JP5794695B2 - 多弁咲きシクラメンの生産方法 - Google Patents
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Description
一般に「八重咲き」と呼ばれる花は、花弁の内側の雄しべや雌しべが並んでいる場所にさらに多くの花びらが並んで、花弁だけで花が構成されているように見える状態を指す。
しかしながら、シロイヌナズナはAG遺伝子を1種類のみ有する花卉であり、複数のAG遺伝子を有する花卉とは、AG遺伝子の働きが異なると考えられる。実際、シロイヌナズナのAGタンパク質と機能性ペプチドとが融合したキメラタンパク質は、トレニアにおいて花弁数を増加させることができなかったことが報告されている(非特許文献2)。また、複数のAG遺伝子を有する花卉における各AG遺伝子の機能は、花卉の種類により異なることも知られている。
[1]シクラメンの花器官の形態形成に関与する転写因子の機能を抑制する工程を少なくとも含む、花弁数が増加した多弁咲きシクラメン植物体の生産方法であって、
前記転写因子が下記(a)〜(c)のいずれかのアミノ酸配列を有する、生産方法。
(a)配列番号2のアミノ酸配列
(b)配列番号2のアミノ酸配列において1若しくは数個のアミノ酸が置換、欠失、挿入及び/又は付加されたアミノ酸配列
(c)配列番号2のアミノ酸配列と90%以上の同一性を有するアミノ酸配列
[2]シクラメンの花器官の形態形成に関与する転写因子であって下記記(d)〜(f)のいずれかのアミノ酸配列を有する転写因子の機能を抑制する工程をさらに含む、[1]に記載の生産方法。
(d)配列番号4のアミノ酸配列
(e)配列番号4のアミノ酸配列において1若しくは数個のアミノ酸が置換、欠失、挿入及び/又は付加されたアミノ酸配列
(f)配列番号4のアミノ酸配列と90%以上の同一性を有するアミノ酸配列
[3]シクラメンの花器官の形態形成に関与する転写因子の機能を抑制する工程を少なくとも含む、花弁数が増加した多弁咲きシクラメン植物体の生産方法であって、
前記転写因子が下記(d)〜(f)のいずれかのアミノ酸配列を有する、生産方法。
(d)配列番号4のアミノ酸配列
(e)配列番号4のアミノ酸配列において1若しくは数個のアミノ酸が置換、欠失、挿入及び/又は付加されたアミノ酸配列
(f)配列番号4のアミノ酸配列と90%以上の同一性を有するアミノ酸配列
[4]シクラメンの花器官の形態形成に関与する転写因子の機能を抑制する工程を少なくとも含む、花弁数が増加した多弁咲きシクラメン植物体の生産方法であって、
前記転写因子が下記(d)〜(f)のいずれかのアミノ酸配列を有し、
前記転写因子の機能が抑制されるシクラメンが、シクラメンの花器官の形態形成に関与する下記(a)〜(c)のいずれかのアミノ酸配列を有する転写因子の機能が抑制されているシクラメン突然変異体である、生産方法。
(a)配列番号2のアミノ酸配列
(b)配列番号2のアミノ酸配列において1若しくは数個のアミノ酸が置換、欠失、挿入及び/又は付加されたアミノ酸配列
(c)配列番号2のアミノ酸配列と90%以上の同一性を有するアミノ酸配列
(d)配列番号4のアミノ酸配列
(e)配列番号4のアミノ酸配列において1若しくは数個のアミノ酸が置換、欠失、挿入及び/又は付加されたアミノ酸配列
(f)配列番号4のアミノ酸配列と90%以上の同一性を有するアミノ酸配列
[5]前記転写因子と、転写因子を転写抑制因子に転換する機能性ペプチドとを融合させたキメラタンパク質を用いて、前記転写因子の機能を抑制する、[1]〜[4]のいずれかに記載の生産方法であって、
前記機能性ペプチドが、配列番号21のアミノ酸配列を有するペプチドである、生産方法。
[6][1]〜[5]のいずれかに記載の生産方法により生産されたシクラメン植物体。
(1)シクラメンの花器官の形態形成に関与する転写因子
本発明において「シクラメンの花器官の形態形成に関与する転写因子」とは、シクラメンの花器官の形成過程において花器官の形態に影響を与える遺伝子の発現を制御する転写因子であり、雄しべや雌しべ等の花器官の形態形成に関与する遺伝子の発現を制御する転写因子であることが好ましい。このような転写因子としては、MADSボックスファミリーのCクラスに属するAGAMOUS(AG)タンパク質が挙げられるが、中でも、AGAMOUS1(AG1)タンパク質やAGAMOUS2(AG2)タンパク質が好ましい。
また、AG1タンパク質は、配列番号1の塩基配列における111番目〜851番目の塩基配列を有するDNAにコードされるタンパク質であることが好ましく、配列番号1の塩基配列における111番目〜851番目の塩基配列と相補的な塩基配列からなるDNAにストリンジェントな条件下でハイブリダイズするDNAの塩基配列を有するDNAにコードされるタンパク質であってもよい。
また、AG2タンパク質は、配列番号3の塩基配列における87番目〜830番目の塩基配列を有するDNAにコードされるタンパク質であることが好ましく、配列番号3の塩基配列における87番目〜830番目の塩基配列と相補的な塩基配列からなるDNAにストリンジェントな条件下でハイブリダイズするDNAの塩基配列を有するDNAにコードされるタンパク質であってもよい。
本発明において、シクラメンの花器官の形態形成に関与する転写因子は、シクラメン植物体内においてその機能が抑制される。前記転写因子の機能を抑制する方法に特に制限はなく、例えば、転写抑制因子をシクラメン植物体に導入する方法、前記転写因子をコードする遺伝子を破壊する方法、RNA干渉(RNAi)などにより前記転写因子をコードする遺伝子の発現を抑制する方法が挙げられるが、転写抑制因子を植物体内に導入する方法が好ましい。転写抑制因子としては、例えば、転写因子と、転写因子を転写抑制因子に転換する機能を有する機能性ペプチドとを融合させたキメラタンパク質が好ましい。該キメラタンパク質をコードするDNAを植物体内に導入し、植物体内で該キメラタンパク質を生産させ、これにより転写因子の機能を抑制することができる。
上記各タンパク質は、カルボキシル末端側の領域に、アスパラギン酸−ロイシン−アスパラギンを含むモチーフ(DLNモチーフ)を有し、転写抑制転換ペプチドとして機能する。上記各タンパク質の部分ペプチドはDLNモチーフを含む。
該キメラタンパク質をコードするDNA(キメラDNA)は、シクラメンの花器官の形態形成に関与する転写因子をコードするDNAと、転写抑制転換ペプチドをコードするDNAとを、該転写因子と転写抑制転換ペプチドとの融合タンパク質をコードするように連結することで得ることができる。
また、転写抑制転換ペプチドをコードするDNAは、既知の転写抑制転換ペプチドをコードするDNAの塩基配列に基づき通常の方法で作製したプライマー対を用いて、転写抑制転換ペプチドが由来する植物のcDNA又はゲノミックDNAを鋳型として通常の方法でPCRを行うことにより得ることができる。また、上記転写因子をコードするDNAは、公知の方法により化学合成して得ることもできる。
上記キメラDNAは、シクラメンの花器官の形態形成に関与する転写因子をコードするDNAと転写抑制転換ペプチドをコードするDNAとを連結するための付加的な塩基配列を含んでいてもよい。また、上記キメラDNAは、トリプレットの読み枠を調整するための塩基配列などの付加的な塩基配列を含んでいてもよい。
組換え発現ベクターは、プロモーター配列と、シクラメンの花器官の形態形成に関与する転写因子をコードする塩基配列と、転写抑制転換ペプチドをコードする塩基配列とを少なくとも含むベクターである。
前記組換え発現ベクターにおいては、ターミネーターを適当な位置に配置することにより、植物細胞に導入された後に、不必要に長い転写物を合成したり、強力なプロモーターがプラスミドのコピー数を減少させたりするような現象を防止することができる。
また、前記組換え発現ベクターは、さらにT−DNA領域を有していてもよい。T−DNA領域を有する組換え発現ベクターは、特にアグロバクテリウムを介して組換え発現ベクターをシクラメンに導入する場合に、シクラメンのゲノムDNA中への目的遺伝子の組み込み効率を高めることができる点で好ましい。
上述した組換え発現ベクターでシクラメン植物体を形質転換し、該細胞にキメラDNA発現カセットを導入することができる。
形質転換されるシクラメン植物体として、例えば、シクラメンの花、葉、根等の器官を構成する組織や細胞の他、カルス、不定胚、懸濁培養細胞等を挙げることができる。
上記組換え発現ベクターをシクラメン植物体に導入する方法に特に制限はなく、公知の方法を用いることができる。例えば、組換え発現ベクターを保持するアグロバクテリウムをシクラメンの組織や細胞等に感染させることでアグロバクテリウムが感染した細胞のゲノム中にキメラタンパク質の発現カセットを挿入する方法や、マイクロインジェクション法、エレクトロポレーション法(電気穿孔法)、ポリエチレングリコール法、パーティクルガン法、プロトプラスト融合法、リン酸カルシウム法等の、組換え発現ベクターを直接シクラメンの細胞内に導入する方法を用いることができる。
形質転換体の選抜方法に特に制限はなく、形質転換処理を施した植物体の、ハイグロマイシンやカナマイシン等の薬剤に対する耐性を指標として選抜してもよいし、形質転換処理を施した前記植物体を再生させて生育したシクラメンの花の形態を指標として選抜してもよい。
花の形態から選抜する例として、形質転換処理を施した前記植物体を再生させ、生育したシクラメンの花の形態を、形質転換していないシクラメンの花の形態と比較し、形質転換処理を施した植物体に由来するシクラメンにおいて、形質転換していないシクラメンに比べて花弁の数が増加しているシクラメンを選抜することが挙げられる。花の形態を指標とする選抜方法は、単に目視比較するだけで選抜が可能であり、また、花器官の形態の改変、特に花弁数の増加という本発明の効果そのものを確認することができる点で好ましい。
本発明の生産方法には、形質転換植物体に再生処理を施して該形質転換植物体から生育したシクラメンを得、このシクラメンから有性生殖又は無性生殖により花の形態が改変された子孫を得る工程が含まれていてもよい。また、形質転換細胞から再生させたシクラメンやその子孫から植物細胞や、種子、果実、株、カルス、塊茎、切穂、塊等の繁殖材料を得て、これらを再生させて、再度、花弁を有する生育したシクラメンを得る工程が含まれていてもよい。すなわち、本発明の生産方法には、形質転換植物体を繁殖させる工程(量産工程)が含まれていてもよい。
(1)シクラメンの蕾由来の全RNAの調製
シクラメン(品種:フレグランスミニ)の蕾(がく、花弁、雄ずい、雌ずい)0.1gを液体窒素存在下で凍結後、凍結した蕾を破砕機MM300(QIAGEN社製)を用いて粉砕した。この粉砕物に0.75mlの2×CTAB溶液(0.1M Tris‐HCl(pH9.5)、20mM EDTA、1.4M NaCl、4% β−メルカプトエタノール、2%臭化セチルトリメチルアンモニウム)を加えて撹拌し、65℃で10分間インキュベートした後、クロロフォルム抽出操作を2回行い核酸を回収した。得られた核酸抽出液に等量のイソプロパノールを加え、21,000g、4℃で10分間遠心分離を行って核酸を沈殿させ、これを0.8mlのTE(10mM Tris−HCl(pH8.0)、1mM EDTA)に溶解した。この溶解液に0.2mlの10M 塩化リチウム溶液を加え、氷上に2時間静置後、21,000g、4℃で10分間遠心分離することで全(トータル)RNAを沈澱させた。沈殿した全RNAを蒸留水に溶解した後、フェノール/クロロフォルム抽出を行い、得られた核酸画分をエタノール沈殿操作に供することで全RNAを精製した。沈殿した全RNAを適当量のTEに溶解し、その濃度を分光光度計により測定したところ、収量が11.5μgであった。以降の実験に用いるため、RNA溶液の濃度を1mg/mlに調整した。
(i)3’RACE法を用いて、シクラメンのAGAMOUS転写因子(以下AGとする。)をコードする遺伝子のcDNA断片をクローニングするために、シロイヌナズナ、ガーベラ、ペチュニア及びバラのAG遺伝子のアライメントをもとに縮重プライマーの設計を行った。配列番号45の塩基配列からなるオリゴヌクレオチド及び配列番号46の塩基配列からなるオリゴヌクレオチド(塩基配列中のKはG又はTを表し、YはT又はCを表し、MはA又はCを表し、RはA又はGを表す)を、それぞれ1stPCR用プライマー、NestedPCR用プライマーとして設計し、DNA合成サービス(北海道システムサイエンス(株))を利用してオリゴヌクレオチドを作製した。以下、オリゴヌクレオチドの作製は、DNA合成サービス(北海道システムサイエンス(株))を利用した。
前記NestedPCR後の反応液の5μlを電気泳動し、設計されたプライマーから想定されるサイズのDNAの増幅を確認した。
その結果、前記増幅産物はポリAシグナルを含む826bpの塩基配列を含むことが確認された。決定された塩基配列をこれまで明らかにされているAG遺伝子ファミリーの塩基配列と比較した結果、上記増幅反応産物はシクラメン由来のAG遺伝子の3’側領域をコードするDNA断片である事が強く示唆され、該DNA断片をCpAG3’と命名した。
(i)5’RACE法を用いて前記CpAG3’を含む遺伝子における上流域をクローニングためのプライマーの設計を行った。配列番号47の塩基配列からなるオリゴヌクレオチド(塩基配列中のKはG又はTを表し、YはT又はCを表し、MはA又はCを表し、RはA又はGを表す)及びCpAG3’の塩基配列に基づき設計した配列番号48の塩基配列からなるオリゴヌクレオチドを、それぞれ1stPCR用プライマー及びNestedPCR用プライマーとして作製した。
前記NestedPCR後の反応液を5μl電気泳動し、設計されたプライマーから想定されるサイズのDNAの増幅を確認した。
その結果、538bp及び482bpの塩基配列を含む2種類のシクラメンAG遺伝子の5’側上流域をコードすると思われるDNA断片が確認され、それぞれCpAG5’−1及びCpAG5’−2と命名した。
前記(2)及び(3)で決定されたCpAG3’並びにCpAG5’−1及びCpAG5’−2の塩基配列を解析するために、ソフトウエアGenetyx(ゼネティクス社製)を用い、塩基配列アラインメント(Alignment)ファイルをソフトウェアの初期設定条件で作成した。その結果、CpAG5’−1とCpAG5’−2は93%の塩基配列の同一性を有していた。また、CpAG3’遺伝子の塩基配列はCpAG5’−1遺伝子の塩基配列と部分的に一致し、塩基配列を結合させたところ一つのオープンリーディングフレーム(ORF)をもつ遺伝子を構成することが明らかとなった。この単一のORFをもつ遺伝子をCpAG1遺伝子と命名した。このCpAG1遺伝子は、全長1083塩基、741塩基からなるORFを有するDNA配列を含む。また、CpAG5’−2を含む遺伝子をCpAG2遺伝子と命名した。
CpAG1遺伝子及びCpAG2遺伝子のORFをクローニングする目的で、配列番号49の塩基配列からなるオリゴヌクレオチド及び配列番号50の塩基配列からなるオリゴヌクレオチドを、それぞれフォワードプライマー及びリバースプライマーとして作製した。
次に前記(1)で得られた全RNAの1μgをテンプレートとして、逆転写酵素PrimeScript Reverse Transcriptase(タカラバイオ社製)を用い、1μlのオリゴ(dT)Oligo(dT)12−18 primer(インビトロジェン社製)と逆転写酵素に付属の試薬を用いて逆転転写反応液20μlを調製して逆転写反応を行った。逆転写反応は、該逆転写反応液を30℃で10分間、50℃で30分間、99℃で5分間、4℃で5分間、順次インキュベートすることで行った。
さらに形質転換大腸菌4クローンを選抜し、その増幅産物DNA断片の塩基配列解析を行った結果、4クローンは全てCpAG1遺伝子のORFを有していた。
上記方法によりCpAG1遺伝子はクローニングできたがCpAG2遺伝子はクローニングできなかった。その理由として、CpAG2遺伝子の3’側非翻訳領域の配列がCpAG1遺伝子と大きく異なっていることが考えられた。
(i)CpAG2遺伝子の3’側領域をクローニングするために、前記(4)で作成したCpAG1遺伝子の塩基配列と、CpAG5’−2の塩基配列とのアライメントから配列同一性の低い部分を選択し、プライマーとして、配列番号51及び配列番号52の塩基配列からなる2種類のオリゴヌクレオチドを作製した。
前記(3)と同様に5’RACEを行い、クローニングした増幅産物の塩基配列を決定した。その結果、クローニングされたDNA断片は517bpの塩基配列を含むcDNAであることが確認された。
(7)CpAG1,2遺伝子の塩基配列解析
CpAG1遺伝子とCpAG2遺伝子のORFの塩基配列は、90%の同一性を有し、また推定アミノ酸配列においても、90%の同一性を示した。該推定アミノ酸配列を既知のAG遺伝子のアミノ酸配列と比較したところ、高い同一性を示し、CpAG1遺伝子及びCpAG2遺伝子がAG転写因子のオーソログ遺伝子であることが推測された。
また、シクラメンのCpAG2遺伝子は1073bpの塩基配列からなり(配列番号3)、その内部には単一のオープンリーディングフレームである744個の塩基配列を含む(配列番号3の塩基番号第87番目〜第830番目の塩基配列)。該オープンリーディングフレームは、配列番号4に示される248個のアミノ酸残基からなるタンパク質をコードしている。
CpAG1遺伝子及びCpAG2遺伝子のcDNAはBluescriptプラスミドベクターにサブクローニングされ、これを導入した大腸菌はEscherichia coli DH5α(CpAG−1、CpAG−2)と命名され、独立行政法人産業技術総合研究所 特許生物寄託センターを国際寄託当局として、2010年11月5日付で、受託番号FERM BP−11306及びFERM BP−11307として寄託されている。
(1)形質転換用ベクターを構築するためのベクターp35SGの作製
(i)配列番号21のアミノ酸配列からなる転写抑制転換ペプチド(SRDX)をコードし、3’末端に終止コドンTAAを持つように設計したポリヌクレオチド(配列番号60)及びその相補鎖(配列番号61)を合成し、70℃で10分間加温した後、自然冷却によりアニールさせて2本鎖DNAとした。
(i)試験例1で取得したCpAG1遺伝子から配列番号62の塩基配列からなるオリゴヌクレオチドと配列番号63の塩基配列からなるオリゴヌクレオチドをプライマーセットとして用いて、終止コドンを除くシクラメンCpAG1遺伝子のコード領域のみを含むDNA断片をPCRにて増幅した。
(i)試験例1で取得したCpAG2遺伝子から配列番号62の塩基配列からなるオリゴヌクレオチドと配列番号64の塩基配列からなるオリゴヌクレオチドをプライマーセットとして用いて、終止コドンを除くシクラメンCpAG2遺伝子のコード領域のみを含むDNA断片をPCRにて増幅した。
(iii)このプラスミドで大腸菌を形質転換し、プラスミドを調製して、塩基配列を決定し、順方向に挿入されたクローンを単離し、CpAG2遺伝子とSRDXをコードする遺伝子とが融合したキメラ遺伝子が組み込まれたベクターp35SCpAG2SRDXGを得た。
前記(3)、(4)で調製したベクターp35SCpAG1SRDXG及びp35SCpAG2SRDXGを利用し、35SCpAG1SRDXG及び35SCpAG2SRDXGのDNA断片を同時に保持する、ベクターp35SCpAG1SRDXG:35SCpAG2SRDXGを構築した。
前記(3)、(4)及び(5)で調製したベクター上にあるCaMV35Sプロモーター、キメラ遺伝子、Nos−ter等を含むDNA断片を、植物形質転換用ベクターpBIGCKH(独立行政法人産業技術総合研究所より入手)に組換えることにより、植物を宿主とする発現ベクターを構築した。具体的には、Gateway(登録商標)LR clonase(登録商標、インビトロジェン社製)を用いて以下の工程(i)〜(iii)のとおりに行った。
(ii)これらの溶液にLR clonase4.0μlを加えて25℃で60分間インキュベートした。続いて、proteinaseK2μlを加えて37℃で10分間インキュベートした。
(iii)これらの各溶液1〜2μlを別々に大腸菌(DH5α等)に導入し、ハイグロマイシン耐性を指標にして形質転換大腸菌を選抜した。
これにより、植物形質転換用ベクターp35CpAG1SRDX及びp35CpAG2SRDX、並びにp35SCpAG1SRDX:35SCpAG2SRDXを得た。
前記植物形質転換用ベクターp35CpAG1SRDX又はp35CpAG2SRDXを有する各大腸菌から該ベクターをプラスミドDNAとしてそれぞれ抽出して、各ベクターをそれぞれ、アグロバクテリウム・ツメファシエンス菌(EHA101)及びアグロバクテリウム・ツメファシエンス菌(LBA4404)にエレクトロポレーション法により導入した。また、p35CpAG1SRDX:35CpAG2SRDXをアグロバクテリウム・ツメファシエンス菌(LBA4404)に対してエレクトロポレーション法により導入した。ハイグロマイシンを含むLB培地上で、28℃、2日間静置培養することで、植物形質転換用ベクターp35CpAG1SRDXを保持するアグロバクテリウム・ツメファシエンス菌(EHA101)、植物形質転換用ベクターp35CpAG2SRDXを保持するアグロバクテリウム・ツメファシエンス菌(LBA4404)、並びにp35CpAG1SRDX:35CpAG2SRDXを保持するアグロバクテリウム・ツメファシエンス菌(LBA4404)を得た。
(1)一重咲き品種への導入
シクラメン(品種:メロディホワイト)の種子を有効塩素濃度が1%の次亜塩素酸ナトリウム液で20分間浸漬し滅菌後、1/2無機塩濃度のMS培地にショ糖を最終濃度3%、ゲランガムを最終濃度0.3%となるように加えた培地(pH5.8)に置床して、20℃、暗所で60日間培養した。種子から発芽して生じた幼苗の葉柄部分を長さ5mmに切断し、遺伝子導入用組織片とした。1試験区あたり100本の組織片を、1/2無機塩濃度のMS培地にショ糖を最終濃度3%、植物ホルモンとしてチジアズロンを最終濃度1mg/l、2,4−Dを最終濃度1mg/l、アセトシリンゴンを最終濃度20mg/lとなるように加え、pH5.8として、ゲルライトを最終濃度0.3%となるように加えた固体培地に置床した。この培養に用いられる容器は、滅菌したプラスチックシャーレ(直径9cm、高さ1.5cm)であり、シャーレ1枚あたり組織片10本を置床している。これを20℃で暗所にて7日間培養した。
シクラメン(品種:ウインクピンク)の葉身を遺伝子導入用組織として用い、組換えベクターp35SCpAG2SRDXを包含するアグロバクテリウム・ツメファシエンス菌(LAB4404)を感染させた以外は、上記(1)と同様の方法で行った。
尚、ウインクピンク品種について、RT−PCRによりCpAG1及びCpAG2の発現を確認したところ、CpAG1の発現は認められず、CpAG2の発現のみが確認された。すなわち、ウインクピンク品種はCpAG1遺伝子の機能が喪失した突然変異八重咲き品種であった。
前記(1)、(2)において選抜培地に移植された組織片は、約2ヶ月でハイグロマイシン抵抗性の形質転換カルスを形成した。これらのカルスを、1/3無機塩濃度のMS培地にショ糖を最終濃度3%、植物ホルモンとしてNAAを最終濃度0.2mg/l、BAを最終濃度0.02mg/l、カルベニシリンを最終濃度300mg/l、ハイグロマイシンを最終濃度5mg/lとなるように加え、pH5.8として、ゲルライトを最終濃度0.3%となるように加えた不定芽再生培地に置床した。20℃、暗所にて1ヶ月毎に新しい不定芽再生培地に移植した。
前記(3)で得られた形質転換シクラメンについて、その葉を遺伝子解析用の材料とし、PCRによりCpAG1遺伝子又はCpAG2遺伝子とSRDXをコードする遺伝子との融合遺伝子が導入されていることを確認した。
シクラメン(品種:フレグランスミニアメジストブルー)の遺伝子導入用組織片を上記(1)と同様の方法で用意した。1試験区あたり100本の組織片を、ショ糖5%、2,4−D4mg/l、カイネチン0.1mg/l、アセトシリンゴン20mg/l、ゲルライト0.3%を含有する固体培地に置床した。この培養に用いられる容器は、滅菌したプラスチックシャーレ(直径9cm、高さ1.5cm)であり、シャーレ1枚あたり組織片10本を置床している。これを20℃で暗所にて7日間培養した。
次に上記で得られた不定胚から植物体を再生した。具体的には、MS培地の無機成分組成において、さらにショ糖3%、BA0.1mg/l、ナフタレン酢酸0.01mg/l、ジベレリン0.2mg/l、ゲルライト0.5%を含有してなる再生培地上に、上記不定胚をシャーレあたり100個の密度になるよう調整して置床した。これを25℃暗所で30日間培養し、さらに25℃、10000ルックスの光を1日当たり16時間照明しながら培養することで形質転換された再生植物体を得た。この再生植物体(幼植物体)を、ショ糖を30g/l、ゲルライトを3g/lの濃度で含むMS培地を入れた試験管に移殖した。移殖された幼植物体を培養し、生育したシクラメン植物体(フレグランスミニアメジストブルーの形質転換体)24株を得た。
前記で得られた形質転換シクラメンについて、その葉を遺伝子解析用の材料とし、PCRによりCpAG1遺伝子とSRDXをコードする遺伝子との融合遺伝子、及びCpAG2遺伝子とSRDXをコードする遺伝子との融合遺伝子の双方が導入されていることを確認した。
シロイヌナズナcDNAライブラリー(独立行政法人産業技術総合研究所から入手)から、配列番号65の塩基配列からなるオリゴヌクレオチドと配列番号66の塩基配列からなるオリゴヌクレオチドをプライマーセットとして用いて、終止コドンを除くシロイヌナズナAG遺伝子(AtAG遺伝子)のコード領域のみを含むDNA断片をPCRにて増幅した。
Claims (6)
- シクラメンの花器官の形態形成に関与する転写因子の機能を抑制する工程を少なくとも含む、花弁数が増加した多弁咲きシクラメン植物体の生産方法であって、
前記転写因子が下記(a)〜(c)のいずれかのアミノ酸配列を有する、生産方法。
(a)配列番号2のアミノ酸配列
(b)配列番号2のアミノ酸配列において1若しくは数個のアミノ酸が置換、欠失、挿入及び/又は付加されたアミノ酸配列
(c)配列番号2のアミノ酸配列と90%以上の同一性を有するアミノ酸配列 - シクラメンの花器官の形態形成に関与する転写因子であって下記(d)〜(f)のいずれかのアミノ酸配列を有する転写因子の機能を抑制する工程をさらに含む、請求項1に記載の生産方法。
(d)配列番号4のアミノ酸配列
(e)配列番号4のアミノ酸配列において1若しくは数個のアミノ酸が置換、欠失、挿入及び/又は付加されたアミノ酸配列
(f)配列番号4のアミノ酸配列と90%以上の同一性を有するアミノ酸配列 - シクラメンの花器官の形態形成に関与する転写因子の機能を抑制する工程を少なくとも含む、花弁数が増加した多弁咲きシクラメン植物体の生産方法であって、
前記転写因子が下記(d)〜(f)のいずれかのアミノ酸配列を有する、生産方法。
(d)配列番号4のアミノ酸配列
(e)配列番号4のアミノ酸配列において1若しくは数個のアミノ酸が置換、欠失、挿入及び/又は付加されたアミノ酸配列
(f)配列番号4のアミノ酸配列と90%以上の同一性を有するアミノ酸配列 - シクラメンの花器官の形態形成に関与する転写因子の機能を抑制する工程を少なくとも含む、花弁数が増加した多弁咲きシクラメン植物体の生産方法であって、
前記転写因子が下記(d)〜(f)のいずれかのアミノ酸配列を有し、
前記転写因子の機能が抑制されるシクラメンが、シクラメンの花器官の形態形成に関与する下記(a)〜(c)のいずれかのアミノ酸配列を有する転写因子の機能が抑制されているシクラメン突然変異体である、生産方法。
(a)配列番号2のアミノ酸配列
(b)配列番号2のアミノ酸配列において1若しくは数個のアミノ酸が置換、欠失、挿入及び/又は付加されたアミノ酸配列
(c)配列番号2のアミノ酸配列と90%以上の同一性を有するアミノ酸配列
(d)配列番号4のアミノ酸配列
(e)配列番号4のアミノ酸配列において1若しくは数個のアミノ酸が置換、欠失、挿入及び/又は付加されたアミノ酸配列
(f)配列番号4のアミノ酸配列と90%以上の同一性を有するアミノ酸配列 - 前記転写因子と、転写因子を転写抑制因子に転換する機能性ペプチドとを融合させたキメラタンパク質を用いて、前記転写因子の機能を抑制する、請求項1〜4のいずれか1項に記載の生産方法であって、
前記機能性ペプチドが、配列番号21のアミノ酸配列からなるペプチドである、生産方法。 - 請求項1〜5のいずれか1項に記載の生産方法により生産されたシクラメン植物体。
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