JP5798847B2 - 細胞間脂質の分子会合構造の評価方法 - Google Patents
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しかし、ヒトの皮膚の角層のラマンスペクトルを測定した場合、図21及び22に示すように、細胞間脂質のCH2伸縮振動由来の信号(2850cm-1付近及び2880cm-1付近に出現)と、タンパク質のCH3伸縮振動に由来する信号(2930cm-1付近に出現)は、一部が重複した波数領域で観測される。そのため、タンパク質、脂質及び水を主要構成成分とする角層のラマンスペクトルを測定するとタンパク質及び脂質をそれぞれ由来とする信号が重畳したスペクトルが得られ、ラマンスペクトル中の細胞間脂質に特異的な信号を定量的に取扱うことが困難となる。したがって、角層のラマンスペクトルから、CH3伸縮振動の影響を除去して、細胞間脂質に特異的な信号を抽出する方法が必要となる。
測定したスペクトルから含水脱脂角層の寄与分を除去し、細胞間脂質に特異的な信号を抽出したスペクトルを得る工程、
細胞間脂質に特異的な信号を指標とし細胞間脂質の分子会合構造を評価する工程、
を含む細胞間脂質の分子会合構造の評価方法に関する。
ラマンスペクトル測定装置についても特に制限はなく、通常の装置を用いることができる。このうち、角層自体は非常に薄いため、高い空間分解能で測定可能な共焦点光学系を有する測定装置を用いることが好ましい。ラマンスペクトルの測定方法についても特に制限はなく、一般的な方法を使用することができるが、共焦点顕微ラマン法による測定が好ましい。
本発明において、レーザー光入射部位の深さ方向については特に制限はない。例えば、ラマンスペクトルは共焦点装置により、皮膚表面から200μm程度の深さまでの任意の深さのスペクトルを測定することが可能である。実際の測定では、角層の厚さを考慮し、測定頻度と測定深度を適宜決定して測定を行う。例えば、ヒトの角層の厚さは通常約20μm前後であることから、皮膚表面から40μm程度の深さまでの任意の深さにレーザー光入射部位を調整し、皮膚の角層のラマンスペクトルを測定すればよい。
使用する対物レンズについて、倍率、開口数(N.A.)は特に限定はない。例えば、より高空間分解能での測定を行う場合には、倍率は40倍〜100倍、開口数は0.9〜1.5が好ましい。
本発明では、皮膚のラマンスペクトルから含水脱脂角層の寄与分を除去し、図1に示すように細胞間脂質に特異的な信号(図1に示すラマンスペクトルにおいては、2850cm-1付近で検出されるCH2対称伸縮振動に由来する信号、2880cm-1付近で検出されるCH2逆対称伸縮振動に由来する信号)を抽出する。
なお、対象とする動物が同じであれば含水脱脂試料のラマンスペクトル中のCH3伸縮振動由来の信号のピークトップ波数には個体差や部位差が無いことを確認しており、一つの含水脱脂試料のラマンスペクトルを、同じ動物であれば異なる個体や異なる部位の評価に適用することができる。
上述の通り、測定した皮膚の角層のラマンスペクトルから含水脱脂角層の寄与分を除去することで、細胞間脂質に特異的な信号を正確に抽出することできる。したがって、本発明によれば、抽出した細胞間脂質に特異的な信号を指標とし、層構造形成の有無、細胞間脂質のパッキング状態(細胞間脂質の会合状態)、細胞間脂質を構成するアルキル鎖の運動性、細胞間脂質の結晶構造等、細胞間脂質の分子会合構造を正確かつ簡便に評価することができる。
(1)含水脱脂角層のモデルとする部位の角層を採取し、有機溶媒に浸漬して脱脂処理を施し、水分量が概ね40wt%以上となるように水分を付与し、含水脱脂角層を調製する。
(2)含水脱脂角層のラマン測定を行い、含水脱脂角層の標準スペクトルを得る。
(3)皮膚にレーザー光を照射し、角層のラマン測定を行う。具体的には、共焦点顕微ラマン法に従い、皮膚表面から40μm程度の深さまでの任意の深さで角層のラマン測定を行う。
(4)角層のラマンスペクトルと、含水脱脂角層の標準スペクトルとを規格化する。具体的には、ラマンスペクトル中2930cm-1付近に出現する、タンパク質のCH3伸縮振動由来の信号の強度で規格化する。
(5)含水脱脂角層の標準スペクトルを用いて、細胞間脂質由来の信号に重畳するタンパク質由来の信号の影響を排除して含水脱脂角層の寄与分を除去し、角層のラマンスペクトルから細胞間脂質に特異的な信号を抽出する。具体的には、タンパク質、水及び脂質を構成成分とする角層のラマンスペクトルから、タンパク質及び水を構成成分とする含水脱脂試料のラマンスペクトルを差し引いて、細胞間脂質に特異的な2つの信号を抽出する。
(6)抽出した細胞間脂質に特異的な2つの信号を指標とし、細胞間脂質の分子会合構造を評価する。例えば、2850cm-1付近の信号と2880cm-1付近の信号との強度比(R値)を算出し、層構造形成の有無、細胞間脂質のパッキング状態(細胞間脂質の会合状態)、細胞間脂質を構成するアルキル鎖の運動性、細胞間脂質の結晶構造等を評価する。
健常男性(40歳代)のかかとから角層片(約3mg)を剥離し、クロロホルム−メタノール溶液(体積比:1:1)に一昼夜浸して脂質等の油溶性成分を除去し、さらに水に24時間浸してアミノ酸等の水溶性成分を除去した後、五酸化二リンとともに調湿容器に入れ密封し、調湿容器を23℃のデシケーター内で1週間保管し、完全に乾燥させたかかと角層(以下、「脱脂乾燥角層(かかと)」ともいう)を調製した。
飽和LiCl水溶液を用いて前記脱脂乾燥角層を調湿(10%RH)したかかと角層(以下、「脱脂調湿角層(10%RH)」ともいう)を調製した。
飽和Na2HPO4水溶液を用いて前記脱脂乾燥角層を調湿(98%RH)したかかと角層(以下、「脱脂調湿角層(98%RH)」ともいう)を調製した。
前記脱脂乾燥角層(約3mg)にイオン交換水10μLを滴下し、含水かかと角層(以下、「含水脱脂角層」とともいう)を調製した。
前腕内側部から、剥離した角層(粉末状)について、前記脱脂乾燥角層と同様の処理をした角層(以下、「脱脂乾燥角層(前腕内側部)」ともいう)を調製した。
前記脱脂乾燥角層(かかと)、及び前記脱脂乾燥角層(前腕内側部)のラマンスペクトルを共焦点ラマン分光器 ナノファインダー30(商品名、東京インスツルメンツ製)を用いて測定した。測定条件は以下のとおりである。
<測定条件>
励起波長632.8nm
波数分解能:5cm-1(脱脂乾燥角層(かかと))又は30cm-1(脱脂乾燥角層(前腕内側部))
対物レンズ:100倍、NA=1.3(油浸)
その結果を図2に示す。さらに、該ラマンスペクトルのベースラインを調整し、タンパク質のCH3伸縮振動に由来する信号が出現する2920〜2950cm-1領域を拡大した図を図3に示す。
これに対して、図3より、タンパク質のCH3伸縮振動由来の信号については、前腕内側部とかかとでは大きな違いはなかった。特に、2つのスペクトルにおいて、タンパク質のCH3伸縮振動由来の信号のピークトップの波数に大きな違いはなかった。
そこで、下記実施例では、ヒトの角層のラマンスペクトルにおいてCH2伸縮振動に由来する信号に重畳する、CH3伸縮振動に由来する信号の影響を除去するための標準的な脱脂角層のラマンスペクトル(標準スペクトル)として、S/Nの良いかかとの角層のラマンスペクトルを用いることとした。
20代男性の前腕内側部をドライヤー(1000W)で1分間加熱し、前腕内側部角層のラマンスペクトルを共焦点ラマン分光器 ナノファインダー30(商品名、東京インスツルメンツ製)を用いて測定した。この測定中、前腕は測定台(温度:約25℃)に固定し、同一部位を5回測定した。測定条件は以下のとおりである。
<測定条件>
励起波長632.8nm
波数分解能:5cm-1
対物レンズ:100倍、NA=1.3(油浸)
測定深さ:皮膚表面から約5μm
CH3伸縮振動由来の信号強度で規格化した、前腕内側部、脱脂調湿角層(98%RH)、脱脂調湿角層(10%RH)及び脱脂乾燥角層(かかと)のラマンスペクトルを図4に示す。さらに、図4中の各スペクトルのベースラインを調整し、タンパク質のCH3伸縮振動由来の信号が出現する2920cm-1〜2960cm-1領域を拡大した図を図5に示す。
一方、図5から、各スペクトルにおいてタンパク質(ケラチン)のCH3伸縮振動由来の信号のピークトップの波数が、角層に含まれる水分量が多くなるに従い、長波長側にシフトすることが明らかになった。すなわち、角層に含まれる水分量の違いによって、ラマンスペクトル中のCH3伸縮振動由来の信号のピークトップの波数が変化した。
図4中の各スペクトルの水のOH伸縮振動及びタンパク質のNH伸縮振動に由来する信号強度(2950cm-1〜3750cm-1に出現)に、水のラマンスペクトル(図6)を足し合わせて、前腕内側部のOH伸縮振動由来の信号強度に揃えたスペクトルを図7に示す。さらに、図7に示す各スペクトルのタンパク質のCH3伸縮振動に由来する信号が出現する2920cm-1〜2960cm-1領域を拡大した図を図8に示す。図5に示す各スペクトルと同様に、タンパク質のCH3伸縮振動由来の信号のピークトップの波数が、脱脂乾燥角層、脱脂調湿角層(10%RH)、脱脂調湿角層(98%RH)、前腕内側部の順に大きくなる。
さらに、脱脂乾燥角層、脱脂調湿角層(10%RH)、脱脂調湿角層(98%RH)、前腕内側部に含まれる水分量を特開2010−12076号公報に記載の方法に準じてCH3伸縮振動由来の信号強度(2800〜3030cm-1)とOH伸縮振動由来の信号強度(3100〜3750cm-1)の比から測定し、図8に示す各信号のピークトップの波数を各試料の角層水分量に対してプロットした図を図9に示す。図9から、図7に示すような、OH伸縮振動由来の信号強度の違いに応じて水の寄与分を除去したラマンスペクトルにおいても、CH3伸縮振動由来の信号のピークトップ波数が、試料に含まれる水分量の違いにより変化することが明らかとなった。
このように、角層のラマンスペクトル中のタンパク質のCH3伸縮振動由来の信号のピークトップ波数は水分量増加に伴い長波長側にシフトする。したがって、角層のラマンスペクトルから、脱脂調湿角層又は脱脂乾燥角層のラマンスペクトルにおけるタンパク質の寄与分を排除して抽出したスペクトルは、細胞間脂質の分子会合構造を正確に反映するものとはいえない。
試験例3で測定した20代男性の前腕内側部のラマンスペクトル、及び同様の条件で測定した試験例1で調製した含水脱脂角層のラマンスペクトルについて、CH3伸縮振動由来の信号(2930cm-1)の強度で規格化を行った。その結果を図10に示す。CH3伸縮振動由来の信号強度当たりのNH伸縮振動由来の信号強度は一定とみなせるので、3400cm-1付近の信号強度の変化は水分量の変化に対応するとみなすことができる。これより、角層に含まれる水分量は、前腕内側部よりも含水脱脂角層で多いことがわかる。
さらに、図10に示すスペクトル中、タンパク質のCH3伸縮振動に由来する信号が出現する2920〜2960cm-1の領域の拡大図を図11に示す。図11より、前腕内側部のスペクトルと含水脱脂角層のスペクトルにおいて、CH3伸縮振動由来の信号の形状及びピークトップ波数がほぼ一致していることが分かった。
図13より、含水脱脂角層のラマンスペクトルから水の寄与分を排除して得られた補正後のスペクトルは、補正前のスペクトルと比べて、タンパク質のCH3伸縮振動の信号の形状及び極大値(ピークトップの波数)に変化は見られなかった。したがって、含水脱脂角層のラマンスペクトルにおける水のOH伸縮振動由来の信号の強度は、脂質由来の信号(2880cm-1及び2850cm-1付近に出現する信号)に重畳する、タンパク質のCH3伸縮振動由来の信号の影響を除くための標準スペクトルの選択に影響はないと言える。
試験例4で得られた含水脱脂角層の標準ラマンスペクトルを用いて、試験例3で測定した20代男性の前腕内側部のラマンスペクトルから、含水脱脂角層の寄与分を除去しタンパク質由来の信号の影響を排除し、細胞間脂質に由来の信号を抽出した。その結果を図1に示す。
図1に示すように、CH3伸縮振動由来の信号(2930cm-1)が確認されず、CH2逆対称伸縮振動由来の信号(2880cm-1)及びCH2対称伸縮振動由来の信号(2850cm-1)が確認された。したがって、角層の主な構成成分は脂質、タンパク質及び水であるため、図1に示すラマンスペクトル中の2つの信号は細胞間脂質のCH2伸縮振動を反映するものである。
よって、ヒトの皮膚のラマンスペクトルから、含水脱脂角層のラマンスペクトルを用いて、含水脱脂角層の寄与分を除去して角層のラマンスペクトルからCH3伸縮の影響を除いてスペクトルを抽出することにより、細胞間脂質由来のCH2伸縮の信号の抽出が可能となる。
20代男性の前腕内側部をドライヤー(1000W)で1分間加熱した。加熱直後から、経時的に前腕内側部角層のラマンスペクトルを共焦点ラマン分光器 ナノファインダー30(商品名、東京インスツルメンツ製)を用いて測定した(1分間隔、5分間)。この測定中、前腕は測定台(温度:約25℃)に固定し、同一部位を経時的に測定した。測定条件は以下のとおりである。
<測定条件>
励起波長632.8nm
波数分解能:5cm-1
対物レンズ:100倍、NA=1.3(油浸)
測定深さ:皮膚表面から約5μm
測定したラマンスペクトルについて、CH3伸縮振動由来の信号強度で規格化した。このようにして得られた加熱直後及び加熱から5分経過後のヒト前腕内側部のラマンスペクトルを図15に示す。
さらに、図10に示す含水脱脂角層の標準ラマンスペクトルを用いて、図15に示す各ラマンスペクトルから、含水脱脂角層の寄与分を除去しタンパク質由来の信号の影響を排除し、細胞間脂質に由来の信号を抽出したスペクトルを図16に示す。
図17より、R値は加熱直後から経時的に上昇し(加熱直後〜3分後)、その後ほぼ一定になる傾向を示した(3〜5分後)。一般に、細胞間脂質は39℃において、斜方晶/六方晶の相転移が生じる(例えば、I.Hatta et al.,Biochimica et Biophysica Acta.,vol.1758,p.1830-1836,2006;小幡ら,Spring-8 User Experiment Report,2009A1876など参照)。ドライヤーによる加熱処理直後の皮膚表面温度は約45℃であったことからこの加熱処理により角層を一時的に39℃以上に加熱したと考えられ、このようなR値の変化は、加熱により六方晶に相転移(R値が低下)した細胞間脂質が、その後の冷却過程において経時的に斜方晶に相転移(R値が上昇)していく過程を示している。このことは、細胞間脂質の分子会合構造が、加熱前は横方向の秩序度が高かったが、加熱により横方向の秩序度が低くなり、加熱後の冷却過程において経時的に横方向の秩序度が再び上昇したことを示している。これらの点からも、R値は細胞間脂質の分子会合構造の評価の指標となる。したがって、本発明によれば温度変化に伴う細胞間脂質のCH2伸縮振動由来の信号の変化を正確に測定することができ、本発明の評価方法が細胞間脂質の分子会合構造の評価に好適であることがいえる。
20代男性の上腕内側部、前腕内側部及び頬部のラマンスペクトルを共焦点ラマン分光器 ナノファインダー30(商品名、東京インスツルメンツ製)を用いて測定した。この測定中、上腕、前腕及び頬は測定台(温度:約25℃)に固定した。上腕内側部、前腕内側部及び頬部を各5回ずつ測定した。測定条件は以下のとおりである。
<測定条件>
励起波長632.8nm
波数分解能:5cm-1
対物レンズ:100倍、NA=1.3(油浸)
測定深さ:皮膚表面から約5μm
測定したラマンスペクトルについて、CH3伸縮振動由来の信号強度で規格化した。このようにして得られた上腕内側部及び頬部のラマンスペクトルを図18に示す。さらに、図10に示す含水脱脂角層の標準ラマンスペクトルを用いて、図18に示す各ラマンスペクトルから、含水脱脂角層の寄与分を除去しタンパク質由来の信号の影響を排除し、細胞間脂質に由来の信号を抽出したラマンスペクトルを図19に示す。
図19からも明らかなように、前腕内側部以外の部位でも、測定したスペクトルから含水脱脂角層の寄与分を除去し、細胞間脂質に特異的な信号を抽出することにより、細胞間脂質のCH2逆対称伸縮振動(2880cm-1)及びCH2対称伸縮振動(2850cm-1)由来の信号が確認できた。
したがって、本発明によれば部位による細胞間脂質のCH2伸縮振動由来の信号の違いを正確に捉えることができ、本発明の評価方法が細胞間脂質の分子会合構造の評価に好適であることがいえる。
Claims (3)
- ラマン分光により皮膚の角層のスペクトルを測定する工程、
予め測定した含水脱脂角層の標準スペクトルを用いて、細胞間脂質由来の信号に重畳するタンパク質由来の信号の影響を排除して、測定した皮膚の角層のスペクトルから含水脱脂角層の寄与分を除去し、細胞間脂質に特異的な信号を抽出したスペクトルを得る工程、
細胞間脂質に特異的な信号を指標とし細胞間脂質の分子会合構造を評価する工程、
を含む細胞間脂質の分子会合構造の評価方法。 - 細胞間脂質に特異的な信号が、CH2対称伸縮振動に由来するスペクトル中2850cm-1付近で検出される信号、及びCH2逆対称伸縮振動に由来するスペクトル中2880cm-1付近で検出される信号である、請求項1記載の評価方法。
- 細胞間脂質の分子会合構造の評価が美容目的である、請求項1又は2記載の評価方法。
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