JP5773955B2 - HPVE6、E7mRNAアッセイ、及びその使用方法 - Google Patents
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Description
本発明の詳細な実施態様を記載する前に、本発明の記載において使用される定義を説明することが有用であろう。以下の定義が、本発明の記載において使用される。定義において使用される専門用語は、本発明の特定の実施態様を記載するためのものであり、これに限定することを意図しない。
本発明は、細胞内におけるHPV E6, E7 mRNAの存在を検出することによって、前癌性及び癌性の子宮頸部細胞を同定するHPV E6, E7 mRNAアッセイ(細胞内HPVアッセイ)を提供する。HPV E6, E7 mRNAは、子宮頸部の細胞の悪性形質転換を検出するための高感度なバイオマーカーであるため、本明細書に記載した細胞内HPVアッセイは、異常な細胞診を示す細胞、例えばASCUS、LGSIL、及びHGSIL(実施例6及び7)に加えて、正常な細胞診を示す子宮頸部細胞の悪性形質転換を検出することが可能である。
本明細書に記載した細胞内HPVアッセイは、3時間未満で実施され得る、前癌製及び癌性の子宮頸部細胞の検出のための高感度且つ特異的なスクリーニング方法として有用である。細胞内HPVアッセイは、HPV E6, E7 mRNAの同定及び定量を条件とし、子宮頸部細胞におけるHPV E6, E7 mRNAレベルの上昇の存在が、細胞の悪質形質転換を示す。
HPV E6, E7を検出するための同時免疫蛍光及び超高感度蛍光in situハイブリダイゼーション(「細胞内HPVアッセイ」)
対象から単離した液状子宮頸部細胞診検体から1mLのアリコートを取り出した。400×gで遠心分離して前記細胞を沈殿させ、リン酸緩衝生理食塩水(「PBS」) ,pH7.4で一度洗浄した。細胞を100μLのPBS,pH7.4に再懸濁し、フィコエリトリン(「PE」)結合抗CAM 5.2とPE/cy5結合抗CD16(BDPはr民減、San Diego, CA)との1:10の希釈物で染色した。次いで、前記細胞を暗所で20分間、4℃でインキュベートした。インキュベート後に、細胞を固定化し、透過化処理して、PBS,pH7.4で一度洗浄し、400×gで遠心分離して沈殿させ、2×SSCで再び洗浄し、遠心分離によって沈殿させた。次いで、前記細胞を5×SSC、30%ホルムアミド、及び100μg/mL剪断サケ精子DNA(「ssDNA」)、並びに「HPV OncoTect」とう名称でInvirion, Inc., Frankfort, MI,から入手し得るか、又は当該技術分野において既知のオリゴヌクレオチドの調製技術によって調製して良い5'-及び3'-フルオロセイン標識HPV E6, E7 mRNAオリゴヌクレオチドプローブのカクテルからなるハイブリダイゼーション混合物に再懸濁した(例えば、Caruthers et al., Chemical Synthesis of Deoxyoligonucleotides by the Phosphoramidite Method, METHODS ENZYMOL 154:287-313 (1987)を参照すべきである)。ハイブリダイゼーションは30分間、37度で実施し、続いて2×SSC、0.1% Triton X-100で5分間洗浄し、0.1% SSC、0.1% Triton X-100で15分間洗浄した。
スライドに基づく細胞内HPVアッセイ
対象から単離した液状子宮頸部細胞診検体から100μLの細胞(1×106細胞/mL)を移し、集細胞遠心(cytocentrifuge)又は液状スライドシステム(liquid based slide system)を実施する。前記スライドを、室温で2分間、800×gで遠心分離した。1×PBS,pH7.4で洗浄した後に、1時間、室温でコプリンジャーにおいて、1×PermiFlow(Invirion, Inc, Frankfort, MI)固定化/透過化試薬を使用して前記スライドをインキュベートした。次いで、前記スライドをPBSで一度、2×SSCで一度洗浄した。30から120分間、37度でハイブリダイゼーションオーブンにおいて、前記細胞をHPV OncoTectプローブのカクテルにハイブリダイズさせた。次いで、50mLの加熱した2×SSC、0.1% Triton X-100を含有するコプリンジャーで5分間、前記スライドを洗浄し、50mLの加熱した0.1×SSC、0.1% Triton X-100を含有するコプリンジャーで15分間インキュベートした。PBS,pH7.4で簡単に洗浄した後に、Fluorsave mounting medium(CalBioChem, San Diego, CA)を使用して、前記スライドにカバーガラスをのせた。
細胞内HPVアッセイの評価
細胞内HPVアッセイの効果を評価するために、市販の正常な子宮膣部の細胞、すなわち、HPV-子宮膣部細胞、及びHPV+ SiHa及びHeLa細胞を培養して増殖させ、20サンプルにわけて、フローサイトメトリーを使用する細胞内HPVアッセイによってHPV E6, E7 mRNAについて分析し、1細胞当たり10コピーの検出限界を有するリアルタイムRT-PCRによってHPV E6 mRNAについて分析した。図1は、各々の細胞集団のHPV E6, E7 mRNAのMFIとHPV E6 mRNAのコピー数との間の関係を示す。図1の線形回帰分析は、0.001のp値と共に、0.88の相関関係をもたらした。この実験結果に基づいて、細胞内HPVアッセイの理論的な感度が、1細胞当たり10から20コピーのHPV E6, E7 mRNAであることを算出した。全ての後の患者のサンプルの分析では、細胞が1細胞当たり200コピーを超えるMFIを示した場合に(200は平均的な患者から容易に除去され得ないHPVのコピー数を表わす)、細胞はHPV E6, E7 mRNAに関して陽性であると解した。
異常な細胞におけるHPV E6, E7 mRNAメッセージの形態学的評価
異常な細胞を検出する細胞内HPVアッセイの特異性を確認するために、HPV+ HeLa細胞及びHPV-正常子宮膣部細胞を、HPV E6, E7 mRNA OncoTextプローブとハイブリダイズさせて、検出可能なレベルのHPV E6, E7 mRNAメッセージを発現した細胞の形態を試験した(図3)。細胞内HPVアッセイは、HeLa細胞に特徴的な細胞質染色パターンを生じさせた。対照的に、HPV-細胞株は染色されなかった(C33A株を使用した) (各々Box A及びB)。フローサイトメトリーで使用したものと同一のプローブカクテルを使用して、非定型的な細胞が、多数の正常な扁平細胞の視野において、特徴的な細胞質に対する核の高い割合によって検出された(Box CからE)。488nM蛍光共焦点画像とノマルスキー位相差画像の重ね合わせた画像によって、異常細胞を超えるハイブリダイゼーションシグナルの局在が確認された。
不均一の子宮頸部細胞診サンプルにおけるHPV E6, E7 mRNA発現細胞のサイトメトリー濃縮(cytometric enrichment)
子宮頸部細胞診検体は、扁平子宮膣部細胞、円柱子宮頚管内膜細胞、PMN(多核白血球)、及びリンパ球を含むが、それらに限らない多数の細胞タイプを含有するため、LBC検体における興味のある細胞タイプを区別するために、抗体カクテルが開発して、細胞内HPVアッセイと共に使用した。試験対象のLBCプレパラートにおいて子宮膣部細胞、子宮頚管内膜細胞、及びPMNの間で区別するために、CD16、好中球マーカー、及び子宮頚管内膜細胞では発現しているが、子宮膣部細胞では発現していない70kDaの分子量のサイトケラチンを検出する抗体であるCAM 5.2を組み合わせて子宮頸部細胞検体を染色した。特定のマーカーについての細胞染色は、子宮膣部細胞、子宮頚管内膜細胞、及びPMNの間で区別するための前方及び直角(90°側方散乱)の光散乱ゲート内でそれらの存在を同定するためにバックゲート(backgate)される。Grundhoefer and Patterson, Determination of Liquid-Based Cervical Cytology Specimen Adequacy Using Cellular Light Scatter and Flow Cytometry, CYTOMETRY 46:340-344 (2001)を参照すべきである。図4Aから4Iに示すように、子宮膣部細胞は、CD16及びCAM 5.2の発現を欠いているもの(CD16-、CAM 5.2-)についてゲーティングすることによって、正常(WNL)及び異常(HGSIL)な子宮頸部細胞検体において同定された(図4の最初の2つのボックス)。HPV E6, E7 mRNAを発現する細胞のサンプル中の割合を測定するためのカットオフポイントとして1細胞当たり100コピーのHPV E6, E7 mRNAを使用して、本発明の細胞内HPVアッセイを用いて、HPV E6, E7 mRNAについて子宮膣部細胞を分析した(図4A、3つ目のボックス)。図4Bから4Iの各々の右上部の角に記載した割合は、HGSIL(図4Bから4E)及びWNL(図4Fから4I)サンプルにおける、1細胞当たり100コピーを超えるHPV mRNAを発現する細胞の割合を示す。同様に、子宮頚管内膜細胞におけるHPV E6, E7 mRNAの発現は、CD16-、CAM 5.2+発現を同定するゲーティングストラテジーを使用することによって分析され得る。
高リスクのコホートにおける異常なSILを検出するためのPap塗抹試験に対する細胞内HPVアッセイの比較分析
LBCにおける前悪性状態についてスクリーニングするために、正常な子宮頸部細胞診を有する41人の女性及び異常な子宮頸部細胞診を有する41人の女性からなる高リスクのコホートから、LBC検体を得た。実施例4に記載したように、異常な細胞は、特徴的な細胞質に対する核の高い割合によって同定されるが、正常な扁平上皮細胞は、細胞質に対する核の低い割合を示す。異常な細胞を有する女性は、以下のカテゴリー:9 ASCUS、22 LGSIL、及び 10HGSILからなった。この実験のために、陽性のHPV E6, E7 mRNA結果についての量的なカットオフは、真の陰性の平均から2標準偏差に設定した。子宮頸部細胞はCD16及びCAM 5.2で染色され(実施例5に記載したように)、ハイブリダイズされる(実施例1に記載したように)。子宮膣部細胞は、前方及び直角の光散乱の双方によって、及び子宮膣部細胞にはない子宮頚管内膜細胞におけるCAM 5.2の発現によって、子宮頚管内膜細胞から区別された(実施例5、図4A)。好中球で覆われた子宮膣部細胞は、CD16+染色の存在によって分析から除外された。細胞内HPVアッセイは、9のうち5のASCUSサンプル、22のうち13のLGSILサンプル、10のうち10のHGSILサンプル、及び41のうち3の正常な(WNL)子宮頸部細胞診検体におけるHPV E6, E7 mRNAを検出した。3のうち2の正常なサンプルは、Taqmanプローブを使用し、定量リアルタイムRT-PCRによって確認した。実施例3で使用した方法と同様に、1細胞当たり200コピーよりも多いMFIを示した場合に、細胞はHPV E6, E7 mRNAに関して陽性であると解した。対照のために、HPV+ HeLa細胞およびHPV- C33A細胞が、全ての試験に含められた。HPV E6, E7 mRNA発現細胞の割合は、表1に示すように、細胞診の診断と正の相関関係があった。
低リスクのコホートにおける異常なSILを検出するための、HC II HPV試験と細胞内HPVアッセイとの比較分析
高悪性度の子宮頸部病変を検出するためのHC II HPV試験と細胞内HPVアッセイとの能力を比較するために、149のLBC検体を、以下のカテゴリー:109 WNL、21 ASCUS、5 LGSIL、12 HGSIL、及び2の細胞診試験で同定された侵襲性子宮頸癌を有するものを含む低リスクのコホートから得た。表2は、前記比較試験の結果を示す。上述したように、細胞内HPVアッセイはHPV E6, E7 mRNAの存在について試験するが、HC II HPV試験は高リスクのHPV DNA、例えばHPV-16及びHPV-18の存在についてスクリーニングする。
Claims (8)
- 子宮頸部細胞を含む検体の悪性形質転換を決定するための方法であって、
子宮頸部細胞の検体をHPV E6, E7 mRNA特異的オリゴヌクレオチドに接触させる工程;
前記子宮頸部細胞における1細胞当たりのHPV E6, E7 mRNAのコピー数をin vitroのアッセイで定量する工程;
各細胞に対して、所定のカットオフポイントより大きいHPV E6, E7 mRNAコピーの発現を有する検体における子宮頸部細胞の割合を同定する工程
各細胞に対するHPV E6, E7 mRNAコピーの発現が所定のカットオフポイントより大きい検体における子宮頸部細胞の割合に基づいて、子宮頸部細胞の検体の悪性形質転換を決定する工程
を含む方法。 - 所定のカットオフポイントより小さい各細胞に対するHPV E6, E7 mRNAコピーの発現を有する検体における子宮頸部細胞の割合に基づいて、前記子宮頸部細胞の検体が良性であることを決定する工程を含む、請求項1に記載の方法。
- 前記子宮頸部細胞が、正常細胞、意義不明な異常扁平上皮細胞(ASCUS)、低悪性度の扁平上皮内病変(LGSIL)を有する細胞、及び高悪性度の扁平上皮内病変(HGSIL)を有する細胞からなる群から選択される、請求項1または2に記載の方法。
- フローサイトメトリーにより、各細胞に対してHPV E6, E7 mRNAの発現を定量する工程を含む、請求項1から3のいずれか一項に記載の方法。
- 前記子宮頸部細胞が、液状細胞診(LBC)検体として調製されたものである、請求項4に記載の方法。
- CD16とCAM5.2の組み合わせで子宮頸部細胞を染色する工程をさらに含む、請求項1から4のいずれか一項に記載の方法であって、好中球がCD16+染色によって同定され、円柱子宮頚管内膜細胞がCD16-, CAM 5.2+染色によって同定され、及び扁平子宮膣部細胞がCD16-, CAM5.2-染色によって同定される方法。
- 悪性形質転換した円柱子宮頚管内膜細胞を同定することにより、腺癌細胞の状態を決定する工程を含む、請求項6に記載の方法。
- 悪性形質転換した扁平子宮膣部細胞を同定することにより、扁平細胞癌細胞の状態を決定する工程を含む、請求項6に記載の方法。
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