JP5695572B2 - 向流クロマトグラフィーロータ - Google Patents

Description

本発明は、向流クロマトグラフィー（ＣＣＣ）に用いられる螺旋管支持装置の構築方法、使用方法及び改良型設計に関する。

クロマトグラフィーは、移動相中に溶解した物質を固定層中に通してこの物質を分離し、その結果、この物質を、多くの場合には物質の複合混合物から精製し又は識別することができるようにする技術である。物質としては、（１）ガス、（２）化学物質、（３）生物学的物質、例えばＤＮＡ、糖質、脂質、ペプチド、タンパク又はこれらの組合せ、（４）分子又は（５）上述の物質の任意の組合せが挙げられるが、これらには限定されない。クロマトグラフィーを利用して分離された物質は、螺旋管支持装置に取り付けることができる種々の検出手段によって分析可能である。クロマトグラフィーの形態と分離技術の両方における多くのバリエーションが目下存在し、これらバリエーションは、研究において積極的に用いられている。

向流クロマトグラフィーは、移動相と固定相の両方が液体状態にある液‐液による分離を利用している。この技術は、移動液相中の化合物をコイル状管内に保持されていて、例えば、プラネタリー型遠心分離機での回転により生じる力を受ける固定液相から分離する。向流クロマトグラフィーは、１９７０年代初頭から存在しており、化合物又は小分子物質を分離するために首尾良く用いられている。これについては、米国特許第３，７８４，４６７号明細書、同第３，７７５，３０９号明細書、同第６，５０３，３９８号明細書、同第５，７７０，０８３号明細書、同第５，３５４，４７３号明細書、同第５，３３２，５０４号明細書及び同第５，２１５，６６４号明細書を参照されたい。試料物質を相相互間の溶解度に従って分離する。溶剤を様々な容量比で混合すると、クロマトグラフィー用の溶剤系を構成する２種類の安定した不混和性相を形成することができる。向流クロマトグラフィーは、小分子物質を分離し又は精製する用途の広い方法を提供し、確かに、先行技術は、主として、小分子分離、識別又は精製に制限されていた。大分子物質を分離するといわれている向流クロマトグラフィー遠心分離機に関する先行技術の発明は僅かながらあるが、かかる先行技術の発明は、本発明と同じほど効率的に且つ良好に分離を行なうことができなかった。これについては、米国特許第４，７１４，５５４号明細書及び同第５，１０４，５３１号明細書を参照されたい。

向流クロマトグラフィーの最初期の形態は、垂直に固定されると共に一端にポンプを備えた移送管により互いに連結された一連のカラムを備えていた。これについては、米国特許第３，７８４，４６７号明細書を参照されたい。試料物質を別のカラム中の固相と固定相の混合物中に溶解させ、かかるカラムを移送管によりポンプに連結し、直列状態の他のカラムの前に配置した。

次になされた発明は、溶剤入口及び出口のために回転シールなしで、中心軸線回りに回転する螺旋コイル中で連続管をどのように構成するかを示すものであった。これについては、米国特許第３，７７５，３０９号明細書を参照されたい。１回転すると、この装置は、惑星状運動で加撚及び解撚作用を達成し、それにより相を混合した。このシステムにおける１回転中、二相溶剤入りのコイル状管内において、（１）コイル状管の回転方向（時計回り又は反時計回りの方向）及び（２）ロータの回転方向（時計回り又は反時計回りの方向）に応じて、軽い相は一端部（ヘッド）に移動し、重い相は他端部（テール）に移動する。移動相は、固定相が移動するにあたって取りやすい方向とは逆の方向へ端部中に圧送され、かくして、固定相は、平衡状態では、コイル状管の全容積の４０〜８０％に保持される。移動相の過剰分は、他端部から溶け出る。プラネタリー型ＣＣＣ遠心分離機の現行の形態又は用途では、種々のうちの螺旋管が用いられている。これについては米国特許第３，９９４，８０５号明細書、同第４，４３０，２１６号明細書、同第４，５３２，０３９号明細書及び同第４，７１４，５５４号明細書を参照されたい。

近年、螺旋管又はスプールに代えて、螺旋管支持体と呼ばれているフレームによって定位置に保持されている螺旋状に整然と並べられた管が用いられている。これについては米国特許出願公開第２００５／０２４２０４０号明細書を参照されたい。現時点において、螺旋管支持体は、製作に時間がかかり且つ労力がかかる。この装置の第１の形式は、軽量アルミニウムに２インチ（５．０８ｃｍ）深さまで研削して螺旋チャネルを精巧に作ると共に半径方向チャネルを精巧に作って４本の螺旋をなして巻かれたテフロン（Teflon（登録商標））管を保持する一平面内に保持することによって構築されている。螺旋管支持体の利点は、（１）フローチャネルを備えたサンドイッチ状態のプレートからの漏れがないこと及び（２）管が小径であることにより物質の分解能が高いことである。

米国特許第３，７８４，４６７号明細書 米国特許第３，７７５，３０９号明細書 米国特許第６，５０３，３９８号明細書 米国特許第５，７７０，０８３号明細書 米国特許第５，３５４，４７３号明細書 米国特許第５，３３２，５０４号明細書 米国特許第５，２１５，６６４号明細書 米国特許第４，７１４，５５４号明細書 米国特許第５，１０４，５３１号明細書 米国特許第３，９９４，８０５号明細書 米国特許第４，４３０，２１６号明細書 米国特許第４，５３２，０３９号明細書 米国特許出願公開第２００５／０２４２０４０号明細書

一実施形態では、本発明の要旨は、１つ又は２つ以上の第１の表面を有する向流クロマトグラフィー装置にあり、第１の表面は、管を収容する複数本の螺旋チャネル又は溝を有する。第１の表面は、オプションとして、１本又は２本以上の半径方向チャネルを有する。第１の表面は、入口若しくは出口又は管のための接近ポートを有する。この装置は、次の改良点、即ち、（１）１本又は２本以上の湾曲半径方向チャネル、（２）管を定位置に保持するためにチャネル又は溝に設けられた１つ又は２つ以上の突起、（３）重りを収納できる１つ又は２つ以上の空間、（４）スナップロックにより保持可能な１つ又は２つ以上の圧縮ねじユニオン、（５）１つ又は２つ以上のリテーナ支持体及び（６）流管を案内するのを助けるために表面の外部に設けられた１つ又は２つ以上のループ構造体のうちの１つ又は２つ以上を更に有するのが良い。「ループ」という用語は、管を第１の表面の外部上に保持することができる他の形物、例えばフックを含む。半径方向チャネルは、一端又は両端が任意の方向に湾曲しているのが良い。第１の表面には、管を研磨から保護するためにトップに施される潤滑剤、テフロン（Teflon（登録商標））、パリレン又は液体ポリエチル化（polyethylated）グリコールの塗布又は被着したものが更に施されるのが良い。

また、向流クロマトグラフィー装置の製造方法が提供される。一実施形態では、この方法は、１つ又は２つ以上の第１の表面を形成するステップを有し、第１の表面は、複数本の螺旋チャネル又は溝を有する。第１の表面は、造形法を用いて形成できる。好ましい方法は、３次元プロトタイピング機及び容易に成形可能な材料を用いる。使用できると考えられる他の造形法としては、任意形式の成形、穴あけ、機械加工プロトタイピング又は上述の方法の任意の組合せが挙げられる。容易に成形可能な材料としては、次の材料、即ち、（１）ナイロンポリマー、（２）プラスチック、（３）ポリテトラフルオロエチレン（テフロン：Teflon（登録商標））、（４）ポリ塩化ビニル、（５）ポリスチレン、（６）ポリアミドＰＡ‐２２０、（７）フォトポリマー、（８）FullCure（登録商標）材料、（９）Polyjet 3D Printer（登録商標）材料、（１０）モノマー粉末及び（１１）金属又は金属複合材から成る粒子又は粉末のうちの１つ又は２つ以上が挙げられるが、これらには限定されない。３次元プロトタイピング機は、第１の表面を備えた層を形成するために１つ又は２つ以上の方法、例えば、レーザ焼結、紫外線照射、穴あけ、機械加工又はプロタイピングを利用することができる。

この製造方法は、次の改良点、即ち、（１）１本又は２本以上の真っ直ぐな半径方向チャネル、（２）１本又は２本以上の湾曲した半径方向チャネル（この場合、「湾曲した」という用語は、例えば管内の曲がり部及び縮れ部の発生を回避するために管の配置及び嵌め込みを容易にするよう正弦波形状、“Ｓ”形状、逆“Ｓ”形状等を含む）、（３）１つ又は２つ以上の入口若しくは出口又は管のための接近ポート、（４）重りを収容できる１つ又は２つ以上の空間又は収納手段、（５）第２の表面を取り付けることができるよう挿通させる１つ又は２つ以上の空間、（６）反対側の表面を取り付けるために使用できる１つ又は２つ以上のねじ山、（７）管を保持するための１つ又は２つ以上のループ、（８）圧縮ねじユニオンを保持するためのスナップロックによって取り付けられた１つ又は２つ以上の圧縮ねじユニオン、（９）１つ又は２つ以上のリテーナ支持体及び（１０）１つ又は２つ以上の歯車並びにこれらの組合せのうちの１つ又は２つ以上を有する第１の表面を形成するために利用可能である。「組合せ」という用語は、上述の１０通りの形式の改良点のうちの２つ以上を有し又は個々の形式の改良点の機能のうちの少なくとも２つを備えた構造体を有することを意味する。本明細書で用いられる「歯車」という用語は、１つ又は２つ以上の歯車が（１）１つ又は２つ以上の表面に直接的に又は間接的に取り付けられ、（２）中央シャフトに取り付けられ、（３）支承ブロック内に設けられ又は（４）上述の歯車位置のうちの任意の組合せ又は全ての組合せになっている実施形態を含む。半径方向チャネルは、一方の端部又は両方の端部のところが任意の方向に湾曲しているのが良い。加うるに、この製造方法は、シャフトを挿通状態で配置できる中央空間を有する第１の表面を形成するために利用できる。第１の表面は、周囲のところに設けられていて、管を受け入れる空間を形成する壁を有するのが良い。

製造方法は、別の実施形態では、第１の表面に対してトップである第２の表面を形成する複数の層を形成するよう利用できる。「トップ」という用語は、カバー、蓋又は第１の表面への任意他の取付け具として働く任意の表面材を含む。第２の表面は、第１の表面と同種の材料で且つ造形法により、例えば３次元プロトタイピング機を用いて形成されるのが良い。３次元プロトタイピング機は、第２の表面を有する層を形成するために１つ又は２つ以上の方法を利用するのが良く、かかる方法としては、レーザ焼結、紫外線照射、穴あけ、機械加工、射出成形又はプロトタイピングが挙げられる。製造方法は、更に、次の特徴、即ち、（１）入口若しくは出口又は管のための接近ポート、（２）重りを収納できる１つ又は２つ以上の空間、（３）第１の表面を取り付けることができるよう挿通させる１つ又は２つ以上の空間又は手段、（４）反対側の表面に取り付けるために使用できる１つ又は２つ以上のねじ山、（５）管を保持するための１つ又は２つ以上のループ又はフック、（６）スナップロックによって取り付けられる１つ又は２つ以上の圧縮ねじユニオン及び（７）１つ又は２つ以上のリテーナ支持体並びにこれらの組合せのうちの１つ又は２つ以上を有する第２の表面を形成するために利用できる。「組合せ」という用語は、上述の７形式のアイテムのうちの２つ以上を有し又は個々の形式のアイテムの機能のうちの少なくとも２つを備えた構造体を有することを意味する。加うるに、この方法は、以下の特徴、即ち、（１）１つ又は２つ以上のラッチ、（２）１本又は２本以上のボルト、（３）１つ又は２つ以上のスナップ、（４）１つ又は２つ以上のクリップ、（５）１つ又は２つ以上の切欠き、（６）シャフトを配置するために挿通させることができる１つ又は２つ以上の中央空間、（７）反対側の表面を取り付けるために使用できる１つ又は２つ以上のねじ山又は（８）任意公知のロック機構体のうちの１つ又は２つ以上によって第１の表面に取り付けられる第２の表面を形成するために利用できる。例えば、ねじ山により、ねじを用いて第２の表面を第１の表面に取り付けることができる。第２の表面は、第２の表面を第１の表面に又はこの上に差し向け又は取り付けるための手段を更に有するのが良い。その一例は、第１又は第２の表面のうちの一方に設けられた異形突起であり、他方の面にはこの異形突起が嵌まり込むボイドが設けられる。一般に、遊星歯車手段は、設計上の選択事項としてＣＣＣ装置への関心のあるロータの組み込みを可能にするよう外面に、例えば、第２の表面のところに直接的に又は間接的に取り付けられる。

別の実施形態では、物質を分離するために向流クロマトグラフィーを実施する方法によって製造され又は上述の改良点のうちの１つ又は２つ以上を有する装置を使用する。本明細書において用いられる「物質」としては、化学物質、小有機分子及び生物学的物質、例えば、ＤＮＡ、ポリヌクレオチド、オリゴヌクレオチド、タンパク、ポリペプチド、多糖類、少糖類、脂質、これらの組合せ等が挙げられる。向流クロマトグラフィーを実施する方法は、（１）試験試料及び溶剤系を用意するステップ、（２）入口、螺旋チャネル、半径方向チャネル及び出口を通って引き回すステップ、（３）試験試料を溶剤系中に投入するステップ、（４）組合せ状態の試験試料及び溶剤系を装置内に配置するステップ、（５）この装置を遠心分離機内で所与の期間及び指定された速度で回転させるステップを有する。任意形式の柔軟性管を用いることができ、かかる管としては、（１）テフロン（Teflon（登録商標））管、（２）弗素化エチレンプロピレン管、（３）シリコーン管、（４）ステンレス鋼管、（５）タイゴン（Tygon（登録商標））管、（６）きょ壁形管、（７）回旋状管、（８）一般的に用いられるフレキシブルチューブ又は（９）上述の材料の内の任意のものの組合せから成る任意の管が挙げられるがこれらには限定されない。管は、不規則な又は非一様な内面を有する管であっても良い。不規則性は、不規則性が生じるように製造された市販の管を用いることにより、或いは、管を手動で操作することにより、例えば、管を縮れさせ、管を曲げ、管を折り曲げるなどして管に欠陥部を導入形成することにより、特に、管の滑らかな内面を乱して管に非一様な又は不規則な内面を形成することによって得られる。向流クロマトグラフィーを実施する方法は、第１の表面を覆い又はこれに取り付けるよう第２の表面を利用するのが良い。第２の表面は、管が中央シャフトに出るようにする穴を有するのが良い。この方法は、管が任意種類の摩擦又は研磨を受ける可能性がある場合にはいつでも、テフロン（Teflon（登録商標））、パリレン又は液体ポリエチル化（polyethylated）グリコール又はこれらに類似した材料を第１の表面か第２の表面かのいずかに塗布し又は被着させるステップを更に有するのが良い。製造された装置は、任意形式の遠心分離機に使用できる。好ましい形式の遠心分離機は、惑星状回転をもたらす。別の実施形態では、向流クロマトグラフィーは、次の特徴、即ち、（１）１本又は２本以上の湾曲した半径方向チャネル、（２）管を案内すると共に嵌め込むのを助けるために装置の螺旋チャネルに設けられた１つ又は２つ以上の突起、（３）１つ又は２つ以上のリテーナ支持体及び（４）管を案内すると共に着座させるために螺旋管支持体表面かトップかのいずれかに設けられた１つ又は２つ以上のループのうちの１つ又は２つ以上有する装置を用いて実施されるのが良い。また、螺旋管支持体は、バランスを取るために１つ又は２つ以上の重りを必要とする場合があり、重りは、第１の表面か第２の表面か又は第１の表面と第２の表面の両方かのいずれかに設けられた１つ又は２つ以上の空間内に配置されるのが良い。この方法は又、第１若しくは第２の表面又はこれら両方の表面に設けられた１つ又は２つ以上のループを通って管を引き回すステップを更に有するのが良い。

本願において特許請求の範囲に記載されている方法によって製造された螺旋管支持体を用いると、生物学的物質を含む１種類又は２種類以上の化学物質を分離することができる。生物学的物質又は化学物質は、小分子又は大分子、例えば、ＤＮＡ、タンパク又はペプチドであるのが良い。先行技術は、大分子化合物を精製するために極性溶剤の使用を記載している。用いることができる溶剤系としては、次のもの、即ち、（１）二相水性ポリエチレン及び塩溶液、（２）二相重アルコール水溶液、（３）ＰＥＧ（ＭＷ１０００）１２．５％‐Ｋ₂ＨＰＯ₄１２．５％又はｓ‐ブタノール‐１％トリフルオロ酢酸の１：１（ｖ／ｖ）溶液が挙げられるが、これらには限定されない。

以下の図の説明及び図面は、本発明を例示する種々の実施形態を示している非限定的な例である。

改良型螺旋管支持体の断面図である。 歯車及び支承ブロックが螺旋管支持体のトップ（頂部）及びボトム（底部）に設けられた状態の組立て状態のロータの側面図である。 螺旋管支持体の底面図である。 トップが省かれた状態の螺旋管支持体の拡大図である。 向流クロマトグラフィーを用いて調製されたリゾチーム及びミオグロビンを含むタンパクの混合物に関する溶出プロフィールを示す図である。 図４Ａからの選択された画分のＰＡＧＥ分析結果を示す図であり、２種類のタンパクの分離の成功結果を示す図である。

次に、添付の図面を参照して本発明の詳細な説明及び種々の実施形態を説明する。なお、図中、参照符号は、同一の要素を示している。本発明は、先行技術と比較して幾つかの利点及び改良点を提供し、本発明は、先行技術の欠点をなくしている。本発明は、主として、向流クロマトグラフィーの分野に関するが、本発明の範囲は、かかる特定の（１）方法論、（２）用途、（３）使用又は（４）装置形状には限定されない。本発明の特定の実施形態についての説明は、本発明の考えられる多くの実施形態のうちの１つに関してであり、本発明の範囲を制限し又は限定するものと解されてはならない。別段の指定がなければ、本明細書で用いられる科学用語は、当業者によって通常理解される意味を有している。また、文脈上、別段の明示の定めがなければ、複数の要素が含まれることはいうまでもない。例えば、原文明細書における“ａ”、“ａｎ”及び“ｔｈｅ”という用語は、当該分野において知られているように単数と複数の両方を含むことを意味している。

本発明の内容は、種々の形式の遠心分離機に利用でき、かかる遠心分離機としては、（１）プラネタリー型遠心分離機、（２）固定角度型遠心分離機、（３）揺動バケット型遠心分離機、（４）分析用遠心分離機、（５）調製用遠心分離機及び（６）ヘマトクリット遠心分離機が挙げられるが、これらには限定されない。本発明は又、種々の温度で作用可能であると共に小規模から工業規模までの用途向きにスケール変更可能である。

一実施形態では、向流クロマトグラフィー装置は、複数本の編成された螺旋チャネルで構成されている。一実施形態では、等間隔を置いて設けられた切れ目が半径方向溝又はチャネルを形成している。等間隔を置いて配置された切れ目は、数の上において、２つの切れ目、３つの切れ目、４つの切れ目、５つの切れ目等であるのが良い。図１は、螺旋管支持装置１の上から下に見た図であり、例えば中央のシャフト４から出て螺旋チャネルを通って時計回りの方向に進む管のためのトップ又は内側入口箇所２を示している。流管の外側出口箇所は、符号３で示されている。これは、図２Ｂの符号１７で示されている螺旋管支持体９のボトムのところにも見える。図示の実施形態では、管は、中央シャフト４に入っている。４本の湾曲した半径方向チャネル５が示されているが、本発明は、半径方向チャネル５の特定の数には限定されない。半径方向チャネル５は、本発明に従って一方の端部又は両端部のところが湾曲しているのが良い。先行技術の発明は、管の縮れを生じさせ、その結果、溶剤の流れを妨げる真っ直ぐな半径方向チャネル５を有していた。これについては国際公開第２００９／０７３７４６号パンフレットを参照されたい。管は、本発明に従って反時計回りの仕方で通され又は引き回されるのが良い。中心から外方に向かう螺旋方向は、反時計回りの方向であるのが良く、半径方向チャネルは、“Ｓ”形態を有するのが良い。

図１に示されている実施形態は、改良型螺旋管支持装置１の断面を示している。管を湾曲している半径方向チャネル５中に通すことができる。この曲率は、管を整列させてこれが適当な螺旋チャネルに入って管の編成螺旋体を形成する。螺旋管支持体９は、層１つ当たり４つの編成螺旋体を有する。管は、フレームのボトムから敷設されてチャネル内で反時計回りに配置されるのが良い。次に、９時の箇所で半径方向チャネルを横切って管を通し、この箇所で、管は、外側から見て内方へ１番目のチャネルに嵌まり込むよう案内される。６時の箇所では、管は、半径方向チャネルと交差して外周部から見て内方へ２番目のチャネルに入る。３時の箇所では、管は、縁部から見て内方へ３番目のチャネルに入り、そして以下同様である。管は、箇所３の近くで半径方向チャネルと交差すると、管は、外縁部から見て内方へ４番目のチャネル中に進む。これがロータ回りに繰り返され、ついには、管が中心まで来て、次に、９時の箇所に位置する半径方向チャネル５から出て縁部に進められ、次に縁部に沿ってチャネルに続き、そして６時の箇所で次の半径方向チャネルと交差して縁部から見て内方へ１番目のチャネルに入り、従前通り、ついには、管は、中心に至り、そして再び次の半径方向チャネル５から出るようになる。管が中心のところでトップに到達すると、管は、接近ポートからトップに通されて中央シャフトに進む管に連結される。

関心のあるロータ内での管の巻回により、もし存在していれば半径方向チャネルを利用することができる。ロータが半径方向チャネルを備えていない場合、管の巻回では、もし存在している場合であっても半径方向チャネルを用いる必要がない。また、本明細書において教示するように、巻回は、適当に構成されたロータについて時計回り（ＣＷ）でも反時計回り（ＣＣＷ）でも良い。というのは、管の方向及びロータの回転方向を変えることにより、関心のある分子又は対象物の分離を可能にすると共に最大にすることができるからである。

管の巻回の方向は、設計上の選択事項としてオプションであるので、上述のパラメータを関心のある分離に利用することができる。関心のあるロータは、適当に湾曲したオプションとしての半径方向チャネルを有すると共に適当に差し向けられた螺旋チャネル又は溝を有する。チャネル又は溝は、第１の表面に設けられていて、管を受け取ってこれを嵌合させるような寸法形状のボイドである。かくして、管は、中心において、半径方向チャネル内に案内可能であり、かかるチューブは、半径方向チャネルを通って第１の表面の周囲まで延びる。管は、螺旋管支持体の縁部のところでチャネルに通され、そして縁部から見て内方へ１番目のチャネル中に入る。管は、縁部から見て内方へ２番目のチャネルに通され、そして以下同様である。管が中央シャフト領域に達すると、管は、別の半径方向チャネルを通って外縁部に通され、そして、中央の内側入口領域まで内方に湾曲した半径方向チャネルを横切って別の半径方向チャネルから出て、ついには、管は、縁部沿いに外側入口箇所領域に沿って最終のチャネルに達し、ここから、管は、螺旋チャネルに通され、ついには、管は、中央シャフト領域に達する。管は、カバーに設けられている出口又は接近ポートを通過し、ここから、管は、例えば圧縮管ユニオン（これについては、例えば、圧縮管ユニオンがスナップロック手段に嵌め込まれた状態で示されている図２Ａ及び図２Ｂを参照されたい）のところで流管に連結される。管は、螺旋管支持シャフト（例えば、図１、図２Ａ及び図２Ｂに示されている）に入り、そして、他方の入口からの管と一緒になって螺旋管支持体から出て中心軸線シャフトに入ることができる。

一般に、管は、３本目ごとのチャネルをスキップし、外側領域に戻る螺旋経路内に差し向けられる。半径方向チャネル内の管を壁付きの第１の表面空間中に押し込んで螺旋に差し向けられた管の複数個の層を受け入れ、即ち、より多くの層をフレーム内に嵌め込むのが良い。溶剤の流れは、管を通り、二相溶剤系の下側の又は重い相を内部入口箇所から導入する。変形例として、二相溶剤系の上側の又は軽い相をロータ及びかくして管上の適当な螺旋巻き方向で且つ遠心分離器による適当な回転方向で外側入口箇所を介して圧送しても良い。

それ故、単一の管をこれが一連の編成螺旋体を形成するよう構成するのが良い。本発明の目的に関し、編成は、交互配置と同義であると考えられ、かかる編成は、一連の螺旋体を合致させること又は一連の螺旋体が嵌合状態であることと同義である。ロータは、関心のあるロータからの管の出入りのための２つの接近箇所を有する。流路の作用を向上させるため、本発明のロータは、編成螺旋層の層積み重ねを可能にする。それ故、ロータは、編成された嵌合状態の管螺旋体の２つの層、３つの層、４つの層、５つの層、６つの層、７つの層、８つの層、９つの層、１０個の層、１１個の層、１２個の層、１３個の層、１４個の層、１５個の層等を有するのが良い。管は、ボトムから反時計回りの方向に巻回されるのが良い。編成螺旋体の個々の層は、半径方向チャネル、螺旋チャネル又はこれらの両方のチャネル内に嵌まり込むよう形作られた１つ又は複数個の合成部分又は突起を備えた専用加圧ツールを用いてロータ本体内に設置され又は詰め込まれるのが良い。

図１に示されている装置の周囲には、一連の穴６が示されている。１つ又は２つ以上の穴６は、重りが螺旋管支持体９のバランスを取るように役立つようにするための場所として役立ち得る。本明細書において用いられる「重り」という用語は、質量を持つ任意の物質を意味している。変形例として、穴６のうちの１つ又は２つ以上を用いてトップ８（図２Ａ参照）を例えばねじ山付き穴７とねじにより螺旋管支持体９に取り付けても良い。穴６は、円形又は円筒形の形状である必要はなく、これら穴が装置の周囲のところ又はその近くのところに配置される必要もない。

図２Ａは、支持装置（又は支持体）１及び対応のトップ８を含む組立て状態の螺旋管支持体又はロータ９の側面図である。トップ８は、ＣＣＣ装置内に組み込まれて惑星状回転を生じさせるよう歯車１０及び支承ブロック１１の下に位置している。１つ又は２つ以上の歯車１０及び１つ又は２つ以上の支承ブロック１１は、図２Ａに示されている歯車及び小ブロックから見て形状又は位置が異なっていても良い。トップ８は、中央の近くに穴を有し、管は、この穴を通ってトップ８の表面に設けられているループ１５に至り、そして、図１の中央シャフト４に入る流管に取り付けられる。管支持体９と同様、トップ８は、１つ又は２つ以上の穴１３を有し、これら穴は、形状が円形であるのが良い。穴１３のうちの１つ又は２つ以上は、重りが組立て状態の螺旋管支持体９のバランスを取るのを助けるための場所として役立ち得る。変形例として、穴１３のうちの１つ又は２つ以上を用いて例えばねじ１４によりトップ８を螺旋管支持体９に取り付けても良い。穴は、形状が円形又は円筒形である必要はなく、装置の周囲のところ又はその近くに配置される必要もない。同様に、穴６，１３は、重りを配置すると共に取付け手段のために互いに位置が合っているのが良い。トップ８を種々の手段により螺旋管支持体９に取り付けることができ、かかる手段としては、以下のもの、即ち、（１）１つ又は２つ以上のラッチ、（２）１本又は２本以上のボルト、（３）１つ又は２つ以上のスナップ、（４）１つ又は２つ以上のクリップ、（５）１つ又は２つ以上の切欠き、（６）シャフトを配置するために挿通させることができる１つ又は２つ以上の中央空間、（７）反対側の表面を取り付けるために使用できる１つ又は２つ以上のねじ山又は（８）任意公知のロック機構体並びにこれらの組合せのうちの１つ又は２つ以上が挙げられるが、これらには限定されず、組合せは、上述の８つの形式のうちの２つ以上又は２つ又は３つ以上の機能を組み合わせた形態を有する。例えば、ねじを取付け手段として用いることができる。トップ８は、別の取付け手段として螺旋管支持体１に螺入するねじ山を更に有するのが良い。同様に、種々の取付け手段が螺旋管支持体１をトップ８に取り付けるのに当てはまる。図２Ｂに示されているように、管支持体は、管接近ポート１７を更に有している。

先行技術の別の技術改良点は、螺旋管支持体１及びトップ８に図２Ａ及び図２Ｂに示されている１つ又は２つ以上のループ１５及び１つ又は２つ以上のリテーナ支持体１６が設けられていることである。ループ１５は、流管を保持することができる。ループ１５とリテーナ支持体１６の両方は、螺旋管支持体１の下面、トップ８の上面又は螺旋管支持体１の下面とトップ８の上面の両方周りに互いに間隔を置いて配置されるのが良い。ループ１５を直接リテーナ支持体１６に取り付けることは必要条件ではない。また、ループ１５以外の形状物を用いて流管を本発明と合致した仕方で保持することができる。この実施形態におけるリテーナ支持体１６は、ウェッジの形状に見え、それにより、ウェッジの幅の最も狭い部分は、螺旋管支持体１の周囲、トップ８の周囲又はこれら両方に差し向けられ、ウェッジの幅の最も広い部分は、螺旋管支持体１の中心、トップ８の中心又はこれら両方に差し向けられる。リテーナ支持体１６の形状と間隔の両方は、本発明のこの形態とは異なっていても良い。ループ１５を再位置決めできることは、（１）管を縮れさせるのを回避することができ、（２）管を研磨する恐れのある鋭利な縁部が生じるのを回避することができ、（３）可動部品が生じるのを回避することができ、（４）組立て状態の螺旋管支持体１が遠心分離機内に位置しているときに容易な接近を行なうことができるので、先行技術と比較して技術改良点である。リテーナ支持体１６の利点は、螺旋管支持体１及びトップ８のいずれかの表面に重量を追加しないで、螺旋管支持体１及びトップ８に強度を追加することにある。

図２Ａ及び図２Ｂは、螺旋管支持体１及びトップ８の別の技術改良例を示しており、この場合、１つ又は２つ以上の圧縮ねじユニオンが設けられている。圧縮ねじユニオンをスナップロック１８により螺旋管支持体１及びトップ８に取り付けるのが良い。この改造の目的は、螺旋管支持体１内に存在している内側管を異なる内径を有する流管に連結することにある。流管は、螺旋管支持体１から出て、シャフトを通り、組立て状態の螺旋管支持装置１のボトムから出て中心軸線対応シャフトまで延びる。

図３に示されている別の実施形態では、小さな突起１９が向流クロマトグラフィーで用いられるチャネル又は溝内で螺旋管支持体１の表面に追加的に設けられている。先行技術の発明では、かかる突起１９が設けられていないので、螺旋管支持体１内における管の引き回し又は巻回が阻害されていた。本発明は、螺旋溝に出入りする管の全体的な運動を制限し、管を螺旋管支持体１中に先行技術と比較して容易且つ迅速に通す方法を提供する。

別の実施形態では、組立て式の螺旋管支持体９は、コンピュータによる設計及び（ＣＡＤ）アルゴリズムを用いて設計される。組立て式螺旋管支持体９を設計するためにＣＡＤを使用することは、この実施形態の目的上、不要であるが、本発明に従って設計を作る都合の良い方法を提供する。ＣＡＤ設計は、設計上の変化に対応することができるので先行技術と比較して有利である。例えば、螺旋管の幅は、特定の直径の管に対応するよう変更可能である。各螺旋チャネルの幅は、０．５ｍｍ〜１０ｍｍ、１ｍｍ〜９ｍｍ、２ｍｍ〜８ｍｍ、３ｍｍ〜７ｍｍ、４ｍｍ〜６ｍｍ、５ｍｍ、２．５ｍｍ、３．５ｍｍ等であって良い。螺旋チャネルは、同一の寸法のものであるのが良い。図２Ａ及び図２Ｂに例示されている本発明は、形状が円筒形であり、直径が約１７．５ｃｍであり、高さが約７．３ｃｍである。寸法形状は、任意の遠心分離機型に対応するよう変更可能である。螺旋管支持体１は、チャネル又は溝の螺旋状壁及び中心に至る半径方向チャネル５を有し、半径方向チャネル５は、図１に示されている一端部又は両端部が湾曲していても良く湾曲していなくても良い。

図１は、４本の湾曲した半径方向チャネル５を示している。しかしながら、螺旋管支持体１は、１本又は２本以上の真っ直ぐな又は湾曲した半径方向チャネル５を備えた状態で製造されても良い。各半径方向チャネル５の幅は、例えば、０．５ｍｍ〜１０ｍｍ、１ｍｍ〜７ｍｍ、２ｍｍ〜５ｍｍ、３ｍｍ〜４ｍｍであるのが良く、又は、大きな容積が得られるよう分離可能に適当にスケール変更可能であっても良い。螺旋チャネル又は溝は、上述したように、分離スケールに応じて設計上の選択事項として変更可能な同一の寸法を有しても良い。かくして、螺旋チャネル及びオプションとしての半径方向チャネルは、大きな容積に関与した分離を行うことができるよう上述したサイズを超えても良い。それ故、チャネルは、数センチメートル、数デシメートル、数インチ等のサイズであっても良い。また、螺旋管支持体は、トップ８なしで構成されても良いことが想定できる。好ましい実施形態は、螺旋チャネル内で螺旋管支持体１の表面に設けられていて、管の引き回しを助ける小さな突起１９を更に有する。

螺旋管支持体１及びトップ８は、種々の材料で形成でき、かかる材料としては、次の材料、即ち、（１）ナイロンポリマー、（２）プラスチック、（３）ポリテトラフルオロエチレン（テフロン：Teflon（登録商標））、（４）ポリ塩化ビニル、（５）ポリスチレン、（６）ポリアミドＰＡ‐２２０、（７）フォトポリマー、（８）FullCure（登録商標）材料、（９）Polyjet 3D Printer（登録商標）材料、（１０）モノマー粉末及び（１１）金属又は金属複合材から成る粒子のうちの１つ又は２つ以上が挙げられる。上述の材料は、硬い表面を作るために使用できる。可撓性構造体を作るため、例えばPolyjet 3D Printer（登録商標）により提供されるタンゴブラック（Tango Black）のような材料を用いるのが良い。容易に成形可能な材料を用いた場合の利点は、螺旋管支持体１又はトップ８を迅速且つ安価に製作でき、設計上の変更に容易に対応できるということにある。先行技術は、螺旋体を金属から穿孔形成することによる螺旋管支持体の構成を教示しているが、これは、本発明よりも製造するのに実質的に労力がかかる。組立て状態の向流クロマトグラフィー装置９を製造する本発明の方法では、金属は、次に説明するようにラピッドプロトタイピング（積層造形）機に利用しやすい状態になるということが可能である。

一実施形態では、この設計例に用いられる材料は、３次元プロトタイピング機を用いて形成される。３次元プロトタイピング機は、種々の方法、例えば、レーザ焼結又は紫外線照射を用いて管支持体１又はトップ８を形成することができる。当業者であれば理解されるように、螺旋管支持体１又はトップ８をレーザ焼結又は紫外線照射以外の方法を用いて本発明に従って形成することができる。螺旋管支持体の設計用の材料を形成するために使用できる機械の例としては、シンターステーション２３００プラス（Sinterstation 2300 plus）、オブジェット・ジオメトリックス・インコーポレイテッド（Objet Geometrics, Inc.）製のEden500V又はEOS Precisonが挙げられるが、これらには限定されない。

先行技術に対する別の改良点は、製造された螺旋管支持体１が任意公知の柔軟性管と適合性があることであり、かかる柔軟性管としては、（１）テフロン（Teflon（登録商標））管、（２）弗素化エチレンプロピレン管、（３）シリコーン管、（４）ステンレス鋼管、（５）タイゴン（Tygon（登録商標））管、（６）きょ壁形管、（７）回旋状管、（８）一般的に用いられるフレキシブルチューブ又は（９）上述の材料の内の任意のものの組合せから成る任意の管が挙げられるが、これらには限定されない。管は又、クロスプレス（cross-press）内で手動で又は機械的に加圧されても良く、或いは、捩じられても良い。この装置は、種々のチャネルサイズに対応することができるので、管は、事実上任意の直径を有しても良い。従来、管を巻回して向流クロマトグラフィー装置の螺旋チャネルの状態にするのが困難であった。螺旋管支持体１及びトップ８を製造する同一の方法を用いると、ツールを形成することができ、次に、このツールを用いて管を螺旋チャネル５の状態に案内し又は押し下げることができる。管をこのように平べったくすることにより、管の層が試験試料の分離を向上させることができる。加うるに、かかる形態は、溶剤の層流を乱す。

本明細書において説明した改良点を備える製造された装置又は先行技術の向流クロマトグラフィー装置を用いると、１種類又は２種類以上の生物学的物質及び化学物質を分離することができる。生物学的物質としては、大分子、例えば、ＤＮＡ、ポリヌクレオチド、オリゴヌクレオチド、タンパク、ポリペプチド、オリゴペプチド、多糖類、少糖類、脂質、これらの組合せ等が挙げられる。先行技術は、主として、小分子に制限されていたが、本発明の組立て状態の螺旋管支持体９は、小サイズの分子と大サイズの分子の両方を分離し又は精製することができる。本発明は、大分子の生物学的物質を精製することができる特異溶剤系、例えば二相水性ポリエチレン及び塩溶液及び二相重アルコール水溶液を保持することができる。

ＣＣＣ装置及びこれに用いられるよう構成された本発明のロータは、多量の液体媒体、例えば、この中に含まれている分子、例えば、ポリペプチド、オリゴペプチド、ポリヌクレオチド、オリゴヌクレオチド、タンパク、多糖類、少糖類、脂質、これらの組合せ等のための細胞可溶化物又は使用済み培地の分離に対応するよう容易にスケール変更可能である。

関心のあるロータを用いることは、クロマトグラフィー技術において知られている。というのは、関心のあるロータは、任意のクロマトグラフィー装置で使用できるよう構成可能だからである。それ故、関心のあるロータには、固定相及び移動相を提供し、クロマトグラフィー装置、例えば遠心分離機、例えばプラネタリー型遠心分離機内に配置するよう適当なリザーバ又は緩衝液、溶剤等に連結された管が装填される。管及び遠心分離機を介して試料を導入してロータの適正な回転を生じさせる。画分を収集して更に処理すると共に／或いは分析する。固定相を公知のフラッシング手段により、例えば、緩衝液、溶剤又はガスを用いて管から追い出すのが良い。

次に、本発明を以下の非限定的な実施例により例示的に説明する。

実施例

小分子及びペプチドの分離に螺旋管支持装置を使用する先行技術は、各移動相について使用手段又は溶出モードを解明するものであった。管を中心又はトップから時計回りの方向に巻くと、表１にまとめた状態に固定相を保持することができる。主に小分子に使用される無極性溶媒系は、流体力学特性が様々であるために、溶出モードのための固定相保持も一様でない。かくして、本発明の螺旋管支持装置の使用方法は、今までは向流クロマトグラフィーでの使用が困難であった極性溶媒系に関して異なっている。螺旋管支持体のトップは、下相が導入される内側終端である場合があり、螺旋管支持体のボトムは、移動相として使用される時に上相がポンプで注入される外側終端である場合がある。回転が時計回り又は螺旋の巻き方向と同方向の場合、内側終端がヘッドである。これら条件下では、外側終端はテールである。回転が反時計回りの場合、ヘッドとテールとの両端は逆にされる。回転が反時計回りの場合、内側終端がテールになる。そのような条件下では、高い固定相保持が可能となる。当該溶出モードを、ポリエチレングリコール／燐酸溶液のような水性二相溶媒系（「ＴＰＡＳ」）と併用することができる。表２は、かかる溶媒系を使用した結果を示すものであり、タンパク分離のために高い固定相保持が得られた。

例示の実験においてタンパクを精製し溶解物を分別するために使用した溶媒系の作動パラメータを以下に示す。ＴＰＡＳの組成は、異なるＭＷのポリエチレングリコール（「ＰＥＧ」）を含有するように修正することができ、塩類は、異なるｐＨのものであって良い。また、高ＭＷデキストランのような他の添加物も添加してもよい。トリフルオロ酢酸（ＴＦＡ）を使用することができる。表２の最後に記載の溶媒系は、溶出モードにおいて重アルコールのｎ‐ブタノールを中濃度の水性燐酸緩衝液と併せて使用するものであり、水性移動相は、溶解物からタンパクを単離するためのものである。このような条件はタンパクを変性させない。第２ブタノールのようなその他の重アルコール及びＮａＣｌ、酢酸アンモニウムなどのようなその他の塩類も使用することができる。

実施例１

シンターステーション２３００に加えてラピッドプロトタイピング機を用い、レーザ焼結技法により３Ｄ（３次元）印刷プロセスを行って、螺旋管支持体フレームを構築した。ラピッドプロプロトタイピング機がＣＡＤで設計された螺旋管支持体及びトップの３Ｄ形状物を形成した。これは、モノマー粉末、ＥＯＳプレシジョン（EOS Precision ）社製ポリアミドＰＡ２２０のレーザ硬化により行われた。印刷機で螺旋管支持装置を１個形成し、さらに３個同時に成形した。チャンバ内で粉末を層状にし、レーザが、プログラミングされたパターンで表面上を移動し、表面に当たりながら形状を硬化させる。その後、延展機により別の粉末層を加えた。それ故、本明細書に記載したように製作した場合、多数の層が支持体１及びトップ８を構成する。形状をボトムから積み上げる。完成すると、形状物を取り出し、固まっていない粉末を除去するために水で洗浄した。その結果生じた白色の硬質ナイロン複合材ロータを耐薬品性塗料で染色し又は着色する。螺旋管支持体と同じ製造方法を用いて、トップを調製し、さらに、組み立てた装置内で管が摩耗しないように、トップの裏面にテフロン（Teflon（登録商標））被膜を塗布した。同じレーザ焼結プロセスで、加圧ツールを作った。これは、直径１５ｃｍの円板に２ｃｍの中心孔を開けてシャフトを嵌め込んだものから成り、５ｃｍの湾曲延長部が４箇所あって螺旋管支持装置の放射状溝に嵌っている。管、ＦＥＰ ＳＷ＃１４（ゼウス社製）内径１．６ｍｍ、外径２．４ｍｍを、螺旋管支持体内にボトムから巻いていき、３層巻き終えるごとに、加圧ツールで管を中圧で加圧し、１５分間クランプで留めた。このプロセスの後、約１０個の層の管は、全容積が１３５ｍｌの容量を与えるのに適する。組み立てた螺旋管支持装置内の管に水を充填した。この装置を中央シャフトに挿入したねじから管で吊り下げ、ロータを水平にするために重りを加えた。重りは、短い金属棒（約２ｃｍ）で、ロータの周囲を取り巻く孔に挿入されエポキシ系接着剤で所定の位置に保持される。ロータの内側からの管を、ナット、フェルール及びユニオンで２本の流動管に接続し、ボトムの外側及びカバー上で、内径０．８ｍｍ、外径１．６ｍｍのＰＴＦＥ流動管に接続されるようにした。かかる流動管を、中心軸線シャフトを貫通してプラネタリー型遠心分離器のトップまで進め、これをクランプ留めした。流入管を、溶媒ポンプに接続されたサンプルループに接続し、流出管をフラクションコレクタに接続した。

高さ７．３ｃｍ、外径１７．５ｃｍのカバー付き螺旋管支持体（歯車抜きの寸法）を構築し、Centrichrom 社製プラネタリー型遠心分離器内に入れて使用し、同サイズの別のロータをピーシー・インコーポレイテッド（P.C.Inc.）社製プラネタリー型遠心分離器内で使用した。本明細書に記載した実験の実施例は、Centrichrom 社製計器内で、このロータを用いて行った。シャフトの反対側に重りを付けて遠心分離器内のロータのバランスが取られる。さらに、ファーマテックリサーチ（Pharma-Tech Research）社製プラネタリー型遠心分離器内において、３個一組のロータ（高さ１０．４ｃｍ、外径１０．８ｃｍ）を流動管が相互接続されている３本の別個のプラネタリー型シャフトに連続して取り付け、実験に利用した。最後に、２個のロータを構築し、ユニオンで管が接続された単一シャフトに取り付けた。奥行９ｃｍ、外径１７ｃｍの寸法のこれらロータを、島津製作所製の計器に取り付けるために構築した。

実施例２

この実施例は、図３に示す３種のペプチドを分離するための螺旋管支持体の使用について説明するものである。２０‐マーは、追加的なＷ残基が存在すると共にＨ残基が２０‐マーではＡと置き換わることを除き、１８‐マーと同じ配列を有する。ｓ‐ブタノール‐１％トリフルオロ酢酸（「ＴＦＡ」）の１：１（ｖ／ｖ）水溶液から成る溶媒系内で、水性下相を移動相として、ペプチドを分離した。各ペプチドを約１０ｍｇずつ流速１ｍｌ／分で分離した。２分間隔で画分を回収し、各ペプチドの溶出プロファイルを、ＨＰＬＣ及び吸光光度分析で算定した。

ペプチド及びタンパクに使用することになる溶媒系の固定相保持を動作条件下で測定するために、螺旋管支持装置の初期研究を行わなければならない。溶媒系の重相及び軽相は、遠心分離の方向及び螺旋管支持体内で管が巻かれた方向に応じて、異なるように保持される。一般に、固定相の最大保持は、重相が内側吸込口を通じて（ヘッドからテールへ）導入され軽相が外側終端に（テールからヘッドへ）圧送されるときに達成される。このような設定下では、軽相は移動相として使用され、螺旋管支持体は反時計回り方向に回転される。固定相保持は、移動相として使用する各相について測定される。これは、次の操作、即ち、（１）コイルに固定相を充填し、（２）螺旋管支持装置の回転を開始し、（３）通過する移動相をポンプで注入することにより行われる。回転の開始から溶媒フロントが通過する時点までの間に装置から出た量が、平衡状態の確立後の排除体積Ｖ_mに相当する。カラム全容積Ｖ_cからＶ_mを差し引くと、固定相体積、Ｖ_sが得られる。相保持は、固定相体積対全体積の比、Ｖ_s／Ｖ_cである。移動相の溶出が生じている間は、背圧が増大する。背圧は、溶媒系の界面張力で左右される。

分配係数Ｋの算定は、少量のサンプルを溶媒系に溶かし混合液を振盪して相分離後に両相のサンプル濃度を測定することにより行われる。これにより、上相対下相の濃度比（Ｃ_u／Ｃ_l）が得られる。移動相として選ばれる相は、１〜２の分配係数を示す相である。分離効率は、従来のガスクロマトグラフィー方程式であるＮ＝（４Ｒ／Ｗ）²を使用して算定される。理論段又はＮは、ピーク形状から計算される。Ｒは、最大ピークの保持時間又は体積であり、Ｗは、Ｒと同じ単位で表示したピーク幅である。調製的分離のために、Ｎの数値は、最大１０００まででよいが、より重要な関係式は、分解能である。隣接ピーク間の分解能は次式で示される。Ｒ_S＝２（Ｖ_R,2−Ｖ_R,1）／（Ｗ₁＋Ｗ₂）。この方程式を用いて、各溶質保持体積に次式、即ち、Ｖ_R＝Ｖ_m＋ＫＶ_Sを代入すると、Ｖ_m項は消え、次式、即ち、Ｒ_S＝２（Ｋ₂−Ｋ₁）Ｖ_s／（Ｗ₁＋Ｗ₂）が与えられる。

分解能は、Ｖ_s及びＫ間の差に比例する。向流クロマトグラフィーに特有の高いＶ_sから、Ｎ＜１０００の場合、高い分解能が可能となる。分解能は、向流クロマトグラフィーの場合である均一濃度溶離（グラジエントは、ゼロ）で測定され、溶媒系の組成により調整することができる。

代表的には、サンプルは、少量（コイルの全体積の１／１０以下）の両相に溶かし、固定相を充填してあるコイルに装填する。遠心分離を開始し、移動相を例えば２ｍｌ／分で圧送する。溶出液は、ＵＶ検出器を通過することができ、その方向は、移動下相については流動セルを通過して上向き、移動上相については下向きであり、透明な相液滴になる。クロマトグラフィーは、カラム容積２〜３個分、続行することができ、かかる時間中に画分が回収される。回転が停止されると、内容物がポンプで注入されるか又は窒素圧もしくはヘリウム圧で押し出され、画分は回収され続ける。希望される場合、溶出速度が非常に遅い化合物については、他方の移動相の進入を改変し固定相としての他方の相を介して化合物を溶出させることにより、移動相を変更することができる。ランの間に、管のコイルを次の操作、即ち、（１）水ですすぎ洗いし、（２）アセトンですすぎ洗いし、（３）窒素気流でコイルを乾燥させることにより洗浄するのが良い。関心のあるタンパク又はペプチドの溶出プロファイルを算定するために、回収した画分を、画分の分取に対するタンパク定量により分析することができる。また、タンパク又はペプチドは、回収した画分に対して質量分析を行うことによっても特定できるはずである。ＨＰＬＣ又はＰＡＧＥで分析される通りの、純粋化合物を含む画分は、プールして乾燥させることができる。

上述の通り、Ｋは、Ｃ_n／Ｃ_lとして定義される。表３に記載の各ペプチドについて、固定相の濃度（Ｃ_s）を移動相の濃度（Ｃ_m）で除算することにより、実験に基づくＫ（Ｋ_exp）を計算した。３種のペプチドは、予想された順序で溶出し、予想されたＫ値とＫ_exp値とは、比較的よく相関していた。

ペプチドは、各自のＫ値から予想された通りに溶出した（表３）。データは、螺旋管支持体ロータが理論予測に非常に近いこと及び新型ロータを用いて比較的大きな分子が効果的に分離できることを実証している。

実施例３

本実施例は、３次元印刷及びレーザ焼結を用いて構築されたプラスチック製螺旋管支持体の、小分子（ＭＷ＜５００の分子として定義されるもの）混合物を分離する能力を説明するものである。小分子化合物であるアスピリン、サルチル酸、サリシン及びナリンゲニンを、ｓ‐ブタノール‐１％ＴＦＡの１：１（ｖ／ｖ）水溶液から成る溶媒系に装填した。その後、装填した混合物を螺旋管支持体内に入れ、８００ｒｐｍで、流速１ｍｌ／分で遠心分離した。５０画分が回収されるまで、２分間隔で画分を回収した。５０個目の画分を回収した後、内容物を押し出した。

４種類全ての小分子が分離され、アスピリンとナリンゲニンだけは、溶出が一部重複した。溶出順序は、分子のＫ値に基づいて予期された順序と一致する。固定相保持は、高率の６９％であった。データは、小分子の分離に関する、改良型螺旋管支持体の有用性を実証する。設計は、工業プロセスのためのスケールアップ又は質量分析への分析応用のためのスケールダウンが容易に行える。

実施例４

関心のある装置は、タンパク又はその他の大分子の分離に使用することができる。本実施例では、上記の通りに螺旋管支持体を作り、マウスのウテログロビンの精製に使用した。マウスのウテログロビンは、ＭＷが７０ｋＤａで、通常、ダイマーとして存在するが、溶液内ではモノマー型のタンパクも蓄積することができる。ウテログロビンダイマーからウテログロビンモノマーを分離するために、螺旋管支持体に入れて分離を行った。これは、ＨＰＬＣによるＫ値の測定後に螺旋管支持装置による向流クロマトグラフィーを用いてタンパクを分離することにより行われた。ＰＡＧＥ分析は、タンパクのモノマーとダイマーとの順調な分離を実証した。各々のＫ値を測定するために、ＨＰＬＣの定量方法を用いた。モノマーについては３１．５分、ダイマーについては３２．８分のところに相当するピークの高さである各ＨＰＬＣ保持時間を測定し、上相対下相の濃度比は、双方で異なる数値を示す。２つのタンパクピークは、ＰＥＧ（１０００）１２．５％‐Ｋ₂ＨＰＯ₄１２．５％内において、Ｋ値が４．０及び６．９と計算された。異なるＫ値は、一方又は他方の移動相により２種が分離できるはずであることを意味する。数値が２より高いため、検体は、コイル内に長時間留まり最終的にはほぼ４〜７個のカラム容積内に溶出されるはずである。このため、カラム容積２個分のランを行い、その後、カラムの内容物を押し出して分析した。

下（移動）相は、予想された体積のタンパクが出現したことを示した。実験から回収した選択画分の体積を、ＰＡＧＥで調べた。ＰＡＧＥは、ウテログロビンのモノマーとダイマーとの分離を明らかにし、よって、かかる装置及びこの装置の使用方法が、タンパクのような大分子生体材料を順調に分離できることが実証された。出発物質のＰＡＧＥランは、それぞれ約５ｋＤａ及び１４．５ｋＤａのところに延びているマウスのウテログロビンのモノマー及びダイマーの存在を示した。

実施例５

この実施例は、さらに、改良型装置及びかかる装置の使用方法の大分子分離能力を実証するものである。本実施例では、３１ｍｇのリゾチーム（１４．４ｋＤａ）と２４ｍｇのミオグロビン（１７．７ｋＤａ）とを混合し、特許請求の範囲に記載している向流クロマトグラフィー装置及び使用方法を用いて分離した。１２．５％ＰＥＧ（ＭＷ１０００）：１２．５％Ｋ₂ＨＰＯ₄から成る非変性水性二相溶媒系は、ポリエチレンリッチ上相及び燐酸緩衝液リッチ下相を提供する。下相を移動相として流速１ｍｌ／分で使用した。ＵＶ検出は、およそ４０ｍｌの地点での溶媒フロントの溶出を明らかにして、７０％の固定相保持を示し、その後、ベースラインで分離された２つのタンパクピークを示した。図４Ａは、この特定の実験に関するＵＶ吸収（グラフ内では電圧として特定される）のグラフである。図４Ｂは、１００分ピーク（レーン３〜５参照）及び２００分ピーク（レーン７〜９参照）のＰＡＧＥ分析である。レーン１０及び１１は、それぞれリゾチーム又はミオグロビンのみを示した対照である。データは、大分子生体材料の混合物の精製に関する向流クロマトグラフィー装置及び使用方法の汎用性を実証している。ミオグロビン及びリゾチームのＫ値は、それぞれ０．３８及び１．３５で、溶出順序と一致した。

実施例６

本明細書に記載した向流クロマトグラフィー法及び装置の別の利点は、複数の化学物質又は生体材料の分離に様々な溶媒系を使用することができるということにある。この実施例では、かかる方法及び装置を、粗溶解物からタンパクを分離するために使用する。先行技術の発明では、向流クロマトグラフィーを行うために細胞溶解後、その他の準備ステップ（例えば遠心分離）が必要であった。大腸菌内で発現させた融合タンパクを、細胞溶解後、その他のクロマトグラフィー又は準備ステップなしに、特許請求の範囲に記載している螺旋管支持装置及び使用方法を用いて単離した。前出の実施例に記載のＰＥＧ溶媒系を使用した。宿主細胞タンパクとその他の細胞片との塊から、標的の融合タンパクを分離して十分に精製し、特異的なプロテアーゼにより消化されて融合タンパクから標的タンパクが放出され得るようにした。タンパク生成物、出発融合タンパク及びプロテアーゼから融合タグを分離するために、消化された融合タンパク又はペプチドを再度、装置を用いて適切な溶媒系で精製した。

実施例７

この実施例は、さらに、融合タンパクであるＴｏｓｙｎ２‐インスリンＡの粗溶解物からの分離を説明するものである。Ｔｏｓｙｎ２‐インスリンＡ融合タンパク付きの細菌を、４Ｌのスーパーブロス内で成長させた。ペレット化した細菌細胞は、重量が８７ｇあり、２０ｍＭのＮａ₂ＨＰＯ₄、０．５ＭのＮａＣＬ、ｐＨ７．２溶液４３５ｍｌに懸濁させた。１０〜１５Ｋｐｓｉのアベスチン・エマルシフレックスＣ５均質機に、懸濁液を２回通した。この溶液を４°Ｃで３０分間、１９０００Ｇで遠心分離した。後で分析するために、上澄み液の一部を−２０°Ｃで保管した。標的の融合タンパクのＭＷは、約１０ｋＤａである。

螺旋向流クロマトグラフィーの溶媒系を、次のような組合せで、即ち、７５ｇのＰＥＧ１０００、７５ｇのＫ₂ＫＰＯ₄と４５０ｇの水を１Ｌのエルレンマイヤーフラスコに入れたもの（１２．５％ＰＥＧ：１２．５％塩溶媒系）で調製した。化学物質が完全に溶けるまで、溶液を撹拌した。その後、５００ｍｌのガラス製分液漏斗に溶液を移し、溶液は、およそ２４０ｍｌの上相と３００ｍｌの下相とに分離された。９ｇの（上記均質化からの）解凍溶解物、１．５ｇのＰＥＧ及び１．５ｇのＫ₂ＫＰＯ₄を組み合わせることにより、Ｔｏｓｙｎ２‐インスリンＡを含有する粗溶解物を調製した。化学物質が溶解した後、サンプルを５分間、１０００Ｇで遠心分離した。上相の透明部と下相の透明部とを一緒にして注入用のサンプルループに入れ、螺旋管支持装置に入れた。黒っぽい沈殿物は後に残した。１２．５％ＰＥＧ：１２．５％塩溶媒系は、細胞片及び宿主細胞タンパク並びにＤＮＡを相当量除去するために役立つ。

螺旋管支持装置を、プラネタリー型遠心分離器内に入れ、管に上相を充填した。初めに、サンプルを８３０ｒｐｍで遠心分離して１ｍｌ／分の流動を開始させ、流動ライン内にサンプルを注入した。反時計回りの回転により、下相を内側終端に溶出させた。２分ごとに画分を回収した。溶媒フロント又は螺旋管支持装置から排除された上相は、４４．５ｍｌの地点又は画分２０に現れた。ラン中の固定相保持は６７％であった。画分１６１で遠心分離を停止した。螺旋管支持装置内に残った内容物をヘリウム圧で押し出し、画分を回収した。

吸光光度分析で測定したピークに基づいて、特定の画分に対してＨＰＬＣ及びＰＡＧＥ分析を実施した。ＰＡＧＥによれば、画分３０には、多くの低ＭＷ帯域があり、画分１８１及び１８２には、１０ｋＤａの標的タンパク（最小のタンパクであると思われる）を含め、多くの高ＭＷタンパク帯域があった。早期画分１７７〜１７４には、それより少ない量のタンパクがあった。Ｔｏｓｙｎ２‐インスリンＡ融合タンパクは、第１の大ピークに多くのタンパクから分離された。ＰＡＧＥでは、後期に溶出するタンパクの数量が、たとえＵＶピークの方が高くとも、第１の溶出画分からのタンパクより多いように見えた。

上述の分離では、螺旋管支持装置内に標的タンパクが強く保持され、従って、タンパクの分解が改善されるか否かを観察するために、逆モードで溶出させることが決定された。同じ溶媒系及び同じサンプルを調製したが、螺旋管支持装置には下相を充填した。遠心分離を開始し、上相の流動が始まった。外側終端に上相をポンプで注入し、回転は反時計回りであった。溶媒フロントが画分３１に現れ、５９％の固定相保持であった。他方のランで保持されていたタンパクが、溶媒フロントの後に溶出され、２つの主要ピークに広がった。非常に高いＵＶ吸収画分が最後になった。ＰＡＧＥは、画分３５に標的タンパクがその他のタンパクとともに存在することを明らかにし、また、画分４０，５０及び５５も、低濃度のタンパクの存在を示した。

分離に対する溶媒系内の高ＭＷのＰＥＧの効果を観察するために、溶媒系及びサンプルを高ＭＷのＰＥＧ（ＭＷ３３５０）で作ったことを除き、上記と同じ手順に従った。溶媒フロントが画分３９に現れ、排出体積は６７ｍｌで、５０％の固定相保持であった。ＰＡＧＥは、標的タンパクが画分４４に、高ＭＷのタンパクよりも（また、画分５２，５６及び１１２と比べても）著しく高い濃度で存在することを明らかにした。画分５２〜５６は、標的タンパク及び他の１種類のみの有意のタンパクを含んでいた。画分１１２は、多くの異なるタンパクを含み、これらを標的タンパクから除去した。この結果、より多くの不純物が融合タンパクから除去されたように思われた。

以上要約すれば、重合溶媒系のツールは、次の項目、即ち、（１）重合体のＭＷに関する組成、（２）水溶性塩のｐＨ及び（３）精製しようとする実体の分配係数を最適にするために添加可能なその他の含有物により変更することができる。不純物を最大限分離するために、上相又は移動性の下相に溶媒系を加えることができる。したがって、本発明は、巨大分子（生体分子のような）のような実体を単離して精製するために、汎用性のある方法である。

表 1

下相内側終端ヘッド（「Ｌ‐ｉ‐Ｈ」）、下相内側終端テール（「Ｌ‐ｉ‐Ｔ」）、上相外側終端ヘッド（「Ｕ‐ｏ‐Ｈ」）及び上相外側終端テール（「Ｕ‐ｏ‐Ｔ」）。「Ｈ」及び「Ｔ」は、それぞれヘッド及びテールを指す。ＣＷは、時計回りの回転を意味し、ＣＣＷは、反時計回りの回転を意味する。

表 2

表 3

本明細書において記載した特許文献及び非特許文献の全てを参照により引用し、これらの記載内容を本明細書の一部とする。
なお、好ましい実施態様として、本発明を次のように構成することもできる。
１． 向流クロマトグラフィー装置であって、
１）１つ又は２つ以上の第１の表面を有し、前記第１の表面は、複数本の編成された螺旋チャネルを有し、
２）１つ又は２つ以上の管接近ポートを有し、
３）オプションとして、１本又は２本以上の半径方向チャネルを有する、装置。
２． 前記半径方向チャネルは、湾曲している、上記１記載の装置。
３． 前記装置は、管を前記螺旋チャネル内の定位置に保持する１つ又は２つ以上の突起を更に有する、上記１記載の装置。
４． 前記装置は、重りを収容できる１つ又は２つ以上の空間を更に有する、上記１記載の装置。
５． 前記装置は、圧縮ねじユニオンを保持する１つ又は２つ以上のスナップロックを更に有する、上記１記載の装置。
６． 前記装置は、１つ又は２つ以上の圧縮ねじユニオンを更に有する、上記１記載の装置。
７． 前記装置は、管を保持する１つ又は２つ以上のループを更に有する、上記１記載の装置。
８． 前記装置は、１つ又は２つ以上のリテーナ支持体を更に有する、上記１記載の装置。
９． 前記装置は、第２の表面を更に有し、前記第２の表面は、前記第１の表面に対してトップである、上記１記載の装置。
１０． 前記第２の表面は、１つ又は２つ以上の管接近ポートを更に有する、上記９記載の装置。
１１． 前記第２の表面は、重りを収容できる１つ又は２つ以上の空間を更に有する、上記９記載の装置。
１２． 前記第１の表面は、１つ又は２つ以上のロック機構体により前記第２の表面に取り付けられる、上記９記載の装置。
１３． 前記第２の表面は、管を保持する１つ又は２つ以上のループを更に有する、上記９記載の装置。
１４． 前記第２の表面は、圧縮ねじユニオンを保持する１つ又は２つ以上のスナップロックを更に有する、上記９記載の装置。
１５． 前記第２の表面は、１つ又は２つ以上のリテーナ支持体を更に有する、上記９記載の装置。
１６． 向流クロマトグラフィー装置を製造する方法であって、複数本の編成された螺旋チャネル、１つ又は２つ以上の管接近ポート及びオプションとして半径方向チャネルを有する第１の表面を形成するステップを有する、方法。
１７． 前記第１の表面は、ナイロンポリマー、プラスチック、ポリテトラフルオロエチレン（テフロン：Teflon（登録商標））、ポリ塩化ビニル、ポリスチレン、ポリアミドＰＡ‐２２０、フォトポリマー、FullCure（登録商標）材料、Polyjet 3D Printer（登録商標）材料、モノマー粉末、及び金属又は金属複合材から成る粒子から成る群から選択された１種類又は２種類以上の材料で作られる、上記１６記載の方法。
１８． 前記形成は、レーザ焼結、紫外線照射、成形、プロトタイピング、穴あけ、及び機械加工から成る群から選択された方法である、上記１６記載の方法。
１９． 前記半径方向チャネルは、湾曲している、上記１６記載の方法。
２０． 前記第１の表面は、重りを収容できる空間、管を保持するループ、リテーナ支持体、スナップロック、又はこれらの組合せを更に有する、上記１６記載の方法。
２１． 前記方法は、第２の表面を形成するステップを更に有し、前記第２の表面は、前記第１の表面に対してトップである、上記１６記載の方法。
２２． 前記第２の表面は、ナイロンポリマー、プラスチック、ポリテトラフルオロエチレン（テフロン：Teflon（登録商標））、ポリ塩化ビニル、ポリスチレン、ポリアミドＰＡ‐２２０、フォトポリマー、FullCure（登録商標）材料、Polyjet 3D Printer（登録商標）材料、モノマー粉末、及び金属又は金属複合材から成る粒子から成る群から選択された１種類又は２種類以上の材料で作られる、上記２１記載の方法。
２３． 前記形成方法は、レーザ焼結、紫外線照射、成形、プロトタイピング、穴あけ、及び機械加工から成る群から選択される、上記２１記載の方法。
２４． 前記第２の表面は、管接近ポートと、重りを収容できる空間と、前記第２の表面を前記第１の表面に取り付けるロック機構体、又はこれらの組合せを更に有する、上記２１記載の方法。
２５． 前記ロック機構体は、ラッチ、ボルト、スナップ、クリップ、ねじ、切欠き、シャフトを挿通状態で配置できる中央空間、及び反対側の表面を取り付けるためのねじ山から成る群から選択される、上記２４記載の方法。
２６． 前記第２の表面は、ループ、スナップロック、リテーナ支持体、又はこれらの組合せを更に有する、上記２１記載の方法。
２７． １種類又は２種類以上の物質を分離するために向流クロマトグラフィー装置を使用する方法であって、
管を入口に通して、編成された螺旋チャネル及びオプションとして半径方向チャネルを有する前記装置に用いられるロータ中に通すステップと、
前記管を前記編成状態の螺旋チャネル中に通し、次に前記ロータに設けられた出口中に通すステップと、
前記１種類又は２種類以上の物質を含む試験試料を用意するステップと、
溶剤系を用意するステップと、
前記試験試料を前記溶剤系中に投入するステップと、
前記組合せ状態の試験試料と溶剤系を前記管から前記装置中に配置するステップと、
前記装置内での前記ロータを前記装置内で回転させて前記１種類又は２種類以上の物質を分離するステップとを有する、方法。
２８． 前記管は、非一様な内面を有する、上記２７記載の方法。
２９． 前記半径方向チャネルは、湾曲している、上記２７記載の方法。
３０． 前記装置は、前記螺旋チャネルに設けられていて、管を定位置に保持する１つ又は２つ以上の突起を更に有する、上記２７記載の方法。
３１． 前記装置は、重りを収容できる空間、スナップロック、圧縮ねじユニオン、ループ、リテーナ支持体、又はこれらの組合せを更に有する、上記２７記載の方法。
３２． 前記装置は、第２の表面を更に有し、前記第２の表面は、前記第１の表面に対するトップである、上記２７記載の方法。
３３． 前記第２の表面は、管接近ポート、重りを収容できる空間、ロック機構体、ループ、スナップロック、リテーナ支持体、又はこれらの組合せを更に有する、上記３２記載の方法。
３４． 前記回転は、惑星状回転である、上記２７記載の方法。
３５． 前記溶剤系は、二相水性ポリエチレン及び塩溶液、二相重アルコール水溶液、ポリエチレングリコール：Ｋ ₂ ＨＰＯ ₄ 溶液、及びｓ‐ブタノール‐トリフルオロ酢酸溶液から成る群から選択される、上記２７記載の方法。

Claims (1)

1. 向流クロマトグラフィー装置であって、
   １）複数本の編成された螺旋チャネルを有する１つ又は２つ以上の表面と、
   ２）前記表面に設けられた、１つ又は２つ以上の管接近ポートと、
   ３）前記表面に設けられた、１本又は２本以上の、端部又は両端部のところで湾曲した半径方向チャネルと、を有する、装置。

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