JP5288912B2 - 皮膚水分量の測定方法 - Google Patents
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Description
さらに、本発明は、皮膚内部の水分分布測定方法を提供することを目的とする。
さらに、本発明によれば、皮膚内部の水分分布測定方法を提供することができる。
本発明の皮膚水分量の測定方法では、皮膚のラマンスペクトルを測定する。ラマンスペクトルの測定について、皮膚を採取してラマンスペクトルを測定する方法(侵襲法)や、皮膚のラマンスペクトルを直接測定する方法(非侵襲法)等が挙げられるが、直接肌の状態を測定できる非侵襲法が好ましい。ラマンスペクトルの測定においては、一般的な方法を使用することができ、特に、顕微ラマン法による測定が好ましい。
ラマンスペクトル測定装置についても特に制限はなく、通常の装置を用いることができる。水分量の測定箇所が非常に狭い場合、測定部位が非常に小さな場合でもラマンスペクトルを得ることができる共焦点光学系を有する測定装置を用いることが好ましい。
本発明において、レーザー光入射部位の深さ方向については特に制限はない。例えば、ヒトの皮膚について測定する場合、ヒトの皮膚の表面から真皮組織までの水分量を測定するのが好ましく、レーザー光入射部位を表面から1000μmまでの範囲とするのが好ましく、表面から200μmまでの範囲とするのがより好ましい。
使用する対物レンズについて、倍率、開口数(N.A.)は特に限定はない。例えば、被測定物がヒト皮膚の場合、より高空間分解能での測定を行う場合には、倍率は40倍〜100倍、開口数は0.9〜1.5が好ましい。水平方向および深さ方向により広範囲の測定を行う場合は、倍率は10倍〜40倍、開口数は0.3〜0.9が好ましい。
また、本発明において、ラマンスペクトル中には前記重水由来の信号の他に、軽水由来の信号も観測される。この軽水は、皮膚内部にもともと存在していたものである。従って、本発明において、ラマンスペクトル中の軽水の信号強度を測定することで、皮膚外部から浸透した水分量の他に、皮膚内部にもともと存在していた水分量も測定することができる。
皮膚の角層の主要成分は水(軽水)と蛋白質である。したがって、角層を水と蛋白質の二成分系で近似した場合、角層蛋白質に由来(主にCH伸縮振動に由来)する2900cm-1付近のラマン信号強度Iprotein、水のOH伸縮振動および蛋白質のNH伸縮振動に由来する3400cm-1付近のラマン信号強度IOH、および角層中の軽水と蛋白質の質量比RH2O/proteinの間には以下の関係が与えられる。
式(1)において、IOHおよびIproteinは以下の式で表すことができる。
蛋白質のCH伸縮振動に由来する信号と重水のOD伸縮振動由来の信号の強度比を直接求めることは容易ではない。したがって、軽水のOH伸縮振動由来のピークと重水のOD伸縮振動由来のピークの強度比より、間接的に蛋白質のCHと重水のODの信号強度比を求めることが好ましい。ここで、重水と軽水の密度比は1.11である。また、下記参考例で示すように、重水のOD伸縮振動と軽水のOH伸縮振動にぞれぞれ由来するピークの強度比は実質的には一定値Cを示す。これらの値を用いると、角層中の重水と蛋白質の質量比RD2O/proteinは以下のように与えられる。
また、本発明の水分量の測定方法を用いて、皮膚のラマンスペクトルを表面からの深さ方向及び/または水平方向に変えて測定することで、皮膚内部の水分分布を測定することができる。
軽水(イオン交換水)と重水(Merck製、NMR用、99.96%)を軽水:重水=1:0(軽水のみ)、3:1、2:1、1:1、1:2、1:3および0:1(重水のみ)の体積比で混合し、ガラスボトムディッシュ(マツナミ製)に入れ、ラマンスペクトルを測定した。その結果を図1に示す。なお、図1中の各スペクトルはスペクトルの最大値および最小値を用いて規格化して表示した(オフセット表示)。
ラマンスペクトル測定装置としては、共焦点ラマン分光器 ナノファインダー30(商品名、東京インスツルメンツ製)を用いた。また、測定条件は以下のとおりである。
<測定条件>
対物レンズ:40×、NA0.9
レーザー:633nm、8mW(試料上)
積算時間:60s
ピンホール径:80μm
回折格子:150gr/mm
軽水に少量の重水を添加(例えば、軽水:重水=3:1の体積比で軽水に重水を添加)すると、前記の重水由来のピークに加え、1450cm-1付近に新たなピークが出現した。1450cm-1のラマン線はHODの変角振動由来のピークと判断できる。また2本のOH伸縮振動由来のピーク(対称、逆対称)の強度比に関しては、3250cm-1付近のOH対称伸縮振動由来のピークの相対強度が低下することも観測された。OH伸縮振動由来のピークに関しては、OH変角振動由来のピークの波数の二倍に相当するため、フェルミ共鳴による信号強度の増大現象が生じる事が知られている。軽水に重水を加えることによりフェルミ共鳴が抑制され、OH伸縮振動由来のピークの強度が低下したと考えられる。
重水に少量の軽水を添加(例えば、軽水:重水=1:3の体積比で重水に軽水を添加)した場合でも同様に、OD対称伸縮振動由来のピークの強度低下が観測された。
重水と軽水の各混合比での、重水と軽水の信号強度比ROD/OHを下記式で算出した。
図2で示すように、混合体積比と信号強度比の関係は直線性を示し、その傾きは約1.20となった。前述のように、軽水と重水の混合過程では、HOD分子の出現やフェルミ共鳴の発生等があり、混合体積比と信号強度比の間には直線性が原理的に保証されているわけではない。しかし、図2より、軽水と重水の存在比を重水及び軽水の伸縮振動由来のピークの面積比から見積もれば、実用上は十分である判断できる。従って、単位体積当たりの重水と軽水の分子数を同じと近似する(25℃での重水と軽水の密度比1.110は、重水と軽水の分子量比1.112とほぼ一致する)と、モル当たりのラマン散乱強度の比較においては、重水のOD伸縮振動由来のピークの強度(面積)は、軽水のOH伸縮振動由来のピークの強度(面積)の1.20倍と見積もることができる。したがって式(4)のCの実験値として、1.20を得ることができた。
式(1)における定数AおよびBを得るために、含水量の異なる角層のラマンスペクトルの測定を以下のとおりに行った。
健常男性(40歳代)のかかとより角層片(3.0〜5.5mg)を剥離し、クロロホルムおよび水に浸漬し、脂質等の油溶性成分と、アミノ酸等の水溶性成分を除去した。本処理後の角層片を、角層蛋白質のモデルとした。各角層を5酸化りんの調湿ボックス中に3日間放置し、調湿ボックス中の角層片に対してレーザーを照射し、ラマンスペクトルを測定した。その後に各角層を調湿ボックスより取り出し、速やかに重量を測定した。このときのラマンスペクトルおよび角層重量を、近似的に含水量0%における各角層片の重量およびラマンスペクトルと定義した。
その後、各角層片を順次調湿環境下に放置した後の、ラマンスペクトルの測定と重量の測定を繰り返した。調湿環境の調製には、乾燥シリカゲル、飽和塩化ナトリウム水溶液、飽和臭化ナトリウム水溶液、飽和硫酸ナトリウム水溶液および飽和リン酸水素二ナトリウム水溶液を用いた。このときのラマンスペクトルの変化を図3に示す。吸湿により、蛋白質のCH伸縮振動に由来する信号(2920cm-1付近)に対する、水のOH伸縮振動に由来する信号強度(3100cm-1〜3700cm-1付近、蛋白質のNH伸縮振動に由来する信号を含む)が変化していることがわかる。
ここで上記秤量により得た、各調湿環境下での各角層片の含水率Rwaterを以下のように定義した。
健常男性(40歳代)の前腕内側を顕微ラマン分光器のガラス窓に接触させ、ガラス窓越しにラマンスペクトル(深さ方向の連続スキャン)を測定した。
その後、上記でラマンスペクトルを測定した部位と同じ部位に重水(40℃)を満たした円筒状のカップを10分間接触させた。その後カップを外し、皮膚上に残っている重水を軽くタオルで除いた後、速やかに前腕内側のラマンスペクトルを深さ方向の連続スキャンで測定した。その結果を図5に示す。各スペクトルは最大・最小値を用いて縦軸を規格化後、オフセットをとって表示している。
なお、ラマン測定条件は以下のとおりである。
<測定条件>
装置:顕微ラマン分光器 ナノファインダー(商品名、東京インスツルメンツ製)
励起光:633nm、8mW(試料上)
ピンホール:150μm
対物レンズ:NA1.3
スキャン間隔:深さ方向に2μm間隔
以上の結果から、皮膚表面に接触させた重水が、皮膚表面から約13μmの深さまで浸透していることがわかる。
また、重水浸透後の軽水分布も同様に、2本の直線で近似できるプロファイルを示した。表層に近い濃度勾配の大きな領域(重水処理後では0〜18μm)が、ほぼ直線性を維持したままその領域を広げたことは、(1)重水処理により角層が膨潤して厚くなったこと、および(2)重水が浸透してももともと皮膚内部に存在していた軽水の分布にはほとんど影響を及ぼしていないこと、を意味すると考えられる。
さらに、重水浸透後の重水分布から、重水が皮膚表面〜13μm付近までの範囲に浸透している様子が観測できた。なお、皮膚表面0〜4μm付近での表層に向けた重水濃度の低下は、重水浸透処理からラマン測定までの間に、重水が揮発したためと推察される。
このように、重水分布と軽水分布を区別して観察することにより、皮膚における水分の挙動に関する情報量が飛躍的に向上する。
図7の結果からは、皮膚表面から5μmにかけての水分濃度が上昇していることは確認できるが、それ以上の考察には困難である。
このように、重水を用いて、体内にもともと存在していた水と、体外から進入した水とを区別することにより、皮膚内部における水の動態を詳細に把握することができる。
健常男性(40歳代)の前腕内側部に重水(40℃)を満たした円筒状のカップを30分間接触させた。その後カップを外し、皮膚上に残っている重水を軽くタオルで除いた後、速やかに前腕内側のラマンスペクトルを深さ方向(Z方向)と水平方向(X方向)の2次元にて連続スキャンで測定した。ラマンスペクトル測定条件は以下のとおりである。
<測定条件>
装置:顕微ラマン分光器 ナノファインダー(商品名、東京インスツルメンツ製)
対物レンズ:100×、NA1.3
レーザー:633nm、8mW(試料上)
積算時間:1s/1点
ピンホール径:150μm
回折格子:150gr/mm
深さ方向(Z)のスキャン間隔:2μm
深さ方向(Z)のスキャン幅:40μm(21点)
水平方向(X)のスキャン間隔:2μm
水平方向(X)のスキャン幅:40μm(21点)
合計測定点数:441点
総積算時間:約8分
まず、軽水は深部ほど濃度が高く、重水は表層ほど濃度が高いことがわかった。また、重水の多い部位では軽水が少ないことがわかった。これは、皮膚外部から重水を浸透させたことを考えれば当然の結果である。さらに、重水が皮膚の表面から深さ40μm付近まで浸透している領域と、20μm程度までしか浸透していない領域があることがわかった。
Claims (4)
- 皮膚内部の水分量の測定方法であって、重水を浸透させた皮膚のラマンスペクトルを測定し、得られたラマンスペクトル中の重水の信号強度より測定する皮膚水分量の測定方法。
- 前記ラマンスペクトル中の重水の信号強度と蛋白質の信号強度の比に基づき重水分量を算出する、請求項1記載の測定方法。
- さらに、前記ラマンスペクトル中の軽水の信号強度と蛋白質の信号強度の比に基づき軽水分量を測定する、請求項1または2記載の測定方法。
- 請求項1〜3のいずれか記載の測定方法により、皮膚のラマンスペクトルを表面からの深さ方向及び/または水平方向に変えて測定し、皮膚内部の水分分布を測定する方法。
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