JP5806694B2 - 研究、判定又は評価法 - Google Patents
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Description
(a)ワクシニアウイルスを接種し発痘させたウサギ、マウス等の皮膚組織等を採取し、発痘組織を破砕し、水、フェノール水、生理食塩液またはフェノール加グリセリン水等の抽出溶媒を加えた後、濾過または遠心分離することによって抽出液(濾液または上清)を得る。
(b)前記抽出液を酸性のpHに調整して加熱し、除蛋白処理する。次いで除蛋白した溶液をアルカリ性に調整して加熱した後に濾過または遠心分離する。
(c)得られた濾液または上清を酸性とし活性炭、カオリン等の吸着剤に吸着させる。
(d)前記吸着剤に水等の抽出溶媒を加え、アルカリ性のpHに調整し、吸着成分を溶出することによってワクシニアウイルス接種炎症組織抽出物を得ることができる。
(a)について
ワクシニアウイルスを家兎等のウサギに接種して発痘させた炎症皮膚組織を採取して破砕し、その1乃至5倍量の抽出溶媒を加えて乳化懸濁液とする。抽出溶媒としては、蒸留水、生理食塩水、弱酸性乃至弱塩基性の緩衝液などを用いることができ、グリセリン等の安定化剤、フェノール等の殺菌・防腐剤、塩化ナトリウム、塩化カリウム、塩化マグネシウム等の塩類などを適宜添加してもよい。この時、凍結融解、超音波、細胞膜溶解酵素又は界面活性剤等の処理により細胞組織を破壊して抽出を容易にすることもできる。
得られた乳状抽出液を濾過又は遠心分離等によって組織片を除去した後、除蛋白処理を行う。除蛋白操作は、通常行われている公知の方法により実施でき、加熱処理、蛋白質変性剤、例えば、酸、塩基、尿素、グアニジン、アセトン等の有機溶媒などによる処理、等電点沈澱、塩析等の方法を適用することができる。次いで、不溶物を除去する通常の方法、例えば、濾紙(セルロース、ニトロセルロース等)、グラスフィルター、セライト、ザイツ濾過板等を用いた濾過、限外濾過、遠心分離等により析出してきた不溶蛋白質を除去する。
こうして得られた有効成分含有抽出液を、塩酸、硫酸、臭化水素酸等の酸を用いて酸性、好ましくはpH3.5乃至5.5に調整し、吸着剤への吸着操作を行う。使用可能な吸着剤としては、活性炭、カオリン等を挙げることができ、抽出液中に吸着剤を添加し撹拌するか、抽出液を吸着剤充填カラムに通過させて、該吸着剤に有効成分を吸着させることができる。抽出液中に吸着剤を添加した場合には、濾過や遠心分離等によって溶液を除去して、有効成分を吸着させた吸着剤を得ることができる。
吸着剤より有効成分を溶出(脱離)させるには、前記吸着剤に溶出溶媒を加え、室温又は適宜加熱して或いは撹拌して溶出し、濾過や遠心分離等の通常の方法で吸着剤を除去して達成できる。用いられる溶出溶媒としては、塩基性の溶媒、例えば塩基性のpHに調整した水、メタノール、エタノール、イソプロパノール等又はこれらの適当な混合溶液を用いることができ、好ましくはpH9乃至12に調整した水を使用することができる。
(1)動物
6週齡のWistar系雄性ラットにSARTストレスを負荷し、SARTストレスラットを作製した。ラットには飼料及び水道水を自由に摂取させて5日間負荷し、6日目にストレス負荷から解放し、実験に供した。
ワクシニアウイルス接種炎症組織抽出物としては、上記特許文献1の実施例2に従って製造されたワクシニアウイルスを接種したウサギの炎症皮膚からの抽出物を20 NU/mLに調製したもの(ワクシニアウイルス接種家兎炎症皮膚抽出物)を用いた。NUとは、疼痛閾値が正常動物より低下した慢性ストレス動物であるSARTストレスマウスを用い、Randall-Selitto変法に準じて試験を行い、鎮痛効力のED50値をもって規定する。1NUはED50値が100 mg/kgであるときのワクシニアウイルス接種家兎炎症皮膚抽出物の鎮痛活性含有成分1mgを示す活性である。
上記SARTストレス負荷ラットに、ワクシニアウイルス接種家兎炎症皮膚抽出物を体重1kg当り200 NUでSARTストレス負荷開始日から連日腹腔内投与した(SARTストレス被検物質投与群)。正常対照群及びSARTストレス負荷対照群には、生理食塩液を同じスケジュールで投与した。投与液量は、体重1kg当り10 mLとした。群編成としては、正常対照群 (n=5)、SARTストレス負荷対照群 (n=10)、SARTストレス負荷被検物質投与群 (n=10) とした。
疼痛閾値は圧刺激鎮痛効果測定装置を用いたRandall-Selitto変法に準じた試験によって測定した。すなわち、ラット右後肢足蹠に一定の加圧速度で圧刺激を加えて、動物が逃避あるいは鳴諦反応を示す加圧重量 (g) を疼痛閾値とて測定した。
(1)体重の変化
SARTストレス負荷対照群の体重は、正常対照群と比較してストレス負荷開始1日後から有意な体重増加の抑制が認められた。SARTストレス負荷被検物質投与群の体重は、SARTストレス負荷対照群と比較して変化はみられなかった。
SARTストレスを5日間負荷すると疼痛閾値は正常対照群と比較して有意に低下した。SARTストレス負荷被検物質投与群で最終投与30分後に疼痛閾値を測定した結果、SARTストレス負荷対照群と比較して有意な改善が観察された。
上記のとおり、SARTストレス負荷による疼痛閾値の低下とワクシニアウイルス接種家兎炎症皮膚抽出物の鎮痛効果が確認できた後、各群の脳組織から大脳、中脳、小脳、間脳、橋と延髄、及び脊髄後角と後根神経節を回収した。得られた各サンプルは、ポリトロンホモジナイザーを用いてそれぞれの群より4匹分のサンプルを氷冷下で細胞溶解緩衝液(30mmol/L トリス塩酸、2mol/L チオ尿素、7mol/L 尿素、4% CHAPS、pH8.5)〔CHAPS:3-[(3-Cholamidopropyl)dimethylammonio]propanesulfonic acid〕でホモジナイズした。組織ホモジネートは、液体窒素で急冷し使用時まで-80℃で凍結保存した。
上記二次元電気泳動に使用する試薬はいずれもGEヘルスケア バイオサイエンス株式会社(旧Amersham Bioscience)が指定する製造元、グレードのものを使用した。細胞溶解緩衝液、膨潤緩衝液に使用する尿素及びチオ尿素は分解物による実験系への悪影響を避けるため、イオン交換樹脂Amberliteを加えて振盪し、分解物を吸着除去した後使用した。試薬の調製には超純水(Milli-Q水)を使用した。
上記方法で得られたサンプルの蛋白質濃度はBradford法によりウシ血清アルブミンで作製した検量線を用いて定量した。これを二次元電気泳動のサンプルとして使用し、蛋白質発現量変化の解析には2D-DIGE法を用いた。
サンプルの蛋白質濃度を2あるいは5mg/mLとなるように細胞溶解緩衝液で調製し、液性がpH8.0〜9.0の範囲であることを確認した。測定する全サンプルを等量ずつ混合したものを作製しこれを内部標準とした。内部標準、蛋白質サンプル50μgをマイクロチューブに取り、Cy Dye DIGE Fluor minimal dye標識溶液(無水ジメチルホルムアミドでCy Dye色素を400pmol/μLに希釈)1μLを加え、攪拌後氷中・暗所で30分静置して蛋白質を標識した。内部標準サンプルはCy2色素で、蛋白質サンプルはCy3あるいはCy5色素で標識した。10mmol/L リジン溶液1μLを添加し、氷中・暗所で10分間静置して標識反応を停止させた。Cy2、Cy3及びCy5で標識した各サンプルを1本のマイクロチューブに入れて混和し、これを一次元目電気泳動に使用した。
一次元目の電気泳動はAmersham BioscienceのIPG precast gel(Immobiline Drystrip)と等電点電気泳動システム(IPGphor)を用いた等電点電気泳動を行った。 ストリップ長は24cm、pH範囲はpH4-7L、4.5-5.5L、5.3-6.5L及び6-9Lのものを使用した。
pH4-7L、4.5-5.5L及び5.3-6.5Lのストリップの場合、膨潤とサンプル添加を同時に行った。サンプルを含む膨潤緩衝液(2mol/L チオ尿素、7mol/L 尿素、4% CHAPS、1.2% DeStreak Reagent、0.5% IPG Buffer)450μLを24cmストリップホルダーに乗せ、これにIPG ストリップを乗せて10時間膨潤後、1ストリップあたり最大50μA、最大8000Vで130,000-180,000VHr電気泳動を実施した。
サンプル添加後の操作は極力遮光した条件で実施し、泳動が完了したストリップは二次元目電気泳動まで-80℃で保存した。
二次元目の電気泳動は、24cm×20cm、1mm厚のドデシル硫酸ナトリウム-ポリアクリルアミドゲル電気泳動(SDS-PAGE、アクリルアミド濃度:12.5%)で実施した。電気泳動が完了したストリップに平衡化緩衝液 A(50mmol/L トリス塩酸、6mol/L 尿素、30%グリセロール、2%SDS、1%ジチオスレイトール、 pH8.8)を加えて15分間振盪し、平衡化緩衝液B(50mmol/L トリス塩酸、6mol/L 尿素、30%グリセロール、2%SDS、2.5%ヨードアセトアミド、 pH8.8)に変更後更に15分間振盪した。平衡化終了後、直ちに二次元目電気泳動を実施した。泳動は10℃、2W/ゲル、遮光状態で、泳動先端がGel下端から5〜10mmの位置まで実施した。
泳動が終了したゲルは泳動槽より取り出した後遮光し、ガラス板に挟んだまま直ちにTyphoon 9400バリアブルイメージアナライザー(蛍光画像解析装置)を用いてCy2、Cy3、Cy5の蛍光イメージの取り込みを行った(励起波長/蛍光波長: Cy2:488nm/520nm, Cy3:532nm/580nm, Cy5:633nm/670nm)。各神経組織につき6枚のゲル(ゲルイメージ数18)を、DeCyder Differential Analysis Softwareでスポットの検出、マッチング、統計解析を行った。正常対照群とSARTストレス負荷対照群ならびにSARTストレス負荷対照群とSARTストレス負荷被検物質投与群を比較し、発現量の差が1.5倍以上、t-testでp<0.05であるスポットを選別した。
翻訳後修飾の影響について確認するため、蛍光標識試薬(Cy Dye)を用いた全蛋白質の標識とリン酸化蛋白質染色試薬(Pro-Q Diamond)を用いたリン酸化蛋白質の染色を同一ゲルで実施した。サンプル50μgをCy2でラベルし、ラベルしていない450μgのサンプルと混和し上記と同様に二次元電気泳動を実施した。泳動終了後、Cy DyeならびにPro-Q Diamondの退色が起こらないよう遮光下で染色操作を実施した。
蛋白質量で500μgに相当する組織ホモジネートをサンプルとして添加し、上記と同様に二次元電気泳動を実施した。
ゲル中の全蛋白質の染色はSYPRO Ruby Protein Gel及びBlot Stain kitを用い、プロトコルに従い染色した。泳動が完了したゲルはガラス板より取り出し、固定液(10%メタノール、7%酢酸)500mLに浸し終夜静かに室温で振盪して固定した。固定後染色液500mLを入れ、遮光下で5時間以上静かに室温で振盪し染色した。その後脱色液(10%メタノール、6%酢酸)500mLを入れ、遮光下で1〜2時間静かに室温で振盪して脱色した。ゲルはTyphoon 9400バリアブルイメージアナライザーを用いて励起波長457nm/蛍光波長610nmで測定した。染色後のゲルはBioRad SpotCutterを用いて目的のスポットをピックし、これを解析した。
(1)pH4-7の範囲における蛋白質発現変動の解析
採取した全ての組織において、pH4-7の範囲での蛍光標識二次元ディファレンスゲル電気泳動(2D-DIGE)解析を実施した。
解析の結果、正常対照群とSARTストレス負荷対照群ならびにSARTストレス負荷対照群とSARTストレス負荷被検物質投与群を比較し、発現量の差が1.5倍以上、t-testでp<0.05であるスポットは見出されなかった。以下、同様の検定基準でスポットの発現量の差を評価した。
正常対照群とSARTストレス負荷対照群ならびにSARTストレス負荷対照群とSARTストレス負荷被検物質投与群で発現量に差のあるスポットは見出されなかった。
正常対照群とSARTストレス負荷対照群の比較ではSARTストレス負荷対照群で5個のスポットが増加しており、減少したスポットは見出されなかった。SARTストレス負荷対照群とSARTストレス負荷被検物質投与群では、被検物質投与群で1個のスポットが増加し、4個のスポットが減少していた。
正常対照群とSARTストレス負荷対照群の比較ではSARTストレス負荷対照群で6個のスポットが増加しており、4個のスポットが減少していた。SARTストレス負荷対照群とSARTストレス負荷被検物質投与群では、被検物質投与群で3個のスポットが増加し、減少したスポットは見出されなかった。
正常対照群とSARTストレス負荷対照群の比較ではSARTストレス負荷対照群で増加したスポットは見られず、1個のスポットが減少していた。SARTストレス負荷対照群とSARTストレス負荷被検物質投与群では、被検物質投与群で増加したスポットは見られず、1個のスポットが減少していた。
正常対照群とSARTストレス負荷対照群の比較ではSARTストレス負荷対照群で5個のスポットが増加しており、9個のスポットが減少していた。SARTストレス負荷対照群とSARTストレス負荷被検物質投与群では、発現量に差のあるスポットは見出されなかった。
正常対照群とSARTストレス負荷対照群の比較ではSARTストレス負荷対照群で1個のスポットが増加しており、減少したスポットは見られなかった。SARTストレス負荷対照群とSARTストレス負荷被検物質投与群では、被検物質投与群で1個のスポットが増加しており、1個のスポットが減少していた。
正常対照群とSARTストレス負荷対照群の比較ではSARTストレス負荷対照群で1個のスポットが増加しており、減少したスポットは見られなかった。SARTストレス負荷対照群とSARTストレス負荷被検物質投与群では、発現量に差のあるスポットは見出されなかった。
pH4-7の範囲で、複数のスポットの変化が確認できた中脳、橋及び小脳に関して、より狭い範囲(pH4.5-5.5及びpH5.3-6.5)でのDIGEを実施し、pH4-7で得られた結果の再確認と新たなスポットの検出を試みた。
pH4.5-5.5の範囲においては正常対照群とSARTストレス負荷対照群ではSARTストレス負荷対照群で14個のスポットが増加しており、6個のスポットが減少していた。SARTストレス負荷対照群とSARTストレス負荷被検物質投与群では、1個のスポットが被検物質投与群で増加し、14個のスポットが減少していた。pH5.3-6.5の範囲においては正常対照群とSARTストレス負荷対照群ではSARTストレス負荷対照群で7個のスポットが増加しており、2個のスポットが減少していた。SARTストレス負荷対照群とSARTストレス負荷被検物質投与群では、2個のスポットが被検物質投与群で増加し、6個のスポットが減少していた。
中脳においてpH4-7の範囲で変動が見られたスポットは1つを除いてpH4.5-5.5及びpH5.3-6.5の範囲においても1.5倍以上有意に変動しており、実験の再現性が確認できた。
pH4.5-5.5の範囲においては正常対照群とSARTストレス負荷対照群ならびにSARTストレス負荷対照群とSARTストレス負荷被検物質投与群で発現量に差のあるスポットは見出されなかった。pH5.3-6.5の範囲においては正常対照群とSARTストレス負荷対照群ではSARTストレス負荷対照群で1個のスポットが増加しており、1個のスポットが減少していた。SARTストレス負荷対照群とSARTストレス負荷被検物質投与群では、2個のスポットが被検物質投与群で増加し、1個のスポットが減少していた。
橋においては、pH4-7の範囲で変動が検出できたスポットをpH4.5-5.5及びpH5.3-6.5の範囲において確認することができなかった。
pH4.5-5.5の範囲においては正常対照群とSARTストレス負荷対照群ではSARTストレス負荷対照群で3個のスポットが増加しており、12個のスポットが減少していた。SARTストレス負荷対照群とSARTストレス負荷被検物質投与群では、2個のスポットが被検物質投与群で増加し、1個のスポットが減少していた。pH5.3-6.5の範囲においては正常対照群とSARTストレス負荷対照群ではSARTストレス負荷対照群で2個のスポットが増加しており、7個のスポットが減少していた。SARTストレス負荷対照群とSARTストレス負荷被検物質投与群では、1個のスポットが被検物質投与群で増加し、減少しているスポットは見出されなかった。
小脳においてpH4-7の範囲で変動が見られたスポットは2つを除いてpH4.5-5.5及びpH5.3-6.5の範囲においても1.5倍以上有意に変動しており、実験の再現性が確認できた。
pH6-9の範囲での大脳と後根神経節におけるDIGE解析結果は次のとおりであった。
正常対照群とSARTストレス負荷対照群ならびにSARTストレス負荷対照群とSARTストレス負荷被検物質投与群で発現量に差のあるスポットは見出されなかった。
正常対照群とSARTストレス負荷対照群ならびにSARTストレス負荷対照群とSARTストレス負荷被検物質投与群で発現量に差のあるスポットは見出されなかった。
プロテオーム解析では翻訳後修飾の影響を見出せる点で他の手法よりも利点があるといわれている。そこで、中脳サンプルで蛋白質のリン酸化について確認を行った。総蛋白質をCy5でプレ標識し、二次元電気泳動後リン酸化している蛋白質をProQ Diamondで染色してそれぞれの蛍光波長でイメージを取得し、蛋白質のリン酸化の有無を確認した。
中脳、橋及び小脳のサンプルについて二次元電気泳動を行い、スポットに関してピックしゲル内消化した後MALDI-TOF/MSで解析した。
これら同定された蛋白質のうち、中脳においてSARTストレス負荷により変動するが被検物質投与により変動が抑制された、CRMP-2、CRMP-4、Munc-18-1及びNSF、ならびに小脳おいてSARTストレス負荷により変動が認められたComplexin 1/2について、更に詳細に検討を行なった。
見出された蛋白質に関しては公共のデータベースおよび公知の文献より情報を収集した。
Claims (7)
- 被検物質の鎮痛作用又は抗ストレス作用を評価する方法であって、SARTストレスを負荷した動物(ヒトを除く)に被検物質を投与し、該動物の脳組織における、翻訳後に修飾されている又は修飾されていないCRMP-4の蛋白質の発現を、該被検物質を投与した場合と投与していない場合で比較し、その変動を指標として、該被検物質の上記作用の少なくともいずれかを評価する方法。
- SARTストレスを負荷した動物(ヒトを除く)がラット、マウス又はモルモットである請求項1に記載の方法。
- 脳組織が中脳、橋又は小脳である請求項1又は2に記載の方法。
- 被検物質がワクシニアウイルス接種炎症組織抽出物である請求項1乃至3のいずれか1項に記載の方法。
- 被検物質がワクシニアウイルス接種家兎炎症皮膚抽出物である請求項4に記載の方法。
- 請求項1乃至5のいずれか1項に記載の方法に用いるSARTストレスを負荷した動物(ヒトを除く)の使用方法。
- 被検物質がワクシニアウイルス接種家兎炎症皮膚抽出物である請求項1乃至3のいずれか1項に記載の方法に用いるSARTストレスを負荷した動物(ヒトを除く)の使用方法。
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