JP5858984B2 - ＥｒｂＢ／ＥｒｂＢリガンドに関連する疾患を治療するための分子及びその分子を使用する方法 - Google Patents

ＥｒｂＢ／ＥｒｂＢリガンドに関連する疾患を治療するための分子及びその分子を使用する方法 Download PDF

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Description

本発明は、癌などの過剰増殖性の疾患を治療するための標的を選択する方法、及びかかる疾患を治療するための薬剤の組み合わせに関する。
チロシンキナーゼ受容体のＥｒｂＢファミリー及びそれに結合するリガンドは、胚発生及び成体期の組織リモデリングにおいて重要な役割を果たす。シグナル伝達は、リガンド結合で開始し、これは受容体の二量体化及びリン酸化をもたらし、増殖、分化、移動及び生存を含む様々な細胞過程を生じる。
四つの密接に関連したＥｒｂＢ受容体がある：上皮増殖因子（ＥＧＦ）、α型トランスフォーミング増殖因子（ＴＧＦα）、ヘパリン結合ＥＧＦ様増殖因子（ＨＢ−ＥＧＦ）、アンフィレギュリン（ＡＲ）、ベータセルリン（ＢＴＣ）、エピレギュリン（ＥＰＲ）、及びエピゲンに結合するＥｒｂＢ−１（上皮増殖因子受容体（ＥＧＦＲ））；ニューレギュリン増殖因子に結合するＥｒｂＢ−３及びＥｒｂＢ−４；及び現在のところリガンドが知られていないＥｒｂＢ−２（ＨＥＲ２）。
全てのＥｒｂＢファミリーのリガンドは、上皮増殖因子（ＥＧＦ）モチーフとして集約的に称される、保存された間隔及び内容において六つのシステインを含む５０〜６０アミノ酸長さの配列を共有する。このモチーフは、受容体認識の役割を有する中心的構造及び機能的特徴である。増殖因子は、Ｉ型膜貫通タンパク質として合成され、（タンパク質分解プロセスを介して）ドメイン外脱落が生じ、これにより（ＥＧＦ様ドメインを含む）可溶性増殖因子が放出される。可溶性リガンドは次に、離れた細胞、隣接する細胞、又はその起源の細胞上の受容体に結合してそれを活性化する。膜に付着されたリガンドの中には、隣接する細胞の膜上のＥＧＦＲを活性することができるものもある。この作用機構は、可溶性リガンドとは異なる生物学的結果を誘導することができる。
ＥｒｂＢは、乾癬、関節硬化症、及びいくつかの種類のヒトの癌を含むいくつかの疾患に関与することが記載されている。例えば、上皮起源の多くの腫瘍は、これらの細胞表面上にＥｒｂＢ−１の増大されたレベルを発現する［Ｕｌｌｒｉｃｈ，Ａ．ら．（１９８４）Ｎａｔｕｒｅ ３０９，４１８−４２５］。増大されたＥｒｂＢ受容体発現を有する腫瘍は、ＴＧＦαの又は他のＥｒｂＢリガンドの増大した生産をしばしば示し、オートクリンループによる受容体の活性化を可能にする。
臨床研究は、一つ以上のＥｒｂＢリガンドの過剰発現は、減少した患者の生存と相関することを示す。例えば、原発性結腸直腸腫瘍の標本内のＴＧＦαの幅広い発現は、肝臓転移を発展させる危険性の５０倍以上の増大と関連している［Ｂａｒｏｚｚｉ，Ｃ．ら．（２００２）Ｃａｎｃｅｒ ９４，６４７−６５７］。膀胱癌では、多数のＥｒｂＢリガンド（ＡＲ，ＨＢ−ＥＧＦ，ＴＧＦα，及び特にＥＰＲ）の増大した発現は、減少した患者の生存と関連する［Ｔｈｏｇｅｒｓｅｎ，Ｖ．Ｂ．ら．（２００１）Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ ６１，６２２７−６２３３］。それに加えて、転移性疾患における増大したＴＧＦαの発現は、貧弱な患者の生存と関連し［Ｄｅ Ｊｏｎｇ，Ｋ．Ｐ．ら（１９９８）Ｈｅｐａｔｏｌｏｇｙ ２８，９７１−９７９］、頭部及び首の腫瘍におけるＴＧＦαの増大した発現は、減少した患者の生存と相関する［Ｇｒａｎｄｉｓ，Ｊ．Ｒ．ら．（１９９８）Ｊ Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｃｈｅｍ ６９，５５−６２］。さらに、いくつかのリガンド、特にＴＧＦα，ＡＲ，及びＨＢ−ＥＧＦの腫瘍細胞における発現は、化学療法に対する抵抗性と関連する［Ｅｃｋｓｔｅｉｎ，Ｎ．ら．（２００８）Ｊ Ｂｉｏｌ Ｃｈｅｍ ２８３，７３９−７５０；Ｗａｎｇ，Ｆ．ら．（２００７）Ｏｎｃｏｇｅｎｅ ２６，２００６−２０１６］。
出現しつつあるデータは、特定の腫瘍における特定のＥｒｂＢリガンドの発現は、予後と異なって関連することを示す。胸部の腫瘍サンプルにおけるＥＧＦ発現は、より好ましい予後と関連しているが、ＴＧＦα発現は、より攻撃的な腫瘍と関連している［Ｒｅｖｉｌｌｉｏｎ，Ｆ．ら．（２００８）Ｉｎｔ Ｊ Ｂｉｏｌ Ｍａｒｋｅｒｓ ２３，１０−１７］。同様に、マイクロアレイ分析は、乳癌の初期の過形成前駆体は、正常な胸組織と比較して増大したＡＲ転写、及び減少したＥＧＦ転写を示すことを明らかにしている［Ｌｅｅ，Ｓ．ら．（２００７）Ａｍ Ｊ Ｐａｔｈｏｌ １７１，２５２−２６２］。非小細胞肺癌腫（ＮＳＣＬＣ）を有する患者において、ＴＧＦα及びＡＲの血清濃度は、腫瘍の攻撃性と相関する［Ｌｅｍｏｓ−Ｇｏｎｚａｌｅｚ，Ｙ．ら．（２００７）Ｂｒ Ｊ Ｃａｎｃｅｒ ９６，１５６９−１５７８］。これらの結果をまとめると、このデータは、ＴＧＦα及びＡＲは、ＥＧＦＲに関連する腫瘍細胞の攻撃性及び化学耐性と関連しており、一方、ＥＧＦは、ＴＧＦα及びＡＲによる病因性シグナル伝達の刺激に実際に対抗することができるということを示唆する［Ｗｉｌｓｏｎ，Ｋ．Ｊ．ら．（２００９）Ｐｈａｒｍａｃｏｌ Ｔｈｅｒ １２２，１−８］。
ＥｒｂＢに関連する癌の治療のために現在承認されている医薬は、ＥｒｂＢ−１に指向されたモノクローナル抗体（ＥＧＦＲ、例えばエルビツクス／セツクシマブ）、又はＨＥＲ２に指向されたモノクローナル抗体（ＥｒｂＢ−２、例えばヘルセプチン／トラスツズマブ）、又は小分子のチロシンキナーゼ阻害剤（ＴＫＩ、例えばタルセバ／エルロチニブ）を含む［Ｂｒｉｔｔｅｎ，Ｃ．Ｄ．（２００４）Ｍｏｌ Ｃａｎｃｅｒ Ｔｈｅｒ ３，１３３５−１３４２；Ｗｅｉｎｅｒ，Ｌ．Ｍ．，ａｎｄ Ｂｏｒｇｈａｅｉ，Ｈ．（２００６）Ｈｕｍ Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ １５，１０３−１１１］。モノクローナル抗体（例えばトラスツズマブ）又はチロシンキナーゼ阻害剤（例えばゲフィチニブ）に対する後天的な抵抗性は、ＥｒｂＢ受容体又はリガンドの上方制御としばしば関連しており、例えば、トラスツズマブに対する抵抗性について生体内で選択されたヒトの乳癌細胞は、ＥＧＦＲ及びＥｒｂＢリガンドＴＧＦα，ＨＢ−ＥＧＦ及びＮＲＧ１を顕著に過剰発現した［Ｒｉｔｔｅｒ，Ｃ．Ａ．ら．（２００７）Ｃｌｉｎ Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ １３，４９０９−４９１９］。同様に、ＥＧＦＲ及びＨＥＲ２を標的とするモノクローナル抗体は、機能的な受容体及び医薬回避機構を阻害することによって、ドセタキセルの抗腫瘍効果を増大させる［Ｂｉｊｍａｎ，Ｍ．Ｎ．ら．（２００９）Ａｎｔｉｃａｎｃｅｒ Ｄｒｕｇｓ ２０，４５０−４６０；Ｆｒｅｅｍａｎ，Ｄ．Ｊ．ら．（２００９）．Ｍｏｌ Ｃａｎｃｅｒ Ｔｈｅｒ ８，１５３６−１５４６］。
それに加えて、リガンドを直接標的とする代替的な戦略が提案されている。一つのかかる戦略は、個別のリガンドに対して特異的なモノクローナル抗体である。例えば、ベバシズマブは、血管内皮増殖因子Ａ（ＶＥＧＦ−Ａ）に結合するヒト化モノクローナル抗体である［Ｈｕｒｗｉｔｚ，Ｈ．，ら．（２００４）Ｎ Ｅｎｇｌ Ｊ Ｍｅｄ ３５０，２３３５−２３４２；Ｓｈｉｈ，Ｔ．，ａｎｄ Ｌｉｎｄｌｅｙ，Ｃ．（２００６）Ｃｌｉｎ Ｔｈｅｒ ２８，１７７９−１８０２］。別の戦略は、「リガンドトラップ」、つまり、特定の受容体の可溶性リガンド結合ドメインを使用する。かかるリガンドトラップの例は、エタネルセプトであり、これは、ヒトの免疫グロブリンＧ（ＩｇＧ）のＦｃ領域に融合されたＴＮＦ−α受容体のリガンド結合ドメインを含む融合タンパク質であり、関節リウマチの治療に使用される［Ｍｏｈｌｅｒ，Ｋ．Ｍ．，ら．（１９９３）Ｊ Ｉｍｍｕｎｏｌ １５１，１５４８−１５６１］。別の代替案は、脱落因子、つまりディスインテグリン及びメタロプロテイナーゼ（ＡＤＡＭ）ファミリーのメンバーの阻害であり、これらのメンバーは、ＥＧＦＲリガンドの脱落（機能的なＥＧＦＲリガンドの生産のために重要な現象）を媒介すると考えられる［Ｋａｔａｏｋａ，Ｈ．（２００９）Ｊ Ｄｅｒｍａｔｏｌ Ｓｃｉ ５６，１４８−１５３；Ｋｅｎｎｙ，Ｐ．Ａ．，ａｎｄ Ｂｉｓｓｅｌｌ，Ｍ．Ｊ．（２００７）Ｊ Ｃｌｉｎ Ｉｎｖｅｓｔ １１７，３３７−３４５；Ｍｅｒｃｈａｎｔ，Ｎ．Ｂ．，ら．（２００８）Ｃｌｉｎ Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ １４，１１８２−１１９１］。
ＥｒｂＢリガンドを標的化する追加のモノクローナル抗体は、技術分野において記載されている。例えば、ＷＯ２００９／０２６７０５は、骨関節炎の治療のためにＴＧＦαを標的化するモノクローナル抗体を記載する。
米国特許第７５０１１２２号は、抗ＥｒｂＢ２抗体の組み合わせでの治療を記載する。特に、この米国特許は、ヒト化された抗ＥｒｂＢ２抗体を使用した癌（例えば乳癌、結腸癌）の治療を教示する。この発明の教示によって記載された抗体は、上皮増殖因子受容体（ＥＧＦＲ）又はＥＧＦＲリガンド（例えば、ＥＧＦ，ＴＧＦ−α、又はＨＢ−ＥＧＦ）を過剰発現する癌におけるＥｒｂＢ受容体のリガンド活性化を阻害するために、一緒に又は個別に投与されることができ、それにより癌細胞の増殖を阻害する。
米国特許第７４８５３０２号は、抗ＥｒｂＢ２抗体及び化学療法剤を使用して癌を治療する方法を記載する。特に、この米国特許は、上皮増殖因子受容体（ＥＧＦＲ）又はそのリガンド（例えばＴＧＦα）を過剰発現する癌（例えば、乳癌、肺癌）の治療のために化学療法剤を抗ＥｒｂＢ２抗体と共に使用することを教示する。
本発明のある実施形態の側面によれば、過剰増殖性の疾患をその必要性のある対象において治療するための標的を選択する方法が提供される。前記方法は、対象からの生物学的サンプル中の少なくとも一つのＥｒｂＢリガンドの量及び／又は活性を分析することを含み、予め決定されたレベルより上の非過剰増殖性の細胞又は組織と比較して上方制御された量及び／又は活性を示すＥｒｂＢリガンドが、過剰増殖性の疾患を治療するための標的として選択されることを特徴とする。
本発明のある実施形態の側面によれば、以下のことを含むことを特徴とする、過剰増殖性の疾患をその必要性のある対象において治療する方法が提供される：（ａ）請求項１の方法に従って、過剰増殖性の疾患を治療するための標的を選択すること；及び（ｂ）前記標的の量及び／又は活性を下方制御する薬剤の治療有効量を前記対象に投与し、それにより前記対象における過剰増殖性の疾患を治療すること。
本発明のある実施形態の側面によれば、以下のことを含むことを特徴とする、過剰増殖性の疾患をその必要性のある対象において治療する方法が提供される：（ａ）第一のＥｒｂＢリガンドの量及び／又は活性を下方制御する薬剤の治療有効量を投与すること；及び（ｂ）第二のＥｒｂＢリガンドの量及び／又は活性を下方制御する薬剤の治療有効量を投与し、それにより前記対象における過剰増殖性の疾患を治療すること、ただし、前記第一のＥｒｂＢリガンドと前記第二のＥｒｂＢリガンドは同一でない。
本発明のある実施形態の側面によれば、医薬的に許容可能な担体と、第一のＥｒｂＢリガンドの量及び／又は活性を下方制御する第一の活性薬剤と、第二のＥｒｂＢリガンドの量及び／又は活性を下方制御する第二の活性薬剤とを含む医薬組成物であって、前記第一のＥｒｂＢリガンドと前記第二のＥｒｂＢリガンドは同一でないことを特徴とする医薬組成物が提供される。
本発明のある実施形態の側面によれば、包装材料と、第一のＥｒｂＢリガンドの量及び／又は活性を下方制御する第一の活性薬剤と、第二のＥｒｂＢリガンドの量及び／又は活性を下方制御する第二の活性薬剤とを含む製造物品であって、前記第一のＥｒｂＢリガンドと前記第二のＥｒｂＢリガンドは同一でなく、製造物品は、過剰増殖性の疾患の治療のために包装材料中に又は包装材料上に印刷されて特定されていることを特徴とする製造物品が提供される。
本発明のある実施形態の側面によれば、ＴＧＦαのＥＧＦ様ドメインの少なくとも一つのエピトープに特異的に結合することができるモノクローナル抗体又はそのフラグメントであって、Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ Ｎａｔｉｏｎａｌｅ Ｄｅ Ｃｕｌｔｕｒｅｓ Ｄｅ Ｍｉｃｒｏｏｒｇａｎｉｓｍｅｓ（ＣＮＣＭ）に寄託された受託番号ＣＮＣＭ Ｉ−４２９２（クローン番号５５１．６．１０３）によって記載されるモノクローナル抗体又はそのフラグメントが提供される。
本発明のある実施形態の側面によれば、ＨＢ−ＥＧＦのＥＧＦ様ドメインの少なくとも一つのエピトープに特異的に結合することができるモノクローナル抗体又はそのフラグメントであって、Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ Ｎａｔｉｏｎａｌｅ Ｄｅ Ｃｕｌｔｕｒｅｓ Ｄｅ Ｍｉｃｒｏｏｒｇａｎｉｓｍｅｓ（ＣＮＣＭ）に寄託された受託番号ＣＮＣＭ Ｉ−４２９１（クローン番号８９８．４７）によって記載されるモノクローナル抗体又はそのフラグメントが提供される。
本発明のある実施形態によれば、前記薬剤が、前記標的に特異的に結合する抗体又はそのフラグメントを含む。
本発明のある実施形態によれば、前記薬剤が、前記標的に特異的に結合するｓｉＲＮＡを含む。
本発明のある実施形態によれば、前記投与することが、少なくとも二種の薬剤を投与することを含み、前記少なくとも二種の薬剤の各々が同一でない標的に特異的に結合する。
本発明のある実施形態によれば、前記薬剤が、前記第一のＥｒｂＢリガンド及び／又は前記第二のＥｒｂＢリガンドに特異的に結合する抗体又はそのフラグメントを含む。
本発明のある実施形態によれば、前記薬剤が、前記第一のＥｒｂＢリガンド及び／又は前記第二のＥｒｂＢリガンドに特異的に結合するｓｉＲＮＡを含む。
本発明のある実施形態によれば、前記方法は、前記対象に化学療法剤を投与することをさらに含む。
本発明のある実施形態によれば、前記過剰増殖性の疾患が癌である。
本発明のある実施形態によれば、前記癌が膵臓癌である。
本発明のある実施形態によれば、前記癌が肺癌である。
本発明のある実施形態によれば、前記生物学的サンプルが癌細胞を含む。
本発明のある実施形態によれば、前記分析することがＥＬＩＳＡによって行われる。
本発明のある実施形態によれば、前記ＥｒｂＢリガンドが、上皮増殖因子（ＥＧＦ）、α型トランスフォーミング増殖因子（ＴＧＦα）、ヘパリン結合ＥＧＦ様増殖因子（ＨＢ−ＥＧＦ）、アンフィレギュリン（ＡＲ）、ベータセルリン（ＢＴＣ）、エピレギュリン（ＥＰＲ）、エピゲン、及びニューレギュリン増殖因子からなる群から選択される。
本発明のある実施形態によれば、前記第一のＥｒｂＢリガンドがα型トランスフォーミング増殖因子（ＴＧＦα）を含む。
本発明のある実施形態によれば、前記第二のＥｒｂＢリガンドがヘパリン結合ＥＧＦ様増殖因子（ＨＢ−ＥＧＦ）を含む。
本発明のある実施形態によれば、前記医薬組成物は、化学療法剤をさらに含む。
本発明のある実施形態によれば、前記製造物品は、化学療法剤をさらに含む。
本発明のある実施形態によれば、前記第一の活性薬剤と前記第二の活性薬剤は、別個の医薬組成物中に処方されている。
本発明のある実施形態によれば、前記第一の活性薬剤と前記第二の活性薬剤は、単一の医薬組成物中に処方されている。
本発明のある実施形態によれば、前記モノクローナル抗体又はそのフラグメントは、検出可能な成分を含む。
本発明のある実施形態によれば、前記モノクローナル抗体又はそのフラグメントは、モノクローナル抗体又はそのフラグメントに取り付けられた細胞毒性薬剤を含む。
別途定義されない限り、本明細書で使用されるすべての技術的用語及び／又は科学的用語は、本発明が属する技術分野の当業者によって一般に理解されるのと同じ意味を有する。本明細書に記載される方法及び材料と類似又は同等である方法及び材料を本発明の実施又は試験において使用することができるが、例示的な方法及び／又は材料が下記に記載される。矛盾する場合には、定義を含めて、本特許明細書が優先する。加えて、材料、方法及び実施例は例示にすぎず、限定であることは意図されない。
本明細書では本発明のいくつかの実施形態を単に例示し添付の図面を参照して説明する。特に詳細に図面を参照して、示されている詳細が例示として本発明の実施形態を例示考察することだけを目的としていることを強調するものである。この点について、図面について行う説明によって、本発明の実施形態を実施する方法は当業者には明らかになるであろう。
図１Ａ−１Ｅは、組み換えＥＧＦ様リガンドの構築、発現、及び生物学的活性、並びにＧＰＩ固定ＴＧＦαを使用したＴＧＦα阻害抗体の検出を示す。図１Ａは、チオレドキシン（ＴＲＸ）ドメイン、ヒスチジンボックス（６ＸＨｉｓ）、隣接因子Ｘａ開裂部位、及びカルボキシル末端ＥＧＦ様ドメインを含む一般的なキメラタンパク質の略図を示す。図１Ｂは、アクリルアミドゲルのクーマシーブルー染色を示し、細菌発現を使用して調製されてＮｉＮＴＡカラムで精製されたＴＧＦα及びＨＢ−ＥＧＦを示す。分子量マーカーは、キロダルトンで示されている。図１Ｃは、チロシン残基にＥＧＦＲリン酸化を誘導する能力について試験することによって証明されるように、精製されたタンパク質の生物学的活性を示す。細胞は、２４ウェルプレートに播種され、洗浄され、精製された融合タンパク質の増大する濃度でインキュベートされた（ＴＲＸ−ＴＧＦα：２，２０，２００ｎｇ／ｍｌ；ＴＲＸ−ＨＢ−ＥＧＦ：３，３０，３００ｎｇ／ｍｌ）。ＥＧＦ（１０ｎｇ／ｍｌ）は、正の対照として使用された。１０分間のインキュベーション後、細胞は、溶解され、清澄化された抽出物は、抗ホスホチロシン（Ｐ−Ｔｙｒ）抗体で免疫プロット（ＩＢ）された。図１Ｄは、ＥｒｂＢ−２′のシグナルペプチド（ＳＰ）、ＴＧＦα（又はＨＢ−ＥＧＦ）のＥＧＦ様ドメイン、ＨＡペプチドタグ、及び原形質膜を固定することを可能にするＧＰＩ脂質アンカーを含む一般的なＧＰＩ（グリコシルホスファチジルイノシトール）融合タンパク質のドメイン構造を示す略図である。残基数は、ＴＧＦαに言及する。ＥＧＦ様ドメインのシステイン残基は、ハイライトされている。図１Ｅは、免疫化されたマウスからの抗血清の増大した量の存在において試験されるようにＥＧＦＲのＴＧＦαによって誘導されたリン酸化を示す。細胞は、２４ウェルプレートに播種され、洗浄され、ＴＧＦαで免疫化されたマウスからの抗血清の増大した体積（１２０μｌの全量に希釈された０．２，２，４，６，８及び１０μｌの血清；対照：未処置の動物からの１０μｌの血清）と共に、及びＴＧＦα（５ｎｇ／ｍｌ）あり又はなしでインキュベートされた。抗ホスホチロシンｍＡｂは、リン酸化ＥＧＦＲを検出するために使用された。
図２Ａ−２Ｃは、抗ＴＧＦα ｍＡｂの抗原特異性及び機能試験を示す。図２Ａは、抗原特異性を示す。９６ウェルプレートは、示されたリガンド（０．１ｎｇ／ｍｌ）で被覆され、次に、抗ＴＧＦα ｍＡｂ５５１（灰色）と共に、又は生理的食塩水（黒色）と共に２時間インキュベートされた。その後、ウェルは、ＨＲＰにコンジュゲート化された抗マウス抗体で１時間インキュベートされ、ＡＴＢＳで３０分間インキュベートされた。シグナルは、ＥＬＩＳＡリーダー（４２０ｎｍに設定）を使用して決定された。図２Ｂは、ＴＧＦαの市販の調製物との抗ＴＧＦα ｍＡｂの免疫沈降を示す。抗ＴＧＦα ｍＡｂ５５１抗体は、抗マウスＦｃ抗体にコンジュゲート化されたビーズを使用してＴＧＦα（５０ｎｇ；Ｓｉｇｍａ）を免疫沈降させるために使用された。免疫複合体は、ｍＡｂ５５１でブロットされた。分子量マーカー（７キロダルトン）が示されている。図２Ｃは、ＴＧＦαによって誘導されるＥＧＦＲのリン酸化を特異的に阻害するｍＡｂ５５１の能力を示す。細胞は、２４ウェルプレートに播種され、１０時間インキュベートされた後、洗浄され、示されたリガンド及び抗ＴＧＦα ｍＡｂの増大する濃度（１５，８０，１６０μｇ／ｍｌ）あり又はなしで１０分間インキュベートされた。その後、細胞は、溶解され、清澄化された抽出物は、示されたように抗ホスホチロシンｍＡｂ又は抗ＥＧＦＲ ｍＡｂで免疫ブロット（ＩＢ）された。
図３Ａ−３Ｃは、抗ＨＢ−ＥＧＦ ｍＡｂの機能試験を示す。図３Ａは、抗原特異性を示す。９６ウェルプレートは、示されたリガンド（０．１ｎｇ／ｍｌ）で被覆され、次に、抗ＨＢ−ＥＧＦ ｍＡｂ８９８（白色）、抗ＨＢ−ＥＧＦ ｍＡｂ８７８（灰色）、又は抗ＨＢ−ＥＧＦ ｍＡｂ３８４（黒色）と共に２時間インキュベートされた。その後、ウェルは、ＨＲＰにコンジュゲート化された抗マウス抗体で１時間インキュベートされ、ＡＴＢＳで３０分間インキュベートされた。シグナルは、ＥＬＩＳＡリーダー（４２０ｎｍに設定）を使用して決定された。図３Ｂは、異なる抗ＨＢ−ＥＧＦ ｍＡｂを使用したＨＢ−ＥＧＦの市販の調製物の免疫沈降を示す。示されたＨＢ−ＥＧＦに対するｍＡｂは、抗マウスＦｃ抗体にコンジュゲート化されたビーズを使用してＨＢ−ＥＧＦ（Ｓｉｇｍａ；Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，ＭＯ）を免疫沈降（ＩＰ）させるために使用された。免疫複合体は、ＨＢ−ＥＧＦに対するｍＡｂ３２７で免疫ブロットされた。分子量マーカーが示されている。図３Ｃは、ＨＢ−ＥＧＦによって誘導されるＥＧＦＲのリン酸化を特異的に阻害するＨＢ−ＥＧＦ ｍＡｂの能力を示す。ＨｅＬａ又はＴ４７Ｄ細胞のまばらな単層は、洗浄され、ＨＢ−ＥＧＦ（３ｎｇ／ｍｌ）及び異なるＨＢ−ＥＧＦ ｍＡｂ（３８４，８７８，８９８）で１０分間インキュベートされた。その後、細胞は、溶解され、清澄化された抽出物は、抗ホスホチロシンｍＡｂ、抗ＥＧＦＲ ｍＡｂ（ＨｅＬａ）、又は抗ＥｒｂＢ−３ ｍＡｂ（Ｔ４７Ｄ）で免疫ブロット（ＩＢ）された。
図４Ａ−４Ｂは、抗ＴＧＦαと抗ＨＢ−ＥＧＦ ｍＡｂの組み合わせによる、ヒト膵臓癌細胞の（生体外及び生体内での）増殖及び腫瘍原性の効果的な阻害を示す。図４Ａは、本発明のｍＡｂで処置された膵臓癌細胞の生体外での減少した細胞増殖を示す。ＢｘＰＣ３細胞（２×１０４個）は、９６ウェルプレートに播種され、一晩接着され、抗ＴＧＦα又は抗ＨＢ−ＥＧＦ ｍＡｂ（それぞれ３０μｇ／ｍｌ）、又は両方のｍＡｂの混合物（それぞれ１５μｇ／ｍｌ）を添加された。細胞増殖は、９６時間後にＭＴＴ法を使用して六連で決定された。平均±ＳＤが示されている。実験は、二回繰り返された。図４Ｂは、本発明のｍＡｂで処置されたマウスにおける膵臓癌細胞の生体内での減少した細胞増殖を示す。メスのヌードマウス（６週齢）は、２×１０６個のＢｘＰＣ３細胞を皮下接種された。いったん腫瘍が触診できるようになったら（５〜７日後）、マウスは、無作為に群に分けられ、抗ＴＧＦα又は抗ＨＢ−ＥＧＦ ｍＡｂ（それぞれ一注入当たり１２５μｇ）、又は両方のｍＡｂの組み合わせ（それぞれ一注入当たり１２５μｇ）を腹腔内注入された。マウスは、９，１６，２０，２３，２６，３０，３３，３７，４０及び４４日目にｍＡｂで処置された。対照群は、１２匹のマウスを含んでおり、各処置群は、８匹のマウスを含んでいた。マウスの体重の間には差は観察されなかった（データは示さず）。
図５Ａ−５Ｂは、二つのｍＡｂと化学療法の組み合わせによるヒト膵臓癌細胞の（生体内及び生体外での）増殖の効果的な阻害を示す。図５Ａは、化学療法と共に、本発明のｍＡｂで処置された膵臓癌細胞の生体外での減少した細胞増殖を示す。ＢｘＰＣ３細胞（２×１０４個）は、図４Ａで上述したようにして処置された。ただし、ゲンシタビン（５０ｍｇ／ｍｌ）が、単独で又は抗ＴＧＦα ｍＡｂと抗ＨＢ−ＥＧＦ ｍＡｂ（それぞれ１５μｇ／ｍｌ）の混合物との組み合わせで使用された。実験は、二回繰り返された。図５Ｂは、化学療法と共に、本発明のｍＡｂで処置されたマウスにおける膵臓癌細胞の生体内での減少した細胞増殖を示す。メスのヌードマウス（６週齢）は、２×１０６個のＢｘＰＣ３細胞を皮下接種された。いったん腫瘍が触診できるようになったら（５〜７日後）、マウスは、無作為に群に分けられた。第一群は、ＴＧＦα及びＨＢ−ＥＧＦに対して特異的なｍＡｂ（それぞれ一注入当たり２５０μｇ；白色の矢印で示される）の混合物を腹腔内注入された。第二群（１１匹のマウス）は、１６日目及び２１日目にゲンシタビン（腹腔内注入、体重１ｋｇ当たり１５０ｍｇ；黒色の矢印で示される）で処置された。第三群（６匹のマウス）は、ゲンシタビンとｍＡｂの組み合わせで処置された。対照群（１１匹のマウス）は、生理的食塩水で処置された。腫瘍体積の平均±ＳＤが示されている。体重の監視は、体重のゆっくりとした増大を除いては、いかなる一貫した傾向及び差を検出しなかった（データは示さず）。
図６Ａ−６Ｄは、抗ＴＧＦα及び抗ＨＢ−ＥＧＦ ｍＡｂによる、動物モデル中のヒトの腫瘍細胞の増殖の阻害を示す。ＭｉａＰａＣａヒト膵臓癌細胞（図６Ａ及び６Ｃ）、又はヒト肺腫瘍細胞系Ｈ１４３７（図６Ｂ及び６Ｄ）の触診可能な腫瘍を有するヌードマウスは、１週間に２回、抗ＴＧＦαと抗ＨＢ−ＥＧＦ ｍＡｂの組み合わせ（それぞれ１２５μｇ）で処置された。ＭｉａＰａＣａ異種移植片を有するマウスは、１４，１８，２１，２４，２７，３０，３４及び３７日目にｍＡｂで処置された。対照群は、８匹のマウスを含んでおり、処置群は、５匹のマウスを含んでいた。Ｈ１４３７異種移植片を有するマウスは、６，１０，１４，１７及び２１日目にｍＡｂで処置された。対応する対照群は、１５匹のマウスを含んでおり、処理群は、１１匹のマウスを含んでいた（図６Ｂ）。腫瘍体積（図６Ａ〜Ｂ）及び体重（図６Ｃ〜Ｄ）が示されている。黒丸は、ｍＡｂ（抗ＴＧＦα及び抗ＨＢ−ＥＧＦ）で処置されたマウスを示し、白丸は、対照のマウスを示す。
本発明は、癌などの過剰増殖性の疾患を治療するための標的を選択する方法、及びかかる疾患を治療するための薬剤の組み合わせに関する。
本発明の原理及び操作は、図面及び付随する説明を参照してより良く理解されることができる。
本発明の少なくとも一つの実施形態を詳細に説明する前に、本発明は、その適用において、下記の説明に示される細部、又は、実施例によって例示される細部に限定されないことを理解しなければならない。本発明は他の実施形態が可能であり、あるいは、様々な方法で実施、又は、実行される。また、本明細書中において用いられる表現法及び用語法は説明のためであって、限定として見なされるべきでないことを理解しなければならない。
ＥｒｂＢタンパク質は、乾癬や関節硬化症、及びいくつかの種類のヒトの癌を含むいくつかの疾患に関与していることが知られている。臨床研究は、一つ以上のＥｒｂＢリガンドの過剰発現は、減少した患者の生存と相関することを示す。
本発明者は、癌の治療のための療法が、特定の患者に由来する生物学的サンプル中のＥｒｂＢの発現プロフィールに基づいて、特定の患者の要求に応じて選択されて個別に調節されることができるということを提案する。さらに、本発明者は、ＥｒｂＢリガンド（例えば、ＴＧＦαとＨＢ−ＥＧＦ）であって、両方とも特定の腫瘍において特異的に上方制御されているＥｒｂＢリガンドを標的とする二つのモノクローナル抗体での組み合わせ処置が、その腫瘍の増殖を有意に減少させ、癌治療において有利であることを示している。
具体的には、本発明者は、膵臓腫瘍は、ＥＧＦＲ及びＥｒｂＢリガンド（つまり、ＴＧＦα，ＨＢ−ＥＧＦ、及びＡＲ）が関与するいくつかのオートクリンループ（以下の表１参照）を維持することを示している。本発明者は、ＴＧＦαを標的にする特異的なモノクローナル抗体（ｍＡｂ５５１、以下の実施例３）、及びＨＢ−ＥＧＦを標的にする特異的なモノクローナル抗体（ｍＡｂ８９８，ｍＡｂ８７８、及びｍＡｂ３８４、以下の実施例４）を作成し、これらの抗体がそれらの標的リガンドに対して特異的であることを示した（図２Ａ及び３Ａ）。さらに、これらのｍＡｂの単独での又は組み合わせでの使用は、生体外で（図４Ａ）及び生体内で（図４Ｂ）、腫瘍の増殖を有意に減少させた。重要なことに、これらのｍＡｂをゲンシタビンのような従来の化学療法剤に添加すると、治療の効率が増大した（図５Ａ〜Ｂ）。これはたぶん、細胞毒性に対して腫瘍を感作し、化学耐性の発症を遅らせたためである。これらの知見をまとめると、本発明の教示は、ＥｒｂＢリガンドを標的とするモノクローナル抗体の治療的な価値を示し、かかる抗体を腫瘍の治療に使用することを示唆する。
従って、本発明によれば、過剰増殖性の疾患をその必要性のある対象において治療する方法であって、前記方法は、（ａ）対象からの生物学的サンプル中の少なくとも一つのＥｒｂＢリガンドの量及び／又は活性を分析することを含み、予め決定されたレベルより上の非過剰増殖性の細胞又は組織と比較して上方制御された量及び／又は活性を示すＥｒｂＢリガンドが、過剰増殖性の疾患を治療するための標的として選択されること、及び（ｂ）前記標的の量及び／又は活性を下方制御する薬剤の治療有効量を前記対象に投与し、それにより前記対象における過剰増殖性の疾患を治療することを含む方法が提供される。
本明細書で使用される用語「治療する／処置する」は、疾患の発症を防止すること、疾患の症状を緩和すること、弱めること、和らげること、又は除去すること、疾患の進行を遅らせること、逆転させること、又は阻止すること、又は疾患を治癒することを示す。
本明細書で使用される場合、句「過剰増殖性の疾患」は、迅速な及び／又は制御されない細胞分裂によって特徴付けられるいかなる疾患であって、発症及び／又は進行についてＥｒｂＢリガンド（活性及び／又は発現）に依存する疾患を示す。かかる疾患は、癌性のものであってもよいし、良性のものであってもよい。
過剰増殖性の疾患は、以下のものを含むことができるが、これらに限定されない：癌；乾癬、紫外線角化症、脂漏性角化症、葉状魚鱗癬、中毒性湿疹、アレルギー性湿疹、アトピー性皮膚炎、及びボーエン病などの皮膚疾患；骨髄異形成症候群、子宮頸部上皮内症；ガードナー症候群などの家族性腸ポリープ；口腔白板症；組織球増殖症；ケロイド；血管腫；炎症性関節炎；過角化、及び関節炎を含む落屑丘性皮疹。また、疣贅などのウイルスによって誘導される過剰増殖性の疾患、及びＥＢＶによって誘導される疾患（即ち、感染性単核細胞症）、瘢痕形成、再狭窄、動脈硬化、ステント内狭窄、血管移植片再狭窄などの血管増殖性疾患；繊維症疾患；糸球体腎炎；黄斑変性疾患；前立腺肥大及び脂肪腫などの良性増殖疾患；自己免疫疾患；心臓の律動不整；子宮内膜症、子宮筋腫（子宮平滑筋腫）、月経過多、子宮膣部びらん、子宮頸管ポリープ；及び椎間板の欠損又は疾患も含まれる。
特定の実施形態によれば、過剰増殖性の疾患は、癌である。
本明細書で使用される場合、用語「癌」は、発症及び／又は進行についてＥｒｂＢリガンド（活性及び／又は発現）に依存する癌性疾患を示す。癌細胞は、制御されない増殖、特化した機能の損失、不死性、顕著な転移能力、抗アポトーシス活性の顕著な増大、迅速な増殖及び増殖速度、及び特定の特徴的な形態及び細胞マーカーなどの表現型に関連されることができる。ある状況では、癌細胞は、腫瘍の形態であり、かかる細胞は、動物の体内で局所的に存在しうるか、又は白血球のように独立した細胞として血流中を循環することができる。本明細書で使用される用語「癌」は、いかなる段階及びいかなる形態のすべての種類の癌を含むことは理解されるだろう。
本発明の方法を介して治療しやすい腫瘍疾患の種類は、良性腫瘍、疣贅、ポリープ、前癌、及び悪性腫瘍／癌を含む。
本発明の方法を使用して治療されることができる腫瘍疾患の具体例は、以下のものを含むが、これらに限定されない：遺伝性副腎皮質腺癌；膀胱癌；乳癌；導管性乳癌；侵襲性導管内乳癌；散発性乳癌；感染性乳癌；４型乳癌；１型乳癌；３型乳癌；乳卵巣癌；バーキットのリンパ腫；子宮頸癌；大腸直腸腺腫；大腸直腸癌；遺伝性非ポリープ性１型大腸直腸癌；遺伝性非ポリープ性２型大腸直腸癌；遺伝性非ポリープ性３型大腸直腸癌；遺伝性非ポリープ性６型大腸直腸癌；遺伝性非ポリープ性７型大腸直腸癌；隆起性皮膚線維肉腫；子宮内膜癌；食道癌；線維肉腫性多型膠芽腫胃癌；多発性グロムス腫瘍；肝芽腫；肝細胞癌；急性リンパ芽球性白血病；急性骨髄性白血病；好酸球増加を伴う急性骨髄性白血病；急性非リンパ球白血病；慢性骨髄性白血病；リー・フラウメニ症候群；肺癌性脂肪肉腫；小細胞肺癌；非ホジキンリンパ腫；リンチ癌家族性症候群ＩＩ；男性生殖細胞腫瘍；マスト細胞白血病；髄質性甲状腺；髄芽腫；悪性黒色腫；髄膜腫；多発性内分泌腫瘍形成；素因性悪性骨髄；粘液肉腫；神経芽腫；骨肉腫；卵巣癌；漿液性卵巣癌；卵巣癌腫；卵巣性索腫瘍；膵臓癌；膵臓内分泌腫瘍；家族性非クロム親和性パラガングリオーマ；石灰化上皮腫；下垂体腫瘍；侵襲性前立腺腺癌；前立腺癌；乳頭状家族性散発性腎臓癌腫；網膜芽細胞腫；家族性ラブドイド（ｒｈａｂｄｏｉｄ）素因症候群；ラブドイド腫瘍；横紋筋肉腫；肺の小細胞癌；柔組織肉腫、扁平細胞癌、頭部及び頸部の基底細胞癌；Ｔ細胞急性リンパ芽白血病；膠芽腫を伴うターコット症候群；食道癌を伴う白斑症；子宮頸癌；ウィルムス腫瘍２型；ウィルムス腫瘍１型。
前癌は、当該技術分野で良く特徴付けられており、知られている（例えば、Ｂｅｒｍｎ ＪＪ．ａｎｄ Ｈｅｎｓｏｎ ＤＥ．，２００３．Ｃｌａｓｓｉｆｙｉｎｇ ｔｈｅ ｐｒｅｃａｎｃｅｒｓ：ａ ｍｅｔａｄａｔａ ａｐｐｒｏａｃｈ．ＢＭＣ Ｍｅｄ Ｉｎｆｏｒｍ Ｄｅｃｉｓ Ｍａｋ．３：８を参照）。本発明の方法を介して治療されることができる前癌のクラスは、後天性の小さな又は顕微鏡レベルの前癌、異型核を有する後天性の大きな病変、癌に進行する遺伝性の過剰増殖症候群と共に生じる前駆体病変、及び後天性の拡散過形成及び拡散変質形成を含む。小さな又は顕微鏡レベルの前癌の例は、ＨＧＳＩＬ（高度の子宮頸の扁平上皮内病変）、ＡＩＮ（肛門上皮内腫瘍形成）、声帯の異形成、（大腸の）迷入陰窩、ＰＩＮ（前立腺上皮内腫瘍形成）を含む。異型核を有する後天性の大きな病変の例は、管状腺腫、ＡＩＬＤ（タンパク質障害を伴う血管性免疫芽球性リンパ腺症）、異形髄膜腫、胃ポリープ、大班乾癬、骨髄異形成、乳頭状移行上皮内癌、過剰芽細胞を伴う難治性貧血、及びシュナイダー乳頭を含む。癌に進行する遺伝性の過剰増殖症候群と共に生じる前駆体病変の例は、異形性ほくろ症候群、Ｃ細胞腺腫、及びＭＥＡを含む。後天性の拡散過形成及び拡散変質形成の例は、ＡＩＤＳ、異形リンパ球過形成、骨のパジェット病、移植後リンパ球増殖疾患、及び潰瘍性大腸炎を含む。
本発明のこの側面の特定の実施形態によれば、癌は、膵臓癌又は肺癌である。
本明細書で使用される場合、句「膵臓癌」は、腺腫、扁平腺腫、印環細胞癌、ヘパトイド癌、コロイド腺癌、未分化癌、破骨細胞様巨細胞を伴う未分化癌、及び島細胞癌を含むがこれらに限定されない膵臓の悪性新生物を示す。
本明細書で使用される場合、句「肺癌」は、小細胞肺癌、組み合わされた小細胞肺癌、非小細胞肺癌、肉腫様癌、唾液腺腫瘍、カルチノイド腫瘍、扁平腺腫、及び胸膜肺ブラストーマを含むがこれらに限定されない肺組織における未制御の細胞増殖を示す。
本願明細書で使用される場合、句「その必要性のある対象」は、過剰増殖性の疾患（例えば癌）を有するか、又は過剰増殖性の疾患を有する可能性のある対象を示す。対象は哺乳動物、例えばヒトであることができる。例えば、治療される疾患が膵臓癌の場合、対象は典型的には、転移あり又はなしの、任意の段階の膵臓癌であると診断された対象である。
本明細書で使用される場合、用語「ＥｒｂＢリガンド」は、以下のものを示す：ＧｅｎＢａｎｋ登録番号ＮＭ ００１９６３又はＮＰ ００１９５４に規定される上皮増殖因子（ＥＧＦ）遺伝子生成物（即ち、タンパク質又はｍＲＮＡ）；ＧｅｎＢａｎｋ登録番号ＮＭ ００３２３６又はＮＰ ００３２２７に規定されるα型トランスフォーミング増殖因子（ＴＧＦα）遺伝子生成物；ＧｅｎＢａｎｋ登録番号ＮＭ ００１９４５又はＮＰ ００１９３６に規定されるヘパリン結合ＥＧＦ様増殖因子（ＨＢ−ＥＧＦ）遺伝子生成物；ＧｅｎＢａｎｋ登録番号ＮＭ ００１６５７又はＮＰ ００１６４８に規定されるアンフィレギュリン（ＡＲ）遺伝子生成物；ＧｅｎＢａｎｋ登録番号ＮＭ ００１７２９又はＮＰ ００１７２０に規定されるベータセルリン（ＢＴＣ）遺伝子生成物；ＧｅｎＢａｎｋ登録番号ＮＭ ００１４３２又はＮＰ ００１４２３に規定されるエピレギュリン（ＥＰＲ）遺伝子生成物；ＧｅｎＢａｎｋ登録番号ＮＭ ００１０１３４４２又はＮＰ ００１０１３４６０に規定されるエピゲン遺伝子生成物；ＧｅｎＢａｎｋ登録番号ＮＭ ００４４９５又はＮＰ ００４４８６に規定されるニューレギュリン１（ＮＲＧ１）、ＧｅｎＢａｎｋ登録番号ＮＭ ０１３９８１又はＮＰ ０５３５８４に規定されるニューレギュリン２（ＮＲＧ２）、ＧｅｎＢａｎｋ登録番号ＮＭ ００１０１０８４８又はＮＰ ００１０１０８４８に規定されるニューレギュリン３（ＮＲＧ３）、及びＧｅｎＢａｎｋ登録番号ＮＭ １３８５７３又はＮＰ ６１２６４０に規定されるニューレギュリン４（ＮＲＧ４）を含むニューレギュリン遺伝子生成物。
以下の表１に示されるように、及び以下の実施例１に記述されるように、本発明者は、癌細胞は、上方制御されたレベルのＥｒｂＢリガンドを、それらの別個の組み合わせで分泌することを発見した。
本明細書で使用される場合、ＥｒｂＢリガンドの量は、細胞内、細胞膜、細胞表面及び／又は細胞の近位のＥｒｂＢリガンド（例えばＥｒｂＢリガンドのｍＲＮＡ、ＥｒｂＢリガンドのポリペプチド）の量を示す。本明細書で使用される場合、ＥｒｂＢリガンドの活性は、その適切なＥｒｂＢ受容体にそれが結合して（例えば、ＥＧＦ，ＴＧＦα、又はＨＢ−ＥＧＦのＥｒｂＢ−１受容体への結合）、それを活性化させる（例えば、細胞内シグナル伝達経路を活性化させる）ことを示す。
過剰増殖性の疾患の治療のための標的を選択するために、生物学的サンプルはまず、対象から得られて、ＥｒｂＢリガンドの量及び／又は活性について分析される。
一つの実施形態によれば、サンプルは、血液、血漿、唾液などの体液を含む。
サンプルは、以下の細胞を含む細胞を含んでもよいが、それらに限定されない：血液細胞、骨髄細胞、膵臓細胞、肺細胞、肝細胞、脾臓細胞、腎臓細胞、心臓細胞、卵巣細胞、乳房組織の細胞、皮膚細胞（例えば、内皮細胞、繊維芽細胞、ケラチン生成細胞）、リンパ節細胞。特定の実施形態によれば、細胞は、癌細胞を含む。かかる細胞は、以下のものを含む、当該技術分野では公知の方法を使用して得られることができる：微細針生検、針生検、芯針生検、及び手術生検（例えば、脳又は肝生検）、頬の内側をこすること、及び洗浄。
次に、ＥｒｂＢリガンドの量及び／又は活性は、ＥｒｂＢリガンドをコードするＲＮＡの発現レベルを検出する（例えば、ノーザンブロット分析、ＲＴ−ＰＣＲ分析、ＲＮＡインサイチュハイブリダイゼーション染色、インサイチュＲＴ−ＰＣＲ染色を使用して）か、又はＥｒｂＢリガンドタンパク質それ自体を検出する（例えば、ウェスタンブロット、酵素結合免疫吸着アッセイ（ＥＬＩＳＡ）、放射線免疫アッセイ（ＲＩＡ）、蛍光活性化細胞分別（ＦＡＣＳ）、免疫組織化学分析を使用して）ための当該技術分野では公知のいかなる構造的、生物学的、又は生化学的方法も使用してサンプル中で検出されることができる。
次に、ＥｒｂＢリガンドの量又は活性は、対照サンプル中のＥｒｂＢリガンドの量又は活性と比較される。もし試験サンプル中のＥｒｂＢリガンドの量又は活性が対照サンプルと比較して増大（例えば、少なくとも１．５倍、少なくとも２倍、少なくとも５倍）していたならば、そのリガンドは、治療の標的として選択されることができる。
対象のサンプルと比較される対照サンプルは、典型的には同じ種、年齢及び亜集団（例えば、喫煙者／非喫煙者）の健康な個体から得られることができる。代替的に、対照サンプルは、患者自身の非過剰増殖性組織（例えば、非癌性組織）に由来することもできる。代替的に、対照データは、データベース又は文献からとられることもできる。
いったん好適な標的が選択されると、治療は、その量及び／又は活性を下方制御する任意の薬剤を使用して行われることができる。
本明細書で使用される場合、標的の量及び／又は活性に関して用語「下方制御する」は、ＥｒｂＢリガンドの量及び／又は活性を防止すること、低減させること、阻害すること、減少及び／又は削減することを示す。一つの実施形態によれば、減少させることは、レベルが対照サンプルと比較して実質的に上昇しないように行われる。別の実施形態によれば、レベルは、ＥｒｂＢリガンドの活性を完全に削減するように最大限に減少される。
過剰増殖性の細胞（例えば、癌細胞）中のＥｒｂＢリガンドの量及び／又は活性を低減／下方制御するために、本発明のこの側面に従って多数の薬剤が使用されることができる。
従って、例えば、ＥｒｂＢリガンドの発現レベルを減少させることは、転写及び／又は翻訳に干渉する様々な分子（例えば、アンチセンスｓｉＲＮＡ、リボザイム、ＤＮＡザイム）を使用してゲノム及び／又は転写レベルで、又は例えばアンタゴニスト、抗体、ポリペプチドを開裂させるかもしくはペプチドの機能を阻害する酵素を使用してタンパク質レベルで行われることができる。
以下のものは、本発明のＥｒｂＢリガンドの量及び／又は活性を減少させることができる薬剤のリストである。
本発明のＥｒｂＢリガンドを下方制御（又はその発現レベルを減少）させることができる薬剤の一例は、ＥｒｂＢリガンドに特異的に結合することができる抗体又は抗体フラグメントである。好ましくは、抗体は、ＥｒｂＢリガンドの少なくとも一つのエピトープ（例えばＥｒｂＢリガンドのＥＧＦ様ドメイン）に特異的に結合する。一つの実施形態によれば、抗体は、任意の他のＥｒｂＢリガンドと比較して、特定のＥｒｂＢリガンドに対して少なくとも２倍高い親和性を有する。一つの実施形態によれば、抗体は、任意の他のＥｒｂＢリガンドと比較して、特定のＥｒｂＢリガンドに対して少なくとも５倍高い親和性を有する。一つの実施形態によれば、抗体は、任意の他のＥｒｂＢリガンドと比較して、特定のＥｒｂＢリガンドに対して少なくとも１０倍高い親和性を有する。
本発明のこの側面の別の好ましい実施形態によれば、抗体は、少なくとも１μＭ、２００ｎＭ，１００ｎＭ，１ｎＭの最小親和性でそれらの標的ＥｒｂＢリガンドに結合する。
本発明のこの側面の抗体は、既存の抗体（例えば、公的に入手可能なハイブリドーマ、又は商業的に入手可能な抗体）、又は当該技術分野では周知で以下にさらに記述される方法に従って生成された、新規作成抗体から選択されることができる。商業的に入手可能な抗体の例は、ＥＧＦモノクローナル抗体（例えば、ＡｂａｚｙｍｅからのＣｌｏｎｅ Ｓ−２１）、ＨＢ−ＥＧＦモノクローナル抗体（例えば、Ｒ＆Ｄ ｓｙｓｔｅｍｓからのＣｌｏｎｅ １２５９２３及びＣｌｏｎｅ ４０６３１６）、及びＴＧＦαモノクローナル抗体（例えば、ＡｂｃａｍからのＣｌｏｎｅ １３４Ａ−２Ｂ３及びＣｌｏｎｅ １８９−２１３０．１）である。
本明細書で使用される場合、用語「エピトープ」は、抗体のパラトープが結合する抗原上の任意の抗原決定基を示す。
抗原決定基は通常、アミノ酸や炭水化物側鎖などの分子の化学的に活性な表面グループからなり、特定の三次元構造特徴、及び特定の荷電特徴を有する。
本明細書で使用される用語「抗体」は、完全な抗体分子、並びにその機能的なフラグメント、例えば、Ｆａｂ、Ｆ（ａｂ’）２及びＦｖ、又は単一ドメイン分子、例えば抗原のエピトープに対するＶＨ及びＶＬを含む。これらの機能的な抗体フラグメントは次のように定義される：（１）Ｆａｂは、抗体分子の一価の抗原結合性フラグメントを含有するフラグメントであり、完全な抗体を酵素パパインで消化して、無傷の軽鎖と、一方の重鎖の一部とを生じさせることによって作製することができる；（２）Ｆａｂ’は、完全な抗体をペプシンで処理し、その後、還元して、無傷の軽鎖と、重鎖の一部とを生じさせることによって得ることができる抗体分子のフラグメントである；２つのＦａｂ’フラグメントが１つの抗体分子あたり得られる；（３）（Ｆａｂ’）２は、その後の還元を行うことなく、完全な抗体を酵素ペプシンで処理することによって得ることができる抗体のフラグメントである；Ｆ（ａｂ’）２は、２つのジスルフィド結合によって一緒にされた２つのＦａｂ’フラグメントのダイマーである；（４）Ｆｖは、２つの鎖として発現された軽鎖の可変領域及び重鎖の可変領域を含有する遺伝子操作されたフラグメントとして定義される；（５）単鎖抗体（「ＳＣＡ」）は、遺伝子的に融合された単一鎖分子として好適なポリペプチドリンカーによって連結されて、軽鎖の可変領域及び重鎖の可変領域を含有する遺伝子操作された分子である；そして（６）単一ドメイン抗体は、抗原に対して十分な親和性を示す単一のＶＨ又はＶＬドメインからなる。
ポリクローナル抗体、モノクローナル抗体、及びそのフラグメントの生成方法は、この技術分野では広く知られている（例えば、Ｈａｒｌｏｗ及びＬａｎｅ、Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ、Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ、Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ、１９８８を参照のこと。これは参照により本明細書に組み込まれる）。
本発明による抗体フラグメントは、抗体のタンパク質分解的加水分解によって調製することができ、あるいは、フラグメントをコードするＤＮＡの大腸菌又は哺乳動物細胞（例えば、チャイニーズハムスター卵巣細胞培養又は他のタンパク質発現システム）における発現によって調製することができる。抗体フラグメントは、従来の方法による完全な抗体のペプシン消化又はパパイン消化によって得ることができる。例えば、抗体フラグメントを、抗体をペプシンで酵素切断して、Ｆ（ａｂ’）２として示される５Ｓフラグメントを得ることによって製造することができる。このフラグメントは、３．５ＳのＦａｂ’一価フラグメントを製造するために、チオール還元剤、及び場合により、ジスルフィド連結の切断から生じるスルフヒドリル基に対する保護基を使用してさらに切断することができる。あるいは、ペプシンを使用する酵素切断により、２つの一価Ｆａｂ’フラグメント及びＦｃフラグメントが直接的に得られる。これらの方法は、例えば、Ｇｏｌｄｅｎｂｅｒｇの米国特許第４０３６９４５号及び同第４３３１６４７号、並びにそれらに含まれる参考文献に記載されている（それらの特許は本明細書によりその全体が参照により組み込まれる）。また、Ｐｏｒｔｅｒ，Ｒ．Ｒ．、Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｊ．、７３：１１９〜１２６、１９５９も参照のこと。抗体を切断する他の方法、例えば、一価の軽鎖−重鎖フラグメントを形成させるための重鎖の分離、フラグメントのさらなる切断、又は他の酵素的、化学的もしくは遺伝学的な技術などもまた、フラグメントが、無傷の抗体によって認識される抗原に結合する限り、使用することができる。
ＦｖフラグメントはＶＨ鎖及びＶＬ鎖の会合を含む。この会合は、Ｉｎｂａｒ他、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔ’ｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ、６９：２６５９〜６２、１９７２に記載されているように非共有結合性であり得る。あるいは、可変鎖を、分子間ジスルフィド結合によって連結することができ、又は、グルタルアルデヒドなどの化学剤によって架橋することができる。好ましくは、Ｆｖフラグメントは、ペプチドリンカーによってつながれたＶＨ鎖及びＶＬ鎖を含む。これらの単鎖抗原結合タンパク質（ｓＦｖ）は、オリゴヌクレオチドによりつながれたＶＨドメイン及びＶＬドメインをコードするＤＮＡ配列を含む構造遺伝子を構築することによって調製される。この構造遺伝子は発現ベクターに導入され、続いて、発現ベクターは大腸菌などの宿主細胞に導入される。組換え宿主細胞により、２つのＶドメインを架橋するリンカーペプチドを有する単一ポリペプチド鎖が合成される。ｓＦｖを製造するための様々な方法が、例えば、Ｗｈｉｔｌｏｗ及びＦｉｌｐｕｌａ、Ｍｅｔｈｏｄｓ、２：９７〜１０５、１９９１；Ｂｉｒｄ他、Ｓｃｉｅｎｃｅ、２４２：４２３〜４２６、１９８８；Ｐａｃｋ他、Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ、１１：１２７１〜７７、１９９３；Ｌａｄｎｅｒ他、米国特許第４９４６７７８号（これは本明細書によりその全体が参照により組み込まれる）によって記載されている。
抗体フラグメントの別の形態は、単一の相補性決定領域（ＣＤＲ）をコードするペプチドである。ＣＤＲペプチド（「最小認識ユニット」）は、目的とする抗体のＣＤＲをコードする遺伝子を構築することによって得ることができる。そのような遺伝子は、例えば、抗体産生細胞のＲＮＡから可変領域を合成するためにポリメラーゼ連鎖反応を使用することによって調製される。例えば、Ｌａｒｒｉｃｋ及びＦｒｙ、Ｍｅｔｈｏｄｓ、２：１０６〜１０、１９９１を参照のこと。
非ヒト（例えば、ネズミ）抗体のヒト化形態は、非ヒト免疫グロブリンに由来する最小配列を含有する、免疫グロブリン、免疫グロブリン鎖又はそのフラグメント（例えば、Ｆｖ、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ’）２、又は抗体の他の抗原結合性の部分配列など）のキメラ分子である。ヒト化抗体には、レシピエントの相補性決定領域（ＣＤＲ）に由来する残基が、所望する特異性、親和性及び能力を有する、マウス、ラット又はウサギなどの非ヒト種（ドナー抗体）のＣＤＲに由来する残基によって置換されているヒト免疫グロブリンレシピエント抗体が含まれる。場合により、ヒト免疫グロブリンのＦｖフレームワーク残基が、対応する非ヒト残基によって置換される。ヒト化抗体はまた、レシピエント抗体においても、あるいは取り込まれたＣＤＲ配列又はフレームワーク配列においても、そのいずれにも見出されない残基を含むことができる。一般に、ヒト化抗体は、実質的にはすべての可変ドメイン又は１つ以上の（典型的には２つ）可変ドメインを含み、この場合、ＣＤＲ領域のすべて又は実質的にすべてが非ヒト免疫グロブリンのＣＤＲ領域に対応し、ＦＲ領域のすべて又は実質的にすべてがヒト免疫グロブリンコンセンサス配列のＦＲ領域である。ヒト化抗体はまた、最適には、免疫グロブリン定常領域（Ｆｃ）の一部を、典型的には、ヒト免疫グロブリンの定常領域の一部を少なくとも含む［Ｊｏｎｅｓ他、Ｎａｔｕｒｅ、３２１：５２２〜５２５（１９８６）；Ｒｉｅｃｈｍａｎｎ他、Ｎａｔｕｒｅ、３３２：３２３〜３２９（１９８８）；Ｐｒｅｓｔａ、Ｃｕｒｒ．Ｏｐ．Ｓｔｒｕｃｔ．Ｂｉｏｌ．、２：５９３〜５９６（１９９２）］。
非ヒト抗体をヒト化するための様々な方法がこの技術においては広く知られている。一般に、ヒト化抗体は、非ヒトである供給源から導入された１つ以上のアミノ酸残基を有する。これらの非ヒトアミノ酸残基は、多くの場合、輸入残基と呼ばれており、この輸入残基は、典型的には、輸入可変ドメインに由来する。ヒト化は、齧歯類のＣＤＲ又はＣＤＲ配列をヒト抗体の対応する配列の代わりに使用することによって、Ｗｉｎｔｅｒ及び共同研究者の方法に従って本質的には行うことができる［Ｊｏｎｅｓ他、Ｎａｔｕｒｅ、３２１：５２２〜５２５（１９８６）；Ｒｉｅｃｈｍａｎｎ他、Ｎａｔｕｒｅ、３３２：３２３〜３２７（１９８８）；Ｖｅｒｈｏｅｙｅｎ他、Ｓｃｉｅｎｃｅ、２３９：１５３４〜１５３６（１９８８）］。従って、そのようなヒト化抗体は、実質的に完全でないヒト可変ドメインが非ヒト種由来の対応する配列によって置換されているキメラ抗体である（米国特許第４８１６５６７号）。実際、ヒト化抗体は典型的にはヒト抗体であり、この場合、一部のＣＤＲ残基及びおそらくは一部のＦＲ残基が、齧歯類抗体における類似部位に由来する残基によって置換される。
ヒト抗体はまた、ファージディスプレーライブラリー［Ｈｏｏｇｅｎｂｏｏｍ及びＷｉｎｔｅｒ、Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．、２２７：３８１（１９９１）；Ｍａｒｋｓ他、Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．、２２２：５８１（１９９１）］を含む、この分野で知られている様々な技術を使用して製造することができる。Ｃｏｌｅ他及びＢｏｅｒｎｅｒ他の技術もまた、ヒトモノクローナル抗体を調製するために利用することができる［Ｃｏｌｅ他、Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ ａｎｄ Ｃａｎｃｅｒ Ｔｈｅｒａｐｙ、Ａｌａｎ Ｒ．Ｌｉｓｓ、７７頁（１９８５）；Ｂｏｅｒｎｅｒ他、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．、１４７（１）：８６〜９５（１９９１）］。同様に、ヒト免疫グロブリン遺伝子座を、内因性免疫グロブリン遺伝子が部分的又は完全に不活性化されている遺伝子組換え動物（例えば、マウス）に導入することによって作製することができる。抗原投与したとき、ヒト抗体の産生が認められ、この場合、その産生は、遺伝子再配置、組み立て及び抗体レパートリーを含むすべての点に関してヒトにおいて見られる産生と非常に似ている。この方法は、例えば、米国特許第５５４５８０７号、同第５５４５８０６号、同第５５６９８２５号、同第５６２５１２６号、同第５６３３４２５号、同第５６６１０１６号、及び下記の科学的刊行物：Ｍａｒｋｓ他、Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ、１０、７７９〜７８３（１９９２）；Ｌｏｎｂｅｒｇ他、Ｎａｔｕｒｅ、３６８：８５６〜８５９（１９９４）；Ｍｏｒｒｉｓｏｎ、Ｎａｔｕｒｅ、３６８：８１２〜１３（１９９４）；Ｆｉｓｈｗｉｌｄ他、Ｎａｔｕｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ、１４：８４５〜５１（１９９６）；Ｎｅｕｂｅｒｇｅｒ、Ｎａｔｕｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ、１４：８２６（１９９６）；Ｌｏｎｂｅｒｇ及びＨｕｓｚａｒ、Ｉｎｔｅｒｎ．Ｒｅｖ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．、１３：６５〜９３（１９９５）に記載されている。
細胞内の特定の区画の標的化が、細胞内抗体（これはまた「細胞内発現抗体細胞内発現抗体」として知られている）を使用して達成され得ることが理解される。細胞内抗体は本質的には、細胞内局在化シグナルが付加されているＳＣＡである（例えば、ＥＲ、ミトコンドリア、核、細胞質）。この技術は当該分野では問題なく適用されている（総説については、Ｒｉｃｈａｒｄｓｏｎ及びＭａｒａｓｃｏ（１９９５、ＴＩＢＴＥＣＨ、第１３巻）を参照のこと）。細胞内発現抗体は、そうでない場合には多量に存在する細胞表面受容体の発現を事実上なくすこと、及び、タンパク質機能を細胞内で阻害することが示されている（例えば、Ｒｉｃｈａｒｄｓｏｎ他、１９９５、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ、９２：３１３７〜３１４１；Ｄｅｓｈａｎｅ他、１９９４、Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒ．、１：３３２〜３３７；Ｍａｒａｓｃｏ他、１９９８、Ｈｕｍａｎ Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒ、９：１６２７〜４２；Ｓｈａｈｅｅｎ他、１９９６、Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．、７０：３３９２〜４００；Ｗｅｒｇｅ，Ｔ．Ｍ．他、１９９０、ＦＥＢＳ Ｌｅｔｔｅｒｓ、２７４：１９３〜１９８；Ｃａｒｌｓｏｎ，Ｊ．Ｒ．、１９９３、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ、９０：７４２７〜７４２８；Ｂｉｏｃｃａ，Ｓ．他、１９９４、Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ、１２：３９６〜３９９；Ｃｈｅｎ，Ｓ−Ｙ．他、１９９４、Ｈｕｍａｎ Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒａｐｙ、５：５９５〜６０１；Ｄｕａｎ，Ｌ他、１９９４、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ、９１：５０７５〜５０７９；Ｃｈｅｎ，Ｓ−Ｙ．他、１９９４、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ、９１：５９３２〜５９３６；Ｂｅｅｒｌｉ，Ｒ．Ｒ．他、１９９４、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．、２６９：２３９３１〜２３９３６；Ｍｈａｓｈｉｌｋａｒ，Ａ．Ｍ．他、１９９５、ＥＭＢＯ Ｊ．、１４：１５４２〜１５５１；ＰＣＴ公開番号ＷＯ９４／０２６１０（Ｍａｒａｓｃｏ他）；ＰＣＴ公開番号ＷＯ９５／０３８３２（Ｄｕａｎ他）を参照のこと）。
細胞内抗体発現ベクターを調製するために、目的とする標的タンパク質について特異的な抗体軽鎖及び抗体重鎖をコードするｃＤＮＡが、典型的には、マーカーについて特異的なモノクローナル抗体を分泌するハイブリドーマから単離される。抗マーカーモノクローナル抗体又は組換えモノクローナル抗体を分泌するハイブリドーマを、当該技術分野で既知の方法を使用して調製することができる。マーカータンパク質について特異的なモノクローナル抗体（例えば、ハイブリドーマ由来のモノクローナル抗体又はコンビナトリアルライブラリー由来の組換え抗体のどちらでもあっても）が特定されると、モノクローナル抗体の軽鎖及び重鎖をコードするＤＮＡが標準的な分子生物学的技術によって単離される。ハイブリドーマ由来の抗体については、軽鎖及び重鎖のｃＤＮＡを、例えば、ＰＣＲ増幅又はｃＤＮＡライブラリースクリーニングによって得ることができる。組換え抗体（例えば、ファージ呈示ライブラリーなど）については、軽鎖及び重鎖をコードするｃＤＮＡを、ライブラリースクリーニングプロセス時に単離された呈示パッケージ（例えば、ファージ）から回収することができ、抗体の軽鎖遺伝子及び重鎖遺伝子のヌクレオチド配列が決定される。例えば、多くのそのような配列が、Ｋａｂａｔ，Ｅ．Ａ．他（１９９１）、Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ ｏｆ Ｐｒｏｔｅｉｎｓ ｏｆ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ Ｉｎｔｅｒｅｓｔ（第５版、米国厚生省、ＮＩＨ刊行物番号９１−３２４２）において、また、「Ｖｂａｓｅ」ヒト生殖細胞系配列データベースにおいて開示される。抗体の軽鎖配列及び重鎖配列が得られると、抗体の軽鎖配列及び重鎖配列は、標準的な方法を使用して組換え発現ベクターにクローン化される。
軽鎖及び重鎖のミトコンドリア発現のために、ミトコンドリアの標的配列をコードするヌクレオチド配列が追加される［例えば、Ｂｃｌ−２のＣＯＯＨ末端シグナルアンカー（Ｎｇｕｙｅｎ，Ｍ．ら．，１９９３．Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６８：２５２６５−２５２６８）］。細胞内抗体発現ベクターは、細胞内抗体をいくつかの異なる形態のうちの一つでコードすることができる。例えば、一つの実施形態では、ベクターは、抗体の全長が細胞内で発現されるように抗体軽鎖及び重鎖の全長をコードする。別の実施形態では、ベクターは、Ｆａｂフラグメントが細胞内で発現されるように軽鎖の全長及び重鎖のＶＨ／ＣＨ１領域のみをコードする。別の実施形態では、ベクターは、一本鎖抗体（ｓｃＦｖ）をコードし、そこでは、軽鎖及び重鎖の可変領域がフレキシブルペプチドリンカーによって結合されて一本鎖分子として発現される。細胞内のマーカー活性を阻害するため、細胞内抗体をコードする発現ベクターは、上述のような標準的なトランスフェクション方法によって細胞中に導入される。
いったん抗体のＣＤＲが従来の遺伝子工学技術を使用して同定されたなら、それは、本明細書で記述する抗体の任意の形態又はそのフラグメントをコードする発現可能なポリヌクレオチドを作成するために使用されることができる。
単一の抗体が二つのＥｒｂＢリガンドを認識することができるバイエピトープ性抗体も想定されている。かかる抗体を作成する方法は、米国特許出願公開第２００７１７８１０２号に開示されている。その内容は、参考によって本明細書に組み入れられる。
以下の実施例（例えば実施例３，４）に詳述されるように、本発明者は、ＴＧＦαを特異的に標的にする抗体（ｍＡｂ−５５１と称する）、及びＨＢ−ＥＧＦを特異的に標的にする抗体（ｍＡｂ−８９８、ｍ−Ａｂ８７８及びｍＡｂ−３８４と称する）を作成した。さらに、本発明者は、これらの抗体でのマウスの生体内処置が腫瘍体積を減少させることを示した。
従って、本発明のある実施形態によれば、ＴＧＦαのＥＧＦ様ドメインの少なくとも一つのエピトープに特異的に結合することができるモノクローナル抗体又はそのフラグメントであって、Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ Ｎａｔｉｏｎａｌｅ Ｄｅ Ｃｕｌｔｕｒｅｓ Ｄｅ Ｍｉｃｒｏｏｒｇａｎｉｓｍｅｓ（ＣＮＣＭ）に寄託された受託番号ＣＮＣＭ Ｉ−４２９２（クローン番号５５１．６．１０３）によって記載されるモノクローナル抗体又はそのフラグメントが提供される。
従って、本発明の別の実施形態によれば、ＨＢ−ＥＧＦのＥＧＦ様ドメインの少なくとも一つのエピトープに特異的に結合することができるモノクローナル抗体又はそのフラグメントであって、Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ Ｎａｔｉｏｎａｌｅ Ｄｅ Ｃｕｌｔｕｒｅｓ Ｄｅ Ｍｉｃｒｏｏｒｇａｎｉｓｍｅｓ（ＣＮＣＭ）に寄託された受託番号ＣＮＣＭ Ｉ−４２９１（クローン番号８９８．４７）によって記載されるモノクローナル抗体又はそのフラグメントが提供される。
本発明のＥｒｂＢリガンドを下方制御することができる別の薬剤は、小さい干渉性ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）分子である。ＲＮＡ干渉は２つの工程プロセスである。開始工程と称される第一工程では、加えられたｄｓＲＮＡがたぶんダイサー（ｄｓＲＮＡ特異的リボヌクレアーゼのＲＮＡａｓｅ ＩＩＩファミリーの一員であり、ｄｓＲＮＡ（直接導入されたか、又は発現ベクター、カセット又はウイルスを介して導入される）をＡＴＰ依存性の様式で加工（開裂）する）の作用によって２１〜２３個のヌクレオチド（ｎｔ）の小さい干渉性ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）分子へと消化される。連続する開裂事象はＲＮＡを１９〜２１ｂｐの二本鎖（ｓｉＲＮＡ）に分解し、それぞれの鎖は２−ヌクレオチド３’オーバーハングを有する（Ｈｕｔｖａｇｎｅｒ及びＺａｍｏｒｅ Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎ．Ｇｅｎｅｔｉｃｓ ａｎｄ Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ １２：２２５−２３２（２００２）；及びＢｅｒｎｓｔｅｉｎ Ｎａｔｕｒｅ ４０９：３６３−３６６（２００１））。
エフェクター工程では、ｓｉＲＮＡ二本鎖はヌクレアーゼ複合体に結合してＲＮＡによって誘導されるサイレンシング複合体（ＲＩＳＣ）を形成する。ｓｉＲＮＡ二本鎖のＡＴＰ依存性巻き戻しがＲＩＳＣの活性化のために要求される。次に、活性なＲＩＳＣは、塩基対合相互作用によって相同な転写物を標的とし、ｍＲＮＡをｓｉＲＮＡの３’末端から１２ヌクレオチドの断片へと開裂する（Ｈｕｔｖａｇｎｅｒ及びＺａｍｏｒｅ Ｃｕｒｒ，Ｏｐｉｎ．Ｇｅｎｅｔｉｃｓ ａｎｄ Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ １２：２２５−２３２（２００２）；Ｈａｍｍｏｎｄ他（２００１）Ｎａｔ．Ｒｅｖ．Ｇｅｎ．２：１１０−１１９（２００１）；及びＳｈａｒｐ Ｇｅｎｅｓ．Ｄｅｖ．１５：４８５−９０（２００１））。開裂のメカニズムは未だ解明されようとしているが、研究は各ＲＩＳＣが単一のｓｉＲＮＡ及びＲＮａｓｅを含むことを示している（Ｈｕｔｖａｇｎｅｒ及びＺａｍｏｒｅ Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎ．Ｇｅｎｅｔｉｃｓ ａｎｄ Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ １２：２２５−２３２（２００２））。
ＲＮＡｉの顕著な有効性のため、ＲＮＡｉ経路内の増幅工程が示唆されている。増幅は、加えられたｄｓＲＮＡを複写すること（これはより多くのｓｉＲＮＡを生み出す）によって、又は形成されたｓｉＲＮＡを複製することによって生じることがありうる。代わりに又は追加的に、増幅はＲＩＳＣの多数の代謝事象によって行われることがありうる（Ｈａｍｍｏｎｄ他 Ｎａｔ．Ｒｅｖ．Ｇｅｎ．２：１１０−１１９（２００１），Ｓｈａｒｐ Ｇｅｎｅｓ．Ｄｅｖ．１５：４８５−９０（２００１），Ｈｕｔｖａｇｎｅｒ及びＺａｍｏｒｅ Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎ．Ｇｅｎｅｔｉｃｓ ａｎｄ Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ １２：２２５−２３２（２００２））。ＲＮＡｉについてのさらなる情報については、Ｔｕｓｃｈｌ ＣｈｅｍＢｉｏｃｈｅｍ．２：２３９−２４５（２００１）；Ｃｕｌｌｅｎ Ｎａｔ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．３：５９７−５９９（２００２）；及びＢｒａｎｔｌ Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ａｃｔ．１５７５：１５−２５（２００２）の解説を参照されたい。
本発明で用いるのに好適なＲＮＡｉ分子の合成は以下のようにして行われることができる。まず、ＥｒｂＢリガンド（例えば、上皮増殖因子（ＥＧＦ）、ＧｅｎＢａｎｋ登録番号ＮＭ ００１９６３）をコードするｍＲＮＡ配列標的はＡＡジヌクレオチド配列についてＡＵＧ開始コドンの下流に走査される。各ＡＡ及び３’隣接１９ヌクレオチドの存在は潜在的なｓｉＲＮＡ標的部位として記録される。好ましくはｓｉＲＮＡ標的部位はオープンリーディングフレームから選択される。なぜなら、非翻訳領域（ＵＴＲ）は制御タンパク質結合部位に富んでいるからである。ＵＴＲ結合タンパク質及び／又は翻訳開始複合体はｓｉＲＮＡエンドヌクレアーゼ複合体の結合に干渉するかもしれない（Ｔｕｓｃｈｌ（２００１）ＣｈｅｍＢｉｏｃｈｅｍ．２：２３９−２４５）。しかし、非翻訳領域に指向されたｓｉＲＮＡもＧＡＰＤＨについて示されているように効果的であることは理解されるであろう。ＧＡＰＤＨについては、５’ＵＴＲに指向されたｓｉＲＮＡは細胞内ＧＡＰＤＨ ｍＲＮＡの約９０％の減少を媒介し、タンパク質レベルを有意に減少させた（ｗｗｗ．ａｍｂｉｏｎ．ｃｏｍ／ｔｅｃｈｌｉｂ／ｔｎ／９１／９１２．ｈｔｍｌ）。
次に、可能性のある標的部位は、ＮＣＢＩサーバ（ｗｗｗ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／ＢＬＡＳＴ／）から入手可能なＢＬＡＳＴソフトウェアなどのいかなる配列アラインメントソフトウェアを用いて適切なゲノムデータベース（例えばヒト、マウス、ラットなど）と比較される。他のコード配列に対して顕著な相同性を示す仮想的な標的部位は取り除かれる。
定性化する標的配列はｓｉＲＮＡ合成のための鋳型として選択される。好ましい配列は低いＧ／Ｃ含有量を含む配列である。なぜなら、かかる配列は、５５％より高いＧ／Ｃ含有量を有する配列と比較してより効果的に遺伝子サイレンシングを媒介することが証明されているからである。いくつかの標的部位は評価のために標的遺伝子の長さに沿って選択されることが好ましい。選択されたｓｉＲＮＡのより良好な評価のためには、陰性コントロールを併用することが好ましい。陰性コントロールｓｉＲＮＡは、ｓｉＲＮＡと同じヌクレオチド組成を含むがゲノムに対する顕著な相同性を欠くことが好ましい。従って、いかなる他の遺伝子に対しても顕著な相同性を示さないという条件の下で、ｓｉＲＮＡの混合されたヌクレオチド配列は用いられることが好ましい。
選択されたｓｉＲＮＡは、（例えば、固相合成を使用して）化学的に合成されたオリゴヌクレオチドであるか、又は（例えば、ｐＲＥＴＲＯ−ＳＵＰＥＲベクターを使用して）トランスフェクション後に細胞中にＲＮＡｉを誘導するためにプラスミドからコードされることができる。最近、レトロウイルス又はレンチウイルス由来のＲＮＡｉが開発され、生体内で長期間の遺伝子サイレンシングにおいて効果的であることが見出されている［Ｈａｏ ＤＬ．，ら．，２００５，Ａｃｔａ．Ｂｉｏｃｈｉｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｓｉｎ．（Ｓｈａｎｇｈａｉ），３７（１１）：７７９−８３］。
例えば、好適なＥｒｂＢリガンドｓｉＲＮＡは、ＥＧＦ ｓｉＲＮＡ（例えば、Ｓａｎｔａ Ｃｒｕｚ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，Ｉｎｃ．のｓｃ−３９４１６）、又はＴＧＦα ｓｉＲＮＡ（例えばＳａｎｔａ Ｃｒｕｚ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，Ｉｎｃ．のｓｃ−３９４２３）、又はＨＢ−ＥＧＦ ｓｉＲＮＡ（例えば、Ｓａｎｔａ Ｃｒｕｚ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，Ｉｎｃ．のｓｃ−３９４２０）であることができる。
本発明のＥｒｂＢリガンドを下方制御することができる別のオリゴヌクレオチド薬剤が、ＥｒｂＢリガンドのｍＲＮＡ転写物又はＤＮＡ配列を特異的に切断することができるＤＮＡザイム分子である。ＤＮＡザイムは、一本鎖及び二本鎖の両方の標的配列を切断することができる一本鎖ポリヌクレオチドである（Ｂｒｅａｋｅｒ，Ｒ．Ｒ．及びＪｏｙｃｅ，Ｇ．、Ｇ．Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ａｎｄ Ｂｉｏｌｏｇｙ、１９９５、２：６５５；Ｓａｎｔｏｒｏ、Ｓ．Ｗ．＆Ｊｏｙｃｅ，Ｇ．Ｆ．、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ、１９９７、９４：４２６２）。ＤＮＡザイムについての一般的なモデル（「１０−２３」モデル）が提案されている。「１０−２３」ＤＮＡザイムは、それぞれが７個〜９個のデオキシリボヌクレオチドからなる２つの基質認識ドメインが隣接する、１５個のデオキシリボヌクレオチドからなる触媒作用ドメインを有する。このタイプのＤＮＡザイムはその基質ＲＮＡをプリン：ピリミジン接合部において効率的に切断することができる（Ｓａｎｔｏｒｏ、Ｓ．Ｗ．＆Ｊｏｙｃｅ，Ｇ．Ｇ．、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ、１９９；ＤＮＡザイムの総説については、Ｋｈａｃｈｉｇｉａｎ，Ｌ．Ｍ．［Ｃｕｒｒ Ｏｐｉｎ Ｍｏｌ Ｔｈｅｒ、４：１１９〜２１（２００２）］を参照のこと）。
一本鎖及び二本鎖の標的の切断部位を認識する合成及び操作されたＤＮＡザイムの構築及び増幅の様々な例が米国特許第６３２６１７４号（Ｊｏｙｃｅ他）に開示されている。ヒトウロキナーゼ受容体に対して向けられた類似する設計のＤＮＡザイムが最近、ウロキナーゼ受容体の発現を阻害し、また、結腸ガン細胞の転移をインビボで首尾よく阻害することが認められた（Ｉｔｏｈ他、２００２、アブストラクト４０９、Ａｎｎ Ｍｅｅｔｉｎｇ Ａｍ Ｓｏｃ Ｇｅｎ Ｔｈｅｒ、ｗｗｗ．ａｓｇｔ．ｏｒｇ）。別の適用では、ｂｃｒ−ａｂ１ガン遺伝子に対して相補的なＤＮＡザイムが、白血病細胞におけるガン遺伝子の発現を阻害すること、並びに、慢性骨髄性白血病（ＣＭＬ）及び急性リンパ性白血病（ＡＬＬ）の場合には自家骨髄移植における再発率を低下させることに成功していた。
本発明のＥｒｂＢリガンドを下方制御はまた、ＥｒｂＢリガンド（例えば、上皮増殖因子）をコードするｍＲＮＡ転写物と特異的にハイブリダイゼーションすることができるアンチセンスポリヌクレオチドを使用することによって行うことができる。
ＥｒｂＢリガンドを下方制御するために使用されることができるアンチセンス分子の設計は、アンチセンスアプローチに対する２つの重要な側面を考慮に入れて行われなければならない。第一の側面は適切な細胞の細胞質中へのオリゴヌクレオチドの送達であり、第二の側面は細胞内の指定されたｍＲＮＡの翻訳を阻害するような態様で細胞内の指定されたｍＲＮＡに特異的に結合するオリゴヌクレオチドの設計である。
従来技術は、幅広い種類の細胞中にオリゴヌクレオチドを効果的に送達するために用いられることができる多数の送達戦略を教示する（例えばＬｕｆｔ Ｊ Ｍｏｌ Ｍｅｄ ７６：７５−６（１９９８）；Ｋｒｏｎｅｎｗｅｔｔ他，Ｂｌｏｏｄ ９１：８５２−６２（１９９８）；Ｒａｊｕｒ他，Ｂｉｏｃｏｎｊｕｇ Ｃｈｅｍ ８：９３５−４０（１９９７）；Ｌａｖｉｇｎｅ他，Ｂｉｏｃｈｅｍ Ｂｉｏｐｈｙｓ Ｒｅｓ Ｃｏｍｍｕｎ ２３７：５６６−７１（１９９７）及びＡｏｋｉ他 Ｂｉｏｃｈｅｍ Ｂｉｏｐｈｙｓ Ｒｅｓ Ｃｏｍｍｕｎ ２３１：５４０−５（１９９７）を参照）。
加えて、標的ｍＲＮＡ及びオリゴヌクレオチドの両方における構造的変化のエネルギーを計算に入れる熱動力学サイクルに基づく標的ｍＲＮＡに対する最高の予想された結合親和性を有する配列を同定するためのアルゴリズムも利用可能である（例えばＷａｌｔｏｎ他，Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ Ｂｉｏｅｎｇ ６５：１−９（１９９９）参照）。
かかるアルゴリズムは、細胞におけるアンチセンスアプローチを実行するために成功して用いられている。例えば、Ｗａｌｔｏｎ他によって開発されたアルゴリズムを用いて科学者はウサギのベータグロブリン（ＲＢＧ）及びマウスの腫瘍壊死因子アルファ（ＴＮＦアルファ）転写物に対するアンチセンスオリゴヌクレオチドを設計するのに成功している。同じ研究グループは、動的ＰＣＲ技術によって評価されるように細胞培養物中で３つのモデル標的ｍＲＮＡ（ヒトの乳酸デヒドロゲナーゼＡ及びＢ及びラットのｇｐ１３０）に対する合理的に選択されたオリゴヌクレオチドのアンチセンス活性がホスホジエステル及びホスホロチオエートオリゴヌクレオチド化学を用いた２つの細胞型における３つの異なる標的に対する試験を含むほぼ全ての場合において有効であることを証明したことを最近報告している。
加えて、インビトロシステムを用いて特定のオリゴヌクレオチドを設計してその有効性を予測するためのいくつかのアプローチも発表されている（Ｍａｔｖｅｅｖａ他，Ｎａｔｕｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ １６，１３７４−１３７５（１９９８））。
いくつかの臨床試験はアンチセンスオリゴヌクレオチドの安全性、実行可能性及び活性を証明している。例えば癌の治療のために好適なアンチセンスオリゴヌクレオチドは成功して用いられており（Ｈｏｌｍｕｎｄ他，Ｃｕｒｒ Ｏｐｉｎ Ｍｏｌ Ｔｈｅｒ １：３７２−８５（１９９９））、一方、アンチセンスオリゴヌクレオチド標的化ｃ−ｍｙｂ遺伝子、ｐ５３及びＢｃｌ−２を介した血液の悪性腫瘍の治療は、臨床試験の段階に入っており、患者によって耐えられることが示されている（Ｇｅｒｗｉｔｚ Ｃｕｒｒ Ｏｐｉｎ Ｍｏｌ Ｔｈｅｒ １：２９３−３０６（１９９９））。
最近、ヒトのヘパラナーゼ遺伝子発現のアンチセンス媒介された抑制は、マウスモデル中のヒト癌細胞の胸膜転移を阻害することが報告されている（Ｕｎｏ他，Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ ６１：７８５５−６０（２００１））。
従って、現在のコンセンサスは、上記で記載されたように、非常に正確なアンチセンス設計アルゴリズム及び広範囲の様々なオリゴヌクレオチド送達システムをもたらしているアンチセンス技術の分野における最近の開発により、当業者は、過度な試行錯誤実験に頼ることを必要とすることなく、既知配列の発現を下方制御するために好適なアンチセンス法を設計し、実行することができるということである。
ＥｒｂＢリガンドの発現を下方制御することができる別の薬剤が、ＥｒｂＢリガンド（例えば、ＥＧＦ，ＴＧＦα）をコードするｍＲＮＡ転写物を特異的に切断することができるリボザイム分子である。リボザイムは、目的とするタンパク質をコードするｍＲＮＡの切断による遺伝子発現の配列特異的な阻害のためにますます使用されている［Ｗｅｌｃｈ他、Ｃｕｒｒ Ｏｐｉｎ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ、９：４８６〜９６（１９９８）］。任意の特定の標的ＲＮＡを切断するためにリボザイムを設計することができることにより、リボザイムは基礎研究及び治療的適用の両方において貴重なツールになっている。治療剤の領域では、リボザイムは、感染性疾患におけるウイルスＲＮＡ、ガンにおける優勢なガン遺伝子、及び、遺伝病における特定の体細胞変異を標的化するために利用されている［Ｗｅｌｃｈ他、Ｃｌｉｎ Ｄｉａｇｎ Ｖｉｒｏｌ、１０：１６３〜７１（１９９８）］。最も注目すべきことは、ＨＩＶ患者のためのいくつかのリボザイム遺伝子治療プロトコルが既に第１相試験中である。より近年には、様々なリボザイムが、トランスジェニック動物研究、遺伝子標的妥当性確認及び経路解明のために使用されている。いくつかのリボザイムが臨床試験の様々な段階にある。ＡＮＧＩＯＺＹＭＥは、ヒト臨床研究で研究されるための最初の化学合成されたリボザイムであった。ＡＮＧＩＯＺＹＭＥは、血管形成経路における重要な成分であるＶＥＧＦ−ｒ（血管内皮増殖因子受容体）の形成を特異的に阻害する。Ｒｉｂｏｚｙｍｅ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ，Ｉｎｃ．、並びに、他の企業が、抗血管形成治療剤の重要性を動物モデルで明らかにしている。ＨＥＰＴＡＺＹＭＥ、すなわち、Ｃ型肝炎ウイルス（ＨＣＶ）ＲＮＡを選択的に破壊するために設計されたリボザイムは、Ｃ型肝炎ウイルスのＲＮＡを細胞培養アッセイで低下させることにおいて効果的であることが見出された（Ｒｉｂｏｚｙｍｅ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ，Ｉｎｃｏｒｐｏｒａｔｅｄ−ＷＥＢのホームページ）。
細胞中での本発明のＥｒｂＢリガンドの発現レベルを下方制御するために使用できる別の薬剤は、三重鎖形成オリゴヌクレオチド（ＴＦＯ）である。最近の研究により、二本鎖のらせんＤＮＡにおけるポリプリン／ポリピリミジン領域を配列特異的な様式で認識し、かつ、これに結合することができるＴＦＯを設計できることが示されている。これらの認識規則がＭａｈｅｒ ＩＩＩ，Ｌ．Ｊ．他、Ｓｃｉｅｎｃｅ（１９８９）、２４５：７２５〜７３０；Ｍｏｓｅｒ、Ｈ．Ｅ．他、Ｓｃｉｅｎｃｅ（１９８７）、２３８：６４５〜６３０；Ｂｅａｌ，Ｐ．Ａ．他、Ｓｃｉｅｎｃｅ（１９９２）、２５１：１３６０〜１３６３；Ｃｏｏｎｅｙ，Ｍ．他、Ｓｃｉｅｎｃｅ（１９８８）、２４１：４５６〜４５９；及びＨｏｇａｎ，Ｍ．Ｅ．他、欧州特許公開３７５４０８号によって概略される。オリゴヌクレオチドの改変（例えば、インターカレーター及び骨格置換の導入など）、及び、結合条件（ｐＨ及びカチオン濃度）の最適化は、ＴＦＯ活性に対する本来的な疾患（例えば、電荷反発及び不安定性など）を克服することを助けており、また、最近では、合成オリゴヌクレオチドが特定の配列に標的化され得ることが示された（最近の総説については、Ｓｅｉｄｍａｎ及びＧｌａｚｅｒ（２００３）、Ｊ Ｃｌｉｎ Ｉｎｖｅｓｔ、１１２：４８７〜９４を参照のこと）。
一般に、三重鎖形成オリゴヌクレオチドは下記の配列対応を有する：
オリゴ ３’−Ａ Ｇ Ｇ Ｔ
二重鎖 ５’−Ａ Ｇ Ｃ Ｔ
二重鎖 ３’−Ｔ Ｃ Ｇ Ａ
しかしながら、Ａ−ＡＴ及びＧ−ＧＣの三重鎖は、最大の三重らせん安定性を有することが示されている（Ｒｅｉｔｈｅｒ及びＪｅｌｔｓｃｈ，ＢＭＣ Ｂｉｏｃｈｅｍ，２００２、３：２７）。同じ著者らは、Ａ−ＡＴ及びＧ−ＧＣの規則に従って設計されたＴＦＯが非特異的な三重鎖を形成しないことを明らかにしている。このことは、三重鎖形成が実際に、配列特異的であることを示している。
従って、ＥｒｂＢリガンドの調節領域における任意の所与の配列について、三重鎖形成配列を考案することができる。三重鎖形成オリゴヌクレオチドは好ましくは、長さが少なくとも１５ヌクレオチド、より好ましくは２５ヌクレオチド、さらにより好ましくは３０ヌクレオチド又はそれ以上から、５０ｂｐ又は１００ｂｐまでである。
ＴＦＯによる細胞のトランスフェクション（例えば、カチオン性リポソームによるトランスフェクション）、及び、標的ＤＮＡとの三重鎖らせん構造の形成は、立体的及び機能的な変化を誘導し、これにより、転写の開始及び伸長を妨げ、内因性ＤＮＡにおける所望される配列変化の誘導を可能にし、また、遺伝子発現の特異的な下方制御をもたらす。ＴＦＯにより治療された細胞における遺伝子発現のそのような抑制の例には、哺乳動物細胞におけるエピソームｓｕｐＦＧ１遺伝子及び内因性ＨＰＲＴ遺伝子のノックアウト（Ｖａｓｑｕｅｚ他、Ｎｕｃｌ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．（１９９９）、２７：１１７６〜８１；Ｐｕｒｉ他、Ｊ Ｂｉｏｌ Ｃｈｅｍ（２００１）、２７６：２８９９１〜９８）、並びに、Ｅｔｓ２転写因子（これは前立腺ガンの病因において重要である）の発現の配列特異的及び標的特異的な下方制御（Ｃａｒｂｏｎｅ他、Ｎｕｃｌ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．（２００３）、３１：８３３〜４３）、並びに、前炎症性ＩＣＡＭ−１遺伝子の配列特異的及び標的特異的な下方制御（Ｂｅｓｃｈ他、Ｊ Ｂｉｏｌ Ｃｈｅｍ（２００２）、２７７：３２４７３〜７９）が含まれる。加えて、Ｖｕｙｉｓｉｃｈ及びＢｅａｌは近年、配列特異的なＴＦＯがｄｓＲＮＡに結合し、これにより、ｄｓＲＮＡ依存性酵素（例えば、ＲＮＡ依存性キナーゼなど）の活性を阻害することができることを示している（Ｖｕｙｉｓｉｃｈ及びＢｅａｌ、Ｎｕｃ．Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ（２０００）、２８：２３６９〜７４）。
加えて、上記の原理に従って設計されたＴＦＯは、ＤＮＡ修復を行うことができる誘導された変異誘発を誘導することができ、従って、内因性遺伝子の発現の下方制御及び上方制御の両方をもたらすことができる［Ｓｅｉｄｍａｎ及びＧｌａｚｅｒ、Ｊ Ｃｌｉｎ Ｉｎｖｅｓｔ（２００３）、１１２：４８７〜９４］。効果的なＴＦＯの設計、合成及び投与の詳細な記載を、米国特許出願公開第２００３０１７０６８号及び同第２００３００９６９８０（Ｆｒｏｅｈｌｅｒ他）、同第２００２０１２８２１８号及び同第２００２０１２３４７６号（Ｅｍａｎｕｅｌｅ他）、並びに、米国特許第５７２１１３８号（Ｌａｗｎ）に見出すことができる。
本発明の教示によれば、及び以下の実施例５及び６に詳述されるように、それぞれが異なるＥｒｂＢリガンド（例えば、第一のＥｒｂＢリガンド及び第二のＥｒｂＢリガンド）を標的にする二つの薬剤（例えば、抗体）の対象への共投与は、腫瘍細胞の増殖を効果的に皆無にする。
従って、本発明の別の側面によれば、過剰増殖性の疾患は、二つの薬剤、例えば、それぞれが同一でないＥｒｂＢリガンドを標的にする二つの抗体又は二つのｓｉＲＮＡ分子の投与を介して治療されることができる。二つの薬剤の投与は、同時に行われてもよいし、一方が他方の後に行われてもよい。
本発明は、ＥｒｂＢリガンドを下方制御するために二つ以上の薬剤の使用を構想する。標的の数（及びその同一性）は典型的に、手順の分析段階で決定される。
加えて、本発明は、阻害抗体、小さなキナーゼ阻害剤、及び可溶性リガンド受容体トラップ／デコイ［参考として本明細書中に組み込まれるＣａｒｄｏ−Ｖｉｌａら．（２０１０）ＰＮＡＳ １０７（１１）５１１８−５１２３に詳述される］などのＥｒｂＢ受容体を下方制御する薬剤と共に使用されることもできる。
本発明の薬剤（例えば、抗体、ｓｉＲＮＡ、又はそれをコードする発現ベクター）は、それ自体で、又はそれが好適な担体又は賦型剤と混合された医薬組成物として対象に投与されることができることは理解されるだろう。
本明細書中で使用される「医薬組成物」は、本明細書中に記載される有効成分の１つ又は複数と、他の化学的成分（例えば、生理学的に好適な担体及び賦形剤など）との調製物を示す。医薬組成物の目的は、生物に対する化合物の投与を容易にすることである。
本明細書中において、用語「有効成分」は、生物学的効果を説明することができる薬剤（例えば、抗体、ｓｉＲＮＡ）を示す。
本明細書中以降、表現「生理学的に許容可能な担体」及び表現「医薬的に許容可能な担体」は、交換可能に使用され得るが、生物に対する著しい刺激を生じさせず、かつ、投与された化合物の生物学的な活性及び性質を妨げない担体又は希釈剤を示す。アジュバントはこれらの表現に包含される。
本明細書中において、用語「賦形剤」は、有効成分の投与をさらに容易にするために医薬組成物に添加される不活性な物質を示す。賦形剤の非限定的な例としては、炭酸カルシウム、リン酸カルシウム、様々な糖及びデンプン、セルロース誘導体、ゼラチン、植物油及びポリエチレングリコールが挙げられる。
薬物の配合及び投与のための技術が「Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ」（Ｍａｃｋ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ Ｃｏ．、Ｅａｓｔｏｎ、ＰＡ、最新版）に見出されることができ、これは参考として本明細書中に組み込まれる。
好適な投与経路には、例えば、経口送達、直腸送達、経粘膜送達、特に経鼻送達、腸管送達、又は非経口送達（これには、筋肉内注射、皮下注射及び髄内注射、並びに、クモ膜下注射、直接的な脳室内注射（例えば、右又は左脳室内注射）、心臓内注射（例えば、冠動脈内注射）、静脈内注射、腹腔内注射、鼻内注射又は眼内注射が含まれる）が含まれることができる。
あるいは、例えば、患者の身体の組織領域に直接的に調製物の注射をすることによって、全身的な方法よりも局所的に調製物を投与することができる。
用語「組織」は、類似の構造及び／又は共通の機能を有する細胞の集合からなる生物の一部を示す。組織の例は、次のものを含むが、これらに限定されない：脳組織、網膜、皮膚組織、肝臓組織、膵臓組織、骨、軟骨、結合組織、血液組織、筋肉組織、心臓組織、血管組織、腎臓組織、肺組織、生殖腺組織、造血組織。
本発明の医薬組成物は、この分野で十分に知られているプロセスによって、例えば、従来の混合、溶解、造粒、糖衣錠作製、研和、乳化、カプセル化、包括化又は凍結乾燥のプロセスによって製造されることができる。
本発明に従って使用される医薬組成物は、医薬品として使用されることができる調製物への有効成分の加工を容易にする賦形剤及び補助剤を含む１つ又は複数の生理学的に許容され得る担体を使用して従来の様式で配合されることできる。適正な配合は、選ばれた投与経路に依存する。
注射の場合、本発明の医薬組成物の有効成分は、水溶液において、好ましくは生理学的に適合しうる緩衝液（例えば、ハンクス溶液、リンゲル溶液、又は生理学的な食塩緩衝液など）において配合されることができる。経粘膜投与の場合、浸透されるバリヤーに対して適切な浸透剤が配合において使用される。そのような浸透剤はこの分野では一般に知られている。
経口投与の場合、化合物は、活性化合物をこの分野でよく知られている医薬的に許容され得る担体と組み合わせることによって容易に配合されることができる。そのような担体は、本発明の化合物が、患者によって経口摂取される錠剤、ピル、糖衣錠、カプセル、液剤、ゲル、シロップ、スラリー剤及び懸濁物などとして配合されることを可能にする。経口使用される薬理学的調製物は、固体の賦形剤を使用し、得られた混合物を場合により粉砕し、錠剤又は糖衣錠コアを得るために、望ましい好適な補助剤を添加した後、顆粒の混合物を加工して作製されることができる。好適な賦形剤は、特に、ラクトース、スクロース、マンニトール又はソルビトールを含む糖などの充填剤；セルロース調製物、例えば、トウモロコシデンプン、コムギデンプン、コメデンプン、ジャガイモデンプン、ゼラチン、トラガカントゴム、メチルセルロース、ヒドロキシプロピルメチルセルロース、ナトリウムカルボメチルセルロースなど；及び／又はポリビニルピロリドン（ＰＶＰ）などの生理学的に許容され得るポリマーである。もし望むなら、架橋されたポリビニルピロリドン、寒天、又はアルギン酸もしくはその塩（例えば、アルギン酸ナトリウムなど）などの崩壊剤が加えられることができる。
糖衣錠コアには、好適なコーティングが施される。この目的のために、高濃度の糖溶液を使用することができ、この場合、糖溶液は、場合により、アラビアゴム、タルク、ポリビニルピロリドン、カルボポールゲル、ポリエチレングリコール、二酸化チタン、ラッカー溶液、及び好適な有機溶媒又は溶媒混合物を含有しうる。色素又は顔料は、活性化合物の量を明らかにするために、又は活性化合物の量の種々の組合せを特徴づけるために、錠剤又は糖衣錠コーティングに加えられることができる。
経口使用されうる医薬組成物としては、ゼラチンから作製されたプッシュ・フィット型カプセル、並びに、ゼラチン及び可塑剤（例えば、グリセロール又はソルビトールなど）から作製された軟いシールされたカプセルが挙げられる。プッシュ・フィット型カプセルは、充填剤（例えば、ラクトースなど）、結合剤（例えば、デンプンなど）、滑剤（例えば、タルク又はステアリン酸マグネシウムなど）、及び場合により安定化剤との混合で有効成分を含有することができる。軟カプセルでは、有効成分は、好適な液体（例えば、脂肪油、流動パラフィン又は液状のポリエチレングリコールなど）に溶解又は懸濁されることができる。さらに、安定化剤が加えられることができる。経口投与される配合物はすべて、選ばれた投与経路について好適な投薬形態でなければならない。
口内投与の場合、組成物は、従来の方法で配合された錠剤又はトローチの形態を取ることができる。
鼻吸入による投与の場合、本発明による使用のための有効成分は、好適な噴射剤（例えば、ジクロロジフルオロメタン、トリクロロフルオロメタン、ジクロロテトラフルオロエタン又は二酸化炭素）の使用により加圧パック又はネブライザーからのエアロゾルスプレー提示物の形態で都合よく送達される。加圧されたエアロゾルの場合、投与量は、計量された量を送達するためのバルブを備えることによって決定されることができる。ディスペンサーにおいて使用される、例えば、ゼラチン製のカプセル及びカートリッジは、化合物及び好適な粉末基剤（例えば、ラクトース又はデンプンなど）の粉末混合物を含有して配合されることができる。
本明細書中に記載される調製物は、例えば、ボーラス注射又は連続注入による非経口投与のために配合されることができる。注射用配合物は、場合により保存剤が添加された、例えば、アンプル又は多回用量容器における単位投薬形態で提供されることができる。組成物は、油性ビヒクル又は水性ビヒクルにおける懸濁物又は溶液剤又はエマルションにすることができ、懸濁化剤、安定化剤及び／又は分散化剤などの配合剤を含有することができる。
非経口投与される医薬組成物には、水溶性形態の活性調製物の水溶液が含まれる。さらに、有効成分の懸濁物は、適切な油性又は水性の注射用懸濁物として調製されることができる。好適な親油性の溶媒又はビヒクルとしては、脂肪油（例えば、ゴマ油など）、又は合成脂肪酸エステル（例えば、オレイン酸エチルなど）、トリグリセリド又はリポソームが挙げられる。水性の注射用懸濁物は、懸濁物の粘度を増大させる物質、例えば、ナトリウムカルボキシメチルセルロース、ソルビトール又はデキストランなどを含有することができる。場合により、懸濁物はまた、高濃度溶液の調製を可能にするために、有効成分の溶解性を増大させる好適な安定化剤又は薬剤を含有することができる。
あるいは、有効成分は、好適なビヒクル（例えば、無菌の、パイロジェン不含水溶液）を使用前に用いて構成される粉末形態であることができる。
本発明の調製物はまた、例えば、カカオ脂又は他のグリセリドなどの従来の座薬基剤を使用して、座薬又は停留浣腸剤などの直腸用組成物に配合されることができる。
本発明に関連した使用のために好適な医薬組成物として、有効成分が、その意図された目的を達成するために有効な量で含有される組成物が含まれる。より具体的には、「治療有効量」は、処置されている対象の疾患（例えば、癌）の症状を予防、緩和あるいは改善するために効果的であるか、又は、処置されている対象の生存を延ばすために効果的である、有効成分（即ち、抗体やｓｉＲＮＡなどの薬剤）の量を意味する。
治療有効量の決定は、十分に当業者の能力の範囲内であり、特に本明細書に与えられる詳細な開示に鑑みればそうである。
本発明の方法において使用されるいかなる調製物についても、投与量又は治療有効量は、生体外アッセイから最初に推定されることができる。例えば、投与量は、動物モデルにおいて決定されることができ、そのような情報は、ヒトにおける有用な投与量をより正確に決定するために使用されることができる。
本明細書中に記載される有効成分の毒性及び治療効力は、生体外、細胞培養物、又は実験動物における標準的な薬学的手法によって決定されることができる。これらの生体外、細胞培養アッセイ及び動物研究から得られたデータは、ヒトにおける使用のための投与量範囲を定めるために使用されることができる。投与量は、用いられる投薬形態及び利用される投与経路に依存して変化しうる。正確な配合、投与経路及び投与量は、患者の状態を考慮して個々の医師によって選択されることができる（例えば、Ｆｉｎｇｌら、（１９７５）「Ｔｈｅ Ｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｉｃａｌ Ｂａｓｉｓ ｏｆ Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ」，Ｃｈ．１ ｐ．１を参照のこと）。
投薬量及び投薬間隔は、生物学的効果を誘導又は抑制するために十分な、有効成分の血漿又は組織のレベル（これは最小有効濃度（ＭＥＣ）と呼ばれる）をもたらすために個々に調節することができる。ＭＥＣは、それぞれの調製物について変化するが、場合により、生体外データから推定することができる。ＭＥＣを達成するために必要な投薬量は、個人の特性及び投与経路に依存する。血漿中濃度を求めるために検出アッセイが使用されることができる。
処置される状態の重篤度及び応答性に依存して、投薬は、単回又は複数回投与で行われることができ、この場合、処置期間は、数日から数週間まで、又は治療が達成されるまで、又は疾患状態の軽減が達成されるまで続く。
投与される組成物の量は、当然のことではあるが、処置されている対象、苦痛の重篤度、投与様式、処方医の判断などに依存するだろう。投薬量及び投薬タイミングは、個別の変化する状況の注意深く連続的な監視に反応するだろう。
癌のためのモデルは、ＭｉａＰａＣａヒト膵臓癌細胞を接種されたＮＣｒ−ヌードマウス（即ち、膵臓癌動物モデル）、又はヒト肺腫瘍細胞系Ｈ１４３７を接種されたＮＣｒ−ヌードマウス（即ち、肺癌動物モデル）を含む齧歯類の動物モデルを含むが、これに限定されない。
上記のこととは無関係に、本発明の薬剤は、望ましくない副作用（例えば、上方制御された免疫応答）を回避するように選択された量で投与される。
本発明の組成物は、所望されるならば、有効成分を含有する１つ又は複数の単位投薬形態物を含有し得るパック又はディスペンサーデバイス（例えば、ＦＤＡ（米国食品医薬品局）承認キットなど）で提供され得る。パックは、例えば、金属ホイル又はブリスターパックなどのプラスチックホイルを含むことができる。パック又はディスペンサーデバイスには、投与のための説明書が付随し得る。パック又はディスペンサーデバイスはまた、医薬品の製造、使用又は販売を規制する政府当局によって定められた形式で、容器に関連した通知によって適応させることがあり、この場合、そのような通知は、組成物の形態、あるいはヒト又は動物への投与の当局による承認を反映する。そのような通知は、例えば、処方薬物について米国食品医薬品局によって承認されたラベル書きであり得るか、又は、承認された製品添付文書であり得る。適合し得る医薬用担体に配合された本発明の化合物を含む組成物もまた、上で詳述されたように、示された症状を処置するために調製され、適切な容器に入れられ、かつ標識され得る。
本発明のＥｒｂＢリガンドを下方制御する薬剤は、医薬組成物として好適に処方されることができ、その医薬組成物は、製造物品として包装されることができる。かかる製造物品は、過剰増殖性の疾患の治療において使用するためのラベル、及び医薬的に有効な量の薬剤（即ち、第一のＥｒｂＢリガンドを下方制御する第一の薬剤と、第二のＥｒｂＢリガンドを下方制御する第二の薬剤）を包装する包装材料を含む。本発明の薬剤は、別個の医薬組成物中に処方されてもよく、又は、単一の医薬組成物中に処方されてもよいことは理解されるだろう。
過剰増殖性の疾患の治療効果を増大させるため、本発明は、放射線療法又は化学療法のような追加の療法を対象に投与することをさらに構想する。鎮痛剤及び他の治療療法も想定される。化学療法剤の例は、以下のものを含むが、これらに限定されない：アナストロゾール、三酸化砒素、アスパラギナーゼ、アザシチジン、ベバクジマブ、ベキサロテン、ブレオマイシン、ボルテゾミブ、ブスルファン、カルステロン、カペシタビン、カルボプラチン、カルムスチン、セレコキシブ、セツキシマブ、シスプラチン、クラドリビン、クロファラビン、シクロホスファミド、シタラビン、ダカルバジン、ダクチノマイシン、アクチノマイシンＤ、ダルベポエチンα、ダウノルビシンリポゾーマル、ダウノルビシン、デシタビン、デニロイキンジフチトックス、デキストラゾキサン、ドセタキセル、ドキソルビシン、ドロモスタノロンプロピオネート、エリオットのＢ溶液、エピルビシン、エポエチンα、エルロチニブ、エストラムスチン、エトポシド、エキセメスタン、フィルグラスチン、フロクリジン、フルダラビン、フルオロウラシル５−ＦＵ、フルベストラント、ゲフィチニブ、ゲンシタビン、ゲンツズマブオゾガミシン、酢酸ゴセレリン、酢酸ヒストレリン、水酸化尿素、イブリツモマブチルキセタン、イダルビシン、イフォスファミド、イマチニブメシレート、インターフェロンα２ａ、インターフェロンα２ｂ、イリノテカン、レナリドミド、レトロゾール、ロイコボリン、酢酸ロイプロリデ、レバミソール、ロムスチン、ＣＣＮＵ、メクロレタミン、窒素マスタード、酢酸メゲストロール、メルファラン、Ｌ−ＰＡＭ、メルカプトプリン６−ＭＰ、メスナ、メトトレキレート、ミトマイシンＣ、ミトタン、ミトキサントロン、ナンドロロンフェンプロピオネート、ネララビン、ノフェツモマブ、オプレルベキン、オキサリプラチン、パクリタキセル、パリフェルミン、パミドロネート、ペガデマーゼ、ペガスパルゲーゼ、ペグフィルグラスチン、ペメトレキセドジソジウム、ペントスタチン、ピポブロマン、プリカマイシンミトラマイシン、ナトリウムポルフィメル、プロカルバジン、キナクリン、ラスブリカーゼ、リツキシマブ、サルグラモスチン、ソラフェニブ、ストレプトゾシン、スニチニブマレエート、タモキシフェン、テモゾロミド、テニポシドＶＭ−２６、テストラクトン、チオグアニン６−ＴＧ、チオテーパ、トポテカン、トレミフェン、トシツモマブ、トラスツズマブ、トレチノインＡＴＲＡ、ウラシルマスタード、バルルビシン、ビンブラスチン、ビノレルビン、ゾレドロネート、及びゾレドロン酸。
かかる化学療法剤（例えばゲンシタビン）は、本発明の抗体にコンジュゲート化されることもできる。
加えて、本発明の抗体によって発揮される特定の生物学的活性を増大させるため、かかる抗体は、細胞毒性剤（即ち、薬剤）（例えば、シュードモナスの菌体外毒素ＰＥ３５，ＰＥ３８，ＰＥ４０、シュードモナス・アエロギノーサの菌体外毒素Ａ（ＥＴＡ）、及びジフテリアの毒素（ＤＴ３９０））をさらに含んでもよく、これにより特異的な免疫毒性を形成する。かかる細胞毒性剤は、抗体に取りつけられることができる。
本発明によって教示される抗体は、過剰増殖性の細胞又は組織（例えば、癌細胞又は組織）におけるＥｒｂＢリガンドを検出するために、又はその下方制御を評価するためにさらに使用されることができる。診断適用のために、抗体は典型的には、検出可能な成分により標識される。検出可能な成分は、検出可能シグナルを直接的又は間接的のどちらかで生じさせることができる任意の成分が可能である。例えば、検出可能な成分は、放射性同位体、蛍光性化合物もしくは化学発光性化合物、又は、タグ（例えば、標識された抗体が結合することができる本明細書中上記で記載されるタグなど）であり得る。本発明の抗体は、任意の知られているアッセイ方法（例えば、競合的結合アッセイ、直接的及び間接的なサンドイッチアッセイ、並びに、免疫沈殿アッセイなど）において用いることができる。Ｚｏｌａ、Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：Ａ Ｍａｎｕａｌ ｏｆ Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ、１４７頁〜１５８頁（ＣＲＣ Ｐｒｅｓｓ、Ｉｎｃ．、１９８７）。
本発明のこの態様の抗体は、本発明のこの態様の抗体、並びに、場合により、固体担体及び画像化試薬（例えば、抗体、発色性基質など）が、適切な緩衝液及び保存剤とともに好適な容器に包装され、診断のために使用され得る診断キットにおいて含まれることができる。
本明細書中で使用される用語「約」は、±１０％を示す。
用語「含む／備える（ｃｏｍｐｒｉｓｅｓ、ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ、ｉｎｃｌｕｄｅｓ、ｉｎｃｌｕｄｉｎｇ）」、「有する（ｈａｖｉｎｇ）」、及びそれらの同根語は、「含むが、それらに限定されない（ｉｎｃｌｕｄｉｎｇ ｂｕｔ ｎｏｔ ｌｉｍｉｔｅｄ ｔｏ）」ことを意味する。
用語「からなる（ｃｏｎｓｉｓｔｉｎｇ ｏｆ）」は、「含み、それらに限定される（ｉｎｃｌｕｄｉｎｇ ａｎｄ ｌｉｍｉｔｅｄ ｔｏ）」ことを意味する。
表現「から本質的になる（ｃｏｎｓｉｓｔｉｎｇ ｅｓｓｅｎｔｉａｌｌｙ ｏｆ）」は、さらなる成分、工程及び／又は部分が、主張される組成物、方法又は構造の基本的かつ新規な特徴を実質的に変化させない場合にだけ、組成物、方法又は構造がさらなる成分、工程及び／又は部分を含み得ることを意味する。
本明細書中で使用される場合、単数形態（「ａ」、「ａｎ」及び「ｔｈｅ」）は、文脈がそうでないことを明確に示さない限り、複数の参照物を包含する。例えば、用語「化合物（ａ ｃｏｍｐｏｕｎｄ）」又は用語「少なくとも１つの化合物」は、その混合物を含めて、複数の化合物を包含し得る。
本開示を通して、本発明の様々な態様が範囲形式で提示され得る。範囲形式での記載は単に便宜上及び簡潔化のためであり、本発明の範囲に対する柔軟性のない限定として解釈すべきでないことを理解しなければならない。従って、範囲の記載は、具体的に開示された可能なすべての部分範囲、並びに、その範囲に含まれる個々の数値を有すると見なさなければならない。例えば、１〜６などの範囲の記載は、具体的に開示された部分範囲（例えば、１〜３、１〜４、１〜５、２〜４、２〜６、３〜６など）、並びに、その範囲に含まれる個々の数値（例えば、１、２、３、４、５及び６）を有すると見なさなければならない。このことは、範囲の広さにかかわらず、適用される。
数値範囲が本明細書中で示される場合には常に、示された範囲に含まれる任意の言及された数字（分数又は整数）を含むことが意味される。第１の示された数字及び第２の示された数字「の範囲である／の間の範囲」という表現、及び、第１の示された数字「から」第２の示された数「まで及ぶ／までの範囲」という表現は、交換可能に使用され、第１の示された数字と、第２の示された数字と、その間のすべての分数及び整数とを含むことが意味される。
本明細書中で使用される用語「方法（ｍｅｔｈｏｄ）」は、所与の課題を達成するための様式、手段、技術及び手順を示し、これには、化学、薬理学、生物学、生化学及び医学の技術分野の実施者に知られているそのような様式、手段、技術及び手順、又は、知られている様式、手段、技術及び手順から、化学、薬理学、生物学、生化学及び医学の技術分野の実施者によって容易に開発されるそのような様式、手段、技術及び手順が含まれるが、それらに限定されない。
明確にするため別個の実施形態の文脈で説明されている本発明の特定の特徴は単一の実施形態に組み合わせて提供することもできることは分かるであろう。逆に、簡潔にするため単一の実施形態の文脈で説明されている本発明の各種の特徴は、別個に又は適切なサブコンビネーションで、又は本発明の他の実施形態において好適に提供することもできる。種々の実施形態の文脈において記載される特定の特徴は、その実施形態がそれらの要素なしに動作不能である場合を除いては、それらの実施形態の不可欠な特徴であると見なされるべきではない。
本明細書の上記に詳述され、かつ添付の特許請求の範囲において特許請求される本発明の種々の実施形態及び側面は、以下の実施例に実験的裏付けを見出す。
上記説明とともに、本発明を非限定的な様式で例示する以下の実施例を参照する。
本願で使用される用語と、本発明で利用される実験方法には、分子生化学、微生物学及び組み換えＤＮＡの技法が広く含まれている。これらの技術は文献に詳細に説明されている。例えば以下の諸文献を参照されたい：「Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ」Ｓａｍｂｒｏｏｋら、（１９８９）；「Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ」Ｉ〜ＩＩＩ巻、Ａｕｓｕｂｅｌ，Ｒ．Ｍ．編（１９９４）；Ａｕｓｕｂｅｌら、「Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ」、Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ａｎｄ Ｓｏｎｓ、米国メリーランド州バルチモア（１９８９）；Ｐｅｒｂａｌ「Ａ Ｐｒａｃｔｉｃａｌ Ｇｕｉｄｅ ｔｏ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ」、Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ＆ Ｓｏｎｓ、米国ニューヨーク（１９８８）；Ｗａｔｓｏｎら、「Ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ ＤＮＡ」Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｂｏｏｋｓ、米国ニューヨーク；Ｂｉｒｒｅｎら編「Ｇｅｎｏｍｅ Ａｎａｌｙｓｉｓ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ Ｓｅｒｉｅｓ」１〜４巻、Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ、米国ニューヨーク（１９９８）；米国特許の第４６６６８２８号、同第４６８３２０２号、同第４８０１５３１号、同第５１９２６５９号及び同第５２７２０５７号に記載される方法；「Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌｏｇｙ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｈａｎｄｂｏｏｋ」Ｉ〜ＩＩＩ巻、Ｃｅｌｌｉｓ，Ｊ．Ｅ．編（１９９４）；「Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ」Ｉ〜ＩＩＩ巻、Ｃｏｌｉｇａｎ，Ｊ．Ｅ．編（１９９４）；Ｓｔｉｔｅｓら編「Ｂａｓｉｃ ａｎｄ Ｃｌｉｎｉｃａｌ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ」（第８版）、Ａｐｐｌｅｔｏｎ ＆ Ｌａｎｇｅ、米国コネティカット州ノーウォーク（１９９４）；ＭｉｓｈｅｌｌとＳｈｉｉｇｉ編「Ｓｅｌｅｃｔｅｄ Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｃｅｌｌｕｌａｒ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ」、Ｗ．Ｈ． Ｆｒｅｅｍａｎ ａｎｄ Ｃｏ．、米国ニューヨーク（１９８０）；利用可能な免疫アッセイ法は、特許と科学文献に広範囲にわたって記載されており、例えば：米国特許の第３７９１９３２号、同第３８３９１５３号、同第３８５０７５２号、同第３８５０５７８号、同第３８５３９８７号、同第３８６７５１７号、同第３８７９２６２号、同第３９０１６５４号、同第３９３５０７４号、同第３９８４５３３号、同第３９９６３４５号、同第４０３４０７４号、同第４０９８８７６号、同第４８７９２１９号、同第５０１１７７１号及び同第５２８１５２１号；「Ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ」Ｇａｉｔ，Ｍ．Ｊ．編（１９８４）；「Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄ Ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ」Ｈａｍｅｓ，Ｂ．Ｄ．及びＨｉｇｇｉｎｓ Ｓ．Ｊ．編（１９８５）；「Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ ａｎｄ Ｔｒａｎｓｌａｔｉｏｎ」Ｈａｍｅｓ，Ｂ．Ｄ．及びＨｉｇｇｉｎｓ Ｓ．Ｊ．編（１９８４）；「Ａｎｉｍａｌ Ｃｅｌｌ Ｃｕｌｔｕｒｅ」Ｆｒｅｓｈｎｅｙ，Ｒ．Ｉ．編（１９８６）；「Ｉｍｍｏｂｉｌｉｚｅｄ Ｃｅｌｌｓ ａｎｄ Ｅｎｚｙｍｅｓ」ＩＲＬ Ｐｒｅｓｓ（１９８６）；「Ａ Ｐｒａｃｔｉｃａｌ Ｇｕｉｄｅ ｔｏ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ」Ｐｅｒｂａｌ，Ｂ．（１９８４）及び「Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ」１〜３１７巻、Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ；「ＰＣＲ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ：Ａ Ｇｕｉｄｅ Ｔｏ Ｍｅｔｈｏｄｓ Ａｎｄ Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ」、Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ、米国カリフォルニア州サンディエゴ（１９９０）；Ｍａｒｓｈａｋら、「Ｓｔｒａｔｅｇｉｅｓ ｆｏｒ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ ａｎｄ Ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ−Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｃｏｕｒｓｅ Ｍａｎｕａｌ」ＣＳＨＬ Ｐｒｅｓｓ（１９９６）；これらの文献の全ては、あたかも本願に完全に記載されているように援用するものである。その他の一般的な文献は、本明細書を通じて提供される。それらの文献に記載の方法は当業技術界で周知であると考えられ、読者の便宜のために提供される。それらの文献に含まれるすべての情報は本願に援用するものである。
実施例１
腫瘍細胞系からのＥＧＦ様リガンドの分泌
材料及び実験手順
材料
増殖因子は、ＰｅｐｒｏＴｅｃｈ Ａｓｉａ（Ｐｅｐｒｏｔｅｃｈ，Ｒｏｃｋｙ Ｈｉｌｌ，ＮＪ）から購入された。ＮｉＮＴＡビーズは、Ｎｏｖａｇｅｎ（Ｍａｄｉｓｏｎ， ＷＩ）から購入された。抗マウスＦｃ抗体にコンジュゲート化されたビーズ、ＡＴＢＳ（２，２′−アジノ−ビス（３−エチルベンズチオゾリン−６−スルホン酸）及びＭＴＴ（３−（４，５−ジメチルチアゾール−２−イル）−２，５−ジフェニルテトラゾリウムブロマイド）は、Ｓｉｇｍａ（Ｓｉｇｍａ，Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，ＭＯ）から購入された。増殖因子アッセイのためのＤｕｏ−ｓｅｔキットは、Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ（Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ，Ｍｉｎｎｅａｐｏｌｉｓ，ＭＮ）から購入された。ハイグロマイシンは、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ（Ｃａｒｌｓｂａｄ，ＣＡ）から購入された。ゲンシタビンは、Ｅｌｉ Ｌｉｌｌｙ ＬＴＤ．（Ｅｌｉ Ｌｉｌｌｙ ＬＴＤ．，Ｈａｍｐｓｈｉｒｅ，Ｅｎｇｌａｎｄ）から購入された。
ＥＧＦＲ及びＥｒｂＢ−３に対するモノクローナル抗体は、本明細書に記述されるようにして生成された。ホスホチロシン（ｐ−Ｔｙｒ）に対する抗体は、Ｓａｎｔａ−Ｃｒｕｚ （Ｓａｎｔａ Ｃｒｕｚ，ＣＡ）から購入された。西洋ワサビペルオキシダーゼ（ＨＲＰ）コンジュゲート化抗マウス抗体は、Ｊａｃｋｓｏｎ Ｉｍｍｕｎｏ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ（Ｗｅｓｔ Ｇｒｏｖｅ，Ｐｅｎｎｓｙｌｖａｎｉａ）から購入された。
細胞系及び組織培養
ＨｅＬａ，Ｔ４７Ｄ，ＮＳＯ及びＭｉａＰａＣａは、ＤＭＥＭ培地中で培養された。ＢｘＰＣ３細胞はＲＰＭＩ培地中で培養された。チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞は、ダルベッコの改変イーグル培地（ＤＭＥＭ）とＦ１２の混合物（１：１）中で維持された。全ての培地は、１０％の加熱により不活性化されたウシ胎児血清を添加された。
ならし培地中のリガンド濃度の決定
ヒトの癌細胞系（１×１０６個）は、１０ｃｍプレートに播種され、８ｍｌの培地で被覆され、４日間インキュベートされた。次に、培地が採取され、リガンドは、ＤｕｏＳｅｔ ＥＬＩＳＡキットを製造者（Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ，Ｍｉｎｎｅａｐｏｌｉｓ，ＭＮ）の指示に従って使用して定量された。
結果
本発明者は、腫瘍細胞系からの様々なＥＧＦ様リガンドの分泌を試験した。この目的のため、本発明者は、ＥＧＦＲの四つの異なるリガンド（即ちＥＧＦ，ＴＧＦα，ＨＢ−ＥＧＦ及びＡＲ）の低濃度を検出することができる免疫学的キットを使用した。アッセイは、卵巣、胸、肺、及び膵臓などの幅広い範囲のヒト腫瘍に由来する１３の癌細胞系によってならし培地で行われた（表１参照）。表１に詳述されるように、アッセイは、増殖因子の明確な組み合わせを検出し、そのうち、ＨＢ−ＥＧＦ及びＡＲは、試験された腫瘍細胞系によって分泌される最も豊富なリガンドであった。
実施例２
ＥＧＦ様リガンドのクローニング、発現、及び生物学的活性
材料及び実験手順
材料
上述の実施例１で詳述した通りである。
細菌及び哺乳類細胞におけるＥＧＦ様リガンドのクローニング及び発現
ＴＧＦαのＥＧＦ様ドメイン（配列番号１）又はＨＢ−ＥＧＦのＥＧＦ様ドメイン（配列番号３）は、ｐＥＴ３２ｂベクター中にクローニングされ、ＥＧＦ様ドメインのＮ末端残基に隣接する因子Ｘａ開裂部位を有するＣ末端チオレドキシン（ＴＲＸ）融合タンパク質として発現された。融合タンパク質は、標準的な手順を使用して大腸菌（ＢＬ２１）中で発現された。一つのコロニーは一晩増殖され、２００ｍｌの２ＹＴ中に希釈された。ＯＤ（６００ｎｍ）は、０．５〜０．６に到達するまで連続的に監視され、次に、１ｍＭのＩＰＴＧが添加され、培養物は３０℃に移された。５時間のインキュベーション後、細菌細胞は、氷上で冷却され、遠心分離され、２０ｍＭのＴｒｉｓ ｐＨ７．５、１５０ｍＭのＮａＣｌ、５ｍＭのイミダゾール、及び１％のｔｒｉｔｏｎ Ｘ−１００を含む混合物２０ｍｌ中で再懸濁された。次に、細胞は、超音波照射により破壊され、明澄な抽出物は、予め平衡化されたＮｉＮＴＡビーズに移された。ビーズは、同じ緩衝液を使用して洗浄され、３００ｍＭのイミダゾールで溶出された。
ＧＰＩ付着モチーフに結合されたＥＧＦ様ドメインを含む融合タンパク質の構築は、二つの工程で行われた。第一のＰＣＲ反応は、ラットのコンタクチンー１のＧＰＩシグナル上で行われた。５′プライマーは、ＨＡタグに続くＮｓｉＩ部位を導入し、３′プライマーは、ＮｏｔＩ部位を導入した。生成物は、ＮｓｉＩ及びＮｏｔＩ制限酵素を使用してｐＩＲＥＳ−Ｈｙｇベクター中にクローニングされた。第二工程は、重複ＰＣＲを使用した。第一の反応は、テンプレートとしてのＨＥＲ２のシグナルペプチド、及びそれぞれのＥＧＦ様ドメインの５′配列を含む３′プライマーを使用した。第二のＰＣＲ反応は、テンプレートとしてのそれぞれのＥＧＦ様ドメイン、及びＨＥＲ２シグナルペプチドの３′末端を含む５′プライマーを使用した。両方の反応の生成物は、精製され、１：１のモル比で組み合わされ、これが別のＰＣＲ反応のテンプレートとして使用された。最終ＰＣＲ生成物は、ＢａｍＨＩ及びＮｓｉＩ開裂部位を使用してｐＩＲＥＳ−Ｈｙｇ−ＧＰＩインフレーム（ｉｎｆｒａｍｅ）にクローニングされ、５′をＨＡタグに結合された。
免疫ブロット分析
細胞は、２４ウェルプレートに播種された。２４時間後、細胞は、洗浄され、様々な薬剤でインキュベートされた。１０分間のインキュベートの後、細胞は、溶解され、明澄な抽出物は電気泳動され、次に、抗ホスホチロシンｍＡｂ、抗ＥＧＦＲ ｍＡｂ（ＨｅＬａ）、又は抗ＥｒｂＢ−３ ｍＡｂ（Ｔ４７Ｄ）で免疫ブロットされた。
結果
標的の天然の配座の特異的な認識及びそれへの特異的な結合は、モノクローナル抗体（ｍＡｂ）に基づく療法の顕著な特徴である。ＥｒｂＢリガンドのＥＧＦ様ドメインの正確な折り畳み及び活性のためには、高度に保存された三つのジスルフィド結合が必要であることが知られている［Ｖａｎ Ｚｏｅｌｅｎ，Ｅ．Ｊ．，ら．（２０００）Ｖｉｔａｍ Ｈｏｒｍ ５９，９９−１３１］。従って、本発明者は、ＥＧＦＲ特異的リガンドのＥＧＦ様ドメインを、チオレドキシンタンパク質（ＴＲＸ、図１Ａ）に結合された融合タンパク質として発現させることを選択した。融合タンパク質は、ニッケルカラム（例えば、ＮｉＮＴＡカラム）の使用による続く精製を可能にするヒスチジンリピートも含んでいた。加えて、因子Ｘａ開裂部位が導入され、組み換えタンパク質の残りからのＥＧＦ様ドメインの放出を可能にした。（上述の材料及び方法の欄で詳述したような）細菌系中での発現後、二つのリガンド（ＴＧＦα及びＨＢ−ＥＧＦ）は、ＮｉＮＴＡカラムを使用して精製され（図１Ｂ）、それらの生物学的活性は、チロシン残基上でのＥＧＦＲリン酸化を誘導するそれらの能力を試験することによって検証された（図１Ｃ）。図１Ｃに示されるように、組み換えリガンドは、それぞれの機能的に活性な配座を示した。従って、マウスは、以下に詳述されるように活性ＴＲＸ融合タンパク質で続いて免疫化された。
実施例３
ＴＧＦαのＥＧＦ様ドメインに対して指向された拮抗抗体の作成
材料及び実験手順
材料
上述の実施例１で詳述した通りである。
細菌及び哺乳類細胞におけるＥＧＦ様リガンドのクローニング及び発現
上述の実施例２で詳述した通りである。
哺乳類細胞におけるＥＧＦ様リガンドの発現
ＥＧＦ様ドメインを安定して発現するチャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞のクローンを確立するため、本発明者は、リポフェクタミン（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，Ｃａｒｌｓｂａｄ，ＣＡ）を使用して対応するｐＩＥＲＳ−Ｈｙｇをトランスフェクトし、ハイグロマイシン（２μｍ／ｍｌ）を使用してクローンを選択した。選択の２週間後、安定にトランスフェクトされた細胞は、小さなコロニーとして出現し、これらのコロニーがスクリーニングされ、高発現を示すコロニーが増殖された。
モノクローナル抗体の作成
５匹のメスのｂａｌｂ／ｃマウス（３ヶ月齢；Ｈａｒｌｅｎ，Ｉｓｒａｅｌ）は、完全フロインドアジュバント中の３０μｍのタンパク質を皮下的にかつ一つの脚の内部フットパッド（ｉｎｔｒａ ｆｏｏｔ ｐａｄ）中に注入された。３週間後、第二回の注入が不完全フロインドアジュバントで行われた。この注入の後、３週間の間隔で、ＰＢＳ中の３０μｇのタンパク質の３〜５回の注入が行われた。最後の注入の１０日後、マウスは、放血され、血清は、抗体力価について試験された。最後の追加抗原投与の１ヶ月後、最高の力価を有する２匹のマウスは、もう２回の注入を二日間にわたって連続して受けた。最後の追加抗原投与の４日後、脾臓は、除去され、各個体の脾臓からの細胞は、２０×１０６個のＮＳ０／１骨髄腫系と融合された。融合は、以前に記述されたように［Ｅｓｈｈａｒ，Ｚ．，ら．（１９８０）．Ｊ Ｉｍｍｕｎｏｌ １２４，７７５−７８０］、４１％のポリエチレングリコール１５００（Ｓｅｒｖａ，Ｈｅｉｄｅｌｂｅｒｇ，ＧＭＢＨ）を使用して行われた。融合後、細胞は、９６ウェルプレートに１ウェル当たり２×１０４個の生存している骨髄腫細胞の濃度で分散された。ハイブリッド細胞は、ＨＡＴの存在下で増殖について選択された。陽性のハイブリッド培養物は、ＨＡＴから引き離され、クローニングされて限界希釈で再クローニングされた。
ＥＧＦ様リガンドへのｍＡｂの結合の生体外試験
９６ウェルプレートは、示されたリガンド（０．１ｎｇ／ｍｌ）で被覆され、３７℃で３時間インキュベートされた。プレートは、２回洗浄され、ＰＢＳＴ中の１％ＢＳＡで３７℃で１時間ブロックされ、抗体（１μｇ／ｍｌ）又は生理的食塩水で室温で３時間インキュベートされた。次に、ウェルは、抗マウスＨＲＰ抗体で２０分間インキュベートされ、その後、ＡＴＢＳ（Ｓｉｇｍａ，Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，ＭＯ）試薬でインキュベートされた。シグナルは、ＥＬＩＳＡ読み取り器（４２０ｎｍ）を使用して決定された。
免疫沈降アッセイ
ｍＡｂは、抗マウスＦｃ抗体にコンジュゲート化されたアガロースビーズで４５分間インキュベートされた。その後、ビーズは、ＰＢＳ中で２回洗浄され、ＨＢ−ＥＧＦ又はＴＧＦα（Ｓｉｇｍａ，Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，ＭＯ）で１時間インキュベートされた。免疫複合体は、ＨＢ−ＥＧＦに対するｍＡｂ３２７で免疫ブロットされた。
結果
ＴＲＸ含有融合タンパク質は、完全フロインドアジュバント（Ｔｉｆｃｏ，Ｄｅｔｒｏｉｔ，Ｍｉｃｈｉｇａｎ）を使用して、Ｂａｌｂ／ｃマウスを免疫化するために使用された（５０μｇ／動物）。４回の腹腔内注入の後、血清は、採取され、抗リガンド応答について試験された。抗血清及びハイブリドーマスクリーニングを容易にするために、本発明者は、原形質膜上にＴＧＦαのＥＧＦ様ドメインを発現する安定なチャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞系を確立した。ＥＧＦ様ドメインは、ＨＥＲ２シグナルペプチド、ＨＡ−ペプチドタグ、及びＧＰＩアンカー（グリコシルホスファチジルイノシトール）モチーフに融合された。このモチーフは、原形質膜への融合タンパク質の脂質ベースの固定に関与する（図１Ｄ）。免疫化されたマウスからの抗血清は、ＧＰＩ固定されたリガンドを発現するＣＨＯ細胞に特異的に結合するその能力について試験された。加えて、本発明者は、リガンド誘導ＥＧＦＲリン酸化を阻害する抗血清の能力を試験した。図１Ｅ（例示的アッセイ）に示されるように、ＥＧＦＲのＴＧＦαによって誘導されるリン酸化は、免疫化されたマウスからの抗血清の増大した量の存在において試験された。続いて、２匹の陽性マウスの脾臓を使用してハイブリドーマが確立され、これらのハイブリドーマは、次に表面に露出されたＧＰＩ−ＴＧＦα融合タンパク質を認識するそれらの能力、及び哺乳類の組み換えリガンドを弱化させるそれらの能力についてスクリーニングされた（データは示さず）。
選択された抗ＴＧＦα ｍＡｂ（ｍＡｂ−５５１と称される）を機能的に特性決定するために、本発明者は、ＥＬＩＳＡアッセイを使用してその特異性を試験した。このアッセイにより、ｍＡｂ−５５１は、ＴＧＦαのみに結合し、試験された他の四つのリガンド（ＡＲ，ＥＧＦ，ＨＢ−ＥＧＦ，ＮＲＧ１、図２Ａ）には結合しないことが確認された。さらに、抗ＴＧＦα ｍＡｂは、ＴＧＦαの市販の調製物を免疫沈降させることが見出された（図２Ｂ）。さらに、本発明者は、ｍＡｂ−５５１は、ＴＧＦαによって誘導されるＥＧＦＲリン酸化を特異的に阻害する能力を有する（図２Ｃ）が、ＥＧＦ又はＨＢ−ＥＧＦによって誘導されるＥＧＦＲの活性化は阻害されない（図２Ｃ）ことを確認した。これらの結果は総合的に、ＴＧＦαによって媒介されるオートクリンループを妨害するｍＡｂ−５５１の好適さを確立した。
実施例４
ＨＢ−ＥＧＦのＥＧＦ様ドメインに対して指向された拮抗抗体の作成
材料及び実験手順
材料
上述の実施例１で詳述した通りである。
細菌及び哺乳類細胞におけるＥＧＦ様リガンドのクローニング及び発現
上述の実施例２で詳述した通りである。
哺乳類細胞におけるＥＧＦ様リガンドの発現
上述の実施例３で詳述した通りである。
モノクローナル抗体の作成
上述の実施例３で詳述した通りである。
ＥＧＦ様リガンドへのｍＡｂの結合の生体外試験
上述の実施例３で詳述した通りである。
免疫沈降アッセイ
上述の実施例３で詳述した通りである。
結果
本発明者は、別の主要な増殖刺激ＥＧＦ様リガンドであるＨＢ−ＥＧＦに対するｍＡｂを作成した。本発明者は、ＨＢ−ＥＧＦに対する三つのｍＡｂ及び固定されたＨＢ−ＥＧＦを使用して、特異性、及びＥｒｂＢファミリーの他の増殖因子に対する交差反応性の非存在を確認した（図３Ａ）。次に、本発明者は、ＨＢ−ＥＧＦの市販の調製物を免疫沈降させることに対するハイブリドーマの三つの陽性クローンの能力を確認した（図３Ｂ）。加えて、本発明者は、ＨｅＬａ及びＴ４７Ｄ哺乳類癌細胞におけるＨＢ−ＥＧＦによって誘導されるチロシンのリン酸化を試験することによって、ＨＢ−ＥＧＦに対する三つのｍＡｂ（ｍＡｂ−８９８，ｍＡｂ−８７８及びｍＡｂ−３８４）は、リガンドによって誘導される受容体の活性化を不定に阻害すると結論付けた（図３Ｃ）。
実施例５
個別の抗体及びそれらの組み合わせの増殖阻害活性
材料及び実験手順
材料
上述の実施例１で詳述した通りである。
細菌及び哺乳類細胞におけるＥＧＦ様リガンドのクローニング及び発現
上述の実施例２で詳述した通りである。
モノクローナル抗体の作成
上述の実施例３で詳述した通りである。
細胞増殖アッセイ（ＭＴＴ）
ＢｘＰＣ３膵臓腫瘍細胞は、９６ウェルプレート（２０００個の細胞／ウェル）に６連で播種された。細胞は、様々なｍＡｂの添加の前に一晩接着させられた。増殖は、２４，４８及び７２時間後に、ＭＴＴ法を以前に記述されたように［Ｍｏｓｓｍａｎｎ Ｔ．Ｊ．，Ｉｍｍｕｎｏｌ Ｍｅｔｈｏｄｓ．（１９８３）１６；６５（１−２）：５５−６３］使用して測定された。ＭＴＴ（３−（４，５−ジメチルチアゾール−２−イル）−２，５−ジフェニルテトラゾリウムブロマイド）は、ウェルに添加され、２時間後、細胞は（イソプロパノール中の）４ｍＭのＨＣｌに溶解された。吸光度は５７０ｎｍで決定された。
動物中でのｍＡｂの抗腫瘍活性の決定
メスの異型ＮＣｒヌードマウス（６週齢；Ｈａｒｌｅｎ，Ｉｓｒａｅ）は、２×１０６個のヒト癌細胞を皮下接種された。いったん腫瘍が触診可能になると（５〜７日後）、マウスは、無作為に群に分けられ、示された時点にｍＡｂ、化学療法、又は様々な組み合わせを腹腔内注入された。腫瘍体積は、１週間に２回監視され、体重は、１週間に１回測定された。
結果
組み合わせ療法は、単一療法より効率的であることがしばしば証明されている。ＴＧＦαに対する拮抗抗体及びＨＢ−ＥＧＦに対する拮抗抗体の利用可能性は、ＢｘＰＣ３膵臓腫瘍細胞が両方のリガンドを分泌した（上述の表１参照）という発見と共に、ＢｘＰＣ３細胞の腫瘍原性増殖に対する二つのオートクリン増殖因子を標的にする組み合わせ療法を試験するように本発明者を刺激した。この目的のため、本発明者は、作成された各ｍＡｂの存在下で、又は二つの抗体の組み合わせ下でＢｘＰＣ３細胞の増殖を定量した。結果（図４Ａに示される）は、細胞増殖に対するｍＡｂ−５５１（ＴＧＦαに対するもの）及びｍＡｂ−８９８（ＨＢ−ＥＧＦに対するもの）の両方の阻害効果を証明した。重要なことに、両方のｍＡｂでの組み合わせ治療は、同時オートクリンループと一貫してＢｘＰＣ３細胞の増殖に対する阻害効果を増大させた。
本発明者は、同一の膵臓ＢｘＰＣ３異種移植片を使用して、二つの抗増殖因子ｍＡｂを組み合わせる効率を生体内でチェックした。細胞は、（上述の材料及び方法の欄で記述されたようにして）マウスに皮下注入され、触診可能な腫瘍が出現するまで（５〜７日間）増殖された。次に、マウスは、ｍＡｂ（ｍＡｂ−５５１又はｍＡｂ−８９８）のうちの一方で、又は抗ＴＧＦα ｍＡｂと抗ＨＢ−ＥＧＦ ｍＡｂの組み合わせで１週間に２回処置された（図４Ｂ）。図４Ｂに示されるように、これらのｍＡｂの生体内活性は、生体外の結果より深い（ｐｒｏｆｏｕｎｄ）ように見えただけでなく、二つのｍＡｂの組み合わせは、相乗効果をもたらし、各ｍＡｂ単独で観察される腫瘍寸法の減少より大きい腫瘍寸法の減少がもたらされた（データは示さず）。加えて、本発明者は、膵臓細胞系ＭｉａＰａＣａ−２及び肺癌細胞系Ｈ１４３７の異種移植片は、ｍＡｂ−５５１又はｍＡｂ−８９８での個別の治療より二つのｍＡｂの組み合わせによって良好に阻害されたことを見出した（データは示さず）。従って、二つの増殖因子に対する抗体を組み合わせることは、幅広い増殖阻害効果を毒性なしに誘導するように見える。
実施例６
抗増殖因子抗体の組み合わせは、腫瘍を化学療法に対して感作する
材料及び実験手順
材料
上述の実施例１で詳述した通りである。
細菌及び哺乳類細胞におけるＥＧＦ様リガンドのクローニング及び発現
上述の実施例２で詳述した通りである。
モノクローナル抗体の作成
上述の実施例３で詳述した通りである。
細胞増殖アッセイ（ＭＴＴ）
ＢｘＰＣ３膵臓腫瘍細胞は、９６ウェルプレート（２０００個の細胞／ウェル）に６連で播種された。細胞は、二つのｍＡｂ（ｍＡｂ−５５１又はｍＡｂ−８９８）又はゲンシタビンの添加の前に一晩接着させられた。増殖は、２４，４８及び７２時間後に、ＭＴＴ法を使用して測定された。ＭＴＴ（３−（４，５−ジメチルチアゾール−２−イル）−２，５−ジフェニルテトラゾリウムブロマイド）は、ウェルに添加され、２時間後、細胞は（イソプロパノール中の）４ｍＭのＨＣｌに溶解された。吸光度は５７０ｎｍで決定された。
動物中でのｍＡｂの抗腫瘍活性の決定
メスの異型ＮＣｒヌードマウス（６週齢；Ｈａｒｌｅｎ，Ｉｓｒａｅ）は、２×１０６個のヒト癌細胞を皮下接種された。いったん腫瘍が触診可能になると（５〜７日後）、マウスは、無作為に群に分けられ、ゲンシタビン（１５０ｍｇ／ｋｇ体重）で２回（１６日目及び２１日目）（腹腔内注入によって）処置され、二つのｍＡｂあり又はなしで１週間に２回処置された。腫瘍体積は、１週間に２回監視され、体重は、１週間に１回測定された。
結果
本発明者は、ＥＧＦＲを刺激する自己生産増殖因子（ＥｒｂＢ−１）及びＨＥＲ２を刺激する自己生産増殖因子（ＥｒｂＢ−２）は、ＥｒｂＢ−３／４と共に、化学療法及び放射線療法に対する膵臓腫瘍及び他の腫瘍の抵抗性において本質的な役割を果たすと仮定する。従って、本発明者は、かかるオートクリンループの阻害は、逃避機構を遮断して、従来の療法の毒性効果に対して腫瘍を再感作するかどうかを試験することを望んだ。このシナリオの初期の試験として、本発明者は、二つのｍＡｂとゲンシタビン（進行した膵臓腫瘍の主要な化学療法剤）との組み合わせ効果を生体外で試験した。図５Ａに示されるように、ＴＧＦαに対する抗体及びＨＢ−ＥＧＦに対する抗体（それぞれｍＡｂ−５５１及びｍＡｂ−８９８）の混合物を使用して、ゲンシタビンの増殖阻害効果が（培養されたＢｘＰＣ３細胞に見られるように）増強された。
次の実験において、本発明者は、動物における三つの組み合わせ（即ち、ゲンシタビン、ｍＡｂ−５５１及びｍＡｂ−８９８）の、ＢｘＰＣ３細胞の腫瘍原性増殖に対する影響を試験した。細胞は、皮下注入され、触診可能な腫瘍が出現するまで増殖された。次に、マウスは、ゲンシタビン（１５０ｍｇ／ｋｇ体重）で、及び二つのｍＡｂであり又はなしで二回（１６日目及び２１日目に）処置された。図５Ｂに示される結果は、ゲンシタビンの二回の注入は、８５％以上の腫瘍増殖阻害を生じたが、二つのｍＡｂの混合物での繰り返し注入は、この化学療法剤の細胞毒性効果を増殖したことを証明する。
実施例７
抗増殖因子抗体の組み合わせは、膵臓腫瘍及び肺腫瘍を生体内で有意に減少させる
材料及び実験手順
材料
上述の実施例１で詳述した通りである。
細菌及び哺乳類細胞におけるＥＧＦ様リガンドのクローニング及び発現
上述の実施例２で詳述した通りである。
モノクローナル抗体の作成
上述の実施例３で詳述した通りである。
動物中でのｍＡｂの抗腫瘍活性の決定
メスの異型ＮＣｒヌードマウス（６週齢；Ｈａｒｌｅｎ，Ｉｓｒａｅ）は、２×１０６個のＭｉａＰａＣａヒト膵臓癌細胞又はヒト肺腫瘍細胞系Ｈ１４３７を皮下接種された。いったん腫瘍が触診可能になると（５〜７日後）、ＭｉａＰａＣａ異種移植片を担持するマウスは、１４，１８，２１，２４，２７，３０，３４及び３７日目にｍＡｂ（それぞれ一回の注入当たり１２５μｇ）で処置された。対照群は、８匹のマウスを含んでおり、処置群は、５匹のマウスを含んでいた。Ｈ１４３７腫瘍異種移植片を担持するマウスは、６，１０，１４，１７及び２１日目にｍＡｂ（それぞれ一回の注入当たり１２５μｇ）で処置された。対照群は、１５匹のマウスを含んでおり、処置群は、１１匹のマウスを含んでいた。腫瘍体積及びマウス体重は、監視された。
結果
図６Ａ〜Ｄに示されるように、抗ＴＧＦα ｍＡｂ及び抗ＨＢ−ＥＧＦ ｍＡｂでのマウスの処置は、膵臓腫瘍及び肺腫瘍を有意に減少させた。
本発明はその特定の実施態様によって説明してきたが、多くの別法、変更及び変形があることは当業者には明らかであることは明白である。従って、本発明は、本願の請求項の精神と広い範囲の中に入るこのような別法、変更及び変形すべてを包含するものである。
本明細書で挙げた刊行物、特許及び特許出願はすべて、個々の刊行物、特許及び特許出願が各々あたかも具体的にかつ個々に引用提示されているのと同程度に、全体を本明細書に援用するものである。さらに、本願で引用又は確認したことは本発明の先行技術として利用できるという自白とみなすべきではない。節の見出しが使用されている程度まで、それらは必ずしも限定であると解釈されるべきではない。
テキストファイルの内容
以下のものは、本明細書に同封され、本願と共に提出されたテキストファイルの内容を記載する。ファイル情報は、ファイル名／バイトサイズ／作成日／オペレーティングシステム／機械フォーマットとして与えられている。
Ｓｅｑｕｅｎｃｅ＿Ｌｉｓｔｉｎｇ／１，８６９ ｂｙｔｅｓ／１８ Ａｐｒｉｌ ２０１０／ＰＣ／Ｎｏｔｅｐａｄ

Claims (8)

  1. 必要性のある対象における膵臓癌又は肺癌のための治療を選択する方法であって、前記方法は、対象からの生物学的サンプル中の少なくとも二つの同一でないＥｒｂＢリガンドの量及び／又は活性を分析することを含み、前記少なくとも二つの同一でないＥｒｂＢリガンドが、α型トランスフォーミング増殖因子（ＴＧＦα）、ヘパリン結合ＥＧＦ様増殖因子（ＨＢ−ＥＧＦ）、及びアンフィレギュリン（ＡＲ）からなる群から選択され、前記少なくとも二つの同一でないＥｒｂＢリガンドが、癌でない細胞又は組織と比較して予め決定されたレベルより上の上方制御された量及び／又は活性を示すとき、前記少なくとも二つの同一でないＥｒｂＢリガンドが、対象における膵臓癌又は肺癌の治療のための標的として選択され、前記治療は、前記少なくとも二つの同一でないＥｒｂＢリガンドに特異的に結合する少なくとも一種の抗体又はそのフラグメントであって、前記少なくとも二つの同一でないＥｒｂＢリガンドの量及び／又は活性を下方制御する少なくとも一種の抗体又はそのフラグメントを含むことを特徴とする方法。
  2. 前記生物学的サンプルが、癌細胞を含むことを特徴とする請求項１に記載の方法。
  3. 前記生物学的サンプルが、血液、血漿、唾液、生検、頬の内側をこすることで得られた試料、及び洗浄からなる群から選択されることを特徴とする請求項１に記載の方法。
  4. 前記少なくとも二つの同一でないＥｒｂＢリガンドが、α型トランスフォーミング増殖因子（ＴＧＦα）及びヘパリン結合ＥＧＦ様増殖因子（ＨＢ−ＥＧＦ）であることを特徴とする請求項１に記載の使用。
  5. 必要性のある対象における膵臓癌又は肺癌の治療のために特定された医薬を製造するための、少なくとも二つの同一でないＥｒｂＢリガンドに特異的に結合する少なくとも一種の抗体又はそのフラグメントであって、前記少なくとも二つの同一でないＥｒｂＢリガンドの量及び／又は活性を下方制御する少なくとも一種の抗体又はそのフラグメントの治療有効量の使用であって、前記対象が、請求項１〜４のいずれかに記載の方法に従った治療のために選択されていることを特徴とする使用。
  6. 前記少なくとも一種の抗体が、少なくとも二種の抗体を含み、前記少なくとも二種の抗体が、前記少なくとも二つの同一でないＥｒｂＢリガンドに結合することを特徴とする請求項５に記載の使用。
  7. 前記抗体が、ＥＧＦ様ドメインのエピトープに結合することを特徴とする請求項５に記載の使用。
  8. ゲンシタビンをさらに含むことを特徴とする請求項５に記載の使用。
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