BRPI1003932A2 - teste de microlesão e uso do mesmo - Google Patents

Abstract

teste de microlesão e uso do mesmo a presente invenção refere-se a um método para testar a pele humana e outros tecidos biológicos, e o uso do mesmo para testar in vivo os efeitos de ingredientes e composições em tais tecidos

Description

Relatório Descritivo da Patente de Invenção para "TESTE DE MICROLESÃO E USO DO MESMO".

Campo da Invenção A presente invenção refere-se a um método para testar a pele humana e outros tecidos biológicos, e ao uso in vivo do mesmo para testar os efeitos de ingredientes e composições em tais tecidos.

ANTECEDENTES DA INVENÇÃO

Testes de produtos cosméticos em pele humana têm sido sempre um componente vital à pesquisa básica e à aplicada. Existe sempre alguma preocupação com testes em pele humana, já que um efeito adverso pode resultar em uma alteração da pele, como descoloração ou cicatriz. Por esta razão, testes em animais tipicamente precedem os testes na pele humana. O desenvolvimento de sistemas alternativos de testes em pele humana é uma prioridade crescente devido aos recentes regulamentos da Comunidade Européia proibindo o uso de animais em testes de ingredientes cosméticos. Vários métodos foram desenvolvidos para examinar, in vivo, tecidos biológicos, particularmente a pele (devido à sua fácil acessibilidade), com o uso de ferramentas macroscópicas. Por exemplo, protocolos aprovados para testar os efeitos de radiação UV na pele exigem que uma área de 1 cm2 da pele seja exposta à radiação UV. Testes de punctura para avaliar a sensibilidade a alérgenos são, também, uma prática comum em clínicas de alergia.

Algumas técnicas microscópicas foram desenvolvidas para o tratamento do envelhecimento da pele, isto é, redução de rugas, para minimizar o dano à epiderme e reduzir o risco de efeitos colaterais, complicações e o tempo de recuperação pós-procedimento. Estas técnicas envolvem induzir um conjunto de lesões microscópicas na superfície da pele, que são rapidamente re-epitelizadas pelo tecido não danificado circundante, poupando a epiderme. Um laser com comprimento de onda no infravermelho é frequentemente usado, e a radiação é absorvida pelos componentes aquosos no interior do tecido com áreas limitadas e controladas de fotocoagulação que estimulam uma resposta terapêutica profunda na derme. Isto resulta em uma produção aumentada de neocolágeno e melhora na aparência e textura da pele. É conhecido na técnica o uso de uma variedade de técnicas de formação de macro e microimagens para avaliar as propriedades da pele humana. Entretanto, a aplicação de lesões microscópicas com o propósito de análise da pele, em vez de tratamento de características, como rugas, não foi realizada até a presente invenção.

Existe uma necessidade contínua por um teste na pele humana que minimize o dano visível e permanente à pele que seja preditivo do efeito na atividade metabólica e na integridade estrutural da pele. As requerentes descobriram na presente invenção um método eficaz para testar a pele humana caracterizado pela combinação de aplicação de uma ou mais microle-sões a uma área da pele humana e monitoração dessa área com o uso de uma técnica de formação de imagens.

SUMÁRIO DA INVENÇÃO A presente invenção refere-se a um método para testar a pele humana, que compreende provocar pelo menos uma microlesão em uma área da pele humana e monitorar a área com o uso de uma técnica de formação de imagens.

Em uma segunda modalidade, a presente invenção refere-se a um método para determinar os efeitos de uma composição aplicada topica-mente em pele humana, que compreende, em sequência, aplicar a composição a uma área da pele humana; provocar pelo menos uma microlesão na área; e monitorar a área com o uso de uma técnica de formação de imagens.

Em uma terceira modalidade, a presente invenção apresenta um método para determinar os efeitos de uma composição para uso tópico em pele humana, que compreende, em sequência, provocar pelo menos uma microlesão a uma área da pele humana; aplicar a composição na área; e monitorar a área com o uso de uma técnica de formação de imagens.

Breve Descrição dos Desenhos As figuras 1A e 1B são imagens de polarização cruzada de mi- crolesões descritas no exemplo 1.

As figuras 2A, 2B, 2C, 2D e 2E são imagens microscópicas confocais das microlesões descritas no exemplo 1 após 30 minutos. A figura 2F mostra o perfil da intensidade em função da profundidade de três regiões diferentes de uma pilha de imagens microscópicas confocais de um indivíduo: área tratada, área circundante e área não tratada, conforme descrito no exemplo 1.

As figuras 3A, 3B, 3C e 3D são imagens de polarização cruzada de lesões microscópicas descritas no exemplo 1 adquiridas com o uso de vídeo microscopia 30 minutos, 2 dias, 4 dias e 23 dias após o tratamento. A figura 4 ilustra as imagens microscópicas confocais e perfis de profundidade x intensidade de lesões microscópicas mostradas nas figuras 3A, 3B, 3C e 3D.

As figuras 5A, 5B e 5C são perfis normalizados de intensidade em função da profundidade de um indivíduo de 25 anos de idade, um indivíduo de 53 anos de idade e um indivíduo de 30 anos de idade em diferentes pontos no tempo após o tratamento, como descrito no exemplo 1. A figura 6 é um perfil um espectro do simulador solar em comparação com o padrão COLIPA, como descrito no exemplo 2.

As figuras 7A e 7B são imagens de polarização cruzada de sítios irradiados com UV através de fibras óticas e fendas circulares, como descrito no exemplo 2. A figura 8 ilustra imagens microscópicas de polarização cruzada (magnificação de 20 x a 400x) tomadas em diferentes dias após a radiação UV de um indivíduo, conforme descrito no exemplo 2. A figura 9 mostra imagens microscópicas de polarização cruzadas tomadas 0, 1, 6 e 10 dias após irradiação UV de um indivíduo, conforme descrito no exemplo 2. A figura 10A mostra imagens de polarização cruzada de um fo-toteste UV realizado com o uso do método de acordo com a invenção e um método-padrão recomendado pela COLIPA, conforme descrito no exemplo 3. A figura 10B mostra imagens de polarização cruzada de um fo-toteste UV realizado com o uso do método de acordo com a invenção e uma aplicação do método-padrão recomendado pela COLIPA de um filtro solar, conforme descrito no exemplo 3.

DESCRIÇÃO DETALHADA

Embora a invenção seja descrita primariamente como aplicável a testes em pele humana, os métodos e sistemas descritos aqui também podem ser usados para testar outros tecidos biológicos humanos e animais, como cabelo, lábios, mucosa oral e órgãos internos (esôfago, artérias, intestinos, fígado, etc.), por exemplo, opcionalmente com o uso de fibras óticas ou técnicas laparoscópicas/endoscópicas. A invenção apresenta um método para testar pele humana, que compreende provocar pelo menos uma microlesão em uma área da pele humana e monitorar a área com o uso de técnica de formação de imagens.

Em uma modalidade, o método pode ser usado para avaliar os efeitos de ingredientes ou componentes em pele humana. Por exemplo, o método pode ser usado para testar alergia ou testar a eficácia de produtos e fármacos cosméticos. Os efeitos de produtos antiacne, produtos antienve-Ihecimento, produtos de filtro solar, ou produtos de cura de lesões, ou similares, podem ser testados de acordo com a invenção.

Consequentemente, a invenção apresenta, também, um método para determinar os efeitos de uma composição para uso tópico, que compreende aplicar a composição a uma área da pele humana, provocar pelo menos uma microlesão na área e monitorar a área com o uso de técnica de formação de imagens. A aplicação da composição pode ser feita antes ou após a aplicação da microlesão na pele.

Para uso na presente invenção, o termo "micro" significa ter uma dimensão máxima de menos que cerca de 1.000 mícrons, como menos que cerca de 500 mícrons. Por exemplo, dimensões na faixa de cerca de 0,5 pm a cerca de 5 pm são encontradas no nível subcelular, dimensões de cerca de 5 pm a 50 pm são encontradas no nível de células inteiras, e dimensões de cerca de 50 pm a cerca de 1.000 pm estão no nível de células múl- tiplas.

Para uso na presente invenção, o termo "microlesão" significa uma lesão ou ferimento de tamanho microscópico. Tal lesão ou ferimento pode ser causado por, por exemplo, perfurações, cortes, queimaduras, irradiações, ou exposição a alérgenos. Exemplos de microlesões incluem, mas não se limitam a, microlesões por laser, microirradiação por UV, micro-injeção, e perfurações microscópicas. Microlesões na forma de exposição a alérgenos podem ser causadas com o uso de tubos capilares ou microagu-Ihas para gerar os alérgenos Microlesões na forma de queimaduras podem ser causadas por sondas com o uso de sondas microscópicas de aquecimento ou geradores de radiofrequência. Microlesões na forma de perfurações ou cortes podem ser geradas com o uso de microagulhas. O formato das microlesões não é crítico. Elas são, de preferência, desconectadas e suficientemente espaçadas de modo que cada uma pode ser monitorada individualmente. O espaçamento entre as microlesões pode ser de pelo menos cerca de 10 μηι, por exemplo cerca de 10 μιτι a cerca 1.000 pm, mas pode também ser menor, isto é, menos que cerca de 10 μιτι, se interações entre uma pluralidade de microlesões são analisadas. O espaçamento poder ser regular ou irregular. De preferência, o espaçamento é regular, isto é, em intervalos fixos e uniformes.

As microlesões são monitoradas com o uso de uma técnica de formação de imagens. A técnica de formação de imagens pode ser uma técnica de formação de imagens microscópicas ou macroscópicas. A técnica de formação de imagens é usada para avaliar os efeitos das microlesões nas alterações morfológicas ou fisiológicas do tecido sendo testado. A monitoração pode compreender uma única análise de uma área do tecido com o uso de uma imagem, ou múltiplas análises de uma área do tecido com o uso de múltiplas imagens geradas com o uso de uma ou mais técnica de formação de imagens. Por exemplo, a monitoração pode compreender a análise ou comparação de múltiplas imagens sequênciais de uma área de tecido coletadas em intervalos de tempo predeterminados. Técnicas adequadas de formação de imagens incluem, mas não se limitam a, microscopia confocal, formação de imagens digitais, mi-croscopia de fluorescência, topografia de coerência ótica (OCT), microscopia de fluorescência de dois-fótons, microscopia de geração de segundo harmônico, microscopia de espalhamento Raman anti-Stokes coerente (CARS), e formação de imagens espectrais. De preferência, a técnica de formação de imagens é uma técnica de formação de imagens microscópicas. O método da presente invenção é vantajoso porque é preditivo dos efeitos de microlesões na pele (ou outros tecidos), mas com mínimo dano ou efeito adverso à pele devido ao tamanho extremamente pequeno da lesão. O método fornece rápida recuperação, mínimo desconforto ao indivíduo do teste, e pode ser usado em diferentes partes do corpo, incluindo as áreas sensíveis do rosto e lábios, ou em órgãos internos.

Conforme descrito na presente invenção, um uso particularmente adequado dos presentes métodos é para a avaliação da eficácia de produtos para tratamento de pele. Por exemplo, uma área da pele pode ser tratada com um filtro solar e uma outra área da pele do mesmo indivíduo pode não ser tratada. Ambas as áreas da pele podem, então, ser expostas a microlesões na forma de irradiação UV. Após isso, imagens de ambas as áreas podem ser obtidas com o uso de uma técnica de formação de imagens e então as imagens podem ser comparadas para determinar o efeito do filtro solar.

De modo similar, os efeitos de composições de cura de lesões podem ser avaliados com o uso dos presentes métodos. Microlesões na forma de lesões de perfuração podem ser feitas com microlâminas em duas áreas da pele de um indivíduo. Uma área pode então ser tratada com uma composição para tratamento de lesões e a outra área pode ser deixada sem tratamento. As duas áreas podem então ser monitoradas para determinar o efeito da composição para tratamento de lesões, seja pela obtenção e comparação das imagens individuais de cada área, ou pela obtenção e comparação de uma série de imagens tomadas em períodos de tempo predeterminados durante o processo de cura.

Os métodos da presente invenção podem também ser úteis em testes de alergia. Com o uso de tubos capilares pequenos, pequenas quantidades de alérgenos podem ser aplicadas a uma área da pele para gerar uma microlesão na mesma. A pele pode ser monitorada com o uso de uma técnica de formação de imagens microscópicas para identificar sinais de uma reação alérgica, como inchaço, eritema, e similares.

Exemplos são apresentados abaixo para ilustrar, adicionalmente, a natureza da invenção e a maneira de executá-la. Entretanto, a invenção não deve ser considerada como sendo limitada aos detalhes mostrados. Exemplos Exemplo 1 Foram recrutados oito indivíduos saudáveis com peles tipo II a VI (classificação de Fitzpatrick) entre 27 e 57 anos de idade. A face volar do antebraço de cada indivíduo foi tratada com um conjunto de feixes de laser. Dois sítios foram tratados com dois fluxos radioativos diferentes, 40 mJ e 60 mJ por lesão microscópica, respectivamente. Cada sítio recebeu uma única linha de microexposições em uma seção da pele de 1 cm de comprimento a uma distância de aproximadamente -400 mícrons a partir do centro das zonas de tratamento microscópicas do indivíduo. Foi usada uma fina camada de óleo de bebê para assegurar um acoplamento entre a cabeça do laser e a superfície da pele.

Para avaliar o efeito a curto e longo prazo do tratamento, a resposta dinâmica do processo de cura da microlesão foi monitorada 30 segundos após o tratamento, 2 dias, 4 dias e 3 semanas após o tratamento, in vivo, com o uso de técnicas multimodais de formação de imagens microscópicas e macroscópicas, incluindo vídeo microscopia (KH-300, Hirox, Japão) e microscopia confocal de varredura a laser, modo reflectante, (Vi-vascan 1500, Lucid, Rochester, NY, EUA) com uma potência operacional de menos de 20 mW, resolução lateral de aproximadamente 1 mícron e resolução axial de aproximadamente -5 mícrons a 785 nm.

As figuras 1A e 1B mostram uma imagem de polarização cruzada com o uso de vídeo microscopia e a imagem microscópica confocal, modo de reflectância, correspondente para um dos indivíduos. A polarização cruzada removeu de modo eficaz o brilho da superfície e realçou as características de pigmentação e vasculatura da superfície. As microlesões apai„ ceram como uma linha de manchas marrom-escuro, e sua imagem microscópica confocal correspondente mostraram-se brilhantes na área ferida a aproximadamente 80 mícrons abaixo da superfície da pele, indicando espa-Ihamento na área da microlesão.

Para monitorar o processo de cura de lesões das microlesões individuais e quantificar o processo de cura no nível microscópico, coletaram-se perfis de intensidade dependente de profundidade para cada lesão microscópica, as imagens microscópicas confocais da zona circundante colateralmente danificada e da área normal. Para minimizar o efeito de movimento durante a captura, as imagens foram primeiro corregistradas. O perfil de intensidade de cada área foi obtido usando-se a intensidade média na região de interesse de cada profundidade.

As figuras 2A, 2B, 2C, 2D, 2D e 2E ilustram imagens microscópicas confocais da face volar do antebraço de uma mulher caucasiana de 27 anos de idade, aproximadamente 30 minutos após o tratamento com laser (60 mJ por microlesão). A figura 2F mostra o perfil correspondente de intensidade x profundidade. Nos 10 a 15 primeiros mícrons abaixo da superfície da pele, comparado com a área circundante e a área normal, houve apenas um leve aumento na reflexão na zona microtérmica tratada, indicando o dano mínimo à pele na superfície. Entre 20 e 50 mícrons abaixo da superfície da pele, houve um aumento significativo na reflexão na microzona tratada. O aumento da intensidade na microzona pode ter sido devido ao inchaço, o que ocasionou a divergência do índice de refração a partir da camada superficial. A partir de 50 mícrons e mais profundamente na derme, houve uma leve diminuição na reflexão na microlesão tratada, sugerindo que o tratamento com laser pode ter desnaturado o colágeno na derme. O perfil intensidade x profundidade diferenciou claramente três áreas de interesse e fornece um método quantitativo para avaliar as alterações como uma resposta a microlesão.

As figuras 3A, 3B, 3C e 3D mostram as imagens de polarização cruzada obtidas por vídeo microscopia de um indivíduo em resposta a mióro-lesões a 60 mJ por lesão microscópica a 30 minutos, 2 dias, 4 dias e 23 diâs, após o tratamento na face volar do antebraço, respectivamente. Isto permite um entendimento das alterações dinâmicas de estruturas celulares e a matriz de colágeno. As microlesões foram invisíveis imediatamente após o tratamento, com leve edema e inflamação. As microzonas começaram a aparecer como microlesões de cor marrom dentro de 48 horas após o tratamento. As microlesões gradualmente se cicatrizaram e as microzonas das microlesões se tornaram invisíveis após 3 semanas. A figura 4 mostra imagens microscópicas confocais e perfis correspondentes de intensidade x profundidade do mesmo indivíduo a 30 minutos, 2 dias, 4 dias e 23 dias após o tratamento. A figura 4(a) mostra o perfil representativo da intensidade x profundidade de uma microlesão tratada, da zona danificada colateral circundante e da área normal em pontos no tempo específicos. O perfil da pele normal reteve padrões similares ao longo do tempo. Comparado com a área normal, o perfil de intensidade x profundidade da microlesão tratada mostrou um aumento progresso na intensidade entre 20 e 100 mícrons abaixo da superfície até 4 dias após o tratamento, e então retornou ao padrão similar de pele normal após 3 semanas após o tratamento. Comparado com a pele normal, a zona danificada circundante colateral mostrou pouca alteração 30 minutos após o tratamento, então mostrou um aumento significativo em intensidade após 2 dias e 4 dias e então retornou ao normal após 23 dias. Os perfis de intensidade x profundidade também indicaram que houve mínima alteração na pele superficial nos 20 primeiros mícrons da superfície da pele, confirmando a observação clínica de dano mínimo à epiderme superficial. Os perfis de intensidade x profundidade forneceram uma medida quantitativa das alterações estruturais e celulares associadas.

Para compensar o declínio exponencial intrínseco na intensidade associada com o aumento da profundidade na microscopia confocal, os perfis de intensidade x profundidade das zonas de microlesão tratadas foram normalizados para aqueles da área normal. As figuras 5A. 5B e 5D mostram os perfis normalizados de intensidade x profundidade de indivíduos de diferentes idades em diferentes pontos no tempo após o tratamento (60 mJ por microlesão). Em geral, os perfis normalizados de intensidade x profundidade mostraram um pico e a posição do pico, primeiro deslocado para a profundidade maior e então para a profundidade mais superficial. O ponto de transição no tempo, quando a posição do pico deslocou e retornou para a profundidade mais superficial, foi dependente idade. Por exemplo, para um indivíduo de 25 anos de idade, o pico retornou à profundidade mais superficial 4 dias após o tratamento; enquanto que para um indivíduo de 30 anos, o pico retornou 9 dias após o tratamento e para um indivíduo de 53 anos, o pico retornou 13 dias após o tratamento. Isto sugere que indivíduos mais jovens têm uma taxa mais rápida de cura de lesões que indivíduos mais velhos, em concordância com observações clínicas. Um perfil normalizado de intensidade x profundidade pode ser usado como um método quantitativo para avaliar a taxa de cura de lesões em um nível celular microscópico. Exemplo 2 Microlesões por radiação ultravioleta (UV) de uma fonte de luz (LightCure 200, Hamamatsu) foram aplicadas à pele de um indivíduo com o uso de fibras óticas personalizadas (Multimode) ou orifícios (National Apertu-re, Inc., Salem, NH, EUA) de diâmetros microscópicos. Foram testados diâmetros de 50 mícrons, 200 mícrons e 500 mícrons. Os indivíduos receberam radiação com um simulador solar de radiação com irradiância na faixa de 20 a 50 mW/cm2 e doses na faixa de 0,5 a 3 DEM (dose eritematosa mínima. A fonte de luz do simular solar de radiação (280 a 400 nm) foi filtrada com uma espessura UG-11 de 1 mm e uma espessura WG320 (Schott) de 2 mm. Á figura 6 mostra o perfil espectral.

As fibras óticas foram colocadas cuidadosamente na pele durante todo o experimento de modo que a irradiação se limitou ao diâmetro da fibra/fenda. Fita adesiva de dupla face foi usada para fixar as fibras à pele. Técnicas multimodais de formação de imagens macroscópicas e microscópicas, como formação de imagens digitais de polarização cruzada, formação de imagens por fluorescência e excitação UV, formação de imagens espec- trais, vídeo microscopia (KH-300, Hirox, Japão) e microscopia confocâi jçie varredura a laser, modo de reflectância (Vivascan 1500, Lucid, Rochesteh NY, EUA), foram usados para avaliar o progresso da cura após a irradiação. Para monitorar as microlesões, as sondas/fendas óticas foram dispostas em uma linha. A figura 7 A mostra imagens de polarização cruzada de sítios irradiados tomados 24 horas (direta) e 48 (esquerda) após exposição do simulador solar e mostra o eritema da pele. Os sítios entre os parênteses e os quatro pontos receberam irradiações com uma linha de fibras de diâmetro 200 μιη a 152,5 mJ/cm2 e 254,1 mJ/cm2, respectivamente. O sítio nos dois pontos recebeu irradiação através de uma fenda de 0,5 mm a 24,4 mJ/cm2. A figura 7B mostra o nível de eritema das irradiações com a sonda de fibra ótica de 200 um (topo) e a sonda de fibra ótica circular de 2 mm de diâmetro (parte inferior). As doses para a sonda de fibra ótica de 200 um foram 60, 120, 240 e 400 mJ/cm2 da esquerda para a direita, e 120 e 240 mJ/cm2 para a sonda de fibra ótica circular com 2 mm de diâmetro. A formação de imagens microscópicas (HiScope) tomadas em diferentes dias após a irradiação na pele foi usada para rastrear o desenvolvimento das microlesões durante um período de tempo prolongado em várias ampliações óticas e é mostrada na figura 8. A figura 9 mostra imagens similares tomadas em pontos de tempo sequenciais após a irradiação. São ilustrados os diferentes aspectos das microlesões como eritema imediatamente e em 24 horas, e pigmentação em 6 e 11 dias após a radiação. Exemplo 3 O desempenho do filtro solar com fato de proteção solar FPS 48 foi avaliado in vivo, de acordo com a invenção, como se segue. Um simular solar do mesmo tipo descrito no exemplo 2 foi usado para aplicar lesões microscópicas de radiação UV em incrementos de 25%. Primeiro, a pele foi testada sem filtro solar para determinar a DEM para o indivíduo. A figura 10A mostra os resultados. Este teste foi feito com uma fibra de microlesão e, para comparação, com uma fibra regular de fototeste tendo 8 mm de diâmetro, para comparação, como recomendado pelo padrão COLIPA. Foram aplica- das doses de 15,5, 12,4, 9,9, 7,9, 6,3, e 5,1 mJ/cm2 para os sítios 1 a 6, respectivamente. A DEM mínima determinada foi de 9,9 mJ/cm2 (sítio 3). O filtro solar foi então aplicado uniformemente (2 ml/mm2) e a pele foi irradiada com doses 470, 381, 304,8, mJ/cm2 para os sites 1 a 3, respectivamente (figura 10B). Os sítios "1a", "2a" e "3a" foram irradiados com o uso de uma fibra de 8 mm de diâmetro e os sítios "1b", "2b" e "3b" foram irradiados com o uso de uma fibra de microlesão. A DEM com o filtro solar determinada foi de 470 mJ/cm2 (sítio 1). O FPS in vivo pode ser calculado como 470/9,9 = 47,5, que se correlaciona muito bem com o valor nominal de 48.

Conforme demonstrado por este exemplo, o método da invenção pode ser usado para predizer exatamente, in vivo, o valor de FPS de uma composição de filtro.

Claims (16)

1. Método para testar a pele humana, que compreende: provocar pelo menos uma microlesão em uma área da pele humana; e monitorar a área com o uso de uma técnica de formação de imagens.

2. Método, de acordo com a reivindicação 1, em que a técnica de formação de imagens é uma técnica de formação de imagens microscópicas.

3. Método, de acordo com a reivindicação 1, em que a técnica de formação de imagens é selecionado do grupo que consiste em microsco-pia confocal, formação de imagens digitais, microscopia de fluorescência, tomografia de coerência ótica, microscopia de fluorescência de dois-fótons, microscopia de geração de segundo harmônico, microscopia de espalha-mento Raman anti-Stokes coerente, e formação de imagens espectrais.

4. Método, de acordo com a reivindicação 1, em que a microlesão tem uma dimensão máxima de menos de cerca de 500 mícrons.

5. Método, de acordo com a reivindicação 1, no qual pelo menos duas microlesões espaçadas por pelo menos 10 mícrons são aplicadas à área.

6. Método, de acordo com a reivindicação 1, em que a microlesão é causada por uma ação selecionada do grupo que consiste em perfurações, cortes, queimaduras, irradiação, e exposição a alérgenos.

7. Método para determinar os efeitos de uma composição aplicada topicamente em pele humana, que compreende, em sequência: aplicar a composição a uma área da pele humana; provocar pelo menos uma microlesão na área; e monitorar a área com o uso de uma técnica de formação de imagens.

8. Método, de acordo com a reivindicação 7, em que a técnica de formação de imagens é selecionada do grupo que consiste em microscopia confocal, formação de imagem digital, microscopia de fluorescência, to- mografia de coerência ótica, microscopia de fluorescência de dois fótons, microscopia de geração de segundo harmônico, microscopia de espalha-mento Raman anti-Stokes coerente, e formação de imagens espectrais.

9. Método, de acordo com a reivindicação 7, em que a microle-são tem uma dimensão máxima de menos de cerca de 500 mícrons.

10. Método, de acordo com a reivindicação 7, em que pelo menos duas microlesões espaçadas pelo menos 10 mícrons são aplicadas à área.

11. Método, de acordo com a reivindicação 7, em que a micro-lesão é causada por uma ação selecionada do grupo que consistem em perfurações, cortes, queimaduras, irradiação e exposição a alérgenos.

12. Método para determinar os efeitos de uma composição de uso tópico em pele humana, que compreende, em sequência: provocar pelo menos uma microlesão a uma área da pele humana; aplicar a composição à área; e monitorar a área com o uso de uma técnica de formação de imagens.

13. Método, de acordo com a reivindicação 12, em que a técnica de formação de imagens é selecionada do grupo que consiste em microscopia confocal, formação de imagens digitais, microscopia de fluorescência, tomografia de coerência ótica, microscopia de fluorescência de dois fótons, microscopia de geração de segundo harmônico, microscopia de es-palhamento Raman anti-Stokes coerente, e formação de imagens espectrais.

14. Método, de acordo com a reivindicação 12, em que a microlesão tem uma dimensão máxima de menos de cerca de 500 mícrons.

15. Método, de acordo com a reivindicação 12, em que pelo menos duas microlesões espaçadas pelo menos 10 mícrons são aplicadas na área.

16. Método, de acordo com a reivindicação 12, em que a microlesão é causada por uma ação selecionada do grupo que consiste em perfu- rações, cortes, queimaduras, irradiação e exposição a alérgenos.