JP5818056B2 - 免疫性を有するペプチド(TheileriaorientalisToMRP抗原) - Google Patents
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Lymphoproliferatative group に含まれるTheileria parva(以下T.parva)やTheileria annulata(以下T.annulata)は、アフリカをはじめとする高温地域を中心に感染が確認されている。
一方、nonlymphoproliferative groupに分類されるT.orientalis (=T.selgenti)は、我が国を始め、東アジアからヨーロッパまで広範囲にその感染が確認されている。T.orientalis感染は、ダニによる吸血によってウシ体内へ送り込まれたスポロゾイトが、細網内皮系細胞に侵入してシゾントとなって増殖し、その後、血中へ出たメロゾイトが赤血球へ寄生することによって成立すると考えられている。
Lymphproliferative groupのT.parvaやT.annulataでは、寄生するシゾントがJNK1/2の恒常的活性化をもたらしてTやBリンパ球をtransformするため、リンパ系細胞の異常増殖とそれに関連すると考えられる症状lymphoproliferative disease(リンパ球増殖症)が出現する。一方、nonlymphoproliferative groupのT.orientalisには、リンパ球に対するtransform活性は確認されていない。一方で免疫系細胞から生産される活性酸素による赤血球の膜変性が生じ、脾臓の網内皮系による変性赤血球除去が亢進することで生じると考えられる貧血と、それに関連した慢性消耗疾患(Chronic Wasting Disease)が出現する事が知られている。但し、T.orientalisの感染動向を調査した結果、抗ダニ剤が普及した現在では、原虫が感染した赤血球が末梢血中に観察されるものの、貧血等の明らかな臨床所見を呈する事は稀で、大部分は不顕性感染となる。(以上、非特許文献1〜5参照)
したがって、lymphoproliferative groupに属するTheileria感染症においては、原虫抗原特異的なCD8陽性T細胞の増加を検出する事は、感染状態である事を意味する。(以上、非特許文献6〜9参照)
しかしながら、これらの事象のいずれにおいても、タイレリア抗原特異的にT細胞が存在して、免疫システムを活性化しているのかどうか、もしくは、どのような免疫応答をもたらしているのかは十分に明らかにされていない。(以上、特許文献10〜14参照)
(1)配列番号3〜5、10及び12のいずれかに示されるアミノ酸配列を有するペプチド。
(2)上記(1)に記載のペプチドからなる、ウシのT.orientalis感染症診断剤。
(3)上記(1)に記載のペプチド及びIFN-γに対する抗体及び/又はIL-10に対する抗体を少なくとも含むことを特徴とする、ウシのT.orientalis感染症診断キット。
以上のとおり、本発明のペプチド抗原はT.orientalis感染症の診断剤として、極めて有用である。
ToMRPは、T.orientalisのpiroplasmステージのcDNAライブラリーからクローニングされ、T.parvaのMRP(=p104)と相同性が高いことから、その名がつけられたものである。ToMRPの機能の多くは不明であるが、T.orientalisと同様に赤血球に寄生することが知られるPlasmodium(=マラリア)のmicroneme-rhoptry細胞内小器官に関連する遺伝子群は赤血球に侵入する際に重要な役割を果たすことが知られている。実際、ToMRPは赤血球膜を構成するBand3と結合することも知られているため、赤血球への侵入(もしくは脱出)に利用される可能性が考られる。
本発明のペプチドは、ウシのT.orientalis原虫感染の有無あるいは、その病態を診断するための診断剤として用いられる。以下に、本発明のペプチドを用いたT.orientalisの感染症の診断手法について説明する。
ウシがT.orientalis原虫に感染した場合のT細胞免疫応答は、IFN-γの分泌により特徴づけられる細胞性免疫促進型のT細胞免疫応答と、IL-10の分泌により特徴づけられる免疫抑制型のT細胞免疫応答で構成される。これらT.orientalis原虫抗原特異的なIFN-γ分泌T細胞とIL-10分泌T細胞の数は、T.orientalis感染の進行を反映し、IFN-γ分泌T細胞とIL-10分泌細胞の数がともに一定値を超えるウシは、T.orientalis感染による、貧血等の特徴的な症状が顕在化することが、MPSPペプチドを用いた解析によって明らかになっている(特許文献1)。
T.orientalis抗原ToMRP特異的に応答してIFN-γを分泌するT細胞もしくは、IL-10を分泌するT細胞は、それぞれIFN-γ ELISpot法およびIL-10 ELISpot法によって検出される(最終的にT.orientalis抗原ToMRP特異的に応答するIFN-γ分泌T細胞及びIL-10分泌T細胞数がスポット数として計測される)(特許文献1)。
本発明のペプチドを使用するウシT.orientalis感染症の診断に使用される被験試料のPBMCs懸濁液は、ウシから採取された末梢血から精製されたものをそのまま用いてもよいし、また、凍結保存したものを用いてもよい。
サイトカイン分泌T細胞の数を測定する方法は、抗体による細胞内染色を行ないフローサイトメーターで検出する等いくつか知られているが、本願発明においては、感度の高さおよび抗原特異的T細胞を検出する目的からELISpot(Enzyme-Linked ImmunoSpot)法が好ましく用いられる。
本実施例において用いた手法及び抗原ペプチドは以下に示される。
1)ELISpotアッセイの準備
下記の免疫活性化反応の培養が終了するまでの操作は安全キャビネットもしくはクリーンベンチ内で無菌的に行った。
底面がPolyVinylidine DiFluoride(PVDF)メンブランで構成されている96ウエルプレート(Millipore社)を準備し、各ウエルへ70%EtOHを50μlずつ加え30秒−2分間処理することにより疎水性PVDFメンブランの親水処理を行った。ウエル内のEtOHをアスピレーターにより吸引除去後、Phosphate Buffered Saline(Ca2+ Mg2+ 無添加)(PBS)を各ウエルあたり150μl加えた後にアスピレーターで取り除く洗浄作業を5回繰り返す。洗浄操作が終了した後、抗bovine IFN-γキャプチャー抗体(MABTECH code 3115-3)または、抗IL-10キャプチャー抗体(AbD serotec,code MCA2110,clone CC318)をPBSにより7.5μg/mlに希釈し、80μlずつ加え4℃、一晩処理することにより底面のPVDF メンブランへキャプチャー抗体をコーティングさせた。翌日に余剰なキャプチャー抗体はアスピレーターにより吸引除去後、各ウエルを150μlのPBSで洗浄作業を行った。洗浄終了後のウエルにはRPMIコンプリートメディウム(RPMIメディウムへ最終濃度10%FCS(本実験系では非働化処理したFCSを使用)、50μM2-メルカプトエタノール、100units/ml penicillin、100μg/ml streptomycinになるように添加したもの)を100μlずつ加えて室温30分間もしくは4℃、1時間以上のブロッキング処理を行った。また、処理温度が4℃でのブロッキング処理を行った場合はELISpot assayを行う前にプレートを室温へ戻した。
目的のウシ個体から抗凝固処理した末梢血液を遠心することでPBMCsを含むバフィーコートを形成させた。同バフィーコートを慎重に回収後、混入してきた赤血球をHISTOPAQE(登録商標)-1077(SIGMA-ALDRICH社)を使用した密度遠心分離法によって取り除くことで、精製PBMCsを得た。また、単離後すぐに使用しない場合は細胞凍結保護液CP-1(極東製薬工業株式会社)などを用いて必要になるまで保存した。精製・回収されたPBMCsはRPMIコンプリートメディウムで洗浄後、同メディウムへ再懸濁させ細胞数検出キットNucleoCassetteTM(chemometec)もしくは血球計算盤を用いて細胞数を算出しておいた。
上記1)のキャプチャー抗体がコーティングされ、加えてブロッキング処理が施された96ウエルフィルタープレートにおいて、ブロッキング処理に用いたRPMIコンプリートメディウムを除去した後に、抗bovine IFN-γキャプチャー抗体をコーティングしたウエルには3×10E5cellsの細胞を含むRPMIコンプリートメディウムを100μlずつウエルへ播種した。続けて、ToMRPに由来するT細胞刺激用抗原ペプチドをRPMIコンプリートメディウムで最終使用濃度の2倍濃度に調製し、同刺激用抗原ペプチド入りコンプリートメディウムを100μlずつPBMCs入りのウエルに加えた(この段階で、目的の最終濃度のT細胞刺激用抗原ペプチドを含む細胞懸濁液が1ウエル当たり200μl含まれることになる)。ELISPOTアッセイのコントロールとして、最終濃度1μg/ml phytohemagglutin(PHA)とPBMCsを含むウエルを用意した。最後に、ウエル内のPBMCsと刺激物質の混合液を数回ピペティングし、37℃のCO2インキュベーター内で18−42時間、振動を与えないように培養した。
細胞懸濁液を除去した後に200μlPBSで5回洗浄作業をし、0.5%FCSを含むPBS(0.5%FCS/PBS)で希釈した抗bovine IFN-γビオチン化抗体(最終濃度0.25μg/ml MABTECH code 3115-6)をウエルへ80μlずつ加えて室温2時間反応させた。ビオチン化抗体溶液を除去し、200μl PBSで5回洗浄作業をした後に0.5%FCS/PBS で500〜1000倍希釈したHorseradish Peroxidase(HRP)をコンジュゲートしたstreptavidin(MABTECH code 3310-9)を室温1時間反応させた。その後、HRP 溶液を除去し、200μlPBSで5回洗浄作業をした後に3-Amino-9-ethylcarbazole(AEC)substrate kit(BD Biosciences code 551951)を用いて室温30分間、発色させた。流水により反応液を洗い流し発色反応を停止させた。プレートは風乾によって十分に乾燥させた。ウエル底面に現れたスポットは顕微鏡によってカウントした。
図1に示すように、T.orientalis由来抗原ToMRPタンパク質のアミノ酸配列(配列番号18)において、シグナルペプタイド部位以降のアミノ酸配列に基づき、C末端方向に10アミノ酸をオーバーラップさせながら20アミノ酸残基を有するペプチドを順次合成し、17種のペプチドを得た(Int.J.Parasitol.,29:593-599,1999 Sako Y et al)。なお、最後のNo.17のみ15アミノ酸で構成した。これら17種のペプチドのアミノ酸配列(配列番号1〜17)を以下に示す。
SGKTFNFFEPDDSLGKMEYH(配列番号1)
・ToMRP No.2
DDSLGKMEYHDHRGLKVYFF(配列番号2)
・ToMRP No.3
DHRGLKVYFFTPLHNSGVDK(配列番号3)
・ToMRP No.4
TPLHNSGVDKVVVGNQGIWT(配列番号4)
・ToMRP No.5
VVVGNQGIWTARSGQTLTKL(配列番号5)
・ToMRP No.6
ARSGQTLTKLVGFFRCMGFG(配列番号6)
・ToMRP No.7
VGFFRCMGFGLSHVSYFNQE(配列番号7)
・ToMRP No.8
LSHVSYFNQEGENKELLLGY(配列番号8)
・ToMRP No.9
GENKELLLGYSHGDDNLVEF(配列番号9)
・ToMRP No.10
SHGDDNLVEFDRKRFYDKLL(配列番号10)
・ToMRP No.11
DRKRFYDKLLDYTVSSEPFN(配列番号11)
・ToMRP No.12
DYTVSSEPFNKDVPGHLVLY(配列番号12)
・ToMRP No.13
KDVPGHLVLYQLEQLLKERE(配列番号13)
・ToMRP No.14
QLEQLLKEREESEKKSKAEK(配列番号14)
・ToMRP No.15
ESEKKSKAEKVAEVVHEAAE(配列番号15)
・ToMRP No.16
VAEVVHEAAEKKSEVPVTEE(配列番号16)
・ToMRP No.17
KKSEVPVTEEAHTEL(配列番号17)
放牧によりT.orientalis原虫に自然に感染したウシ(自然感染ウシ)2頭(#1と#2)と、タイレリア原虫を含む血液を接種したウシ(人工感染ウシ)2頭(#3と#4)から、上記2)の方法により回収したPBMCを用いた。上記3)に記載の手法(免疫活性化反応)に従い、上記1)に記載の抗bovine IFN-γ キャプチャー抗体をコーティングしたプレート(IFN-γ検出プレート)に、上記2) の方法に従い調整した標的細胞と、上記5)の方法により合成した17種の抗原ペプチド(最終濃度:1μM) を混合し42時間インキュベーションした。その後、上記4)のELISpotアッセイの操作を行ってスポットを検出した。結果を図2、3に示す。
感染が成立したウシを解析した結果であるウシ#2、#3、#4において、共通してToMRP No.3〜5、10、12のペプチド(ウシ#1ではNo.3、5)に強い反応が認められ、加えて、ウシ#1において ToMRP No.1が、ウシ#4においてToMRP No.16が独立して高い反応を示す領域であることが認められた。
Claims (3)
- 配列番号3〜5、10及び12のいずれかに示されるアミノ酸配列からなるペプチド。
- 請求項1に記載のペプチドからなる、ウシのT.orientalis感染症診断剤。
- 請求項1に記載のペプチド及びIFN-γに対する抗体及び/又はIL-10に対する抗体を少なくとも含むことを特徴とする、ウシのT.orientalis感染症診断キット。
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