JP5868584B2 - 熱安定化されたタンパク質の製造方法 - Google Patents
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Description
2 蓋
11 周壁
12 底部
13 ポール
21 不活性ガス導入管
22 熱分解ガス排出管
23、24 開閉弁
111 カマ
112 ヒータ
113 網体
114 断熱材
115 外装材
製造装置としては、図2に示される装置を使用した。まず、原料となる北海道産規格外廃棄小豆を処理槽1内に入れ、処理槽内の雰囲気を窒素ガスで置換した後、2時間かけて450℃まで加熱する。その間、連続的または適宜の時期に雰囲気ガスを排出管から排出する。その際、排出をスムースに行うため不活性ガス導入管から窒素ガスを適宜導入してもよい。その後、温度を350℃とし3時間炭化を行い、炭化終了後100℃で1時間冷却する。こうして得られた炭化物をジェットミルで平均粒径7μmに粉砕して非晶質炭素微粒子(BCP)を製造した。得られた非晶質炭素微粒子のゼータ電位は、−49.9mVであった。
(炭素微粒子吸着リゾチームの調製)
本実施例では、モデルタンパク質としてかぜ薬や目薬などの天然抗菌剤として使用されている卵白リゾチーム(シグマ社製)を用い、非晶質炭素微粒子として、前記製造例1の方法により得た非晶質炭素微粒子(EEN社製)を用い、リゾチームを含む水溶液に所定量の非晶質炭素微粒子を加えた。すなわち、500μM卵白リゾチームを含むpH7の0.01Mリン酸緩衝液1Lに3.0gの非晶質炭素微粒子を添加し、25℃で24時間、120rpm振とう撹拌しながら吸着処理を施した。吸着処理後のリゾチーム溶液を孔径0.1μmのメンブレンフィルターを用いて吸引ろ過し、炭素微粒子吸着リゾチームをろ別・回収した。ろ液中のリゾチームの量から逆算して、リゾチームの非晶質炭素微粒子への吸着量は150μMであった。
上記でろ別・回収された、リゾチームが吸着された非晶質炭素微粒子をpH7の0.01Mリン酸緩衝液に分散して、150μMのリゾチーム及び3.0g/Lの非晶質炭素微粒子を含む液を作製し、試験管に所定量採り、90℃で30分間加熱処理した。結果を図6に示す。図中(f)が本例である。目視観察したところ、加熱処理後においても、リゾチームに起因する凝集はみられず、非晶質炭素微粒子吸着リゾチームは水溶液中で加熱処理前(図6(c))と同様の良好な分散状態が保たれていた。
上記加熱処理後恒温水槽で25℃、30分間冷却したリゾチーム溶液350μLを予めバイアル瓶に入れておいた0.2g/LのMicrococcus lysodeikticusを含む0.01Mリン酸緩衝液(pH7)21mLに加えて撹拌し、所定時間ごとにその混合液から所定量分取して450nmに設定された分光光度計により濁度の変化を追跡して残存活性を測定した。非晶質炭素微粒子吸着リゾチームの残存活性は51%であった(図7)。
[n0]:基質溶液初濃度(T=0)
[n]:基質溶液濃度(T=t)
A0 450:450nmにおける溶液の吸光度(T=0)
A450:450nmにおける溶液の吸光度(T=t)
とするとき、次式で示される。
リゾチームとして生(native)の150μM卵白リゾチームを用い、これをpH7の0.01Mリン酸緩衝液に添加することにより、比較例1のリゾチーム水溶液を作製した。
比較例1の生のリゾチーム水溶液を、実施例1と同様の条件(90℃、30分)で加熱処理した。結果を図6(d)に示す。目視観察の結果、水溶液には変性リゾチームの凝集物の生成に起因した白濁が観察された。
比較例1のリゾチーム水溶液を90℃、30分加熱した後、恒温水槽で25℃、30分間冷却したリゾチーム水溶液350μLを、予めバイアル瓶に入れておいた0.2g/LのMicrococcus lysodeikticusを含む0.01Mリン酸緩衝液(pH7)21mLに加えて撹拌し、所定時間ごとにその混合液から所定量分取して450nmに設定された分光光度計により濁度の変化を追跡して残存活性を測定した。残存活性は0%であった(図7)。
実施例1と同じ非晶質炭素微粒子を用い、150μM卵白リゾチームを含むpH7の0.01Mリン酸緩衝液に3.0g/Lの前記非晶質炭素微粒子を添加し、軽く攪拌することにより、非晶質炭素微粒子混合リゾチームを作製した。
こうして得られた後、非晶質炭素微粒子混合リゾチームに対し、実施例1と同様の条件(90℃で30分間)で熱処理試験を行った。結果を図6(e)に示す。目視観察の結果、比較例2の炭素微粒子を含むリゾチーム水溶液を加熱処理したときにおいても、水溶液には白濁が観察されたが、比較例1の生(native)のリゾチームを加熱処理した場合に比べて視覚的に白濁の度合いがやや小さく、さらに溶液粘性も小さい傾向を示した。
比較例2の非晶質炭素微粒子混合リゾチーム水溶液を90℃、30分加熱した後、恒温水槽で25℃、30分間冷却したリゾチーム溶液350μLを、予めバイアル瓶に入れておいた0.2g/LのMicrococcus lysodeikticusを含む0.01Mリン酸緩衝液(pH7)21mLに加えて撹拌し、所定時間ごとにその混合液から所定量分取して450nmに設定された分光光度計により濁度の変化を追跡して残存活性を測定した。残存活性は4%であった(図7)。
実施例1で作製された非晶質炭素微粒子吸着リゾチーム水溶液を用い、加熱処理温度を25℃、65℃、71℃、82℃、90℃、95℃、98℃と変えて実施例1の「溶菌法による残存活性試験」を繰り返し実施し、各温度におけるリゾチームの残存活性を測定した。結果を図8に黒四角点(■)で示す。
生のリゾチーム水溶液を用い、加熱処理温度を25℃、50℃、60℃、65℃、73℃、75℃、80℃、90℃と変えて実施例1に記載の「溶菌法による残存活性試験」を繰り返し実施し、各温度におけるリゾチームの残存活性を測定した。結果を図8に白菱形点(◇)で示す。
原料有機物として、小豆に変えて木材を用い、製造例1と同様の方法で製造された平均粒径18μmの非晶質炭素微粒子を用いることを除き、実施例1と同様に処理して、ろ過工程を経た非晶質炭素微粒子吸着リゾチーム分散水溶液を調製した。この非晶質炭素微粒子吸着リゾチーム分散水溶液を用いて、実施例1と同様、「加熱処理試験」および「溶菌法による残存活性試験」を行ったところ、実施例1と同様の結果が得られた。
Claims (6)
- タンパク質を含有する溶液に、不活性雰囲気において炭化された有機物の炭化物を粉砕することにより得られた非晶質炭素微粒子を添加して、タンパク質を非晶質炭素微粒子に吸着させ、ろ過した後、ろ材上の非晶質炭素微粒子吸着タンパク質を回収することにより熱安定化されたタンパク質を製造する方法であって、前記非晶質炭素微粒子へのタンパク質の吸着が、前記タンパク質および非晶質炭素微粒子含有液の12時間以上の振とうおよび/または撹拌により行われることを特徴とする熱安定化されたタンパク質の製造方法。
- 前記非晶質炭素微粒子が、有機物を不活性雰囲気において所定の温度で順次温度を上げて加熱し、前記雰囲気中及び有機物中の炭素以外の成分を、500℃以下の温度において分解温度の低いものから順次熱分解させて個別的に遊離させて製造された炭化物を粉砕することにより製造されたものであることを特徴とする請求項1に記載の熱安定化されたタンパク質の製造方法。
- 前記非晶質炭素微粒子は、平均粒径が50μm以下であり、また1nm以下の粒径の炭素超微粒子集合体であることを特徴とする請求項1または2に記載の熱安定化されたタンパク質の製造方法。
- 前記タンパク質が、酸化還元酵素、転移酵素、加水分解酵素、脱離酵素、異性化酵素、合成酵素、血漿タンパク質、ペプチドホルモンまたは遺伝子組み換えタンパク質であることを特徴とする請求項1〜3のいずれか1項に記載の熱安定化されたタンパク質の製造方法。
- 前記タンパク質が酵素であり、前記熱安定化が酵素の温度上昇時の活性保持であることを特徴とする請求項1〜4のいずれか1項に記載の熱安定化されたタンパク質の製造方法。
- 前記溶液が水溶液であることを特徴とする請求項1〜5のいずれか1項に記載の熱安定化されたタンパク質の製造方法。
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