JP5825570B2 - 糸状菌培養用培地 - Google Patents
糸状菌培養用培地 Download PDFInfo
- Publication number
- JP5825570B2 JP5825570B2 JP2011010086A JP2011010086A JP5825570B2 JP 5825570 B2 JP5825570 B2 JP 5825570B2 JP 2011010086 A JP2011010086 A JP 2011010086A JP 2011010086 A JP2011010086 A JP 2011010086A JP 5825570 B2 JP5825570 B2 JP 5825570B2
- Authority
- JP
- Japan
- Prior art keywords
- insolens
- culture
- activity
- medium
- enzyme
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Expired - Fee Related
Links
Landscapes
- Enzymes And Modification Thereof (AREA)
- Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
Description
本発明は、糸状菌培養用培地に関する。さらに詳しくは、大豆由来の不溶性窒素成分を窒素源として含む糸状菌培養用培地に関する。
Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ属、Ｈｕｍｉｃｏｌａ属、Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ属等の糸状菌は、セルラーゼ、ヘミセルラーゼ等の糖化酵素を産生する菌として、リグノセルロース系のバイオマスを原料としたエタノールの製造や、コムギわら等からグルコース、セロビオース等の加水分解性生物を得ること等に利用できるとされてきた（例えば、特許文献１、２参照）。
日本ではイナワラが毎年大量に排出されていることから、これを原料として、エタノール等を製造することが望まれている。しかし、イナワラは強固な構造を持つことから、一般に利用されているＴｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ属由来のセルラーゼのみではなかなか分解されないという問題があった。
そこで、イナワラの分解に有用なセルラーゼ、ヘミセルラーゼ等の酵素を効率的に産生できる糸状菌の培養条件が検討されているが、十分な培養方法は開発されておらず、イナワラ高分解酵素生産菌として知られるＨｕｍｉｃｏｌａ属の糸状菌においては、酵素生産性が極めて低いという問題もあった。
本発明者らはこれらの問題に対し、大豆由来の不溶性窒素成分を窒素源とする糸状菌培養用培地を本発明において見出した。
大豆由来の成分を窒素源として用いることは、従来、滅菌された大豆、脱脂大豆、これらを熱処理等したもの、大豆蛋白質等を窒素源とすること等から知られているが（例えば、特許文献４〜７参照）、窒素源として大豆由来の不溶性窒素成分を特に用いることは知られていなかった。
大豆由来の成分を窒素源として用いることは、従来、滅菌された大豆、脱脂大豆、これらを熱処理等したもの、大豆蛋白質等を窒素源とすること等から知られているが（例えば、特許文献４〜７参照）、窒素源として大豆由来の不溶性窒素成分を特に用いることは知られていなかった。
本発明は、イナワラ等の分解に有用なセルラーゼ、ヘミセルラーゼ等の酵素を効率的に産生できる糸状菌の培養条件の提供を課題とする。さらに、詳しくは、Ｈｕｍｉｃｏｌａ属の糸状菌がペレット化せず、結果として酵素を効率的に産生できる培養条件の提供を課題とする。
本発明者らは上記課題を解決するために鋭意検討を行ったところ、窒素源として大豆由来の不溶性窒素成分を用いた糸状菌培養用培地を見出した。この糸状菌培養用培地で糸状菌を培養すると、イナワラ等の分解に有用なセルラーゼ、ヘミセルラーゼ等の酵素を効率的に糸状菌に産生させることが可能となる。さらに、Ｈｕｍｉｃｏｌａ属の糸状菌において、糸状菌がペレット化せず培養が行えることを見出し、本発明を完成するに至った。
すなわち、本発明は、次の（１）〜（１２）で示される、糸状菌培養用培地、糸状菌を培養する方法等に関する。
（１）大豆由来の不溶性窒素成分を含む糸状菌培養用培地。
（２）次の（Ａ）または（Ｂ）の特徴を有する大豆由来の不溶性窒素成分を含む上記（１）に記載の糸状菌培養用培地。
（Ａ）水分８％以下、粗たん白質含量４７％以上、粗繊維７％以下、粗灰分６．８％以下、窒素分７．５２％以上、粒度０．１０６ｍｍ（１５０メッシュ）パス９０％以上、抗原量１００Ｕ／１０ｍｇ以下
（Ｂ）水分１２％以下、粗たん白質含量５１．１２５％以上（無水物換算）、粗繊維３〜７％、粗灰分６〜７％、窒素分８．１８％以上（無水物換算）、粒度０．３５５ｍｍ以上痕跡、０．２５ｍｍ（６０メッシュ）パス９０％以上、０．１５ｍｍ（１００メッシュ）パス５０％以上、ウレアーゼ活性度０．３以下
（３）糸状菌がＡｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ属、Ｈｕｍｉｃｏｌａ属またはＴｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ属に属する菌である上記（１）または（２）に記載の糸状菌培養用培地。
（４）糸状菌がＨｕｍｉｃｏｌａ ｉｎｓｏｌｅｎｓである上記（１）〜（３）のいずれかに記載の糸状菌培養用培地。
（５）上記（１）〜（４）のいずれかに記載の糸状菌培養用培地によって、糸状菌を培養する方法。
（６）上記（１）〜（４）のいずれかに記載の糸状菌培養用培地によって、糸状菌を培養することにより、糸状菌に酵素を産生させる方法。
（７）酵素がセルラーゼ、ヘミセルラーゼ、プロテアーゼまたはリグニン分解酵素である上記（６）に記載の方法。
（８）上記（１）〜（４）のいずれかに記載の糸状菌培養用培地によって、糸状菌を培養することにより、糸状菌に産生させる酵素を調節する方法。
（９）酵素がセルラーゼ、ヘミセルラーゼ、プロテアーゼまたはリグニン分解酵素である上記（８）に記載の方法。
（１０）上記（５）に記載の方法によって培養された糸状菌を用い、バイオマスを分解する方法。
（１１）バイオマスが草本系バイオマスである上記（１０）に記載の方法。
（１２）草本系バイオマスがイナワラ、バガスまたはススキである上記（１１）に記載の方法。
（１）大豆由来の不溶性窒素成分を含む糸状菌培養用培地。
（２）次の（Ａ）または（Ｂ）の特徴を有する大豆由来の不溶性窒素成分を含む上記（１）に記載の糸状菌培養用培地。
（Ａ）水分８％以下、粗たん白質含量４７％以上、粗繊維７％以下、粗灰分６．８％以下、窒素分７．５２％以上、粒度０．１０６ｍｍ（１５０メッシュ）パス９０％以上、抗原量１００Ｕ／１０ｍｇ以下
（Ｂ）水分１２％以下、粗たん白質含量５１．１２５％以上（無水物換算）、粗繊維３〜７％、粗灰分６〜７％、窒素分８．１８％以上（無水物換算）、粒度０．３５５ｍｍ以上痕跡、０．２５ｍｍ（６０メッシュ）パス９０％以上、０．１５ｍｍ（１００メッシュ）パス５０％以上、ウレアーゼ活性度０．３以下
（３）糸状菌がＡｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ属、Ｈｕｍｉｃｏｌａ属またはＴｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ属に属する菌である上記（１）または（２）に記載の糸状菌培養用培地。
（４）糸状菌がＨｕｍｉｃｏｌａ ｉｎｓｏｌｅｎｓである上記（１）〜（３）のいずれかに記載の糸状菌培養用培地。
（５）上記（１）〜（４）のいずれかに記載の糸状菌培養用培地によって、糸状菌を培養する方法。
（６）上記（１）〜（４）のいずれかに記載の糸状菌培養用培地によって、糸状菌を培養することにより、糸状菌に酵素を産生させる方法。
（７）酵素がセルラーゼ、ヘミセルラーゼ、プロテアーゼまたはリグニン分解酵素である上記（６）に記載の方法。
（８）上記（１）〜（４）のいずれかに記載の糸状菌培養用培地によって、糸状菌を培養することにより、糸状菌に産生させる酵素を調節する方法。
（９）酵素がセルラーゼ、ヘミセルラーゼ、プロテアーゼまたはリグニン分解酵素である上記（８）に記載の方法。
（１０）上記（５）に記載の方法によって培養された糸状菌を用い、バイオマスを分解する方法。
（１１）バイオマスが草本系バイオマスである上記（１０）に記載の方法。
（１２）草本系バイオマスがイナワラ、バガスまたはススキである上記（１１）に記載の方法。
本発明によって提供される糸状菌培養用培地を用いることにより、セルラーゼ、ヘミセルラーゼ等の酵素を効率的に糸状菌に産生させることが可能となる。また、本発明によって培養した糸状菌を用いることにより、イナワラ等のバイオマスを原料として、エタノール等を製造することが可能となる。
本発明の「糸状菌培養用培地」とは、Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ属、Ｈｕｍｉｃｏｌａ属またはＴｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ属等に属する糸状菌の培養に適する培地のことをいう。
ここで「糸状菌の培養に適する」とは、糸状菌の増殖や、糸状菌に酵素を産生させるための培地として有効に利用できることを指す。
本発明の「糸状菌培養用培地」は、大豆由来の不溶性窒素成分を含み、糸状菌の培養に適するものであれば、糸状菌の培養に有用な公知の他の成分等を含んでいてもよく、固体培地であっても液体培地であっても良い。特に液体培地においては、糸状菌がペレット化せず、分散した状態で培養できる培地であることが特に好ましい。
ここで「糸状菌の培養に適する」とは、糸状菌の増殖や、糸状菌に酵素を産生させるための培地として有効に利用できることを指す。
本発明の「糸状菌培養用培地」は、大豆由来の不溶性窒素成分を含み、糸状菌の培養に適するものであれば、糸状菌の培養に有用な公知の他の成分等を含んでいてもよく、固体培地であっても液体培地であっても良い。特に液体培地においては、糸状菌がペレット化せず、分散した状態で培養できる培地であることが特に好ましい。
このような糸状菌がペレット化せず、分散した状態で培養できる液体培地としては、窒素源として次の（Ａ）のような特徴を有する不溶性窒素成分を含む本発明の「糸状菌培養用培地」等が挙げられる。
（Ａ）水分８％以下、粗たん白質含量４７％以上、粗繊維７％以下、粗灰分６．８％以下、窒素分７．５２％以上、粒度０．１０６ｍｍ（１５０メッシュ）パス９０％以上、抗原量１００Ｕ／１０ｍｇ以下である。
また、上記（Ａ）のような特徴に加え、さらに、水溶性窒素指数（ＮＳＩ）が概ね５以上、２０未満、ウレアーゼ活性度０．０２以下、トリプシンインヒビター活性１．５Ｕ／ｍｇ以下である、（Ａ’）のような特徴を有する不溶性窒素成分を含むものであっても良い。
この（Ａ）または（Ａ’）のような特徴を有する不溶性窒素成分として、例えば、市販のＪ−オイルミルズ ソヤレックス（Ｓｏｙａｌｌｅｘ）（登録商標）（Ｊ−オイルミルズ製）等が挙げられる。また、本発明の「糸状菌培養用培地」は、炭素源としてバイオマスをさらに含むこともできる。
（Ａ）水分８％以下、粗たん白質含量４７％以上、粗繊維７％以下、粗灰分６．８％以下、窒素分７．５２％以上、粒度０．１０６ｍｍ（１５０メッシュ）パス９０％以上、抗原量１００Ｕ／１０ｍｇ以下である。
また、上記（Ａ）のような特徴に加え、さらに、水溶性窒素指数（ＮＳＩ）が概ね５以上、２０未満、ウレアーゼ活性度０．０２以下、トリプシンインヒビター活性１．５Ｕ／ｍｇ以下である、（Ａ’）のような特徴を有する不溶性窒素成分を含むものであっても良い。
この（Ａ）または（Ａ’）のような特徴を有する不溶性窒素成分として、例えば、市販のＪ−オイルミルズ ソヤレックス（Ｓｏｙａｌｌｅｘ）（登録商標）（Ｊ−オイルミルズ製）等が挙げられる。また、本発明の「糸状菌培養用培地」は、炭素源としてバイオマスをさらに含むこともできる。
本発明の「糸状菌培養用培地」に含まれる「大豆由来の不溶性窒素成分」とは、大豆由来のタンパク質等窒素源になり得るものであって水に不溶なものを含むもののことをいい、糸状菌の増殖や、糸状菌に酵素を産生させるために有用な「大豆由来の不溶性窒素成分」であれば、従来知られているいずれのものも用いることができる。
このような「大豆由来の不溶性窒素成分」として、例えば、上記（Ａ）または（Ａ’）のような特徴を有するものが挙げられる。このような特徴を有する「大豆由来の不溶性窒素成分」は、エクストルーダーで脱脂大豆を処理し、膨化、変性させた後、乾燥し、粉砕することで調製することができる。
エクストルーダーによる脱脂大豆の処理は、上記（Ａ）または（Ａ’）のような特徴を有する「大豆由来の不溶性窒素成分」が得られる条件であれば、いずれの処理条件であっても良い。例えば、エクストルーダーＫＥＩ−８７（幸和工業株式会社製）を用いる場合には、バレル温度１６０〜１９０℃、圧力３０〜５０ｋｇ／ｃｍ2、回転数２８０ｒｐｍ、スクリュー配置に於いてニーディングディスクを６個含むスクリューを使用し、原料供給量５３０〜６００ｋｇ／時間、水供給量８０〜１３０リットル／時間、ダイ２．５ｍｍ×２２６穴の処理条件等が挙げられる。
また、二軸型エクストルーダーＫＥ１４５−２５（幸和工業株式会社製）を用いる場合には、バレル温度１８０℃、圧力４５ｋｇ／ｃｍ2、回転数２８０ｒｐｍ、原料供給量７７ｋｇ／ｈｒ、ダイ２ｍｍ×１０穴の処理条件やバレル温度１４０℃、圧力５４ｋｇ／ｃｍ2、回転数２８０ｒｐｍ、原料供給量７７ｋｇ／ｈｒ、ダイ２ｍｍ×１０穴の処理条件等が挙げられる
このような「大豆由来の不溶性窒素成分」として、例えば、上記（Ａ）または（Ａ’）のような特徴を有するものが挙げられる。このような特徴を有する「大豆由来の不溶性窒素成分」は、エクストルーダーで脱脂大豆を処理し、膨化、変性させた後、乾燥し、粉砕することで調製することができる。
エクストルーダーによる脱脂大豆の処理は、上記（Ａ）または（Ａ’）のような特徴を有する「大豆由来の不溶性窒素成分」が得られる条件であれば、いずれの処理条件であっても良い。例えば、エクストルーダーＫＥＩ−８７（幸和工業株式会社製）を用いる場合には、バレル温度１６０〜１９０℃、圧力３０〜５０ｋｇ／ｃｍ2、回転数２８０ｒｐｍ、スクリュー配置に於いてニーディングディスクを６個含むスクリューを使用し、原料供給量５３０〜６００ｋｇ／時間、水供給量８０〜１３０リットル／時間、ダイ２．５ｍｍ×２２６穴の処理条件等が挙げられる。
また、二軸型エクストルーダーＫＥ１４５−２５（幸和工業株式会社製）を用いる場合には、バレル温度１８０℃、圧力４５ｋｇ／ｃｍ2、回転数２８０ｒｐｍ、原料供給量７７ｋｇ／ｈｒ、ダイ２ｍｍ×１０穴の処理条件やバレル温度１４０℃、圧力５４ｋｇ／ｃｍ2、回転数２８０ｒｐｍ、原料供給量７７ｋｇ／ｈｒ、ダイ２ｍｍ×１０穴の処理条件等が挙げられる
また、「大豆由来の不溶性窒素成分」として、次の（Ｂ）のような特徴を有するものも用いることができる。（Ｂ）水分１２％以下、粗たん白質含量５１．１２５％以上（無水物換算）、粗繊維３〜７％、粗灰分６〜７％、窒素分８．１８％以上（無水物換算）、粒度０．３５５ｍｍ以上痕跡、０．２５ｍｍ（６０メッシュ）パス９０％以上、０．１５ｍｍ（１００メッシュ）パス５０％以上、ウレアーゼ活性度０．３以下である。
また、上記（Ｂ）のような特徴に加え、さらに、抗原量５０００〜２万Ｕ／１０ｍｇであり、水溶性窒素指数（ＮＳＩ）が概ね１５以上３５未満である、（Ｂ’）のような特徴を有する不溶性窒素成分を含むものであっても良い。
この（Ｂ）または（Ｂ’）のような特徴を有する不溶性窒素成分として、例えば、市販のソイプロ（Ｊ−オイルミルズ製（登録商標））等が挙げられる。このような特徴を有する「大豆由来の不溶性窒素成分」は、脱脂大豆を乾燥し、粉砕することで調製することができる。
この（Ｂ）または（Ｂ’）のような特徴を有する「大豆由来の不溶性窒素成分」を用いた糸状菌培養用培地では、上記（Ａ）または（Ａ’）のような特徴を有する「大豆由来の不溶性窒素成分」を用いた糸状菌培養用培地と比べてやや糸状菌がペレット化しやすく、必ずしも糸状菌が完全に分散した状態で培養することはできないが、糸状菌に酵素を産生させる場合等において有用である。
また、上記（Ｂ）のような特徴に加え、さらに、抗原量５０００〜２万Ｕ／１０ｍｇであり、水溶性窒素指数（ＮＳＩ）が概ね１５以上３５未満である、（Ｂ’）のような特徴を有する不溶性窒素成分を含むものであっても良い。
この（Ｂ）または（Ｂ’）のような特徴を有する不溶性窒素成分として、例えば、市販のソイプロ（Ｊ−オイルミルズ製（登録商標））等が挙げられる。このような特徴を有する「大豆由来の不溶性窒素成分」は、脱脂大豆を乾燥し、粉砕することで調製することができる。
この（Ｂ）または（Ｂ’）のような特徴を有する「大豆由来の不溶性窒素成分」を用いた糸状菌培養用培地では、上記（Ａ）または（Ａ’）のような特徴を有する「大豆由来の不溶性窒素成分」を用いた糸状菌培養用培地と比べてやや糸状菌がペレット化しやすく、必ずしも糸状菌が完全に分散した状態で培養することはできないが、糸状菌に酵素を産生させる場合等において有用である。
本発明の培地を用いて培養する糸状菌としては、従来知られているいずれの糸状菌であっても良いが、例えば、Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ属、Ｈｕｍｉｃｏｌａ属またはＴｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ属等に属する糸状菌や難培養性の糸状菌等が挙げられる。このような糸状菌として、Ｈｕｍｉｃｏｌａ ｉｎｓｏｌｅｎｓ等が挙げられる。
本発明の「糸状菌を培養する方法」とは、本発明の大豆由来の不溶性窒素成分を含む糸状菌培養用培地を用いて、糸状菌を増殖させ、また、糸状菌に酵素を産生させる培養方法のことをいう。
本発明の「糸状菌を培養する方法」では、本発明の糸状菌培養用培地を培地として用いれば、従来、糸状菌の培養方法として知られているいずれの方法を用いても良い。例えば、液体培地を用いて糸状菌を培養する場合には、ＰＷ−１（サクラ精機製）等の市販のジャーファメンターを用いて培養してもよく、ＭＩＲ−２２０Ｒ（ＳＡＮＹＯ製）等の市販の震盪培養機を用いて震盪培養してもよい。震盪培養することにより、糸状菌の増殖や、糸状菌による酵素の産生を効率的に行うことができるため好ましい。
また、本発明の「糸状菌を培養する方法」において、糸状菌の生育を促し、生育ステージを均一にするために、糸状菌の胞子を本発明の糸状菌培養用培地に植菌して培養を行うことが好ましい。
本発明の「糸状菌を培養する方法」では、本発明の糸状菌培養用培地を培地として用いれば、従来、糸状菌の培養方法として知られているいずれの方法を用いても良い。例えば、液体培地を用いて糸状菌を培養する場合には、ＰＷ−１（サクラ精機製）等の市販のジャーファメンターを用いて培養してもよく、ＭＩＲ−２２０Ｒ（ＳＡＮＹＯ製）等の市販の震盪培養機を用いて震盪培養してもよい。震盪培養することにより、糸状菌の増殖や、糸状菌による酵素の産生を効率的に行うことができるため好ましい。
また、本発明の「糸状菌を培養する方法」において、糸状菌の生育を促し、生育ステージを均一にするために、糸状菌の胞子を本発明の糸状菌培養用培地に植菌して培養を行うことが好ましい。
本発明の「糸状菌に酵素を産生させる方法」とは、本発明の「糸状菌を培養する方法」において、さらに、糸状菌による酵素の産生を促進できる培養方法のことをいう。
本発明の「糸状菌に酵素を産生させる方法」では、本発明の糸状菌培養用培地を培地として用いれば、糸状菌に酵素を産生させるために有効な方法として知られているいずれの方法を用いても良い。例えば、前培養によって糸状菌を増殖させた後、増殖した糸状菌を効率的に酵素が産生できる培地に植菌して本培養を行うこと等が挙げられる。
本発明の「糸状菌に酵素を産生させる方法」では、本発明の糸状菌培養用培地を培地として用いれば、糸状菌に酵素を産生させるために有効な方法として知られているいずれの方法を用いても良い。例えば、前培養によって糸状菌を増殖させた後、増殖した糸状菌を効率的に酵素が産生できる培地に植菌して本培養を行うこと等が挙げられる。
ここで、前培養では、糸状菌が効率的に増殖できる「糸状菌培養用培地」を用いることが好ましく、このような「糸状菌培養用培地」として、糸状菌がペレット化せず、分散して培養できる、上記（Ａ）または（Ａ’）のような特徴を有する「大豆由来の不溶性窒素成分」を含む糸状菌培養用培地を用いることが好ましい。また、やや糸状菌がペレット化しやすく、必ずしも糸状菌が完全に分散した状態で培養を行うことはできないが、上記（Ｂ）または（Ｂ’）のような特徴を有する「大豆由来の不溶性窒素成分」を含む糸状菌培養用培地を用いることもできる。
本培養では、糸状菌が効率的に酵素を産生できる「糸状菌培養用培地」を用いることが好ましい。このような「糸状菌培養用培地」として、上記（Ａ）あるいは（Ａ’）または（Ｂ）あるいは（Ｂ’）のような特徴を有する「大豆由来の不溶性窒素成分」を含む糸状菌培養用培地を用いることができる。
特に上記（Ａ）または（Ａ’）のような特徴を有する「大豆由来の不溶性窒素成分」を含む糸状菌培養用培地を用いて糸状菌がペレット化せず、分散した状態で前培養を行い、糸状菌を効率よく増殖させた後、上記（Ｂ）または（Ｂ’）のような特徴を有する「大豆由来の不溶性窒素成分」を含む糸状菌培養用培地でこの糸状菌を本培養することにより、糸状菌に特に効率的に酵素を産生させることができる。
特に上記（Ａ）または（Ａ’）のような特徴を有する「大豆由来の不溶性窒素成分」を含む糸状菌培養用培地を用いて糸状菌がペレット化せず、分散した状態で前培養を行い、糸状菌を効率よく増殖させた後、上記（Ｂ）または（Ｂ’）のような特徴を有する「大豆由来の不溶性窒素成分」を含む糸状菌培養用培地でこの糸状菌を本培養することにより、糸状菌に特に効率的に酵素を産生させることができる。
本発明の「糸状菌に酵素を産生させる方法」により、糸状菌によって産生される「酵素」としては、キシラナーゼ活性、βキシロシダーゼ活性等を有するヘミセルラーゼ、セロビオハイドラーゼ活性、エンドグルカナーゼ活性、β−グルコシダーゼ活性等を有するセルラーゼ等の糖化酵素やプロテアーゼやリグニン分解酵素等が挙げられる。
本発明の実施例においては、本発明の糸状菌培養用培地を用いて糸状菌を培養することにより、カバ由来キシラン分解活性（主にキシラナーゼ活性）およびパラ−ニトロフェニル−β−Ｄ−キシロピラノシド分解活性（主にβ−キシロシダーゼ活性）を測定することにより、これらの酵素活性を有するヘミセルラーゼが産生され、パラ−ニトロフェニル−β−Ｄ−ラクトシド分解活性（主にセロビオハイドラーゼ活性、エンドグルカナーゼ活性）およびパラ−ニトロフェニル−β−Ｄ−グルコピラノシド分解活性（主にβ−グルコシダーゼ活性）を測定することにより、セロビオハイドラーゼ活性、エンドグルカナーゼ活性、β−グルコシダーゼ活性等を有するセルラーゼが産生されていることを確認している。
本発明の実施例においては、本発明の糸状菌培養用培地を用いて糸状菌を培養することにより、カバ由来キシラン分解活性（主にキシラナーゼ活性）およびパラ−ニトロフェニル−β−Ｄ−キシロピラノシド分解活性（主にβ−キシロシダーゼ活性）を測定することにより、これらの酵素活性を有するヘミセルラーゼが産生され、パラ−ニトロフェニル−β−Ｄ−ラクトシド分解活性（主にセロビオハイドラーゼ活性、エンドグルカナーゼ活性）およびパラ−ニトロフェニル−β−Ｄ−グルコピラノシド分解活性（主にβ−グルコシダーゼ活性）を測定することにより、セロビオハイドラーゼ活性、エンドグルカナーゼ活性、β−グルコシダーゼ活性等を有するセルラーゼが産生されていることを確認している。
本発明の「糸状菌に産生させる酵素を調節する方法」とは、本発明の「糸状菌を培養する方法」において、糸状菌の培養に用いる糸状菌培養用培地を選択することによって、糸状菌に産生させる酵素の種類や組み合わせ、量等を調節することをいう。
この糸状菌培養用培地は、その培地に含まれる成分によって選択することができ、特に、大豆由来の不溶性窒素成分によって選択することが好ましい。例えば、糸状菌培養用培地として、上記（Ａ）または（Ａ’）のような特徴を有する「大豆由来の不溶性窒素成分」を含む糸状菌培養用培地を選択し、Ｈｕｍｉｃｏｌａ ｉｎｓｏｌｅｎｓ等の糸状菌を培養する場合には、パラ−ニトロフェニル−β−Ｄ−キシロピラノシド分解活性（主にβ−キシロシダーゼ活性）（ｐＮＰ−Ｘａｓｅ）等を有するヘミセルラーゼを産生させることができ、さらにパラ−ニトロフェニル−β−Ｄ−ラクトシド分解活性（主にセロビオハイドラーゼ活性、エンドグルカナーゼ活性）（ｐＮＰ−Ｌａｓｅ）等を有するセルラーゼを多く産生させることができる。
この糸状菌培養用培地は、その培地に含まれる成分によって選択することができ、特に、大豆由来の不溶性窒素成分によって選択することが好ましい。例えば、糸状菌培養用培地として、上記（Ａ）または（Ａ’）のような特徴を有する「大豆由来の不溶性窒素成分」を含む糸状菌培養用培地を選択し、Ｈｕｍｉｃｏｌａ ｉｎｓｏｌｅｎｓ等の糸状菌を培養する場合には、パラ−ニトロフェニル−β−Ｄ−キシロピラノシド分解活性（主にβ−キシロシダーゼ活性）（ｐＮＰ−Ｘａｓｅ）等を有するヘミセルラーゼを産生させることができ、さらにパラ−ニトロフェニル−β−Ｄ−ラクトシド分解活性（主にセロビオハイドラーゼ活性、エンドグルカナーゼ活性）（ｐＮＰ−Ｌａｓｅ）等を有するセルラーゼを多く産生させることができる。
また、糸状菌培養用培地として、上記（Ｂ）または（Ｂ’）のような特徴を有する「大豆由来の不溶性窒素成分」を含む糸状菌培養用培地を選択し、Ｈｕｍｉｃｏｌａ ｉｎｓｏｌｅｎｓ等の糸状菌を培養する場合には、パラ−ニトロフェニル−β−Ｄ−ラクトシド分解活性（主にセロビオハイドラーゼ活性、エンドグルカナーゼ活性）（ｐＮＰ−Ｌａｓｅ）等を有するセルラーゼを産生させることができ、さらにパラ−ニトロフェニル−β−Ｄ−キシロピラノシド分解活性（主にβ−キシロシダーゼ活性）（ｐＮＰ−Ｘａｓｅ）等を有するヘミセルラーゼを多く産生させることができる。
本発明の「バイオマスを分解する方法」とは、上記のような糸状菌に産生させたセルラーゼ、ヘミセルラーゼ、プロテアーゼやリグニン分解酵素等によって、バイオマスを糖化し、分解することをいう。ここで、分解対象となるバイオマスとしては、バガス、ススキまたはイナワラ等の草本系バイオマスや、木質系バイオマス等が挙げられる。これらを炭素源として本発明の「糸状菌培養用培地」に加えることにより、糸状菌を培養しながら、これらのバイオマスを分解することができる。
以下、実施例によって本発明を詳細に説明するが、本発明はそれに限定されるものではない。
糸状菌培養用培地
糸状菌培養用培地として、グルコース５ｗ／ｖ％と大豆由来の不溶性窒素成分を０．３ｗ／ｖ％含む培地を調製した。この大豆由来の不溶性窒素成分は、以下のように調製したものをそれぞれ用いた。
糸状菌培養用培地として、グルコース５ｗ／ｖ％と大豆由来の不溶性窒素成分を０．３ｗ／ｖ％含む培地を調製した。この大豆由来の不溶性窒素成分は、以下のように調製したものをそれぞれ用いた。
不溶性窒素成分
１）Ｊ−オイルミルズ ソヤレックス（Ｓｏｙａｌｌｅｘ）（登録商標）
脱脂大豆（水溶性窒素指数１５〜３５程度）（Ｊ−オイルミルズ製）を、エクストルーダーＫＥＩ−８７（幸和工業株式会社製）にて、バレル温度１９０℃、圧力５４〜６９ｋｇ／ｃｍ2、回転数２８０ｒｐｍ、スクリュー配置に於いてニーディングディスクを６個含むスクリューを使用し、原料供給量７７０ｋｇ／時間、水供給量１２３リットル／時間、ダイ２．５ｍｍ×２２６穴の条件下で処理し、大気中に押し出して膨化、変性させた。この処理物を３〜５ｍｍ程度に切断し、８０℃の温風で充分に乾燥し、これを粉砕機ＡＣＭ−１００（ホソカワミクロン製）にて粉砕したものを、Ｊ−オイルミルズ ソヤレックス（Ｓｏｙａｌｌｅｘ）（登録商標）として調製した。
このように調製された不溶性窒素成分は、水分８％以下、粗たん白質含量４７％以上、粗繊維７％以下、粗灰分６．８％以下、窒素分７．５２％以上、粒度０．１０６ｍｍ（１５０メッシュ）パス９０％以上、抗原量１００Ｕ／１０ｍｇ以下であるという特徴（Ａ）を有する。
１）Ｊ−オイルミルズ ソヤレックス（Ｓｏｙａｌｌｅｘ）（登録商標）
脱脂大豆（水溶性窒素指数１５〜３５程度）（Ｊ−オイルミルズ製）を、エクストルーダーＫＥＩ−８７（幸和工業株式会社製）にて、バレル温度１９０℃、圧力５４〜６９ｋｇ／ｃｍ2、回転数２８０ｒｐｍ、スクリュー配置に於いてニーディングディスクを６個含むスクリューを使用し、原料供給量７７０ｋｇ／時間、水供給量１２３リットル／時間、ダイ２．５ｍｍ×２２６穴の条件下で処理し、大気中に押し出して膨化、変性させた。この処理物を３〜５ｍｍ程度に切断し、８０℃の温風で充分に乾燥し、これを粉砕機ＡＣＭ−１００（ホソカワミクロン製）にて粉砕したものを、Ｊ−オイルミルズ ソヤレックス（Ｓｏｙａｌｌｅｘ）（登録商標）として調製した。
このように調製された不溶性窒素成分は、水分８％以下、粗たん白質含量４７％以上、粗繊維７％以下、粗灰分６．８％以下、窒素分７．５２％以上、粒度０．１０６ｍｍ（１５０メッシュ）パス９０％以上、抗原量１００Ｕ／１０ｍｇ以下であるという特徴（Ａ）を有する。
２）ソイプロ（登録商標）
脱脂大豆（水溶性窒素指数１５〜３５程度）（Ｊ−オイルミルズ製）を、粉砕機ＡＣＭ−１００（ホソカワミクロン製）でソイプロ（登録商標）として調製した。このように調製された不溶性窒素成分は、水分１２％以下、粗たん白質含量５１．１２５％以上（無水物換算）、粗繊維３〜７％、粗灰分６〜７％、窒素分８．１８％以上（無水物換算）、粒度０．３５５ｍｍ以上痕跡、０．２５ｍｍ（６０メッシュ）パス９０％以上、０．１５ｍｍ（１００メッシュ）パス５０％以上、ウレアーゼ活性度０．３以下であるという特徴（Ｂ）を有する。
脱脂大豆（水溶性窒素指数１５〜３５程度）（Ｊ−オイルミルズ製）を、粉砕機ＡＣＭ−１００（ホソカワミクロン製）でソイプロ（登録商標）として調製した。このように調製された不溶性窒素成分は、水分１２％以下、粗たん白質含量５１．１２５％以上（無水物換算）、粗繊維３〜７％、粗灰分６〜７％、窒素分８．１８％以上（無水物換算）、粒度０．３５５ｍｍ以上痕跡、０．２５ｍｍ（６０メッシュ）パス９０％以上、０．１５ｍｍ（１００メッシュ）パス５０％以上、ウレアーゼ活性度０．３以下であるという特徴（Ｂ）を有する。
糸状菌培養用培地の調製方法
蒸留水１００ｍｌを５００ｍｌ三角フラスコに入れ、グルコース５ｗ／ｖ％、不溶性窒素成分０．３ｗ／ｖ％を添加しよく溶かした。その後、オートクレーブ（ＥＳ−３１５：ＴＯＭＹ製）で１２１℃、２０分高温高圧滅菌を行い、糸状菌培養用培地とした。
蒸留水１００ｍｌを５００ｍｌ三角フラスコに入れ、グルコース５ｗ／ｖ％、不溶性窒素成分０．３ｗ／ｖ％を添加しよく溶かした。その後、オートクレーブ（ＥＳ−３１５：ＴＯＭＹ製）で１２１℃、２０分高温高圧滅菌を行い、糸状菌培養用培地とした。
糸状菌の培養
実施例１で調製した糸状菌培養用培地を用い、糸状菌の培養を行った。比較として、基本培地を用いた培養も行った。
１．糸状菌
Ｈｕｍｉｃｏｌａ ｉｎｓｏｌｅｎｓ ＡＴＣＣ２６９０８株（ＡＴＣＣ（Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｔｙｐｅ Ｃｕｌｔｕｒｅ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ）の菌株保存機関より住商ファーマインターナショナル社を通じて入手した）を用いた。
実施例１で調製した糸状菌培養用培地を用い、糸状菌の培養を行った。比較として、基本培地を用いた培養も行った。
１．糸状菌
Ｈｕｍｉｃｏｌａ ｉｎｓｏｌｅｎｓ ＡＴＣＣ２６９０８株（ＡＴＣＣ（Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｔｙｐｅ Ｃｕｌｔｕｒｅ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ）の菌株保存機関より住商ファーマインターナショナル社を通じて入手した）を用いた。
２．前培養用培地
１）糸状菌培養用培地
実施例１で調製した糸状菌培養用培地を用いた。
２）基本培地
グルコース５ｗ／ｖ％、Ｙｅａｓｔ ｅｘｔｒａｃｔ２ｗ／ｖ％、Ｐｏｌｙｐｅｐｔｏｎ０．１ｗ／ｖ％、硫酸マグネシウム０．０３ｗ／ｖ％、塩化カルシウム０．０３ｗ／ｖ％を含む培地を基本培地として調製した。
即ち、蒸留水５０ｍｌを５００ｍｌ三角フラスコに入れ、グルコース（関東化学製）５ｗ／ｖ％、Ｙｅａｓｔ ｅｘｔｒａｃｔ（ＢＤ製）２ｗ／ｖ％、Ｐｏｌｙｐｅｐｔｏｎ（日本製薬製）０．１ｗ／ｖ％、を添加しよく溶かした。その後、オートクレーブ（ＥＳ−３１５：ＴＯＭＹ製）で１２１℃、２０分高温高圧滅菌を行った（１）。
次に１０ｗ／ｖ％硫酸マグネシウム水溶液（和光純薬製）、１０ｗ／ｖ％塩化カルシウム水溶液（和光純薬製）を調製し、オートクレーブ（ＥＳ−３１５：ＴＯＭＹ製）で上記と同様に滅菌した後、０．０３ｗ／ｖ％になるように上記（１）に無菌的に添加し、基本培地とした。
１）糸状菌培養用培地
実施例１で調製した糸状菌培養用培地を用いた。
２）基本培地
グルコース５ｗ／ｖ％、Ｙｅａｓｔ ｅｘｔｒａｃｔ２ｗ／ｖ％、Ｐｏｌｙｐｅｐｔｏｎ０．１ｗ／ｖ％、硫酸マグネシウム０．０３ｗ／ｖ％、塩化カルシウム０．０３ｗ／ｖ％を含む培地を基本培地として調製した。
即ち、蒸留水５０ｍｌを５００ｍｌ三角フラスコに入れ、グルコース（関東化学製）５ｗ／ｖ％、Ｙｅａｓｔ ｅｘｔｒａｃｔ（ＢＤ製）２ｗ／ｖ％、Ｐｏｌｙｐｅｐｔｏｎ（日本製薬製）０．１ｗ／ｖ％、を添加しよく溶かした。その後、オートクレーブ（ＥＳ−３１５：ＴＯＭＹ製）で１２１℃、２０分高温高圧滅菌を行った（１）。
次に１０ｗ／ｖ％硫酸マグネシウム水溶液（和光純薬製）、１０ｗ／ｖ％塩化カルシウム水溶液（和光純薬製）を調製し、オートクレーブ（ＥＳ−３１５：ＴＯＭＹ製）で上記と同様に滅菌した後、０．０３ｗ／ｖ％になるように上記（１）に無菌的に添加し、基本培地とした。
３）比較用培地
グルコース５ｗ／ｖ％、比較用窒素成分０．３ｗ／ｖ％、硫酸マグネシウム０．０３ｗ／ｖ％、塩化カルシウム０．０３ｗ／ｖ％を含む培地を比較用培地として調製した。
比較用窒素成分は、Ｐｏｌｙｐｅｐｔｏｎ−Ｙ（日本製薬製）、ＰｈｙｔｏｎｅＰｅｐｔｏｎ（ＢＢＬ製）、ゼラチンペプトン（ｎａｃａｌａｉ ｔｅｓｑｕｅ製）、乾燥おから（さとの雪食品製）、小麦ふすま（ナチュラルキッチン製）、米ぬか（ノイマン製）、魚粉（益川商店製）、菜種ミール（Ｊ−オイルミルズ製）、コーングルテンミール（Ｊ−オイルミルズ製）、脱脂大豆（Ｊ−オイルミルズ製）またはペプトン（極東製薬工業製）をそれぞれ用い、上記２）の基本培地と同様に比較用培地を調製した。
グルコース５ｗ／ｖ％、比較用窒素成分０．３ｗ／ｖ％、硫酸マグネシウム０．０３ｗ／ｖ％、塩化カルシウム０．０３ｗ／ｖ％を含む培地を比較用培地として調製した。
比較用窒素成分は、Ｐｏｌｙｐｅｐｔｏｎ−Ｙ（日本製薬製）、ＰｈｙｔｏｎｅＰｅｐｔｏｎ（ＢＢＬ製）、ゼラチンペプトン（ｎａｃａｌａｉ ｔｅｓｑｕｅ製）、乾燥おから（さとの雪食品製）、小麦ふすま（ナチュラルキッチン製）、米ぬか（ノイマン製）、魚粉（益川商店製）、菜種ミール（Ｊ−オイルミルズ製）、コーングルテンミール（Ｊ−オイルミルズ製）、脱脂大豆（Ｊ−オイルミルズ製）またはペプトン（極東製薬工業製）をそれぞれ用い、上記２）の基本培地と同様に比較用培地を調製した。
３．本培養用培地
炭素源としてコシヒカリのイナワラを一週間程度天日干しして乾燥し実験用カッティングミルＰ−１５（ＦＲＩＴＳＣＨ製）にて粉砕した後、８０メッシュで篩別したものを５ｗ／ｖ％含み、窒素源としてＪ−オイルミルズ ソヤレックス（Ｓｏｙａｌｌｅｘ）（登録商標）として調製した不溶性窒素成分を０．３ｗ／ｖ％含むものをｐＨ６．０としたものを本培養用の糸状菌培養用培地として調製した。
即ち、蒸留水１００ｍｌを５００ｍｌ三角フラスコに入れ、イナワラ５ｗ／ｖ％、不溶性窒素成分０．３ｗ／ｖ％を添加しよく溶かした。その後、オートクレーブ（ＥＳ−３１５：ＴＯＭＹ製）で１２１℃、２０分高温高圧滅菌を行い、本培養用の糸状菌培養用培地とした。
炭素源としてコシヒカリのイナワラを一週間程度天日干しして乾燥し実験用カッティングミルＰ−１５（ＦＲＩＴＳＣＨ製）にて粉砕した後、８０メッシュで篩別したものを５ｗ／ｖ％含み、窒素源としてＪ−オイルミルズ ソヤレックス（Ｓｏｙａｌｌｅｘ）（登録商標）として調製した不溶性窒素成分を０．３ｗ／ｖ％含むものをｐＨ６．０としたものを本培養用の糸状菌培養用培地として調製した。
即ち、蒸留水１００ｍｌを５００ｍｌ三角フラスコに入れ、イナワラ５ｗ／ｖ％、不溶性窒素成分０．３ｗ／ｖ％を添加しよく溶かした。その後、オートクレーブ（ＥＳ−３１５：ＴＯＭＹ製）で１２１℃、２０分高温高圧滅菌を行い、本培養用の糸状菌培養用培地とした。
４．糸状菌培養
１）前培養
上記の前培養用培地（糸状菌培養用培地、基本培地または比較用培地）をそれぞれ５０ｍＬいれた５００ｍＬ三角フラスコに、糸状菌を１白金耳植菌し、２００ｒｐｍ、３０℃で３日間、震盪培養機（ＭＩＲ−２２０Ｒ：ＳＡＮＹＯ製）を用いて震盪培養した。
基本培地で前培養した場合、図１、Ａ．に示したように、菌体は、１ｃｍほどのぺレツトを形成したが、本願発明の糸状菌培養用培地で前培養した場合は、図１、Ｂ．に示したように、ペレットを形成せず、菌体が分散した状態で前培養できることが確認できた。
比較用培地で前培養した場合は、図２に一例を示したが、いずれの比較用窒素成分を使用した場合も糸状菌がペレットを形成してしまい、十分に増殖が行えないことが確認された。
１）前培養
上記の前培養用培地（糸状菌培養用培地、基本培地または比較用培地）をそれぞれ５０ｍＬいれた５００ｍＬ三角フラスコに、糸状菌を１白金耳植菌し、２００ｒｐｍ、３０℃で３日間、震盪培養機（ＭＩＲ−２２０Ｒ：ＳＡＮＹＯ製）を用いて震盪培養した。
基本培地で前培養した場合、図１、Ａ．に示したように、菌体は、１ｃｍほどのぺレツトを形成したが、本願発明の糸状菌培養用培地で前培養した場合は、図１、Ｂ．に示したように、ペレットを形成せず、菌体が分散した状態で前培養できることが確認できた。
比較用培地で前培養した場合は、図２に一例を示したが、いずれの比較用窒素成分を使用した場合も糸状菌がペレットを形成してしまい、十分に増殖が行えないことが確認された。
２）本培養
上記糸状菌培養用培地で前培養した糸状菌を１０ｗ／ｖ％となるように、上記の本培養用の糸状菌培養用培地１Ｌに加え、２Ｌジャーファメンター（ＰＷ−１：サクラ精機製）を用いて、通気量はｌｖｖｍ、回転数は溶存酸素量に合わせ２００ｒｐｍ〜５００ｒｐｍで制御し、１０日間培養を行った。
２４時間おきに培養上清を１０ｍＬずつ採取し、採取したサンプルについてＰＨを６．０に調整し、次のような手法により、還元糖および遊離糖を測定することで、ヘミセルラーゼ等の酵素活性を調べた。
上記糸状菌培養用培地で前培養した糸状菌を１０ｗ／ｖ％となるように、上記の本培養用の糸状菌培養用培地１Ｌに加え、２Ｌジャーファメンター（ＰＷ−１：サクラ精機製）を用いて、通気量はｌｖｖｍ、回転数は溶存酸素量に合わせ２００ｒｐｍ〜５００ｒｐｍで制御し、１０日間培養を行った。
２４時間おきに培養上清を１０ｍＬずつ採取し、採取したサンプルについてＰＨを６．０に調整し、次のような手法により、還元糖および遊離糖を測定することで、ヘミセルラーゼ等の酵素活性を調べた。
還元糖の測定（ＤＮＳ）
表１の組成で混合した混合液のうち１００μＬに、ＤＮＳ試薬３００μＬを加え、５０℃で６０分間反応させた後、１００℃で５分間おくことにより反応を停止した。この反応溶液５０μＬを１０００μＬの滅菌水で希釈した後、吸光度（５００ｎｍ）を測定した。
ＤＮＳ試薬の調製および還元糖の測定は、以下の文献を参考にして、次のように行った。
文献：Ｕｓｅ ｏｆ ｄｉｎｉｔｒｏｓａｌｉｃｙｌｉｃ ａｃｉｄ ｒｅａｇｅｎｔ ｆｏｒ ｄｅｔｅｒｍｉｎａｔｉｏｎ ｏｆ ｒｅｄｕｃｉｎｇ ｓｕｇａｒ；Ｇ．Ｌ． Ｍｉｌｌｅｒ；Ａｎａｌ． Ｃｈｅｍ．， ３１， ４２６−４２８ （１９５９）
表１の組成で混合した混合液のうち１００μＬに、ＤＮＳ試薬３００μＬを加え、５０℃で６０分間反応させた後、１００℃で５分間おくことにより反応を停止した。この反応溶液５０μＬを１０００μＬの滅菌水で希釈した後、吸光度（５００ｎｍ）を測定した。
ＤＮＳ試薬の調製および還元糖の測定は、以下の文献を参考にして、次のように行った。
文献：Ｕｓｅ ｏｆ ｄｉｎｉｔｒｏｓａｌｉｃｙｌｉｃ ａｃｉｄ ｒｅａｇｅｎｔ ｆｏｒ ｄｅｔｅｒｍｉｎａｔｉｏｎ ｏｆ ｒｅｄｕｃｉｎｇ ｓｕｇａｒ；Ｇ．Ｌ． Ｍｉｌｌｅｒ；Ａｎａｌ． Ｃｈｅｍ．， ３１， ４２６−４２８ （１９５９）
使用薬品
水酸化ナトリウム（和光純薬工業製）、３，５ジニトロサリチル酸（ＤＮＳ）（東京化成工業製）、ロッシェル塩（和光純薬工業製）、結晶フェノール（和光純薬工業製 核酸抽出用）、炭酸水素ナトリウム（和光純薬工業製）、ろ紙（Ｗｈａｔｍａｎ（登録商標） Ｎｏ，１）、リン酸二水素ナトリウム（和光純薬工業製）、リン酸水素二ナトリウム（和光純薬工業製）、カルボキシメチルセルロースナトリウム（ＣＭＣ）（ナカライテスク製）Ｘｙｌａｎ Ｂｉｒｃｈｗｏｏｄ（ＳＩＧＭＡ製）
水酸化ナトリウム（和光純薬工業製）、３，５ジニトロサリチル酸（ＤＮＳ）（東京化成工業製）、ロッシェル塩（和光純薬工業製）、結晶フェノール（和光純薬工業製 核酸抽出用）、炭酸水素ナトリウム（和光純薬工業製）、ろ紙（Ｗｈａｔｍａｎ（登録商標） Ｎｏ，１）、リン酸二水素ナトリウム（和光純薬工業製）、リン酸水素二ナトリウム（和光純薬工業製）、カルボキシメチルセルロースナトリウム（ＣＭＣ）（ナカライテスク製）Ｘｙｌａｎ Ｂｉｒｃｈｗｏｏｄ（ＳＩＧＭＡ製）
測定手法
１）ＤＮＳ試薬溶液の調製
４．５％の水酸化ナトリウム水溶液６０ｍＬと１％ＤＮＳ水溶液１７６ｍＬを混合し４５ｇのロッシェル塩を加え完全に溶解させた。（Ａ液）
１０％水酸化ナトリウム水溶液４．４ｍＬに結晶フェノール２ｇを加え完全に溶解させ、純水で２０ｍＬにフィルアップした。この溶液１３．８ｍＬに炭酸水素ナトリウムを１．３８ｇ完全に溶かした。（Ｂ液）
Ｂ液にＡ液を全量加えよく攪拌させ、さらにロッシェル塩を飽和するまで溶かしこみ遮光して室温で２日以上安定させた。この操作でできた溶液をＤＮＳ試薬溶液とした。
１）ＤＮＳ試薬溶液の調製
４．５％の水酸化ナトリウム水溶液６０ｍＬと１％ＤＮＳ水溶液１７６ｍＬを混合し４５ｇのロッシェル塩を加え完全に溶解させた。（Ａ液）
１０％水酸化ナトリウム水溶液４．４ｍＬに結晶フェノール２ｇを加え完全に溶解させ、純水で２０ｍＬにフィルアップした。この溶液１３．８ｍＬに炭酸水素ナトリウムを１．３８ｇ完全に溶かした。（Ｂ液）
Ｂ液にＡ液を全量加えよく攪拌させ、さらにロッシェル塩を飽和するまで溶かしこみ遮光して室温で２日以上安定させた。この操作でできた溶液をＤＮＳ試薬溶液とした。
２）還元糖の測定
１Ｍリン酸二水素ナトリウム水溶液３９ｍＬと、１Ｍリン酸水素二ナトリウム水溶液６１ｍＬを混合し、ｐＨを６に調整した物をリン酸バッファーとした。
氷上にてリン酸バッファー２５μＬ、純水９７５μＬ、１％ＣＭＣまたは１％Ｘｙｌａｎ Ｂｉｒｃｈｗｏｏｄを１２５μＬ、培養上清１２５μＬを入れ、激しく攪拌した。
以下の操作は三連で行った。
混合した溶液のうち１００μＬを予め反応の０時間として採取し、氷上に保管しておいた。残った溶液を１５０μＬずつ採取した。５０℃の湯を入れたウォーターバスに浮かべ１時間反応させた。反応後は、直ちに氷上に移し５分間急冷した。
溶液は次に氷上で１００μＬずつ分注し、０時間として保管しておいたサンプルとともに１）で調製したＤＮＳ試薬を３００μＬずつ加え、よく攪拌した。その後５分間煮沸しその後直ちに冷水で５分間冷却した。
最後にそこから５０μＬ採取し、１０００μＬの純水で希釈した後、分光光度計（ＢＥＣＫＭＡＮ ＣＯＵＬＴＥＲ ＤＵ７３０）でＯＤ５００ｎｍの波長の吸光度を測定した。
１Ｍリン酸二水素ナトリウム水溶液３９ｍＬと、１Ｍリン酸水素二ナトリウム水溶液６１ｍＬを混合し、ｐＨを６に調整した物をリン酸バッファーとした。
氷上にてリン酸バッファー２５μＬ、純水９７５μＬ、１％ＣＭＣまたは１％Ｘｙｌａｎ Ｂｉｒｃｈｗｏｏｄを１２５μＬ、培養上清１２５μＬを入れ、激しく攪拌した。
以下の操作は三連で行った。
混合した溶液のうち１００μＬを予め反応の０時間として採取し、氷上に保管しておいた。残った溶液を１５０μＬずつ採取した。５０℃の湯を入れたウォーターバスに浮かべ１時間反応させた。反応後は、直ちに氷上に移し５分間急冷した。
溶液は次に氷上で１００μＬずつ分注し、０時間として保管しておいたサンプルとともに１）で調製したＤＮＳ試薬を３００μＬずつ加え、よく攪拌した。その後５分間煮沸しその後直ちに冷水で５分間冷却した。
最後にそこから５０μＬ採取し、１０００μＬの純水で希釈した後、分光光度計（ＢＥＣＫＭＡＮ ＣＯＵＬＴＥＲ ＤＵ７３０）でＯＤ５００ｎｍの波長の吸光度を測定した。
遊離糖の測定（ｐＮＰ）
表２の組成で混合し、リン酸バッファーでｐＨ６．０に調製したものを５０℃で１０分間反応させた後、１Ｍ炭酸ナトリウムを１００μＬ加えることで反応を停止した。この反応溶液の吸光度（４１５ｎｍ）を測定した。
表２の組成で混合し、リン酸バッファーでｐＨ６．０に調製したものを５０℃で１０分間反応させた後、１Ｍ炭酸ナトリウムを１００μＬ加えることで反応を停止した。この反応溶液の吸光度（４１５ｎｍ）を測定した。
その結果、図３に示したように、培養日数が本培養開始から３日目以降では、カバ由来キシラン分解活性（主にキシラナーゼ活性）（図３、ＸＹＬａｓｅ）、パラ−ニトロフェニル−β−Ｄ−キシロピラノシド分解活性（主にβ−キシロシダーゼ活性）（図３、ｐＮＰ−Ｘａｓｅ）、パラ−ニトロフェニル−β−Ｄ−ラクトシド分解活性（主にセロビオハイドラーゼ活性、エンドグルカナーゼ活性）（図３、ｐＮＰ−Ｌａｓｅ）が上昇することが確認された。
一方、パラ−ニトロフェニル−β−Ｄ−グルコピラノシド分解活性（主にβ−グルコシダーゼ活性）（図３、ｐＮＰ−Ｇａｓｅ）、カルボキシメチルセルロース分解活性（主にエンドグルカナーゼ活性）（図３、ＣＭＣａｓｅ）は本培養の開始から７日目以降の後期になって始めて活性の上昇が確認され、カルボキシメチルセルロース分解活性に関しては、培養期間を通してほとんど活性がみられなかった。
従って、この結果より、本発明の糸状菌培養用培地を用いて糸状菌を培養することにより、糸状菌にキシラナーゼ活性、βキシロシダーゼ活性等を有するヘミセルラーゼおよびセロビオハイドラーゼ活性、エンドグルカナーゼ活性、β−グルコシダーゼ活性等を有するセルラーゼ等を産生させることができることが確認できた。
一方、パラ−ニトロフェニル−β−Ｄ−グルコピラノシド分解活性（主にβ−グルコシダーゼ活性）（図３、ｐＮＰ−Ｇａｓｅ）、カルボキシメチルセルロース分解活性（主にエンドグルカナーゼ活性）（図３、ＣＭＣａｓｅ）は本培養の開始から７日目以降の後期になって始めて活性の上昇が確認され、カルボキシメチルセルロース分解活性に関しては、培養期間を通してほとんど活性がみられなかった。
従って、この結果より、本発明の糸状菌培養用培地を用いて糸状菌を培養することにより、糸状菌にキシラナーゼ活性、βキシロシダーゼ活性等を有するヘミセルラーゼおよびセロビオハイドラーゼ活性、エンドグルカナーゼ活性、β−グルコシダーゼ活性等を有するセルラーゼ等を産生させることができることが確認できた。
また、本培養の開始から培養日数が８日目の培地を顕微鏡で観察したところ、図４の写真（左）に示したように、Ｈｕｍｉｃｏｌａ ｉｎｓｏｌｅｎｓ ＡＴＣＣ２６９０８株がイナワラ粉末に対し菌糸を伸ばし分解しようとしていることが観察された。
また、図４の写真（右）においてイナワラの細胞壁がわからないほど分解されていることも観察された。従って、これらより、Ｈｕｍｉｃｏｌａ ｉｎｓｏｌｅｎｓ ＡＴＣＣ２６９０８株によってイナワラ粉末を資化できることが確認された。
また、図４の写真（右）においてイナワラの細胞壁がわからないほど分解されていることも観察された。従って、これらより、Ｈｕｍｉｃｏｌａ ｉｎｓｏｌｅｎｓ ＡＴＣＣ２６９０８株によってイナワラ粉末を資化できることが確認された。
さらに、同様に本発明の糸状菌培養用培地で前培養したＨｕｍｉｃｏｌａ ｉｎｓｏｌｅｎｓ ＡＴＣＣ２６９０８株を用いた本培養における培養上清と、基本培地で前培養したＨｕｍｉｃｏｌａ ｉｎｓｏｌｅｎｓ ＡＴＣＣ２６９０８株を用いた本培養における培養上清との活性を比較した。
その結果、図５に示したように、ＣＭＣアーゼ活性（ＣＭＣａｓｅ）はほとんど差が見られなかった。キシラナーゼ活性（ＸＹＬａｓｅ）については、基本培地で前培養したＨｕｍｉｃｏｌａ ｉｎｓｏｌｅｎｓ ＡＴＣＣ２６９０８株を用いた場合は、ほとんど活性が見られなかったが、糸状菌培養用培地で前培養した場合には、酵素活性が著しく高まり、基本培地で前培養した場合と比べて約１０００倍の活性を示すことが確認された。
この活性値は、キシラナーゼ分解酵素（キシラナーゼ分解活性：４００ｕｎｉｔ／ｍ）として市販されているノボザイムＨ−ＴＥＣＵ（ノボザイム製）の活性の約１０分の１程度であるが、さらなる上昇も可能であり、この点からも本発明の糸状菌培養用培地で前培養したＨｕｍｉｃｏｌａ ｉｎｓｏｌｅｎｓ ＡＴＣＣ２６９０８株を用いることにより、イナワラ等のバイオマスの分解が可能であることが十分に示唆された。従ってこの結果から、ペレットを形成せず、分散した状態で前培養を行い、十分に増殖した糸状菌を用いることが、バイオマスの分解において好ましいものと考えられた。
その結果、図５に示したように、ＣＭＣアーゼ活性（ＣＭＣａｓｅ）はほとんど差が見られなかった。キシラナーゼ活性（ＸＹＬａｓｅ）については、基本培地で前培養したＨｕｍｉｃｏｌａ ｉｎｓｏｌｅｎｓ ＡＴＣＣ２６９０８株を用いた場合は、ほとんど活性が見られなかったが、糸状菌培養用培地で前培養した場合には、酵素活性が著しく高まり、基本培地で前培養した場合と比べて約１０００倍の活性を示すことが確認された。
この活性値は、キシラナーゼ分解酵素（キシラナーゼ分解活性：４００ｕｎｉｔ／ｍ）として市販されているノボザイムＨ−ＴＥＣＵ（ノボザイム製）の活性の約１０分の１程度であるが、さらなる上昇も可能であり、この点からも本発明の糸状菌培養用培地で前培養したＨｕｍｉｃｏｌａ ｉｎｓｏｌｅｎｓ ＡＴＣＣ２６９０８株を用いることにより、イナワラ等のバイオマスの分解が可能であることが十分に示唆された。従ってこの結果から、ペレットを形成せず、分散した状態で前培養を行い、十分に増殖した糸状菌を用いることが、バイオマスの分解において好ましいものと考えられた。
糸状菌培養
１）前培養
実施例１と同様に調製した前培養用の糸状菌培養用培地（不溶性窒素成分：Ｊ−オイルミルズ ソヤレックス（Ｓｏｙａｌｌｅｘ）（登録商標））５０ｍｌに、糸状菌の胞子を１白金耳植菌し、２００ｒｐｍ、３０℃で３日間、震盪培養機（ＭＩＲ−２２０Ｒ：ＳＡＮＹＯ製）を用いて震盪培養した。
２）本培養
実施例２と同様に調製した本培養用の糸状菌培養用培地（不溶性窒素成分：Ｊ−オイルミルズ ソヤレックス（Ｓｏｙａｌｌｅｘ）（登録商標）またはソイプロ（登録商標）（いずれも５ｗ／ｖ％））１００ｍｌに、上記１）の前培養で得られた糸状菌培養液をそれぞれ１０ｗ／ｖ％となるように加え、２００ｒｐｍ、３０℃で１０日間、震盪培養機（ＭＩＲ−２２０Ｒ：ＳＡＮＹＯ製）を用いて震盪培養した。
本培養終了後（１０日目）の培養上清を採取し、採取したサンプルについて実施例２と同様の方法で遊離糖を測定することで、ヘミセルラーゼ等の酵素活性を調べた。
１）前培養
実施例１と同様に調製した前培養用の糸状菌培養用培地（不溶性窒素成分：Ｊ−オイルミルズ ソヤレックス（Ｓｏｙａｌｌｅｘ）（登録商標））５０ｍｌに、糸状菌の胞子を１白金耳植菌し、２００ｒｐｍ、３０℃で３日間、震盪培養機（ＭＩＲ−２２０Ｒ：ＳＡＮＹＯ製）を用いて震盪培養した。
２）本培養
実施例２と同様に調製した本培養用の糸状菌培養用培地（不溶性窒素成分：Ｊ−オイルミルズ ソヤレックス（Ｓｏｙａｌｌｅｘ）（登録商標）またはソイプロ（登録商標）（いずれも５ｗ／ｖ％））１００ｍｌに、上記１）の前培養で得られた糸状菌培養液をそれぞれ１０ｗ／ｖ％となるように加え、２００ｒｐｍ、３０℃で１０日間、震盪培養機（ＭＩＲ−２２０Ｒ：ＳＡＮＹＯ製）を用いて震盪培養した。
本培養終了後（１０日目）の培養上清を採取し、採取したサンプルについて実施例２と同様の方法で遊離糖を測定することで、ヘミセルラーゼ等の酵素活性を調べた。
その結果、図６に示したように、本培養においてソイプロ（登録商標）を窒素源とする糸状菌培養用培地を用いた場合（図６、Ｂ）は、Ｊ−オイルミルズ ソヤレックス（Ｓｏｙａｌｌｅｘ）（登録商標）を窒素源とする糸状菌培養用培地を用いた場合（図６、Ａ）よりもヘミセルラーゼ活性が上昇する事が確認された。
したがって、この結果より、窒素源としてＪ−オイルミルズ ソヤレックス（Ｓｏｙａｌｌｅｘ）（登録商標）を含む培地で糸状菌を前培養した後、窒素源としてソイプロ（登録商標）を含む培地で本培養を行うことにより、糸状菌の酵素産生効率を高めることができた。
したがって、この結果より、窒素源としてＪ−オイルミルズ ソヤレックス（Ｓｏｙａｌｌｅｘ）（登録商標）を含む培地で糸状菌を前培養した後、窒素源としてソイプロ（登録商標）を含む培地で本培養を行うことにより、糸状菌の酵素産生効率を高めることができた。
また、Ｊ−オイルミルズ ソヤレックス（Ｓｏｙａｌｌｅｘ）（登録商標）を窒素源とする糸状菌培養用培地で本培養を行なった場合は、パラ−ニトロフェニル−β−Ｄ−キシロピラノシド分解活性（主にβ−キシロシダーゼ活性）（ｐＮＰ−Ｘａｓｅ）と比べて、さらにパラ−ニトロフェニル−β−Ｄ−ラクトシド分解活性（主にセロビオハイドラーゼ活性、エンドグルカナーゼ活性）（ｐＮＰ−Ｌａｓｅ）が高かった。
一方で、ソイプロ（登録商標）を窒素源とする糸状菌培養用培地で本培養を行なった場合はパラ−ニトロフェニル−β−Ｄ−ラクトシド分解活性（主にセロビオハイドラーゼ活性、エンドグルカナーゼ活性）（ｐＮＰ−Ｌａｓｅ）と比べて、さらにパラ−ニトロフェニル−β−Ｄ−キシロピラノシド分解活性（主にβ−キシロシダーゼ活性）（ｐＮＰ−Ｘａｓｅ）が高かったことから、糸状菌培養用培地に使用する窒素源の選択により、糸状菌に産生させる酵素の活性を調節できることが示唆された。従って、この結果より、糸状菌培養用培地に使用する窒素源等、糸状菌培養用培地やその成分を選択することにより、目的のバイオマスの種類に応じて、酵素活性の調節が可能となると考えられた。
また、この結果から、本発明の糸状菌培養培地を用い、震盪培養機ではなく、さらに、通気性、撹拌性などが向上するジャーファメンターによってスケールアップ試験を行うことにより、更なる酵素産生の効率化が可能であると予測された。
一方で、ソイプロ（登録商標）を窒素源とする糸状菌培養用培地で本培養を行なった場合はパラ−ニトロフェニル−β−Ｄ−ラクトシド分解活性（主にセロビオハイドラーゼ活性、エンドグルカナーゼ活性）（ｐＮＰ−Ｌａｓｅ）と比べて、さらにパラ−ニトロフェニル−β−Ｄ−キシロピラノシド分解活性（主にβ−キシロシダーゼ活性）（ｐＮＰ−Ｘａｓｅ）が高かったことから、糸状菌培養用培地に使用する窒素源の選択により、糸状菌に産生させる酵素の活性を調節できることが示唆された。従って、この結果より、糸状菌培養用培地に使用する窒素源等、糸状菌培養用培地やその成分を選択することにより、目的のバイオマスの種類に応じて、酵素活性の調節が可能となると考えられた。
また、この結果から、本発明の糸状菌培養培地を用い、震盪培養機ではなく、さらに、通気性、撹拌性などが向上するジャーファメンターによってスケールアップ試験を行うことにより、更なる酵素産生の効率化が可能であると予測された。
本発明によって、糸状菌培養用培地を提供することにより、セルラーゼ、ヘミセルラーゼ等の酵素を効率的に産生できる糸状菌を提供することが可能となる。このような糸状菌を用いることにより、セルラーゼ、ヘミセルラーゼ等の酵素を提供したり、イナワラ等を原料として、エタノール等を製造したりすること等が可能となる。
Claims (9)
- 次の（Ａ）または（Ｂ）の特徴を有する大豆由来の不溶性窒素成分を含むフーミコラ インソレンス（Ｈｕｍｉｃｏｌａ ｉｎｓｏｌｅｎｓ）培養用培地。
（Ａ）水分８％以下、粗たん白質含量４７％以上、粗繊維７％以下、粗灰分６．８％以下、窒素分７．５２％以上、粒度０．１０６ｍｍ（１５０メッシュ）パス９０％以上、抗原量１００Ｕ／１０ｍｇ以下
（Ｂ）水分１２％以下、粗たん白質含量５１．１２５％以上（無水物換算）、粗繊維３〜７％、粗灰分６〜７％、窒素分８．１８％以上（無水物換算）、粒度０．３５５ｍｍ以上痕跡、０．２５ｍｍパス（６０メッシュ）９０％以上、０．１５ｍｍ（１００メッシュ）パス５０％以上、ウレアーゼ活性度０．３以下 - 請求項１に記載のフーミコラ インソレンス（Ｈｕｍｉｃｏｌａ ｉｎｓｏｌｅｎｓ）培養用培地によって、フーミコラ インソレンス（Ｈｕｍｉｃｏｌａ ｉｎｓｏｌｅｎｓ）を培養する方法。
- 請求項１に記載のフーミコラ インソレンス（Ｈｕｍｉｃｏｌａ ｉｎｓｏｌｅｎｓ）培養用培地によって、フーミコラ インソレンス（Ｈｕｍｉｃｏｌａ ｉｎｓｏｌｅｎｓ）を培養することにより、フーミコラ インソレンス（Ｈｕｍｉｃｏｌａ ｉｎｓｏｌｅｎｓ）に酵素を産生させる方法。
- 酵素がセルラーゼ、ヘミセルラーゼ、プロテアーゼまたはリグニン分解酵素である請求項３に記載の方法。
- 請求項１に記載のフーミコラ インソレンス（Ｈｕｍｉｃｏｌａ ｉｎｓｏｌｅｎｓ）培養用培地によって、フーミコラ インソレンス（Ｈｕｍｉｃｏｌａ ｉｎｓｏｌｅｎｓ）を培養することにより、フーミコラ インソレンス（Ｈｕｍｉｃｏｌａ ｉｎｓｏｌｅｎｓ）に産生させる酵素を調節する方法。
- 酵素がセルラーゼ、ヘミセルラーゼ、プロテアーゼまたはリグニン分解酵素である請求項５に記載の方法。
- 請求項２に記載の方法によって培養されたフーミコラ インソレンス（Ｈｕｍｉｃｏｌａ ｉｎｓｏｌｅｎｓ）を用い、バイオマスを分解する方法。
- バイオマスが草本系バイオマスである請求項７に記載の方法。
- 草本系バイオマスがイナワラ、バガスまたはススキである請求項８に記載の方法。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP2011010086A JP5825570B2 (ja) | 2011-01-20 | 2011-01-20 | 糸状菌培養用培地 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP2011010086A JP5825570B2 (ja) | 2011-01-20 | 2011-01-20 | 糸状菌培養用培地 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JP2012147741A JP2012147741A (ja) | 2012-08-09 |
| JP5825570B2 true JP5825570B2 (ja) | 2015-12-02 |
Family
ID=46790684
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP2011010086A Expired - Fee Related JP5825570B2 (ja) | 2011-01-20 | 2011-01-20 | 糸状菌培養用培地 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| JP (1) | JP5825570B2 (ja) |
Family Cites Families (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JP5643475B2 (ja) * | 2008-03-03 | 2014-12-17 | 富山県 | 複合培養による二次代謝産物の製造方法 |
| JP5339823B2 (ja) * | 2008-09-02 | 2013-11-13 | 公益財団法人微生物化学研究会 | 新規化合物セラミダスチン、その製造方法及びその用途 |
-
2011
- 2011-01-20 JP JP2011010086A patent/JP5825570B2/ja not_active Expired - Fee Related
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| JP2012147741A (ja) | 2012-08-09 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| KR101261666B1 (ko) | 진균 배양물의 제조 방법 | |
| CN105961854A (zh) | 一种玉米秸秆饲料的制备方法 | |
| CN102627504B (zh) | 一种有机草本水果专用栽培基质及其制备方法 | |
| Kadarmoidheen et al. | Effect of cellulolytic fungi on the degradation of cellulosic agricultural wastes | |
| dos Santos et al. | Production, optimisation and partial characterisation of enzymes from filamentous fungi using dried forage cactus pear as substrate | |
| Sørensen et al. | Screening of carbon sources for beta-glucosidase production by Aspergillus saccharolyticus | |
| Pérez-Rodríguez et al. | Feruloyl esterase production by Aspergillus terreus CECT 2808 and subsequent application to enzymatic hydrolysis | |
| Carvalho et al. | Improvement of some chemical and biological methods for the efficient production of xylanases, xylooligosaccharides and lignocellulose from sugar cane bagasse | |
| Iqbal et al. | Media optimization for hyper-production of carboxymethyl cellulase using proximally analyzed agroindustrial residue with Trichoderma harzianum under SSF | |
| JP2011050359A (ja) | 新規微生物および該微生物由来の酵素、ならびにこれらを用いた糖化液の製造方法 | |
| CN104171678A (zh) | 一种马铃薯渣饲料添加剂的制作方法 | |
| Afifi | Effective technological pectinase and cellulase by Saccharomyces cervisiae utilizing food wastes for citric acid production | |
| CN101638645A (zh) | 一种固态机械发酵生产木聚糖酶方法 | |
| Gaffney et al. | Optimization of xylanase production by Thermomyces lanuginosus in solid state fermentation | |
| CN103626563A (zh) | 一种木腐型食用菌栽培基质及其制备方法 | |
| CN100379355C (zh) | 微生物固体发酵水生植物生产蛋白饲料的方法 | |
| Sanguine et al. | Xylanases of Trichoderma koningii and Trichoderma pseudokoningii: Production, characterization and application as additives in the digestibility of forage for cattle | |
| JP5825570B2 (ja) | 糸状菌培養用培地 | |
| CN108018239B (zh) | 一种耐盐纤维素降解菌剂及其制备方法与应用 | |
| CN100999713A (zh) | 一种黑曲霉菌株及其nsp酶的制备方法 | |
| CN100420735C (zh) | 臭曲霉菌株及其用途 | |
| CN106635843B (zh) | 发酵培养基、菌糠发酵菌剂及发酵方法 | |
| de Souza Araújo et al. | Changes in biochemical composition of cassava and beet residues during solid state bioprocess with Pleurotus ostreatus | |
| Walia et al. | Production of alkalophilic xylanases by Paenibacillus polymyxa CKWX1 isolated from decomposing wood | |
| Premkumar et al. | Cellulase and xylanase production by Pleurotus sp. on mixed substrate system |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| A621 | Written request for application examination |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A621 Effective date: 20131211 |
|
| A131 | Notification of reasons for refusal |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A131 Effective date: 20150225 |
|
| A521 | Written amendment |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A523 Effective date: 20150410 |
|
| TRDD | Decision of grant or rejection written | ||
| A01 | Written decision to grant a patent or to grant a registration (utility model) |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A01 Effective date: 20150924 |
|
| A61 | First payment of annual fees (during grant procedure) |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A61 Effective date: 20151002 |
|
| R150 | Certificate of patent or registration of utility model |
Ref document number: 5825570 Country of ref document: JP Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R150 |
|
| LAPS | Cancellation because of no payment of annual fees |