JP5755840B2 - ナノエマルジョンワクチン - Google Patents
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Description
本発明は、免疫応答の刺激のための方法および組成物を提供する。具体的には、本発明は、粘膜アジュバントとしてのナノエマルジョン化合物を用いて、環境病原体に対して免疫性を誘導させるための方法および組成物を提供する。
免疫化は、人々の健康を改良するための重要な特徴である。多くの通常の病気に対して種々の成功したワクチンを入手できるにもかかわらず、感染症は依然として健康の問題および死亡の主導的原因である。現存のワクチンに固有な重要な問題は、反復した免疫化の必要性、ワクチン接種、および病気の幅広いスペクトルに対する現行ワクチン送達系の非有効性を含む。
本発明は、免疫応答の刺激のための方法および組成物を提供する。具体的には、本発明は、粘膜アジュバントとしてナノエマルジョン化合物を用いて、環境病原体に対して免疫性を誘導するための方法および組成物を提供する。従って、いくつかの態様においては、本発明は病原体(例えば、不活化病原体)およびナノエマルジョン組成物を含む粘膜ワクチンを提供する。いくつかの態様においては、投与に先立って、病原体を不活化するのに充分な時間、病原体をナノエマルジョンと混合する。他の場合には、病原体からの精製されたタンパク質成分をナノエマルジョンと混合する。
本発明の理解を容易とするために、多数の用語およびフレーズを以下に定義する。
本発明は、特異的な免疫応答の刺激のための方法および組成物を提供する。従って、いくつかの態様においては、本発明は病原体に対する免疫性の刺激用のワクチンを提供する。いくつかの態様においては、本発明は、不活化病原体およびナノエマルジョンを含むナノエマルジョンワクチン組成物を提供する。本発明はいずれかの特定のナノエマルジョンまたは病原体に限定されない。例示的なワクチン組成物およびワクチン組成物を投与する方法は後により詳細に記載する。
本発明のいくつかの態様で使用されるナノエマルジョン組成物は抗病原体作用を示した。例えば、ナノエマルジョン組成物は細菌(栄養および胞子形態双方)、ウイルスおよび真菌を不活化することが示されている。本発明の好ましい態様においては、ワクチンとして投与される前にナノエマルジョンへの曝露によって病原体が不活化される。
ナノエマルジョン組成物を用いて、細菌を迅速に不活化することができる。ある態様においては、組成物は、グラム陽性菌を不活化するのに特に効果的である。好ましい態様においては、細菌の不活化は約5〜10分後に起こる。従って、細菌をエマルジョンと接触させることができ、迅速かつ効果的に不活化されると考えられる。接触および不活化の間の時間は5〜10分と短くすることができると予測され、この際、細菌はエマルジョンに直接的に曝露される。しかし、ナノエマルジョンを治療で用い、全身適用した場合、不活化は、限定されるものではないが、適用後5分、10分、15分、20分、25分、30分、60分を含めた時間にわたって起こることができる。さらに、追加の態様においては、不活化が起こるのに2時間、3時間、4時間、5時間または6時間かかると考えられる。
ある特別の例(例えば、実施例5および11)では、ナノエマルジョンが抗殺胞子活性を有することが示された。いずれの理論にも拘束されないが(機序の理解は本発明を実施するのに必要ではなく、本発明はいずれかの特定の機序に限定されない)、これらのエマルジョンの殺胞子活性は、エマルジョンによる破壊に罹りやすい胞子を残す栄養形態への完全な復帰なくして発芽の開始を経て起こることが提案される。発芽の開始は、エマルジョンまたはその成分の作用によって媒介され得る。
本発明のさらなる例示的な例(例えば、実施例12)において、本発明のナノエマルジョン組成物は抗ウイルス特性を有することが示された。これらのウイルス剤に対するこれらのエマルジョンの効果はプラーク減少アッセイ法(PRA)、細胞酵素結合免疫吸着検定(ELISA)、β−ガラクトシダーゼアッセイ法、および電子顕微鏡(EM)を用いてモニターし、脂質調製物の細胞毒性は(4,5−ジメチルチアゾール−2−イル)−2,5−ジフェニルテトラゾリウム(MTT)染色アッセイ法を用いて評価した(Mosmann,J.Immunol.Methods.,65:55[1983])。
本発明のいくつかの態様で用いたナノエマルジョンのさらにもう1つの特性は、それが抗真菌活性を保有することである。真菌感染の通常の病原体はカンジダ属およびアスペルギルス属の種々の種、およびそのタイプ、ならびにその他を含む。外部真菌感染は比較的重要でないが、全身真菌感染は深刻な医学的結果を生じ得る。損なわれた免疫系を有する増加する数の患者に帰すことができるヒトにおける真菌感染の増大する発生がある。特に全身である場合、真菌病は損なわれた免疫系を有する患者に対して生命を脅かしかねない。
本発明の他の例示的な例において、ナノエマルジョン製剤は動物において病原体感染と戦いそれを妨げることが示された。実験動物におけるバチルス・セレウス感染は、炭疽の研究のためにモデル系として既に用いられている(例えば、BurdonおよびWende,J.Infect.Diseas.170(2);272[1960];LamannaおよびJohns,J.Bact.85:532[1963];およびBurdonら、J Infect.Diseas.117:307[1967]参照)。実験的にバチルス・セレウスで感染させた動物で誘導させた病気症候群は炭疽菌と同様である(Drobniewski,Clin.Microbio.Rev.6:324[1993];及びFritzら、Lab.Invest.73:691[1995])。本発明の開発の間に行った実験は、マウスに注射する前にX8Pをバチルス・セレウス胞子と混合すると、バチルス・セレウスの病理学的効果を妨げることを示した。さらに、汚染したシミュレート創傷のバチルス・セレウス胞子でのX8P処理は、マウスにおいて感染の危険および死亡率を顕著に低下させることが示された。1:10に希釈されたX8P単独で注射された対照動物はいずれの炎症効果も示さず、これは、X8Pがマウスにおいて皮膚毒性を有さないことを証明した。これらの結果は、曝露前または後における胞子の即時処理が、実験的皮膚感染の組織損傷の重傷度を効果的に低下させることができることを示唆する。
いくつかの態様において、本発明は、ナノエマルジョンおよび一つまたは複数の不活化病原体または病原体産物を含むワクチン組成物を提供する。本発明は任意の数の病原体用のワクチンを提供する。本発明はいずれかの特定のナノエマルジョン製剤に限定されない。事実、種々のナノエマルジョン製剤が考えられる(例えば、以下の記載および例示的実施例、および参照として本明細書に組み入れられる米国特許出願第20020045667号参照)。
創傷、皮膚または粘膜いずれかに適用した場合に予防的方法で感染を妨げるナノエマルジョンの能力は記載されている(Hamoudaら、J.Infect.Dis.,180:1939[1999];Donovanら、Antivir Chem Chemother.,11:41[2000])。本発明の開発の間に、いくつかの研究において、インフルエンザウイルスへの曝露前にマウスを鼻適用ナノエマルジョンで予め処理して、吸入インフルエンザ肺炎を妨げるナノエマルジョンの能力を記録した。ナノエマルジョンでの予備処理からの罹患率は対照動物と比較して最小であり、死亡率は大いに減少した(予備処理での20%に対し対照において80%;実施例13)。生存するエマルジョン予備処理動物のいくつかは、エマルジョンで処理したがウイルスに曝露されなかった対照動物には存在しない肺における免疫反応性および巨大細胞形成の少ない面積の証拠を有することが判明した。予備処理動物の全ては、肺マクロファージへの脂質取込の証拠を有した。本発明はいずれかの1つの機序に限定されない。事実、機序の理解は本発明を実施するのに必要でない。それにもかかわらず、ナノエマルジョン/ウイルス組成物での処理の結果、インフルエンザウイルスに対する免疫性は発生すると考えられる。
本発明は、病原体のいずれか1つの特異的タイプの使用に制限されない。事実、種々の病原体に対するワクチンは本発明の範囲内のものである。従って、いくつかの態様において、本発明は、(例えば、限定されるものではないが、バチルス・セレウス、バチルス・シルクランス、および巨大菌、炭疽菌・ウェルシュ菌、コレラ菌、化膿連鎖球菌、ステレプトコッカス・アガラクティエ、肺炎球菌、黄色ブドウ球菌、淋菌、インフルエンザ菌、大腸菌、ネズミチフス菌、志賀赤痢菌、プロテウス・ミラビリス、緑膿菌、エンテロコリチカ菌および偽結核菌を含めた)栄養または胞子形態の細菌病原体に対するワクチンを提供する。他の態様において、本発明は、(例えば、限定されるものではないが、インフルエンザA型、単純疱疹ウイルスI、単純疱疹ウイルスII、センダイ、シンドビス、ワクシニア、パルボウイルス、ヒト免疫不全ウイルス、B型肝炎ウイルス、C型肝炎ウイルス、A型肝炎ウイルス、サイトメガロウイルス、およびヒトパピローマウイルス、ピコルナウイルス、ハンタウイルス、フニンウイルス、およびエボラウイルスを含めた)ウイルス病原体に対するワクチンを提供する。なおさらなる態様において、本発明は、限定されるものではないが、鵞口瘡カンジダおよびパラシロシス、アスペルギルス・フミガーツスおよび黒色アスペルギルス、フザリウム spp.、トリコフィートンspp.を含めた真菌病原体に対するワクチンを提供する。
本発明のナノエマルジョンワクチン組成物はいずれかの特定のナノエマルジョンに制限されない。限定されるものではないが、Hamoudaら、J.Infect Dis.,180:1939[1999];HamoudaおよびBaker,J.Appl.Microbiol.,89:397 [2000];およびDonovanら、Antivir.Chem.Chemother.,11:41[2000]に開示されたもの、ならびに表1および2および図4および9に示されたものを含めた、任意の数の適当なナノエマルジョン組成物を本発明のワクチン組成物で使用することができる。本発明の好ましいナノエマルジョンは、病原体を死滅させまたは不活化するのに効果的であり、動物に対して非毒性であるものである。従って、好ましいエマルジョン製剤はエタノールのような非毒性溶媒を使用し、より低い濃度のエマルジョンでより効果的な死滅を達成する。好ましい態様において、本発明の方法で使用するナノエマルジョンは安定であり、長い保存期間(例えば、1年またはそれ以上)後でさえ分解しない。加えて、好ましいエマルジョンは、高温および凍結への曝露の後でさえ安定性を維持する。もしそれらが極端な条件で適用されるものであれば(例えば、戦場)、これは特に有用である。いくつかの態様において、表1および/または図4または9に記載されたナノエマルジョンのうちの1つを使用する。
いくつかの態様において、エマルジョンは、水相を含む。ある好ましい態様においては、前記エマルジョンの合計容量に基づき、(他の濃度も考えられるが)エマルジョンは約5〜50、好ましくは10〜40、より好ましくは15〜30容量%の水相を含む。好ましい態様において、水相は、約4〜10、約6〜8のpHの水を含む。水は好ましくは脱イオン化されている(以後、「DiH2O」)。いくつかの態様において、水相はリン酸緩衝化生理食塩水(PBS)を含む。いくつかの好ましい態様において、水相は滅菌されており、かつ発熱物質なしである。
いくつかの態様において、エマルジョンは油相を含む。ある好ましい態様において、(他の濃度も考えられるが)本発明のエマルジョンの油相(例えば、担体油)は、前記エマルジョンの合計容量に基づき、30〜90容量%、好ましくは60〜80容量%、より好ましくは60〜70容量%の油を含む。適当な油は、限定されるものではないが、大豆油、アボカド油、スクワレン油、スクワレン油、オリーブ油、アブラナ油、トウモロコシ油、菜種油、サフラワー油、ヒマワリ油、魚油、フレーバー油、水不溶性ビタミンおよびその混合物を含む。特に好ましい態様において、大豆油を用いる。本発明の好ましい態様において、油相は、好ましくは、約1〜2ミクロン、より好ましくは0.2〜0.8ミクロン、最も好ましくは約0.8ミクロンの範囲の平均粒子サイズを有する液滴としての水相の全体に分配される。他の態様において、水相は油相中に分配することができる。
いくつかの態様において、エマルジョンは、さらに、界面活性剤または洗剤を含む。いくつかの好ましい態様において、(他の濃度も考えられるが)エマルジョンは、約3〜15%、および好ましくは約10%の一つまたは複数の界面活性剤または洗剤を含む。本発明はいずれかの特定の機序に限定されないが、エマルジョン中に存在すると、界面活性剤はエマルジョンを安定化させるように助けると考えられる。非イオン性(非アニオン)およびイオン性界面活性剤双方が考えられる。加えて、界面活性剤のBRIJファミリーからの界面活性剤は本発明の組成物の使用が見出されている。界面活性剤は水相または油相いずれか中に提供することができる。エマルジョンで用いるのに適した界面活性剤は種々のアニオン性およびノニオン性界面活性剤ならびに水中油型エマルジョンの形成を促進することができる他の乳化化合物を含む。一般に、乳化化合物は比較的親水性であり、乳化化合物の混和を用いて必要な品質を達成することができる。いくつかの製剤において、ノニオン性界面活性剤は、それらが広いpH範囲に実質的により適合し、しばしば、イオン性(例えば、石鹸型)乳化剤よりも安定なエマルジョンを形成する点でイオン性乳化剤よりも優れた利点を有する。従って、ある好ましい態様において、本発明の組成物はポリソルベート界面活性剤(例えば、ポリオキシエチレンエーテル)、ポリソルベート洗剤、フェノキシポリエトキシエタノールなどのような一つまたは複数の非イオン性界面活性剤を含む。本発明で有用なポリソルベート洗剤の例は、限定されるものではないが、ツィーン 20、ツィーン 40、ツィーン 60、ツィーン 80等を含む。
いくつかの態様において、エマルジョンは、さらに、カチオン性ハロゲン含有化合物を含む。いくつかの好ましい態様において、(他の濃度も考えられるが)エマルジョンは、前記エマルジョンの合計重量に基づき、約0.5〜1.0重量%またはそれ以上のカチオン性ハロゲン含有化合物を含む。好ましい態様において、カチオン性ハロゲン含有化合物は好ましくは油相と予め混合され;しかし、カチオン性ハロゲン含有化合物は別個の製剤においてエマルジョン組成物と組み合わせて提供することができると理解されるべきである。適当なハロゲン含有化合物は塩化物、フッ化物、臭化物およびヨウ化物イオンを含む化合物より選択することができる。好ましい態様において、適当なカチオン性ハロゲン含有化合物は、限定されるものではないが、ハロゲン化セチルピリジニウム、ハロゲン化セチルトリメチルアンモニウム、ハロゲン化セチルジメチルエチルアンモニウム、ハロゲン化セチルジメチルベンジルアンモニウム、ハロゲン化セチルトリブチルホスフォニウム、ハロゲン化ドデシルトリメチルアンモニウム、またはハロゲン化テトラデシルトリメチルアンモニウムを含む。いくつかの特別な態様において、適当なカチオン性ハロゲン含有化合物は、限定されるものではないが、塩化セチルピリジニウム(CPC)、塩化セチルトリメチルアンモニウム、塩化セチルベンジルジメチルアンモニウム、臭化セチルピリジニウム(CPB)、および臭化セチルトリメチルアンモニウム(CTAB)、臭化セチルジメチルエチルアンモニウム、臭化セチルトリブチルホスフォニウム、臭化ドデシルトリメチルアンモニウム、および臭化テトラデシルトリメチルアンモニウムを含む。特に好ましい態様において、本発明の組成物はいずれかの特定なカチオン含有化合物での製剤化に制限されないが、カチオン性ハロゲン含有化合物はCPCである。
本発明の他の態様において、ナノエマルジョンは、さらに、発芽エンハンサーを含む。いくつかの好ましい態様において、(他の濃度も考えられるが)エマルジョンは約1mM〜15mM、およびより好ましくは約5mM〜約10mMの一つまたは複数の発芽エンハンサー化合物を含む。好ましい態様において、発芽増強化合物はエマルジョンの形成に先立って水相に提供される。本発明では、発芽エンハンサーがナノエマルジョン組成物に添加されると、ナノエマルジョンの殺胞子特性が増強されると考えられる。本発明では、さらに、そのような発芽エンハンサーは中性pH(pH6〜8の間、好ましくは7)の近くで殺胞子活性を開始すると考えられる。そのような中性pHエマルジョンは、例えば、リン酸緩衝生理食塩水(PBS)で希釈することによって、または中性エマルジョンの調製によって得ることができる。ナノエマルジョンの殺胞子活性は、胞子が発芽を開始した場合に優先的に起こる。
なお他の態様において、ナノエマルジョンは、組成物(すなわち、「相互作用エンハンサー」)と標的病原体(例えば、ビブリオ(Vibrio)、サルモネラ(Salmonella)、シゲラ(Shigella)およびシュードモナス(Pseudomonas)のようなグラム陰性菌の細胞壁)との相互作用を増加させることができる一つまたは複数の化合物を含む。好ましい態様において、相互作用エンハンサーは、好ましくは、油相と混合するが、他の態様においては、相互作用エンハンサーは、乳化後、組成物と組み合わせて提供する。ある好ましい態様において、相互作用エンハンサーはキレート化剤(例えば、緩衝液[例えば、トリス緩衝液]中のエチレンジアミンテトラ酢酸[EDTA]またはエチレンビス(オキシエチレンニトリロ)テトラ酢酸[EGTA])。キレート化剤は単に例示的な相互作用増強化合物であると理解される。事実、微生物剤および/または病原体と本発明のいくつかの態様で用いるナノエマルジョンの相互作用を増加させる他の剤が考えられる。特に好ましい態様を用いて、相互作用エンハンサーは約50〜約250μMの濃度におけるものである。当業者であれば、本発明の組成物と組み合わせたそのような剤を標的に適用し、前記剤なくして本発明の組成物による標的の不活化と、混合により接触した場合の標的の不活化を比較することによって、特定の剤が相互作用エンハンサーとして作用する所望の機能を有するか否かを決定することができると考えられる。エマルジョンと細菌との相互作用を増加させ、それにより、その不存在下におけるそのパラメーターと比較して細菌の増殖を減少または阻害するいずれの剤も相互作用エンハンサーと考えられる。
いくつかの態様において、本発明のナノエマルジョンは第四級アンモニウム含有化合物を含む。例示的な第四級アンモニウム化合物は、限定されるものではないが、塩化アルキルジメチルベンジルアンモニウム、塩化ジデシルジメチルアンモニウム、塩化アルキルジメチルベンジルおよび塩化ジアルキルジメチルアンモニム、塩化N,N−ジメチル−2−ヒドロキシプロピルアンモニウムポリマー、塩化ジデシルジメチルアンモニウム、塩化n−アルキルジメチルベンジルアンモニウム、塩化n−アルキルジメチルエチルベンジルアンモニウム、塩化ジアルキルジメチルアンモニウム、塩化n−アルキルジメチルベンジルアンモニウム、塩化n−テトラデシルジメチルベンジルアンモニウム一水和物、塩化n−アルキルジメチルベンジルアンモニウム、塩化ジアルキルジメチルアンモニウム、ヘキサヒドロ−1,3,5−トリス(2−ヒドロキシエチル)s−トリアジン、塩化ミリスタルコニウム(および)カントリニウム(Quat RNIUM) 14、塩化アルキルビス(2−ヒドロキシエチル)べジルアンモニウム、塩化アルキルジメチルベンジルアンモニウム、塩化アルキルジメチル3,4−ジクロロベンジルアンモニウム、塩化アルキルジメチルベンジルアンモニウム、アルキルジメチルベンジルジメチルベンジルアンモニウム、塩化アルキルジメチルジメチルベンジルアンモニウム、臭化アルキルジメチルエチルアンモニウム、臭化アルキルジメチルエチルアンモニウム、塩化アルキルジメチルエチルベンジルアンモニウム、塩化アルキルジメチルイソプロピルベンジルアンモニウム、塩化アルキルトリメチルアンモニウム、塩化アルキル1または3ベンジル−1−(2−ヒドロキシエチル)−2−イミダゾリニウム、塩化ジアルキルメチルベンジルアンモニウム、塩化ジアルキルジメチルアンモニウム、塩化ジデシルジメチルアンモニウム、塩化2−(2−(p−(ジイソブチル)クレゾスキシ)エトキシ)エチルジメチルベンジルアンモニウム、塩化2−(2−(p−(ジイソブチル)フェノキシ)エトキシ)エチルジメチルベンジルアンモニウム、塩化ジオクチルジメチルアンモニウム、塩化ドデシルビス(2−ヒドロキシエチル)オクチルハイドロジェンアンモニウム、塩化ドデシルジメチルベンジルアンモニウム、塩化ドデシルカルバモイルメチルジメチルベンジルアンモニウム、塩化ヘプタデシルヒドロキシエチルイミダゾリニウム、ヘキサヒドロ−1,3,5−トリス(2−ヒドロキシエチル)−s−トリアジン、塩化オクチルデシルジメチルアンモニウム、塩化オクチルドデシルジメチルアンモニウム、塩化オクチルフェノキシエトキシエチルジメチルベンジルアンモニウム、オキシジエチレンビス(アルキルジメチルアンモニウムクロライド)、第四級アンモニウム化合物、塩化ジココアルキルジメチル、トリメトキシシリルクワッツおよび塩化トリメチルドデシルベンジルアンモニウムを含む。
本発明のワクチン組成物に用いるナノエマルジョンは古典的なエマルジョン形成技術を用いて形成することができる。簡単に述べれば、(例えば、高い水圧および機械的力を用い)比較的高い剪断力下で油相を水相と混合して、直径がほぼ0.5〜5ミクロン、および好ましくは1〜2ミクロンである油液滴を含有する水中油型エマルジョンを得る。エマルジョンは、約1:9〜5:1、好ましくは約5:1〜3:1、最も好ましくは4:1の水相に対する油相の範囲の容量対容量の単位で、油相を水相と混和することによって形成される。フレンチプレスまたは高剪断ミキサー(例えば、FDAに認可された高剪断ミキサーは、例えば、Admix,Inc.,Manchester,NHから入手できる)のようなエマルジョンを形成するのに充分な剪断力を生じさせることができるいずれかの装置を用い、油相および水相を混和することができる。そのようなエマルジョンを製造する方法は、参照としてその全体を組み入れられる米国特許第5,103,497号および第4,895,452号に記載されている。
いくつかの態様において、潜在的ナノエマルジョンワクチンを感染症の動物モデルで試験する。良く開発された動物モデル使用は、ヒト対象への投与に先立ってワクチンの有効性および安全性を測定する方法を提供する。例示的な病気の動物モデルを表3に示す。それらの動物は(例えば、Jackson Laboratories Charles River;Portage,MIから)商業的に入手可能である。
いくつかの態様において、候補ナノエマルジョンワクチンはいくつかの適当なモデル系のうちの1つを用いて評価する。例えば、細胞媒介免疫応答はインビトロで評価することができる。加えて、動物モデルを用いてインビボ免疫応答および病原体攻撃に対する免疫性を評価することができる。限定されるものではないが、表3に開示されたものを含めた任意の適当な動物モデルを使用することができる。
本発明はワクチンとして使用するのに適したナノエマルジョン/病原体製剤を提供する。前記組成物は、ヒトおよび動物対象を含めた対象に、任意の効果的な薬学的に許容される形態で投与することができる。一般に、これは、本質的にパイロジェンならびにヒトまたは動物に有害であり得る他の不純物を含まない組成物を調製することを含む。
エマルジョンを製剤化する方法
エマルジョンは以下の通り製造される。有機溶媒、油および界面活性剤を混和し、得られた混合物を37〜90℃にて一時間まで加熱することによって油相が作成される。エマルジョンは往復シリンジ器具またはシルバーソン(Silverson)高剪断ミキサーいずれかで形成される。水相を油相に添加し、1〜30分間、好ましくは5分間混合する。揮発性成分を含有するエマルジョンでは、揮発性成分を水相と共に添加する。
脂質液滴中に形成された乳化リポソームとしての例示的細菌不活化エマルジョンの特徴付け
脂質含有水中油型エマルジョンをX8Pと混合することによってX8W60PCと命名した細菌不活化エマルジョンを形成した。特に、一次脂質としてのモノオレイン酸グリセロール(GMO)および陽性電荷生成剤としての塩化セチルピリジニウム(CPC)を有する脂質含有水中油型エマルジョン(本明細書ではGMO/CPC脂質エマルジョンまたは「W808P」という)およびX8Pを1:1(容量vs容量)比で混合した。(その全体を参照として本明細書に組み入れられる)米国特許第5,547,677号は、GMO/CPC脂質エマルジョン、およびX8Pと組み合わせて本発明のワクチンで使用される細菌不活化水中油型エマルジョンを提供することができる他の関連脂質エマルジョンを記載する。
インビトロ殺菌効果の研究I−グラム陽性菌
本発明のワクチンで使用されるエマルジョンの殺菌効果を研究するために、エマルジョンを種々の細菌と10分間混合し、次いで、種々の希釈にて標準微生物学的培地上で平板培養した。次いで、コロニーのカウントを未処理培養と比較して、処理によって死滅された細菌のパーセントを決定した。表5は実験の結果をまとめる。
インビトロ殺菌効果の研究II−グラム陰性菌
グラム陰性菌の細胞壁による細菌不活化エマルジョンの取り込みを増加させ、それにより、抵抗性グラム陰性菌に対するエマルジョンの殺微生物効果を増強させるため、EDTA(エチレンジアミンテトラ酢酸)をエマルジョンと予め混合した。前記EDTAは低濃度(50〜25μM)で用い、前記混合物を種々のグラム陰性菌と共に15分間インキュベートした。次いで、前記混合物の殺微生物効果をトリプティカーゼ大豆ブロス上で測定した。結果を以下の表7に記載する。1/100希釈中のX8Pを用い、細菌カウントの99%を超える減少があった。カウントのこの減少は、250μMのEDTA単独が15分以内に細菌カウントを減少させることができなかった対照群から示されたように、EDTA単独の死滅効果によるものではなかった。
インビトロ殺菌効果の研究III−栄養および胞子形態
バチルス・セレウス(B. cereus ATCC#14579)を炭疽菌についてのモデル系として使用した。バチルス・セレウスの(活発に増殖しつつある)栄養形態に対する本発明の化合物の殺菌効果を研究するためのX8P希釈調製物での実験を行なった。37℃における10分間の培地中での処理を評価した。表8にまとめるように、X8Pエマルジョンはバチルス・セレウスの栄養形態に対して効果的である。この調製物での10分間の曝露は、1:100と高い希釈を含めた試験した全ての濃度においてバチルス・セレウスの栄養形態の実際に完全な死滅に効果的である。
インビボ殺菌効果の研究
動物研究を行なって、インビボでのエマルジョンの保護および治療効果を証明した。実験動物におけるバチルス・セレウス感染は、以前、炭疽の研究用のモデル系として用いられた(BurdonおよびWende,1960;Burdonら、1967;LamannaおよびJones,1963)。炭疽と同様ないくつかの点において、バチルス・セレウスで実験的に感染させた動物で誘導した病気兆候(Drobniewski,1993;Fritzら、1995)。マウスへの注射前に、エマルジョンをバチルス・セレウス胞子と混合した。
1cmの皮膚創傷を2.5×107バチルス・セレウス胞子で感染させ、次いで、いずれのさらなる処理もなく閉じた。他の群を同一数の胞子で感染させた。1時間後、創傷を本発明のエマルジョンまたは生理食塩水のいずれかで灌注して、曝露後、脱汚染を刺激した。48時間までに、創傷を囲む大きな壊死領域があり、平均面積は4.86cm2であった。加えて、この群における動物の60%は感染の結果として死亡した。これらの病巣の組織学は、皮膚および皮膚下ならびに多数の栄養型バチルス生物の全壊死を示した。生理食塩水での実験的に感染させた創傷の灌注の結果、いずれの明らかな利点もなかった。
CD−1マウスに対照としての生理食塩水中に1:10希釈したエマルジョンを注射し、肉眼または組織学的分析いずれかにおいて、苦痛または炎症反応の兆候を示さなかった。インビボでのバチルス・セレウス胞子の病原効果およびエマルジョンの殺胞子効果を試験するために、4×107バチルス・セレウス胞子の懸濁液を生理食塩水または1:10の最終希釈の本発明のエマルジョンと混合し、次いで、直ちに、CD−1マウスの背中に皮下注射をした。
ウサギの角膜を種々の濃度のエマルジョンで灌注し、24時間および48時間にモニターした。組成物を治療量で用いた場合、刺激または異常は観察されなかった。
鼻腔当たり4%のナノエマルジョンの25μLの注入によって、鼻腔内毒性をマウスにおいて行なった。これらのマウスにおいて臨床的または組織病理学的変化は観察されなかった。
インビボ毒性実験I
CD−1マウスに0.1mlのナノエマルジョンを皮下注射し、炎症および/または壊死の兆候につき4日間観察した。化合物の希釈は滅菌生理食塩水中で行なった。マウスからの組織試料は組織病理学検査のために10%中性緩衝化ホルマリン中に保存した。組織学的再検査のために送付された(未希釈化合物を注射したマウスからの)皮膚および筋肉からの試料は、組織壊死の兆候を示すと報告された。希釈化合物を注射したマウスからの組織試料は組織学的には調べなかった。表16および17は2つの個々の実験の結果を示す。
インビボ毒性実験II
各々5匹のオスおよび5匹のメスよりなるSD(Sprague−Dawley)ラットの1つの群を個々のケージに入れ、投与前に5日間前馴化させた。ラットに14日間毎日投与した。0〜13日には、14日間続けて、グループ1における各ラットは、各々、3ミリリットルのX8P、1:100濃縮の胃管処理を受けた。3ミリリットルの容量は、ラットについての最大許容鼻腔容量であると判断された。投与に先立ち、0日および7日に、各々のラットの体重を測った。その後、ラットは研究の継続中に毎週体重を測った。動物は病気または死亡率につき毎日観察した。動物を14日間休息させた。28日に、ラットの体重を測り、安楽死させた。鼻腔毒性実験の平均体重結果を表19に示す。0日、7日、および14日、21日および28日におけるオスおよびメスについての平均体重ならびに0日〜28日の平均体重増加も表18に示す。1匹のラットが、14日の投与の間に胃管挿入の操作から機械的外傷のため死亡した。全ての生存するラットは28日にわたる研究の間体重を増加し、病気の報告はなかった。従って、リン酸トリブチル単独は毒性であって粘膜に刺激性であることが知られているが、本発明のワクチンで使用するエマルジョンに配合すると、これらの特徴は明らかではない。X8Pエマルジョン、1:100濃縮を、米国連邦規則集16(16CFR)§1500.3に規定されたプロトコルに従ってウサギにおける皮膚毒性についても試験した。エマルジョンは試験した動物において皮膚に対して刺激性でなかった。
炭疽菌でのインビトロ実験
炭疽菌の胞子形態に対する本発明の化合物の殺菌効果を研究するためのX8W60PC調製物での実験を行なった。炭疽菌の6つの異なる系統に対するX8W60PC(水中)の異なる希釈の殺胞子活性を試験した。X8W60PCは4時間以内に炭疽の7つの異なる系統(デルリオ(Del Rio)、テキサス(Tx);バイソン(Bison)、カナダ(Canada):サウスアフリカ(South Africa)2系統);モザンビーク(Mozambique);サススダコタ(S.Dakopa);およびエイムス(Ames)、ウサムリッド(USAMRID))の98%を超えて死滅させ、1〜10%漂白として効果的である。同様な殺胞子活性が培地中のX8W60PCの異なる希釈で見出される(1:10、1:100、1:1000および1:5000)。X8W60PCは30分と短い時間で炭疽胞子を死滅させることができる。
作用機序
以下の実施例は、いくつかのナノエマルジョンの提案された作用機序に対する洞察を提供する。また、本実施例は、本発明のワクチンで使用されるいくつかのナノエマルジョンの殺胞子活性を示す。この機序は本発明の範囲を限定することを意図しない。機序の理解は本発明を実施するのに必要でなく、本発明はいずれかの特定の機序に限定されない。大腸菌に対するGMO/CPC脂質エマルジョン(「W808P」)およびX8Pの効果を調べた。W808Pは(脱イオン水中で)大腸菌を死滅させたが、X8Pはこの生物に対して効果的でなかった。X8P処理大腸菌は正常に見え、規定された構造および無傷脂質膜を備えている。W808P処理大腸菌は内部に空砲を有し、生物の規定された構造が失われるように内容物が膨潤している。特定の理論に拘束されないが(機序の理解は本発明を実施するのに必要ではなく、本発明はいずれかの特定の機序に限定されない)、この観察は、W808Pはそれらを溶解することなく細菌を死滅させ、その代わり、内部構造の変化を引き起こすことを示唆し、空胞化および膨潤によって明らかである。第2の研究はコレラ菌で行なった。コレラ菌は大腸菌に密接に関連するにもかかわらず、X8P、W808PおよびX8W60PCは全てこの生物を死滅させた。対照と比較し、W808P処理コレラ菌は、再度、生物の内部の膨潤および変化を示すが、細胞は無傷のままである。対照的に、X8P処理コレラ菌は残りの細胞片のみで完全に溶解される。X8W60PCは効果の組合せを示し、ここに、生物のいくつかは膨潤するが、無傷であり、あるものは溶解する。これは、明らかに、X8P、W808PおよびX8W60PCが異なる機序によって働くことを示唆する。
バチルス種に対するナノエマルジョンの殺胞子活性のさらなる証拠
本実施例は、異なるバチルス胞を不活化するナノエマルジョンの能力のさらなる検査の結果を提供する。これらの実験の方法および結果を下に概略を示す。
油相が大豆油、リン酸トリ−n−ブチル、および80%水中のトライトン X−100から作成されたX8P、油中水型ナノエマルジョン。X8W60PCは、グリセロールモノステアリン酸、精製大豆ステロール、ツィーン 60、大豆油、カチオンハロゲン含有CPCおよびペパーミント油から作成されたリポソーム様化合物であるW808Pと等しい容量のX8Pを混合することによって調製した。
胞子形成の誘導のために、バチルス・セレウス(ATTC 14579)、バチルス・シルクランス(ATCC 4513)、巨大菌(ATCC 14581)、および枯草菌(ATCC 11774)をNAYEMn寒天(0.1%酵母エキスおよび5mg/l MnSO4を含む栄養寒天)上で37℃にて一週間増殖させた。プレートを掻き取り、細菌/胞子を滅菌50%エタノールに懸濁させ、攪拌しつつ室温(27℃)にて2時間インキュベートして、残りの栄養型細菌を溶解させた。懸濁液を2,500×gにて20分間遠心分離し、ペレットを冷diH2O中で2回洗浄した。胞子ペレットをトリプティカーゼ大豆ブロス(TSB)に再懸濁させ、直ちに、実験で用いた。炭疽菌胞子、エイムスおよびボラム(Vollum) 1B系統はBruce Ivins博士(USAMRIID,Fort Detrick,Frederick,MD)の好意により提供され、以前に記載されているように調製した(Ivinsら、Vaccine 13:1779[1995])。炭疽の4つの他の系統はMartin Hugh−Jones博士(LSU,Baton Rouge,LA)の好意により提供された。これらの系統は、サウスアフリカ;モザンビーク;バイソン、カナダ;およびデルリオ、テキサスからの高い対立遺伝子非類似性を持つ単離体を表す。
固体培地の殺胞子活性の評価のために、トリプティカーゼ大豆寒天(TSA)をオートクレーブ処理し、55℃まで冷却した。X8Pを1:100最終希釈にてTSAに加え、プレートを注ぐ間に連続的に攪拌した。胞子調製物を段階的に希釈し(10倍)、10μlのアリコットを二通りで平板培養した(最高接種はプレート当たり105胞子であった)。プレートを37℃にて好気的に48時間インキュベートし、増殖につき評価した。
37℃振とう培養機中のエルレンマイヤーフラスコを用い、バチルス・セレウス胞子をTSB中1:100最終希釈のX8Pで処理した。50ml試料を間隔をおいて採取し、2,500×gにて20分間遠心分離し、上澄みを捨てた。ペレットを0.1Mカコジレート(pH7.3)中の4%グルタルアルデヒドで固定した。胞子ペレットを透過型電子顕微鏡のために処理し、酢酸ウラニルおよび酢酸鉛での染色の後に薄い切片を調べた。
(最終濃度106胞子/mlの)バチルス・セレウス胞子を、発芽阻害剤D−アラニン(最終濃度1μm)または発芽刺激剤L−アラニン+イノシン(各々、最終濃度50μM)(TitballおよびManchee,J.Appl Bacteriol.62:269[1987];Shibataら、Jpn J.Microbiol.20:529[1976])いずれかを含むTSBに懸濁させ、次いで、直ちに(1:100の最終希釈にて)X8Pと混合し、種々の間隔でインキュベートした。次いで、混合物を段階的に希釈し、平板培養し、一晩インキュベートした。翌日、プレートをカウントし、パーセンテージ殺胞子活性を計算した。
2つの動物モデルを開発した。最初のものにおいて、(滅菌生理食塩水に懸濁させた)ビー・セレウス胞子を1:10の最終希釈にて等容量のX8Pと混合した。対照として、同一ビー・セレウス胞子懸濁液を等容量の滅菌生理食塩水と混合した。次いで、4×107胞子を含有する100μlの懸濁液を直ちにCD−1マウスに皮下注射した。
(式中、aおよびbは創傷の2つの垂直方向直径である)
X8Pの殺胞子活性を評価するために、バチルス属の4つの種、バチルス・セレウス、バチルス・シルクランス、巨大菌および枯草菌からの胞子を試験した。1:100希釈におけるX8Pは、4時間で、バチルス・セレウスおよび巨大菌に対して91%を超える殺胞子活性を示した。バチルス・シルクランスはX8Pに対して感受性は低く、胞子カウントの80%減少を示し、他方、枯草菌は4時間でX8Pに対して抵抗性のように見えた。バチルス・セレウス胞子に対する(1:10および1:100の希釈における)X8Pの殺胞子効果の比較を、漂白剤の1:100希釈(すなわち、0.0525%次亜塩素酸ナトリウム)で行い、殺胞子効果の率または程度いずれかにおいて有意な差は明らかでなかった。他のナノエマルジョンX8W60PCはバチルス胞子を死滅させるのにより効果的であった。1:1000希釈においては、それは(X8Pの1:1000希釈での47%と比較して)4時間以内のバチルス・セレウス胞子の98%死滅を示した。1:1000希釈におけるX8W60PCの結果、X8Pに対するその抵抗性とは対照的に、4時間以内の枯草菌胞子の97.6%死滅をもたらした。
バチルス・セレウス殺胞子経時的観察を行なって、8時間にわたるバチルス・セレウスに対する1:100希釈X8Pおよび1:1000希釈X8W60PCの殺胞子活性を分析した。バチルス・セレウス胞子と一緒にした1:100希釈X8Pのインキュベーションの結果、1時間以内に生きた胞子の数が77%減少し、4時間後に95%減少した。再度、1:1000希釈X8W60PCは1:100希釈X8Pよりも効果的であり、30分後にはカウントが約95%減少した。
初期インビトロ実験に続き、X8P殺胞子活性を炭疽菌の2つのビルレント系統(エイムスおよびボラム 1B)に対して試験した。増殖培地に配合された1:100最終希釈のX8Pは1×105炭疽菌胞子の増殖を完全に阻害することが判明した。また、エイムスまたはボラム 1B胞子いずれかと一緒にした1:1000までの希釈のX8Pでの4時間のインキュベーションの結果、混合物を室温でインキュベートした場合には91%を超える殺胞子活性となり、混合物を37℃でインキュベートした場合には96%を超える殺胞子活性となった(表21)。
1:1000までの希釈のX8Pは、27または37℃(胞子発芽の程度が顕著に異なる条件)いずれかにおいて、4時間以内に双方の胞子系統の>91%を効果的に死滅させた。殺胞子活性は1×106/mlまでの胞子濃度において合致した。
X8W60PCはより高い希釈にてX8Pよりもバチルス胞子のより多くの種に対して効果的であるので、それを室温にて1:10,000までの希釈にて炭疽菌の4つの異なる系統に対して試験して、発芽を妨げた。X8W60PCは1:1000希釈において86%および99.9%の間の最大死滅を示した(表22)。
胞子を室温において異なる希釈にてX8W60PCで処理して、発芽を妨げた。低い希釈では有意な死滅はなかった。最大殺胞子効果は1:1000希釈で観察された。
バチルス・セレウスは炭疽菌に最も密接に関連するので、それを用いて検査を行なった。TSB中に1:100希釈したX8Pで処理したバチルス・セレウス胞子の4時間の透過型電子顕微鏡検査により、中心の歪みおよび密度の喪失を伴う胞子外皮および皮質の広範な破壊を含めたバチルス・セレウス胞子に対する物理的損傷が明らかとなった。
バチルス胞子に対するX8Pの殺胞子効果に与える発芽の阻害の効果を調査するために、発芽阻害剤D−アラニン(TitballおよびManchee,1987,前記)、および発芽刺激剤L−アラニンおよびイノシン(Shibataら、1976,前記)を胞子およびX8Pと共に1時間インキュベートした。X8Pの殺胞子効果は10mMのD−アラニンの存在下では遅延し、50μMのL−アラニンおよび50μMのイノシンの存在下では加速された。
実験動物におけるバチルス・セレウス感染は、以前、炭疽の実験用のモデル系として用いられており、実験的炭疽感染と類似の病気を引き起こす(Welkosら、Infect Immun.51:795[1986];Drobniewski,Clin Microbiol Rev.6:324[1993];Burdonら、J Infect Dis.117:307[1967];Fritzら、Lab Invest.73:691[1995];WelkosおよびFriedlander,Microb Pathog 5:127[1988])。皮膚バチルス・セレウス病の2つの動物モデルを開発して、X8Pのインビボ効果を評価した。これらのモデルはナノエマルジョンの皮下投与を含むので、X8Pのインビボ毒性試験をこの適用に先立って行なった。対照としての生理食塩水中に1:10希釈したX8Pを注射したCD−1マウスは、肉眼または組織学的観察において苦痛または炎症反応の兆候を呈しなかった。インビボでのバチルス・セレウス胞子の病原効果およびX8Pの殺胞子効果を試験するために、4×107バチルス・セレウス胞子の懸濁液を生理食塩水または1:10の最終希釈のX8Pと混合し、次いで、CD−1マウスの背中に直ちに皮下注射した。X8Pなくしてバチルス・セレウス胞子を皮下注射したマウスは6〜8時間において重篤な浮腫を生じた。これに続き、18〜24時間において注射部位を囲う灰色の壊死領域が現れ、48時間までには存在する皮膚はひどいかさぶたとなり、乾燥した赤色病巣が残った。胞子およびX8Pの同時注入の結果、胞子をX8Pと予め混合すると、1.68cm2から0.02cm2への壊死病巣のサイズの98%を超える減少があった。これは最小浮腫または炎症に関連した。
インビトロでのインフルエンザA型ウイルス感染性に対する界面活性剤脂質調製物(SLPS)の効果
以下の実施例は、インフルエンザA型ウイルス感染性に対するエマルジョンの効果を記載する。エンベロープウイルスは病原体として非常に関心がある。それは迅速に広がり、長期間宿主で生存できる。インフルエンザA型ウイルスはそれが抗ウイルス剤を試験するためのよく受け入れられたモデルであるので選択した(KaraivanovaおよびSpiro,Biochem J.329(Pt3):511[1998];Mammenら、J.Med Chem 38:4179[1995])。インフルエンザは、高度に伝染性であって、重篤な流行性病気の原因である臨床的に重要な呼吸器系病原体である。
SLPを2工程手法で作成した。油相は、大豆油を表1に列挙した試薬と混和し、86℃にて1時間加熱することによって調製した(Florence,1993)。次いで、水または水中の1%ビスマス(SS)を、往復シリンジポンプを用いて一定容量/容量比率にて油相に注入することによってSLPを形成した。
インフルエンザウイルスA/AA/6/60はHunein F.Maassab博士(School of Public Health,University of Michigan)によってご好意により提供された。インフルエンザA型ウイルスは、標準的な方法(BarrettおよびInglis,1985)を用い、受精した病原体不含めんどり卵(SPAFAS,Norwich,CT)の尿膜腔中で増殖させた。ウイルスストックを−80℃にて感染性尿膜流体のアリコット(108pfu/ml)中で維持した。アデノウイルスベクター(AD.RSV ntlacZ)はVector Core Facility(University of Michigan Medical Center,Ann Arbor,MI)によって提供され、アリコット中で維持した(−80℃にて1012pfu/ml)。前記ベクターは、E1AおよびE1Bにわたるヌクレオチド配列およびE3領域の一部を欠失したヒトアデノウイルス(セロタイプ5)ゲノム骨格に基づくものである。これは、非許容性細胞を複製または形質転換させるウイルスの能力を与える。それは、ラウス肉腫ウイルスロング末端リピート(RSV−LTR)からのプロモーターの制御下にあるβ−ガラクトシダーゼをコードする大腸菌LacZ遺伝子を運ぶ。また、前記ベクターはタンパク質発現の検出を容易とするためにLacZ遺伝子の5’末端に連結された核標的化(ntと命名)エピトープを含む(Baragiら、1995)。
Madin Darby Canine Kidney(MDCK)細胞はAmerican Type Culture Collection(ATCC;Rockville,MD)から購入し、273細胞(CRL 1573;形質転換された初代胚ヒト腎臓)はVector Core Facility(University of Michigan Medical Center,Ann Arbor、MI)から入手した。前記293細胞はアデノウイルス5の形質転換性遺伝子を発現し、従って、宿主細胞において複製するAd.RSV ntlacZベクターの能力を回復する。
MDCK細胞は10%胎児ウシ血清(FBS;Hyclone Laboratories,Logan,UT)を含有するアール(Earle)塩、2mMのL−グルタミンおよび1.5g/lの炭酸水素ナトリウム(Mediatech,Lnc.,Hemdon,VA)を含むイーグルの最小必須培地中で維持した。前記培地には0.1mMの非必須アミノ酸、1.0mMのピルビン酸ナトリウム、100Uペニシリン/mlおよびストレプトマイシン100μg/mlを補足してあった(Life Technologies,Gaithersburg,MD)。293細胞を、2mMのL−グルタミン、0.1mMの非必須アミノ酸、および1.0mMのピルビン酸ナトリウムを含有するダルベッコ改変イーグル培地(Mediatech,Inc.,Herndon,VA)中に維持した。また、それは100Uペニシリン/mlおよびストレプトマイシン100μg/mlを含有し(Life Technologies,Gaithersburg,MD)を含有し、10%FBSを補足してあった(Hyclone Laboratories,Logan,UT)。
インフルエンザA型感染培地は3.0μg/mlのトリルスルホニルフェニルアラニルクロロメチルケトン(TPCK)処理トリプシン(Worthington Biochemical Corporation,Lakewood,NJ)を補足したMDCK細胞維持培地であった(FBSを含まず)。アデノウイルス感染培地は血清の濃度を減少させた(2%FBS)293T細胞維持培地であった。
重層培地は等量の2×感染培地および1.6%シーケム(SEAKEM)MEアガロースよりなるものであった(FMC Bio Products,Rockland,MD)。染色アガロース重層培地は、TPCK処理トリプシンを含まない、アガロース重層培地+0.01%ニュートラルレッド溶液(Life Technologies,Gaithersburg,MD)よりなるものであった。
プラーク減少アッセイ法はその他の所で記載された方法(Haydenら、1980)を改変して行なった。MDCK細胞を12ウェルファルコン(FALCON)プレート中1×105細胞/ウェルにて接種し、37℃/5%CO2にて3日間インキュベートした。ほぼ1×108pfuのインフルエンザA型ウイルスを後記するように界面活性剤脂質調製物と共にインキュベートした。インフルエンザA型ウイルス−SLP処理物および対照を感染培地中に希釈して、30〜100pfu/250μlを含むようにした。密集細胞単層を3つのプレート上で三連で接種し、37℃/5%CO2にて1時間インキュベートした。接種物/培地を吸引し、1mlのアガロース重層培地/ウェルを加え、プラークが出現するまでプレートを37℃/5%CO2でインキュベートした。単層をアガロース重層培地で染色し、インキュベーションを37℃/5%CO2で継続した。プラークを染色から6〜12時間後にカウントした。脂質調製物濃度と共に9ウェルからの平均プラークカウントを未処理ウイルスウェルの平均プラークカウントと比較した。
インフルエザAウイルスで感染したMDCK細胞におけるウイルスタンパク質を検出し、定量するために、前記インサイチュー細胞ELISAを最適化した。簡単に述べれば、100μlの完全培地中の2×104MDCK細胞を平底96ウェルマイクロタイタープレートに加え、1晩インキュベートした。翌日、培地を取り出し、細胞を無血清維持培地で洗浄した。100μlのウイルス接種物をウェルに加え、1時間インキュベートした。ウイルス接種物を除去し、100μlのMDCK細胞維持培地+2%FBSで置き換えた。感染したMDCK細胞をさらに24時間インキュベートした。次いで、細胞をPBSで1回洗浄し、氷冷エタノール:アセトン混合物(1:1)で固定し、−20℃で保存した。アッセイの日に、固定した細胞のウェルをPBSで洗浄し、37℃にてPBS中の1%乾燥ミルクで30分間ブロックした。(Hunein F.Maassab博士(Scool of Public Health,University of Michigan)の好意によって提供された)100μlの1:1000希釈のフェレット抗インフルエンザA型ウイルスポリクローナル抗体を37℃にて1時間でウェルに添加した。細胞を洗浄乾燥液(PBSおよび0.05%ツィーン−20)で4回洗浄し、37℃にて、100μlの1:1000希釈のヤギ抗フェレットペルオキシダーゼ標識抗体(Kirkegaard & Perry Laboratories Gaithersburg,MA)と共に30分間インキュベートした。細胞を4回洗浄し、発色するまで100μlの1工程ターボTMB-ELISA(1−STEP TURBO TMB−ELISA)基質(Pierce,Rockford,IL)と共にインキュベートした。反応を1N硫酸で停止させ、ELISAマクロタイターリーダーにて450nmの波長でプレートを読んだ。
β−ガラクトシダーゼアッセイ法はその他の所で記載されているように(Lim,1989)細胞抽出物で行なった。簡単に述べれば、ほぼ4×104細胞/ウェルにて、293細胞を96ウェルの「U」底組織培養プレート上に接種し、37℃/5%CO2にて維持培地中で1晩インキュベートした。翌日、培地を除去し、細胞を100μlのダルベッコウのリン酸緩衝化生理食塩水(DPBS)で洗浄した。アデノウイルスストックを感染培地中で5×107pfu/mlの濃度まで希釈し、後記するように異なる濃度のX8Pと混合した。X8Pでの処理の後、ウイルスを1×104pfu/mlの濃度まで感染培地で希釈し、293細胞に重ねた。細胞を37℃/5%CO2にて5日間インキュベートし、その後、プレートを遠心分離し、培地を取り出し、細胞をCa++およびMg++を含まないPBSで3回洗浄した。3回目の洗浄の後、PBSを吸引し、100μlの1×レポーター溶解緩衝液(Promega,Madison,WI)を各ウェルに入れた。細胞溶解を増強するため、プレートを凍結させ、3回解凍し、若干改変した、β−ガラクトシダーゼの販売者(Promega,Madison,WI)によって提供された指示書に従ってβ−ガラクトシダーゼアッセイ法を行なった。5マイクロリットルの細胞抽出物を96ウェルの平底プレートに移し、45μlの1×レポーター溶解緩衝液と混合した(1:10)。引き続いて、50μlの2×アッセイ緩衝液(120mM Na2HPO4,80mM NaH2PO4,2mM NgCl2,100mM β−メルカプトエタノール、1.33mg/ml ONPG(Sigma,St.Louis,MO))を加え、細胞抽出物と混合した。弱い黄色が発色するまで、プレートを室温でインキュベートした。その時点で、100μlの1M炭酸水素ナトリウムを添加することによって反応を停止させた。ELISAマイクロプレートリーダにて420nmの波長でプレートを読んだ。標準におけるレベルと参照することによる回帰分析によって各細胞抽出物のβ−ガラクトシダーゼの単位を計算し、細胞抽出物試料中のタンパク質のミリグラムで割った。
ウイルス罹患性試験に先立ち、MDCKおよび293細胞に対するSLPの細胞傷害性を、顕微鏡観察およびMTTアッセイ法によって評価した。罹患性試験において適用したウイルスおよびSLPの混合物の希釈は、アッセイしたSLPの安全な濃度よりも少なくとも1桁大きくなるようにした。ほぼ1×108pfuのインフルエンザA型またはアデノウイルスいずれかを、振とう機上の結果に示したように異なる時点に1:10、1:100、および1:1000の最終濃度で脂質調製物と共にインキュベートした。インキュベーションの後、SLP/ウイルス混合物の段階希釈を適当な感染培地中で行い、前記したようにMDCK(インフルエンザA型)または293(アデノウイルス)細胞に重ねて、PRA、細胞ELISAまたはβ−ガラクトシダーゼアッセイ法を行なった。
超遠心分離機(20,000rpmでの16時間のBeckmanローターSW 28 Ti)を用いてGTNE(グリシン200mL,トリス−HCl 10mM(pH8.8),NaCl 100mM,およびEDTA 1mM)で調製した30%ショ糖クッションを通すことによって、インフルエンザA型ウイルスを尿膜流体から半精製した。ペレット化されたウイルスをGTNE中で再構築した。10マイクロリットルの各試料(アデノウイルス、インフルエンザウイルス、アデノウイルス+X8P、インフルエンザウイルス+X8P)を15および60分間インキュベートし、次いで、パロジアン被覆200メッシュ銅グリッド上に2分間置いた。5μlの2%カコジル化緩衝グルタルアルデヒドを次いで加えた。3分後、流体を濾紙で除去した。10マイクロリットルの7%酢酸ウラニルをグリッドに加え、30秒後に、濾紙で吸い取った。グリッドを10分間乾燥させ、フィリップス(Philips) EM400t透過型電子顕微鏡で調べた。顕微鏡写真を200,000×の倍率でフジ(Fuji)FGフィルムに記録した。
MDCK細胞のインフルエンザA型感染に対する4つの界面活性剤脂質調製物(X8P,NN,W808PおよびSS)の効果を調べた。全ての試験した調製物は、種々の程度インフルエンザA型ウイルス感染を阻害した。X8PおよびSSは、1:10希釈にてインフルエンザA型感染の95%を超える阻害を呈した。NNおよびW808PはインフルエンザA型ウイルスに対して中程度の効果を示したに過ぎず、ほぼ40%だけ感染を低下させた。X8Pの殺ウイルス効果は1:100希釈においてさえ減少しなかった。SSは55%だけインフルエンザA型感染を阻害する1:100希釈にあまり効果的でなかった。1:1000希釈におけるこれらの2つの脂質調製物は、22〜29%の範囲のウイルス感染性に対する弱い阻害効果を示したにすぎなかった。
X8PがインフルエンザA型感染性に作用する時間条件を調べるために、2つの希釈(1:10、1:100)および4つの異なる時間間隔(5分、10分、15分、30分)においてウイルスをX8Pと共にインキュベートした。引き続いて、プラーク減少アッセイ法を行なった。表24に示すように、いずれかの希釈におけるX8Pとのインキュベーションから5分後、MDCK細胞のインフルエンザA型ウイルス感染性は完全になくなった。濃度または時間に拘わらず、X8PとインフルエザAウイルスの相互作用の間に有意な差はなかった。
トライトン X−100界面活性剤は抗ウイルス活性を有するので(MahaおよびIgarashi,Southeast Asian J Trop Med Public Health 28:718[1997])、トライトン X−100単独または個々のX8P成分と組み合わせたトライトン X−100がX8Pと同程度だけインフルエンザA型感染性を阻害するかを調べた。インフルエンザA型ウイルスを:1)X8P、2)リン酸トリ(n−ブチル)、トライトン X−100、および大豆油(TTO)の組合せ、3)トライトン X−100および大豆油(TO)、または4)トライトン X−100(T)単独で処理した。X8Pは、トライトン X−100単独または試験した他の成分と混合したトライトン X−100よりも1:10および1:100希釈(1:500および1:5000のトライトン X−100希釈)においてインフルエンザA型ウイルスに対して有意により効果的であった。希釈1:1000において、X8P(1:50,000のトライトン X−100希釈)はほぼ50%だけMDCK細胞のインフルエンザA型感染を低下させることができ、他方、同一濃度におけるトライトン X−100単独は完全に効果的でなかった。
X8Pが非エンベロープウイルスの感染性に影響し得るか調べるために、β−ガラクトシダーゼをコードするLacZ遺伝子を含有する遺伝子工学により作成したアデノウイルスを用いた。このアデノウイルス構築物は形質転換する遺伝子を欠き、従って、複製でき、アデノウイルス5の形質転換するウイルスを含有する許容性細胞のみを形質転換させることができる。構成的に形質転換性遺伝子を発現する293細胞を使用して、アデノウイルス複製およびβ−ガラクトシダーゼ酵素の生産を促進させた。X8P処理は293細胞においてβ−ガラクトシダーゼ活性を複製し、それを発現するアデノウイルスの能力に影響しなかった。X8P処理および未処理アデノウイルスは共にほぼ0.11単位のβ−ガラクトシダーゼ酵素を生産した。
X8Pはエンベロープウイルスの感染性を改変したのみだったので、エンベロープウイルス完全性に対するこのエマルジョンの作用を電子顕微鏡を用いてさらに調べた。X8Pの1:100希釈での60分のインキュベーションの後、アデノウイルスの構造は不変であった。X8Pとの15分のインキュベーションの後に少数の認識可能なインフルエンザA型ビリオンが位置したが、1時間のインキュベーションの後に認識可能なインフルエンザA型ビリオンは見出されなかった。インフルエンザA型ウイルスに対するX8Pの効率および粘膜に対するその最小毒性は、エンベロープウイルスでの感染に由来する病気を予防するための効果的な消毒剤および剤としてのその可能性を示す。
マウスにおいて免疫応答を誘導するナノエマルジョン/インフルエンザ組成物の能力
本実施例は、マウスにおいて特異的免疫応答誘導する例示的ナノエマルジョン組成物の能力を記載する。
霧化されたエアロゾルによるインフルエンザウイルス(5×105p.f.u/ml)への曝露の90分前に、マウスを鼻腔適用したナノエマルジョン(1.0%8N8および1.0%または0.2%20N10)で予め処理した。ナノエマルジョンでの予備処理からの罹患率は最小であり、対照動物と比較して、死亡率は多いに減少した(予備処理の20%に対し対照において80%、Donovanら、Antivir Chem Chemother.,11:41[2000])。生存するエマルジョン予備処理動物のいくつかは、エマルジョンで処理したがウイルスに曝露しなかった対照動物に存在しない肺における免疫応答および巨大細胞形成の証拠を有した。予備処理した動物の全ては肺マクロファージにおける脂質取り込みの証拠を有した。
X8Pエマルジョンをウイルスと予め混合した。最終エマルジョン濃度は2%であって、ウイルス濃度は2×106pfu/mlであった。エマルジョン/ウイルス溶液のエマルジョン/ウイルス溶液(25μl)を温和な麻酔下のマウスの鼻腔に投与した。対照群には、3日間インキュベートしたホルムアルデヒド溶液の1:4000希釈を用いて不活化した同一ウイルス用量を与えて、完全な不活化を確実にした。もう1つの対照群は、低下した用量のウイルス(100pfu/マウス)を与えたマウスを含んだ。さらなる対照はナノエマルジョン単独または生理食塩水単独を与えた。
ナノエマルジョンワクチンの試験
本実施例は、その安全性および効率につき潜在的ナノエマルジョンワクチンを試験するのに有用な実験を記載する。
鼻腔内予防:
動物の6群(表26)に、その間15〜60分の間隔で鼻腔内処理の以下のスケジュールを与える。動物を病気のいずれかの兆候につきモニターする。血液、気管肺胞胃管流体および鼻洗浄液を集め、ELISAを用いて病原体特異的抗体力価につき試験した(Fortierら、[1991];Jacobyら、[1983],およびTakaoら、[1997])。二週間後、生存する動物を致死用量の病原体で抗原投与して、保護免疫応答の発生につき試験した。実験の最後(抗原投与から少なくとも2週間後)に全ての他の動物に当てはまるように、最後に病気の動物を同定されるや否や人道的に犠牲にする。血液および組織を組織病理学的検査のために収穫し、血清学的および細胞媒介免疫応答双方を測定する。
細胞媒介免疫応答をインビトロで評価する。評価は、前記した(セクションA)実験から得られた安楽死させた動物から収穫した免疫担当細胞で行なう。抗原での再刺激の後に、T細胞増殖応答を評価する。細胞を全病原体またはDNA、RNAもしくはタンパク質のような病原体構成物の単独またはナノエマルジョンと混合したもので再刺激する。増殖活性はH3−チミジン取り込みまたは細胞増殖ELISA化学発光によって測定する。増殖に加えて、Th1およびTh2サイトカイン応答を測定して、免疫応答を定性的に評価する。これらはIL−2、TNF−γ、IFN−γ、IL−4、IL−6、IL−11、IL−12等を含む。
本実施例は、本発明のナノエマルジョンワクチンを試験する方法の非限定的例を提供する。鼻腔内ワクチン接種:動物を6つの群に分ける。各群に異なる鼻腔内抗原投与を与えて、得られた免疫応答を評価する。
1.ナノエマルジョン単独(陰性対照)
2.病原体単独(陽性対照)
3.投与直前に調製されたナノエマルジョン/病原体混合物
4.投与三日前に調製されたナノエマルジョン/病原体混合物
5.ホルムアルデヒドで死滅させた病原体
インフルエンザA型およびナノエマルジョンでの鼻腔内免疫化後におけるウイルス肺炎からのマウスの保護
A.材料および方法
動物
雌C3H/HeNHsd(Harlan,Indianapolis,IN)(5週齢の特異的病原体の内マウス)を全ての実験で用いる。
インフルエンザA型/アナーバー/6/60ウイルス(H2N2)、マウス適合化F−14−95、E1、M3、E1、SE1はHunein Maassab博士(School of Public Health,University of Michigan,Ann Arbor,MI)によって提供された。インフルエンザA型/プエルトリコ/8/34ウイルス(H1M1)、マウス適合化F8、M593、E173、SE1はATCC(Rockville,MD)からのものであった。その他の所で記載された標準的な方法(Herlocherら、Virus Res.,42:11[1996])を用い、全てのウイルスは受精病原体不含雌鳥卵(SPAFAS,Norwich,CT)の尿膜腔中で増殖させた。ウイルスストックを−80℃において感染性尿膜流体のアリコット中で維持した。以前記載されたように(Mertonら、Production of influenza virus in cell cultures for vaccine preparation.In.Novel Strategies in Design and Production of vaccines,S.Cohenおよび A.Shafferman編、Plenum Press,New York,1996,頁141−151)、ウイルスを4℃における90分間の100,000gのショ糖勾配15〜60%溶液で精製した。ウイルスを含むバンドを収集し、NTE緩衝液(100mM NaCl,10mM トリス−HCl,1mM EDTA,pH=7.5)中に希釈し、4℃にて60分間100,000×gで回転沈降させた。ウイルスペレットをNTE緩衝液に再懸濁し、−80℃で保存した。
以前記載されたように(Chenら、J.Virol.61:7[1987];Novakら、Vaccine 11:1[1993])、ウイルス不活化を行なった。簡単に述べれば、異なる用量(103〜105pfu)のウイルスをホルムアルデヒド溶液(希釈1:4000)中で3日間インキュベートし、引き続いて動物に投与した。
2×104〜5×105pfuの種々の濃度における無傷インフルエンザA型ウイルスを等用量の4%X8Pナノエマルジョンと混合し(最終濃度:2%)、37℃にて60分間インキュベートした。
X8P界面活性剤ナノエマルジョンを2工程手法で調製した。油相は以下の成分:TBP(最終濃度8%)、トライトン X−100(8%)および大豆油(64%)を混和し、70℃にて30分間加熱することによって調製した(例えば、その各々を参照として本明細書に組み入れられる米国特許第6,015,832号および米国特許出願第20020045667号参照)。次いで、シルバーソンL4RTミキサー(Silverson L4RT Mixer)を用いて10,000rpmにて水(20%)と3分間混合することによって界面活性剤ナノエマルジョンを形成した。トライトン X−100はシグマ ケミカルズ(Sigma Chemicals)(St.Louis,MO)から購入し、TBPはアルドリッチ(Aldrich)(Milwaukee,WI)から購入し、大豆油はクロダ(Croda Inc.)(Mill Hill,PA)から購入した。以前記載されたように(例えば、前記実施例参照)、X8Pナノエマルジョンを動物毒性につき試験した。簡単に述べれば、マウスをメトファンで麻酔し、50μl(25μl/鼻腔)の容量の異なる濃度のナノエマルジョン(1、2および4%)をマウスに鼻腔内投与した。マウスにおける直接的鼻腔内吸入の後、全ての試験した濃度のナノエマルジョンは充分に許容された。これらのデータに基づき、免疫化実験のために2%X8Pを選択した。
以前記載されたように(Mycら、J.Virol.Meth.77:165[1999])、プラークアッセイ法(PA)は6ウェルプレートにてMDCK単層細胞で行なった。プラーク減少アッセイ法(PRA)はHaydenらによって記載されている方法(Antimicrob.Agents and Chemother.,17:865[1980])を改変して行なった。MDCK細胞を150×25mmペトリ皿中で80%密集度まで増殖させた。ほぼ1×108pfuのインフルエンザA型ウイルスを室温(RT)30分間、ナノエマルジョンまたはPBSいずれかと共にインキュベートした。インキュベーションの後、ナノエマルジョン処理および未処理ウイルスを250mlの培地に再懸濁し、全容量のウイルス懸濁液を別々の細胞単層上に置き、従前に記載された(MYCら、前記)プラークアッセイ方法に従って1時間インキュベートした。
後記結果セクションに記載するように、全ての群のマウスを、全容量の50μl(25μl/鼻腔)中のウイルスまたは対照溶液で鼻腔内処理した。簡単に述べれば、各マウスをハロタンで麻酔し、外部鼻腔に適用されたエマルジョンの液摘が完全に吸入されるまで鼻を倒置した。全てのマウスを実験の第1日に1回処理した。21日に、マウスを(鼻腔内処理に用いた)共通遺伝子系統ウイルスまたは異種遺伝子系統ウイルスいずれかでLD100にて抗原投与した。抗原投与の後、マウスを病気の臨床的兆候につき14日間毎日モニターした。病気の臨床的兆候を0〜3のスケールで等級分類し、ここに、0は有意な臨床的異常無しを示し;1は増殖、丸まった背中および運動の減少を含めた温和な兆候を示し;2はチアノーゼ、呼吸困難、循環妥協、頻呼吸および直腸温度<33℃を示し;および3は動物の脂肪を示した。直腸コア体温はRET−3型Tマウス直腸プローブを供えたモデルBAT−12デジタル温度計(Physitem,Clifton,NJ)で記録した(Rozenら、Meth.Mol.Biol.,132:365[2000])。33℃未満のコア体温を持つマウスは最後には死に掛かっていると判断され、人道的に安楽死させた(Stevensonら、J.Immunol.,157:3064[1996])。抗原投与から14日後に生存したマウスは正常な体温を有し、病気の臨床的兆候は有さなかった。
血液試料は実験の間に異なる時間間隔での心臓穿刺によって尾静脈からまたは安楽死させた動物から得た。肺、局所的リンパ節、脾臓および肝臓の試料は安楽死させた動物から収集し、後記するようにRT PCRまたは増殖アッセイプロトコルに従って処理した。
A系統で保存されたM遺伝子の246bp断片についての以下のプライマーを、以前記載されたように(Schweigerら、J.Clin.Microbiol.,38:1552[2000])、PCRで用いた。
および
。プライマーはオペロン テクノロジーズ(Operon Technologies,Inc.)(Alameda,CA)に注文した。ウイルスRNAはTri試薬(MRC,Cincinnati,OH)の使用により組織ホモジネートから単離した。肺、縦隔リンパ節、脾臓および肺をRNA抽出で用いた。cDNA合成は、5.0mMのMgCl2、500μMの各dNTP、2.5μMランダムヘキサマープライマー、0.4U/μlのRNase阻害剤および2.5U/μlのスーパースクリプトII RT(Suparscript II RT)(Invitrogen,Rockville,MD)を用いて2.0μgの全組織RNAで行なった。熱サイクルは、12分間の25℃における、50分間の42℃における、次いで15分間の70℃における3単一サイクル(GeneAmp PCR System2400/Perkin Elmer)を用いて全容量20μlで行なった。PCR増幅は0.2μMの各プライマー、0.2mMの各dNTP、1.5mMのMgCl2、0.1U/μlのTaq DNA ポリメラーゼ(Roche Molecular Biochmicals,Indianapolis,IN)を用いて0.01〜0.1μgのcDNAで行なった。20μlの全容量でのPCR反応を94℃にて2分間インキュベートし、次いで、62℃におけるアニーリング、72℃における伸長および94℃における変性にて35サイクルを行なった。電気泳動用のトリス酢酸緩衝液およびDNA染色用の臭化エチジウムを用い、ポストPCR分析を2%ナッシブ(Nusive)/1%アガロースゲルで行なった。バイオラッド(BioRad)(Hercules,CA)からのフォトイメージングカメラおよびソフトウエアを用いて分析を行なった。
IgG特異的Ab力価をELISAで測定した。マイクロタイタープレート(NCNC)を56℃にてPBS中の0.5%グルタルアルデヒド(Sigma,St.Louis,MO)で1時間予備処理し、PBSで4回洗浄した。PBS中のインフルエンザA型ウイルス(5×103pfu/ウェル)を予備処理したプレート上に置き、37℃にて2時間または4℃にて1晩インキュベートした。ウイルスを吸引し;プレートをPBSで洗浄し、−20℃にてエタノール−アセトン(1:1)固定剤で15分間固定した。固定の後、プレートを再度洗浄し、ブロッキング緩衝液(PBS中の1%乾燥ミルク)で30分間ブロックした。ブロッキング緩衝液を除去し、プレートを密閉し、使用するまで4℃で保存した。血清試料および陽性および陰性対照血清を希釈緩衝液(PBS中0.1%BSA)に段階的に希釈し、37℃にてウイルス被覆プレート上でインキュベートした。洗浄緩衝液(PBS中0.05%ツィーン20)での洗浄の後、ビオチニル化抗マウスIgG抗体を加え、37℃にて30分間インキュベートした。洗浄およびAP基質(Sigma,St.Louis,MO)でのインキュベーションに続き、プレートを再度洗浄し、ストレプトアジビン−AP(SIGMA,St.Louis,MO)と共にインキュベートした。発色するまでプレートを室温でインキュベートした。1N NaOHで反応を停止させ、プレートを405nmにおいてELISAリーダーで読んだ。抗体力価を最高血清希釈として任意に測定し、バックグラウンドを3倍超える吸光度を得た(Kremerら、Infection and Immunity 66:5669[1998])。
マウス脾臓をPBS中で破壊して、単細胞懸濁液を得た。細胞をBPS中で洗浄し、塩化アンモニウム溶解緩衝液を用いて赤血球細胞を溶解させた。次いで、脾臓細胞を培地(10%FBS、L−グルタミンおよびペニシリン/ストレプトマイシンを補足したRPMI 1640)に再懸濁させ、96ウェルマイクロタイタープレートに1.5×105細胞/250μl/ウェルで接種した。次いで、一晩のBrdU標識に続き、細胞を分裂促進因子PHA−P(2.5μg/ウェル)と共に3日間(Stevensonら、前記)または6×103pfu/ウェルの濃度のインフルエンザA型のウイルスと共に6日間インキュベートした。製造業者の指示(Roche Diagnostics,Indianapolis,IN)に従い、細胞増殖化学発光ELISAを用いて細胞増殖を測定した。相対的光単位の測定は標準ルミノメーターを用いて行なった。
脾臓細胞を培地(10%FBS、L−グルタミンおよびペニシリン/ストレプトマイシンを補足したRPMI 1640)に再懸濁し、マイクロタイター平底プレートに1.5×105細胞/250μl/ウェルで接種した。次いで、細胞を分裂促進因子PHA−P(2.5μg/ウェル)と共に3日間(Stevensonら、前記)または6×103pfu/ウェルの濃度のインフルエンザA型ウイルスと共に6日間インキュベートした。次いで、上清を収穫し、サイトカイン濃度を定量した。
血清および脾臓細胞上清中のIL−2、IL−4、IL−12およびIFN−γサイトカインレベルは、製造業者の指示に従い、クアンティカイン M ELISA(QUANTIKINE M ELISA)キット(R&D Systems,Inc.)を用いて行なった。
PEまたはFITCいずれかで直接的に標識したマウス分子CD3、CD4、CD8およびCD19(BD PharMingen,San Diego,CA)に対して特異的な抗体をフローサイトメトリー分析で用いた。脾臓細胞の単細胞懸濁液を抗体と共に氷上で30分間インキュベートし、0.1%BSAを含有するBPSで洗浄した。コールターエピックス−XL MCL ベックマン−コールター(Coulter EPICS−XL MCL Beckman−Coulter)フローサイトメーターで試料を獲得し、Expo32ソフトウエア(Beckman−Coulter,Miami,FL)を用いてデータを解析した。
1mlの10%中性緩衝化ホルマリンでの膨張によって肺を固定し、ひとまとめに切開し、中性緩衝化ホルマリンに浸漬させた。パラフィン包埋の後、5μmの切片を切断し、ヘマトキシリンおよびエオシンで染色し、光学顕微鏡で観察した。
Yateの修正を施した平均、標準偏差、標準誤差およびχ2解析を計算した。対照群を実験群と比較するために、Cox回帰を用いた(Coxら、Journal of the Royal Statistical Society Series B,34.187[1972])。実験群および対象群の間の差は、LOG尤度比率検定を用いて試験した。
インフルエンザA型ウイルスに対するナノエマルジョンの殺ウイルス活性
インフルエンザA型ウイルス、アナーバー系統に対するX8Pナノエマルジョンの殺ウイルス効果を、ウイルス/ナノエマルジョン混合物での動物の鼻腔内処理に先立って試験した。合計容量50μl中の2%X8Pナノエマルジョン中の2×104、5×104、2×105および5×105pfuの濃度のウイルスを、インフルエンザ感受性細胞の接種に先立って37℃にて60分間インキュベートした。ナノエマルジョンのプラーク減少質はMDCK細胞を用いてアッセイした。図10aに示すように、ナノエマルジョンは、3logを超えてプラークを形成するウイルスの能力を低下させた。ナノエマルジョンとのウイルスの延長されたインキュベーションは、時間依存的にプラーク形成単位の数を減少させた(図10b)。ナノエマルジョンとの5×105pfuのウイルスのインキュベーションから3時間後に、pfuは検出されなかった(図10b)。同一時点においてウイルス/ナノエマルジョン調製物で行なったRT−PCRは、プラーク減少アッセイ法(PRA)との完全な相関を示した。ウイルスRNAは依然として2時間において検出可能であったが、3時間および4時間ではいずれも存在しなかった。(図10c)。
マウスを2%ナノエマルジョン単独、ホルマリンで死滅させたインフルエンザA型ウイルス「AA」系統(5×105pfu)、2%ナノエマルジョンと混合したホルマリンで死滅させたウイルスまたは2%ナノエマルジョンで不活化したウイルス(5×105pfu)いずれかで鼻腔内処理した。20日後、全ての4つの実験群を共通遺伝子系統ウイルスの致死容量(2×105pfu)で抗原投与した。インフルエンザ/ナノエマルジョン混合物で処理した動物は病気のいずれの兆候も有さなかった。それらのコア体温は実験器官まで正常な範囲内にあり(図11)、全ての動物は抗原投与から生き延びた。ナノエマルジョン単独で処理した動物は抗原投与後にウイルス肺炎に罹り、全て27日(抗原投与後6日)までに死亡した。ホルマリンで死滅させたウイルスおよびナノエマルジョンで処理した全ての動物は26日(抗原投与後5日)までに死亡した。ホルマリンで死滅させたウイルス単独で処理した群においては、ただ1匹のマウスが生き延びた(図12)。
ナノエマルジョン単独で処理された、およびインフルエンザA型ウイルスアナーバー系統の致死用量(5×105pfu)で抗原投与した動物の組織学的検査は、実験の25〜27日(感染後5〜7日)にひどい葉肺炎を示した。肺組織の大きな領域が、肺胞空間を満たし、間質に浸潤する炎症性細胞(好中球およびマクロファージ)のかなりの流入によって引き起こされた均一な硬化を示した。肺胞内出血、中央壊死を伴う腫瘍の存在、および痕跡量の細胞デブリスが満ちた空の洞の形成によって証明される肺組織破壊の領域が観察された。加えて、線維症の領域がこれらのマウスの肺で見出され、増殖する繊維芽細胞によって置き換えられるようになる肺組織のかなりの破壊を示唆する。従って、これらのマウスで観察された重い肺炎および肺組織損傷の組織学的特徴は、インフルエンザ感染によって引き起こされた動物の迅速な肺死滅と合致する。
ウイルス/ナノエマルジョンまたはナノエマルジョン単独いずれかでの単一処理後に、特異的抗インフルエンザIgG抗体のレベルを調べた。初期ワクチン接種(または処理)後10、20および35日に、IgG抗体のレベルを動物の血清において評価した。10日に、全てのマウスは血清中の抗インフルエンザA型 IgGのバックグラウンドレベルを示した。(力価1:100)。20日に、ウイルス/ナノエマルジョンで処理されたマウスは、ナノエマルジョン単独で処理した対照群と比較して有意に高い抗体応答を生じた(p<0.05)。35日に抗原投与から生き延びたウイルス/ナノエマルジョン処理マウスは、抗原投与前の同一動物内で見出されたレベルと比較して10倍高いIgG抗体の血清レベルを生じた(図13)。
全肺RNAからのRT−PCR結果は、処理6日後までウイルス/ナノエマルジョン接種動物におけるインフルエンザA型ウイルスRNAの存在を示したが、7日およびそれ以後は示さなかった(図14a)。処理から最初の6日後の間におけるマウス肺からの0.1μgの全RNAからのRT−PCR反応で生じたシグナルは、合計10プラーク形成単位(pfu)未満のウイルスに相関した(図14b)。
種々のウイルス調製物で処理したマウスにおける初期免疫応答の特異性をサイトカインの分析によって特徴付けた。動物によって生じたサイトカインのレベルを、培養した脾臓細胞からの培地中、および実験動物の血清中双方で測定した。(図16aおよび図16b)。ウイルス/ナノエマルジョン調製物での処理から4日後、上昇したレベルのIL−12、IL−2、TNF−αおよび特にIFN−γの上昇したレベルが検出された(図16a)。動物の対照群において、検出されたレベルのこれらのサイトカインはなかった。上昇したレベルのIL−10および検出されなかったレベルのIL−4が全ての実験群にわたって観察された。
脾臓細胞増殖およびサイトカイン不活化アッセイ法を用い、免疫応答の抗原特異性を評価した。ウイスル/ナノエマルジョンおよびナノエマルジョン単独で処理したマウスからの実験の20日に、脾臓細胞を収穫した。細胞を共通遺伝子系統ウイルス(鼻腔内処理で用いたAA系統)で5日間刺激した。図16に示すように、インフルエンザA型/AA系統は、共通遺伝子系統ウイルス/ナノエマルジョン混合物で処理したマウスから収穫された脾臓細胞を特異的に刺激し、他方、動物のいずれかの他の群から収穫された脾臓細胞では増殖は検出されなかった。刺激指標は1未満であり、これは、インキュベーションの5日間の間に、ウイルスが組織培養におけるいくらかの細胞を死滅させたことを示す。実験の35日(致死的抗原投与から14日後)に、抗原投与から生き延びた動物から収穫された脾臓細胞は、20日に動物の同一群から得られた脾臓細胞の増殖応答と比較してより大きな増殖指標を示した。
実験動物の脾臓におけるT:B(CD3:CD19)およびTh:Tc(CD4:CD8)細胞の比率を調べた。未処置マウスの脾臓において、免疫染色およびフローサイトメトリー分析を用い、T細胞の32%およびCD8陽性細胞の39%が検出された。鼻腔内ワクチン接種から21日後、T細胞のパーセンテージは、ウイルス/ナノエマルジョン混合物およびナノエマルジョン単独で処理した動物の群では不変のままであり、他方、CD8陽性細胞はこれらの群においては、各々、48%および44%まで上昇した。致死的抗原投与から14日後(免疫化から35日後)、生き残った動物はわずかイルス/ナノエマルジョン混合物で処理した群におけるものだけであった。全ての動物は、抗原投与前の同一群と比較して、有意に(p<0.0001)上昇したT細胞およびわずかに上昇したCD8陽性細胞を有した(図18)。T細胞は同一レベルに留まったが、ナノエマルジョン単独およびナノエマルジョンでプレインキュベートしたウイルスで処理した群ではCD8陽性細胞が増大した。
ウイルスアナーバー系統/ナノエマルジョンまたはナノエマルジョン単独の鼻腔内吸入から20日後、マウスをウイルスの共通遺伝子(AA)または異種遺伝子(プエルトリコ)系統いずれかで抗原投与し、14日間観察した。ウイルスアナーバー系統/ナノエマルジョンで処理し、共通遺伝子系統ウイルスで抗原投与した動物は生き残り、回復し、全ての他の群からの動物は肺炎に罹り、実験の26日までに死亡した(図19)。抗原投与後における動物でのIFN−γサイトカイン生産の分析は、この動物群からの脾臓細胞が、サイトカインのかなりの生産による共通遺伝子および異種遺伝子系統ウイルス双方でのインビトロ刺激に応答することを明らかとした(図20b)。本発明は特定の機序に限定されない。事実、機序の理解は本発明を実施するのに必要ではない。それにもかかわらず、共通遺伝子系統ウイルスでの抗原投与から生き延びた動物は異種ウイルスに対しての免疫性を獲得し、それにより、そのエピトープ認識を拡大したことが考えられる。そのような可能性を調べるために、共通遺伝子系統ウイルスでの抗原投与から生き延びた動物を再度異種ウイルス(プエルトリコ系統)で抗原投与し、さらに14日間観察した。全ての動物は、病気のいずれの兆候もなくして異種ウイルスでの再抗原投与から生き延びた(表30)。
HIV gp120に対する免疫応答
本実施例は、組換えHIV−1エンベロープ糖タンパク質(gp120)に対するマウスの免疫応答を記載する。100μl容量中の変化させた濃度のX8Pナノエマルジョン(最終濃度:0.1〜1%)と混合した用量当たり2μgおよび20μgの濃度で組換えgp120糖タンパク質(最終濃度:0.1〜1%)をマウスに鼻腔内または筋肉内投与した。用量投与は最初の免疫化後3週間以内に反復した。対照動物の鼻では、生理食塩水中のタンパク質で置き換えた。また、GP120/X8Pを筋肉内注射して、それが筋肉内投与されたワクチンを補助できるかを決定した。
Claims (12)
- 以下を含む、免疫原性組成物:
(1)
(i)油;
(ii)リン酸トリ(N−ブチル)またはエタノール;
(iii)ポリソルベート界面活性剤;
(iv)塩化セチルピリジニウム;および
(v)水
を含む、エマルジョン;ならびに
(2) 病原性のウイルス、細菌、真菌、および該ウイルス、細菌、または真菌に由来する病原体産物からなる群より選択される、免疫原。 - 病原体が不活化病原体を含む、請求項1記載の免疫原性組成物。
- 病原体産物が、病原体に由来する、ペプチド、ポリペプチド、核酸、多糖、および膜画分からなる群より選択される、請求項1または2記載の免疫原性組成物。
- 油相が大豆、アボカド、スクアレン、オリーブ、アブラナ、トウモロコシ、菜種、サフラワー、ヒマワリ、魚、フレーバー、および水不溶性ビタミンからなる群より選択される油を含む、請求項1〜3のいずれか一項記載の免疫原性組成物。
- ポリソルベート界面活性剤が、ポリソルベート20、ポリソルベート40、ポリソルベート60、およびポリソルベート80からなる群より選択される、請求項1〜4のいずれか一項記載の免疫原性組成物。
- 免疫原が、インフルエンザA型ウイルスまたは単純疱疹ウイルスIIから選択されるウイルスである、請求項1〜5のいずれか一項記載の免疫原性組成物。
- 該免疫原が、該エマルジョンを用いて不活性化された、少なくとも2×104プラーク形成単位のウイルス病原体を含む、請求項1〜6のいずれか一項記載の免疫原性組成物。
- エマルジョンが、水、油、エタノール、ポリソルベート20およびポリソルベート80からなる群より選択されるポリソルベート界面活性剤、ならびに塩化セチルピリジニウムを含む、請求項1〜7のいずれか一項記載の免疫原性組成物。
- エマルジョンが、水、約64%の油、約8%のエタノール、ポリソルベート20およびポリソルベート80からなる群より選択される約5%のポリソルベート界面活性剤、ならびに約1%の塩化セチルピリジニウムを含む、請求項1〜7のいずれか一項記載の免疫原性組成物。
- 請求項1〜9のいずれか一項記載の免疫原性組成物を含む、ワクチン。
- ウイルス、細菌、または真菌によって引き起こされる感染の治療または予防のためのワクチンの製造における、請求項1〜9のいずれか一項記載の免疫原性組成物の使用。
- ウイルス、細菌、または真菌によって引き起こされる感染の治療または予防において使用するための、請求項1〜9のいずれか一項記載の免疫原性組成物。
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