σ （１）
上記（１）式において、Ｚ（λ）は波長λの時の正規化された吸光度、Ｘ（λ）は正規化する吸光度、ｘ_ａｖｅ．は拡散反射光のスペクトル全体の平均値、σは拡散反射光のスペクトル全体の標準偏差である。
Ｙ＝ａ_１ｘ_１＋ａ_２ｘ_２＋・・・＋ａ_ｎｘ_ｎ＋ｂ （２）
上記（２）式において、Ｙは小動物の体脂肪率又は体脂肪量、ｘ_１、・・・、ｘ_ｎは変数増加法で選択された波長での上記（１）式で正規化した近赤外線の吸光度、ａ_１、・・・、ａ_ｎ、ｂは重回帰分析により得られた定数である。

上記のようにして関係式を作成しておくことによって、実際の測定対象について上述した体脂肪測定装置を用いて近赤外スペクトル測定を行ったのち、得られた結果を上記関係式に代入することにより、測定対象の体脂肪率又は体脂肪量を算出することができる。

なお、上記のようにして近赤外スペクトル測定を行う際、測定対象に照射した近赤外光の波長に対する吸光度を示す原スペクトルを二次微分して得られる、二次微分スペクトルを用いることが好ましい。原スペクトルでは散乱によるベースライン変動やピークの重なりが生じることがある。原スペクトルに二次微分処理を行うことによって、符号は反転するがピークの位置は保持され、鋭いピークを得ることができる。また、このように二次微分処理を行う場合、補外処理を行うことが好ましい。微分を行うごとにノイズが増大するが、補外処理を行うことによってノイズを低減し、二次微分した際に鋭いピークを得やすくなる。以下に、マウスの腹部の脂肪に対する近赤外スペクトル測定の結果を例示する。図４（Ａ）は原スペクトルを示しており、図４（Ｂ）は図４（Ａ）に示した原スペクトルに対して８０１点から１００点に補外処理を行った後に二次微分処理をしたスペクトルを示している。また、下記表１は、図４（Ｂ）に示したピークの対応表を示している。

図４（Ｂ）及び表１に示したように、原スペクトルに対して補外処理を行った後に二次微分処理を行うことによって、脂肪由来の鋭いピークを観察することができた。また、このように処理することによって、測定対象の体毛による個体差の影響を低減することができる。

以上説明したように、本発明によれば、生体組織に対して全く侵襲性を持たないため、生きたまま小動物に対する測定を行うことができる。また、本発明によれば、麻酔を使用せずに小動物の体脂肪率又は体脂肪量を簡単に測定することができる。そのため、マウスやラットなどの実験用小動物に本発明を適用すれば、体脂肪率が指標となる疾患に対する研究を大幅に加速することができる。また、ＣＴによって得られた体脂肪率又は体脂肪量で測定値を校正することによって、極めて高精度に小動物の体脂肪率又は体脂肪量を測定することができる。

以下に、実施例にて本発明をさらに詳しく説明するが、本発明は実施例に限定されるものではない。

１４匹のマウスの胸部、腹部、下腹部、背部、及び尾部ついて近赤外スペクトル測定を行った。また、１４匹のうち６匹については脱毛した腹部の近赤外スペクトル測定も行った。当該測定には、Ｉｎｆｒａｒｅｄ Ｆｉｂｅｒ Ｓｙｓｔｅｍｓ社製のｐｌａｓｃａｎ−ｗ（登録商標）を用いて拡散反射方式で行った。また、得られたスペクトルは下記（１）式よって正規化処理を行った。このようにして得られた正規化スペクトルは図５に示した。図５において、横軸は受光した拡散反射光の周波数（μｍ）であり、縦軸が下記（１）式で正規化された吸光度である。
Ｚ（λ）＝｛Ｘ（λ）−ｘ_ａｖｅ．｝／σ （１）
上記（１）式において、Ｚ（λ）は波長λの時の正規化された吸光度、Ｘ（λ）は正規化する吸光度、ｘ_ａｖｅ．は拡散反射光のスペクトル全体の平均値、σは拡散反射光のスペクトル全体の標準偏差である。

次に、ＣＴによって得られたマウスの体脂肪率（％）、又は、該体脂肪率（％）とマウスの体重とから算出した体脂肪量（ｇ）を目的変数とし、測定波長を説明変数として、それぞれのマウスに対して得られた近赤外スペクトルの重回帰分析を行った。回帰式は下記（２）式である。
Ｙ＝ａ_１ｘ_１＋ａ_２ｘ_２＋・・・＋ａ_ｎｘ_ｎ＋ｂ （２）
上記（２）式において、ｘ_１、・・・、ｘ_ｎは選択した波長での上記（１）式で正規化した吸光度、ａ_１、・・・、ａ_ｎ、ｂは重回帰により得られる定数である。重回帰式に用いる波長の選択には変数増加法を使用した。なお、変数増加法では１〜８個の波長が選択された。解析結果は表２乃至表７、及び図６乃至図８に示した。図６の上段の図は腹部、下段の図は胸部、図７の上段の図は背部、下段の図は下腹部、図８の上段の図は尾部、下段の図は脱毛後の腹部についての解析結果を示している。また、図６乃至図８の左側の図において、縦軸は上記（２）式によって得られた体脂肪率（％）、横軸はＣＴを用いて得られた体脂肪率（％）を示しており、図６乃至図８の右側の図において、縦軸は上記（２）式によって得られた体脂肪量（ｇ）、横軸はＣＴを用いて得られた体脂肪量（ｇ）を示している。

以上の解析により、脱毛していないマウスのスペクトルにおいては、体脂肪率よりも体脂肪量に対して非常に高い相関が得られることが分かった。一方、脱毛後のマウスにおいては体脂肪率及び体脂肪量ともに高い相関が得られた。すなわち、本発明によれば、生きたまま小動物に対して、麻酔を使用せずに体脂肪率又は体脂肪量を簡単に測定できることがわかった。また、即座に体脂肪量を測定したい場合は脱毛せずに測定し、高精度に体脂肪率および体脂肪量を測定したい場合は脱毛してから測定するという選択が可能であることもわかった。

１ 光源
２ 分光器（ＡＯＴＦ）
３ レンズ
４ 検出器
５ 小動物（測定対象）
１０ 体脂肪測定装置
１１ 出入光部
１５ 情報処理手段
１６ 受信手段
１７ 中央演算子
１８ 記憶手段
１９ ＲＡＭ
２０ 送信手段
Ｌ１ 白色光
Ｌ２ 近赤外光
Ｌ３ 集光された近赤外光
Ｌ４ 拡散反射光
Ｓ１ 検出部４からの情報
Ｓ２ 表示装置等に対して出力すべき情報

Claims (4)

1. 小動物に近赤外線を照射する工程と、
   前記近赤外線が前記小動物で反射されて生じた拡散反射光を受光する工程と、
   前記近赤外線の吸光度を用いた関係式から前記小動物の体脂肪率又は体脂肪量を算出する工程と、
   を有し、
   コンピュータ断層撮影を用いて得られたサンプルの体脂肪率又は体脂肪量の測定結果を目的変数とし、前記サンプルに近赤外線を照射するとともに該近赤外線が前記サンプルで反射されて生じた拡散反射光を受光して前記近赤外線の吸光度スペクトルを求め、
   該吸光度スペクトルに対して補外処理を行った後に二次微分処理を行うことにより二次微分スペクトルを求め、
   前記二次微分スペクトルから得られる吸光度を下記（１）式で正規化したものを説明変数として、重回帰分析を行って定数を決定した下記（２）式を前記関係式とする、小動物の体脂肪測定方法。
   Ｚ（λ）＝｛Ｘ（λ）−ｘ _ａｖｅ． ｝／σ （１）
   上記（１）式において、Ｚ（λ）は波長λの時の正規化された吸光度、Ｘ（λ）は正規化する吸光度、ｘ _ａｖｅ． は前記拡散反射光のスペクトル全体の平均値、σは前記拡散反射光のスペクトル全体の標準偏差である。
   Ｙ＝ａ _１ ｘ _１ ＋ａ _２ ｘ _２ ＋・・・＋ａ _ｎ ｘ _ｎ ＋ｂ （２）
   上記（２）式において、Ｙは前記小動物の体脂肪率又は体脂肪量、ｘ _１ 、・・・、ｘ _ｎ は変数増加法で選択された波長での前記（１）式で正規化された近赤外線の吸光度、ａ _１ 、・・・、ａ _ｎ 、ｂは前記重回帰分析により得られた定数である。
2. 前記小動物の腹部又は下腹部に前記近赤外線を照射する、請求項１に記載の小動物の体脂肪測定方法。
3. 前記近赤外線を前記小動物に照射する前に、前記小動物の前記近赤外線が照射される部位の毛を取り除いておく、請求項１又は２に記載の小動物の体脂肪測定方法。
4. 前記近赤外線を照射する範囲の直径が０．８ｍｍ以上１．０ｍｍ以下であり、
   前記小動物と、前記近赤外線の照射及び前記拡散反射光の受光を行う体脂肪測定装置の出入光部との距離が、０ｍｍ以上１５ｍｍ以下である、請求項１〜３のいずれかに記載の小動物の体脂肪測定方法。