JP5837761B2 - Classification of Crohn's disease activity - Google Patents
Classification of Crohn's disease activity Download PDFInfo
- Publication number
- JP5837761B2 JP5837761B2 JP2011106270A JP2011106270A JP5837761B2 JP 5837761 B2 JP5837761 B2 JP 5837761B2 JP 2011106270 A JP2011106270 A JP 2011106270A JP 2011106270 A JP2011106270 A JP 2011106270A JP 5837761 B2 JP5837761 B2 JP 5837761B2
- Authority
- JP
- Japan
- Prior art keywords
- disease
- crohn
- activity
- subject
- bacteria
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Active
Links
- 208000011231 Crohn disease Diseases 0.000 title claims description 109
- 230000009266 disease activity Effects 0.000 title claims description 19
- 238000000034 method Methods 0.000 claims description 82
- 241000894006 Bacteria Species 0.000 claims description 79
- 230000000694 effects Effects 0.000 claims description 57
- 239000012634 fragment Substances 0.000 claims description 42
- 230000000968 intestinal effect Effects 0.000 claims description 34
- 244000005709 gut microbiome Species 0.000 claims description 32
- 235000015097 nutrients Nutrition 0.000 claims description 25
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 claims description 20
- 230000006698 induction Effects 0.000 claims description 19
- 238000012423 maintenance Methods 0.000 claims description 16
- 238000007894 restriction fragment length polymorphism technique Methods 0.000 claims description 12
- 238000007477 logistic regression Methods 0.000 claims description 10
- 201000010099 disease Diseases 0.000 claims description 8
- 208000037265 diseases, disorders, signs and symptoms Diseases 0.000 claims description 8
- 230000001580 bacterial effect Effects 0.000 claims description 7
- 239000003795 chemical substances by application Substances 0.000 claims description 6
- 235000016709 nutrition Nutrition 0.000 claims description 6
- 230000003321 amplification Effects 0.000 claims description 5
- 238000003199 nucleic acid amplification method Methods 0.000 claims description 5
- 230000035764 nutrition Effects 0.000 claims description 5
- 230000008569 process Effects 0.000 claims description 5
- 238000012216 screening Methods 0.000 claims description 5
- 238000000605 extraction Methods 0.000 claims description 4
- 238000003776 cleavage reaction Methods 0.000 claims description 2
- 230000007017 scission Effects 0.000 claims description 2
- 108020004414 DNA Proteins 0.000 description 32
- 108091008146 restriction endonucleases Proteins 0.000 description 24
- 239000000523 sample Substances 0.000 description 20
- 230000001965 increasing effect Effects 0.000 description 13
- 108020004465 16S ribosomal RNA Proteins 0.000 description 11
- 230000003247 decreasing effect Effects 0.000 description 6
- 239000000872 buffer Substances 0.000 description 5
- 239000000725 suspension Substances 0.000 description 5
- 241000305071 Enterobacterales Species 0.000 description 4
- 206010061218 Inflammation Diseases 0.000 description 4
- 238000003745 diagnosis Methods 0.000 description 4
- 239000003814 drug Substances 0.000 description 4
- 230000004054 inflammatory process Effects 0.000 description 4
- BZTDTCNHAFUJOG-UHFFFAOYSA-N 6-carboxyfluorescein Chemical compound C12=CC=C(O)C=C2OC2=CC(O)=CC=C2C11OC(=O)C2=CC=C(C(=O)O)C=C21 BZTDTCNHAFUJOG-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 208000025865 Ulcer Diseases 0.000 description 3
- 239000003153 chemical reaction reagent Substances 0.000 description 3
- 229940079593 drug Drugs 0.000 description 3
- 208000028774 intestinal disease Diseases 0.000 description 3
- 239000006041 probiotic Substances 0.000 description 3
- 235000018291 probiotics Nutrition 0.000 description 3
- 230000002441 reversible effect Effects 0.000 description 3
- 231100000397 ulcer Toxicity 0.000 description 3
- 206010012735 Diarrhoea Diseases 0.000 description 2
- 230000005856 abnormality Effects 0.000 description 2
- 230000009798 acute exacerbation Effects 0.000 description 2
- 239000003242 anti bacterial agent Substances 0.000 description 2
- 229940088710 antibiotic agent Drugs 0.000 description 2
- 239000011324 bead Substances 0.000 description 2
- 238000010170 biological method Methods 0.000 description 2
- 230000008859 change Effects 0.000 description 2
- HVYWMOMLDIMFJA-DPAQBDIFSA-N cholesterol Chemical compound C1C=C2C[C@@H](O)CC[C@]2(C)[C@@H]2[C@@H]1[C@@H]1CC[C@H]([C@H](C)CCCC(C)C)[C@@]1(C)CC2 HVYWMOMLDIMFJA-DPAQBDIFSA-N 0.000 description 2
- 238000012136 culture method Methods 0.000 description 2
- 230000036425 denaturation Effects 0.000 description 2
- 238000004925 denaturation Methods 0.000 description 2
- 238000003935 denaturing gradient gel electrophoresis Methods 0.000 description 2
- 238000003748 differential diagnosis Methods 0.000 description 2
- 230000002068 genetic effect Effects 0.000 description 2
- 230000028993 immune response Effects 0.000 description 2
- 230000001939 inductive effect Effects 0.000 description 2
- 230000002757 inflammatory effect Effects 0.000 description 2
- 230000001788 irregular Effects 0.000 description 2
- 238000012986 modification Methods 0.000 description 2
- 230000004048 modification Effects 0.000 description 2
- 230000001575 pathological effect Effects 0.000 description 2
- 230000007170 pathology Effects 0.000 description 2
- 238000011160 research Methods 0.000 description 2
- 238000012795 verification Methods 0.000 description 2
- QKNYBSVHEMOAJP-UHFFFAOYSA-N 2-amino-2-(hydroxymethyl)propane-1,3-diol;hydron;chloride Chemical compound Cl.OCC(N)(CO)CO QKNYBSVHEMOAJP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 208000004998 Abdominal Pain Diseases 0.000 description 1
- 108010088751 Albumins Proteins 0.000 description 1
- 102000009027 Albumins Human genes 0.000 description 1
- 108020000946 Bacterial DNA Proteins 0.000 description 1
- 208000009137 Behcet syndrome Diseases 0.000 description 1
- 206010009900 Colitis ulcerative Diseases 0.000 description 1
- 102000016928 DNA-directed DNA polymerase Human genes 0.000 description 1
- 108010014303 DNA-directed DNA polymerase Proteins 0.000 description 1
- KCXVZYZYPLLWCC-UHFFFAOYSA-N EDTA Chemical compound OC(=O)CN(CC(O)=O)CCN(CC(O)=O)CC(O)=O KCXVZYZYPLLWCC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 108090000790 Enzymes Proteins 0.000 description 1
- 102000004190 Enzymes Human genes 0.000 description 1
- 241000588724 Escherichia coli Species 0.000 description 1
- 206010060891 General symptom Diseases 0.000 description 1
- 208000034826 Genetic Predisposition to Disease Diseases 0.000 description 1
- 102100036263 Glutamyl-tRNA(Gln) amidotransferase subunit C, mitochondrial Human genes 0.000 description 1
- 206010018691 Granuloma Diseases 0.000 description 1
- 101001001786 Homo sapiens Glutamyl-tRNA(Gln) amidotransferase subunit C, mitochondrial Proteins 0.000 description 1
- -1 M63 Proteins 0.000 description 1
- 240000007594 Oryza sativa Species 0.000 description 1
- 235000007164 Oryza sativa Nutrition 0.000 description 1
- ISWSIDIOOBJBQZ-UHFFFAOYSA-N Phenol Chemical compound OC1=CC=CC=C1 ISWSIDIOOBJBQZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000007983 Tris buffer Substances 0.000 description 1
- 201000006704 Ulcerative Colitis Diseases 0.000 description 1
- QCWXUUIWCKQGHC-UHFFFAOYSA-N Zirconium Chemical compound [Zr] QCWXUUIWCKQGHC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 238000000137 annealing Methods 0.000 description 1
- KCXMKQUNVWSEMD-UHFFFAOYSA-N benzyl chloride Chemical compound ClCC1=CC=CC=C1 KCXMKQUNVWSEMD-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229940073608 benzyl chloride Drugs 0.000 description 1
- 238000001574 biopsy Methods 0.000 description 1
- 239000008280 blood Substances 0.000 description 1
- 210000004369 blood Anatomy 0.000 description 1
- 235000012000 cholesterol Nutrition 0.000 description 1
- 230000001684 chronic effect Effects 0.000 description 1
- 238000007796 conventional method Methods 0.000 description 1
- 238000012258 culturing Methods 0.000 description 1
- 230000001351 cycling effect Effects 0.000 description 1
- 238000001514 detection method Methods 0.000 description 1
- 238000011161 development Methods 0.000 description 1
- 238000010586 diagram Methods 0.000 description 1
- 235000015872 dietary supplement Nutrition 0.000 description 1
- 230000004069 differentiation Effects 0.000 description 1
- 230000001079 digestive effect Effects 0.000 description 1
- 230000008030 elimination Effects 0.000 description 1
- 238000003379 elimination reaction Methods 0.000 description 1
- 238000001839 endoscopy Methods 0.000 description 1
- 230000002550 fecal effect Effects 0.000 description 1
- 239000007850 fluorescent dye Substances 0.000 description 1
- 230000002496 gastric effect Effects 0.000 description 1
- 238000001502 gel electrophoresis Methods 0.000 description 1
- 239000011544 gradient gel Substances 0.000 description 1
- ZRALSGWEFCBTJO-UHFFFAOYSA-O guanidinium Chemical compound NC(N)=[NH2+] ZRALSGWEFCBTJO-UHFFFAOYSA-O 0.000 description 1
- 239000004615 ingredient Substances 0.000 description 1
- 201000008267 intestinal tuberculosis Diseases 0.000 description 1
- 210000003750 lower gastrointestinal tract Anatomy 0.000 description 1
- 235000012054 meals Nutrition 0.000 description 1
- 239000000203 mixture Substances 0.000 description 1
- 108020004707 nucleic acids Proteins 0.000 description 1
- 150000007523 nucleic acids Chemical class 0.000 description 1
- 102000039446 nucleic acids Human genes 0.000 description 1
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 description 1
- 238000011002 quantification Methods 0.000 description 1
- 238000002601 radiography Methods 0.000 description 1
- 230000009467 reduction Effects 0.000 description 1
- 238000000611 regression analysis Methods 0.000 description 1
- 108020004418 ribosomal RNA Proteins 0.000 description 1
- 235000009566 rice Nutrition 0.000 description 1
- 238000004062 sedimentation Methods 0.000 description 1
- 238000010187 selection method Methods 0.000 description 1
- 238000001356 surgical procedure Methods 0.000 description 1
- 208000024891 symptom Diseases 0.000 description 1
- LENZDBCJOHFCAS-UHFFFAOYSA-N tris Chemical compound OCC(N)(CO)CO LENZDBCJOHFCAS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 241001148471 unidentified anaerobic bacterium Species 0.000 description 1
- 210000002438 upper gastrointestinal tract Anatomy 0.000 description 1
- 229910052726 zirconium Inorganic materials 0.000 description 1
Images
Landscapes
- Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)
- Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)
Description
本発明は、クローン病の活動性の分類に関するものである。 The present invention relates to the classification of Crohn's disease activity.
クローン病は、病因が未だ明確になっていない慢性腸疾患であり、難治性特定疾患に指定されている。クローン病は、炎症症状の急性増悪・再燃（炎症の悪化）と寛解（炎症の緩和〉を繰り返し、長い経過のなかで徐々に病気が進行していく疾患であり、現在のところ病気を完治させる治療法は見つかっていない。 Crohn's disease is a chronic intestinal disease whose etiology has not yet been clarified and has been designated as an intractable specific disease. Crohn's disease is a disease in which the disease progresses gradually over a long period of time, repeating acute exacerbation / relapse of inflammation (aggravation of inflammation) and remission (reduction of inflammation). No cure has been found.
治療方針としては、速やかにクローン病か否かの鑑別診断を行い、診断後には早期に炎症症状（活動期、急性増悪期、開始期）を緩和（寛解導入）し、再燃を予防（寛解維持）することで、ＱＯＬを高めることに主眼がおかれる。 As a treatment policy, differential diagnosis is promptly performed for Crohn's disease, and after the diagnosis, inflammation symptoms (active phase, acute exacerbation phase, start phase) are alleviated (induction of remission) and relapse is prevented (remission is maintained) ) Will focus on increasing QOL.
クローン病の鑑別診断は、臨床所見を把握して、消化管Ｘ線造影検査、内視鏡検査、生検を行うことにより、縦走潰瘍、敷石像および非乾酪性類上皮細胞肉芽腫のような主要所見、および、縦列する不整形潰瘍またはアフタ、上部消化管と下部消化管の両者に認められる不整形潰瘍またはアフタのような副所見の有無を確認し、これら所見に基づいて、鑑別が行われてきた（例えば、非特許文献１参照）。しかしながら、特異的な所見は無く、確定診断は消去法で行われており、特に潰瘍性大腸炎、ベーチェット病や腸結核との鑑別が重要とされる。 Differential diagnosis of Crohn's disease is based on clinical findings, such as gastrointestinal radiography, endoscopy, and biopsy, such as longitudinal ulcers, paving stones, and non-caseating epithelioid cell granuloma The main findings and the presence or absence of minor irregularities such as irregular ulcers or after, or irregular ulcers or after found in both the upper and lower gastrointestinal tract are identified, and based on these findings, discrimination is performed. (For example, refer nonpatent literature 1). However, there are no specific findings, and the definitive diagnosis is performed by the elimination method. In particular, differentiation from ulcerative colitis, Behcet's disease and intestinal tuberculosis is important.
クローン病と診断された場合、活動期（開始期）には寛解導入を目的とした治療が行われ、いったん寛解導入されたら長期に寛解を維持することを目的とした治療が行われる。つまり、クローン病が活動期、寛解期（寛解導入期または寛解維持期）のいずれであるかを分類し、その活動性に応じて治療方法を選択するため、治療を行う上でクローン病の活動性の把握が不可欠となっている。現在、クローン病の活動性の分類は、主にＣＤＡＩ（Ｃｒｏｈｎ’ｓ Ｄｉｓｅａｓｅ Ａｃｔｉｖｉｔｙ Ｉｎｄｅｘ）という過去１週間の軟便または下痢の回数、過去１週間の腹痛、過去１週間の主観的な一般症状・患者が現在有している所見等をスコア化する指標を用いて行われ、一般的にＣＤＡＩ≧１５０を活動期、ＣＤＡＩ＜１５０を寛解期と定義している。一方、血沈亢進、ＣＲＰ上昇、血小板増加、アルブミン低下および総コレステロール低下等の臨床検査値の変動に基づいて活動性が分類されることもある。 When Crohn's disease is diagnosed, treatment for the purpose of induction of remission is performed in the active phase (starting phase), and once it has been introduced, treatment for the purpose of maintaining remission for a long time is performed. In other words, Crohn's disease is classified into whether it is active or in remission (remission induction or remission maintenance), and the treatment method is selected according to its activity. Understanding sex is essential. At present, Crohn's disease activity is classified into CDAI (Crown's Disease Activity Index), the number of loose stools or diarrhea in the past week, abdominal pain in the past week, subjective general symptoms / patients in the past week Is performed using an index for scoring the current findings, etc., and generally CDAI ≧ 150 is defined as an active period and CDAI <150 is defined as a remission period. On the other hand, activity may be classified based on changes in clinical laboratory values such as increased blood sedimentation, increased CRP, increased platelets, decreased albumin and decreased total cholesterol.
一方、安藤朗等により、Ｔ−ＲＦＬＰ解析（Ｔｅｒｍｉｎａｌ Ｒｅｓｔｒｉｃｔｉｏｎ Ｆｒａｇｍｅｎｔ Ｌｅｎｇｔｈ Ｐｏｌｙｍｏｒｐｈｉｓｍ）を用いて、腸内細菌の割合や腸内細菌の分類群を解析し、クラスター分類することにより、クローン病患者と健常人が区別可能であることが報告された。しかしながら、得られたクラスター分類は、クローン病の活動性とは関連性がないことが報告されている（非特許文献３）。 On the other hand, Akira Ando et al. Analyzed the proportion of enterobacteria and taxonomic groups of enterobacteria using T-RFLP analysis (Terminal Restriction Fragment Length Polymorphism) and classified them into clusters. Were reported to be distinguishable. However, it has been reported that the obtained cluster classification is not related to the activity of Crohn's disease (Non-patent Document 3).
クローン病の病勢変化の診断（クローン病の活動性の分類）には、高度な医学的知識を有する専門医の判断が必要であり、特に活動性を分類するためにＣＤＡＩを実施する場合には１週間を要するため、クローン病の活動性の決定に至るまでには、かなりの時間を要し、寛解導入のための治療を早期に開始できないでいるのが実情である。本発明の目的は、高度な医学的知識を有することなく、かつ、速やかにクローン病の活動性を分類する方法を提供することにある。 Diagnosis of Crohn's disease state change (Classification of Crohn's disease activity) requires the judgment of a specialist with advanced medical knowledge, especially when CDAI is performed to classify activity. Since it takes weeks, it takes a considerable amount of time to determine the activity of Crohn's disease, and the fact is that treatment for induction of remission cannot be started early. An object of the present invention is to provide a method for quickly classifying the activity of Crohn's disease without having advanced medical knowledge.
このような目的は、下記の本発明により達成される。
（１）被検者の腸内細菌叢を分析することにより、被検者のクローン病の活動性を分類する方法であって、
前記被検者から採取された試料中の前記腸内細菌叢を分析する分析工程と
前記腸内細菌叢に含まれる細菌の種類やその割合に基づいて、前記被検者のクローン病の活動性を分類する工程とを有する、クローン病の活動性を分類する方法。
Such an object is achieved by the present invention described below.
(1) A method for classifying the activity of Crohn's disease in a subject by analyzing the gut microbiota of the subject,
Based on the analysis step of analyzing the gut microbiota in the sample collected from the subject and the type and proportion of bacteria contained in the gut microbiota, the activity of Crohn's disease of the subject And classifying the activity of Crohn's disease.
（２）前記分析工程において、前記腸内細菌叢の分析は、分子生物学的手法を用いて行われる上記（１）に記載のクローン病の活動性を分類する方法。 (2) The method for classifying the activity of Crohn's disease according to (1) above, wherein in the analysis step, the analysis of the intestinal flora is performed using a molecular biological technique.
（３）前記分子生物学的手法は、
前記被験者から採取した試料中に含まれる細菌からＤＮＡを抽出する抽出工程と、
前記ＤＮＡの一部を増幅させる増幅工程と、
増幅された前記ＤＮＡの一部を切断することにより末端制限フラグメントを得る切断工程と、
前記末端制限フラグメントの長さに応じて、前記腸内細菌叢に含まれる細菌の種類を分析する分析工程とを有するＴ−ＲＦＬＰ法である上記（２）に記載のクローン病の活動性を分類する方法。
(3) The molecular biological technique is:
An extraction step of extracting DNA from bacteria contained in the sample collected from the subject;
An amplification step of amplifying a portion of the DNA;
A cleavage step of obtaining a terminal restriction fragment by cleaving a part of the amplified DNA;
According to the length of the terminal restriction fragment, the activity of Crohn's disease described in (2) above is classified as a T-RFLP method having an analysis step of analyzing the type of bacteria contained in the intestinal flora how to.
（４）前記工程において、多変数判別式を用いて、前記被検者のクローン病の活動性を分類する、上記（１）ないし（３）のいずれかに記載のクローン病の活動性を分類する方法。 (4) Classifying the activity of Crohn's disease according to any one of (1) to (3) above, wherein in the step, the activity of Crohn's disease of the subject is classified using a multivariate discriminant. how to.
（５）前記工程において、多変数判別式として、ロジスティック回帰式を用いて、判別値を求め、該判別値に基づいてクローン病の活動性を分類する上記（４）に記載のクローン病の活動性を分類する方法。 (5) The activity of Crohn's disease according to (4), wherein in the step, a discriminant value is obtained using a logistic regression equation as a multivariate discriminant, and the activity of Crohn's disease is classified based on the discriminant value How to classify gender.
（６）前記工程において、前記判別値に基づいてクローン病の活動性を分類ための閾値は、０．５である上記（５）に記載のクローン病の活動性を分類する方法。 (6) The method for classifying the activity of Crohn's disease according to (5) above, wherein in the step, the threshold for classifying Crohn's disease activity based on the discriminant value is 0.5.
（７）前記工程において、多変数判別式を用いて、前記被験者がクローン病の活動期または寛解期のいずれであるかを分類する上記（１）ないし（６）のいずれかに記載のクローン病の活動性を分類する方法。 (7) The Crohn's disease according to any one of (1) to (6) above, wherein in the step, the subject is classified as having an active phase or a remission phase of Crohn's disease using a multivariate discriminant. How to classify activity.
（８）クローン病の活動性に適した栄養剤を選択する方法において、
（ａ）前記被検者から採取された試料中の前記腸内細菌叢を分析する分析工程、
（ｂ）前記腸内細菌叢に含まれる細菌やその割合に基づいて、前記被検者のクローン病の活動性を分類する工程、
（ｃ）被験者のクローン病の活動性が活動期と分類された場合には寛解導入に適した栄養剤を選択し、被験者のクローン病の活動性が寛解期と分類された場合には寛解維持に適した栄養剤を選択する工程
を含むクローン病の活動性に適した栄養剤を選択する方法。
(8) In a method for selecting a nutrient suitable for Crohn's disease activity,
(A) an analysis step of analyzing the intestinal bacterial flora in a sample collected from the subject;
(B) classifying the activity of Crohn's disease of the subject based on the bacteria contained in the intestinal flora and the ratio thereof;
(C) If the subject's Crohn's disease activity is classified as active, select a nutrient suitable for remission induction; if the subject's Crohn's disease activity is classified as remission, maintain remission A method for selecting a nutrient suitable for Crohn's disease activity, comprising the step of selecting a nutrient suitable for the disease.
（９）クローン病の活動性に影響を与える栄養剤のスクリーニング方法において、
（ａ）前記被検者から採取された栄養剤の投与前と投与後の試料中の前記腸内細菌叢を分析する分析工程、
（ｂ）前記腸内細菌叢に含まれる細菌やその割合に基づいて、前記被検者のクローン病の活動性を分類する工程、
（ｃ）栄養剤投与前のクローン病の活動性と栄養剤投与後のクローン病の活動性とを比較し、投与によりクローン病の活動性を変化させる栄養剤を選択する工程
を含むスクリーニング方法。
(9) In a method for screening a nutrient that affects the activity of Crohn's disease,
(A) an analysis step of analyzing the intestinal microflora in a sample before and after administration of a nutrient collected from the subject;
(B) classifying the activity of Crohn's disease of the subject based on the bacteria contained in the intestinal flora and the ratio thereof;
(C) A screening method comprising a step of comparing the activity of Crohn's disease before administration of a nutrient and the activity of Crohn's disease after administration of the nutrient, and selecting a nutrient that changes the activity of Crohn's disease by administration.
（１０）上記（９）に記載のスクリーニング方法により選択された、クローン病の活動性を変化させる栄養剤。 (10) A nutrient that changes the activity of Crohn's disease, selected by the screening method according to (9) above.
（１１）寛解期のクローン病患者と比較して活動期のクローン病患者において減少している細菌又はその細菌を増加させるための薬剤を含む、活動期のクローン病患者の寛解導入剤。 (11) A remission-inducing agent for patients with Crohn's disease in active phase, comprising a bacterium that is decreasing in patients with Crohn's disease in active phase compared with patients with Crohn's disease in remission phase or an agent for increasing the bacteria.
（１２）寛解期のクローン病患者と比較して活動期のクローン病患者において増加している細菌を減少させるための薬剤を含む、活動期のクローン病患者の寛解導入剤。 (12) A remission inducing agent for patients with active Crohn's disease, comprising an agent for reducing bacteria that are increasing in patients with Crohn's disease in active stages compared with patients with Crohn's disease in remission.
（１３）被検者から採取された試料中の腸内細菌叢に含まれる細菌の種類やその割合を分析するための手段を含む、
クローン病の活動性を分類するためのキット。
(13) including means for analyzing the type and proportion of bacteria contained in the intestinal flora in a sample collected from a subject,
Kit for classifying Crohn's disease activity.
本発明によれば、被検者の腸内細菌叢を分析することで、高度な医学的知識を有することなく、かつ、速やかにクローン病の活動性の分類を行うことができる。 According to the present invention, by analyzing the intestinal bacterial flora of a subject, the activity of Crohn's disease can be quickly classified without having advanced medical knowledge.
以下、本発明の被検者のクローン病の活動性を分類する方法を好適実施形態に基づいて詳細に説明する。
本発明のクローン病の活動性を分類する方法は、被検者の腸内細菌叢を分析することにより、被検者のクローン病の活動性を分類する方法であり、被検者から採取された試料中の腸内細菌叢を分析する分析工程と、腸内細菌叢に含まれると推察される細菌の種類に基づいて、被検者のクローン病の病態を判別する工程とを有することを特徴とする。
Hereinafter, the method for classifying the activity of Crohn's disease in a subject according to the present invention will be described in detail based on preferred embodiments.
The method for classifying the activity of Crohn's disease of the present invention is a method for classifying the activity of Crohn's disease of a subject by analyzing the gut microbiota of the subject, which is collected from the subject. Analyzing the gut microbiota in the sample, and determining the pathological condition of the subject's Crohn's disease based on the type of bacteria presumed to be contained in the gut microbiota. Features.
かかる分類方法によれば、被検者の腸内細菌叢を分析して、腸内細菌叢に含まれる細菌の種類を推察することにより、高度な医学的知識を有することなく、かつ、速やかにクローン病の活動性を分類することができる。 According to such a classification method, by analyzing the intestinal microflora of the subject and inferring the type of bacteria contained in the intestinal microflora, it is possible to quickly and without having advanced medical knowledge. The activity of Crohn's disease can be classified.
また、本実施形態の方法により、患者（被検者）が活動期または寛解期（寛解導入期または寛解維持期）であるかを分類することにより、その病態に適した栄養剤を選択し、患者に投与することが可能となる。例えば、活動期であると分類された場合は、中心静脈栄養および経腸栄養により経過観察する必要があることから、適した栄養剤の剤形として点滴または点滴＋経腸栄養剤を選択することができる。さらに、活動期には積極的に腸内菌叢を変える、抗生剤やプロバイオティクスとの併用や、プロバイオティクスとしての栄養剤を選択することもできる。 Further, by classifying whether the patient (subject) is in the active phase or in remission (remission induction phase or remission maintenance phase) by the method of the present embodiment, a nutrient suitable for the disease state is selected, It can be administered to patients. For example, if you are classified as active, it is necessary to follow up with central parenteral and enteral nutrition, so choose a drip or drip + enteral nutrient as the appropriate nutritional form Can do. Furthermore, during the active period, it is possible to select a combination of antibiotics and probiotics that actively change the intestinal flora, and a nutrient as probiotics.
また、寛解期であると分類された場合は、経腸栄養剤または経腸栄養剤＋米飯を中心とした食事を選択することができる。経腸栄養剤としては、成分栄養剤や消化態栄養剤が挙げられる。 In addition, when it is classified as being in remission, a meal centered on enteral nutrition or enteral nutrition + cooked rice can be selected. Examples of enteral nutrients include ingredient nutrients and digestive nutrients.
また、従来の方法では、クローン病の活動性を決定するまでにかなりの時間を要したことから、投与した栄養剤の影響を経時的に観察することは困難であったが、本実施形態の方法では、患者（被検者）が活動期または寛解期（寛解導入期または寛解維持期）であるかを速やかに分類できることから、他の因子による影響を最小限にし、投与された栄養剤の影響を観察することができる。さらに、本実施形態の方法では、患者（被検者）が活動期、寛解期（寛解導入期または寛解維持期）であるかを速やかに分類できることから、クローン病の活動性に影響を与える栄養剤を速やかにスクリーニングすることも可能となった。 Further, in the conventional method, since it took a considerable time to determine the activity of Crohn's disease, it was difficult to observe the influence of the administered nutrient over time. The method can quickly classify whether a patient (subject) is active or in remission (induction or maintenance of remission), minimizing the effects of other factors, and The effect can be observed. Furthermore, in the method of the present embodiment, it is possible to quickly classify whether a patient (subject) is in an active phase or a remission phase (remission induction phase or remission maintenance phase), and thus nutrition that affects the activity of Crohn's disease. It has also become possible to screen agents quickly.
また、以下の実施例に記載されるように、活動期のクローン病患者、寛解期のクローン病患者の間で特定の細菌の割合が異なる傾向が示された。このことは、活動期のクローン病患者の腸内細菌叢を寛解期のクローン病患者の腸内細菌叢へと近づけることにより、クローン病患者を寛解導入させる可能性を示している。
寛解期のクローン病患者と比較して活動期のクローン病患者において減少している細菌の割合を増加させて、寛解期のクローン病患者の腸内細菌叢へと近づけることにより、活動期のクローン病患者を寛解導入させる可能性を示している。そのような細菌の割合を増加させる手段としては、減少した細菌そのものの投与や、減少した細菌の割合を増加させることができる薬剤の投与などが考えられる。寛解期のクローン病患者と比較して活動期のクローン病患者において割合が減少している細菌としては、例えば末端制限フラグメントとしてＨ５７、Ｈ１８６、Ｈ３２０、Ｈ３７６、Ｈ５６１、Ｈ６０３、Ｈ１０７９、Ｍ８１、Ｍ９６、Ｍ１３３、Ｍ１９０、Ｍ２０２、Ｍ２２１、Ｍ２９７、Ｍ３０２、Ｍ９０２にピークを持つ細菌群が挙げられる。
一方、寛解期のクローン病患者と比較して活動期のクローン病患者において増加している細菌の割合を減少させて、寛解期のクローン病患者の腸内細菌叢へと近づけることにより、活動期のクローン病患者を寛解導入させる可能性を示している。そのような細菌の割合を減少させる手段としては、増加した細菌の割合を減少させることができる薬剤の投与などが考えられる。寛解期のクローン病患者と比較して活動期のクローン病患者において割合が増加している細菌としては、例えば末端制限フラグメントとしてＨ２１４、Ｈ２２６、Ｈ５７９、Ｍ３２、Ｍ６３、Ｍ７０、Ｍ９０、Ｍ９４、Ｍ１４２、Ｍ１６６、Ｍ２８５、Ｍ４９４、Ｍ４９９、Ｍ５５６、Ｍ５６３にピークを持つ細菌群が挙げられる。
特定の細菌の割合を増加又は減少させることができる薬剤は、Ｔ−ＲＦＬＰ解析を用いた腸内細菌の割合や腸内細菌の分類群を解析する技術を用いて、抗生剤やプロバイオティクスとしての栄養剤などからスクリーニングすることができる。
In addition, as described in the following examples, there was a tendency that the proportion of specific bacteria was different between patients with Crohn's disease in active phase and those with Crohn's disease in remission. This indicates the possibility of introducing remission of patients with Crohn's disease by bringing the intestinal flora of Crohn's disease patients in active phase closer to that of Crohn's disease patients in remission.
By increasing the percentage of bacteria that are decreasing in patients with Crohn's disease in active phase compared to those in Crohn's disease in remission, it is closer to the intestinal flora of patients with Crohn's disease in remission. It shows the possibility of introducing remission in patients with illness. As means for increasing the ratio of such bacteria, administration of the reduced bacteria themselves or administration of a drug capable of increasing the ratio of the decreased bacteria can be considered. Bacteria having a reduced proportion in patients with Crohn's disease in active phase compared with those in Crohn's disease in remission include, for example, H57, H186, H320, H376, H561, H603, H1079, M81, M96 as terminal restriction fragments. Examples include a group of bacteria having peaks at M133, M190, M202, M221, M297, M302, and M902.
On the other hand, by reducing the percentage of bacteria increasing in active Crohn's disease patients compared to those in Crohn's disease in remission, it is closer to the intestinal flora of patients with Crohn's disease in remission. This indicates the possibility of introducing remission in patients with Crohn's disease. As a means for reducing the percentage of such bacteria, administration of a drug capable of reducing the percentage of increased bacteria can be considered. Bacteria with an increased proportion in patients with Crohn's disease in active phase compared with those in Crohn's disease in remission include, for example, H214, H226, H579, M32, M63, M70, M90, M94, M142 as terminal restriction fragments. Examples include a group of bacteria having peaks at M166, M285, M494, M499, M556, and M563.
Drugs that can increase or decrease the proportion of specific bacteria can be used as antibiotics or probiotics using techniques that analyze the proportion of enterobacteria and taxonomic groups of enterobacteria using T-RFLP analysis. Can be screened from nutritional supplements.
また、一実施態様として、被検者から採取された試料中の腸内細菌叢を分析するための手段を含む、クローン病の活動性を分類するためのキットが提供される。本実施形態のキットを用いることにより、被検者から採取された試料中の腸内細菌叢を分析し、分析された腸内細菌叢に含まれると推察される細菌の種類や割合に基づいて、高度な医学的知識を有することなく、かつ、速やかに被検者のクローン病の病態を判別することができる。
本実施態様のキットにおける上記腸内細菌叢を分析するための手段は、腸内細菌叢に含まれると推測される細菌の種類及び割合を分析するための試薬であってもよく、好ましくは細菌の種類を識別可能なＤＮＡ領域をＰＣＲ法を用いて増幅するためのプライマー又はプローブを含む試薬である。上記のプライマー又はプローブは、蛍光標識されていてもよい。
また、上記手段として、ＤＮＡを切断し、生じた末端制限フラグメントが由来する細菌の種類を推察するための制限酵素であってもよく、そのような制限酵素は、細菌の種類に応じて、切断された末端制限フラグメントの長さに差異が生じるようにＤＮＡを切断する制限酵素であってもよい。
また、上記キットは、採用する検出・定量方法に応じて任意の試薬、バッファー、容器等を含み得る。例えば、ＰＣＲ用には、バッファー、ｄＮＴＰ、ＤＮＡポリメラーゼ及びコントロールＤＮＡ（例えばＥ．ｃｏｌｉの１６ＳｒＤＮＡ）などを含み得る。さらに、採取された試料を保存するためのバッファーを含むバッファー及び／又は指示書をさらに含んでもよい。指示書により、分析された腸内細菌叢の結果に基づいて、医学的知識を用いることなく機械的な判断工程を用いてクローン病の活動性を分類することができる。
In one embodiment, a kit for classifying Crohn's disease activity is provided that includes means for analyzing the gut microbiota in a sample collected from a subject. By using the kit of this embodiment, the intestinal microflora in the sample collected from the subject is analyzed, and based on the type and ratio of bacteria presumed to be included in the analyzed intestinal microflora Thus, it is possible to quickly determine the pathological condition of Crohn's disease in a subject without having advanced medical knowledge.
The means for analyzing the intestinal microflora in the kit of this embodiment may be a reagent for analyzing the type and proportion of bacteria presumed to be contained in the intestinal microflora, preferably bacteria. A reagent containing a primer or a probe for amplifying a DNA region that can be identified by the PCR method using the PCR method. The above primer or probe may be fluorescently labeled.
Further, as the above means, it may be a restriction enzyme for inferring the kind of bacteria from which DNA is cleaved and the resulting terminal restriction fragment is derived, and such restriction enzyme is cleaved according to the kind of bacteria. It may be a restriction enzyme that cleaves DNA so that a difference occurs in the length of the terminal restriction fragments.
Moreover, the said kit can contain arbitrary reagents, a buffer, a container, etc. according to the detection / quantification method employ | adopted. For example, for PCR, a buffer, dNTP, DNA polymerase, control DNA (eg, 16S rDNA of E. coli), and the like can be included. Furthermore, a buffer and / or instructions including a buffer for storing the collected sample may be further included. The instructions can classify Crohn's disease activity using a mechanical decision process without using medical knowledge based on the analyzed gut microbiota results.
以下、本発明のクローン病の活動性を分類する方法の各工程について、順次説明する。
［Ｓ１：被検者から採取された試料中の腸内細菌叢を分析する分析工程］
図１は、試料中の腸内細菌叢を分析する分析工程を説明するための図である。
Hereinafter, each step of the method for classifying the activity of Crohn's disease of the present invention will be described sequentially.
[S1: Analysis step for analyzing intestinal bacterial flora in a sample collected from a subject]
FIG. 1 is a diagram for explaining an analysis process for analyzing an intestinal bacterial flora in a sample.
ここで、腸内細菌叢に含まれる細菌の種類を分析する方法としては、各種手法を用いることができ、特に限定されるものではなく、例えば、培養法や、Ｔ−ＲＦＬＰ法、ＤＧＧＥ（Ｄｅｎａｔｕｒｉｎｇ Ｇｒａｄｉｅｎｔ Ｇｅｌ Ｅｌｅｃｔｒｏｐｈｏｒｅｓｉｓ）法のような分子生物学的手法等を用いることができるが、これらの中でも、分子生物学的手法を用いるのが好ましい。腸内細菌叢には、１００種類にもおよぶ細菌が含まれており、これら多数の細菌を培養法により培養し、その種類を同定することは、これら細菌中には嫌気性細菌等も含まれていることから、その培養条件の設定には困難性を伴うため、時間と労力を非常に要することとなる。これに対して、分子生物学的手法は、ＰＣＲ法により増幅させた特定の遺伝子断片の種類に基づいて腸内細菌叢中の細菌の種類を同定する方法であり、培養法のように培養条件に左右されず、腸内細菌叢中に含まれる細菌を比較的容易に同定することができる。 Here, various methods can be used as a method for analyzing the type of bacteria contained in the intestinal microflora, and are not particularly limited. For example, a culture method, a T-RFLP method, DGGE (Denaturing) A molecular biological technique such as a gradient gel electrophoresis method can be used, and among these, a molecular biological technique is preferably used. The intestinal microflora contains as many as 100 types of bacteria, and culturing many of these bacteria using a culture method and identifying their types includes anaerobic bacteria and the like. Therefore, the setting of the culture conditions is difficult, and time and labor are required. In contrast, the molecular biological method is a method for identifying the type of bacteria in the intestinal flora based on the type of a specific gene fragment amplified by the PCR method. It is possible to identify bacteria contained in the intestinal flora relatively easily.
さらに、上述した分子生物学的手法の中でも、Ｔ−ＲＦＬＰ法を用いるのが好ましい。Ｔ−ＲＦＬＰ法によれば、ＤＧＧＥ法のように、アニーリング温度の違いによりＤＮＡの増幅効率に差が生じてしまうことに起因して、解像度や再現性に間題が生じることがないため、かかる観点から、分子生物学的手法として好適に選択される。 Further, among the molecular biological methods described above, it is preferable to use the T-RFLP method. According to the T-RFLP method, unlike the DGGE method, there is no problem in resolution and reproducibility due to a difference in amplification efficiency of DNA caused by a difference in annealing temperature. From the viewpoint, it is preferably selected as a molecular biological technique.
以上のことから、本実施形態では、腸内細菌叢に含まれる細菌の種類を分析する方法として、Ｔ−ＲＦＬＰ法を用いる場合を一例にして説明する。 From the above, in this embodiment, a case where the T-RFLP method is used as an example will be described as a method for analyzing the types of bacteria contained in the intestinal flora.
（Ｓ１１）まず、被検者から、例えば、糞便等の試料を採取する。
そして、この試料を、バッファー等に懸濁し糞便懸濁液を調製する。
(S11) First, a sample such as stool is collected from the subject.
Then, this sample is suspended in a buffer or the like to prepare a stool suspension.
（Ｓ１２）次に、糞便懸濁液中に含まれる細菌のＤＮＡを抽出することによりＤＮＡ抽出液を得る（抽出工程）。 (S12) Next, a DNA extract is obtained by extracting the bacterial DNA contained in the fecal suspension (extraction step).
この細菌からのＤＮＡの抽出は、例えば、Ｍａｒｍｕｒ法（Ｊ，Ｍａｒｍｕｒ，Ｊ・ＭｏＩ．ＢｉｏＩ．（１９６１）３：２０８−２１８）、酵素法の改良法（Ｇ，Ｖｏｏｒｄｏｕｗｅｔａｌ，Ａｐｐｌｎ．Ｅｌｌｖｉｒｏｎ，Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．（１９９１）５７：３０７０−３０７８）、ベンジルクロライド法（ＮｕｃｌｅｉｃＡｃｉｄｓ Ｒｅｓ．（１９９３〉２１：５２７９−５２８０）、ビーズ・フェノール法（Ｂｉｏｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ（２０００）２８：６４０−６４６）等の各種手法を用いて行われる。 Extraction of DNA from this bacterium can be performed by, for example, the Marmur method (J, Marmur, J. MoI. BioI. (1961) 3: 208-218), an improved enzyme method (G, Voodouwetal, Appln. Ellviron, Microbiol. (1991) 57: 3070-3078), benzyl chloride method (Nucleic Acids Res. (1993> 21: 5279-5280), bead-phenol method (Biotechniques (2000) 28: 640-646). Is called.
（Ｓ１３）次に、ＤＮＡ抽出液中に含まれるＤＮＡの一部を、例えばＰＣＲ法を用いて増幅させる（増幅工程）。 (S13) Next, a part of the DNA contained in the DNA extract is amplified using, for example, the PCR method (amplification step).
ここで、各細菌が備える遺伝情報をコードするＤＮＡは、細菌の特性がその種類に応じて記録されており、細菌毎に特徴的な配列を有している。 Here, the DNA encoding the genetic information included in each bacterium has the characteristics of the bacterium recorded according to its type, and has a characteristic sequence for each bacterium.
そのため、ＰＣＲ法を用いて増輻させるＤＮＡの領域は、腸内細菌叢に含まれる細菌同士間でその配列が相違し、その配列の違いに基づいて細菌の種類を識別可能な領域が選択される。 For this reason, the region of DNA to be amplified using the PCR method is different in sequence among bacteria contained in the intestinal flora, and a region that can identify the type of bacteria is selected based on the difference in sequence. The
このように細菌の種類が識別可能な領域としては、特に限定されないが、例えば、細菌のリボソーマルＲＮＡの１６ＳｒＲＮＡサブユニットをコードした１６ＳｒＤＮＡを用いるのが好ましい。この１６ＳｒＤＮＡは、１５００ｂｐ程度の塩基長を有するものであり、細菌同士間においてわずかながらに配列が相違することから、後工程において、この配列の相違に基づいて、細菌の分析を行うことが可能となる。 The region in which the type of bacteria can be identified is not particularly limited. For example, it is preferable to use 16S rDNA encoding the 16S rRNA subunit of bacterial ribosomal RNA. This 16S rDNA has a base length of about 1500 bp, and since the sequences are slightly different between bacteria, it is possible to analyze bacteria based on this sequence difference in a later step. Become.
そのため、細菌の種類が識別可能な領域として、１６ＳｒＤＮＡを増幅させる場合には、プライマー対（フォアードプライマーおよびリバースプライマー）としては、この１６ＳｒＤＮＡを増幅可能なものが選択され、例えば、配列番号１および配列番号２のプライマー対、配列番号１および配列番号３のプライマー対、配列番号４および配列番号５のプライマー対ならびに配列番号６および配列番号７のプライマー対等を用いることができる。 Therefore, when 16S rDNA is amplified as a region where the type of bacteria can be identified, a primer pair (forward primer and reverse primer) is selected that can amplify this 16S rDNA. For example, SEQ ID NO: 1 and SEQ ID NO: The primer pair of No. 2, the primer pair of SEQ ID No. 1 and SEQ ID No. 3, the primer pair of SEQ ID No. 4 and SEQ ID No. 5, the primer pair of SEQ ID No. 6 and SEQ ID No. 7, and the like can be used.
なお、これらフォアードプライマーおよびリバースプライマーの少なくとも一方の末端を、予め、６−ＦＡＭ（６−カルボキシフルオレセイン）、ＴＥＴ（６−カルボキシ−４，７，２’，７’−テトラクロロフルオレセイン）、ＨＥＸ（６−カルボキシ−２’，４’，７’，４，７−ヘキサクロロフルオレセイン）のような蛍光プローブを用いて蛍光標識しておく。これにより、後工程において、制限酵素により切断された末端制限フラグメント（Ｔ−ＲＦ）の長さを容易に識別することができるようになる。 In addition, at least one end of the forward primer and the reverse primer was previously prepared with 6-FAM (6-carboxyfluorescein), TET (6-carboxy-4,7,2 ′, 7′-tetrachlorofluorescein), HEX ( 6-carboxy-2 ′, 4 ′, 7 ′, 4,7-hexachlorofluorescein) and the like are fluorescently labeled. This makes it possible to easily identify the length of a terminal restriction fragment (T-RF) cleaved by a restriction enzyme in a subsequent step.
また、ＰＣＲ法を用いてＤＮＡの一部を増幅させる際の条件は、特に限定されないが、例えば、変性温度を９４℃として５分間維持し、その後、９４℃×１分間、５５℃×１分間、７２℃×１分間を１サイクルとして、これを３０サイクル行った後、７２℃を５分間維持することとするのが好ましい。 The conditions for amplifying a part of DNA using the PCR method are not particularly limited. For example, the denaturation temperature is maintained at 94 ° C. for 5 minutes, and then 94 ° C. × 1 minute, 55 ° C. × 1 minute. It is preferable to maintain 72 ° C. for 5 minutes after 30 cycles of 72 ° C. × 1 minute.
（Ｓ１４）次に、増幅されたＤＮＡの一部を制限酵素で切断する（切断工程〉。
ここで、腸内細菌叢に含まれる細菌の種類に応じて、１６ＳｒＤＮＡの配列がわずかながらに相違するため、増幅されたＤＮＡを制限酵素で切断すると、制限酵素により切断される部位が細菌毎に異なることとなる。そのため、細菌の種類に応じて、ＤＮＡが切断された末端制限フラグメントの長さに差異が生じる。
(S14) Next, a part of the amplified DNA is cut with a restriction enzyme (cutting step).
Here, since the 16S rDNA sequence slightly differs depending on the type of bacteria contained in the intestinal flora, when the amplified DNA is cleaved with a restriction enzyme, the site cleaved by the restriction enzyme is different for each bacterium. It will be different. Therefore, depending on the type of bacteria, the length of the end restriction fragment from which the DNA has been cleaved varies.
ＤＮＡを切断するための制限酵素としては、特に限定されないが、４塩基認識制限酵素が好ましく用いられ、具体的には、例えば、ＨｈａＩ（配列ＧＣＧＣを認識）、ＭｓｐＩ（配列ＣＣＧＧを認識）、Ｍｂｏｌ（配列ＧＡＴＣを認識）、ＭａｅＩＩ（配列ＡＣＧＴを認識）、ＨｐａＩＩ（配列ＣＣＧＧを認識）およびＲｓａＩ（配列ＧＴＡＣを認識）等が挙げられる。これらの制限酵素によれば、細菌の種類に応じて末端制限フラグメントの長さに差異が生じるように確実にＤＮＡを切断することができる。 The restriction enzyme for cleaving DNA is not particularly limited, but a 4-base recognition restriction enzyme is preferably used. Specifically, for example, HhaI (recognizes the sequence GCGC), MspI (recognizes the sequence CCGG), Mbol (Recognizes the sequence GATC), MaeII (recognizes the sequence ACGT), HpaII (recognizes the sequence CCGG), RsaI (recognizes the sequence GTAC) and the like. According to these restriction enzymes, the DNA can be cleaved reliably so that the length of the end restriction fragment varies depending on the type of bacteria.
（Ｓ１５）次に、ＤＮＡが切断された末端制限フラグメントの長さに応じて、その末端制限フラグメントが由来する細菌の種類を推察することにより、腸内細菌叢に含まれる細菌の種類を分析する（分析工程）。 (S15) Next, according to the length of the terminal restriction fragment whose DNA has been cleaved, the kind of bacteria from which the terminal restriction fragment is derived is analyzed to analyze the kind of bacteria contained in the intestinal flora. (Analysis process).
本実施形態では、上述のように、末端制限フラグメントが蛍光プローブにより蛍光標識されているため、キャピラリーＤＮＡシーケンサーを用いて、切断された末端制限フラグメントの長さを特定することができる。 In this embodiment, as described above, since the end restriction fragment is fluorescently labeled with the fluorescent probe, the length of the cleaved end restriction fragment can be specified using a capillary DNA sequencer.
そして、キャピラリーＤＮＡシーケンサーを用いて検出された末端制限フラグメントの長さから、Ｇｅｎｂａｎｋ（米国）、ＥＭＢＬ（ＥＵ）、ＤＤＢＪ（日本）のような公共データベースに登録されている１６ＳｒＤＮＡの情報に基づいて、その末端制限フラグメント由来する細菌の種類を推察することができる。 Based on the length of the end restriction fragment detected using a capillary DNA sequencer, based on 16S rDNA information registered in public databases such as Genbank (USA), EMBL (EU), DDBJ (Japan), The type of bacteria derived from the end restriction fragment can be inferred.
以上のような工程を経ることにより、Ｔ−ＲＦＬＰ法を用いて、腸内細菌叢に含まれる細菌の種類を推察することができる。 By passing through the above steps, the type of bacteria contained in the intestinal flora can be inferred using the T-RFLP method.
［Ｓ２１被検者のクローン病の活動性を分類する工程］
前記工程［Ｓ１］のようにして、各被検者の試料中に含まれる細菌の種類、すなわち各被検者の腸内細菌叢に含まれる細菌の種類を推察することができる．
[Step of classifying the activity of Crohn's disease in S21 subjects]
As in the step [S1], the type of bacteria contained in each subject's sample, that is, the type of bacteria contained in the gut microbiota of each subject can be inferred.
ここで、現在、クローン病の発症には、遺伝的素因を起因とする免疫応答の異常が関与していると考えられている。 Here, at present, it is considered that abnormalities of immune responses caused by genetic predisposition are involved in the development of Crohn's disease.
本発明者は、かかる点に着目し、腸内細菌叢が、この異常を来した免疫応答の標的となっているものと推察し、患者の腸内細菌叢に含まれる細菌の種類と、健常人の腸内細菌叢に含まれる細菌の種類とを比較検討し、さらには、患者の活動期における腸内細菌叢に含まれる細菌の種類と、患者の寛解期（寛解導入期＋寛解維持期）における腸内細菌叢に含まれる細菌の種類とを比較検討すること、および、患者の活動期における腸内細菌叢に含まれる細菌の種類と、患者の寛解期における腸内細菌叢に含まれる細菌の種類とを比較検討することにより、これら同士の間に含まれている腸内細菌叢の細菌の種類やその割合に基づいて、被検者のクローン病の活動性を分類し得ることを見出し、本発明を完成するに至った。 The inventor pays attention to this point and speculates that the intestinal flora is a target of the immune response that has caused this abnormality, and the type of bacteria contained in the intestinal flora of the patient, Compared with the types of bacteria contained in human gut microbiota, the types of bacteria contained in gut microbiota during the patient's active phase and the patient's remission phase (remission induction phase + remission maintenance phase) ) In the gut microbiota in the gut microbiota and the type of bacteria in the gut microbiota during the patient's active phase and in the gut microbiota during the patient remission By comparing the types of bacteria, the activity of Crohn's disease in the subject can be classified based on the types of bacteria in the intestinal flora contained between them and their proportions. The headline and the present invention were completed.
そこで、本実施形態では、前記工程［Ｓ１］において、腸内細菌叢に含まれる細菌の種類をＴ−ＲＦＬＰ法を用いて分析された分析結果に基づいて、被検者のクローン病の活動性を分類する場合を一例にして説明する。 Therefore, in the present embodiment, the activity of Crohn's disease in the subject based on the analysis result obtained by analyzing the type of bacteria contained in the intestinal flora using the T-RFLP method in the step [S1]. The case of classifying the above will be described as an example.
（Ｓ２１）まず、本発明者は、クローン病と診断された被験者のうち、治療開始前にＣＤＡＩが１５０未満のものを除外し、治療開始前にＣＤＡＩが１５０以上のものを活動期クローン病患者と判断した。 (S21) First, the present inventor excludes subjects diagnosed with Crohn's disease whose CDAI is less than 150 before the start of treatment, and subjects patients with active Crohn's disease who have a CDAI of 150 or more before the start of treatment. It was judged.
また、［Ｓ２１］の活動期クローン病患者に対して、治療を開始して治療により、ＣＤＡＩが１５０未満となったものを寛解導入（寛解導入期）と判断し、さらに、ＣＤＡＩが１５０未満の状態を６〜１２週間以上維持されたものを寛解維持（寛解維持期）と判断した。 In addition, for patients with active Crohn's disease in [S21], when the treatment started and the CDAI was less than 150 due to the treatment, it was determined as remission induction (remission induction period), and the CDAI was less than 150 Those in which the state was maintained for 6 to 12 weeks or more were judged to be in remission maintenance (remission maintenance period).
そして、前記工程［Ｓ１］において説明した手順により、Ｔ−ＲＦＬＰ法を用いた腸内細菌叢に含まれる細菌の種類の分析を、活動期、寛解期（寛解導入期＋寛解維持期）について実施した。 Then, according to the procedure described in the above step [S1], the analysis of the types of bacteria contained in the intestinal flora using the T-RFLP method is performed for the active period and the remission period (remission induction period + remission maintenance period). did.
（Ｓ２２）ここで、本発明者の検討により、前記工程（Ｓ２１）において、各患者の活動期及び寛解期（寛解導入期＋寛解維持期）でそれぞれ観察された、キャピラリーＤＮＡシーケンサーのプロファイルに違いが認められることが判ってきた。すなわち、各細菌に由来する末端制限フラグメント（Ｔ−ＲＦ）のピーク強度（面積値（ＯＴＵ））に違いが認められることが判ってきた。かかる傾向は、前記工程（Ｓ２１〉に用いる制限酵素の種類を代えても同様に認められた。 (S22) Here, according to the study of the present inventors, in the step (S21), the profile of the capillary DNA sequencer observed in each patient's active phase and remission phase (remission induction phase + remission maintenance phase) is different. Has been found to be accepted. That is, it has been found that there is a difference in the peak intensity (area value (OTU)) of the terminal restriction fragment (T-RF) derived from each bacterium. Such a tendency was similarly recognized even when the type of restriction enzyme used in the step (S21) was changed.
その結果、ある特定の細菌に由来する末端制限フラグメントのピーク強度の平均値が、健常人群と患者群間だけでなく、患者群間で異なる傾向が見られた。 As a result, there was a tendency that the average value of peak intensities of terminal restriction fragments derived from a specific bacterium was different not only between the healthy group and the patient group but also between the patient groups.
例えば、制限酵素としてＨｈａＩを用いた場合には、末端制限フラグメントとして、５７ｂｐ（Ｈ５７）、１８６ｂｐ（Ｈ１８６）、２１４ｂｐ（Ｈ２１４）、２２６ｂｐ（Ｈ２２６）、３２０ｂｐ（Ｈ３２０）、３７６ｂｐ（Ｈ３７６）、５６１ｂｐ（Ｈ５６１）、５７９ｂｐ（Ｈ５７９）、６０３ｂｐ（Ｈ６０３）、および１０７９ｂｐ（Ｈ１０７９）の塩基対を有するものに由来するピーク強度が患者群間で異なる傾向が見られた。 For example, when HhaI is used as a restriction enzyme, 57 bp (H57), 186 bp (H186), 214 bp (H214), 226 bp (H226), 320 bp (H320), 376 bp (H376), 561 bp ( There was a tendency for the peak intensities derived from those having base pairs of H561), 579 bp (H579), 603 bp (H603), and 1079 bp (H1079) to differ between patient groups.
また、制限酵素としてＭｓｐＩを用いた場合には、末端制限フラグメントとして、３２ｂｐ（Ｍ３２）、６３ｂｐ（Ｍ６３）、７０ｂｐ（Ｍ７０）、８１ｂｐ（Ｍ８１）、９０ｂｐ（Ｍ９０）、９４ｂｐ（Ｍ９４）、９６ｂｐ（Ｍ９６）、１３３ｂｐ（Ｍ１３３）、１４２ｂｐ（Ｍ１４２）、１６６ｂｐ（Ｍ１６６）、１９０ｂｐ（Ｍ１９０）、２０２ｂｐ（Ｍ２０２）、２２１ｂｐ（Ｍ２２１）、２８５ｂｐ（Ｍ２８５）、２９７ｂｐ（Ｍ２９７）、３０２ｂｐ（Ｍ３０２）、４９４ｂｐ（Ｍ４９４）、４９９ｂｐ（Ｍ４９９）、５５６ｂｐ（Ｍ５５６）、５６３ｂｐ（Ｍ５６３）および９７４ｂｐ（Ｍ９７４）の塩基対を有するものに由来するピーク強度が患者群間で異なる傾向が見られた。 When MspI is used as a restriction enzyme, 32 bp (M32), 63 bp (M63), 70 bp (M70), 81 bp (M81), 90 bp (M90), 94 bp (M94), 96 bp (96 bp) are used as terminal restriction fragments. M96), 133 bp (M133), 142 bp (M142), 166 bp (M166), 190 bp (M190), 202 bp (M202), 221 bp (M221), 285 bp (M285), 297 bp (M297), 302 bp (M302), 494 bp ( M494), 499 bp (M499), 556 bp (M556), 563 bp (M563) and 974 bp (M974) and those having a base pair 974 bp (M974) tend to have different tendencies between patient groups.
（Ｓ２３）前記工程（Ｓ２２）で示したように、末端制限フラグメントに由来するピーク強度が、クローン病の病態に強い相関関係を有していることが判ってきた。 (S23) As shown in the step (S22), it has been found that the peak intensity derived from the terminal restriction fragment has a strong correlation with the pathology of Crohn's disease.
そこで、本発明者は、各患者の活動期ならびに寛解期（寛解導入期および寛解維持期）の各細菌に由来する末端制限フラグメント（Ｔ−ＲＦ）のピーク強度（面積値（ＯＴＵ））を用いて、ＣＤＡＩ≧１５０またはＣＤＡＩ＜１５０を識別する多変数判別式を求めた。 Therefore, the present inventor uses the peak intensity (area value (OTU)) of the terminal restriction fragment (T-RF) derived from each bacterium in the active phase and the remission phase (remission induction phase and remission maintenance phase) of each patient. Thus, a multivariate discriminant for identifying CDAI ≧ 150 or CDAI <150 was obtained.
多変数判別式としては、ロジスティック回帰式、線形判別式および重回帰式等が挙げられるが、本実施形態では、ロジスティック回帰式を用いて判別式を求めた。 Examples of the multivariable discriminant include a logistic regression equation, a linear discriminant equation, and a multiple regression equation. In this embodiment, the discriminant equation is obtained using a logistic regression equation.
すなわち、判別値πは下記判別式１で表わされ、下記判別式１中の変数ｘは下記式２で表わすことができる。
That is, the discriminant value π can be represented by the following
π＝１／［１＋ｅｘｐ（−ｘ）］・・・式１
ｘ＝（Ａ０＋Ａ１・Ｘ１＋Ａ２・Ｘ２＋・・・＋Ａｎ・Ｘｎ）・・・式２
（但し、式２中、Ａ０、Ａ１、Ａ２、・・・Ａｎは、それぞれ係数を表し、Ｘ０、Ｘ１、Ｘ２、・・・Ｘｎは、選択された末端制限フラグメントのピーク強度（面積値（ＯＴＵ））を表す。）
π = 1 / [1 + exp (−x)]
x = (A 0 + A 1 · X 1 + A 2 · X 2 +... + A n · X n ) ...
(However, in
ロジスティック回帰式を用いた判別式の変数として用いる末端制限フラグメントのピーク強度は、例えばステップワイズ法により選択することができる。ステップワイズ法とは回帰分析、判別分析の変数選択手法の一つであり、特定の独立変数の中から変数増加法、変数減少法、変数増減法のいずれかを用いて、定法により有用な変数を選択することができる。本発明の一実施形態では、以下の実施例で示すように、変数としてＭ９０、Ｍ９６、Ｍ３２、Ｈ５７９、Ｈ３２０、Ｍ８１、Ｍ１６６、Ｈ６０３、Ｍ２９７、Ｍ９７４を選択して判別式を作成することにより、クローン病の活動性を分類することができる。 The peak intensity of the terminal restriction fragment used as a variable of the discriminant using the logistic regression equation can be selected by, for example, the stepwise method. The stepwise method is one of the variable selection methods for regression analysis and discriminant analysis. Variables that are useful by the regular method using the variable increase method, variable decrease method, or variable increase / decrease method from specific independent variables. Can be selected. In one embodiment of the present invention, as shown in the following examples, by selecting M90, M96, M32, H579, H320, M81, M166, H603, M297, M974 as variables, and creating a discriminant, The activity of Crohn's disease can be classified.
そして、かかる判別式１を用いて、各被検者の末端制限フラグメントに由来するピーク強度から判別値πを求め、判定のための閾値（カットオフ値）π０を０．５としたとき、被検者のクローン病の活動性を好適に分類できることを見出し、本発明を完成するに至った。
And using
具体的には、かかる判別式１を用いて、例えば、患者（被検者）が活動期か寛解期（寛解導入期＋寛解維持期）であるかの分類（病勢診断）を行うことができる。
Specifically, using this
一方、ステップワイズ法で選択された変数以外にも、同定された細菌の種類の生物学的背景を基準にして、ロジスティック回帰式に用いる独立変数を選択することも可能である。本発明の他の実施形態では、独立変数を増減させることにより、より高い識別率を有する判別式を作製することも可能であるが、高い識別率を有するが故、試験した患者群への特異性が高くなり、汎用性が失われる判別式となる可能性が考えられる。 On the other hand, in addition to the variable selected by the stepwise method, it is also possible to select an independent variable used for the logistic regression equation based on the biological background of the identified bacterial type. In other embodiments of the present invention, it is possible to create a discriminant having a higher identification rate by increasing or decreasing the independent variable, but because it has a higher identification rate, it is specific to the tested patient group. It is possible that the discriminant becomes a discriminant that loses versatility.
以上、本発明のクローン病の活動性を分類する方法を好適実施形態に基づいて説明したが、本発明はこれらに限定されるものではない。例えば、本発明のクローン病の活動性を分類する方法は、任意の目的の工程が１または２以上追加されていてもよい。 As mentioned above, although the method of classifying the activity of Crohn's disease of the present invention has been described based on the preferred embodiments, the present invention is not limited to these. For example, in the method for classifying the activity of Crohn's disease of the present invention, one or two or more steps for any purpose may be added.
次に、本発明の具体的実施例について説明する。
１．被験者の選定
まず、クローン病患者として診断された患者のうち、ＣＤＡＩが１５０未満の患者を除外し、ＣＤＡＩが１５０以上の患者を５６名、活動期の患者として選定した。その後の治療により、ＣＤＡＩが１５０未満となった患者を寛解導入（寛解導入期）したと判断し、さらに、ＣＤＡＩが１５０未満の状態を６〜１２週間以上維持されたものを寛解維持（寛解維持期）したものと判断した。
Next, specific examples of the present invention will be described.
1. Selection of subjects First, among patients diagnosed as Crohn's disease patients, patients with CDAI of less than 150 were excluded, and 56 patients with CDAI of 150 or more were selected as active patients. Patients with CDAI less than 150 as a result of subsequent treatment are judged to have introduced remission (remission induction phase), and those with CDAI less than 150 maintained for 6 to 12 weeks or more are maintained in remission (remission maintenance) Judgment).
なお、活動期の患者７１名のうち、治療の途中で手術適応になった患者を除外した結果、５１名が寛解導入し、さらに、そのうち４２名が寛解維持された。 As a result of excluding 71 patients in the active period who had undergone surgery during the treatment, 51 patients were in remission and 42 of them were maintained in remission.
２．腸内細菌叢に含まれる細菌の１６ＳｒＤＮＡの増幅
＜２−１＞まず、各被検者から採取した糞便について、ＭＰ ＢｉｏＭｅｄｉｃａｌｓ社製 Ｆａｓｔ Ｐｒｅｐ ＦＰ１００Ａ Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔキットを用いて、Ｔｒｉｓバッファー（１００ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ９．０）、４０ｍＭ ＥＤＴＡ、４Ｍ Ｇｕａｎｉｄｉｕｍ ｔｈｉｏｃｙａｎａｔｅ）に懸濁した後、ジルコニウムビーズを加えて振とうし、糞便懸濁液を被験者毎に調製した。
2. Amplification of 16S rDNA of bacteria contained in intestinal flora <2-1> First, stool collected from each subject was subjected to Tris buffer (100 mM Tris-HCl ( After suspending in pH 9.0), 40 mM EDTA, 4M guanidinium thiocynate), zirconium beads were added and shaken to prepare a stool suspension for each subject.
なお、各被検者からの糞便の採取は、活動期（７１名）、寛解導入期（５１名）および寛解維持期（４２名）の最大３回実施した。 In addition, stool collection from each subject was performed a maximum of three times during the active period (71 patients), the remission induction period (51 persons), and the remission maintenance period (42 persons).
＜２−２＞次に、糞便懸濁液をＰｒｅｃｉｓｉｏｎ Ｓｙｓｔｅｍ Ｓｃｉｅｎｃｅ社製 Ｍａｇｔｒａｔｉｏｎ Ｓｙｓｔｅｍ １２ＧＣ ａｎｄ ＧＣ Ｓｅｒｉｅｓ Ｍａｇｔｒａｔｉｏｎ−ＭｅｇａＺｏｒｂＤＮＡ Ｃｏｍｍｏｎ キットを用いて、ビーズ・フェノール法に供し、糞便懸濁液中に含まれる細菌からＤＮＡを抽出することにより、ＤＮＡ抽出液を得た。 <2-2> Next, the stool suspension was subjected to a bead phenol method using the Magration System 12GC and GC Series Magration-MegaZorbDNA Common kit manufactured by Precision System Science, and contained in the stool suspension. A DNA extract was obtained by extracting the DNA.
＜２−３＞次に、６−ＦＡＭで蛍光標識された配列番号８のプライマーをフォアードプライマーとして、配列番号９のプライマーをリバースプライマーとして用意し、Ｑｕｉａｇｅｎ社製ＨｏｔＳｔｅｒ Ｔａｑ Ｍａｓｔｅｒ Ｍｉｘキットを用いて、ＰＣＲ法により、１６ＳｒＤＮＡを増幅させた。 <2-3> Next, the primer of SEQ ID NO: 8 fluorescently labeled with 6-FAM is prepared as a forward primer, the primer of SEQ ID NO: 9 is prepared as a reverse primer, and a HotStar Taq Master Mix kit manufactured by Quiagen is used. 16S rDNA was amplified by the PCR method.
なお、１６ＳｒＤＮＡを増幅させた際の条件は、変性温度を９４℃として５分間維持し、その後、９４℃×１分間、５５℃×１分間、７２℃×１分間を１サイクルとして、これを３０サイクル行った後、７２℃を５分間維持することとした。 The conditions for amplifying 16SrDNA were as follows: denaturation temperature was maintained at 94 ° C. for 5 minutes, and then 94 ° C. × 1 minute, 55 ° C. × 1 minute, 72 ° C. × 1 minute was set as one cycle. After cycling, 72 ° C. was maintained for 5 minutes.
以上のような工程を経て、各被検者の腸内細菌叢に含まれる細菌に由来する１６ＳｒＤＮＡが増幅されたサンプルを被検者毎に調製した。 Through the steps as described above, a sample in which 16SrDNA derived from bacteria contained in the gut microbiota of each subject was amplified was prepared for each subject.
３．増幅させた１６ＳｒＤＮＡに基づく腸内細菌叢に含まれる細菌の種類の分析
＜３−１＞まず、各被験者の増幅された１６ＳｒＤＮＡを含有するサンプルを、４塩基認識制限酵素であるＨｈａＩを用いて切断した。
3. Analysis of types of bacteria contained in intestinal flora based on amplified 16SrDNA <3-1> First, a sample containing 16SrDNA amplified from each subject was cleaved with HhaI, a 4-base recognition restriction enzyme. did.
＜３−２＞次に、制限酵素による処理が施された１６ＳｒＤＮＡを含有するサンプルを、キャピラリーＤＮＡシーケンサー（Ａｐｐlｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ社製、ＡＢＩ ＰＲＩＳＭ ３１０ Ｇｅｎｅｔｉｃ Ａｎａｌｙｓｅｒ）を用いて、末端制限フラグメント（Ｔ−ＲＦ）の長さを求め、得られた末端制限フラグメント（Ｔ−ＲＦ）の長さから細菌の種類を推察した。 <3-2> Next, a sample containing 16S rDNA that has been treated with a restriction enzyme is subjected to terminal restriction fragment (T-RF) using a capillary DNA sequencer (Applied Biosystems, ABI PRISM 310 Genetic Analyzer). The type of bacteria was inferred from the length of the obtained terminal restriction fragment (T-RF).
＜３−３＞４塩基認識制限酵素としてＨｈａＩに代えてＭｓｐＩを用いて、前記工程＜３−１＞および前記工程＜３−２＞と同様の工程を行い、末端制限フラグメント（Ｔ−ＲＦ）の長さを求めるとともに、得られた末端制限フラグメント（Ｔ−ＲＦ）の長さから細菌の種類を推察した。 <3-3> Using MspI instead of HhaI as a 4-base recognition restriction enzyme, the same steps as in the above step <3-1> and step <3-2> are performed, and a terminal restriction fragment (T-RF) And the type of bacteria was inferred from the length of the obtained terminal restriction fragment (T-RF).
なお、制限酵素としてＨｈａＩおよびＭｓｐＩを用いた際に、キャピラリーＤＮＡシーケンサーにより得られた、末端制限フラグメントのプロファイルと、末端制限フラグメントの長さから推察された細菌の種類とを、それぞれ、図２および図３に示す。 When HhaI and MspI were used as restriction enzymes, the profile of the terminal restriction fragment obtained by the capillary DNA sequencer and the type of bacteria inferred from the length of the terminal restriction fragment were respectively shown in FIG. 2 and As shown in FIG.
各患者の活動期及び寛解期（寛解導入期＋寛解維持期）でそれぞれ観察された、キャピラリーＤＮＡシーケンサーのプロファイルを比較したところ、そのパターンにいくつかの違いが認められた。 When the profiles of the capillary DNA sequencers observed in each patient's active phase and remission phase (remission induction phase + remission maintenance phase) were compared, some differences were observed in the pattern.
なお、各プロファイルに認められたピークに示す記号は、アルファベットが用いた制限酵素の頭文字を示し、数字がＴ−ＲＦの長さ（塩基長）を示す。 In addition, the symbol shown to the peak recognized by each profile shows the initial letter of the restriction enzyme which the alphabet used, and a number shows the length (base length) of T-RF.
４．健常人群および患者群における腸内細菌叢に含まれる細菌の種類の差異の検討
＜４−１＞まず、制限酵素としてＨｈａＩを用いた場合について、健常入群および患者群（活動期〜寛解維持期）毎に、キャピラリーＤＮＡシーケンサーにより観察されたプロファイルに基づいて、各長さの末端制限フラグメントのピーク強度の平均値を求めた。
4). <4-1> First, regarding the case of using HhaI as a restriction enzyme, the normal enrollment group and the patient group (active period to remission maintenance period) ), The average value of the peak intensities of the end restriction fragments of each length was determined based on the profile observed by the capillary DNA sequencer.
＜４−２＞４塩基認識制限酵素としてＨｈａＩに代えてＭｓｐＩを用いた場合についても、前記工程＜４−１＞と同様にして、各長さの末端制限フラグメントのピーク強度の平均値を求めた。 <4-2> When MspI is used instead of HhaI as a 4-base recognition restriction enzyme, the average value of peak intensities of terminal restriction fragments of each length is determined in the same manner as in the above step <4-1>. It was.
得られた結果を表１および表２に示す。 The obtained results are shown in Tables 1 and 2.
表１に示すように、制限酵素としてＨｈａIを用いた場合には、末端制限フラグメントとして、Ｈ５７、Ｈ１８６、Ｈ２１４、Ｈ２２６、Ｈ３２０、Ｈ３７６、Ｈ５６１、Ｈ５７９、Ｈ６０３及びＨ１０７９に由来するピーク強度が、健常人群、患者群（活動期）および患者群（寛解期）間で異なる傾向が見られた。 As shown in Table 1, when HhaI was used as a restriction enzyme, the peak intensity derived from H57, H186, H214, H226, H320, H376, H561, H579, H603, and H1079 was healthy as a terminal restriction fragment. There were different trends between the human group, patient group (active phase) and patient group (remission phase).
また表２に示すように、制限酵素としてＭｓｐIを用いた場合には、末端制限フラグメントとして、Ｍ３２、Ｍ６３、Ｍ７０、Ｍ８１、Ｍ９０、Ｍ９４、Ｍ９６、Ｍ１３３、Ｍ１４２、Ｍ１６６、Ｍ１９０、Ｍ２０２、Ｍ２２１、Ｍ２８５、Ｍ２９７、Ｍ３０２、Ｍ４９４、Ｍ４９９、Ｍ５５６、Ｍ５６３及びＭ９７４に由来するピーク強度が、健常人群、患者群（活動期）および患者群（寛解期）間で異なる傾向が見られた。 As shown in Table 2, when MspI was used as a restriction enzyme, M32, M63, M70, M81, M90, M94, M96, M133, M142, M166, M190, M202, M221, The peak intensity derived from M285, M297, M302, M494, M499, M556, M563 and M974 tended to be different among the healthy group, patient group (active phase) and patient group (remission phase).
すなわち、これら末端制限フラグメントに由来するピーク強度が、クローン病の病態に強い相関関係を有していると考えられた。 That is, the peak intensity derived from these terminal restriction fragments was considered to have a strong correlation with the pathology of Crohn's disease.
５．末端制限フラグメントのピーク強度の平均値を変数とした判別式を用いた、クローン病の活動性の分類
＜５−１＞腸内細菌叢に含まれる細菌の種類やその割合がクローン病の病態に強い相関関係を有していることが推察されたことから、活動期、寛解期をあわせたピークサンプルから、半数に当たる８４サンプルを抽出し、そのデータを基にロジスティック回帰式を用いてクローン病の活動性を分類するための判別式を作成した。変数としては、ステップワイズ法により、判別に最適な変数として、Ｍ９０、Ｍ９６、Ｍ３２、Ｈ５７９、Ｈ３２０、Ｍ８１、Ｍ１６６、Ｈ６０３、Ｍ２９７、Ｍ９７４が選択され、以下の式３が得られた。
π＝１／［１＋ｅｘｐ（−ｘ）］・・・式１
ｘ＝（−０．１７９９＋０．２１１４×Ｍ９０−０．０７７７×Ｍ９６＋２．３５９８×Ｍ３２＋０．１７０２×Ｈ５７９−１．２１７６×Ｈ３２０−０．２０４７×Ｍ８１＋０．３７５２×Ｍ１６６−１．８３３５×Ｈ６０３−０．０６２０×Ｍ２９７−０．１８４３×Ｍ９７４）・・・式３
判定方法：πが０．５未満＝寛解期（ＣＤＡＩ＜１５０）
πが０．５以上＝活動期（ＣＤＡＩ≧１５０）
5. Classification of Crohn's disease activity using a discriminant with the average value of peak intensities of terminal restriction fragments as a variable <5-1> The type and proportion of bacteria in the gut microbiota Since it was inferred that there was a strong correlation, 84 samples, half of which were extracted from the peak samples that combined the active period and remission period, were extracted from Crohn's disease using a logistic regression equation based on the data. A discriminant for classifying activity was created. As variables, M90, M96, M32, H579, H320, M81, M166, H603, M297, and M974 were selected by the stepwise method, and the following
π = 1 / [1 + exp (−x)]
x = (− 0.1799 + 0.2114 × M90−0.0777 × M96 + 2.3598 × M32 + 0.1702 × H579-1.2176 × H320−0.2047 × M81 + 0.3752 × M166-1.8335 × H603-0. 0620 × M297-0.1843 × M974)
Determination method: π is less than 0.5 = remission period (CDAI <150)
π is 0.5 or more = active period (CDAI ≧ 150)
＜５−２＞式３の判別式によりＣＤＡＩの値が予測可能かどうかを確認するために、クローン病と診断された患者の腸内細菌叢の解析データを式３に入力し、πの値を求めた。判別式により予測されたＣＤＡＩの値と、定法により求めたＣＤＡＩの値と比較し、ＣＤＡＩの値が予測可能であった確率（識別率）を算出した。結果を以下の表３に示す。
<5-2> In order to confirm whether the value of CDAI can be predicted by the discriminant of
６．末端制限フラグメントのピーク強度の平均値を変数とした判別式の汎用性の検証
＜６−１＞末端制限フラグメントのピーク強度の平均値を変数とした判別式の汎用性を、クロスバリデーション法により検証した。＜５−１＞で求めた判別式を用いて、判別式の作成において抽出されなかった残８４サンプルの活動性を予測できるかどうかを検証した。
6). Versatile verification of discriminant using the average value of peak intensity of terminal restriction fragments as a variable <6-1> Versatile verification of discriminant using the average value of peak intensity of end restriction fragments as a variable did. Using the discriminant obtained in <5-1>, it was verified whether the activity of the remaining 84 samples that were not extracted in creating the discriminant could be predicted.
＜６−２＞結果を表４及び図５に示す。結果より、本発明の判別式が高い汎用性を有することが示された。 <6-2> The results are shown in Table 4 and FIG. From the results, it was shown that the discriminant of the present invention has high versatility.
以上、本発明を実施例に基づいて説明した。この実施例はあくまで例示であり、種々の変形例が可能なこと、またそうした変形例も本発明の範囲にあることは当業者に理解されるところである。 In the above, this invention was demonstrated based on the Example. It is to be understood by those skilled in the art that this embodiment is merely an example, and that various modifications are possible and that such modifications are within the scope of the present invention.
Claims (8)
前記被検者から採取された試料中の前記腸内細菌叢を分析する分析工程と
前記腸内細菌叢に含まれる細菌の種類やその割合に基づいて前記被検者のクローン病の活動性を分類する工程とを有し、多変数判別式として、ロジスティック回帰式を用いて、判別値を求め、該判別値に基づいて前記被検者のクローン病の活動性を分類する方法。 A method of classifying a subject's Crohn's disease activity by analyzing the intestinal microbiota of the subject,
Analyzing the intestinal microflora in the sample collected from the subject, and the activity of the subject's Crohn's disease based on the type and proportion of bacteria contained in the intestinal microflora method possess a step of classifying, as multivariate discriminant, using logistic regression equation, we obtain a determination value, classifying the activity of the subject of Crohn's disease on the basis of the該判by value.
前記被験者から採取した試料中に含まれる細菌からＤＮＡを抽出する抽出工程と、
前記ＤＮＡの一部を増幅させる増幅工程と、
増幅された前記ＤＮＡの一部を切断することにより末端制限フラグメントを得る切断工程と、
前記末端制限フラグメントの長さに応じて、前記腸内細菌叢に含まれる細菌の種類を分析する分析工程とを有するＴ−ＲＦＬＰ法である請求項２に記載のクローン病の活動性を分類する方法。 The molecular biological technique is:
An extraction step of extracting DNA from bacteria contained in the sample collected from the subject;
An amplification step of amplifying a portion of the DNA;
A cleavage step of obtaining a terminal restriction fragment by cleaving a part of the amplified DNA;
The activity of Crohn's disease according to claim 2 is classified by the T-RFLP method having an analysis step of analyzing the type of bacteria contained in the intestinal flora according to the length of the terminal restriction fragment. Method.
（ａ）被検者から採取された試料中の腸内細菌叢を分析する分析工程、
（ｂ）前記腸内細菌叢に含まれる細菌やその割合に基づき、多変数判別式として、ロジスティック回帰式を用いて、判別値を求め、該判別値に基づいて前記被検者のクローン病の活動性を分類する工程、及び
（ｃ）被験者のクローン病の活動性が活動期と分類された場合には寛解導入に適した栄養剤を選択し、被験者のクローン病の活動性が寛解期と分類された場合には寛解維持に適した栄養剤を選択する工程
を含むクローン病の活動性に適した栄養剤を選択する方法。 In a method for selecting a nutrient suitable for Crohn's disease activity,
(A ) an analysis step for analyzing the intestinal bacterial flora in a sample collected from the subject ;
(B)-out based on bacteria and their proportions contained in the intestinal flora, as multivariate discriminant, using logistic regression equation, obtains a determination value, clones of the subject based on該判by value step classifying activity of disease, and (c) if the activity of the subject's Crohn's disease was classified as active phase is selected nutrients suitable for induction, remission activity of a subject's Crohn's disease A method of selecting a nutrient suitable for Crohn's disease activity, including a step of selecting a nutrient suitable for remission maintenance when classified as a stage.
（ａ）被検者から採取された栄養剤の投与前と投与後の試料中の腸内細菌叢を分析する分析工程、
（ｂ）前記腸内細菌叢に含まれる細菌やその割合に基づき、多変数判別式として、ロジスティック回帰式を用いて、判別値を求め、該判別値に基づいて前記被検者のクローン病の活動性を分類する工程、及び
（ｃ）栄養剤投与前のクローン病の活動性と栄養剤投与後のクローン病の活動性とを比較し、投与によりクローン病の活動性を変化させる栄養剤を選択する工程
を含むスクリーニング方法。 In a method for screening for nutrients that affect Crohn's disease activity,
(A ) an analysis step for analyzing an intestinal microflora in a sample collected before and after administration of a nutrient collected from a subject ;
(B)-out based on bacteria and their proportions contained in the intestinal flora, as multivariate discriminant, using logistic regression equation, obtains a determination value, clones of the subject based on該判by value A process of classifying the activity of the disease, and (c) a nutrition that compares the activity of Crohn's disease before administration of the nutrient with the activity of Crohn's disease after administration of the nutrient and changes the activity of Crohn's disease by administration A screening method comprising a step of selecting an agent.
前記腸内細菌叢に含まれると推察される細菌の種類やその割合に基づき、多変数判別式として、ロジスティック回帰式を用いて、判別値を求め、該判別値に基づいて前記被検者のクローン病の活動性を分類するためのキット。 It means for analyzing the intestinal flora in a sample collected from a subject including,
Under the type and rate of bacteria is estimated to be contained in the intestinal flora, as multivariate discriminant, using logistic regression equation, obtains a determination value, the test based on該判by value For classifying Crohn's disease activity in the elderly.
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP2011106270A JP5837761B2 (en) | 2010-05-12 | 2011-05-11 | Classification of Crohn's disease activity |
Applications Claiming Priority (3)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP2010110437 | 2010-05-12 | ||
| JP2010110437 | 2010-05-12 | ||
| JP2011106270A JP5837761B2 (en) | 2010-05-12 | 2011-05-11 | Classification of Crohn's disease activity |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JP2011254810A JP2011254810A (en) | 2011-12-22 |
| JP5837761B2 true JP5837761B2 (en) | 2015-12-24 |
Family
ID=45471729
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP2011106270A Active JP5837761B2 (en) | 2010-05-12 | 2011-05-11 | Classification of Crohn's disease activity |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| JP (1) | JP5837761B2 (en) |
Families Citing this family (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN107924409B (en) * | 2015-08-12 | 2022-04-08 | 爱康迪健康规划服务股份有限公司 | Information processing apparatus, information processing method, and recording medium |
Family Cites Families (5)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| AU2002330215A1 (en) * | 2001-10-03 | 2003-04-14 | Oxford Glycosciences (Uk) Ltd. | Nucleic acid molecules, polypeptides and uses therefor, including diagnosis and treatment of alzheimer's disease |
| AU2003217954A1 (en) * | 2002-03-06 | 2003-09-22 | Johns Hopkins University | Use of biomarkers to detect breast cancer |
| JP4143756B2 (en) * | 2002-06-21 | 2008-09-03 | 財団法人名古屋産業科学研究所 | Risk diagnosis method for myocardial infarction |
| JP5280214B2 (en) * | 2007-02-15 | 2013-09-04 | 学校法人 埼玉医科大学 | Diagnosis method of inflammatory bowel disease |
| EA201000131A1 (en) * | 2007-08-02 | 2010-08-30 | АйЭсЭс ИММЬЮН СИСТЕМ СТИМУЛЕЙШН АБ | DIAGNOSTIC, DETERMINATION OF THE STAGE AND MONITORING OF THE INFLAMMATORY DISEASE OF THE INTESTINE |
-
2011
- 2011-05-11 JP JP2011106270A patent/JP5837761B2/en active Active
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| JP2011254810A (en) | 2011-12-22 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| Geng et al. | Diversified pattern of the human colorectal cancer microbiome | |
| US6699670B2 (en) | Quantitative assay for the simultaneous detection and speciation of bacterial infections | |
| JP2020513856A (en) | Leveraging Sequence-Based Fecal Microbial Survey Data to Identify Multiple Biomarkers for Colorectal Cancer | |
| EP2419527B1 (en) | Method for the detection and characterization of a toxinogenic clostridium difficile strain | |
| CN111411150B (en) | Intestinal flora for diagnosing sarcopenia and application thereof | |
| CN112899368B (en) | Biomarker for early diagnosis of primary hepatocellular carcinoma, detection reagent and application thereof | |
| CN114134219A (en) | Multiple nucleic acid detection system and preparation method and application thereof | |
| KR20220035482A (en) | Arrangements for detection of genomic sequences using a combination of probes and specific detection of probe molecules and organisms comprising the probes | |
| KR20170022201A (en) | Primer for nucleic acid amplification having dumbbell structure and method for detection of intestinal beneficial bacteria | |
| JP5837761B2 (en) | Classification of Crohn's disease activity | |
| US20230340625A1 (en) | Method and system for detecting and treating exposure to an infectious pathogen | |
| CN113584190A (en) | Intestinal flora marker for diagnosing calcium oxalate calculus and application thereof | |
| KR101765677B1 (en) | Primer set for detection of mycobacterium tuberculosis and non-Tuberculosis mycobacteria and use thereof | |
| JP2006149400A (en) | Primer for bacteroides and detection method using the primer | |
| CN111662992A (en) | Flora associated with acute pancreatitis and application thereof | |
| JP2006101891A (en) | Primer for clostridium and detection method using the same | |
| KR101677952B1 (en) | Genetic Marker for Discrimination and Detection of Lactococcus Garvieae, and Method for Discrimination and Detection of Lactococcus Garvieae Using the Same | |
| CN112048552B (en) | Intestinal flora for diagnosing myasthenia gravis and application thereof | |
| EP1606420B1 (en) | Method and kit for a specific detection of m.tuberculosis | |
| JP2007020423A (en) | Nucleic acid fragment for detecting intestinal bacterial group | |
| JP2014064543A (en) | Oligonucleotides for detecting and/or quantifying bifidobacterium longum | |
| WO2023080154A1 (en) | Method for determining risk of adverse event | |
| JP2006136338A (en) | Primer for prevotella and detection method using the same | |
| JP7252606B2 (en) | Lactic acid bacteria detection primer set and detection method using the primer set | |
| KR101677951B1 (en) | Genetic Marker for Discrimination and Detection of Streptococcus Parauberis, and Method for Discrimination and Detection of Streptococcus Parauberis Using the Same |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| A621 | Written request for application examination |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A621 Effective date: 20140319 |
|
| A521 | Request for written amendment filed |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A821 Effective date: 20140319 |
|
| A131 | Notification of reasons for refusal |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A131 Effective date: 20150331 |
|
| A521 | Request for written amendment filed |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A523 Effective date: 20150529 |
|
| TRDD | Decision of grant or rejection written | ||
| A01 | Written decision to grant a patent or to grant a registration (utility model) |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A01 Effective date: 20151027 |
|
| A61 | First payment of annual fees (during grant procedure) |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A61 Effective date: 20151106 |
|
| R150 | Certificate of patent or registration of utility model |
Ref document number: 5837761 Country of ref document: JP Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R150 |
|
| S111 | Request for change of ownership or part of ownership |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R313117 |
|
| R250 | Receipt of annual fees |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R250 |
|
| R350 | Written notification of registration of transfer |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R350 |
|
| R250 | Receipt of annual fees |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R250 |
|
| R250 | Receipt of annual fees |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R250 |
|
| R250 | Receipt of annual fees |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R250 |