CN101229452A - 一种多功能高效逆流色谱仪 - Google Patents
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Abstract
一种多功能高效逆流色谱仪,它由盘式逆流色谱分离柱、配重体、行星架、柱体自转轴、行星轮、中心轮、中心公转轴、电机、传动装置、速度控制装置和保温机箱组成;所述的盘式逆流色谱分离柱,它包括有至少一个或多个设槽的圆盘、每个圆盘两侧的隔板、柱体自转轴和上法兰、下法兰;所述的柱体自转轴为空心,贯穿在上法兰、下法兰、圆盘及隔板的中心;在上法兰、下法兰、圆盘及隔板的内外边缘设有多个螺栓部件,将上、下法兰、圆盘及隔板固定在一起。本发明的优势在于:可以使含有机相两相体系的固定相保留值进一步提高,实现在高流速下对小分子物质的高效快速分离。同时实现对双水相体系的保留率的显著提高,使其能够适用于生物大分子的分离。
Description
技术领域
本发明涉及逆流色谱分离技术领域,是一种多功能高效逆流色谱仪。
背景技术
逆流色谱(countercurrent chromatography,CCC)是一种连续的液液分配色谱分离技术,在在二十世纪八十年代发展成为高速逆流色谱(High-speed,HSCCC),近年来在天然生物活性成分,尤其是小分子成分的分离纯化方面显示了许多独特的优势。由于其不需要固体支撑体,物质的分离依据其在两相互不混溶的液体中分配系数的不同而实现,因而避免了被分离物质的不可逆吸附、失活和变性等问题。而且由于被分离物质与液态固定相之间能够充分接触,使得上样量大大提高,是一种理想的制备分离手段。
目前,国内外商业化的高速逆流色谱仪,都采用多层盘绕的聚四氟乙烯螺旋管柱系统(如图1所示)。它利用螺旋管柱在离心力场中的同步行星式运动而产生的切向阿基米德螺旋力和径向离心力,使两相溶剂体系在螺旋管内建立起一种特殊的单向性流体动力学平衡,从而实现液态固定相的高效保留。对于分离小分子物质的两相溶剂体系的固定相保留值在一定条件下可达到70%以上,基本上可满足各类天然小分子物质的分离纯化需要。但是其分离速度和分离效率有待进一步提高。
对于分离生物大分子所必需的高黏度、低界面张力两相溶剂体系,如双水相聚合物体系,由于其粘度大,扩散系数小,两相密度差也很小,分层时间长,在柱内有出现乳化的倾向,使得常用的聚合物体系在HSCCC仪上固定相保留值低于10%,因而限制了高速逆流色谱技术在分离生物大分子物质方面的应用。
发明内容
本发明的目的是针对上述逆流色谱仪的不足,提供一种新型的逆流色谱分离仪。采用这种逆流色谱仪器一方面可以使含有机相两相体系的固定相保留值进一步提高,从而实现小分子物质在高流速下的快速高效分离;另一方面可以使双水相体系的固定相实现高效保留,使其适用于生物大分子物质的分离。
为实现上述目的,本发明采取以下技术方案:
一种多功能高效逆流色谱仪,它有盘式逆流色谱分离柱、配重体(或第二分离柱)、行星架、行星轮、柱体自转轴、中心轮、中心公转轴、电机、传动装置、速度控制装置和保温机箱组成。
所述的盘式逆流色谱分离柱,它包括有至少一个或多个设槽的圆盘,圆盘两侧的隔板,柱体自转轴和上法兰、下法兰;所述的柱体自转轴为空心,贯穿在上法兰、下法兰、圆盘及隔板的中心;在上法兰、下法兰、圆盘及隔板的内外边缘设有多个螺栓部件,将上、下法兰、圆盘及隔板固定在一起。
所述的设槽的圆盘的上端面设有至少一条螺线型流通槽,该螺线型流通槽有首端口和尾端口,首端口设于靠近圆盘的柱体自转轴的位置,尾端口设于靠近圆盘边缘的位置。每个圆盘在其背面径向方向上设有至少一条直线型通道,用以连通同一圆盘上的多条螺线型流通槽,以及与相邻圆盘上的螺线型流通槽之间连通。
所述的每个圆盘的两侧设有隔板,在隔板上对应圆盘首端口处设有小孔,使相邻圆盘上的流通槽之间实现连通。
所述的螺线型流通槽是单头或多头螺线型流通槽。
所述的单头螺线型流通槽有首端口和尾端口,首端口设于靠近圆盘的柱体自转轴的位置,尾端口设于靠近圆盘边缘的位置,并设有一个小孔,该小孔与圆盘背面的一条窄的直线型通道的一端连通,该直线型通道的另一端与相阾的另一圆盘的流通槽的首端口相对应,在两圆盘之间隔板上的对应位置设有隔板小孔,使上一个圆盘的流通槽的尾端口通过小孔、直线型通道、隔板小孔与下一个圆盘的螺线型流通槽的首端口相连通,实现不同圆盘上的螺线型流通槽之间的串联。
所述的多头螺线型流通槽的每条螺线型流通槽有首端口和尾端口,首端口设于靠近圆盘的柱体自转轴的位置,尾端口设于靠近圆盘边缘的位置,首端口和尾端口在圆盘上对应均匀设置;
其中,第一条螺线型流通槽的首端口内不设小孔,尾端口内设有小孔,其余每条螺线型流通槽的首端口内和尾端口设有小孔,每条螺线型流通槽的尾端口内小孔与圆盘背面的一条窄的直线型通道的一端连通,该直线型通道的另一端与同一圆盘的下一条螺线型流通槽的首端口内的小孔连通,使圆盘上的螺线型流通槽之间实现串联。在隔板上对应第一条螺线型流通槽的首端口处设有隔板小孔,使上一个圆盘的流通槽的最后的尾端口通过直线型通道与下一个圆盘的螺线型流通槽的首端口相通,实现不同圆盘上的螺线型流通槽之间的串联。
在上法兰、下法兰上各设置一个对应隔板小孔的通孔,分别将构成分离柱的圆盘上的第一条螺线型流通槽的首端口和最后一条螺线型流通槽尾端口用两条聚四氟乙烯管引出,形成一个完整的分离柱。
将该分离柱沿着柱体自转轴方向水平或垂直于地面装置于高速逆流色谱仪的行星架上,使其柱体自转轴和行星架的公转轴平行,并将两条聚四氟乙烯管线通过分离柱的柱体自转轴和逆流色谱仪的公转轴的中心解绕后引出逆流色谱仪,两端口分别与外设的进样器和检测器相连。
将该分离柱沿着自转轴方向垂直地面设置,可使流通槽内液体在行星式离心运动过程中所受的离心力方向与重力方向不在一个平面上。相对于水平设置,可以更好地克服由于重力对分离柱内液体在不同转动位置的不同影响所造成的液体返混流失等问题,使分离柱内液体得到更好的保留。
本发明的优势在于:
本逆流色谱仪采用盘式分离柱,通过在圆盘上刻槽的方式使流通槽内的液体在流动过程中所受的离心力呈快速的梯度增长,且增长的速度随螺距的增加而增加,使其对液体固定相的保留能力显著提高。而传统的多层螺旋管逆流色谱柱,每一层螺旋管内液体所受的离心力的增长受其管径的限制(最大螺距为管的外径),增长缓慢(如图1所示)。因此可以使含有机相两相体系的固定相保留值进一步提高,实现在高流速下对小分子物质的高效快速分离。同时实现对对双水相体系的保留率的显著提高,使其能够适用于生物大分子的分离。
附图说明
图1是已有的逆流色谱仪螺旋管分离柱结构示意图。
图2是本发明的逆流色谱仪的结构示意图。
图3是本发明的分离柱的剖视结构示意图。
图4是图3俯视结构示意图。
图5是本发明的单头螺线型流通槽圆盘结构示意图。
图6是图5圆盘的左视剖视结构示意图。
图7是本发明的隔板结构示意图。
图8是图7隔板的左视剖视结构示意图。
图9是本发明的上法兰结构示意图。
图10是图9上法兰的左视剖视结构示意图。
图11是本发明的下法兰结构示意图。
图12是图11下法兰的左视剖视结构示意图。
图13是本发明的四头螺线型流通槽圆盘结构示意图。
图14是图13四头螺线型流通槽圆盘俯视剖视结构示意图。
图15是本发明用于黄酮类物质分离的逆流色谱图(其中:1、异鼠李素;2、三奈酚;3、槲皮素)。
图16是本发明用于肽类物质分离的逆流色谱图(其中:1、Leu-Tyr;2、Val-Tyr)。
图17是本发明用于蛋白类物质分离的逆流色谱图(其中:1、卵转铁蛋白;2、卵白蛋白 3、溶菌酶)。
具体实施方式
参见图2~图14所示:一种多功能高效逆流色谱仪,它由盘式逆流色谱分离柱1、配重体(或第二分离柱)23、行星架14、行星轮6和24、柱体自转轴8、中心轮22、中心公转轴28、电机26、传动装置25(皮带轮和皮带)、速度控制装置27(变频器)和保温机箱21组成。所述的盘式逆流色谱分离柱1,它包括有至少一个或多个设槽的圆盘4、每个圆盘两侧的隔板3、柱体自转轴8和上法兰2、下法兰5;所述的柱体自转轴8为空心,贯穿在上法兰2、下法兰5、圆盘4及隔板3的中心;在上法兰2、下法兰5、圆盘4及隔板3的内外边缘设有多个螺栓部件7,将上、下法兰、圆盘4及隔板3固定在一起。
所述的设槽的圆盘4的上端面设有至少一条螺线型流通槽401,该螺线型流通槽有首端口402和尾端口403,首端口401设于靠近圆盘的柱体自转轴8的位置,尾端口403设于靠近圆盘边缘的位置。每个圆盘4在其背面径向方向上设有至少一条直线型通道404,用以连通同一圆盘上的多条螺线型流通槽,或与相邻圆盘上的螺线型流通槽之间连通。
所述的每个圆盘的两侧设有隔板3,在隔板上对应圆盘首端口处设有小孔301,使相邻圆盘上的流通槽之间实现连通。
圆盘4的材料可以采用不锈钢、塑料或任何耐腐蚀的高分子材料。本实施例中圆盘15的材料采用高密度聚乙烯材料,圆盘15的直径采用20cm,圆盘15厚度为6mm。隔板14可以采用惰性材料,优选密封性能好的。本实施例中隔板14采用1mm厚度聚四氟乙烯(PTFE)板。
见图5、图6所示:所述的单头螺线型流通槽401有首端口402和尾端口403,首端口402设于靠近圆盘的柱体自传轴8的位置,尾端口403设于靠近圆盘边缘的位置,单头螺线型流通槽401的尾端口403内设有小孔405,该小孔与圆盘背面的一条窄的直线型通道404的一端连通,该直线型通道404的另一端与相邻的另一圆盘的流通槽的首端口402相对应,在两圆盘之间隔板3上对应位置处设有隔板小孔301,使上一个圆盘的流通槽的尾端口通过小孔、直线型通道404、隔板小孔301与下一个圆盘的螺线型流通槽的首端口相连通,实现不同圆盘上的螺线型流通槽之间的串联。
在圆盘4的正面刻有单头螺线型流通槽401,该单头螺线型流通槽有两个端口,靠近圆盘中心的端口为首端口402,靠近圆盘外边缘的端口为尾端口403。单头螺线型流通槽401其截面形状可以是矩形或半圆形,其尺寸可以根据需要进行设置。本实施例中采用的流通槽401宽度为2.5mm,深度为2.0mm的矩形槽。该单头螺线型流通槽401与另一分离盘上的单头螺线型流通槽相连通。具体连通方式是:该单头螺线型流通槽的外端尾端口403内设有一个小孔405(约1mm直径),该小孔405与圆盘背面的一条细窄的直线型通道404(1×1mm)相连通,该直线型通道404由外向里延伸直到与流通槽首端口402相对应的位置。该位置与下一隔板上的隔板小孔301相连通,该隔板小孔301(约1mm直径)又与下一个相邻圆盘上的流通槽的里端的首端口402相连通。
见图4所示:由多个圆盘4和隔板3之间靠设置在圆盘的外边缘和内边缘的间隔相等多个螺栓部件7固定在一起,形成由多盘组成的盘式逆流色谱分离柱分离柱1。本实施例中内边缘螺孔间的距离为45度一个,外边缘螺孔之间的距离为10度一个。在所有的圆盘4、隔板3、上法兰2、下法兰5上都设置同样的螺孔20。
见图9和图11所示:在上法兰2、下法兰5上各设置一个对应隔板小孔301的通孔201、501,分别将圆盘的螺线型流通槽的首端口402和尾端口403用两条聚四氟乙烯管9从空心的柱体自传轴8内引出。在柱体自转轴8上套接有行星轮2。
根据使用需要,圆盘4上可以设有单头螺线型流通槽401或多头螺线型流通槽406。
参见图13、图14所示:是圆盘4上布置有四头螺线型流通槽圆盘结构示意图,在圆盘4上均交错设置有四条螺线型流通槽407,在圆盘背面径向方向设有四条窄的直线型通道411,将四条螺线型流通槽407的首端口408和尾端口409串联起来。
每条螺线型流通槽407的首端口408设于靠近圆盘的柱体自转轴8的位置,尾端口409设于靠近圆盘边缘的位置,首端口408和尾端口409在圆盘上对应均匀设置;
其中,第一条螺线型流通槽407的首端口408内不设小孔,尾端口409内设有小孔410,其余每条螺线型流通槽407的首端口408内和尾端口409设有小孔410,每条螺线型流通槽407的尾端口409内小孔410与圆盘背面的一条窄的直线型通道411的一端连通,该直线型通道411的另一端与同一圆盘的下一条螺线型流通槽407的首端口408内的小孔410连通,使圆盘上的螺线型流通槽407之间实现串联。在隔板3上对应第一条螺线型流通槽407的首端口408处设有隔板小孔301,使上一个圆盘的流通槽的最后的尾端口通过直线型通道与下一个圆盘的螺线型流通槽的首端口相通,实现不同圆盘上的螺线型流通槽之间的串联。
相对于单螺旋流通槽而言,在圆盘上交错设置多头螺线型流通槽406,可以使流通槽的螺距得到大幅度提高,从而对溶剂体系的保留更加有利。图13、图14显示了一个四头螺线型流通槽圆盘的结构图。这个圆盘上有四条螺线型流通槽407,每条螺线型流通槽407有一个首端I1,I2,I3,I4和一个尾端O1,O2,O3,O4。每条螺线型流通槽407的尾端刚好与下一条螺线型流通槽407的首端在一个径向方向上,如O1与I2,O2与I3,O3与I4,O4与I1。这样在每一条螺旋线的首端和尾端都设置一个小孔410(其中第一条螺线型流通槽的首端I1不设小孔),这样通过刻在圆盘背面对应位置的细窄的直线型通道411,实现同一分离盘上多条螺线型流通槽407之间的串联。这样交错设置的四条螺旋型流通槽407的螺距可以比单螺旋流通槽的螺距提高四倍。
如同单头螺线型流通槽分离盘之间的连接一样,经过串联形成的多头螺旋型流通槽的首端和尾端分别通过隔板上的小孔与相邻圆盘上的多头螺线型流通槽相连接。同样,多个圆盘之间靠设置在盘的外边缘和内边缘的间隔相等的多个螺孔和螺钉固定在一起,形成多盘分离柱。
在上法兰2、下法兰5上各设置一个对应隔板小孔的通孔201、501(见图9、图10),分别将构成分离柱的圆盘的第一条螺线型流通槽的首端口和最后一条螺线型流通槽的尾端口用两条聚四氟乙烯管9引出,形成一个完整的分离柱。
将该分离柱沿着柱体自转轴方向水平或垂直于地面装置于高速逆流色谱仪的行星架14上,使其柱体自传轴8和行星架的公转轴28平行,并将两条聚四氟乙烯管线9通过柱体自传轴8和逆流色谱仪的公转轴28的中心解绕后引出逆流色谱仪,两端口分别与外设的进样器和检测器相连。
考察装有本发明的逆流色谱仪(图2)对不同极性溶剂体系如氯仿-甲醇-水(4∶3∶2)、正丁醇-乙酸-水(5∶1∶4)、12.5%聚乙二醇1000-12.5%磷酸盐水溶液、4%聚乙二醇8000-5%葡聚糖T500-91%水等体系,在不同操作条件下,如分离柱的顺时针、逆时针旋转、溶剂体系的上相和下相分别作流动相、流动相从首端到尾端以及尾端到首端的不同流通方式等多种条件下的固定相保留行为。结果发现,对于弱极性的氯仿-甲醇-水(4∶3∶2,v/v/v)体系,在转速为800rpm逆时针旋转的情况下,下相为流动相(I→O),流速在较大范围内(0.5-7.0mL/min)变化时,固定相保留值均可保持在80%以上。在低流速下,固定相的保留值可达90%以上。对于正丁醇-乙酸-水(4∶1∶5,v/v/v)体系,在转速为800rpm顺时针旋转,下相为流动相(I→O),流速在(0.5-3.0mL/min)范围内变化时,固定相保留值可以保持在70%以上。对于12.5%聚乙二醇1000-12.5%磷酸盐水溶液体系,在转速为800rpm顺时针旋转,下相为流动相(I→O),流速在(0.5-3.0mL/min)范围内变化时,固定相保留值可以保持在65%以上。对于4%聚乙二醇8000-5%葡聚糖T500-91%水体系,在较低的流动相条件下,固定相的保留值可达近50%。
从上述的实验结果可以看出,本发明的逆流色谱仪,对于弱极性、强极性和双水相体系的固定相保留能力都有明显的提高。对于弱极性体系而言,可以实现高流速下固定相的高效保留,这对于提高小分子物质的分离效率,缩短分离时间非常有意义。对于强极性的正丁醇-乙酸-水体系和双水相聚合物体系的保留能力较传统的螺旋管柱有显著的提高,这对于扩展逆流色谱的应用领域,用于肽类、蛋白质等生物大分子的分离开辟了一条崭新的途径。
将图2所示的逆流色谱仪与外设的输液泵、进样器、检测器及数据采集工作站相连,构成一套完整的逆流色谱分离系统,用于不同类型物质的分离。
(1)用于典型的小分子物质黄酮混合物的分离(见图15):
首先配置氯仿-甲醇-水(4∶3∶2,v/v/v)体系450mL,静止分层。取上相为固定相,下相为流动相。将固定相以10mL/min的流速注满色谱柱,然后启动逆流色谱仪使其在转速800rpm下转动,同时将流动相以一定的流速从柱尾端向首端泵入分离柱,待出口端不再有固定相流出,表明系统已建立起流体动力学平衡。此时,将预先用流动相溶解好的样品混合物通过进样器进样,进行分离。结果如图15所示。可以看出,在流动相流速从4mL/min增加至8mL/min的过程中,三种黄酮类成分之间的分离度没有降低,但分离时间却成比例缩短,大大提高了分离效率。
(2)用于强极性的肽类物质的分离(见图16):
肽类物质的分离操作过程与(1)相同。溶剂体系采用正丁醇-乙酸-水(5∶4∶1,v/v/v),转速800rpm。图16所示分别为上相为流动相,流速2mL/min和4mL/min,采取由尾端向首端的流动方式,所得的两种二肽的分离结果。
(3)用于蛋白类大分子物质的分离(见图17):
图17为采用16%聚乙二醇1000-12.5%磷酸氢二钾水溶液分离鸡蛋清蛋白的分离结果。转速800rpm,下相为固定相,流速1.5mL/min,由首端向尾端洗脱。可见鸡蛋清中三种主要的蛋白之间实现较好的分离。
Claims (10)
1.一种多功能高效逆流色谱仪,它由盘式逆流色谱分离柱(1)、配重体(23)、行星架(14)、行星轮(6)、柱体自转轴(8)、中心轮(22)、中心公转轴(28)、电机(26)、传动装置(25)、速度控制装置(27)和保温机箱(2 1)组成;其特征在于:所述的盘式逆流色谱分离柱(1),它包括有至少一个或多个设槽的圆盘(4)、每个圆盘两侧的隔板(3)、柱体自转轴(8)和上法兰(2)、下法兰(5);所述的柱体自转轴(8)为空心,贯穿在上法兰、下法兰、圆盘及隔板的中心;在上法兰、下法兰、圆盘及隔板的内外边缘设有多个螺栓部件(7),将上、下法兰、圆盘及隔板固定在一起。
2.根据权利要求1所述的多功能高效逆流色谱仪,其特征在于:所述的设槽的圆盘(4)的上端面设有至少一条螺线型流通槽,该螺线型流通槽有首端口和尾端口,首端口设于靠近圆盘的柱体自转轴(8)的位置,尾端口设于靠近圆盘边缘的位置;每个圆盘在其背面径向方向上设有至少一条直线型通道,用以连通同一圆盘上的多条螺线型流通槽,以及与相邻圆盘上的螺线型流通槽之间连通。
3.根据权利要求1所述的多功能高效逆流色谱仪,其特征在于:所述的每个圆盘的两侧设有隔板(3),在隔板上对应圆盘首端口处设有小孔(301),使相邻圆盘上的流通槽之间实现连通。
4.根据权利要求2所述的多功能高效逆流色谱仪,其特征在于:所述的螺线型流通槽其横截面是矩形或半圆型。
5.根据权利要求2所述的多功能高效逆流色谱仪,其特征在于:所述的螺线型流通槽是单头(401)或多头螺线型流通槽(406)。
6.根据权利要求5所述的多功能高效逆流色谱仪,其特征在于:所述的单头螺线型流通槽有首端口(402)和尾端口(403),首端口设于靠近圆盘的自转轴的位置,尾端口设于靠近圆盘边缘的位置,尾端口内设有一个小孔(405),该小孔与圆盘背面的一条窄的直线型通道(404)的一端连通,该直线型通道的另一端与相邻的另一圆盘的流通槽的首端口相对应,在两圆盘之间隔板上的对应位置设有隔板小孔,使上一个圆盘的流通槽的尾端口通过小孔、直线型通道、隔板小孔与下一个圆盘的螺线型流通槽的首端口相连通,实现不同圆盘上的螺线型流通槽之间的串联。
7.根据权利要求5所述的多功能高效逆流色谱仪,其特征在于:所述的多头螺线型流通槽(406)的每条螺线型流通槽(407)有首端口(408)和尾端口(409),首端口设于靠近圆盘的中心自转轴的位置,尾端口设于靠近圆盘边缘的位置,首端口和尾端口在圆盘上对应均匀设置;
其中,第一条螺线型流通槽的首端口内不设小孔,尾端口内设有小孔(410),其余每条螺线型流通槽的首端口内和尾端口设有小孔,每条螺线型流通槽的尾端口内小孔与圆盘背面的一条窄的直线型通道(411)的一端连通,该直线型通道的另一端与同一圆盘的下一条螺线型流通槽的首端口内的小孔连通,使圆盘上的螺线型流通槽之间实现串联。在隔板上对应第一条螺线型流通槽的首端口处设有隔板小孔,使上一个圆盘的流通槽的最后的尾端口通过直线型通道与下一个圆盘的螺线型流通槽的首端口相通,实现不同圆盘上的螺线型流通槽之间的串联。
8.根据权利要求6或7所述的多功能高效逆流色谱仪,其特征在于:在上法兰(2)、下法兰(2)上各设置一个对应隔板小孔的通孔(201、501),分别将构成分离柱的圆盘的第一条螺线型流通槽的首端口和最后一条螺线型流通槽的尾端口用两条聚四氟乙烯管(9)引出,形成一个完整的分离柱。
9.根据权利要求8所述的多功能高效逆流色谱仪,其特征在于:分离柱沿着柱体自转轴方向水平或垂直于地面装置于高速逆流色谱仪的行星架上,使其柱体自转轴和行星架的公转轴平行,并将两条聚四氟乙烯管线通过分离柱的柱体自转轴和逆流色谱仪的中心公转轴的中心解绕将其引出逆流色谱仪,两端口分别与外设的进样器和检测器相连。
10.根据权利要求9所述的多功能高效逆流色谱仪,其特征在于:在分离样品时分离柱进行同向同步行星式运动。
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C02 | Deemed withdrawal of patent application after publication (patent law 2001) | ||
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