JP5801854B2

JP5801854B2 - 抗菌ペプチド

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Publication number: JP5801854B2
Application number: JP2013165557A
Authority: JP
Inventors: ベウワーマン，ロジャー; ジョウ，レイ; リュ，シュオピン; リー，ジン; スレーシュ，アニタ; シェカールベルマ，チャンドラ; タン，ドナルド
Original assignee: Singapore Health Services Pte Ltd
Current assignee: Singapore Health Services Pte Ltd
Priority date: 2006-04-27
Filing date: 2013-08-08
Publication date: 2015-10-28
Anticipated expiration: 2027-04-27
Also published as: EP2277899A3; EP2949663A1; WO2007126392A1; EP2010561A1; EP2277899B1; JP2016020368A; US8691945B2; WO2007126392A8; US20100048469A1; JP2009535027A; EP2010561A4; JP2013252143A; EP2277899A2

Description

本発明は、抗菌ペプチドに関する。詳細には、本発明は、ｈＢＤ３のアナログ、その誘導体またはその断片に関する。

ディフェンシンは、３箇所のジスルフィド結合により拘束された、小さい３〜５ｋＤａの内因性の陽イオン性タンパク質であり、主にその抗菌活性で知られる（ＲａｊＰ．Ａ．ａｎｄＡ．Ｒ．Ｄｅｎｔｉｎｏ、２００２）。ディフェンシンは、多くの生物の自然免疫系、すなわち侵入病原菌に対する防御の最前線において鍵となる要素であることが示されている。また、ディフェンシンは、哺乳動物の単球および樹状細胞に対し化学遊走促進剤としても作用する（Ｙａｎｇら、２００１）。ヒトにおいては、現在のところ６種のαディフェンシン、すなわちヒト好中球ペプチド（ｈＮＰ１からｈＮＰ６）と、４種のβディフェンシン（ｈＢＤ１からｈＢＤ４）とがある。

特定のディフェンシンは、多くの場合、限定的な範囲の活性を有するが、ペプチドの１種として、ディフェンシンは、グラム陰性菌およびグラム陽性菌、酵母、ならびに、ＨＩＶなどエンベロープを有する数種のウイルスに対する幅広い抗菌活性を有する（ＳｃｈｒｏｄｅｒＪ．Ｍ．、１９９９）。ｈＢＤ３は、グラム陰性菌およびグラム陽性菌、真菌ならびにアデノウイルスに対し広い範囲の抗菌活性を有しており、ｈＢＤ３は一貫して最も強力である。そのうえｈＢＤ３は、生理食塩濃度で多剤耐性黄色ブドウ球菌に対する顕著な殺菌活性を有し（Ｄａｖｉｄら、２００２）、バンコマイシン耐性エンテロコッカス・フェシウム、バークホルデリア・セパシアおよび酵母カンジダ・アルビカンスに対する活性も示している（Ｈａｒｄｅｒら、２００１；Ｇａｒｃｉａら、２００１）。

ディフェンシンの抗菌活性は、両親媒性の分子構造の存在と、折りたたまれたペプチド表面上の陽イオン性領域および疎水性領域の広さおよび分布とにより決まると一般に推測されている（ＹｅａｍａｎａｎｄＹｏｕｎｔ、２００３；ＨｗａｎｇａｎｄＶｏｇｅｌ、１９９８）。ジスルフィド架橋の存在および位置とＮ末端配列の変異／断片が、βディフェンシンの抗菌作用にわずかな影響を及ぼすようである（Ｚｕｃｈｔら、１９９８）。βディフェンシンの構造因子が真核生物の膜との相互作用に及ぼす影響については、ほとんど知られていない。

βディフェンシンなどの抗菌ペプチドが細菌細胞および真核細胞に及ぼす効果の選択性は、正電荷を持つ表面領域と疎水性の表面領域とのバランスによって決まると思われる。ｈＢＤ３中のジスルフィド結合は、走化性にとってはケモカイン受容体ＣＣＲ６の結合および活性化のために必要であるが、その抗菌機能にとってはなくてもよいと考えられ、［Ａｂｕ］−ｈＢＤ３の直鎖状構造は、ｈＢＤ３の走化性活性は失ったようであるが、細菌に対する活性は、ジスルフィド結合が一切なくても影響を受けずに保たれていた。ここ数年の著しい進歩にもかかわらず、ヒトディフェンシンについての構造−活性関係は大部分が未開拓のままである。その作用の非常に多様な生物学的機能および機序を支配している、ヒトディフェンシンの配列ルールおよび構造決定因子は、十分解明されていない状態が続いている。

Ｇｏｒｄｏｎ，Ｙ．Ｊｅｒｏｌｄら（ＣｕｒｒｅｎｔＥｙｅＲｅｓｅａｒｃｈ、２００５、３０、５０５〜１５掲載）は、いくつかある欠点の中でも、全身的および局所的な毒性ならびに製造コスト高が、抗感染剤としての抗菌ペプチドの開発にとっての二大欠点であると述べた。より良いディフェンシンを開発するための努力により、その殺菌能力の向上は実現可能であることを示唆する結果がいくつか生み出されているが、このような環境下で宿主細胞に対する毒性が増加する可能性もある。したがって、眼科用に開発するには、細胞毒性が主要な課題であると考えられよう。このことから、当技術分野では、有効な、改良された、細胞毒性の低い製品のさらなる研究・開発の必要性がある。

本発明は、上述の問題に取り組もうとするものである。具体的には、本発明は、単離抗菌ペプチドおよびその使用を提供する。

第一の態様により、本発明は、ｈＢＤ３の直鎖状アナログまたはその断片であり、ただし該アナログは配列番号２８ではなく、該断片は配列番号３１から３６のいずれでもない、単離抗菌ペプチドを提供する。

ｈＢＤ３のシステイン残基のいずれか１つは、他の任意のアミノ酸もしくはその誘導体で置き換えられてもよく、または保護されたシステイン残基もしくはその誘導体で置き換えられてもよく、またはこのシステイン残基は欠失していてもよい。この単離ペプチドは、配列番号２から１２のいずれか１つのアミノ酸配列またはその断片を含んでよく、配列中、Ｘ^１、Ｘ^２、Ｘ^３、Ｘ^４、Ｘ^５およびＸ^６のいずれか１つは、システイン以外の任意のアミノ酸であるか、Ｃ［Ａｂｕ］以外の保護されたシステイン残基もしくはその誘導体であるか、またはアミノ酸は存在していない。

第二の態様により、本発明は、ｈＢＤ３の直鎖状アナログまたはその断片であり、配列番号２から１２のいずれか１つのアミノ酸配列またはその断片を含み、配列中、Ｘ^１、Ｘ^２、Ｘ^３、Ｘ^４、Ｘ^５およびＸ^６のいずれか１つは、システイン以外の任意のアミノ酸であるか、Ｃ［Ａｂｕ］以外の保護されたシステイン残基もしくはその誘導体であるか、またはそのアミノ酸は存在していない、単離抗菌ペプチドを提供する。

本発明の任意の態様による単離ペプチドは、配列番号１３から２５のいずれか１つのアミノ酸配列またはその断片を含みうる。とりわけ、この単離ペプチドは、配列番号１３から１８のいずれか１つのアミノ酸配列またはその断片を含む。保護されたシステイン残基は、Ｃ（Ａｃｍ）、Ｃ（Ｂｕｔ）、Ｃ（ｔ−Ｂｕｔｈｉｏ）、Ｃ（Ｂｚｌ）、Ｃ（４−Ｍｅ−Ｂｚｌ）、Ｃ（４−ＭｅＯ−Ｂｚｌ）、Ｃ（Ｍｍｔ）またはＣ（Ｃａｍ）のいずれか１つとすることができる。この単離ペプチドは、配列番号３９から４５のいずれか１つのアミノ酸配列またはその断片を含んでもよい。

この単離ペプチドは、野生型ｈＢＤ３と比較して、任意の細胞種の少なくとも１種の細胞に対する細胞毒性が低下していてもよい。

また、本発明は、本発明の任意の態様による少なくとも１種のペプチドまたはその断片をコードする単離ポリヌクレオチドも提供する。このポリヌクレオチドは、ベクター中に含めることができる。したがって、本発明は、任意の態様によるポリヌクレオチドを含むベクターも提供する。

本発明の別の態様は、本発明の任意の態様によるポリヌクレオチドを含む宿主細胞、または本発明の任意の態様により提供されるベクターを含む宿主細胞である。

また、本発明は、本発明の任意の態様による少なくとも１種の抗菌ペプチドまたはその断片を含む医薬組成物も提供する。この医薬組成物は、局所、経口または非経口投与用に処方しうる。とりわけ、この医薬組成物は、注射、吸入および／または局所適用による投与用に処方される。

この医薬組成物は、抗菌組成物としうる。したがって、本発明は、本発明の任意の態様による少なくとも１種のペプチドまたはその断片および少なくとも１種の非ペプチド性抗菌剤を含む抗菌組成物を提供する。

本発明の任意の態様による組成物は、局所投与用としてもよく、１または複数の皮膚および／または粘膜の治療に適したものとすることができる。この組成物は、点眼剤（複数も可）の組成物または溶液の形態としてもよい。

また、本発明は、本発明の任意の態様による少なくとも１種の医薬組成物、本発明の任意の態様による少なくとも１種の抗菌組成物、または本発明の任意の態様による少なくとも１種のペプチドおよび／またはその断片を含むコンタクトレンズ用溶液も提供する。

本発明の別の態様は、少なくとも１種のポリマー、および、本明細書にそれぞれ記載の、少なくとも１種のペプチド、少なくとも１種の医薬組成物、および／または少なくとも１種の抗菌組成物を含むコンタクトレンズである。

本発明は、それぞれ本明細書に記載の、少なくとも１種の医薬組成物、少なくとも１種の抗菌組成物、および／または少なくとも１種のペプチドまたはその断片を含む機器コーティングをさらに提供する。この機器コーティングは、医療機器コーティングとすることができる。また、本発明により、本明細書に記載の少なくとも１種のコーティングで被覆された機器も提供される。この機器は、カテーテル、針、シース、ステント、コンタクトレンズおよび／または包帯とすることができるが、これらに限定されない。

別の態様により、本発明は、少なくとも１種の適当な容器に入れられた、本明細書にそれぞれ記載の、少なくとも１種の抗菌ペプチド、少なくとも１種の医薬組成物、および／または少なくとも１種の抗菌組成物を含む、キットを提供する。このキットは、少なくとも１種の追加の抗菌剤をさらに含んでもよい。

また、本発明は、本発明の任意の態様による少なくとも１種の抗菌ペプチド、本発明の任意の態様による少なくとも１種の医薬組成物、および／または本発明の任意の態様による少なくとも１種の抗菌組成物を微生物に接触させることを含む、少なくとも１種の微生物の生育を阻害および／または抑制する方法も提供する。

また、本発明の任意の態様による、少なくとも１種の抗菌ペプチド、少なくとも１種の医薬組成物、および／または少なくとも１種の抗菌組成物を宿主に投与または施用することを含む、宿主体内での少なくとも１種の微生物の生育を阻害および／または抑制する方法も提供される。

また、本発明は、本発明の任意の態様による、少なくとも１種の抗菌ペプチド、少なくとも１種の医薬組成物、および／または少なくとも１種の抗菌組成物を対象に投与することを含む、少なくとも１種の微生物感染症を治療する方法も提供する。

本発明の別の態様は、本発明の任意の態様による、少なくとも１種の抗菌ペプチド、少なくとも１種の医薬組成物、および／または少なくとも１種の抗菌組成物を用いて微生物を処理することを含む、少なくとも１種の多剤耐性微生物を処理する方法である。

したがって、記載の方法の任意の１つにおける微生物は、類鼻疸菌、黄色ブドウ球菌、大腸菌、緑膿菌、セレウス菌、ウイルスおよび／または真菌であってよい。

また、本発明は、少なくとも１種のｈＢＤ３アナログまたはその断片を任意の細胞種の少なくとも１種の細胞に投与すること、および該アナログまたはその断片は野生型ｈＢＤ３と比較して任意の細胞種の細胞に対する細胞毒性が低下しているかどうかを確認することを含む、薬剤スクリーニング法も提供する。

本発明の別の態様は、任意のシステイン残基を欠失させること、任意のシステイン残基を他の任意のアミノ酸もしくはその誘導体または保護されたシステイン残基もしくはその誘導体で置き換えること、細胞に投与すること、および細胞毒性の低下を確認することを含む、ペプチドアナログまたはその断片を設計する方法である。

これまでに報告されていない、ヒトβディフェンシン３の新規アナログＷ６、Ｆ６、Ｙ６、Ｓ６、Ａ６およびＣ（Ａｃｍ）６を示す図である。野生型ｈＢＤ３およびｈＢＤ３の直鎖状アナログの、水中でのＣＤ（円二色性）スペクトルを示す図である。図１Ｂ中の化合物Ｃ６という参照記号は、アナログＣ（Ａｃｍ）６を表すことを意図している。野生型ｈＢＤ３およびｈＢＤ３の直鎖状アナログの、ＴＦＥ中でのＣＤ（円二色性）スペクトルを示す図である。野生型ｈＢＤ３およびｈＢＤ３の直鎖状アナログの、ＳＤＳミセル中でのＣＤ（円二色性）スペクトルを示す図である。ｈＢＤ３アナログの濃度に応じたヒト結膜上皮細胞の生存能を示すグラフである。ｈＢＤ３アナログの溶血作用の濃度依存性を示すグラフである。ｈＢＤ３アナログの抗菌活性を示すグラフである。精製済のＷ６のＵＶクロマトグラムであり、条件は、Ｃ１８（１５０ｍｍ×３．９ｍｍ、５μｍ、１００Å）、流速０．２ｍｌ／分、溶離液Ｂの濃度勾配は３２分間で１８％から３８％である。精製済のＷ６のＥＳＩ−ＭＳ分析におけるｍ／ｚ＝１１３２．９（［Ｍ＋５Ｈ］^５＋）でのＳＩＲクロマトグラムであり、条件は、Ｃ１８（１５０ｍｍ×３．９ｍｍ、５μｍ、１００Å）、流速０．２ｍｌ／分、溶離液Ｂの濃度勾配は３２分間で１８％から３８％である。精製済のＷ６のＥＳＩ−ＭＳ分析図であり、条件は、Ｃ１８（１５０ｍｍ×３．９ｍｍ、５μｍ、１００Å）、流速０．２ｍｌ／分、溶離液Ｂの濃度勾配は３２分間で１８％から３８％である。精製済のＷ６のＥＳＩ−ＭＳ分析におけるデコンボリューション後のＭＳスペクトルであり、条件は、Ｃ１８（１５０ｍｍ×３．９ｍｍ、５μｍ、１００Å）、流速０．２ｍｌ／分、溶離液Ｂの濃度勾配は３２分間で１８％から３８％である。精製済のＦ６のＵＶクロマトグラムであり、条件は、Ｃ１８（１５０ｍｍ×３．９ｍｍ、５μｍ、１００Å）、流速０．２ｍｌ／分、溶離液Ｂの濃度勾配は３２分間で１８％から３８％である。精製済のＦ６のＥＳＩ−ＭＳ分析におけるｍ／ｚ＝１０８６（［Ｍ＋５Ｈ］^５＋）でのＳＩＲクロマトグラムであり、条件は、Ｃ１８（１５０ｍｍ×３．９ｍｍ、５μｍ、１００Å）、流速０．２ｍｌ／分、溶離液Ｂの濃度勾配は３２分間で１８％から３８％である。精製済のＦ６のＥＳＩ−ＭＳ分析図であり、条件は、Ｃ１８（１５０ｍｍ×３．９ｍｍ、５μｍ、１００Å）、流速０．２ｍｌ／分、溶離液Ｂの濃度勾配は３２分間で１８％から３８％である。精製済のＦ６のＥＳＩ−ＭＳ分析におけるデコンボリューション後のＭＳスペクトルであり、条件は、Ｃ１８（１５０ｍｍ×３．９ｍｍ、５μｍ、１００Å）、流速０．２ｍｌ／分、溶離液Ｂの濃度勾配は３２分間で１８％から３８％である。精製済のＹ６のＵＶクロマトグラムであり、条件は、Ｃ１８（１５０ｍｍ×３．９ｍｍ、５μｍ、１００Å）、流速０．２ｍｌ／分、溶離液Ｂの濃度勾配は３２分間で１８％から３８％である。精製済のＹ６のＥＳＩ−ＭＳ分析におけるｍ／ｚ＝１１０５．３（［Ｍ＋５Ｈ］^５＋）でのＳＩＲクロマトグラムであり、条件は、Ｃ１８（１５０ｍｍ×３．９ｍｍ、５μｍ、１００Å）、流速０．２ｍｌ／分、溶離液Ｂの濃度勾配は３２分間で１８％から３８％である。精製済のＹ６のＥＳＩ−ＭＳ分析図であり、条件は、Ｃ１８（１５０ｍｍ×３．９ｍｍ、５μｍ、１００Å）、流速０．２ｍｌ／分、溶離液Ｂの濃度勾配は３２分間で１８％から３８％である。精製済のＹ６のＥＳＩ−ＭＳ分析におけるデコンボリューション後のＭＳスペクトルであり、条件は、Ｃ１８（１５０ｍｍ×３．９ｍｍ、５μｍ、１００Å）、流速０．２ｍｌ／分、溶離液Ｂの濃度勾配は３２分間で１８％から３８％である。精製済のＡ６のＵＶクロマトグラムであり、条件は、Ｃ１８（１５０ｍｍ×３．９ｍｍ、５μｍ、１００Å）、流速０．２ｍｌ／分、溶離液Ｂの濃度勾配は３２分間で１８％から３８％である。精製済のＡ６のＥＳＩ−ＭＳ分析におけるｍ／ｚ＝９９４．８（［Ｍ＋５Ｈ］^５＋）でのＳＩＲクロマトグラムであり、条件は、Ｃ１８（１５０ｍｍ×３．９ｍｍ、５μｍ、１００Å）、流速０．２ｍｌ／分、溶離液Ｂの濃度勾配は３２分間で１８％から３８％である。精製済のＡ６のＥＳＩ−ＭＳ分析図であり、条件は、Ｃ１８（１５０ｍｍ×３．９ｍｍ、５μｍ、１００Å）、流速０．２ｍｌ／分、溶離液Ｂの濃度勾配は３２分間で１８％から３８％である。精製済のＡ６のＥＳＩ−ＭＳ分析におけるデコンボリューション後のＭＳスペクトルであり、条件は、Ｃ１８（１５０ｍｍ×３．９ｍｍ、５μｍ、１００Å）、流速０．２ｍｌ／分、溶離液Ｂの濃度勾配は３２分間で１８％から３８％である。精製済のＳ６のＵＶクロマトグラムであり、条件は、Ｃ１８（１５０ｍｍ×３．９ｍｍ、５μｍ、１００Å）、流速０．２ｍｌ／分、溶離液Ｂの濃度勾配は３２分間で１８％から３８％である。精製済のＳ６のＥＳＩ−ＭＳ分析におけるｍ／ｚ＝８４５．１（［Ｍ＋６Ｈ］^６＋）でのＳＩＲクロマトグラムであり、条件は、Ｃ１８（１５０ｍｍ×３．９ｍｍ、５μｍ、１００Å）、流速０．２ｍｌ／分、溶離液Ｂの濃度勾配は３２分間で１８％から３８％である。精製済のＳ６のＥＳＩ−ＭＳ分析図であり、条件は、Ｃ１８（１５０ｍｍ×３．９ｍｍ、５μｍ、１００Å）、流速０．２ｍｌ／分、溶離液Ｂの濃度勾配は３２分間で１８％から３８％である。精製済のＳ６のＥＳＩ−ＭＳ分析におけるデコンボリューション後のＭＳスペクトルであり、条件は、Ｃ１８（１５０ｍｍ×３．９ｍｍ、５μｍ、１００Å）、流速０．２ｍｌ／分、溶離液Ｂの濃度勾配は３２分間で１８％から３８％である。精製済のＣ６のＵＶクロマトグラムであり、条件は、Ｃ１８（１５０ｍｍ×３．９ｍｍ、５μｍ、１００Å）、流速０．２ｍｌ／分、溶離液Ｂの濃度勾配は３２分間で１８％から３８％である。精製済のＣ６のＥＳＩ−ＭＳ分析におけるｍ／ｚ＝７９９．３（［Ｍ＋７Ｈ］^７＋）でのＳＩＲクロマトグラムであり、条件は、Ｃ１８（１５０ｍｍ×３．９ｍｍ、５μｍ、１００Å）、流速０．２ｍｌ／分、溶離液Ｂの濃度勾配は３２分間で１８％から３８％である。精製済のＣ６のＥＳＩ−ＭＳ分析図であり、条件は、Ｃ１８（１５０ｍｍ×３．９ｍｍ、５μｍ、１００Å）、流速０．２ｍｌ／分、溶離液Ｂの濃度勾配は３２分間で１８％から３８％である。精製済のＣ６のＥＳＩ−ＭＳ分析におけるデコンボリューション後のＭＳスペクトルであり、条件は、Ｃ１８（１５０ｍｍ×３．９ｍｍ、５μｍ、１００Å）、流速０．２ｍｌ／分、溶離液Ｂの濃度勾配は３２分間で１８％から３８％である。荷電したペプチド断片のＳＩＲクロマトグラムの保持時間から見た、ｈＢＤ３のＣ末端断片ペプチドの全体の分子疎水性の比較図である。Ｃ末端ペプチドの細胞毒性対濃度の関係を示すグラフである。

本明細書に記載の文献参照は、便宜のために参照文献一覧の形で列挙し、実施例の最後に付け加えてある。このような文献参照の内容全体は、参照により本明細書に組み入れられる。

本発明では、一連のｈＢＤ３の直鎖状アナログを設計・合成し、全体の疎水性、電荷分布／密度、正に荷電した表面領域の疎水性表面領域に対する比率が抗菌活性、細胞毒性および溶血活性に及ぼす影響を調査した。いくらかでもジスルフィド架橋が存在する場合に全体の疎水性が異なるｈＢＤ３アナログの直鎖状の骨格構造が、哺乳動物細胞、とりわけ上皮細胞に対する細胞毒性を減らすための鍵となる構造決定因子であることが見出された。これにより、殺菌活性が向上し哺乳動物細胞に対する細胞毒性が低下したディフェンシン誘導体抗生物質が得られた。したがって、本発明は、単離抗菌ペプチドに関する。

本明細書で使用する場合、「ペプチド」は、任意のアミノ酸分子、ペプチドまたはポリペプチドを指し、包含する。この「ペプチド」は、１または複数のタンパク質または合成ペプチドの断片化により、遺伝子産物、精製産物および／または単離産物、発現産物として入手できる。「単離ペプチド」は、天然の遺伝子発現産物および合成ペプチドを包含する。ペプチド作製：本発明のペプチドは、当技術分野で公知の任意の方法により作製しうる。開示したペプチドを作製する一方法は、タンパク質化学の手法により２つ以上のアミノ酸残基を結合させることである。例えば、Ｆｍｏｃ（９−フルオレニルメチルオキシカルボニル）化学物質またはＢｏｃ（ｔｅｒｔ−ブチルオキシカルボニル）化学物質のいずれかを用いた現在入手可能な実験装置（ＡｐｐｌｉｅｄＢｉｏｓｙｓｔｅｍｓ，Ｉｎｃ．，ＦｏｓｔｅｒＣｉｔｙ，Ｃａｌｉｆ．）を使用して、ペプチドを化学的に合成する。一方のペプチドは、合成し、その合成樹脂から切り離さないこともありうるが、他のペプチドまたはタンパク質の他の断片は、合成した後に樹脂から切り離すこともでき、それにより、末端基が露出する。そして、それは、他の断片上に機能的にブロックされる。ペプチド縮合反応により、これら２つの断片は、それぞれのそのカルボキシル末端およびアミノ末端でそれぞれペプチド結合することで共有結合できる（ＧｒａｎｔＧＡ（１９９２）、ＳｙｎｔｈｅｔｉｃＰｅｐｔｉｄｅｓ：ＡＵｓｅｒＧｕｉｄｅ．Ｗ．Ｈ．ＦｒｅｅｍａｎａｎｄＣｏ．，Ｎ．Ｙ．（１９９２）；ＢｏｄａｎｓｋｙＭａｎｄＴｒｏｓｔＢ．編（１９９３）、ＰｒｉｎｃｉｐｌｅｓｏｆＰｅｐｔｉｄｅＳｙｎｔｈｅｓｉｓ、Ｓｐｒｉｎｇｅｒ−ＶｅｒｌａｇＩｎｃ．，ＮＹ）。他の方法としては、ペプチドを独立にｉｎｖｉｖｏで合成する。一旦単離されると、このような独立したペプチドは、同様のペプチド縮合反応を通じて結合し、ペプチドまたはその断片を形成することができる。

特許請求した配列のペプチドの抗菌性を維持するペプチドの範囲内であれば、特定の修飾を行ってもよいが、ペプチドに何らかの追加的な好ましい特性を与えてもよいと考えられる。ペプチド活性をそれほど失うことなく、タンパク質構造中の他のアミノ酸を特定のアミノ酸で置換しうることは、当技術分野では周知である。そのペプチドの生物機能活性を規定するのはペプチドの相互作用の能力および性質であるため、配列中で特定のアミノ酸配列置換を行ってもよく、そのようにしても同様の特性を有するペプチドを得ることができる。したがって、本発明者らは、生物活性をそれほど失うことなく単離抗菌ペプチドの配列中で多様な変更を行うことができ、おそらく所望の活性を強化しうると考えている。

本明細書で使用しているアミノ酸の略号は、アミノ酸を表す標準的な１文字の符号であり、以下のように表される。ＡまたはＡｌａ：アラニン、Ｂ：アスパラギンまたはアスパラギン酸、ＣまたはＣｙｓ：システイン、ＤまたはＡｓｐ：アスパラギン酸、ＥまたはＧｌｕ：グルタミン酸、ＦまたはＰｈｅ：フェニルアラニン、ＧまたはＧｌｙ：グリシン、ＨまたはＨｉｓ：ヒスチジン、ＩまたはＩｌｅ：イソロイシン、ＫまたはＬｙｓ：リジン、ＬまたはＬｅｕ：ロイシン、ＭまたはＭｅｔ：メチオニン、ＮまたはＡｓｎ、アスパラギン、ＰまたはＰｒｏ：プロリン、ＱまたはＧｌｎ：グルタミン、ＲまたはＡｒｇ：アルギニン、ＳまたはＳｅｒ：セリン、ＴまたはＴｈｒ：トレオニン、ＶまたはＶａｌ：バリン、ＷまたはＴｒｐ：トリプトファン、ＹまたはＴｙｒ：チロシン、Ｚ：グルタミンまたはグルタミン酸。

例えば、抗菌性を有するペプチド構成体の設計においては、分子の１つまたは複数の特性を調節する置換を使用しうる。そのような変異体では、ペプチド内の１つまたは複数の部位において１つのアミノ酸が別のアミノ酸へ交換されていることが通常である。例えば、ペプチド構造体の相互作用的な結合能力を強化するために、その構造体中の特定のアミノ酸を他のアミノ酸に置換してもよい。タンパク質の生物機能活性を規定するのはタンパク質の相互作用の能力および性質であるため、タンパク質配列中、また、優れた特徴を有するペプチドを創出する可能性があるその基礎となるＤＮＡコード配列中で、特定のアミノ酸の置換を行うことができる。したがって、本発明の独自の態様は、ｈＢＤ３のシステイン残基は、他の任意のアミノ酸（上に列挙のとおり）もしくはその誘導体で置き換えられてもよく、または保護されたシステイン残基もしくはその誘導体で置き換えられてもよく、または、このシステイン残基は欠失していてもよい、ということを提供する。アミノ酸誘導体および／または保護基としては、Ｕｓｅｒ’ｓＭａｎｕａｌｆｏｒＰａｔｅｎｔｉｎ３．１の表Ｇ−２に列挙されている任意の誘導体を使用してよい。しかしながら、アミノ酸誘導体および／または保護基の種類は、そうしたリストに限定されるものではない。

本発明に適した保護されたシステイン残基の例としては、Ｃ（Ａｃｍ）、Ｃ（Ｂｕｔ）、Ｃ（ｔ−Ｂｕｔｈｉｏ）、Ｃ（Ｂｚｌ）、Ｃ（４−Ｍｅ−Ｂｚｌ）、Ｃ（４−ＭｅＯ−Ｂｚｌ）、Ｃ（Ｍｍｔ）およびＣ（Ｃａｍ）が挙げられるが、これらに限定されない。したがって、本発明においては、適当な任意の保護されたシステイン残基を使用してよい。

この単離ペプチドは、配列番号２から１２のいずれか１つのアミノ酸配列またはその断片を含んでよく、配列中、Ｘ^１、Ｘ^２、Ｘ^３、Ｘ^４、Ｘ^５およびＸ^６のいずれか１つは、システイン以外の任意のアミノ酸であるか、Ｃ［Ａｂｕ］以外の保護されたシステイン残基もしくはその誘導体であるか、またはアミノ酸は存在していない。この単離ペプチドは、配列番号１３から２５のいずれか１つのアミノ酸配列またはその断片を含んでもよい。とりわけ、この単離ペプチドは、配列番号１３から１８のいずれか１つのアミノ酸配列またはその断片を含む。本発明によるｈＢＤ３の直鎖状アナログの具体例を図１に示す。

また、本発明は、ｈＢＤ３の直鎖状アナログまたはその断片であり、配列番号２から１２のいずれか１つのアミノ酸配列またはその断片を含み、配列中、Ｘ^１、Ｘ^２、Ｘ^３、Ｘ^４、Ｘ^５およびＸ^６のいずれか１つは、システイン以外の任意のアミノ酸であるか、Ｃ［Ａｂｕ］以外の保護されたシステイン残基もしくはその誘導体であるか、またはアミノ酸は存在していない、単離抗菌ペプチドも提供する。この単離ペプチドは、配列番号１３から２５のいずれか１つのアミノ酸配列を含んでもよい。好ましい一態様によれば、ｈＢＤ３中の６つのシステイン残基は、極性の異なる６つの残基、例えばＦ、Ｗ、Ｙ、Ｃ（Ａｃｍ）、ＡおよびＳにより一律に置き換えられて、全体の疎水性の異なる、対応するｈＢＤ３の直鎖状アナログ［Ｆ６、Ｗ６、Ｙ６、Ｃ（Ａｃｍ）６、Ａ６およびＳ６として符号化した］を形成した。したがって、本発明は、配列番号１３から１８のいずれか１つのアミノ酸配列またはその断片を含む、少なくとも１種の直鎖状単離ペプチドを提供する。しかしながら、配列番号２６から３６のアミノ酸配列を含む断片およびペプチドは、本発明の保護の範囲から除外される。

本発明の任意の態様による単離ペプチドは、野生型ｈＢＤ３と比較して、任意の細胞種の少なくとも１種の細胞に対する細胞毒性が低下していることも、さらに提供される。

本発明の別の態様によれば、本発明の任意の態様による少なくとも１種のペプチドまたはその断片をコードする単離ポリヌクレオチドが提供される。

本明細書で使用する場合、ポリヌクレオチドとは、ゲノム起源のまたは合成起源のｃＤＮＡ、ＤＮＡ、ｍＲＮＡまたはＲＮＡを指し、一本鎖であっても二本鎖であってもよい。一本鎖のＤＮＡまたはＲＮＡは、センス鎖としても知られるコード鎖であってもよく、またはアンチセンス鎖とも呼ばれる非コード鎖であってもよい。また、ポリヌクレオチドは、核酸分子も包含する。単離ポリヌクレオチドとは、その本来の環境から取り出されている核酸分子、ＤＮＡまたはＲＮＡを指す。

本発明の抗菌ペプチドは、原核生物または真核生物の発現ベクターにより発現させうる。「発現ベクター」という用語は、転写されることが可能な遺伝子産物の少なくとも一部をコードする核酸配列を含有するベクターを指す。ある場合には、ＲＮＡ分子は、後にタンパク質、ポリペプチドまたはペプチドに翻訳される。別の場合には、例えば、アンチセンス分子またはリボザイムの産生においては、このような配列は翻訳されない。発現ベクターは、さまざまな「制御配列」を含有できるが、制御配列とは、特定の宿主生物において、操作可能な状態で連結したコード配列の転写、また場合によりその翻訳に必要な核酸配列を指す。

さらに、本発明は、本明細書に記載のペプチドのいずれか１種または複数種をコードするポリヌクレオチドまたは核酸を含むベクターも提供する。特定の実施形態では、本発明は、本発明のペプチドの少なくとも１種をコードする核酸を含むベクターを提供する。このベクターは、ウイルスベクター、プラスミドベクター、コスミドベクター、アデノウイルスベクター、ファージベクター、レトロウイルスベクター、アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）ベクター、または、本発明のペプチドをコードする核酸を包含することが可能な、当業者には公知であろう任意の他のベクターとすることができる。このベクターは、細胞ゲノム中に組み込むことを意図されていて、組み込むことが可能な発現ベクターとすることができる。有用なベクターおよびその構造は、ＳａｍｂｒｏｏｋａｎｄＲｕｓｓｅｌ、（２００１）、ＭｏｌｅｃｕｌａｒＣｌｏｎｉｎｇ：ＡＬａｂｏｒａｔｏｒｙＭａｎｕａｌ、ＣｏｌｄＳｐｒｉｎｇＨａｒｂｏｒＬａｂｏｒａｔｏｒｙＰｒｅｓｓ、ＵＳに開示されている。

また、本発明は、本発明のポリヌクレオチド、ポリペプチド、ペプチドおよび／またはベクターを含む宿主細胞も提供する。このような宿主細胞は、真核細胞であっても原核細胞であってもよい。真核細胞の場合は、レトロウイルス系またはアデノウイルス系ベクターを使用して、本発明のポリヌクレオチドを宿主細胞中に入れることができる。核酸またはポリペプチドを宿主細胞中に挿入するための当業者に公知の方法は、本発明内に包含される。ｎａｋｅｄＤＮＡトランスフェクション法、リポフェクションによる導入法、形質転換法、細胞中への核酸のマイクロインジェクション法またはリン酸カルシウム沈殿トランスフェクション法は、そのような方法の非限定的な例である。宿主細胞は、ＡｍｅｒｉｃａｎＴｙｐｅＣｕｌｔｕｒｅＣｏｌｌｅｃｔｉｏｎ（ＡＴＣＣ）などの市販元から入手できる。

宿主細胞は、液体培地中または組織培養プレート上で生育させることができる。生育条件は使用される特定の宿主細胞次第であり、そうした条件は当業者には公知であろう。宿主細胞のトランスフェクションおよび生育については、ＳａｍｂｒｏｏｋａｎｄＲｕｓｓｅｌの同文献に記載されている。本発明は、特許請求した発明のポリペプチドをコードする核酸を発現している組換え細胞を提供する。また、本発明は、本発明のポリペプチドを産生する組換え細胞も提供する。

ベクターの複製および／または発現のための真核生物の宿主細胞の例としては、ＨｅＬａ、ＮＩＨ３Ｔ３、Ｊｕｒｋａｔ、２９３、Ｃｏｓ、ＣＨＯ、Ｓａｏｓ、およびＰＣ１２が挙げられる。多様な細胞種および生物から多くの宿主細胞が利用可能であり、当業者には公知であろうと思われる。同様に、ウイルスベクターは真核生物または原核生物の宿主細胞のいずれか、とりわけベクターの複製または発現に対して許容状態にある宿主細胞と併せて使用しうる。

原核細胞および真核細胞のいずれにおいても複製および／または発現させることが可能な制御配列を採用できるベクターもある。当業者であれば、上述した全ての宿主細胞をインキュベートして宿主細胞を維持し、ベクターの複製を許容する条件をさらに詳しく理解しているであろう。また、ベクターの大規模産生、ならびに、ベクターによりコードされている核酸およびその同系のポリペプチド、タンパク質、またはペプチドの産生が可能になるような手法および条件も理解および承知されている。

本発明の別の態様は、本明細書に記載の少なくとも１種の抗菌ペプチドまたはその断片を含む医薬組成物である。また、本発明は、本発明の任意の態様による少なくとも１種の抗菌ペプチドまたはその断片および少なくとも１種の非ペプチド性抗菌剤を含む抗菌組成物も提供する。

この組成物は、薬剤学的または薬理学的に許容できる担体をさらに含みうる。「薬剤学的または薬理学的に許容できる」という語句は、動物またはヒトに適切に投与した際に、拒絶反応、アレルギー反応または他の有害反応を生じさせない分子的実体および組成物を指す。本発明の組成物は、薬剤学的に許容できる担体または水性媒体中に溶解または分散した有効量の抗菌ペプチドを含む水性組成物としうる。

本明細書で使用する場合、「薬剤学的に許容できる担体」とは、ありとあらゆる溶媒、分散媒、コーティング、抗菌剤および抗真菌剤、等張剤ならびに吸収遅延剤などを包含する。医薬活性物質のためにそのような媒体および作用剤を使用することは、当技術分野では周知である。何らかの従来媒体または作用剤が活性成分と適合しない場合を除き、治療用組成物中でのその使用を考慮している。補助的な活性成分をこの組成物中に組み入れることもできる。

この抗菌ペプチドを対象に供給する場合には、ペプチドの性質が、いくつかの代替投与経路を容易にする。このペプチドの耐久性により、体内投与だけでなく局所製剤としての適用も容易である。ペプチドを体内に施す場合には、さまざまな送達手段が可能である。例えば、感染症の治療または防止のために吸入により送達するのに適した組成物中で、ペプチドを希釈する。ペプチドの核酸配列は、遺伝子療法に関しては、適切なベクターまたはＤＮＡ送達ビヒクルにより細胞へ送達しうることも、さらに考慮している。

したがって、本発明の医薬組成物または抗菌組成物は、局所、経口または非経口投与用に処方しうる。例えば、この組成物は、注射による投与用または吸入による投与用に処方しうる。この活性化合物は、一般に非経口投与用に、例えば、静脈内、筋肉内、皮下、病巣内、局所および／またはさらには腹腔内経路を通じた注射用に処方される。活性成分または活性原料として抗菌ペプチドを含有する水性組成物の調製については、本開示に照らせば当業者には理解されよう。通常、このような組成物は注射剤として、液体溶液または懸濁液のいずれかとして調製してもよく、注射の前に液体を添加して溶液または懸濁液を調製するために使用するのに適した固形形態も調製することができ、また、この調製剤は乳化させることもできる。眼および口などの粘膜表面への局所施用物は、液体溶液または懸濁液として調製することができる。

注射剤用途に適した本発明の医薬組成物または抗菌組成物の例としては、無菌の水溶液または懸濁液、ゴマ油、ピーナッツ油または水性プロピレングリコールを包含する製剤、および無菌の注射用溶液または注射用懸濁液を即時調製するための無菌の粉末が挙げられる。全ての場合において、この形態は無菌でなくてはならず、容易に注射可能な程度に流動性がなくてはならない。また、この形態は製造条件および保管条件下で安定でなくてはならず、細菌および真菌などの微生物に汚染されないように保存することが可能でなくてはならない。この医薬組成物は、塩の形態としてもよい。

薬剤学的に許容できる担体は、例えば、水、エタノール、ポリオール（例えば、グリセロール、プロピレングリコールおよび液体ポリエチレングリコールなど）、適当なその混合物および植物性油を含有する溶媒または分散媒とすることもできる。

直接注射用に、より濃縮された、または高濃度の溶液の調製も提供されるが、この場合、溶媒としてＤＭＳＯを使用することで極めて迅速に浸透し、この医薬組成物および抗菌組成物の高濃度の活性化合物を小さな患部に送達する結果がもたらされうる。

静脈内または筋肉内注射など非経口投与の形態に加え、この医薬組成物またはこの抗菌組成物を投与する他の許容できる形態としては、経口投与用の錠剤または他の固形剤、リポソーム製剤、徐放カプセル、および、クリームなど現在使用されている他の任意の形態が挙げられるが、これらに限定されない。

本発明では、鼻用の溶液またはスプレー、エアロゾルまたは吸入剤を使用してもよい。鼻用の溶液は通常、点鼻薬またはスプレーとして鼻腔に投与するように設計された水溶液である。加えて、必要に応じ、眼用の調製剤中に使用されるものと同様の抗菌保存剤および適切な薬物安定化剤を製剤中に包含させてよい。

他の投与様式に適したその他の製剤としては、膣用の坐薬およびペッサリーが挙げられる。直腸用のペッサリーまたは坐薬を使用してもよい。坐薬は、多様な重量および形状の固形の剤形で、一般に直腸、膣または尿道中への挿入用として投薬される。

経口製剤は、例えば、医薬用のマンニトール、乳糖、デンプン、ステアリン酸マグネシウム、サッカリンナトリウム、セルロース、炭酸マグネシウムなど、普通に採用される賦形剤を包含する。このような組成物は溶液、懸濁液、錠剤、丸剤、カプセル、徐放製剤または粉末の形態をとる。治療のための経口投与用としては、この医薬組成物または抗菌組成物の活性化合物を賦形剤とともに組み入れ、口から摂取可能な錠剤、口腔錠、トローチ、カプセル、エリキシル剤、懸濁液、シロップ、オブラート剤などの形態で使用しうる。

とりわけ、本発明の任意の態様による医薬組成物または抗菌組成物は、局所投与用としてよく、１または複数の皮膚および／もしくは粘膜の治療用に適したものとしてよい。この医薬組成物または抗菌組成物は、点眼剤（複数も可）の組成物または溶液の形態としてもよい。

本発明の組成物は、投薬製剤と適合する様式で、また、治療上有効であるような量で投与しうる。この製剤は、注射剤溶液などさまざまな剤形で容易に投与しうるが、例えば薬剤放出カプセルなど、他の適当な任意の形態を使用してもよい。

精製した単離抗菌ペプチドは、さらなる修飾をせずに使用してもよいし、薬剤学的に許容できる担体中に希釈させてもよい。このペプチドは安定なので、本発明の任意の態様によるペプチドは、ヒトまたは動物に、食品調製物、医薬調製物、薬用製品および医薬製品、化粧品、衛生製品、洗浄製品および洗浄剤中に包含させて投与する以外にも、表面上での微生物の生育を阻害することが求められ、このペプチドをその上にスプレーするかまたはそれに付着させるかできるような任意の材料中に包含させて投与しうる。

本発明は、それぞれ上述の、少なくとも１種の医薬組成物、少なくとも１種の抗菌組成物、および／または少なくとも１種のペプチドまたはその断片を含むコンタクトレンズ用溶液も提供する。

加えて、本発明は、それぞれ上述の、少なくとも１種のポリマーおよび少なくとも１種のペプチド、少なくとも１種の医薬組成物、および／または少なくとも１種の抗菌組成物を含むコンタクトレンズを提供する。

本発明は、治療上または予防上の利益のための対象へのペプチドの投与を包含する一方、このペプチドが他の用途を有するであろうことも想定されている。しかしながら、この単離ペプチドは微生物の生育を防止または抑制したい環境中へ施用または導入するための消毒調製剤または抗菌調製剤中に包含させてもよい。

したがって、本発明は、微生物生育の防止および／または抑制のために、作業台面などの表面または外科用器具、コンタクトレンズ、コンタクトレンズと一緒に使用されるコンタクトレンズ用の溶液もしくは機器に施用するための混合物を提供する。

とりわけ、本発明は、それぞれ上述の、少なくとも１種の医薬組成物、少なくとも１種の抗菌組成物、または少なくとも１種のペプチドもしくはその断片を含む機器コーティングを提供する。この機器コーティングは、医療機器コーティングとすることができる。

また、本発明は、本発明の任意の態様による少なくとも１種のコーティングで被覆された機器も提供する。この機器は、医療機器とすることができる。医療機器に関しては、純粋な形態での本発明のペプチド、または他の抗菌ペプチドもしくは抗菌剤と組み合わせた本発明のペプチドは、表面上での微生物の生育を阻害することが求められる医療機器の任意の表面にスプレーし、表面を被覆し、または表面に付着させることができると思われる。そのような医療機器の例としては、気管内チューブ、カテーテル、血管カテーテル、導尿カテーテル、腎瘻チューブ、胆汁ステント、腹膜カテーテル、硬膜外カテーテル、中枢神経系カテーテル、整形外科用機器、人工弁、針、シース、ステントおよび医療用インプラントが挙げられるが、これらに限定されない。

また、本発明は、少なくとも１種の適当な容器に入れられた、それぞれ上述の、少なくとも１種の抗菌ペプチド、少なくとも１種の医薬組成物、および／または少なくとも１種の抗菌組成物を含む、キットを提供する。このキットは、少なくとも１種の追加の抗菌剤をさらに含みうる。

本発明の抗菌ペプチドは、単独で使用しうる。しかしながら、この抗菌ペプチドは、別の抗菌剤および／または抗生物質と組み合わせて、補助療法において使用することもできる。細菌の殺菌または阻害については、細菌の生育および／または増殖を阻害するのに有効な量の抗菌ペプチドと組み合わせた有効量の抗生物質を細菌に接触させることが考えられよう。したがって、本発明は、それぞれ上述の、少なくとも１種の抗菌ペプチド、少なくとも１種の医薬組成物、および／または少なくとも１種の抗菌組成物を微生物に接触させることを含む、少なくとも１種の微生物の生育を阻害および／または抑制する方法を提供する。

微生物、例えば細菌またはその集団には、ｉｎｖｉｔｒｏまたはｉｎｖｉｖｏのいずれかで接触しうる。ｉｎｖｉｖｏでの接触は、微生物性または細菌性の感染症に罹患しているかまたは罹患している疑いのある対象に、治療上有効な量の薬理学的に許容できる抗菌ペプチド製剤を、単独で、または抗生物質剤または他の抗菌ペプチドの薬理学的に許容できる治療量の製剤と組み合わせて投与することにより達成しうる。したがって本発明は、全身循環中に作用剤の組合せを導入することにより、または、例えば、外傷もしくは熱傷などの特定の部位、または眼、耳もしくは他の感染部位に局所的にその組合せを施用することにより、全身性および限局性の微生物性および細菌性の感染症の両方を治療するために採用しうる。

また、本発明は、それぞれ上述の、少なくとも１種の抗菌ペプチド、少なくとも１種の医薬組成物、および／または少なくとも１種の抗菌組成物を宿主に投与または施用することを含む、宿主体内での少なくとも１種の微生物の生育を阻害および／または抑制する方法も提供する。

また、それぞれ上述の、少なくとも１種の抗菌ペプチド、少なくとも１種の医薬組成物、および／または少なくとも１種の抗菌組成物を対象に投与することを含む、少なくとも１種の微生物感染症を治療する方法も提供される。本発明は、それぞれ上述の、少なくとも１種の抗菌ペプチド、少なくとも１種の医薬組成物、および／または少なくとも１種の抗菌組成物を用いて微生物を処理することを含む、少なくとも１種の多剤耐性微生物を処理する方法を、さらに提供する。

「微生物」という用語は便宜上使用しているもので、本発明が微生物の集団、すなわち「細菌」対策に使用するのに適していることは容易に理解されよう。細菌感染症または微生物感染症に関しては、当業者であれば、可能性のある多種多様な病原菌を認識しているだろう。微生物の例としては、類鼻疸菌、黄色ブドウ球菌、大腸菌、緑膿菌およびセレウス菌ならびにウイルスおよび真菌の任意の１種を挙げられるが、これらに限定されない。

また、本発明は、少なくとも１種のｈＢＤ３アナログまたはその断片を少なくとも１種の細胞に投与して、該アナログまたはその断片は野生型ｈＢＤ３と比較して細胞に対する細胞毒性が低下しているかどうかを確認することを含む、薬剤スクリーニング法も提供する。

本発明の別の態様は、任意のシステイン残基を欠失させることと、任意のシステイン残基を他の任意のアミノ酸もしくはその誘導体または保護されたシステイン残基もしくはその誘導体で置き換えることと、細胞に投与することと、細胞毒性の低下を確認することとを含む、ペプチドアナログまたはその断片を設計する方法である。このペプチドは、少なくとも１種のｈＢＤ３アナログとすることができる。設計原理は以下のとおりとすることができる（が、限定はされない）：ヒト細胞に対する細胞毒性の低減は、全体の疎水性および電荷密度についての分子モデリングと理論計算とを用いてディフェンシンペプチドの直鎖状アナログを合理的に設計することにより制御できる。全体の疎水性は、水中で折りたたまれる結果としての、ペプチドの基本的な生理化学的特性である。全体の疎水性（自由エネルギー変化、ΔＧ、ｋｃａｌ／ｍｏｌ）は、ＷｉｌｍｌｅｙａｎｄＷｈｉｔｅの疎水性尺度に基づいて計算した。疎水性が大きいことは、ΔＧの正の値が大きいことによって表される。全体の疎水性および電荷密度は、ペプチドの３Ｄ構造と関連している。

ここまで本発明を全般的に記載してきたが、同様のことは、例証の目的で提供するもので本発明の限定を意図しない以下の実施例を参照することで、より容易に理解されよう。

材料および方法
固相ペプチド合成（ＳＰＰＳ）
フルオレニルメトキシカルボニル（Ｆｍｏｃ）保護したＬアミノ酸および樹脂をＡｄｖａｎｃｅｄＣｈｅｍＴｅｃｈ（現在のａｄｖａｎｃｅｄａｕｔｏｍａｔｅｄｐｅｐｔｉｄｅｐｒｏｔｅｉｎＴＥＣＨＮＯＬＯＧＩＥＳ，ａａｐｐＴＥＣ）（ＫＹ，Ｕ．Ｓ．Ａ．）から購入し、以下の側鎖保護基と共に使用した：Ａｒｇ（ｐｂｆ）^１またはＡｒｇ（ｐｍｃ）、Ｌｙｓ（Ｂｏｃ）、Ｔｙｒ（Ｂｕｔ）、Ｔｒｐ（Ｂｏｃ）、Ｔｈｒ（Ｂｕｔ）、Ｓｅｒ（Ｂｕｔ）、Ｇｌｎ（Ｔｒｔ）、Ｇｌｕ（ＯＢｕｔ）、Ａｓｎ（Ｔｒｔ）、Ｃｙｓ（Ａｃｍ）およびＦｍｏｃ−Ｌｙｓ（Ｂｏｃ）−Ｗａｎｇ樹脂（置換量０．７２ｍｍｏｌ／ｇ）。ｈＢＤ３の直鎖状アナログ６種の合成をＦｍｏｃ化学によりＡｐｅｘ３９６上で実施した。ＨＢＴＵ−ＨＯＢＴ（ＨＢＴＵはＮ−［１Ｈ−ベンゾトリアゾール−１−イル）−（ジメチルアミノ）メチレン］−Ｎ−メチルメタンアミニウムヘキサフルオロフォスフェート−Ｎ−オキシドであり、ＨＯＢＴはＮ−ヒドロキシベンゾトリアゾールである）を用い、ＤＭＦ（Ｎ，Ｎ−ジメチルフォルムアミド）中で、０．０４ｍｍｏｌの合成スケールで、アシル化（カップリング反応）を実施した。Ｆｍｏｃ脱保護は、ＤＭＦ中で２０％ピペリジンを用いて実施した。その結果得られたペプチジル樹脂を、新たに調製したトリフルオロ酢酸（ＴＦＡ）／トリイソプロピルシラン（ＴＩＳ）／フェノール／チオニゾール（Ｔｈｉｏｎｉｓｏｌｅ）／水（９０／１／２．５／５／１．５、容量パーセントの比率）の混合物を用いて２〜３時間、室温で処理した。未精製のペプチドを氷冷ジエチルエーテル中に濾過することにより沈殿させ、遠心単離により単離し、氷冷エーテルで３回洗浄してから、未精製の固体産物中のエーテルおよび他の残存／残留溶媒を換気フード中で自動蒸発させることにより乾燥させるか、または室温で真空下乾燥させた。さらなる精製のために、未精製の産物をＨ_２Ｏ中の５％ＣＡＮ、０．１％ＴＦＡの混合溶媒中に溶解させてから、セミ分取カラムに注入した（Ｗａｔｅｒｓ、ＤｅｌｔａＰＡＫＣ１８、３００ｍｍ×７．８ｍｍ、１５μｍ、１００Å、流速３ｍｌ／分、溶離液ＡはＤＩ水中の０．０１％ＴＦＡ、溶離液ＢはＣＡＮ中の０．０１％ＴＦＡ、溶離液Ｂの濃度勾配は２０分間で２０％から３５％、２１０ｎｍでＵＶ検出（自動試料採取装置および９９６フォトダイオードアレイ検出器（ＰＤＡ）搭載のＷａｔｅｒｓ２６９５セパレーションモジュール））。分析用のＨＰＬＣ−ＭＳ連動システム（ＭｉｃｒｏｍａｓｓＰｌａｔｆｏｒｍＬＣＺ、ＷａｔｅｒｓＡｓｓｏｃｉａｔｅｓ、１５０ｍｍ×３．９ｍｍ、５μｍ、１００ÅのＤｅｌｔａＰＡＫＣ１８使用、流速０．２ｍｌ／分、溶離液Ｂの濃度勾配は３２分間で１８％から３８％）により、精製したペプチドの特性を示した。質量分析法の使用による直鎖状アナログ６種の分子量の特性解析を、図８〜１３に示す。

分子疎水性
ペプチドの分子疎水性は、ＨＰＬＣ−ＭＳにより、例えば、同様のペプチド濃度（５００または１００μｇ／ｍｌ）、注入量（５μｌ）、および、３２分間で１８％から３８％という溶離液Ａの同様の濃度勾配において流速０．２ｍｌ／分であり、産物ピークの保持時間（Ｒｔ）について相対的に比較されるなどの、同様の実験条件において測定した。

ＣＤ分光法
水溶液（ｐＨ５．０〜５．５）中、ならびに、例えば、ＤＩ水中の１０ｍＭＳＤＳおよび２０ｍＭＳＤＳ、２０、５０、７０％（容量）ＴＦＥなどの他の異なる媒体中で、ＪａｓｃｏＪ−８１０分光偏光計により円二色性分光法を行った。６種のアナログの濃度は１２５μｇ／ｍｌであり、野生型ｈＢＤ３は１００μｇ／ｍｌであった。２７℃、１９６〜２６０ｎｍの範囲の波長でＣＤ測定を実施した。各試料および溶媒を３回ずつ走査し、溶媒のＣＤを試料溶液のＣＤから差し引いた。この結果を図２、３および４に示す。

ディフェンシンアナログについての抗菌アッセイ
材料
アッセイを実施した細菌は、大腸菌ＡＴＣＣ２５９２２、黄色ブドウ球菌ＡＴＣＣ２５９２３、緑膿菌ＡＴＣＣ２７８５３、セレウス菌ＮＣＴＣ２５９９を包含していた。アッセイには、９６ウェル平底の滅菌済組織培養プレート（９２０９６、ＴＰＰ）を使用した。水滴の凝結を防ぐために、２０％エタノール中の０．０５％ＴｒｉｔｏｎＸ−１００でマイクロプレートカバーの内側表面を処理した。Ｍａｇｅｌｌａｎバージョン５．０３のソフトウェアおよび６２０ｎｍフィルターを用いたＴｅｃａｎＧｅｎｉｏｓＰｌｕｓマイクロプレートリーダーで、９６ウェルマイクロプレート中での生育速度を（濁度として）モニターした。６００ｎｍ波長を用いたＰｈａｒｍａｃｉａＢｉｏｔｅｃｈＵｌｔｒｏｓｐｅｃ２０００ＵＶ／可視分光光度計により、種培養物をモニターした。大腸菌、セレウス菌、黄色ブドウ球菌および緑膿菌に対する該アナログおよび野生型ｈＢＤ３の抗菌活性を、段階的に希釈されたペプチドが存在する液体培養液中での細菌生育数を測定することにより確認した。ＬＤ_５０は、生細胞の５０％が死に至るペプチド濃度である。この結果は図７（Ａ、Ｂ、ＣおよびＤ）で報告する。

較正
細菌は、Ｍｕｅｌｌｅｒ−ＨｉｎｔｏｎＢｒｏｔｈ（ＭＨＢ）中での一晩の平板培養により対数期中期まで生育させた。細胞懸濁液は、１０ｍＭリン酸カリウム緩衝溶液／ＭＨＢの混合物（等量）（ＰＭＨ）中でＯＤ０．１に希釈した（６００ｎｍ、ＰｈａｒｍａｃｉａＢｉｏｔｅｃｈＵｌｔｒｏｐｅｃ２０００ＵＶ／可視分光光度計）。この細胞懸濁液の濃度は１０^７ＣＦＵ／ｍｌであった。確認のために、コロニー計数を行った。１０^７から１０^１ＣＦＵ／ｍｌの範囲で、この懸濁液の１０倍希釈系列をＰＭＨ中で作製した（黄色ブドウ球菌ＡＴＣＣ２５９２３およびセレウス菌ＮＣＴＣ２５９９については６部作製（ｓｅｘｔｕｐｌｉｃａｔｅ）、大腸菌ＡＴＣＣ２５９２２については４部作製（ｑｕａｄｒｕｐｌｉｃａｔｅ）、および緑膿菌ＡＴＣＣ２７８５３については３部作製（ｔｒｉｐｌｉｃａｔｅ））。ウェル当たりの最終容量は２００μｌであった。陰性対照ウェルについては、未植菌のＰＭＨ２００μｌを加えた。

細胞毒性アッセイ
ＣｅｌｌＴｉｔｅｒブルーを用いて細胞生存数を測定することにより、初代培養した正常なヒト結膜上皮細胞上でのこれらのアナログの細胞毒性を分析した。全ての分析において、対照として野生型ｈＢＤ３を使用した。図５。

溶血アッセイ
試験したペプチドの膜溶解活性の測定値として、新鮮なウサギ赤血球からのヘモグロビンの遊離率を使用した。図６。

（実施例１）
結果
４５残基を有するｈＢＤ３の直鎖状アナログ
ｈＢＤ３アナログの合成。表１に詳細に記載したとおり（配列、総残基、疎水性、正味荷電、全体の疎水性）、Ｆｍｏｃ化学を用いて、４５残基を有するｈＢＤ３の直鎖状アナログ６種の固相合成を実施した。未精製産物および精製産物の収量は、合成スケールに基づいて報告してあり、表１の補足情報を参照のこと。

分子疎水性
天然のｈＢＤ３と比較すると、完全長かつ正味の正電荷１１を有するこの系列のｈＢＤ３の直鎖状アナログは、ｈＢＤ３中の架橋している６つのシステイン残基を、疎水性の異なる他の６つの残基、例えばＡ、Ｓ、Ｃ（Ａｃｍ）、Ｆ、ＹおよびＷで一律に置き換えることのみにより設計・合成されているため、構造的には同質である。これらの直鎖状アナログは、全体の疎水性、二次構造および直線性または３箇所のジスルフィド架橋により課せられた拘束が抗菌活性、細胞毒性活性および溶血活性に及ぼす効果を試験するための明確なモデルとなる。われわれは、５００μｇ／ｍｌおよび１００μｇ／ｍｌで、ＨＰＬＣ−ＭＳにより相対的な分子疎水性を保持時間（ｔＲ）について測定してから（表２）、ＷｉｌｍｌｅｙａｎｄＷｈｉｔｅの疎水性尺度およびＨｏｐｐ−Ｗｏｏｄｓ尺度にそれぞれ基づいて、全体の疎水性を計算した。２つの異なる尺度に基づいて計算されている全体の疎水性の変化傾向は概ねよく一致しており、ＨＰＬＣの結果はこの計算値に非常によく整合している。ペプチドの相対的な分子疎水性についての全体の序列は、Ｗ６>Ｆ６>Ｙ６>天然のｈＢＤ３>Ａ６>Ｓ６>Ｃ（Ａｃｍ）６のとおりである。しかしながら、置き換えた残基の疎水性についての序列は、Ｐｈｅ>Ｔｙｒ＝Ｔｒｐ>Ｃｙｓ>Ａｌａ>Ｓｅｒのとおりであり（Ｃ（Ａｃｍ）についてのデータは入手できず）［Ｂｌａｃｋ，Ｓ．Ｄ．ａｎｄＭｏｕｌｄ，Ｄ．Ｒ．（１９９１）］、ペプチドが水溶液中で折りたたまれていることから、ペプチドの全体の疎水性傾向は、置き換えた残基のそれに常に整合するわけではない。以下の項では、ペプチドの全体の疎水性が生物活性に及ぼす効果について考察する。

疎水性が高まるのに伴う抗菌活性および溶血活性の上昇は、疎水性が高い基は細胞膜の内側の中心部とより強力に相互作用して選択性の喪失をもたらすであろうと予測している文献報告と合致している。［Ｉｌｋｅｒら、ＪＡＣＳ、２００４、１２６、１５８７０〜７５、本公報に引用してある参照文献１、４も参照のこと］。多くの事例で、疎水性相互作用は溶血活性を制御すると報告されているが、一方では、抗菌活性にとっては静電相互作用の方が重要であることが示唆されている（Ｈａｒｄｅｒら、２００１）。こうした結果は、例えばＷ、ＦおよびＳといった妥当な疎水性残基の存在と、親水性の表面領域に対する疎水性の表面領域のバランスとが、抗菌活性および溶血活性を示す鍵となる構造決定因子であることを示している。

ＣＤ分光法およびペプチド二次構造
Ｘ線およびＮＭＲによるこれまでの研究［ｈＢＤ２、Ｓａｗａｉら、Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ、２００１、４０、３８１０〜１６；ｈＢＤ３、Ｓｃｈｉｂｌｉら、ＪＢＣ２００２、２７７（１０）、８２７９〜８９などいくつかの刊行物］により、ヒトβディフェンシン類（ｈＢＤ１〜３）の三次構造は、３箇所のジスルフィド結合により強固に保持された３本鎖の逆平行βシートに先行する短いαヘリックス部分を有する点で類似していることが示されている。しかしながら、３箇所のジスルフィド結合により課せられた拘束がないと、ｈＢＤ３の直鎖状アナログは水溶液中で柔軟かつ無秩序になり、環境に左右された立体配座をとる傾向がある。したがって、ＣＤ分光法によってこの直鎖状ペプチドの溶液立体配座を体系的に決定することは興味深かった。ｈＢＤ３誘導体の構造的特徴の分析は、水溶液中で、また、有機モディファイヤーであるトリフルオロエタノール（ＴＦＥ）、または膜を模したＳＤＳミセルの存在下で、ＣＤ分光法により実施した。（図２〜４）。ＴＦＥは、水溶液中の構造化されていない／無秩序な別のペプチドから安定なタンパク質様立体配座の採択を誘導できるため、タンパク質構造研究において広く使用されている。水溶液中での直鎖状アナログ６種および野生型ｈＢＤ３のＣＤスペクトルは非常に類似しており、天然のｈＢＤ３のＣＤスペクトルと非常によく一致する。水中では、全てのアナログおよび野生型ｈＢＤ３は、主に不規則構造に従って１９６〜２００ｎｍでの強い極小値を有し、水溶液中で大部分がランダムコイル構造を示す。この結果は、３箇所のジスルフィド結合の存在またはその不在、およびアミノ酸残基を置き換える残基の種類は、ｈＢＤ３誘導体の二次構造に顕著な影響を何ら及ぼさないことを示しており、したがって、この二次構造は、複数のジスルフィド架橋または６つのシステイン残基を置き換える残基の存在に、独立に左右されているように思われる。水中での異なる量、例えば２０、５０、７０％の有機変性剤ＴＦＥの存在下では（本明細書では５０％ＴＦＥ中のＣＤスペクトルのみを報告した）、全てのアナログおよび天然のｈＢＤ３が著しい構造遷移を起こし、それらのＣＤスペクトルはレッドシフトし、波長２０５〜２２２ｎｍに明確に観察できる２つの極小値を、また、１９０〜１９３ｎｍ前後に強い正のピークを示した。このようなスペクトルはαヘリックス構造に典型的であることから、ＴＦＥの存在がこれらのペプチド溶液中におけるヘリックス立体配座の比率を高めると結論づけることが可能である。６種のアナログおよび野生型ｈＢＤ３のαヘリックス含有量は、特にＷ６、Ｓ６、Ｆ６、野生型ｈＢＤ３およびＹ６についてＴＨＦの存在下では大きく増加したが、ＴＨＦは、この型の立体配座を安定化することで知られ、ペプチド間でのαヘリックス含有量の差は、Ｗ６、Ｆ６、Ｙ６中の残基の芳香環側鎖に起こりうるスタッキング、またはＡ６中の残基の側鎖間に起こりうる水素結合、または野生型ｈＢＤ３中の／野生型ｈＢＤ３用のαヘリックスに明確な立体配座をとらせようとする３箇所のジスルフィド結合の安定化力から生じると考えられる。いくつかのケース（Ｗ６、Ｓ６、Ｃ（Ａｃｍ）６）では、ＴＦＥの濃度が高いほど、αヘリックス含有量が高くなる。このＣＤ遷移は、膜の異方性脂質環境にさらによく似た１０ｍＭＳＤＳおよび２０ｍＭＳＤＳのミセル中でも起こり、６種のアナログおよび野生型ｈＢＤ３、特にＷ６、Ｓ６、野生型ｈＢＤ３、Ｆ６およびＹ６についてのαヘリックス含有量も、ＴＦＥの存在下でそうであるように、構造決定因子の同様の効果によりある程度増加した。ほとんどの場合、特にＷ６およびＹ６については、αヘリックス含有量は２０ｍＭＳＤＳよりむしろ１０ｍＭＳＤＳで高い。さらに、分子が強固であれば、その分子は、任意の主要な溶媒に誘導される立体配座の変化に対し抵抗性を有することが期待されることになろう。しかしながら、ＴＦＥおよびＳＤＳの存在下では、ＣＤスペクトルは劇的に変化するようであり、このことは、ペプチドが溶媒との間で強く相互作用することを示唆している。

６種の直鎖状アナログの分子量は、当業者に公知の標準的な手法に従った質量分析法を使用することにより特徴づけた。この結果を図８〜１３で報告する。

らせん性の程度と抗菌活性との間には全体的に相関は観察されておらず、高いらせん性は抗菌活性とは相関しないが高い溶血性と相関することが多いとの報告があった［Ｏｒｅｎら、Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ、１９９７、３６、１８２６〜３５］。らせん性と抗菌活性、細胞毒性活性および溶血活性との間の相関については、以下の項で考察する。

抗菌活性
野生型ｈＢＤ３およびその直鎖状アナログのＬＤ５０、ＬＤ９０、ＬＤ９９およびＬＤ９９．９を、２種のグラム陰性菌（大腸菌および緑膿菌）および２種のグラム陽性菌（セレウス菌、黄色ブドウ球菌）に対して確認した（表３）。図７（Ａ、Ｂ、ＣおよびＤ）も参照のこと。

完全長のｈＢＤ３の直鎖状アナログについてわれわれが得た結果は、６つのシステイン残基を、それぞれアラニン（Ａ）、セリン（Ｓ）、Ａｃｍで保護されたシステイン［Ｃ（Ａｃｍ）］、トリプトファン（Ｗ）、チロシン（Ｙ）およびフェニルアラニン（Ｆ）で置き換えると、抗菌活性に何らかの効果が及ぶことを示している。Ｗ６、Ｓ６およびＦ６はｈＢＤ３と比較して最も強力なアナログであり、一方、Ｙ６、Ｃ（Ａｃｍ）６およびＡ６は相対的に効力が低い。Ｗ６は、大腸菌および黄色ブドウ球菌に対するＬＤ５０が他より低く５μｇ／ｍｌ未満であり、緑膿菌およびセレウス菌に対するＬＤ５０は８μｇ／ｍｌ未満で、他に匹敵している。Ｓ６およびＦ６も、４種の病原菌に対しＬＤ５０は他に匹敵するレベルである（１０μｇ／ｍｌ未満）。Ｃ６、Ｙ６およびＡ６については、病原菌に対するＬＤ５０は大部分が１０〜２０μｇ／ｍｌの範囲内である。この結果は、この系列の直鎖状アナログ、特にＷ６、Ｓ６およびＦ６は、最小生育阻止濃度（ＭＩＣ）について測定された４０残基の環状または非環状ｈＢＤ３誘導体［ＥｎｎｏＫｌｕｖｅｒら、Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ、２００５］に比べ、大腸菌、緑膿菌および黄色ブドウ球菌を殺菌する活性が高いことを示している。Ｓ６、Ｗ６およびＦ６のＬＤ９０は５〜２０μｇ／ｍｌの範囲内であり、これらのアナログは、野生型ｈＢＤ３および最も強力な活性を有する他の環状またはｈＢＤ３の直鎖状アナログと比較した場合、それらに匹敵する活性を有する［Ｈｏｏｖｅｒら、ＡｎｔｉｍｉｃｒｏｂｉａｌＡｇｅｎｔｓａｎｄｃｈｅｍｏｔｈｅｒａｐｙ、２００３、４７（９）、２８０４〜０９］。

この４５残基で完全長の直鎖状変異体が、複数のジスルフィド架橋を有するその野生型ｈＢＤ３同様に活性を有するという事実は、３箇所のジスルフィド結合の存在は抗菌活性にとっての必要要件ではないことを示している。これに対し、還元したｈＢＤ２は抗菌剤としては不活性であることが、以前報告された［ＥｎｎｏＫｌｕｖｅｒら、Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ、２００５］。トリプトファンに富む誘導体Ｗ６は、最も強力な抗菌剤である。この活性の高さは、６つのトリプトファン残基の存在に原因を求めることができる。トリプトファンに富む変異体は、トリプトファンがその中の必要不可欠な構成要素であると報告されているタチプレシンＷ４、トリトルプチシン（ｔｒｉｔｒｐｔｉｃｉｎ）、インドリシジンおよびラクトフェリシンといった他のトリプトファン含有抗菌ペプチドと比較することができる。トリプトファンが有する芳香族のインドリル側鎖はπ−πスタッキング相互作用能力があり、とりわけ界面環境において水素結合に関与することができる。チロシンおよびフェニルアラニンに富む変異体については、Ｙ６およびＦ６も、タチプレシン誘導体のＹ４およびＦ４について見出されたのと同様に、π−πスタッキング相互作用能力があり、および／または水素結合に関与できると考えられる。

ｈＢＤ３誘導体の抗菌活性は、陽イオン性のｈＢＤ３アナログと病原菌の陰性の膜との間の静電相互作用により病原菌の細胞膜に接触し、疎水性相互作用により抗菌剤分子を膜内へ挿入する、その能力に依存する。主要な構造決定因子は、正味の正電荷および全体の疎水性である。ペプチドの全体の疎水性は、ＨＰＬＣにより計算および測定した。直鎖状アナログおよび野生型ｈＢＤ３の中では、最も疎水性の高いＷ６および最も親水性の高いＳ６が強力な抗菌剤であり、このことは、鍵となる第３の構造決定因子、すなわち親水性の表面領域と疎水性の表面領域との間のバランス、したがって両親媒性の立体配座を維持することが、高い抗菌活性を維持するために重要であることを示している。

イオン強度が低い媒体中では、４５残基のｈＢＤ３の直鎖状誘導体３種は、ジスルフィド架橋されたその対応物と比較して類似の効力があった。システイン残基の置換への依存は見出されず、これはつまり、システインをアラニン（Ａ）、トリプトファン（Ｗ）またはカルボキサミドメチル化したシステイン［Ｃ（Ｃａｍ）］で置き換えても、完全にジスルフィド架橋されたｈＢＤ３ペプチドの抗菌活性と比較して、抗菌活性に顕著な変化はなかったということである。

哺乳動物細胞に対する細胞毒性および溶血活性
強力な抗菌性を有する直鎖状アナログおよび野生型ｈＢＤ３を、ヒト細胞に対するその細胞毒性について試験した。ＣｅｌｌＴｉｔｅｒブルーを用いて細胞生存数を測定することにより、初代培養した正常なヒト結膜上皮細胞上でのこれらのアナログの細胞毒性を分析した。図５を参照のこと。全ての分析において、対照として野生型ｈＢＤ３を使用した。陽イオン性ペプチドは、病原菌細胞と相互作用するのみならず、哺乳動物細胞および真核細胞に対しても毒性を呈する可能性があることは十分立証されている。微生物の細胞膜は、主要成分としての陰イオン性のフォスファチジルコリングリセロールから成るが、真核細胞膜は、疎水性相互作用を受けやすい双性イオン性のフォスファチジルコリンおよびフォスファチジルエタノールアミンを主に含有する［ＹｅａｍａｎａｎｄＹｏｕｎｔ、Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ、２００５］。したがって、陽イオン性抗菌ペプチドの溶血活性は、ペプチドの疎水性と直接つながりがあると提唱されてきた。［ＨｗａｎｇａｎｄＶｏｇｅｌ、Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ、２００５］。直鎖状ペプチド６種それぞれの細胞毒性は、６〜１００μｇ／ｍｌの濃度においては、野生型ｈＢＤ３の細胞毒性よりはるかに低かった。この結果により、ｈＢＤ３の直鎖状アナログの疎水性が高いか低いかはあまり問題ではなく、これらのアナログは野生型ｈＢＤ３と比較して細胞毒性が低減していることが明確に示されている。直鎖状アナログと野生型ｈＢＤ３との間の主要な一次元構造的な違いは、ジスルフィド結合により形成された環状構造または６つのシステイン残基を他の残基により置き換えたことによるその直線性にあるため、したがってそれは、野生型ｈＢＤ３における天然の３箇所のジスルフィド結合パターンがその高い細胞毒性にとっての主要な構造決定因子に違いないことを意味する。言い換えれば、直鎖状のポリペプチド骨格は、このアナログの細胞毒性低下に対する鍵となる構造因子である。直鎖状アナログの細胞毒性および溶血活性における違いは、異なる疎水性をもたらした配列によるものである。低い疎水性を有するＡ６、Ｓ６およびＣ（Ａｃｍ）６は、２５〜１００μｇ／ｍｌの高濃度での細胞毒性が最も低く、中間の疎水性を有するＹ６の細胞毒性は中程度であったが、これに対し、高い疎水性を有するＦ６およびＷ６の細胞毒性は相対的に最も高かった。純水中での二次構造の立体配座には明確な違いがないため、ｈＢＤ３およびその誘導体の二次構造のパラメーターが細胞毒性および溶血活性に及ぼす効果は小さい。

ヒトβディフェンシン３（ｈＢＤ３）は、三次元の折りたたみ構造、さらには四次構造を有し、陽イオン性かつ両親媒性であることが構造的な特徴であるため、多くの構造決定因子（一次、二次、三次および四次構造因子、例えば、正味の正電荷の高さ、配列および残基分布、両親媒性の立体配座、疎水性、三次元の折りたたみ構造および二量体構造）が抗菌活性、細胞毒性および溶血活性に影響を及ぼす。われわれは、構造的に同質な一連の完全長のｈＢＤ３の直鎖状アナログを設計・合成しており、天然の３箇所のジスルフィド結合パターンと、疎水性の異なるアミノ酸残基と、ペプチドの分子疎水性とが、ペプチドの抗菌活性、細胞毒性および溶血活性に及ぼす効果をさらに調査するための良好なモデルを提供している。ｈＢＤ３誘導体についてわれわれが得た結果により、特にＷ６およびＳ６およびＦ６については高い抗菌活性が達成されていること、直鎖状アナログ６種についてはヒト細胞に対する細胞毒性が低減していることが見出されたこと、細胞毒性は疎水性の観点からペプチドの設計により制御できることが示されており、そのことは、ヒトβディフェンシンにおける天然の３箇所のジスルフィド結合パターンが、その高い細胞毒性についての鍵となる構造決定因子であることを示している。この知見は、抗菌ペプチドの代替的かつ新しい設計コンセプトを提供し、ジスルフィド結合の選択的形成及び３箇所のジスルフィド結合を有するディフェンシンアナログの複雑な単離は回避するか、または不要とすることができることから、比較的低コストで大規模に生産することができ、ディフェンシンペプチド抗生物質の学術的およびさらには商業的研究開発に対して意味を持つものである。これに伴い、宿主細胞に及ぼす有毒作用がわずかであるかまたは全くない強力な抗菌ディフェンシン誘導体を設計・開発することもできよう。これらのアナログは強力な抗菌剤でありながら哺乳動物細胞への細胞毒性が低いことから多様な用途を有し、例えば、感染症を防止するためにコンタクトレンズ用溶液に添加してもよいし、または、より高い感染症防止効力を付与するために店頭販売用のアイ・ケア溶液に添加してもよい。

（実施例２）
ｈＢＤ３のＣ末端断片アナログ（１０残基）
天然のｈＢＤ３の１０残基断片のＣ末端にあるシステイン残基２つを、疎水性の異なる残基、すなわちフェニルアラニン、トリプトファン、チロシン、ロイシン、イソロイシン、バリン、システインおよびヒスチジンで一律に置き換え、全体の疎水性が多様な、対応する短鎖ペプチド、すなわちｈＢＤ３アナログの第２系列［Ｗ２、Ｆ２、Ｙ２、Ｌ２、Ｉ２、Ｃ２（またはＣ（Ａｃｍ）２）として符号化した］を形成した。

工学技術で作られたこの系列の短鎖ペプチドは、上述の実験的および理論的方法を用いた質量スペクトルおよび分子疎水性分析により設計・合成され、構造的に特徴づけられている。

分子疎水性
ｈＢＤ３のＣ末端アナログの全体的な分子疎水性を、ＲＰ−ＨＰＬＣ−ＭＳにより１ｍｇ／ｍｌでの保持時間について測定した（表４および図１４）。ＲＰ−ＨＰＬＣは、ペプチドまたは抗菌ペプチド中のアミノ酸側鎖のこのような比較のために一般的に採用される研究方法である。Ｃ１８修飾シリカの固定相は疎水性であり、移動相（水−アセトニトリル）は親水性であるため、より長い保持時間はより高い疎水性と相関があるはずである。ペプチドの分子疎水性についての測定値の序列は、Ｗ２>Ｆ２>Ｌ２>Ｉ２>Ｙ２>Ｖ２>Ｃ２>Ｈ２のとおりである。

Ｈｏｐｐ−Ｗｏｏｄｓの親水性尺度に基づいて、ペプチドの相対的な疎水性も計算した（表５）。この系列のペプチドの全体の疎水性についての序列は、Ｗ２>Ｆ２>Ｙ２>Ｌ２＝Ｉ２>Ｖ２>Ｈ２である。この尺度は、無極性の残基が負の値を与えられた場合の親水性の指標であり、親水性部分に基づいて抗原性領域を同定するために通常使用されている。各ペプチドについて、われわれは残りのアナログについてペプチドの相対的な疎水性を計るために、各ペプチドにおける各残基に対応する値を別々に合計した。この尺度を用いて算出されたペプチドの疎水性傾向は、Ｙ２、Ｌ２およびＩ２についての序列を除き、実験的なＨＰＬＣ保持時間のデータの傾向に概ね整合している。ＡｃｍはＨｏｐｐ−Ｗｏｏｄｓ尺度における対応値を有していないため、Ｃ２［Ｃ（Ａｃｍ）２］は除外した。８種のペプチドは相対的に高い親水性を示すが、全体的な分子疎水性は広い範囲で異なっている（表４および図１４）。

細胞毒性
天然のｈＢＤ３および８種の新規ペプチドのうち４種（Ｗ２、Ｙ２、Ｖ２およびＬ２）について、ヒト結膜上皮細胞に対する細胞毒性を試験した。細胞毒性試験の一次結果（図１５）は、４種のペプチドは、ｈＢＤ３の直鎖状アナログの完全長の第１系列６種［Ｆ６、Ｗ６、Ｙ６、Ａ６、Ｓ６およびＣ（Ａｃｍ）６］と同様、天然のｈＢＤ３と比較して６．２５〜２００μｇ／ｍｌの範囲の濃度で細胞毒性の低減を呈していることを示している。

したがって、表４と図１５とを比較すると、この系列のペプチドは、疎水性は細胞毒性と十分に相関するというわれわれが当初得た結論を裏付けている。われわれは、新規のペプチド設計により細胞毒性が低減することを示したが、これらのペプチドは上皮細胞で覆われている粘膜表面に向けられるであろうことを考慮すれば、このことはとりわけ重要である。

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従来技術で開示済の配列
野生型 hBD3: 配列番号1
GIINTLQKYYCRVRGGRCAVLSCLPKEEQIGKCSTRGRKCCRRKK

(Wuら、2003) C(Acm)1-5 配列番号26
GIINTLQKYYC(Acm)RVRGGRCAVLSCLPKEEQIGKCSTRGRKC(Acm)CRRKK

(Wuら、2003) C(Acm)1-6 配列番号27
GIINTLQKYYC(Acm)RVRGGRCAVLSCLPKEEQIGKCSTRGRKCC(Acm)RRKK

(Wuら、2003) [Abu]-BD3 配列番号28
GIINTLQKYYC[Abu]RVRGGRC[Abu]AVLSC[Abu]LPKEEQIGKC[Abu]STRGRK C[Abu]C[Abu]RRKK

(Hooverら、2003) hBD3δ8 配列番号29
KYYCRVRGGRCAVLSCLPKEEQIGKCSTRGRKCCRRKK

(Hooverら、2003) hBD3δl0 配列番号30
YCRVRGGRCAVLSCLPKEEQIGKCSTRGRKCCRRKK

(Hooverら、2003) 配列番号31
KEEQIGKSSTRGRKSSRRKK

(Hooverら、2003) 配列番号32
KSSTRGRKSSRRKK

(Hooverら、2003) 配列番号33
RGRKSSRRKK

(Hooverら、2003) 配列番号34
RGRKSSRRK

(Hooverら、2003) 配列番号35
KYYSRVRGGRSAVLSSLPK

(Hooverら、2003) 配列番号36
GIINTLQKYYSRVRGGR

本発明による配列
配列番号2:
GIINTLQKYYX¹RVRGGRX²AVLSX³LPKEEQIGKX⁴STRGRKX⁵X⁶RRKK
Ｘ^１、Ｘ^２、Ｘ^３、Ｘ^４、Ｘ^５およびＸ^６のいずれか１つは、システイン以外の任意のアミノ酸であるか、Ｃ［Ａｂｕ］以外の保護されたシステイン残基もしくはその誘導体であるか、またはそのアミノ酸は存在していない。Ｘ^ｎの意味は、同様に以下の配列にも適用される。
配列番号3
KYYX¹RVRGGRX²AVLSX³LPKEEQIGKX⁴STRGRKX⁵X⁶RRKK

配列番号4
YX¹RVRGGRX²AVLSX³LPKEEQIGKX⁴STRGRKX⁵X⁶RRKK

配列番号5
LQKYYX¹RVRGGRX²AVLSX³LPKEEQIGKX⁴STRGRKX⁵X⁶RRKK

配列番号6
RX²AVLSX³LPKEEQIGKX⁴STRGRKX⁵X⁶RRKK

配列番号7
KEEQIGKX⁴STRGRKX⁵X⁶RRKK

配列番号8
KX⁴STRGRKX⁵X⁶RRKK

配列番号9
RGRKX⁵X⁶RRKK

配列番号10
RGRKX⁵X⁶RRK

配列番号11
KYYX¹RVRGGRX²AVLSX³LPK

配列番号12
GIINTLQKYYX¹RVRGGR

W6: 配列番号13
GIINTLQKYYWRVRGGRWAVLSWLPKEEQIGKWSTRGRKWWRRKK

F6: 配列番号14
GIINTLQKYYFRVRGGRFAVLSFLPKEEQIGKFSTRGRKFFRRKK

Y6: 配列番号15
GIINTLQKYYYRVRGGRYAVLSYLPKEEQIGKYSTRGRKYYRRKK

S6: 配列番号16
GIINTLQKYYSRVRGGRSAVLSSLPKEEQIGKSSTRGRKSSRRKK

A6: 配列番号17
GIINTLQKYYARVRGGRAAVLSALPKEEQIGKASTRGRKAARRKK

C(Acm)6: 配列番号18
GIINTLQKYY C(Acm)6RVRGGR C(Acm)6AVLS C(Acm)6LPKEEQIGK C(Acm)6STRGRK C(Acm)6C(Acm)6RRKK

C(But)6: 配列番号19
GIINTLQKYY C(But)6RVRGGR C(But)6AVLS C(But)6LPKEEQIGK C(But)6STRGRK C(But)6C(But)6RRKK

C(t-Buthio)6: 配列番号20
GIINTLQKYY C(t-Buthio)6RVRGGR C(t-Buthio)6AVLS C(t-Buthio)6LPKEEQIGK C(t-Buthio)6STRGRK C(t-Buthio)6C(t-Buthio)6RRKK

C(Bzl)6: 配列番号21
GIINTLQKYY C(Bzl)6RVRGGR C(Bzl)6AVLS C(Bzl)6LPKEEQIGK C(Bzl)6STRGRK C(Bzl)6C(Bzl)6RRKK

C(4-MeBzl)6: 配列番号22
GIINTLQKYY C(4-MeBzl)6RVRGGR C(4-MeBzl)6AVLS C(4-MeBzl)6LPKEEQIGK C(4-MeBzl)6STRGRK C(4-MeBzl)6C(4-MeBzl)6RRKK

C(4-MeO-Bzl)6: 配列番号23
GIINTLQKYY C(4-MeO-Bzl)6RVRGGR C(4-MeO-Bzl)6AVLS C(4-MeO-Bzl)6LPKEEQIGK C(4-MeO-Bzl)6STRGRK C(4-MeO-Bzl)6C(4-MeO-Bzl)6RRKK

C(Mmt)6: 配列番号24
GIINTLQKYY C(Mmt)6RVRGGR C(Mmt)6AVLS C(Mmt)6LPKEEQIGK C(Mmt)6STRGRK C(Mmt)6C(Mmt)6RRKK

C(Cam)6: 配列番号25
GIINTLQKYY C(Cam)6RVRGGR C(Cam)6AVLS C(Cam)6LPKEEQIGK C(Cam)6STRGRK C(Cam)6C(Cam)6RRKK

WT C-terminus: 配列番号37
RGRKCCRRKK

W2: 配列番号38
RGRKWWRRKK

F2: 配列番号39
RGRKFFRRKK

Y2: 配列番号40
RGRKYYRRKK

L2: 配列番号41
RGRKLLRRKK

I2: 配列番号42
RGRKIIRRKK

V2: 配列番号43
RGRKVVRRKK

H2: 配列番号44
RGRKHHRRKK

C2 or C(Acm)2: 配列番号45
RGRKC(Acm)C(Acm)RRKK

Claims

ｈＢＤ３の断片である単離抗菌ペプチドであって、配列番号３８−４５のいずれか１つのアミノ酸配列からなる、単離抗菌ペプチド。
野生型ｈＢＤ３と比較して、少なくとも１種の上皮細胞に対する細胞毒性が低下している、請求項１に記載の単離ペプチド。
請求項１または２に記載のペプチドをコードする単離ポリヌクレオチド。
請求項３に記載のポリヌクレオチド、または請求項３に記載のポリヌクレオチドを含むベクターを含む宿主細胞。
請求項１または２に記載の少なくとも１種の抗菌ペプチドを含む医薬組成物。
請求項１または２に記載の抗菌ペプチドおよび少なくとも１種の非ペプチド性抗菌剤を含む抗菌組成物。
点眼剤の組成物および／または溶液の形態である、請求項５に記載の医薬組成物または請求項６に記載の抗菌組成物。
請求項５に記載の少なくとも１種の医薬組成物、請求項６に記載の少なくとも１種の抗菌組成物、および／または、請求項１または２に記載の少なくとも１種の抗菌ペプチドを含む、コンタクトレンズ用溶液。
請求項５に記載の少なくとも１種の医薬組成物、請求項６に記載の少なくとも１種の抗菌組成物、または、請求項１または２に記載の少なくとも１種の抗菌ペプチドを含む、機器コーティング。
少なくとも１種の適当な容器に入れられた、請求項１または２に記載の少なくとも１種の抗菌ペプチド、請求項５に記載の少なくとも１種の医薬組成物、および／または、請求項６に記載の少なくとも１種の抗菌組成物を含む、キット。
請求項１または２に記載の抗菌ペプチド、請求項５に記載の医薬組成物、および／または、請求項６に記載の抗菌組成物を、単独で、または他の抗菌剤および／または抗生物質と組み合わせて、微生物に接触させることを含む、少なくとも１種の微生物の生育をｉｎｖｉｔｒｏで阻害および／または抑制する方法。
ｅｘｖｉｖｏにおける抗菌剤として使用するための、または、微生物感染症の治療に使用するための、請求項１または２に記載の抗菌ペプチド。
（ｉ）局所投与用、ならびに／または、皮膚および／もしくは粘膜の治療用の医薬、（ｉｉ）点眼剤の組成物および／または溶液、（ｉｉｉ）コンタクトレンズ用溶液、（ｉｖ）機器コーティングおよび／または医療機器コーティングとして使用するための、および／または少なくとも１種の微生物の生育を阻害および／または抑制するための、および／または少なくとも１種の微生物感染症を治療するための、請求項１または２に記載のペプチドである、単離ペプチド。
（ｉ）局所投与用、ならびに／または、皮膚および／もしくは粘膜の治療用の医薬、（ｉｉ）点眼剤の組成物および／または溶液、（ｉｉｉ）コンタクトレンズ用溶液、（ｉｖ）機器コーティング、または（ｖ）単独の、または別の抗菌剤および／または抗生物質と組み合わせた、少なくとも１種の微生物の生育を阻害および／または抑制するための組成物および／または少なくとも１種の微生物感染症を治療するための医薬の製造における、請求項１または２に記載の単離ペプチドの使用。