JP5757519B2 - 合成樹脂原料モノマーまたは合成樹脂前駆体への曝露の検出方法 - Google Patents
合成樹脂原料モノマーまたは合成樹脂前駆体への曝露の検出方法 Download PDFInfo
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Description
(1) (a)タンパク質上の官能基と結合可能な2以上の反応性基を有する合成樹脂原料モノマーまたは合成樹脂前駆体と、血清タンパク質とを接触させて両者を反応させ、前記合成樹脂原料モノマーまたは合成樹脂前駆体が前記血清タンパク質上の2以上の官能基と反応し結合した診断抗原を作製する工程において、前記合成樹脂原料モノマーまたは合成樹脂前駆体と前記血清タンパク質とを複数の互いに異なる反応条件下で接触および反応させ、1つの前記合成樹脂原料モノマーまたは合成樹脂前駆体あたり複数の診断抗原を作製する工程と、
(b)被験者から採取した血清サンプルと前記診断抗原とを接触させ、前記診断抗原に特異的な抗体の前記診断抗原への結合量を測定する工程とを有する合成樹脂原料モノマーまたは合成樹脂前駆体への曝露の検出方法。
(2) 前記工程(b)において、前記複数の前記診断抗原と前記血清サンプルとを接触させ、複数の前記診断抗原に特異的な抗体の前記診断抗原への結合量を一度に測定する上記(1)記載の検出方法。
(3) 前記診断抗原の作製において、前記合成樹脂原料モノマーまたは合成樹脂前駆体と前記血清タンパク質とをモル比1〜10,000:1で接触させる上記(1)または(2)記載の検出方法。
(4) 前記工程(a)において、前記合成樹脂原料モノマーまたは合成樹脂前駆体と、前記血清タンパク質の水溶液とを油水二相系で接触させる上記(1)から(3)のいずれか1項記載の検出方法。
(5) 前記血清タンパク質が血清アルブミンである上記(1)から(4)のいずれか1項記載の検出方法。
(a)タンパク質上の官能基と結合可能な2以上の反応性基を有する合成樹脂原料モノマーまたは合成樹脂前駆体と血清タンパク質とを接触させて両者を反応させ、合成樹脂原料モノマーまたは合成樹脂前駆体が血清タンパク質上の2以上の官能基と反応し結合した診断抗原を作製する工程
(b)被験者から採取した血清サンプルと上記工程(a)で作製した診断抗原とを接触させ、血清サンプル中に存在する、診断抗原に特異的な抗体の前記診断抗原への結合量を定量する工程
以下、各工程についてより詳細に説明する。
血清タンパク質として、ヒト血清アルブミン(HSA、和光純薬またはSigma社製)を用いた。診断抗原を作製するための合成樹脂前駆体として無水フタル酸(和光純薬製)、エポキシ樹脂合成に使用されるビスフェノールAジグリシジルエーテル(BADGE、Fluka社製)、m−キシリレン−α,α'−ジアミン(和光純薬製)、n−ブチルグリシジルエーテル(和光純薬製)、Product X(企業より分与)を用いた。
産業医科大学倫理委員会の承認の下、アレルギー専門医あるいは産業医を介して、生活に関する聞き取り調査や臨床所見からエポキシ樹脂前駆体に感作されていると推定されるアレルギー患者(気管支喘息、アレルギー性皮膚炎等)20名程度を集め、インフォームド・コンセントを得たのちに、採血(約20〜30mL)を行った。
上記4つの合成樹脂前駆体で処理したHSAを1枚のメンブランにプロットし、患者血清によるウェスタンドットブロットを行った。その結果の一例を図1に示す。白く見えているのが陽性反応である。左下の3点はヒトIgGをブロットした陽性コントロールである。
標準曲線の作成最初に種々の濃度(25μg/mL〜0.76μg/mL)のヒトIgGを標準物質としてメンブランにスポットし(各スポットは0.5μL)、抗ヒトIgG-HRP抗体で処理した後、基質と反応させ、それぞれのドットの発光強度を定量した。図2に示すように、濃度依存的に発光強度が測定できた。またスポットによる実験誤差(縦に同じ濃度をトリプリケイトでスポットしている)も少ないことが示された。各スポットの発光強度の実測値の平均値を濃度に対してプロットしたものが図3である。このグラフの近似曲線を解析するとy=0.1805×Exp(0.0002×d)という式になった。dは発光強度の実測値で、yは抗原特異的なlgGの濃度である。相関係数R2は0.98であった。
そこで、pH9.2、抗原濃度4%で作成した診断抗原で得られた発光強度を、それぞれのメンブランの標準曲線から換算し、診断抗原特異的IgG濃度とプロットしたのが図4である。その際、化学物質に対するアレルギーの診察結果により4段階に分けてプロットした。3名がアレルギー+++、5名がアレルギー++、3名がアレルギー+、9名がアレルギー症状なし(コントロール群)、という群である。「+」の数が多いほど、アレルギー症状が強いことを表している。グラフの中の縦線は平均標準偏差を表している。コントロール群に対してTTESTを行ったところ、アレルギー+++群とはp=0.0047、アレルギー++群とはp=0.0065、アレルギー+群とはp=0.13であったことから、アレルギー+++とアレルギー++との場合に統計的な有意差が認められた。コントロール群には2名ほどアレルギー+群の平均より高い被験者が含まれていた。この2名を除いて、アレルギー+群とコントロール群でTTESTを行うとp=0.029であった。
この検出方法では、合成樹脂原料をハプテンとして用いる代わりに、合成樹脂前駆体との結合により3次構造が変化した血清タンパク質を診断抗原として用い、それに対する特異的抗体を曝露指標(マーカー)として用いることにより、合成樹脂前駆体への曝露の測定が可能になる。
Claims (5)
- (a)タンパク質上の官能基と結合可能な2以上の反応性基を有する合成樹脂原料モノマーまたは合成樹脂前駆体と、血清タンパク質とを接触させて両者を反応させ、前記合成樹脂原料モノマーまたは合成樹脂前駆体が前記血清タンパク質上の2以上の官能基と反応し結合した診断抗原を作製する工程において、前記合成樹脂原料モノマーまたは合成樹脂前駆体と前記血清タンパク質とを複数の互いに異なる反応条件下で接触および反応させ、1つの前記合成樹脂原料モノマーまたは合成樹脂前駆体あたり複数の診断抗原を作製する工程と、
(b)被験者から採取した血清サンプルと前記診断抗原とを接触させ、前記診断抗原に特異的な抗体の前記診断抗原への結合量を測定する工程とを有することを特徴とする合成樹脂原料モノマーまたは合成樹脂前駆体への曝露の検出方法。 - 前記工程(b)において、前記複数の前記診断抗原と前記血清サンプルとを接触させ、複数の前記診断抗原に特異的な抗体の前記診断抗原への結合量を一度に測定することを特徴とする請求項1記載の検出方法。
- 前記診断抗原の作製において、前記合成樹脂原料モノマーまたは合成樹脂前駆体と前記血清タンパク質とをモル比1〜10,000:1で接触させることを特徴とする請求項1または2記載の検出方法。
- 前記工程(a)において、前記合成樹脂原料モノマーまたは合成樹脂前駆体と、前記血清タンパク質の水溶液とを油水二相系で接触させることを特徴とする請求項1から3のいずれか1項記載の検出方法。
- 前記血清タンパク質が血清アルブミンであることを特徴とする請求項1から4のいずれか1項記載の検出方法。
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