JP5847606B2 - 食品試料中のアミラーゼ活性の分析法 - Google Patents
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Description
分析対象とする食品試料から、該食品試料中に存在し得るアミラーゼを含有する画分を、澱粉及び/又は澱粉加水分解物とは分離されるように取得することを含む、該食品試料中に存在し得るアミラーゼを含有し、澱粉及び/又は澱粉加水分解物を実質的に含有しないアミラーゼ活性測定用試料を調製する工程1と、
アミラーゼ活性測定用試料中のアミラーゼ活性を測定する工程2と
を含む前記方法。
(2) アミラーゼ活性測定用試料における、澱粉及び澱粉加水分解物の合計濃度(澱粉としての換算濃度)が0.03重量%以下である、(1)の方法。
(3) 食品試料中のアミラーゼ活性が100 mU/ml以下である、(1)又は(2)の方法。
(4) 食品試料中の澱粉及び/又は澱粉加水分解が、糊化澱粉及び/又は糊化澱粉の加水分解物を含有する、(1)〜(3)のいずれかの方法。
(5) 食品試料が、糊化澱粉及び/又は糊化澱粉の加水分解物を含有する流動性食品である、(4)の方法。
(7) 食品試料が無機塩類を更に含有し、且つ
工程1が、食品試料から無機塩類を除去することを更に含む
(1)〜(6)のいずれかの方法。
(8) 工程2が、
アミラーゼ活性測定用試料と、アミラーゼ活性の存在下で蛍光物質を遊離可能な基質とを反応させる工程2-1と、
工程2-1後の反応系から前記蛍光物質を分離する工程2-2と、
分離された蛍光物質を検出する工程2-3と
を含む、(1)〜(7)のいずれかの方法。
本発明において活性が分析される「アミラーゼ」とは、澱粉を加水分解する酵素の総称である。アミラーゼとしては具体的にα-アミラーゼ、β-アミラーゼ、グルコアミラーゼ、プルラナーゼ、イソアミラーゼ、グルコシダーゼ等が包含される。アミラーゼの起源は、ヒト及び動物類の唾液、洗剤、蜂蜜、野菜、肉類、微生物等が挙げられる。
本発明で分析対象として用いる食品試料は、澱粉及び/又は澱粉加水分解物を含有する食品試料であれば特に限定されない。
本発明の工程1は、食品試料中に存在し得るアミラーゼを含有し、澱粉及び/又は澱粉加水分解物を実質的に含有しないアミラーゼ活性測定用試料を調製する工程である。工程1は、分析対象とする食品試料から、該食品試料中に存在し得るアミラーゼを含有する画分を、澱粉及び/又は澱粉加水分解物とは分離されるように取得する工程を少なくとも含む。
工程1では、「分析対象とする食品試料から、該食品試料中に存在し得るアミラーゼを含有する画分を、澱粉及び/又は澱粉加水分解物とは分離されるように取得する」工程1-3を必須の工程とする。工程1-3で得られた画分はそれ自体をアミラーゼ活性測定用試料として使用しても良いし、該画分に、必要に応じて、水等の溶媒や、アミラーゼ安定化のための成分(例えばウシ血清アルブミン)等の他の成分を適宜添加してアミラーゼ活性測定用試料としてもよい。工程1は、必要に応じて、水不溶性成分を除去する工程1-1、塩類を除去する工程1-2、画分を安定化する工程1-4等の任意の工程を行うことができる。図1に示す工程1-1〜工程1-4の順序は一例であり、この順序には限定されない。
工程2は、アミラーゼ活性測定用試料中のアミラーゼ活性を測定する工程である。工程2を実施するための手段は特に限定されないが、アミラーゼ活性測定用試料中のアミラーゼ活性は通常は微弱であることから、アミラーゼ活性の存在下で蛍光物質を遊離することが可能な基質(以下「蛍光基質」ともいう)を用いることが好ましい。蛍光基質としては、BODIPY(商標)基が修飾された消光澱粉(未反応時は蛍光発光性を示さないが、アミラーゼ活性による反応生成物が蛍光発光性を示す澱粉)、ピリジルアミン基が修飾されたデキストリン等が挙げられる。
この実施形態では工程2は、
アミラーゼ活性測定用試料と蛍光基質とを反応させる工程2-1と、
工程2-1後の反応系から、蛍光基質から遊離した蛍光物質を分離する工程2-2と、
分離された蛍光物質を検出する工程2-3と
を含む。
試料は1.1%食塩含有3%澱粉液、及びカレーソースを用意した。
1.1%食塩含有3%澱粉液は、食塩1.1%、小麦澱粉3%を含む水を5分間煮込んでスラリー状とし調製したものである。カレーソースは市販のカレー用ルウ10%を5分間煮込んだものであり、1.1%の食塩と3%の小麦澱粉を含む。各試料を小分けしてオートクレーブ121℃で15分間殺菌後に保存した。分析する前に、100℃水浴で5分間加熱した後、40℃水浴で30分間冷却した。
インキュベート直後の試料を20,000×gで10分間遠心分離、上清を5B濾紙でろ過した溶液を抽出液とした。
(1) アミラーゼ精製液中の澱粉濃度を分析した。1.1%食塩含有3%小麦澱粉液に10 mU/mlとなるようにアミラーゼを添加、40℃で30分間インキュベートした分析試料を、上記の通り抽出、脱塩カラム、陰イオン交換カラムで精製した。アミラーゼ精製液50μlと2 mMよう素溶液50μlを混合し、マイクロプレートリーダー(DSファーマ製)、検出波長620 nmで測定した。検量線用の標準試料は0.0003〜0.03% 小麦澱粉液 (糊化したもの) を用いた。
インキュベート直後の分析試料を0.2 mg/ml DQ(商標)スターチ基質50μlと混合し、室温、暗所で30分間反応させた。反応後の蛍光基質分解物をマイクロプレートリーダー、検出波長Ex 485 nm、Em 528 nmで測定した。
<アミラーゼの回収率>
1.1%食塩含有3%澱粉液、カレーソースに添加したアミラーゼ活性の回収率を表1、表2にそれぞれ示した。本発明の分析法では、回収率は一般的な酵素実験の目安である50%を上回っており、分析試料中のアミラーゼの活性に応じた蛍光基質分解物の蛍光強度を測定することができた。本発明の分析法は、従来法では全く検出できなかった10-100 mU/mlのアミラーゼ活性を定量することができた。すなわち、本発明の分析法では、従来法とは異なり、アミラーゼと蛍光基質の反応を競合阻害する澱粉及び糖類、並びに、蛍光基質分解物の検出を阻害する未反応の蛍光基質及び食品由来の色素、の双方を除去したことで、澱粉含有食品中の低濃度のアミラーゼ活性を定量することが可能である。なお、100 mU/mlより高濃度のアミラーゼ活性を持つ澱粉含有食品が試料である場合は、試料を希釈してから蛍光基質反応させることで定量が可能である。
(1) 10 mU/mlアミラーゼを含む分析試料の精製液中の澱粉濃度は0.006%であった。本分析法の精製は分析試料中の澱粉を十分に除去することができた。
(2) 10 mU/mlアミラーゼに澱粉を混在させたときのアミラーゼ回収率は、0.003% 澱粉では74%、0.03%澱粉では57%であった。よって、分析試料中の澱粉濃度を0.03%以下にまで除去すると、分析試料中のアミラーゼの活性を検出することができる。
Claims (7)
- 澱粉及び/又は澱粉加水分解物からなる成分を含有する食品試料中のアミラーゼ活性を分析する方法であって、
分析対象とする食品試料から、該食品試料中にアミラーゼが存在する場合には該アミラーゼを含有することとなる画分を、前記成分とは分離されるように取得することを含む、該食品試料中にアミラーゼが存在する場合には該アミラーゼを含有し、前記成分を実質的に含有しないアミラーゼ活性測定用試料を調製する工程1と、
アミラーゼ活性測定用試料中のアミラーゼ活性を測定する工程2と
を含み、
食品試料中の前記成分が、糊化澱粉及び/又は糊化澱粉の加水分解物を含有する
前記方法。 - アミラーゼ活性測定用試料における、澱粉及び澱粉加水分解物の合計濃度(澱粉としての換算濃度)が0.03重量%以下である、請求項1の方法。
- 食品試料中のアミラーゼ活性が100 mU/ml以下である、請求項1又は2の方法。
- 食品試料が流動性食品である、請求項1〜3のいずれか1項の方法。
- 工程1における前記画分の取得が、陰イオン交換クロマトグラフィー、陽イオン交換クロマトグラフィー、硫酸アンモニウム沈殿、親和性クロマトグラフィー、イムノクロマトグラフィー、及び、固定化酵素による前記成分の加水分解からなる群から選択される少なくとも1つの手段を用いて行われる、請求項1〜4のいずれか1項の方法。
- 食品試料が無機塩類を更に含有し、且つ
工程1が、食品試料から前記画分を取得するよりも前に、食品試料から無機塩類を除去することを更に含み、
工程1における前記画分の取得が、陰イオン交換クロマトグラフィーおよび陽イオン交換クロマトグラフィーからなる群から選択される少なくとも1つの手段を用いて行われる、
請求項1〜5のいずれか1項の方法。 - 工程2が、
アミラーゼ活性測定用試料と、アミラーゼ活性の存在下で蛍光物質を遊離可能な基質とを反応させる工程2-1と、
工程2-1後の反応系から前記蛍光物質を分離する工程2-2と、
分離された蛍光物質を検出する工程2-3と
を含む、請求項1〜6のいずれか1項の方法。
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