JP5812382B2 - Ｇａｔａ阻害剤を有効成分とする有機イオントランスポーター発現増強剤及びｇａｔａ発現抑制剤 - Google Patents

Description

本発明は、ＧＡＴＡ阻害剤を有効成分とすることを特徴とする有機イオントランスポーター発現増強剤及び尿毒症治療・予防薬、並びに有機イオントランスポーター遺伝子の発現増強剤のスクリーニング方法などに関する。また、ＧＡＴＡ阻害剤を有効成分とすることを特徴とするＧＡＴＡ発現抑制剤及び尿毒症治療・予防薬、並びにＧＡＴＡ遺伝子の発現抑制剤のスクリーニング方法などに関する。

腎不全患者等の腎疾患を有する患者、特に腎透析を受ける患者の数は年々増加の一途を辿っている。腎臓の機能の一つは、血液中に流れている薬物や尿毒症物質などを取り込み、尿中に送り出して体外に排泄する排泄作用である。そのため腎機能が低下すると、薬物や尿毒症物質が体内に蓄積しやすくなり、腎臓の細胞が傷害され腎機能のさらなる低下を引き起こす。また、腎機能の低下した人は、正常の人と較べて何倍も脳卒中や心筋梗塞になりやすいことが知られている。したがって尿毒症物質などを排泄する機能を維持することは、腎障害を悪化させない上で非常に重要な意味を持つと同時に、脳卒中や心臓病の予防という点でも重要である。現在２０万人の患者が、尿毒症物質などを人工的に除去するために透析治療を行っており、さらに毎年３万人以上が新たに透析導入に至っている。透析療法には、一人あたり年間約５００万円の費用がかかるため、２０万人に対して約１兆円の医療費が恒常的に必要となり社会的な問題でもある。

近年、慢性腎臓病（Chronic Kidney Disease：ＣＫＤ）という疾患概念が提唱され、その予防・治療の重要性に対する認識が高まりを見せている。ＣＫＤとは、腎障害を示す所見や腎機能低下が慢性的に続く状態で、適切な治療を行わずにいると末期腎不全となり、人工透析や腎移植を受けなければ生きられなくなる疾患である。末期腎不全は全世界的に増え続けている。現在、日本には約１，３３０万人のＣＫＤ患者がいるといわれており、成人の約８人に１人にあたる数である。また、人工透析を受けている患者も、前述したように増え続けているのが現状であり、ＣＫＤの早期発見、早期治療が急務の課題となっている。このような状況下において、腎不全やＣＫＤ等の腎疾患の症状の予防法や、そのような症状を緩和し、透析導入を遅らせる治療法が開発されれば、患者のＱＯＬ（クオリティオブライフ）に資するだけでなく、医療費の大幅な削減が可能となり社会に大きく貢献することが期待されている。

ＣＫＤにおいて腎性貧血は主要な合併症の一つであり、腎性貧血の病態は、内因性エリスロポエチン（Ｅｐｏ）産生の低下を基盤とすることが知られている。腎機能の低下がどのようにエリスロポエチン産生に影響を及ぼすかは明らかになっていないが、血液透析によって腎性貧血が改善したという報告があることから、尿毒症物質がその原因の一つである可能性が示唆されている。エリスロポエチンは赤血球の産生を促進する造血促進因子の一つであり、エリスロポエチンの欠乏は貧血の一因となる。エリスロポエチンは主に腎臓で生成されるため、慢性腎不全によりエリスロポエチンの発現量が低下し、貧血が起こる。そのため、腎性貧血の主な治療法はエリスロポエチンの投与であるが、エリスロポエチン製剤は高価で、頻回の注射が必要であるなどの問題が指摘されている。

エリスロポエチンの発現は、エリスロポエチン遺伝子の上流のＧＡＴＡ配列にＧＡＴＡ転写因子結合することにより、負に制御されている。Ｎ，Ｎ’−ビス［５−（３，４，５−トリメトキシフェニル）−４−ペンテニル］ホモピペラジン（Ｋ−７１７４ともいう）はＧＡＴＡのＧＡＴＡ配列への結合活性を阻害する、ＧＡＴＡ阻害剤として使用されている。Ｎ，Ｎ’−ビス［５−（３，４，５−トリメトキシフェニル）−４−ペンテニル］ホモピペラジンはＧＡＴＡの脱アセチル化を特異的に抑制するため、ＧＡＴＡの転写因子としての活性が抑制されると考えられており、Ｎ，Ｎ’−ビス［５−（３，４，５−トリメトキシフェニル）−４−ペンテニル］ホモピペラジンによりＧＡＴＡ結合活性が抑制されることでエリスロポエチン遺伝子発現が促進されることが知られている。そして、腎不全で蓄積されるＬ−ＮＭＭＡ（NG-monomethyl L-arginine）により、ＧＡＴＡ結合活性が亢進することにより、エリスロポエチン遺伝子発現が抑制されて腎性貧血が発症するが、Ｎ，Ｎ’−ビス［５−（３，４，５−トリメトキシフェニル）−４−ペンテニル］ホモピペラジンによりこのエリスロポエチン遺伝子発現抑制が解除されることが示唆されている（非特許文献１、２）。

Ｎ，Ｎ’−ビス［５−（３，４，５−トリメトキシフェニル）−４−ペンテニル］ホモピペラジン、その酸付加塩、又はこれらの水和物は、阻害剤脳保護剤（特許文献１）や細胞接着阻害剤、細胞浸潤阻害剤、抗アレルギー剤、抗喘息剤及び抗炎症剤（特許文献２）、エリスロポエチン産生促進剤（特許文献３）、前駆脂肪細胞分化抑制剤（特許文献４）などとして有用であることが知られている。しかしながら、Ｎ，Ｎ’−ビス［５−（３，４，５−トリメトキシフェニル）−４−ペンテニル］ホモピペラジンが有機イオントランスポーターの発現やＧＡＴＡの発現にどのような作用をするかは全く知られていなかった。

これまで本発明者らは、ヒト腎臓近位尿細管血管側にのみ発現する有機アニオントランスポーターＳＬＣＯ４Ｃ１（solute carrier organic anion transporter family, member 4C1；別名ＯＡＴＰ（organic anion transport- ing polypeptide）−Ｒとも呼ばれる）が尿毒症物質の排泄に関わっていることを明らかにし、ＳＬＣＯ４Ｃ１の発現を調節することで尿毒症物質排泄を制御するという新たなＣＫＤ治療の可能性を報告した（非特許文献３）。

また、本発明者らは、キャピラリー電気泳動質量分析計（ＣＥ−ＭＳ）を用いてＣＫＤ患者４１名の血清を解析し、腎機能の評価である推定糸球体濾過量（estimated glomerular filtration rate:ｅＧＦＲ）の低下とともに有意に蓄積する物質を検出したことを報告している（非特許文献４）。

特開平３−２１４４号公報 特開平９−１４３０７５号公報 ＷＯ／２００４／００２４９３号パンフレット 特開２００９−５１７９６号公報

Imagawa S. et al., Kidney International. 61. 396-404 (2002) 今川 重彦、赤血球産生阻害 −腎性貧血の新規治療− 臨牀透析 Vol.21 No.9(14) 2005年 Toyohara T. et al., J Am Soc Nephrol., 20: 2546-2555 (2009) Toyohara T. et al., Hypertens Res. 2010 Sep;33(9):944-52. (2010)

本発明者らは、腎機能の評価であるｅＧＦＲの低下と共に蓄積する尿毒症物質を同定し（特願２００９−２０５０３３、非特許文献４）、尿毒症物質のひとつであるインドキシル硫酸（ＩＳ；Indoxyl Sulfate）が、ＧＡＴＡ３の発現を増強すること及びＳＬＣＯ４Ｃ１トランスポーターの発現を抑制することにより、エリスロポエチン産生を抑制し、ＣＫＤの病態に関与していることを明らかにした（特願２０１０−２３１７０９）。そこで、本発明の課題は、有機イオントランスポーターの発現増強や、ＧＡＴＡの発現抑制などによる、腎性貧血の予防・治療剤を開発することにある。

本発明者らは、ＧＡＴＡ阻害剤であるＮ，Ｎ’−ビス［５−（３，４，５−トリメトキシメトキシフェニル）−４−ペンテニル］ホモピペラジン（以下、Ｋ−７１７４ということもある）が、有機イオントランスポーターの発現を増加させることや、尿毒症物質による有機イオントランスポーターの発現抑制作用を解除することや、ＧＡＴＡ発現を抑制することや、尿毒症物質によるＧＡＴＡ発現増強作用を解除することを見いだし、本発明を完成するに至った。

すなわち、本発明は［１］Ｎ，Ｎ’−ビス［５−（３，４，５−トリメトキシメトキシフェニル）−４−ペンテニル］ホモピペラジンを有効成分とすることを特徴とするＳＬＣＯ４Ｃ１発現増強剤や、［２］尿毒症物質によるＳＬＣＯ４Ｃ１発現抑制の解除作用を有することを特徴とする前記［１］記載のＳＬＣＯ４Ｃ１発現増強剤や、［３］ＳＬＣＯ４Ｃ１が、ヒトＳＬＣＯ４Ｃ１であることを特徴とする前記［１］又は［２］記載のＳＬＣＯ４Ｃ１発現増強剤や、［４］前記［１］〜［３］のいずれか記載のＳＬＣＯ４Ｃ１発現増強剤を含むことを特徴とする尿毒症治療・予防薬に関する。

また、本発明は、［５］以下の（ａ）〜（ｅ）の工程を備えたことを特徴とする尿毒症物質によるＳＬＣＯ４Ｃ１発現抑制の解除剤のスクリーニング方法；（ａ）ＧＡＴＡ結合配列を含むヒトＳＬＣＯ４Ｃ１遺伝子の５’上流転写領域の下流にインフレームで連結したレポーター遺伝子をプラスミドに組み込みレポータープラスミドを構築する工程；（ｂ）構築したレポータープラスミドを、ヒトＳＬＣＯ４Ｃ１遺伝子を発現し得る細胞株に導入して形質転換細胞株を調製する工程；（ｃ）調製した形質転換細胞株に、尿毒症物質の存在下で被検物質を接触させる工程；（ｄ）レポーター遺伝子の発現の程度を測定する工程；（ｅ）被検物質不存在下の対照と比較してレポーター遺伝子の発現の程度が大きい場合、被検物質を尿毒症物質によるＳＬＣＯ４Ｃ１発現抑制を解除する活性を有する物質と判定する工程；や、［６］工程（ｂ）において、構築したレポータープラスミドに加えてＧＡＴＡ発現プラスミドを用いることを特徴とする前記［５］記載のスクリーニング方法や、［７］レポーター遺伝子がルシフェラーゼ遺伝子であることを特徴とする前記［５］又は［６］記載のスクリーニング方法に関する。

また、本発明は［８］Ｎ，Ｎ’−ビス［５−（３，４，５−トリメトキシメトキシフェニル）−４−ペンテニル］ホモピペラジンを有効成分とすることを特徴とする尿毒症物質によるＧＡＴＡ発現増強の解除剤や、［９］前記［８］記載の解除剤を含むことを特徴とする尿毒症治療・予防薬に関する。

また、本発明は［１０］以下の（ａ’）〜（ｅ’）のステップを備えたことを特徴とする尿毒症物質によるＧＡＴＡ発現増強の解除剤のスクリーニング方法；（ａ’）ＧＡＴＡ３遺伝子の５’上流転写領域の下流にインフレームで連結したレポーター遺伝子をプラスミドに組み込みレポータープラスミドを構築する工程；（ｂ’）構築したレポータープラスミドを、ＧＡＴＡ３遺伝子を発現し得る細胞株に導入して形質転換細胞株を調製する工程；（ｃ’）調製した形質転換細胞株に、尿毒症物質の存在下で被検物質を接触させる工程；（ｄ’）レポーター遺伝子の発現の程度を測定する工程；（ｅ’）被検物質不存在下の対照と比較してレポーター遺伝子の発現の程度が小さい場合、被検物質を尿毒症物質によるＧＡＴＡ発現増強を解除する活性を有する物質と判定する工程；や、［１１］レポーター遺伝子がルシフェラーゼ遺伝子であることを特徴とする前記［１０］記載のスクリーニング方法に関する。

本発明のＧＡＴＡ阻害剤を有効成分とする有機イオントランスポーター発現増強剤によれば、有機イオントランスポーターの発現を増強し、尿毒症を治療及び／又は予防することができ、本発明の有機イオントランスポーター遺伝子の発現増強剤スクリーニング方法を用いて新規の有機イオントランスポーター遺伝子発現増強剤を同定することができる。また、本発明のＧＡＴＡ阻害剤を有効成分とするＧＡＴＡ発現抑制剤によれば、ＧＡＴＡ３発現を抑制し、尿毒症を治療及び／又は予防することができ、本発明のＧＡＴＡ遺伝子の発現抑制剤スクリーニング方法を用いて新規のＧＡＴＡ遺伝子発現抑制剤を同定することができる。

ＡＣＨＮ細胞においてＧＡＴＡ阻害剤（Ｎ，Ｎ’−ビス［５−（３，４，５−トリメトキシフェニル）−４−ペンテニル］ホモピペラジン；Ｋ−７１７４）がＳＬＣＯ４Ｃ１のｍＲＮＡ発現を増強することを示す図である。 ＨＫ−２細胞においてＧＡＴＡ阻害剤（Ｎ，Ｎ’−ビス［５−（３，４，５−トリメトキシフェニル）−４−ペンテニル］ホモピペラジン；Ｋ−７１７４）がＳＬＣＯ４Ｃ１のｍＲＮＡ発現を増強することを示す図である。 ＡＣＨＮ細胞においてインドキシル硫酸（ＩＳ）がＳＬＣＯ４Ｃ１のｍＲＮＡ発現を抑制し、ＧＡＴＡ阻害剤（Ｎ，Ｎ’−ビス［５−（３，４，５−トリメトキシフェニル）−４−ペンテニル］ホモピペラジン；Ｋ−７１７４）はそのインドキシル硫酸によるＳＬＣＯ４Ｃ１のｍＲＮＡ発現抑制作用を解除することを示す図である。 ＨＫ−２細胞においてインドキシル硫酸（ＩＳ）がＳＬＣＯ４Ｃ１のｍＲＮＡ発現を抑制し、ＧＡＴＡ阻害剤（Ｎ，Ｎ’−ビス［５−（３，４，５−トリメトキシフェニル）−４−ペンテニル］ホモピペラジン；Ｋ−７１７４）はそのインドキシル硫酸によるＳＬＣＯ４Ｃ１のｍＲＮＡ発現抑制作用を解除することを示す図である。 ＨＫ−２細胞においてＧＡＴＡ阻害剤（Ｎ，Ｎ’−ビス［５−（３，４，５−トリメトキシフェニル）−４−ペンテニル］ホモピペラジン；Ｋ−７１７４）がＧＡＴＡ３のｍＲＮＡ発現を抑制し、インドキシル硫酸（ＩＳ）がＧＡＴＡ３のｍＲＮＡ発現を増強する。そしてＧＡＴＡ阻害剤（Ｎ，Ｎ’−ビス［５−（３，４，５−トリメトキシフェニル）−４−ペンテニル］ホモピペラジン；Ｋ−７１７４）はインドキシル硫酸によるＧＡＴＡ３のｍＲＮＡ発現増強作用を解除することを示す図である。 ＡＣＨＮ細胞においてインドキシル硫酸（ＩＳ）がＧＡＴＡ３のｍＲＮＡ発現を増強し、ＧＡＴＡ阻害剤（Ｎ，Ｎ’−ビス［５−（３，４，５−トリメトキシフェニル）−４−ペンテニル］ホモピペラジン；Ｋ−７１７４）はそのインドキシル硫酸によるＧＡＴＡ３のｍＲＮＡ発現増強作用を解除することを示す図である。 ＧＡＴＡ阻害剤（Ｎ，Ｎ’−ビス［５−（３，４，５−トリメトキシフェニル）−４−ペンテニル］ホモピペラジン；Ｋ−７１７４）がＧＡＴＡ３の発現及び機能の阻害を介して、ＳＬＣＯ４Ｃ１の発現を増強するというＧＡＴＡ仮説を表す図である。 Ｋコンパウンド（Ｎ，Ｎ’−ビス［５−（３，４，５−トリメトキシフェニル）−４−ペンテニル］ホモピペラジン；Ｋ−７１７４）が、ＧＡＴＡ３によるＳＬＣＯ４Ｃ１の発現抑制を阻害すること、及びＧＡＴＡ３の発現を抑制することの２つの働きを有することを表す図である。 インドキシル硫酸はＳＬＣＯ４Ｃ１の発現を抑制し、ＧＡＴＡ阻害剤（Ｎ，Ｎ’−ビス［５−（３，４，５−トリメトキシフェニル）−４−ペンテニル］ホモピペラジン；Ｋ−７１７４）はインドキシル硫酸によるＳＬＣＯ４Ｃ１発現抑制作用を解除することをレポーターアッセイにより調べた結果を示す図である（左のグラフ）。インドキシル硫酸はＧＡＴＡ３の発現を増強し、ＧＡＴＡ阻害剤（Ｎ，Ｎ’−ビス［５−（３，４，５−トリメトキシフェニル）−４−ペンテニル］ホモピペラジン；Ｋ−７１７４）はインドキシル硫酸によるＧＡＴＡ３発現増強作用を解除することをレポーターアッセイにより調べた結果を示す図である（右のグラフ）。 Ｋコンパウンド（Ｎ，Ｎ’−ビス［５−（３，４，５−トリメトキシフェニル）−４−ペンテニル］ホモピペラジン；Ｋ−７１７４）が、インドキシル硫酸や１−メチルアデノシンによるエリスロポイエチンやＳＬＣＯ４Ｃ１の転写抑制を解除することを表す図である。

本発明の有機イオントランスポーター発現増強剤やＧＡＴＡ発現抑制剤としては、ＧＡＴＡ阻害剤を有効成分とするものであれば特に制限されず、ここでＧＡＴＡ阻害剤としては、ＧＡＴＡの転写因子としての機能を阻害、好ましくは特異的に阻害する物質であれば特に制限されず、Ｎ，Ｎ’−ビス［５−（３，４，５−トリメトキシフェニル）−４−ペンテニル］ホモピペラジンもしくはそれらの酸付加塩、又はこれらの溶媒和物を挙げることができ、好ましくはＧＡＴＡ特異的阻害剤であるＮ，Ｎ’−ビス［５−（３，４，５−トリメトキシフェニル）−４−ペンテニル］ホモピペラジンを挙げることができる（化１）。化合物がＧＡＴＡ阻害剤であるかどうかは、ＳＬＣＯ４Ｃ１のレポーターアッセイにおいて、コントロールと比べてＳＬＣＯ４Ｃ１のレポーター活性を増強する、あるいはＧＡＴＡ３のレポーターアッセイにおいて、コントロールと比べてＧＡＴＡ３のレポーター活性を抑制することにより判定することができる。本発明のＧＡＴＡ阻害剤Ｎ，Ｎ’−ビス［５−（３，４，５−トリメトキシフェニル）−４−ペンテニル］ホモピペラジンは、市販されている物質を用いてもよいし、適当な化学物質を原料として公知の反応を用いて合成してもよい（例えば、特開平９−１４３０７５に記載の方法などを利用することができる）。

上記ＧＡＴＡとしては、ＧＡＴＡ１、ＧＡＴＡ２、ＧＡＴＡ３、ＧＡＴＡ４、ＧＡＴＡ５、ＧＡＴＡ６を挙げることができ、中でもＧＡＴＡ３を好適に示すことができる。かかるＧＡＴＡ３としては、例えばヒトＧＡＴＡ３遺伝子（NM_001002295；GenBankアクセッション番号）、マウスＧＡＴＡ３遺伝子（NM_008091）やラットＧＡＴＡ３遺伝子（NM_133293）等から発現するタンパク質などを挙げることができる。またこれらの配列情報に基づいて、適当なプライマーを設計することによって、これらの遺伝子を単離することもできるし、単離したこれらの遺伝子を適当な発現ベクターに組み込んで該ベクターを適当な細胞に導入して発現させたり、それによりＧＡＴＡタンパク質を入手することもできる。

本発明の有機イオントランスポーター発現増強剤としては、尿毒症物質による有機イオントランスポーター発現抑制の解除作用を有するものが好ましく、また本発明のＧＡＴＡ発現抑制剤としては、尿毒症物質によるＧＡＴＡ発現増強の解除作用を有するものが好ましい。

本発明の尿毒症治療・予防薬としては、上記本発明の有機イオントランスポーター発現増強剤やＧＡＴＡ発現抑制剤を含むもの、すなわちＮ，Ｎ’−ビス［５−（３，４，５−トリメトキシフェニル）−４−ペンテニル］ホモピペラジン等のＧＡＴＡ阻害剤を有効成分として含むものであれば特に制限されず、その有効量をヒトを含む哺乳動物に投与することによって、有機イオントランスポーターの発現量を増強したり、尿毒症物質による有機イオントランスポーター発現抑制を解除したり、ＧＡＴＡ発現を抑制したり、尿毒症物質によるＧＡＴＡ発現増強を解除することができるものであり、賦形剤等の担体と併用することにより薬剤やサプリメントとすることができる。この薬剤やサプリメントを腎不全のヒトを含む哺乳動物に投与することによって、生体内の有機イオントランスポーターの発現量を増加させることにより、尿毒症物質の排出を増加させ、尿毒症を治療及び／又は予防に利用することができる。なお、本明細書において「尿毒症を治療・予防薬」とは、尿毒症治療及び／又は予防薬を意味し、また、ＧＡＴＡ阻害剤を有効成分とする有機イオントランスポーター発現増強剤の有効量と担体とを投与することを特徴とする尿毒症を治療及び／又は予防方法や、ＧＡＴＡ阻害剤を有効成分とするＧＡＴＡ発現抑制剤の有効量と担体とを投与することを特徴とする尿毒症を治療及び／又は予防方法や、ＧＡＴＡ阻害剤を有効成分とする有機イオントランスポーター発現増強剤を尿毒症の治療及び／又は予防薬を製造するために用いる方法や、ＧＡＴＡ阻害剤を有効成分とするＧＡＴＡ発現抑制剤を尿毒症の治療及び／又は予防薬を製造するために用いる方法を、本発明とすることもできる。

本発明における有機イオントランスポーターとしては、ＳＬＣＯ４Ｃ１（solute carrier organic anion transporter family, member 4C1；別名ＯＡＴＰ（organic anion transport- ing polypeptide）−Ｒとも呼ばれる）、ＯＣＴ（organic cation transporter）１、ＯＣＴ２及びＯＣＴ３、ＯＣＴＮ（novel organic cation transporter）１やＯＣＴＮ２、ＯＡＴ（organic anion transporter）１、ＯＡＴ２及びＯＡＴ３を挙げることができ、中でも有機アニオントランスポーターであるＳＬＣＯ４Ｃ１を好適に示すことができる。かかるＳＬＣＯ４Ｃ１としては、例えばヒトＳＬＣＯ４Ｃ１遺伝子（NM_180991；GenBankアクセッション番号）、マウスＳＬＣＯ４Ｃ１遺伝子（NM_172658）、ラットＳＬＣＯ４Ｃ１遺伝子（NM_001002024）及びこれらから発現するタンパク質などを挙げることができる。上記ＳＬＣＯ４Ｃ１は、腎臓において胆汁酸、ビリルビン、ジゴキシンやウアバイン、ｃＡＭＰ等の尿毒症物質を体外に排出するトランスポーターであるため、本発明のＧＡＴＡ阻害剤を有効成分とする有機イオントランスポーターＳＬＣＯ４Ｃ１の発現増強剤は、尿毒症の治療・予防薬として有利に用いることができる。

本発明の有機イオントランスポーターの発現増強剤やＧＡＴＡ発現抑制剤や尿毒症治療・予防薬は、有機イオントランスポーター遺伝子の発現を増強する活性やＧＡＴＡの発現を抑制する活性や尿毒症治療・予防効果を阻害しない限り、他に任意の成分を配合することができる。例えば本発明の尿毒症治療・予防薬の場合、ＧＡＴＡ阻害剤以外に公知の尿毒症治療・予防薬を配合してもよいし、さらにこれら公知の尿毒症治療・予防薬との併用療法も可能である。また、本発明の有機イオントランスポーター遺伝子の発現増強剤の場合、ＧＡＴＡ阻害剤以外の有機イオントランスポーター遺伝子の発現増強剤を配合してもよいし、有機イオントランスポーター遺伝子の発現増強手段と併用してもよい。また、ＧＡＴＡ遺伝子の発現抑制剤の場合、ＧＡＴＡ阻害剤以外のＧＡＴＡ遺伝子の発現抑制剤を配合してもよいし、ＡＴＡ遺伝子の発現抑制手段と併用してもよい。

本発明の有機イオントランスポーターの発現増強剤やＧＡＴＡ発現抑制剤や尿毒症治療・予防薬の投与形態は特に制限されず、経口的又は非経口的に投与することができ、例えば粉末、顆粒、錠剤、糖衣錠、カプセル剤、スティック剤、シロップ剤、懸濁液等の剤型で経口的に投与することができ、あるいは、例えば溶液、乳剤、懸濁液等の剤型にしたものを注射の型で投与する他、スプレー剤の型で鼻孔内投与したり坐剤等により非経口投与することもできるが、投与の簡便性の観点から経口的に投与することが好ましい。有効成分であるＧＡＴＡ阻害剤の配合量は、尿毒症の予防効果や治療効果が得られる限り特に制限されず、製剤の投与量等の条件に応じて適切な配合量を選択することが可能である。

本発明の尿毒症予防・治療剤は、有効成分であるＧＡＴＡ阻害剤に通常薬学的に許容される担体、結合剤、安定化剤、賦形剤、希釈剤、ｐＨ緩衝剤、崩壊剤、可溶化剤、溶解補助剤、等張剤などの各種調剤用配合成分を配合して製剤の形態で提供される。例えば、経口投与する場合、微晶質セルロース、クエン酸ナトリウム、炭酸カルシウム、リン酸ジカリウム、グリシンのような種々の賦形剤を、澱粉、好適にはとうもろこし、じゃがいも又はタピオカの澱粉、及びアルギン酸やある種のケイ酸複塩のような種々の崩壊剤、及びポリビニルピロリドン、蔗糖、ゼラチン、アラビアゴムのような顆粒形成結合剤と共に使用することができる。また、ステアリン酸マグネシウム、ラウリル硫酸ナトリウム、タルク等の滑沢剤も錠剤形成に非常に有効であることが多い。同種の固体組成物をゼラチンカプセルに充填して使用することもできる。これに関連して好適な物質としてラクトース又は乳糖の他、高分子量のポリエチレングリコールを挙げることができる。経口投与用として水性懸濁液とする場合、ＧＡＴＡ阻害剤を各種の甘味料、香味料、着色料、乳化剤、懸濁化剤と併用し、水、エタノール、プロピレングリコール、グリセリン等の希釈剤と共に使用することもできる。

本発明の尿毒症治療・予防薬の投与量は、対象の種類（動物又はヒト）、対象の年齢、個人差、病状、投与形態等により適宜選定することができる。本発明の有機イオントランスポーター発現増強剤やＧＡＴＡ発現抑制剤の投与量についても、有機イオントランスポーター遺伝子の発現が増強、あるいはＧＡＴＡ遺伝子の発現が抑制され得る限り特に制限はされず、種々の条件に応じて適切な投与量を選択することが可能である。例えば、細胞や組織などにインビトロで適用する場合は、培養液などに有効成分であるＮ，Ｎ’−ビス［５−（３，４，５−トリメトキシフェニル）−４−ペンテニル］ホモピペラジンを、最終濃度が０．０１〜１０００μＭ、好ましくは０．１〜５００μＭ、さらに好ましくは１〜５０μＭとなるように添加し、０．０１〜１２０時間、好ましくは１〜９６時間、さらに好ましくは６〜８４時間、もっとも好ましくは１２〜７２時間インキュベートすることができる。またヒトに経口投与する場合の投与量は、例えば、有効成分であるＮ，Ｎ’−ビス［５−（３，４，５−トリメトキシフェニル）−４−ペンテニル］ホモピペラジンを一日０．０１〜１０００ｍｇ、好ましくは０．１〜５００ｍｇ、さらに好ましくは１〜１００ｍｇを１〜３回に分けて投与するのが好ましく、また症状により投与量を適宜増減してもよい。なお、本明細書における尿毒症治療・予防薬の投与対象は、ヒトだけでなく、他の非ヒト動物含むが、ヒト及び非ヒト哺乳動物が好ましく、ヒトがより好ましい。

本発明の尿毒症の予防・治療剤の対象となる尿毒症としては、ＧＡＴＡ阻害剤を投与することにより、尿毒症の予防効果や治療効果を発揮する限り特に制限はなく、例えば、急性腎不全、急性尿細管壊死、腎性貧血、慢性腎不全、尿細管間質障害、急性腎炎、慢性腎炎、ネフローゼ、腎機能障害、糖尿病性腎症、動脈硬化性腎症などが挙げられるが、なかでも腎性貧血に対して優れた予防効果や治療効果を発揮する。

本発明の有機イオントランスポーター遺伝子の発現増強剤のスクリーニング方法としては、（ａ）ＧＡＴＡ結合配列を含む有機イオントランスポーター遺伝子の５’上流転写領域の下流にインフレームで連結したレポーター遺伝子をプラスミドに組み込みレポータープラスミドを構築する工程；（ｂ）構築したレポータープラスミドを、有機イオントランスポーター遺伝子を発現し得る細胞株に導入して形質転換細胞株を調製する工程；（ｃ）調製した形質転換細胞株に被検物質を接触させる工程；（ｄ）レポーター遺伝子の発現の程度を測定する工程；（ｅ）被検物質不存在下の対照と比較してレポーター遺伝子の発現の程度が大きい場合、被検物質を有機イオントランスポーター遺伝子の発現を増強する活性を有する物質と判定する工程；を備えていれば特に制限されない。

上記工程（ａ）におけるＧＡＴＡ結合配列を含む有機イオントランスポーター遺伝子の５’上流転写領域としては、ヒト有機イオントランスポーター遺伝子の転写開始点より上流−４０００塩基から下流のＧＡＴＡ結合配列（５’−（Ａ又はＴ）ＧＡＴＡ（Ａ又はＧ）−３’）を含む領域を例示することができる。かかる配列の下流にインフレームでレポーター遺伝子を連結したレポーター遺伝子を組み込んだプラスミドは、有機イオントランスポーター遺伝子の転写活性を反映してレポーター遺伝子を発現するため、レポーター遺伝子の発現を検出することにより有機イオントランスポーター遺伝子の転写レベルを測定することができる。上記有機イオントランスポーター遺伝子を発現し得るヒト細胞株としては、本来有機イオントランスポーターを発現しているヒト細胞株の他、転写制御領域と一緒に有機イオントランスポーター遺伝子を発現ベクターに導入し、人工的に有機イオントランスポーターを発現し得るヒト細胞株を挙げることができる。なお、有機イオントランスポーターを発現し得るように形質転換する際に用いるヒト由来の細胞株は、本来有機イオントランスポーターを発現していないヒト細胞株であってもよいし、本来有機イオントランスポーターを発現しているヒト細胞株であってもよい。有機イオントランスポーター遺伝子が組み込まれた発現ベクターを、本来有機イオントランスポーターを発現しているヒト細胞株に導入すると、有機イオントランスポーターがより安定的に発現する点で好ましい。

例えば、有機イオントランスポーターがＳＬＣＯ４Ｃ１の場合は、工程（ａ）におけるＧＡＴＡ結合配列を含むＳＬＣＯ４Ｃ１遺伝子の５’上流転写領域としては、ヒトＳＬＣＯ４Ｃ１遺伝子の転写開始点より上流−４０００塩基から下流のＧＡＴＡ結合配列（５’−（Ａ又はＴ）ＧＡＴＡ（Ａ又はＧ）−３’）を含む領域、好適にはヒトＳＬＣＯ４Ｃ１遺伝子の翻訳開始点より上流−３８８６塩基から下流＋１１０塩基までの配列などを例示することができる。かかる配列の下流にインフレームでレポーター遺伝子を連結したレポーター遺伝子を組み込んだプラスミドは、ＳＬＣＯ４Ｃ１遺伝子の転写活性を反映してレポーター遺伝子を発現するため、レポーター遺伝子の検出することによりＳＬＣＯ４Ｃ１遺伝子の転写レベルを測定することができる。また、ＳＬＣＯ４Ｃ１遺伝子を発現し得るヒト細胞株としては、本来ＳＬＣＯ４Ｃ１を発現しているヒト細胞株の他、転写制御領域と一緒にＳＬＣＯ４Ｃ１遺伝子を発現ベクターに導入し、人工的にＳＬＣＯ４Ｃ１を発現し得るヒト細胞株を挙げることができ、より具体的には、ヒト胎児腎臓由来細胞（ＨＥＫ２９３細胞）や本来ＳＬＣＯ４Ｃ１を発現しているＡＣＨＮ細胞株等の腎癌由来のヒト細胞株や、ヒト近位尿細管由来細胞（ＨＫ−２）等のヒト由来の細胞株の他、ＳＬＣＯ４Ｃ１を発現し得るように形質転換されたヒト由来の細胞株を挙げることができるが、ＡＣＨＮ細胞やＨＫ−２細胞等のヒト細胞株をより好ましく挙げることができる。なお、ＳＬＣＯ４Ｃ１を発現し得るように形質転換する際に用いるヒト由来の細胞株は、本来ＳＬＣＯ４Ｃ１を発現していないヒト細胞株であってもよいし、本来ＳＬＣＯ４Ｃ１を発現しているヒト細胞株であってもよい。ＳＬＣＯ４Ｃ１遺伝子が組み込まれた発現ベクターを、本来ＳＬＣＯ４Ｃ１を発現しているヒト細胞株に導入すると、ＳＬＣＯ４Ｃ１がより安定的に発現する点で好ましい。ＧＡＴＡ結合配列を含むヒトＳＬＣＯ４Ｃ１遺伝子の５’上流転写領域の下流にインフレームで連結したレポーター遺伝子は、哺乳動物細胞等で発現するプラスミドベクターにインテグレートされ、公知の方法で細胞株に導入され、形質転換細胞株を調製することができる。

本発明の有機イオントランスポーター遺伝子の発現増強剤のスクリーニング方法においては、レポータープラスミドに加えて、ＧＡＴＡ発現プラスミドを細胞内に導入してスクリーニングを行うこともできる。かかるＧＡＴＡ発現プラスミドとしては、哺乳動物細胞株においてＧＡＴＡタンパク質の全長あるいは一部を発現するものであれば特に制限されず、ＧＡＴＡとしては、ＧＡＴＡ１、ＧＡＴＡ２、ＧＡＴＡ３、ＧＡＴＡ４、ＧＡＴＡ５、ＧＡＴＡ６を挙げることができ、中でもＧＡＴＡ３を好適に示すことができる。かかるＧＡＴＡ３としては、例えばヒトＧＡＴＡ３遺伝子（NM_001002295；GenBankアクセッション番号）、マウスＧＡＴＡ３遺伝子（NM_008091）やラットＧＡＴＡ３遺伝子（NM_133293）から発現するタンパク質などを挙げることができる。これらの配列情報に基づいて、適当なプライマーを設計することによって、これらの遺伝子を単離することができ、単離したこれらの遺伝子の配列を適当な発現ベクターに組み込んで該ベクターを適当な細胞に導入して発現させることができる。

本発明の有機イオントランスポーター遺伝子の発現増強剤のスクリーニング方法においては、尿毒症物質を細胞培養液に添加して、尿毒症物質の存在下でスクリーニングを行うこともできる。かかる尿毒症物質としては、腎臓の機能低下とともに有意に蓄積する物質であれば特に制限されず、例えば腎機能のマーカーのひとつである推定糸球体濾過量（estimated glomerular filtration rate:ｅＧＦＲ）の低下とともに有意に蓄積する物質、クレアチニン（creatinine）、シンメトリックジメチルアルギニン（ＳＤＭＡ）、グアジニノコハク酸（guanidino succinate）、シトルリン（citrulline）、１−メチルアデノシン（1-methyladenosine）、Ｎ−アセチルグルコサミン（N-acetylgulusosamine）、γ−ブチロベタイン（γ-butyrobetaine）、オフタルム酸（ophthalmate）、３−メチルヒスチジン（3-methylhistidine）、ヒドロキシプロリン（hydroxyproline）、トリメチルアミン−Ｎ−オキシド（trimethylamine N-oxide）、アラントイン（allantoin）、アシンメトリックジメチルアルギニン（ＡＤＭＡ）、Ｎ−ε−アセチルリジン（N-epsilon-acetyllysine）、キヌレニン（kynurenine）、シトシン（cytosine）、インドール−３−酢酸（indole-3-acetate）、ヒポタウリン（hypotaurine）、Ｎ，Ｎ−ジメチルグリシン（n,n-dimethylglycine）、７−メチルグアニン（7-methylguanine）、メチオニンスルホキシド（methionine sulfoxide）、アスパラギン（Ａｓｎ）、イセチオン酸（isethionate）、グルコン酸（gluconate）、トランス−アコニット酸（trans-aconitate）、ピメリン酸（pimelate）、３−インドキシル硫酸（3-indoxyl sulfate）、イソクエン酸（isocitrate）、Ｎ−アセチル−β−アラニン（N-acetyl-beta-alanine）、Ｎ−アセチルグルタミン酸（N-acetylglutamate）、セバシン酸（sebacate）、４−オキソペンタン酸（4-oxopentanoate）、シス−アコニット酸（cis-aconitate）、ホモバニリン酸（homovanillate）、アジピン酸（adipate）、シトラマレイン酸（citramalate）、２−イソプロピルマレイン酸（2-isopropylmalate）、トレオン酸（threonate）、馬尿酸（hippurate）、Ｎ−アセチルアスパラギン酸（N-acetylaspartate）、４−ヒドロキシ−３−メトキシマンデル酸（4-hydroxy-3-methoxymandelate）、オキサミン酸（oxamate）、グルタル酸（glutarate）、アゼテート（azetate）、フタル酸（phthalate）、クエン酸（citrate）、マロン酸（malonate）、シトラコン酸（citraconate）、キナ酸（quinate）、コハク酸（succinate）、システイン−Ｓ−硫酸（cysteine S-sulfate）、４−ヒドロキシ−３−メトキシ安息香酸（4-hydroxy-3-methoxybenzoate）、胆汁酸、ビリルビン、ジゴキシンやウアバイン、ｃＡＭＰなどを挙げることができ、その中でも３−インドキシル硫酸（インドキシル硫酸、ＩＳということもある）及び１−メチルアデノシンを好適に例示することができる。また、ＧＡＴＡ結合促進物質としてはＧＡＴＡのＧＡＴＡ結合配列への結合を促進する物質であれば特に制限されず、例えばインドキシル硫酸及び１−メチルアデノシンを例示することができる。

次に、本発明のＧＡＴＡ遺伝子の発現増強剤のスクリーニング方法としては、（ａ’）ＧＡＴＡ遺伝子の５’上流転写領域の下流にインフレームで連結したレポーター遺伝子をプラスミドに組み込みレポータープラスミドを構築する工程；（ｂ’）構築したレポータープラスミドを、ＧＡＴＡ遺伝子を発現し得る細胞株に導入して形質転換細胞株を調製する工程；（ｃ’）調製した形質転換細胞株に被検物質を接触させる工程；（ｄ’）レポーター遺伝子の発現の程度を測定する工程；（ｅ’）被検物質不存在下の対照と比較してレポーター遺伝子の発現の程度が小さい場合、被検物質をＧＡＴＡ遺伝子の発現を抑制する活性を有する物質と判定する工程；を備えていれば特に制限されない。

上記工程（ａ’）におけるＧＡＴＡ遺伝子の５’上流転写領域としては、ヒトＧＡＴＡ遺伝子のプロモーター領域、好適にはヒトＧＡＴＡ遺伝子の翻訳開始点より上流−４０００塩基から下流の配列などを例示することができる。かかる配列の下流にインフレームでレポーター遺伝子を連結したレポーター遺伝子を組み込んだプラスミドは、ＧＡＴＡ遺伝子の転写活性を反映してレポーター遺伝子を発現するため、レポーター遺伝子の発現を検出することによりＧＡＴＡ遺伝子の転写レベルを測定することができる。上記ＧＡＴＡ遺伝子を発現し得るヒト細胞株としては、本来ＧＡＴＡを発現しているヒト細胞株の他、転写制御領域と一緒にＧＡＴＡ遺伝子を発現ベクターに導入し、人工的にＧＡＴＡを発現し得るヒト細胞株を挙げることができる。なお、ＧＡＴＡを発現し得るように形質転換する際に用いるヒト由来の細胞株は、本来ＧＡＴＡを発現していないヒト細胞株であってもよいし、本来ＧＡＴＡを発現しているヒト細胞株であってもよい。ＧＡＴＡ遺伝子が組み込まれた発現ベクターを、本来ＧＡＴＡを発現しているヒト細胞株に導入すると、ＧＡＴＡがより安定的に発現する点で好ましい。

なおＧＡＴＡがＧＡＴＡ３の場合は、工程（ａ’）ＧＡＴＡ３遺伝子の５’上流転写領域としては、ヒトＧＡＴＡ３遺伝子の転写開始点より上流−４０００塩基から下流、好ましくは翻訳開始点より上流−３５００塩基から下流＋１１０塩基までの配列などを例示することができる。かかる配列の下流にインフレームでレポーター遺伝子を連結したレポーター遺伝子を組み込んだプラスミドは、ＧＡＴＡ３遺伝子の転写活性を反映してレポーター遺伝子を発現するため、レポーター遺伝子の発現を検出することによりＧＡＴＡ３遺伝子の転写レベルを測定することができる。そしてＧＡＴＡ３遺伝子を発現し得るヒト細胞株としては、本来ＧＡＴＡ３を発現しているヒト細胞株の他、転写制御領域と一緒にＧＡＴＡ３遺伝子を発現ベクターで導入し、人工的にＧＡＴＡ３を発現し得るヒト細胞株を挙げることができ、より具体的には、ヒト胎児腎臓由来細胞（ＨＥＫ２９３細胞）や本来ＧＡＴＡ３を発現しているヒトＡＣＨＮ細胞株等の腎癌由来のヒト細胞株や、ヒト近位尿細管由来細胞（ＨＫ−２）等のヒト由来の細胞株の他、ＧＡＴＡ３を発現し得るように形質転換されたヒト由来の細胞株を挙げることができるが、ヒトＡＣＨＮ細胞やＨＫ−２細胞等のヒト細胞株をより好ましく挙げることができる。なお、ＧＡＴＡ３を発現し得るように形質転換する際に用いるヒト由来の細胞株は、本来ＧＡＴＡ３を発現していないヒト細胞株であってもよいし、本来ＧＡＴＡ３を発現しているヒト細胞株であってもよい。ＧＡＴＡ３遺伝子が組み込まれた発現ベクターを、本来ＧＡＴＡ３を発現しているヒト細胞株に導入すると、ＧＡＴＡ３がより安定的に発現する点で好ましい。ヒトＧＡＴＡ３遺伝子の５’上流転写領域の下流にインフレームで連結したレポーター遺伝子は、哺乳動物細胞等で発現するプラスミドベクターにインテグレートされ、公知の方法で前記ＧＡＴＡ３遺伝子を発現し得るヒト細胞株に導入され、形質転換細胞株を調製することができる。

また、上記レポーター遺伝子としては、ルシフェラーゼ遺伝子、抗生物質耐性遺伝子、重金属耐性遺伝子等、より具体的には、ホタルルシフェラーゼ遺伝子、細菌ルシフェラーゼ遺伝子、レニーラ（Renilla）ルシフェラーゼ遺伝子、フォチヌス（Photinus）ルシフェラーゼ遺伝子、緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）遺伝子、強化緑色蛍光タンパク質（ＥＧＦＰ）遺伝子、クロラムフェニコールアセチルトランスフェラーゼ（ＣＡＴ）遺伝子、ネオマイシン耐性遺伝子、ピューロマイシン耐性遺伝子、ハイグロマイシン耐性遺伝子、ジフテリアトキシン耐性遺伝子、ペルオキシダーゼ遺伝子、ウレアーゼ遺伝子、カタラーゼ遺伝子、β−グルクロニダーゼ遺伝子、アルカリホスファターゼ遺伝子、β−ガラクトシダーゼ遺伝子等を挙げることができる。

本発明におけるレポーター遺伝子の発現の程度を測定する方法としては、レポーター遺伝子の発現を検出又は定量し得る限り制限されないが、ホタルルシフェラーゼ遺伝子をレポーター遺伝子として用いた場合は、ルシフェラーゼの酵素活性を反応産物の蛍光を検出することにより測定する方法が好ましい。さらに好ましくは、ホタルルシフェラーゼレポータープラスミドと同時に導入したコントロールプラスミドから発現したレニーラルシフェラーゼを内部コントロールとして利用するシステム、例えばDual-Luciferase（商標登録）Reporter Assay System（プロメガ社製）などを特に好適に例示することができる。

本発明の有機イオントランスポーター遺伝子の発現増強剤のスクリーニング方法においては、被検物質を投与した場合の細胞内におけるレポーター遺伝子の発現の程度が、該被検物質を投与しなかった場合の細胞内におけるレポーター遺伝子の発現の程度よりも高いときには、その被検物質はＳＬＣＯ４Ｃ１遺伝子等の有機イオントランスポーター遺伝子の発現増強剤、又は尿毒症治療・予防薬であると判定し、被検物質を投与した場合の細胞内におけるレポーター遺伝子の発現の程度が、該被検物質を投与しなかった場合の細胞内におけるレポーター遺伝子の発現の程度と同等、もしくは低いときには、その被検物質は有機イオントランスポーター遺伝子の発現増強剤、又は尿毒症治療・予防薬でないと判定することができる。

また、本発明のＧＡＴＡ遺伝子の発現抑制剤のスクリーニング方法においては、被検物質を投与した場合の細胞内におけるレポーター遺伝子の発現の程度が、該被検物質を投与しなかった場合の細胞内におけるレポーター遺伝子の発現の程度よりも低いときには、その被検物質はＧＡＴＡ遺伝子の発現抑制剤、又は尿毒症治療・予防薬であると判定し、被検物質を投与した場合の細胞内におけるレポーター遺伝子の発現の程度が、該被検物質を投与しなかった場合の細胞内におけるレポーター遺伝子の発現の程度と同等、もしくは高いときには、その被検物質はＧＡＴＡ遺伝子の発現増強剤、又は尿毒症治療・予防薬でないと判定することができる。

本発明における被検物質としては、任意の物質を使用することができ、例えば、個々の低分子合成化合物でもよいし、天然物抽出物中に存在する化合物でもよく、あるいは化合物ライブラリー、ファージディスプレーライブラリー、コンビナトリアルライブラリーでもよい。化合物ライブラリーの構築は当業者に公知であり、また市販の化合物ライブラリーを使用することもできる。

以下、実施例によって本発明を具体的に説明するが、これらは本発明の範囲を限定するものではない。

ＡＣＨＮ細胞及びＨＫ−２細胞（ＡＴＣＣ（American Type Culture Collection）より入手）はＲＰＭＩ１６４０培地（GIBCO社製）に最終濃度で１０％ウシ胎児血清（ＦＢＳ）（GIBCO社製）、１００ＩＵ／ｍｌペニシリンと１０μｇ／ｍｌストレプトマイシン（GIBCO社製）となるように添加し、３７℃、５％ＣＯ_２濃度の条件で培養した。

［Ｎ，Ｎ’−ビス［５−（３，４，５−トリメトキシフェニル）−４−ペンテニル］ホモピペラジンはＳＬＣＯ４Ｃ１の発現を増強する］
Ｎ，Ｎ’−ビス［５−（３，４，５−トリメトキシフェニル）−４−ペンテニル］ホモピペラジンがＡＣＨＮ細胞やＨＫ−２細胞におけるＳＬＣＯ４Ｃ１のｍＲＮＡ発現へ与える影響を調べた。６穴細胞培養プレートに５×１０^５個のＡＣＨＮ細胞又はＨＫ−２細胞を蒔いた後、２４時間インキュベーションした。その後、各試薬（Ｎ，Ｎ’−ビス［５−（３，４，５−トリメトキシフェニル）−４−ペンテニル］ホモピペラジン １、３、１０、３０μＭ、又は０．１％ＤＭＳＯ）を含んだ培地に交換し、２４時間インキュベーションした後にＲＮＡを抽出した。Ｎ，Ｎ’−ビス［５−（３，４，５−トリメトキシフェニル）−４−ペンテニル］ホモピペラジンを含んだ培地は、まず、Ｎ，Ｎ’−ビス［５−（３，４，５−トリメトキシフェニル）−４−ペンテニル］ホモピペラジンをＤＭＳＯで１ｍＭ、３ｍＭ、１０ｍＭ、３０ｍＭの溶液に調整したものを、培地に１／１０００量加えて調整した。０．１％ＤＭＳＯは、コントロールである。SuperScript III（Invitrogen社製）を用いてｃＤＮＡを作製したのち、ＧＡＰＤＨ（glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase、グリセルアルデヒド３リン酸脱水素酵素）を内部標準としてＳＬＣＯ４Ｃ１のｍＲＮＡの発現を定量ＰＣＲで測定した。細胞培養培地には腎上皮細胞培養キット（Lonza社製）を用い、定量ＰＣＲはTaqMan（登録商標）Gene Expression Assaysを使用し（ＧＡＰＤＨ；Assay ID: Rn99999916_s1、ＳＬＣＯ４Ｃ１；Assay ID: Rn01427754_m1のTaqMan（登録商標）プローブ（Applied Biosystems社製）を使用）、Step One Plus Real-Time PCR System（Applied Biosystems社製）により行った。その結果、Ｎ，Ｎ’−ビス［５−（３，４，５−トリメトキシフェニル）−４−ペンテニル］ホモピペラジンは、ＡＣＨＮ細胞及びＨＫ−２細胞においてＳＬＣＯ４Ｃ１の発現を増強することが示された（図１、２）。

［Ｎ，Ｎ’−ビス［５−（３，４，５−トリメトキシフェニル）−４−ペンテニル］ホモピペラジンはインドキシル硫酸によるＳＬＣＯ４Ｃ１の発現抑制作用を解除する］
次に、インドキシル硫酸及びＮ，Ｎ’−ビス［５−（３，４，５−トリメトキシフェニル）−４−ペンテニル］ホモピペラジンがＡＣＨＮ細胞やＨＫ−２細胞におけるＳＬＣＯ４Ｃ１のｍＲＮＡ発現へ与える影響を調べた。６穴細胞培養プレートに５×１０^５個のＡＣＨＮ細胞又はＨＫ−２細胞を蒔いた後、２４時間インキュベーションした。その後、各試薬（インドキシル硫酸（０．３、１、又は３ｍＭ）、インドキシル硫酸 １ｍＭ及びＮ，Ｎ’−ビス［５−（３，４，５−トリメトキシフェニル）−４−ペンテニル］ホモピペラジン １０μＭ、Ｎ，Ｎ’−ビス［５−（３，４，５−トリメトキシフェニル）−４−ペンテニル］ホモピペラジン １０μＭ、又はＤＭＳＯ ０．１％）を含んだ培地に交換し、２４時間インキュベーションした後にＲＮＡを抽出した。SuperScript III（Invitrogen社製）を用いてｃＤＮＡを作製したのち、ＧＡＰＤＨ（glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase、グリセルアルデヒド３リン酸脱水素酵素）を内部標準としてＳＬＣＯ４Ｃ１のｍＲＮＡの発現を定量ＰＣＲで測定した。細胞培養培地には腎上皮細胞培養キット（Lonza社製）を用い、定量ＰＣＲはTaqMan（登録商標）Gene Expression Assaysを使用し（ＧＡＰＤＨ；Assay ID: Rn99999916_s1、ＳＬＣＯ４Ｃ１；Assay ID: Rn01427754_m1のTaqMan（登録商標）プローブ（Applied Biosystems社製）を使用）、Step One Plus Real-Time PCR System（Applied Biosystems社製）により行った。その結果、尿毒症物質のひとつであるインドキシル硫酸はＳＬＣＯ４Ｃ１の発現を抑制するが、Ｎ，Ｎ’−ビス［５−（３，４，５−トリメトキシフェニル）−４−ペンテニル］ホモピペラジンは、ＡＣＨＮ細胞及びＨＫ−２細胞において、インドキシル硫酸により低下したＳＬＣＯ４Ｃ１の発現を回復させることが示された（図３、４）。

［Ｎ，Ｎ’−ビス［５−（３，４，５−トリメトキシフェニル）−４−ペンテニル］ホモピペラジンはＧＡＴＡ３の発現を抑制し、インドキシル硫酸によるＧＡＴＡ３の発現増強作用を解除する］
次に、インドキシル硫酸及びＮ，Ｎ’−ビス［５−（３，４，５−トリメトキシフェニル）−４−ペンテニル］ホモピペラジンがＡＣＨＮ細胞やＨＫ−２細胞におけるＧＡＴＡ３のｍＲＮＡ発現へ与える影響を調べた。６穴細胞培養プレートに５×１０^５個のＡＣＨＮ細胞又はＨＫ−２細胞を蒔いた後、２４時間インキュベーションした。その後各試薬（インドキシル硫酸（０．３、１、又は３ｍＭ）、インドキシル硫酸 １ｍＭ及びＮ，Ｎ’−ビス［５−（３，４，５−トリメトキシフェニル）−４−ペンテニル］ホモピペラジン １０μＭ、Ｎ，Ｎ’−ビス［５−（３，４，５−トリメトキシフェニル）−４−ペンテニル］ホモピペラジン １０μＭ、又はＤＭＳＯ ＤＭＳＯ ０．１％）を含んだ培地に交換し、２４時間インキュベーションした後にＲＮＡを抽出した。SuperScript III（Invitrogen社製）を用いてｃＤＮＡを作製したのち、ＧＡＰＤＨ（glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase、グリセルアルデヒド３リン酸脱水素酵素）を内部標準としてＧＡＴＡ３のｍＲＮＡの発現を定量ＰＣＲで測定した。細胞培養培地には腎上皮細胞培養キット（Lonza社製）を用い、定量ＰＣＲはTaqMan（登録商標）Gene Expression Assaysを使用し（ＧＡＰＤＨ；Assay ID: Rn99999916_s1、ＧＡＴＡ３；Assay ID: Hs00231122_m1のTaqMan（登録商標）プローブ（Applied Biosystems社製）を使用）、Step One Plus Real-Time PCR System（Applied Biosystems社製）により行った。その結果、ＨＫ−２細胞においてＮ，Ｎ’−ビス［５−（３，４，５−トリメトキシフェニル）−４−ペンテニル］ホモピペラジンはＧＡＴＡ３の発現を抑制し、また尿毒症物質のひとつであるインドキシル硫酸はＧＡＴＡ３の発現を増強するが、Ｎ，Ｎ’−ビス［５−（３，４，５−トリメトキシフェニル）−４−ペンテニル］ホモピペラジンは、インドキシル硫酸により増加したＧＡＴＡ３の発現を減少させることが示された（図５）。また、ＡＣＨＮ細胞において尿毒症物質のひとつであるインドキシル硫酸はＧＡＴＡ３の発現を増強するが、Ｎ，Ｎ’−ビス［５−（３，４，５−トリメトキシフェニル）−４−ペンテニル］ホモピペラジンは、インドキシル硫酸により増加したＧＡＴＡ３の発現を減少させることが示された（図６）。

以上より、ＳＬＣＯ４Ｃ１の発現は、スタチンにより促進され、ＧＡＴＡ３などにより抑制されるが、ＧＡＴＡ阻害剤Ｎ，Ｎ’−ビス［５−（３，４，５−トリメトキシフェニル）−４−ペンテニル］ホモピペラジンは、このＧＡＴＡ３を介した制御を阻害することにより、ＳＬＣＯ４Ｃ１の発現を増強するというＧＡＴＡ仮説が考えられた（図７）。また、Ｎ，Ｎ’−ビス［５−（３，４，５−トリメトキシフェニル）−４−ペンテニル］ホモピペラジンが、（１）尿毒症物質とＧＡＴＡタンパク質の結合阻害によるＳＬＣＯ４Ｃ１転写抑制を阻害すること及び、（２）尿毒症物質によるＧＡＴＡ３転写増強を阻害することの２つのはたらきにより、ＧＡＴＡ３を介した制御を阻害することが考えられた（図８）。

［Ｎ，Ｎ’−ビス［５−（３，４，５−トリメトキシフェニル）−４−ペンテニル］ホモピペラジンは、インドキシル硫酸による転写レベルでのＳＬＣＯ４Ｃ１遺伝子発現の抑制作用及びＧＡＴＡ３遺伝子発現の増強作用を解除する］
次に、Ｎ，Ｎ’−ビス［５−（３，４，５−トリメトキシフェニル）−４−ペンテニル］ホモピペラジン及びインドキシル硫酸がＳＬＣＯ４Ｃ１及びＧＡＴＡ３遺伝子の転写活性へ与える影響を調べるため、ヒトＳＬＣＯ４Ｃ１遺伝子の５’上流転写調節領域及びＧＡＴＡ３遺伝子の５’上流転写調節領域のプロモーター活性を調べる、ルシフェラーゼレポーターアッセイを以下の方法で行った。

（プラスミドＤＮＡ）
ＳＬＣＯ４Ｃ１遺伝子の５’上流転写調節領域のプロモーター活性ルシフェラーゼアッセイ用のプラスミドベクターSLCO4C1-3886/+110-pGL3cは、翻訳開始点より−３８８６から＋１１０ｂｐの長さの領域を、ゲノムＤＮＡをテンプレートに、配列番号１及び配列番号２のプライマーを用いて、ＰＣＲ法を用いて増幅し、pGL3 basic luciferase expression vector（Promega社製）に挿入して作製した。ＧＡＴＡ３遺伝子の５’上流転写調節領域のプロモーター活性ルシフェラーゼアッセイ用のプラスミドベクターpGATA3-lucは、ＧＡＴＡ３プロモーター領域の３．５ｋｂを、ゲノムＤＮＡをテンプレートに、配列番号３及び配列番号４のプライマーを用いて、ＰＣＲ法を用いて増幅し、制限酵素BamHIとNcoIで切り出し、ホタルルシフェラーゼタンパク質をコードする２ｋｂの遺伝子カセットとインフレームで連続してpBluscriptSK+（Novagen社製）ベクターに挿入することで作製した。

（トランスフェクションとルシフェラーゼレポーターアッセイ）
２４穴細胞培養プレートにＡＣＨＮ細胞を１穴あたり２０×１０^４個の細胞数で調整して継代し、検鏡下で７０−８０％の細胞密度となったＡＣＨＮ細胞に対してルシフェラーゼレポーターアッセイ用のプラスミドＤＮＡのトランスフェクションを施行した。トランスフェクション用の溶液組成は、１穴あたりFire fly luciferase vector（SLCO4C1-3886/+110-pGL １．２μｇ又はpGATA3-luc ２μｇ）、Renilla Luciferase Reporter VectorとしてpRh-TK （Promega社製）５０ｎｇ、トランスフェクション試薬としてLipofectamine2000（Invitrogen社製）２μｌを無血清培地のＯｐｔｉＭＥＭ−Ｉ（GIBCO社製）１００μｌに混合してから室温で２０分インキュベーションして調製した。このトランスフェクション用溶液を、無血清のＯｐｔｉＭＥＭ−Ｉ培地０．５ｍｌでプレインキュベーションした２４穴細胞培養プレートのＡＣＨＮ細胞に添加し、３７℃、５％ＣＯ_２にて無血清かつ抗生物質添加無しで４時間インキュベーションした。その後、培地を各試薬（インドキシル硫酸（１００μＭ）、インドキシル硫酸（１００μＭ）及びＮ，Ｎ’−ビス［５−（３，４，５−トリメトキシフェニル）−４−ペンテニル］ホモピペラジン（１０μＭ）、又はＤＭＳＯ（０．１％））を添加した通常培地（１０％ＦＢＳ、１００ＩＵ／ｍｌペニシリン、１０μｇ／ｍｌストレプトマイシンを含むＲＰＭＩ１６４０培地）に交換し、さらに３７℃、５％ＣＯ_２にて４４時間インキュベーションした。その後に、培地を無血清のＰＢＳ０．５ｍｌに置換して細胞を穏やかに洗浄しＰＢＳを吸引除去する作業を２回施行してから、passive lysis buffer（Promega社製）１００μｌ加えて２０分室温にて混和し溶解した。ルシフェラーゼレポーターアッセイはDual Luciferase Reporter Assay System（Promega社製）にて、ルミノメーターLumat LB9507（NERTHOLD TECHNOLOGIES社製）を用いてホタルルシフェラーゼ及びレニーラルシフェラーゼ量を測定した。そして、ホタルルシフェラーゼ量をレニーラルシフェラーゼ量で割ることにより、ＳＬＣＯ４Ｃ１及びＧＡＴＡ３遺伝子の転写活性を算出した。

ＤＭＳＯを添加したコントロールサンプルの転写活性を１とした場合の、インドキシル硫酸を添加した場合のＳＬＣＯ４Ｃ１遺伝子又はＧＡＴＡ３遺伝子の転写活性を図９に示す。その結果、インドキシル硫酸添加によりＳＬＣＯ４Ｃ１遺伝子の転写活性はコントロールの５６％まで減少するが、Ｎ，Ｎ’−ビス［５−（３，４，５−トリメトキシフェニル）−４−ペンテニル］ホモピペラジンの添加によりＳＬＣＯ４Ｃ１遺伝子の転写活性はコントロールの８５％に回復した（図９左グラフ）。また、インドキシル硫酸添加によりＧＡＴＡ３遺伝子の転写活性はコントロールの１３８％まで増加するが、Ｎ，Ｎ’−ビス［５−（３，４，５−トリメトキシフェニル）−４−ペンテニル］ホモピペラジンの添加によりＧＡＴＡ３遺伝子の転写活性はコントロールの８３％に減少した（図９右グラフ）。すなわち、Ｎ，Ｎ’−ビス［５−（３，４，５−トリメトキシフェニル）−４−ペンテニル］ホモピペラジンは、インドキシル硫酸による、転写レベルでのＳＬＣＯ４Ｃ１遺伝子発現の抑制作用及びＧＡＴＡ３遺伝子発現の増強作用を、解除することが示された。

以上の結果より、Ｎ，Ｎ’−ビス［５−（３，４，５−トリメトキシフェニル）−４−ペンテニル］ホモピペラジンが尿毒症物質によるＳＬＣＯ４Ｃ１及びエリスロポエチンの発現の抑制を阻害することが示唆された（図１０）。

本発明は、有機イオントランスポーター発現増強剤やＧＡＴＡ発現抑制剤、尿毒症治療・予防薬の分野に好適に利用することができる。また、有機イオントランスポーター発現増強剤やＧＡＴＡ発現抑制剤のスクリーニング方法の分野に好適に利用することができる。

Claims (11)

1. Ｎ，Ｎ’−ビス［５−（３，４，５−トリメトキシメトキシフェニル）−４−ペンテニル］ホモピペラジンを有効成分とすることを特徴とするＳＬＣＯ４Ｃ１発現増強剤。
2. 尿毒症物質によるＳＬＣＯ４Ｃ１発現抑制の解除作用を有することを特徴とする請求項１記載のＳＬＣＯ４Ｃ１発現増強剤。
3. ＳＬＣＯ４Ｃ１が、ヒトＳＬＣＯ４Ｃ１であることを特徴とする請求項１又は２記載のＳＬＣＯ４Ｃ１発現増強剤。
4. 請求項１〜３のいずれか記載のＳＬＣＯ４Ｃ１発現増強剤を含むことを特徴とする尿毒症治療・予防薬。
5. 以下の（ａ）〜（ｅ）の工程を備えたことを特徴とする尿毒症物質によるＳＬＣＯ４Ｃ１発現抑制の解除剤のスクリーニング方法。
   （ａ）ＧＡＴＡ結合配列を含むヒトＳＬＣＯ４Ｃ１遺伝子の５’上流転写領域の下流にインフレームで連結したレポーター遺伝子をプラスミドに組み込みレポータープラスミドを構築する工程；
   （ｂ）構築したレポータープラスミドを、ヒトＳＬＣＯ４Ｃ１遺伝子を発現し得る細胞株に導入して形質転換細胞株を調製する工程；
   （ｃ）調製した形質転換細胞株に、尿毒症物質の存在下で被検物質を接触させる工程；
   （ｄ）レポーター遺伝子の発現の程度を測定する工程；
   （ｅ）被検物質不存在下の対照と比較してレポーター遺伝子の発現の程度が大きい場合、被検物質を尿毒症物質によるＳＬＣＯ４Ｃ１発現抑制を解除する活性を有する物質と判定する工程；
6. 工程（ｂ）において、構築したレポータープラスミドに加えてＧＡＴＡ発現プラスミドを用いることを特徴とする請求項５記載のスクリーニング方法。
7. レポーター遺伝子がルシフェラーゼ遺伝子であることを特徴とする請求項５又は６記載のスクリーニング方法。
8. Ｎ，Ｎ’−ビス［５−（３，４，５−トリメトキシメトキシフェニル）−４−ペンテニル］ホモピペラジンを有効成分とすることを特徴とする尿毒症物質によるＧＡＴＡ発現増強の解除剤。
9. 請求項８記載の解除剤を含むことを特徴とする尿毒症治療・予防薬。
10. 以下の（ａ’）〜（ｅ’）のステップを備えたことを特徴とする尿毒症物質によるＧＡＴＡ発現増強の解除剤のスクリーニング方法。
    （ａ’）ＧＡＴＡ３遺伝子の５’上流転写領域の下流にインフレームで連結したレポーター遺伝子をプラスミドに組み込みレポータープラスミドを構築する工程；
    （ｂ’）構築したレポータープラスミドを、ＧＡＴＡ３遺伝子を発現し得る細胞株に導入して形質転換細胞株を調製する工程；
    （ｃ’）調製した形質転換細胞株に、尿毒症物質の存在下で被検物質を接触させる工程；
    （ｄ’）レポーター遺伝子の発現の程度を測定する工程；
    （ｅ’）被検物質不存在下の対照と比較してレポーター遺伝子の発現の程度が小さい場合、被検物質を尿毒症物質によるＧＡＴＡ発現増強を解除する活性を有する物質と判定する工程；
11. レポーター遺伝子がルシフェラーゼ遺伝子であることを特徴とする請求項１０記載のスクリーニング方法。