KR101717302B1 - 역류 크로마토그래피 로터 - Google Patents

역류 크로마토그래피 로터 Download PDF

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KR101717302B1
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Abstract

본 발명은 역류 크로마토그래피에 사용되는 나선형 튜브 지지 장치를 제작하는 방법, 역류 크로마토그래피 튜브 지지체 디자인에 대한 개선, 및 개선된 역류 크로마토그래피 장치를 이용하는 방법을 기술하고 있다. 나선형 튜브 지지 장치는 차례로 레이저 소결 기법을 이용하는 3차원 프린팅 공정과 같은 형상화 공정에 의해 제작될 수 있으며, 이는 용이하게 형성되는 물질로 제조될 수 있다. 튜브 지지체 및 상단 둘 모두에 대한 형태 변화는 튜브 지지체의 성능 및 제작 용이성을 개선시켰다. 개선된 튜브 지지체 및 제작 방법은 미세 규모 또는 대 규모 정제에서의 이용 및 소분자 또는 대분자 정제에서의 사용을 가능하게 한다. 특히, 단백질의 정제를 허용하는 특정 용매계가 기술되어 있다.

Description

역류 크로마토그래피 로터 {COUNTERCURRENT CHROMATOGRAPHY ROTOR}
본 발명은 역류 크로마토그래피 (CCC)에 사용되는 나선관 지지 장치의 제작 방법, 이의 사용 방법 및 이의 개선된 설계에 관한 것이다.
크로마토그래피는 이동상중에 용해된 물질을 고정상을 통과시켜 물질을 분리시켜, 이를 물질의 복합된 혼합물로부터 종종 정제하거나 동정하는 기법이다. 물질로는 (1) 기체, (2) 화학물질, (3) 생물학적 물질 예컨대, DNA, 탄수화물, 리피드, 펩티드, 단백질 또는 이들의 조합, (4) 분자, 또는 (5) 상기 언급된 물질의 임의의 조합물을 포함하나 이에 제한되지 않는다. 크로마토그래피를 사용하여 분리된 물질은 장치에 부착될 수 있는 다양한 검출 수단에 의해 분석될 수 있다. 현재 많은 다양한 유형의 크로마토그래피 및 분리 메카니즘이 존재하며 조사에 활발하게 사용된다.
역류 크로마토그래피는 액체-액체 분할에 기초하며, 여기서 두 이동상 및 고정상은 액체 상태로 존재한다. 이러한 기법은, 나선형 튜빙으로 고정되며 회전 예를 들어, 유성형 원심분리에 의해 발생하는 힘에 노출되는 고정 액체상으로부터 이동 액체상중의 화합물을 분리한다. 역류 크로마토그래피는 1970년대 초반부터 존재해왔으며, 화학적 화합물 또는 소분자 물질을 분리하는데 성공적으로 이용되었다. U.S. 특허 3,784,467, 3,775,309, 6,503,398, 5,770,083, 5,354,473, 5,332,504 및 5,215,664. 샘플 물질은 상 사이에서 물질의 용해도에 따라 분리된다. 용매는 다양한 부피부로 혼합되어 크로마토그래피용 용매계를 포함하는 두개의 안정한 불혼화성 상을 형성할 수 있다. 역류 크로마토그래피는 소분자 물질을 분리하거나 정제하는 다용도의 방법을 제공한다; 그러나, 종래 기술은 소분자 분리, 동정 또는 정제로 주로 제한되었다. 소수개의 종래 발견은 대분자 물질을 분리하기 위한 것으로 주장된 역류 크로마토그래피 원심분리에 관한 것이며, 이들은 본 발명과 같이 효율적이고 우수하게 작동하는 능력은 결여되어 있다. U.S. 특허 4,714,554 및 5,104,531.
역류 크로마토그래피의 초기 구체예는, 수직으로 고정되고, 말단에서 펌프로 이동 튜빙에 의해 서로 연결된 일련의 칼럼을 포함한다. U.S. 특허 3,784,467. 샘플 물질은 또 다른 칼럼중의 고형의 고정상 혼합물중에 용해되며, 이어서 상기 칼럼은 이동 튜빙에 의해 펌프에 연결되고 일련의 나머지 칼럼의 앞에 위치하게 된다.
후속 발명은 중심축 둘레로 회전하는 나선형 코일에서 회전 실 (roating seal) 없이 용매의 유출입을 위한 연속 튜빙을 어떻게 구성하는지를 보여준다. U.S. 특허 3,775,309. 1 회전시 장치는 행성 운동에서 트위스팅 및 언트위스팅을 달성하였으며, 이는 상을 혼합시켰다. 이러한 시스템에서의 단일 회전 동안, 튜빙 코일의 내부는 이중상 용매를 충전되는데, (1) 코일의 회전 방향 (시계방향 또는 반시계방향) 및 (2) 로터의 회전 방향 (시계방향 또는 반시계방향)에 따라 더 가벼운 상은 한쪽 말단 (헤드)로 이동하며, 더 무거운 상은 다른쪽 말단 (꼬리)로 이동한다. 이동상은 고정상이 선호하는 이동 방향에 반하는 말단으로 펌핑되며; 따라서, 평형시 고정상은 코일의 전체 부피의 40-80%로 유지된다. 과량의 이동상은 다른 말단으로 추출된다. 현재 행성 CCC 원심분리의 구체예 또는 적용은 다양한 배향의 나선형 튜빙을 포함한다. U.S. 특허 3,994,805, 4,430,216, 4,532,039 및 4,714,554.
최근에, 나선형 튜빙 또는 스풀 (spool)은 나선형 튜빙 지지체로 불리는 프레임에 의해 정위에 고정된, 나선형으로 구성된 튜빙에 의해 대체되었다. U.S. 특허 공개 US 2005/0242040. 현재, 나선형 튜빙 지지체의 제작은 더디며 고생스럽다. 이러한 장치의 첫번째 유형은 경질 알루미늄으로 2인치 깊이로 감겨진 나선형 채널 및 한 평면에서 4개의 나선형으로 감겨진 테플론 (Teflon?) 튜빙을 고정하기 위한 방사형 채널을 정교화함으로써 제작되었다. 나선형 튜빙 지지체의 이점은 (1) 유동 채널과의 샌드위칭된 플레이트를 통한 누수의 결여 및 (2) 튜빙의 더 작은 직경으로 인한 물질의 더 많은 분해이다.
발명의 요약
일 구체예에서, 본 발명은 하나 이상의 제 1 표면을 포함하는 역류 크로마토그래피 장치로서, 상기 제 1 표면은 튜빙을 하우징하는 다수의 나선형 채널 또는 그루브 (groove)를 포함하는 장치를 포함한다. 제 1 표면은 선택적으로 하나 이상의 방사형 채널을 갖는다. 제 1 표면은 입구 또는 출구를 가지며, 또는 튜빙에 대한 출입구를 갖는다. 상기 장치는 추가적으로 하기 개량부중 하나 이상을 포함한다: (1) 하나 이상의 만곡된 방사형 채널, (2) 정위에 튜빙을 고정하기 위한 채널 또는 그루브에서의 하나 이상의 돌출부, (3) 웨이트 (weight)가 위치할 수 있는 하나 이상의 공간, (4) 스냅 락에 의해 고정될 수 있는 하나 이상의 압축 스크류 유니온, (5) 하나 이상의 리테이너 지지체, 및 (6) 유동 튜빙의 안내를 돕는 표면 외면상의 하나 이상의 루프 구조물. 용어 "루프"는 제 1 표면의 외면상에 튜빙을 고정할 수 있는 다른 형상 예를 들어, 후크를 포함한다. 방사형 채널은 한쪽 또는 양쪽 말단에서 임의의 방향으로 만곡될 수 있다. 제 1 표면은 또한, 마모로부터 튜빙을 보호하기 위해 상단에 윤활제, 테플론?, 파릴렌 (Parylene) 또는 액체 폴리에틸화된 글리콜로 도포 또는 코팅될 수 있다.
역류 크로마토그래피 장치를 제작하는 방법이 또한 제공된다. 일 구체예에서, 상기 방법은 하나 이상의 제 1 표면을 포함하는데, 상기 제 1 표면은 다수의 나선형 채널 또는 그루브를 포함한다. 제 1 표면은 형상화 공정을 이용하여 형성될 수 있다. 바람직한 방법은 3차원 프로토타입 머신 및 용이하게 모델링될 수 있는 재료를 이용한다. 이용될 수 있는 기타 가능한 형상화 공정은 임의의 유형의 몰딩, 드릴링, 기계적 프로토타입핑, 또는 이러한 공정의 임의의 조합을 포함한다. 용이하게 몰딩될 수 있는 재료로는 하기중 하나 이상을 포함하나, 이에 제한되지 않는다: (1) 나일론 폴리머, (2) 플라스틱, (3) 폴리테트라플루오로에틸렌 (테플론 ?), (4) 폴리비닐 클로라이드, (5) 폴리스티렌, (6) 폴리아미드 PA-220, (7) 포토폴리머, (8) 풀큐어 (FullCure?) 물질, (9) 폴리젯 3D 프린터? 물질, (10) 모노머 분말, 및 (11) 금속 또는 금속 복합물을 포함하는 미립자 또는 분말. 3차원 프로토타입핑 기기는 제 1 표면을 포함하는 층을 형성시키기 위해 하나 이상의 공정 예컨대, 레이저 소결, 자외선 방사, 드릴링, 머시닝, 또는 프로토타입핑을 이용할 수 있다.
제작 방법은 하기 개량부중 하나 이상의 포함하는 제 1 표면을 생성시키기 위해 추가로 이용될 수 있다: (1) 하나 이상의 곧은 방사형 채널, (2) 하나 이상의 만곡된 방사형 채널 (여기서, 만곡은 사인곡선 형상, "S" 형태, 역 "S" 형태 등을 포함하여, 예를 들어, 튜빙 배치 및 시팅 (seating)을 조장하고, 예를 들어, 튜빙에서의 벤드 (bend) 및 크림프 (crimp)를 방지함), (3) 튜빙에 대한 하나 이상의 입구 또는 출구, 또는 접근 포트 (access port), (4) 웨이트가 위치할 수 있는 하나 이상의 공간 또는 저장 수단, (5) 제 2 표면이 부착될 수 있는 하나 이상의 공간, (6) 반대면을 부착시키는데 사용될 수 있는 하나 이상의 쓰레드 (thread), (7) 튜빙을 고정하기 위한 하나 이상의 루프, (8) 압축 스크류 유니온을 고정하기 위한 스냅 락에 의해 부착된 하나 이상의 압축 스크류 유니온, (9) 하나 이상의 리테이너 지지체, 및 (10) 하나 이상의 기어, 및 이들의 조합. 조합은 10개 유형의 개량부중 1개 초과를 갖는다는 것을 의미하거나 개별적인 개량부 유형중 2개 이상의 기능을 수반하는 구조를 가짐을 의미한다. 본원에 사용된 바와 같은 용어 "기어"는 하나 이상의 기어가 (1) 직접적으로 또는 간접적으로 하나 이상의 표면에 부착되거나, (2) 중앙 샤프트 (shaft)에 부착되거나, (3) 베어링 블록 (bearing block)내에 포함되거나 (4) 상기 언급된 기어 위치의 임의의 또는 모든 조합일 수 있음을 의미한다. 방사형 채널은 한쪽 또는 양 말단에서 임의의 방향으로 만곡될 수 있다. 추가적으로, 제작 방법은 중앙 공간을 갖는 제 1 표면을 생성시키기 위해 이용될 수 있으며, 상기 중앙 공간을 통과하여 샤프트가 위치할 수 있다. 제 1 표면은 둘레에 벽을 포함하여 튜빙을 수용하기 위한 공간을 형성할 수 있다.
또 다른 구체예에서 제작 방법은 제 1 표면의 상단에 위치하는 제 2 표면을 형성하는 다수의 층을 형성하기 위해 이용될 수 있다. "상단"은 커버, 리드 또는 제 1 표면으로의 임의의 부착부로서 작용하는 임의의 표면을 포함한다. 제 2 표면은 제 1 표면과 동일한 물질로부터 형상화 공정 예컨대, 3차원 프로토타입 머신을 이용하여 형성될 수 있다. 3차원 프로토타입 머신은 레이저 소결, 자외선 방사, 드릴링, 머시닝, 사출 성형 또는 프로토타입핑을 포함하여, 제 2 표면을 포함하는 층을 형성하는 하나 이상의 공정을 이용할 수 있다. 제작 방법은 하기중 하나 이상을 포함하는 제 2 표면을 생성시키는데 추가로 이용될 수 있다: (1) 유입구 또는 유출구, 또는 튜빙에 대한 접근 포트, (2) 웨이트가 위치할 수 있는 하나 이상의 공간, (3) 상기 제 1 표면을 부착시킬 수 있는 하나 이상의 공간 또는 수단, (4) 반대면을 부착시키는데 사용될 수 있는 하나 이상의 쓰레드, (5) 튜빙을 고정하기 위한 하나 이상의 루프 또는 후크, (6) 스냅 락에 의해 부착된 하나 이상의 압축 스크류 유니온, 및 (7) 하나 이상의 리테이너 지지체, 및 이들의 조합. 조합은 7가지 유형의 아이템중 하나 초과를 가짐을 의미하거나 개별적 타입의 아이템의 기능중 2개 이상을 수반하는 구조를 가짐을 의미한다. 또한, 하기중 하나 초과에 의해 제 1 표면에 부착되는 제 2 표면을 생성시키기 위한 방법이 이용될 수 있다: (1) 하나 이상의 래치 (latch), (2) 하나 이상의 볼트, (3) 하나 이상의 스냅, (4) 하나 이상의 클립, (5) 하나 이상의 노치 (notch), (6) 반대면을 부착하는데 사용될 수 있는 쓰레드, 또는 (8) 임의의 락킹 메카니즘. 예를 들어, 쓰레드는 스크류를 이용하여 제 2 표면을 제 1 표면에 부착시킬 수 있다. 제 2 표면은 또한, 제 2 표면을 제 1 표면 쪽으로 또는 그 위에 배향시키거나 부착시키는 수단을 포함할 수 있다. 예로는 상기 제 1 또는 제 2 표면상에 형상화된 돌출부가 있으며, 한쪽의 표면상에는 상기 형상화된 돌출부가 맞춰지는 공간을 갖는다. 일반적으로, 유성형 기어 수단은 직접적으로 또는 간접적으로 외부 표면 예컨대, 제 2 표면상에 부착되어, 선택적 디자인으로서 해당 로터의 CCC 기기로의 통합을 가능하게 한다.
또 다른 구체예에서, 상기 언급된 개량부중 하나 이상을 갖거나 이에 의해 제작된 장치를 사용하는, 물질 분리를 위한 역류 크로마토그래피를 수행하는 방법이 제공된다. 본원에 사용될 바와 같은 용어 "물질"은 화학 물질, 유기 소분자 및 생물학적 물질 예컨대, DNA, 폴리누클레오티드, 올리고누클레오티드, 단백질, 폴리펩티드, 폴리사카라이드, 올리고사카라이드, 리피드, 이의 조합 등을 포함한다. 역류 크로마토그래피를 수행하는 방법은 (1) 시험 샘플 및 용매계를 제공하고, (2) 유입구, 나선형 및 방사형 채널, 및 출구를 통해 튜빙을 유도하고, (3) 상기 시험 샘플을 용매계에 로딩하고, (4) 상기 조합된 시험 샘플 및 용매계를 장치에 위치시키고, (5) 특정 속도 및 기간 동안 원심분리기로 장치를 회전시키는 것을 포함한다. 하기를 포함하나 이에 제한되지 않는 임의의 유형의 가요성 튜빙이 사용될 수 있다: (1) 테플론?, (2) 플루오르화된 에틸렌 프로필렌, (3) 실리콘, (4) 스테인레스 강철, (5) 티곤 (Tygon?), (6) 톱날형, (7) 회선형, (8) 임의의 통상적으로 사용된 가요성 튜빙, 또는 (9) 상기 언급된 물질의 임의의 조합을 포함하는 임의의 튜빙. 튜빙은 또한, 불규칙 또는 불균일한 내부 표면을 갖는 것일 수 있다. 불규칙은 상기 방식으로 제작된 시중의 튜빙을 사용함으로써 또는 튜빙을 수동으로 제작함으로써, 예컨대, 튜빙에 주름을 잡거나, 튜빙을 구브리거나, 튜빙을 접거나 함으로써 튜빙에 삽입된 결함부를 형성함으로써, 특히, 튜빙의 매끄러운 내면을 파괴하여 튜빙내의 불균일하거나 불규칙한 내면을 형성시킴으로써 수득될 수 있다. 역류 크로마토그래피를 수행하는 방법은 제 1 표면을 제 2 표면으로 덮거나 이에 부착시킴으로써 수행될 수 있다. 제 2 표면은 중앙 샤프트로 이어지는 튜빙에 대한 홀을 가질 수 있다. 상기 방법은 추가로, 튜빙에 마찰 또는 마모가 발생할 것 같은 제 1 표면 또는 제 2 표면의 테플론?, 액체 폴리에틸화된 글리콜 또는 유사한 물질로의 도포 또는 코팅을 포함할 수 있다. 제작된 장치는 임의의 원심분리에 사용될 수 있다. 바람직한 유형의 원심분리기는 유성형 회전을 위해 제공된다. 또 다른 구체예에서, 역류 크로마토그래피는 하기 개량부중 하나 이상을 갖는 장치로 수행될 수 있다: (1) 하나 이상의 만곡된 방사형 채널, (2) 튜빙의 안내 및 정착을 돕기 위한 상기 장치의 나선형 채널중의 하나 이상의 돌출부, (3) 하나 이상의 리테이너 지지체, 및 (3) 튜빙을 안내하고 정착시키기 위한, 나선형 튜빙 지지체 표면 또는 상단상의 하나 이상의 루프. 나선형 튜브 지지체는 또한, 균형을 위한 하나 이상의 웨이트를 필요로 할 수 있으며; 웨이트는 제 1 표면, 제 2 표면 또는 제 1 표면과 제 2 표면 둘 모두의 하나 이상의 공간내에 위치할 수 있다. 상기 방법은 제 1 표면 또는 제 2 표면, 또는 이 두 표면상의 하나 이상의 루프를 통해 튜빙을 유도하는 것을 포함할 수 있다.
본원에서 청구된 방법에 의해 제작된 나선형 튜브 지지체는 생물학적 물질을 포함하는 하나 이상의 화학 물질을 분리하기 위해 사용될 수 있다. 생물학적 물질 또는 화학 물질은 소분자 또는 대분자 예컨대, DNA, 단백질 또는 펩티드일 수 있다. 종래 기술은 대분자 화합물을 정제하기 위해 극성 용매의 사용을 기술하고 있다. 사용될 수 있는 용매계는 비제한적으로 하기를 포함한다: (1) 2-상 수성 폴리에틸렌 및 염 용액; (2) 2-상 고알코올 수용액; (3) PEG (MW 1000) 12.5%-K2HPO4 12.5%, 또는 1:1 (v/v) 용액의 이차-부탄올-1% 트리플루오로아세트산.
발명의 상세한 설명
본 발명의 상세한 설명과 다양한 실시예를 첨부 도면을 참고로 지금 설명하겠다. 동일한 참조번호는 동일한 요소를 기술하다. 본 발명은 종래 기술에 비해서 몇몇 장점과 개선점을 제공하고 종래 기술의 단점을 제거한다. 본 발명이 주로 역류 크로마토그래피의 분야에 관련될지라도, 본 발명의 범주는 특정 (1) 방법, (2) 응용, (3) 용도 또는 (4) 장치 형상에 제한을 두지 않는다. 본 발명의 특정 실시예의 설명은 본 발명의 많은 가능한 실시예중 하나일 뿐이고 여기에 본 발명의 범위를 제한하거나 국한하고자 하는 것은 아니다. 여기에 사용된 과학적 용어에 특별한 정의가 없는 한, 이들은 이 기술분야의 숙련된 자에 의해 흔히 이해되는 바와 같은 의미를 가진다. 분명한 표현이 없으면, 복수 및 단수를 모두 포함한다.
본 발명은 이에 제한되지 않지만, (1) 유성형, (2) 고정 각도형, (3) 스윙잉 버킷, (4) 분석형, (5) 정제형 및 (6) 헤마토크리트(haematocrit)를 포함하는 다양한 형태의 원심분리기내에 사용된다. 본 발명은 또한 다양한 온도에서 작동될 수 있고 소형에서부터 산업용까지 적용분야에 맞추어 크기조정가능하다.
한 실시예에서, 역류 크로마토그래피 장치는 다수의 인터위브된 나선형 채널을 포함한다. 한 실시예에서, 동일한 거리로 이격된 절단부는 방사형 그루브 또는 채널을 형성한다. 동일한 거리로 이격된 절단부의 수는 2개 절단부, 3개 절단부, 4 개, 5개 등을 포함한다. 도 1은 예를 들어 중앙 샤프트(4)로부터 밖으로 나선형 채널을 통해서 시계방향으로 뻗은 튜빙용 상부 또는 내부 입구점(2)을 도시하는 나선형 튜빙 지지체 장치(1)의 상면도이다. 유동 튜빙의 외부 출구점은 3으로 표시되어 있다. 이것은 또한 나선형 튜빙 지지체(1)의 바닥에서 도 2b내의 도면부호 17로 볼 수 있다. 여기서 도시한 실시예에서, 튜빙은 중앙 샤프트(4)에 들어간다. 4개의 만곡된 방사형 채널(5)이 도시되어 있지만, 본 발명은 방사형 채널(5)의 특정 수에 제한되지 않는다. 방사형 채널(5)은 본 발명에 따라서 하나 또는 두 단부에서 만곡될 수 있다. 종래 발명은 튜브의 클램핑을 야기하는 따라서 용매 유동을 방해하는 직선형 방사형 채널(5)을 포함하고 있다(WO 2009/073746 참조). 튜빙은 본 발명에 따라서 반시계방향으로 정해질 수 있다. 중앙으로부터 외부로의 나선형 방향을 반시계방향으로 할 수 있고 방사형 채널은 "S" 형태를 가질 수 있다.
도 1에 도시한 실시예는 개선된 나선형 튜빙 지지체 장치(1)의 단면도를 포함한다. 튜빙은 만곡되어진 방사형 채널(5)을 통해서 정해질 수 있다. 나선형 채널의 곡률은 적절한 나선형 채널에 튜빙을 정렬해서 인터위브된 나선을 형성한다. 나선형 튜빙 지지체(1)은 층당 4개의 인터위브된 나선을 포함한다. 튜빙을 프레임의 바닥으로부터 놓아서 채널내의 반시계방향으로 위치시킬 수 있다. 그리고 나서 튜빙을 9시에서 방사형 채널로 통과시키며, 9시에서의 튜빙은 외측으로부터의 첫번째 채널로 고정되도록 안내된다. 6시의 점에서, 튜빙은 방사형 채널을 가로질려서 외부 원주로부터 두 번째 채널로 간다. 3시의 점에서, 튜빙은 에지로부터의 세 번째의 채널로 간다. 튜빙은 3시점 부근에서 방사형 채널을 가로질려서, 외부 에지로부터 4열에 있는 4번째로 간다. 이것은 로터 둘레에서 반복된다, - 튜빙을 중심에 와서 9시에 위치된 방사형 채널(5)로부터 에지까지 경로설정하고 그리고 나서 에지를 따른 채널로 가고, 전번 처럼 6시에서 다음 방사형 채널(5)을 가로질려서 에지로부터 채널로 보내어, 튜빙이 중앙에 도달해서 다시 다음 방사형 채널(5)로 나가기 전까지 안내한다. 튜빙이 중앙에서 상부에 도달하면, 튜빙을 접근 포트로부터 상부로 경로설정을 중앙 샤프트로 가는 튜빙에 연결한다.
관심 로터내의 튜빙의 권선은 존재한다면 방사형 채널을 이용할 수 있다. 로터가 방사형 채널을 포함하지 않을 수 있기 때문에, 튜빙 권선은 존재할지라도 방사형 채널을 사용할 필요가 없다. 또한 여기서 도시한 바와 같이, 권선은 적당하게 구성된 로터에 시계방향(CW)이나 반시계방향(CCW)으로 할 수 있고, 튜빙 방향과 로터 회전 방향은 변경될 수 있어서 관심 분자나 물질의 분리를 최상으로 할 수 있다.
튜빙의 권선의 방향은 디자인 선택으로서 선택적 사항이기 때문에, 이들 매개변수는 관심물의 분리에 사용될 수 있다. 관심 로터는 적당히 만곡된 선택적 방사형 채널과 적당하게 방위설정된 나선형 채널 또는 그루브를 가질 것이다. 채널 또는 그루브는 튜빙을 수용해서 안치시키도록 구성되고 형상되어진 제 1 표면내에서는 빈공간(void)들이다. 그러므로 중앙에서, 튜빙은 방사형 채널로 안내될 수 있고 방사형 채널을 통해서 제 1 표면의 주변까지 연장한다. 튜빙은 나선형 튜빙 지지체의 에지에서 채널에 정해지며 에지로부터의 하나의 채널을 통과한다. 튜빙은 에지 등으로부터의 2개의 채널로 정해진다. 튜빙이 중앙 샤프트 영역에 도달하면, 튜빙은 다른 방사형 채널을 통해서 외부 에지로 정해지고 나선형 채널을 따르고 중앙 내부 입구 영역에 내향으로 만곡하는 방사형 채널을 가로질려서, 튜빙이 에지를 따라서 외부 입구점 영역을 따라서 최종 채널에 도달하기 전까지, 다른 채널로 나간다. 에지로부터 튜빙이 중앙 샤프트 영역에 도달할 때까지 튜빙은 나선형 채널을 통해서 정해진다. 튜빙은 예를 들어 압축 스크류 유니온에서, 유동 튜빙에 연결되어 있는 커버내의 접근 포트 또는 출구를 통과한다. 예를 들어 도 2a 및 도 2b를 보면, 압축 스크류 유니온은 스냅 락 수단내에 안치된 것으로 도시되어 있다. 튜빙은 나선형 튜브 지지 샤프트(예, 도 1, 도 2a 및 도 2b에 도시한 바와 같이)에 들어가고, 나선형 튜빙 지지체로부터 다른 출입으로의 튜빙은 중앙 축 샤프트에 나오고 들어갈 수 있다.
일반적으로, 튜빙은 3개의 채널 마다 띄어넘어 외부 영역으로 복귀하는 나선형 통로내에 방위설정된다. 방사형 채널 내의 튜빙은 나선형으로 방위설정된 튜빙의 다수층을 수용하고, 즉 프레임내에 더 많은 층을 끼워넣도록 벽으로 둘러진 제 1 표면으로 프레스될 수 있다. 용매의 유동은 튜빙을 통하고 두상 용매 시스템중 하부 또는 보다 무거운 상은 내부 출입점으로부터 안내된다. 변경적으로, 두상 용매 시스템중 상부 또는 보다 가벼운 상은 로터상의 나선형 배치의 적절한 방위로, 그러므로 튜빙 및 원심분리기의 회전의 적절한 방향으로, 외부 출입점을 통해서 펌프될 수 있다.
여기서, 단일 튜빙은 일련의 인터위브된 나선을 형성하도록 구성될 수 있으며, 본 발명의 목적을 위해서, 인터위브는 인터리브(interleaved)와 동일한 의미로 간주되고, 또한 레지스터내에서 일련의 나선을 가지는 것 또는 일련의 나선이 끼워지는(nested) 경우와 동일한 의미이다. 로터는 관심 로터로부터 튜빙의 출입과 배출을 위한 두 개의 접근점을 포함한다. 특히 유동 통로를 강화하기 위해서, 본 로터는 인터위브된 나선형 층들의 적층을 할 수 있게 한다. 여기서, 로터는 튜빙의 인터위브되고, 끼워넣어진 나선의 두 층, 3층, 4층, 5층, 6층, 7층, 8층, 9층, 10층, 11층, 12층, 13층, 14층, 15층 등을 포함할 수 있다. 튜빙은 반시계방향으로 바닥으로부터 감겨질 수 있다. 인터위브된 나선의 개별층은 방사형 채널, 나선형 채널 또는 양쪽 채널로 끼워지도록 형상되어진 하나 또는 다수의 돌출부 또는 단단한 부분을 가진 섬세한 프레싱 툴을 사용해서 로터 바디에 설정 또는 패킹될 수 있다.
도 1에 도시한 장치의 주변부에서, 일련의 홀(6)이 도시되어 있다. 하나 또는 그 이상의 홀(6)은 나선형 튜브 지지체(1)를 발란스하는데 도움을 주는 웨이트용 공간으로서 작용할 수 있다. 여기에 사용된 용어 "웨이트(weight)"는 중량을 가진 어떠한 물체로서 언급한다. 변경적으로, 하나 또는 그 이상의 홀(6)은 예를 들어 쓰레드된 홀(7) 및 스크류로 나선형 튜브 지지체(1)에 상부(8)를 부착하는데 사용될 수 있다(도 2a 참조). 홀은 원형 및 원통형상일 필요가 없으며 또는 이들을 장치의 주변에 또는 가까이에 위치할 필요가 없다.
도 2a는 로터(9)와 대응 상부(8)가 조립된 나선형 튜브 지지체의 측면도를 도시한다. 상부(8)는 유성형 회전을 발생하도록 CCC장치와 일체를 위해서 기어(10) 및 베어링 블록(11) 아래에 있다. 하나 또는 그 이상의 기어와 하나 또는 그 이상의 베어링 블록(11)은 도 1a에 도시한 형상 또는 위치에서 변경될 수 있다. 상부(8)는 중앙 부근의 홀을 포함하며, 중앙 부근의 홀을 통해서 튜빙은 상부(8)의 표면상의 루프(15)를 지나서 도 1의 중앙 샤프트(4)로 들어하는 유동 튜빙에 부착한다. 튜브 지지체(1)과 유사하게, 상부(8)는 원형 형상의 하나 또는 그 이상의 홀(13)을 포함한다. 하나 또는 그 이상의 홀(13)은 조립된 나선형 튜브 지지체(1)를 발란스하는데 도움을 주는 웨이트용 공간으로서 작용할 수 있다. 변경적으로, 하나 또는 그 이상의 홀(13)은 예를 들어 스크류(14)로 나선형 튜브 지지체(1)에 상부(8)를 부착하는데 사용될 수 있다(도 2a 참조). 홀(13)은 원형 및 원통형상일 필요가 없으며 또는 이들을 장치의 주변에 또는 가까이에 위치할 필요가 없다. 유사하게 홀(6, 13)은 웨이트의 위치를 위해 그리고 부착 수단을 위해 서로 정렬될 수 있다. 상부(8)는 다양한 수단, 여기서 제한되지 않지만, 다음 중 하나 또는 그 이상, (1) 하나 또는 그 이상의 래치, (2) 하나 또는 그 이상의 볼트, (3) 하나 또는 그 이상의 스냅, (4) 하나 또는 그 이상 클립, (6) 하나 또는 그 이상의 노치 또는 다른 인터락킹 수단(20), (6) 샤프트가 놓여질 수 있는 하나 또는 그 이상 스페이스, (7) 대향면을 부착하는데 사용될 수 있는 하나 또는 그 이상 쓰레드 또는 (8) 알려진 락킹 메카니즘 뿐만 아니라 이들의 조합으로 나선형 튜브 지지체(1)에 부착될 수 있다. 여기서 조합체는 상술한 8개 형태중 하나 이상을 가지거나 두 개 이상의 기능을 조합하는 형태를 포함한다. 예를 들어, 스크류는 부착 수단으로서 사용될 수 있다. 상부(8)는 또한 다른 부착 수단으로서 나선형 튜브 지지체(1)로 나사결합하는 쓰레드를 포함할 수 있다. 유사하게, 부착 수단도 나선형 튜브 지지체(1)를 상부(8)에 부착하는데 적용할 수도 있다. 도 2b에 도시한 바와 같이, 튜브 지지체는 또한 튜빙 접근 포트(17)를 포함한다.
종래 기술보다의 다른 개선점은 나선형 튜브 지지체(1)와 상부(8)상에 도 2a 및 도 2b에 도시한 하나 또는 그 이상 루프(15)와 하나 또는 그 이상 리테이너 지지체(16)를 포함하는 것이다. 루프(15)는 유동 튜빙을 유지할 수 있다. 루프(15)와 리테이너 지지체(16) 양자는 나선형 튜브 지지체(1)의 하부면, 상부(8)의 상부면 또는 나선형 튜브 지지체(1)와 상부(8) 양쪽 모두의 둘레에 이격될 수 있다. 루프(15)가 바로 리테이너 지지체(16)에 부착될 필요는 없다. 본 발명와 일치하는 방법으로 유동 튜빙을 유지하기만 하면 루프(15)와 다른 형상체를 또한 사용할 수 있다. 본 실시예의 리테이너 지지체(16)는 웨지 형상으로 웨지의 가장 좁은 부분이 나선형 튜브 지지체(1), 상부(8) 또는 양자 모두의 주변을 향해서 방위설정되고, 웨지의 가장 넓은 부분이 나선형 튜브 지지체(1), 상부(8) 또는 양자 모두의 중앙을 향해서 방위설정된다. 리테이너 지지체(16)의 형상과 이격거리 모두는 본 발명에 따라서 본 형태로부터 변경될 수 있다. 루프(15)를 재위치시킬 수 있는 능력으로 종래 기술에 비해서 다음의 개선점을 제공하며; (1) 튜빙의 클램핑을 방지, (2) 튜빙이 마찰할 수 있는 뽀쪽한 에지 방지, (3) 부품의 이동 방지, 및 (4) 조립된 나선형 튜브 지지체(1)가 원심분리기에 놓일 때 보다 용이한 접근성. 리테이너 지지체(16)의 장점은 어느 표면에 웨이트를 추가하지 않고 나선형 튜브 지지체(1)에 강도를 추가하는 것이다.
도 2a 및 도 2b는 나선형 튜브 지지체(1) 및 상부(8)의 다른 개선점을 설명한다. 여기서 하나 또는 그 이상 압축 스크류 유니온이 존재한다. 압축 스크류 유니온은 스냅 락(18)에 의해 나선형 튜브 지지체(1) 및 상부(8)에 부착될 수 있다. 개량의 목적으로, 나선형 튜브 지지체(1)내에 존재되는 내부 튜빙과 다른 내경을 가지는 유동 튜빙과 연결하는 것이다. 유동 튜빙은 나선형 튜브 지지체(1)에 나와서 샤프트를 통해서 그리고 조립된 나선형 튜브 지지체 장치(9)의 바닥을 나와 중앙 태양축 샤프트까지 간다.
도 3에 도시한, 다른 실시예에서, 소형 돌출부(19)는 역류 크로마토그래피내에 사용된 채널 또는 그루브내의 나선형 튜브 지지체(1)의 표면에 추가하고 있다. 종래 발명에서는 이런 돌출부(19)가 없어서 나선형 튜브 지지체(1)내에 튜빙을 경로설정(rounting) 또는 권선을 방해했다. 본 발명은 나선형 그루브로 또는 부터 튜빙의 일반적인 이동을 제한해서, 나선형 튜브 지지체(1)를 통한 튜빙의 경로설정 과정을 종래 기술과 비교해서 휠씬 쉽고 빠르게 한다.
다른 실시예에서, 조립된 나선형 튜브 지지체(9)는 CAD(computer-assisted design) 방식을 사용해서 디자인된다. 조립된 나선형 튜브 지지체(9)를 디자인 함에 있어서 CAD를 사용하는 것은 본 실시예의 목적에는 필요하지 않지만, 본 발명에 따라서 디자인하는데 편리한 수단이다. CAD 기본 디자인은 디자인 변경을 수용할 수 있는 종래 기술보다 양호하다. 예를 들어, 나선형 튜빙의 폭은 특정 직경의 튜빙을 수용하도록 변경될 수 있다. 각 나선형 채널의 폭은 O.5 mm와 10 mm 사이, 1 mm와 9 mm 사이, 2 mm와 8 mm 사이, 3 mm와 7 mm 사이, 4 mm와 6 mm 사이, 5 mm, 2.5 mm, 3.5 mm 등등일 수 있다. 방사형 채널은 동일한 치수를 가질 수 있다. 도도 2a 및 도 2b에 예시된 본 발명은 원통형 형상을 하며 약 17.5 cm 직경과 약 7.3 cm 높이를 가진다. 형상과 치수는 어느 원심분리기 형태를 수용함에 있어서 변경될 수 있다. 나선형 튜브 지지체(1)는 채널 또는 그루브의 나선식 벽과 중앙까지 가고, 도 1에 도시한 바와 같이 한 단부 또는 두 단부에서 만곡되거나 만곡되지 않을 수 있는 방사형 채널(5)을 포함한다.
도 1은 4개의 방사형 채널(5)를 도시한다. 그러나, 튜브 지지체(1)는 하나 또는 그 이상 직선 또는 만곡된 방사형 채널(5)로 제조될 수 있다. 각 방사형 채널(5)은 예를 들면 0.5 mm와 10 mm 사이, 1 mm과 7 mm 사이, 2 mm 과 5 mm 사이, 3 mm 과 4 mm 사이의 폭을 가지거나, 또는 대형 볼륨을 포함하는 분리를 위해 적절한 크기로 될 수 있다. 나선형 채널 또는 그루브는 동일한 크기 치수를 가질 수 있고, 상술한 바와 같이, 분리의 스케일에 따른 디자인 선택으로 변경될 수 있다. 그러므로, 나선형 채널 및 선택적 방사향 채널은 대형 볼륨을 분리하기 위해서는 상술한 크기를 초과할 수 있다. 여기서 채널은 센티미터, 데시미터, 인치 등으로 크기로 정할 수 있다. 또한 나선형 튜브 지지체(1)를 상부(8) 없이도 구성할 수 있음을 생각할 수 있다. 양호한 실시예는 또한 튜빙의 경로설정에 도움이 되도록 나선형 채널내의 나선형 튜브 지지체(1)의 표면상의 소형 돌출부(19)를 포함한다.
나선형 튜브 지지체(1)와 상부(8)는 이에 제한되지 않지만 다음과 같은 다양한 재료로부터 형성될 수 있다: (1) 나일론 폴리머, (2) 플라스틱, (3) 폴리테트라플루오로에틸렌 (테플론 ?), (4) 폴리비닐 클로라이드, (5) 폴리스티렌, (6) 폴리아미드 PA-220, (7) 포토폴리머, (8) 풀큐어 (FullCure?) 물질, (9) 폴리젯 3D 프린터? 물질, (10) 모노머 분말, 및 (11) 금속 또는 금속 복합물을 포함하는 미립자. 상술한 재료는 단단한 표면을 만드는데 사용될 수 있다. 가요성 구조를 만들기 위해서, 폴리젯 3D 프린터?에 의해 제공된 탄고 블랙(Tango Black)과 같은 재료를 사용할 수 있다. 쉽게 성형되는 재료를 사용하는 장점은 나선형 튜브 지지체(1) 또는 상부(8)의 디자인 변경이 신속하고 저렴하고 용이하게 되는 것이다. 종래 기술은 본 발명에서 제조하는 것보다 실질적으로 많은 노동력으로 금속으로부터 나선을 드릴링함으로써 나선형 튜브 지지체(1)의 구조물을 만드는 것을 교시한다. 조립된 역류 크로마토그래피 장치(9)를 제조하는 본 발명은 상술한 바와 같은 신속한 프로토타입핑에 사용하기 위해 금속을 분석할 수 있게 될 가능성을 얻는다.
한 실시예에서, 디자인에 사용된 재료는 3차원 프로토타입핑 기기를 사용해서 형성된다. 3차원 프로토타입핑 기기는 튜브 지지체(1) 또는 상부(8)를 형성하는 다양한 공정, 예컨대, 레이저 소결 또는 자외선 방사를 사용할 수 있다. 이 기술분야의 숙련된 자는 나선형 튜브 지지체(1) 또는 상부(8)를 레이저 소결 또는 자외선 방사와 다른 공정을 사용해서 본 발명에 따라서 형성될 수 있음을 알 수 있다. 나선형 지지체의 디자인을 위한 재료를 형성하는데 사용될 수 있는 기기의 예는, 이에 제한되지 않지만, Sinterstation 2300 phus, Objet Geometries, Inc. Eden500V, 또는 EOS Precision이다.
종래 기술에 대한 다른 개선점은 제조된 나선형 튜브 지지체(1)가 아래에 기술되는 알려진 가요성 튜빙과 호환가능하다는 것이다: (1) 테플론?, (2) 플루오르화된 에틸렌 프로필렌, (3) 실리콘, (4) 스테인레스 강철, (5) 티곤 (Tygon?), (6) 톱날형, (7) 회선형, (8) 임의의 통상적으로 사용된 가요성 튜빙, 또는 (9) 상기 언급된 물질의 임의의 조합을 포함하는 임의의 튜빙. 튜빙은 크로스-프레스 또한 트위스트 상태로 수동 또는 기계적으로 프레스될 수 있다. 장치가 다양한 채널 크기를 수용할 수 있기 때문에, 튜빙은 사실상 임의의 직경을 가질 수 있다. 과거에, 역류 크로마토그래피 장치의 나선형 채널로 튜빙을 권선하는 것은 어려웠다. 나선형 튜브 지지체(1)과 상부(8)을 제조하는 동일한 방법은 방사형 채널(5)로 튜빙을 가이드하거나 아래로 밀어넣는데 차례로 사용될 수 있는 툴을 만드는데 사용될 수 있다. 튜빙으로부터의 이러한 적층(fattening)은 튜빙의 더 많은 층을 허용하여 테스트 샘플의 보다 많은 분리를 제공할 수 있다. 추가로 이런 구성은 용매의 층상 흐름을 붕괴시킨다.
상술한 개선점을 가진 제조된 장치 또는 종래 기술의 역류 크로마토그래피는 하나 또는 그 이상의 생물학적 물질 또는 화학 물질을 분리하는데 사용될 수 있다. 생물학적 물질은 예컨대, DNA, 폴리누클레오티드, 올리고누클레오티드, 단백질, 폴리펩티드, 폴리사카라이드, 올리고사카라이드, 리피드, 이의 조합 등과 같은 대분자를 포함한다. 반면에, 종래 기술은 소분자에 크게 제한되었고, 본원의 조립된 나선형 튜브 지지체(9)는 소형 및 대형 크기의 분자를 분리하거나 정제할 수 있다. 본 발명은 대형 생물학적 물질을 정화할 수 있는, 특정 용매계, 예컨대 2-상 수성 폴리에틸렌 및 염 용액 뿐만아니라 2-상 고알코올 수용액을 유지할 수 있다.
여기에 사용하기 위해 구성된 본 CCC 장치와 로터는 세포 용해질(cell lysate)과 같은 액체 매체의 대형 체적 또는 폴리펩티드, 올리고펩티드, 폴리누클레오티드, 올리고누클레오티드, 폴리사카라이드, 올리고사카라이드, 리피드, 이의 조합 등과 같은 여기에 포함된 소비된 배양 배지의 분리물을 수용할 수 있도록 크기를 쉽게 조정할 수 있다.
관심 로터로서 크로마토그래피 기술에서 알려진 바와 같은 관심 로터를 어떠한 크로마토그래피 장치내에서 사용하기 위해 구성할 수 있다. 여기서 관심 로터는 적당한 저장기, 버퍼, 용매 등에 연결된 튜빙을 장착하여, 고정상 및 이동상을 제공하거나, 유성 원심분리기와 같은 원심분리기로 크로마토그래피 장치내에 설치한다. 분별물을 추가의 처리 및/또는 분석을 위해 수집한다. 고정상은 여컨대 완충제, 용매 또는 가스를 사용하여, 플루싱(flushing)의 종래 수단에 의해서 튜빙으로부터 이동될 수 있다.
본 발명은 지금 아래의 비제한적 예에서 예시될 것이다.
실시예
소분자 및 펩티드 분리에서 나선형 튜브 지지 장치를 사용하는 종래 기술은 각 이동상에 대한 용출 모드 또는 사용 수단을 설명한다. 중앙 또는 상단으로부터 시계방향으로 감겨진 튜빙은 표 1에 요약된 조건에서 고정상이 유지되게 할 수 있다. 소분자에 주로 사용되는 비극성 용매계는 다양한 유체역학적 특성으로 인해 용출 모드에 대한 다양한 고정상 보유도를 갖는다. 따라서, 본 나선형 튜브 지지체 장치의 사용 방법은 지금까지 역류 크로마토그래피에 사용하기 어려웠던 극성 용매계와 관련하여 다양하다. 나선형 튜브 지지체 상단은 하부상 (lower phase)이 삽입되는 내부 말단부일 수 있으며, 나선형 튜브 지지체 하단은 상부상 (upper phase)이 이동상으로서 사용되는 경우 펌핑되는 외부 말단부일 수 있다. 내부 말단부는 회전이 시계방향이거나 나선형의 회전 방향과 동일한 방향인 경우 헤드 (head)이다. 외부 말단부는 이러한 조건하에서 테일 (tail)이다. 회전이 시계 반대 방향인 경우 헤드 및 테일 말단은 반대가 된다. 회전이 시계 반대 반향인 경우 내부 말단부는 테일이 된다. 이러한 조건하에서 고정상의 보유도가 높을 수 있다. 동일한 용출 모드가 1-상 수성 용매계 ("TPAS") 예컨대, 폴리에틸렌 글리콜/인산염 용액에 이용될 수 있다. 표 2에는 단백질 분리를 위해 수득된 높은 보유도의 고정상을 갖는 이들 용매계를 사용한 결과가 기재되어 있다.
단백질을 정제하고 용해질을 분별화시키기 위한 예시된 실험에서 사용된 용매계에 대한 작업 파라미터는 하기에 기재되어 있다. TPAS의 조성물은 상이한 MW 폴리에틸렌 글리콜 ("PEG")를 함유하도록 개질될 수 있으며, 염은 상이한 pH를 가질 수 있다. 기타 첨가제, 예컨대, 고 MW 덱스트란이 첨가될 수 있다. 트리플루오로아세트산 (TFA)이 이용될 수 있다. 표 2에 기술된 마지막 용매계는 용해질로부터 단백질을 분리하기 위해, 수성 이동상으로의 용출 모드에서 완만한 농도의 수성 인산염 완충액을 갖는 고알코올 n-부탄올을 이용한다. 이러한 조건은 단백질을 변질시키기 않을 것이다. 기타 고알코올 예컨대, 2차-부탄올 및 기타 염 예컨대, NaCl, 암모늄 아세테이트 등이 사용될 수 있다.
실시예 1
나선형 튜브 지지체 프레임을 3-D (차원) 프린팅 공정을 수행하는 신터스테이션 2300 플러스 고속 프로토타이피 머신 (Sinterstation 2300 plus prototyping machine)을 사용하여 레이저 소결 기법에 의해 제작하였다. 고속 프로토타이핑 머신은 CAD에 의해 설계된 3-D 형상의 나선형 튜브 지지체와 상단부를 형성하였다. 이는 모노머 분말, EOS 프레시젼 폴리아미드 PA220 (EOS Precision polyamide PA220)의 레이저 경화에 의해 수행되었다. 하나 및 또한, 세개의 나선형 튜브 지지 장치는 프린터에서 동시에 형성되었다. 분말을 챔버에서 적층시키고, 레이저를 프로그래밍된 패턴으로 표면 위로 이동시키고, 이는 표면에 가해질 때 형상물을 경화시킨다. 그 후, 또 다른 분말 층을 스프레더로 도포하였다. 따라서, 본원에 제공된 바와 같이 제작되는 경우 다중층은 지지체 (1) 및 상단부 (8)를 포함한다. 형상물은 바닥으로부터 제작되었다. 형성이 완료되는 경우, 형성물은 분리되고 물로 세척되어 비결합된 분말을 제거하였다. 생성된 경질의 백색 나일론 합성 로터를 화학 내성 페인트로 염색하거나 착색시켰다. 나선형 튜브 지지체와 동일한 제작 방식으로 상단부를 제조하고, 추가로 테플론 ? 코팅을 조립된 장치에서 튜빙의 마모를 방지하기 위해 도구의 내면에 도포하였다. 동일한 레이저 소결 공정으로 프레싱 툴을 제조하였다. 이는 중앙에 2cm 홀을 갖는 15cm 직경의 디스크로 이루어지며, 이러한 홀은, 나선형 튜브 지지 장치의 방사형 그루브로 피팅되는 4개의 만곡된 5cm 연장부를 갖는 샤프트 위로 피팅된다. 튜빙 즉, FEP SW #14 (Zeus Co.) 1.6mm ID, 2.4mm OD를 바닥에서부터 나선형 튜브 지지체에 감고, 매 3개의 층마다, 튜빙을 완만한 압력으로 프레싱 툴로 압축시키고, 15분 동안 클램프로 고정시켰다. 이러한 과정 후, 약 10개 층의 튜빙을 총 135ml 용적을 제공하게 하였다. 조립된 나선형 튜브 지지 장치에서의 튜빙을 물로 충전시켰다. 중앙 샤프트에 삽입된 스크류로부터의 튜빙에 의해 장치를 중단시키고, 로터의 균형을 위해 웨이트를 첨가하였다. 웨이트는 로터 둘레의 홀로 삽입되어 에폭시 글루로 정위에 고정되는 짧은 금속 바 (약 2cm 길이)이다. 로터 내부로부터의 튜빙을 기저부 외부에서는 너트, 페룰 및 유니온으로 유동 튜빙 2 조각에 그리고, 커버상에서는 중축 샤프트를 통과하여 유성형 원심분리의 상단으로 이어지는 0.8mm ID, 1.6mm OD PTFE 유동 튜브에 연결하고, 클램핑하였다. 유입 튜빙을 용매 펌프에 연결된 샘플 루프에 연결시키고, 배출 튜빙은 분별 컬렉터에 연결시켰다.
7.3cm 높이 17.5cm OD 나선형 튜브 지지체 및 커버 (기어를 제외한 치수)를 제작하고, 위치시키고, 센트리크롬 (Centrichrom) 유성형 원심분리기에 사용하고, 동일한 크기의 또 다른 로터는 P.C. Inc. 유성형 원심분리기에 사용하였다. 본원에 기술된 구체예의 실례는 센트리크롬 인스트루먼트의 로터를 사용하여 수행하였다. 원심분리기내의 로터를 웨이트로 반대쪽 샤프트와 균형을 이루게 하였다. 또한, 3개 로터 세트 (10.4cm 높이 및 10.8cm OD)를 파마-테크 리서치 코포레이션 (Pharma-Tech Research Corporation) 유성형 원심분리기의 상호연결된 유동 튜빙을 갖는 3개의 별도의 유성형 샤프트상에 연속하여 탑재하고 실험에 사용하였다. 마지막으로, 2개의 로터를 제작하고, 유니온에 의해 연결된 튜빙을 단일 샤프트에 탑재하였다. 9cm 깊이 및 17cm OD 치수의 이러한 로터를 제작하여 쉬마추 코포레이션 (Shimadzu Corporation)의 장치에 탑재하였다.
실시예 2
본 실시예는 표 3에 기재된 3개의 펩티드를 분리하기 위한 나선형 튜브 지지체의 용도를 설명해준다. 20-머는 추가적인 W 잔기가 존재하며, H 잔기가 20-머에서 A로 치환된다는 점만 제외하고는 18-머의 서열과 동일한 서열을 갖는다. 펩티드를 이동상으로서 하부의 수성상을 갖는 물중의 이차-부탄올-1% 트리플루오로아세트산 ("TFA")의 1:1 (v/v) 용액으로 이루어진 용매계에서 분리하였다. 약 10mg의 각각의 펩티드를 1ml/min의 유속으로 분리하였다. 분별물을 2분 간격으로 수집하고, 각 펩티드에 대한 용출 프로필을 HPLC 및 흡수 스펙트로포토미터로 측정하였다.
나선형 튜브 지지 장치의 초기 연구는 작업 조건하에서 펩티드 및 단백질에 이용되는 용매계의 고정상 보유도를 측정하기 위해 이루어졌다. 용매계의 중상 및 경상은 원심분리의 방향 및 튜빙이 나선형 튜브 지지체내에서 감겨진 방향에 따라 상이하게 유지된다. 일반적으로, 고정상의 대부분의 보유도는 더 무거운 상이 내부 유입구로 유입되고 (헤드-투-테일), 더 가벼운 상이 외부 말단부 (테일-투-헤드)로 펌핑되는 경우 얻어진다. 이러한 환경하에서, 더 가벼운 상은 이동상으로서 이용되며, 나선형 튜브 지지체는 반시계방향으로 회전된다. 고정상 보유도는 이동상으로서 사용된 각 상에 대해서 측정된다. 이는 하기에 의해 수행된다: (1) 코일을 고정상으로 충전시키고, (2) 나선형 튜브 지지 장치의 회전을 개시하고, (3) 이동상을 펌핑시킨다. 균형 성립 후, 회전이 시작되는 시간과 용매 선단이 나타나는 시간 사이의 장치로부터 배출되는 부피는 방출 부피 Vm로 나타낸다. 전체 부피 Vc로부터 Vm을 제하면 고정상 부피 Vs가 된다. 상 보유도는 전체 부피에 대한 고정상 부피의 비 Vs/Vc이다. 이동상의 용출이 발생되는 동안, 배압이 증가된다. 배압은 용매계의 계면 장력에 의존적이다.
분리 계수 K는 용매계에 소량의 샘플을 용해시키고, 혼합물을 쉐이킹하고, 상 분리 후 양 상중의 샘플의 농도를 측정함으로써 결정되었다. 이는 상부 상 대 하부 상의 농도 비 (Cu/Cl)로 제공된다. 이동 상으로서 선택된 상은 1 대 2의 분리 계수를 제공하는 것이다. 분리 효능도는 통상적인 기체 크로마토그래피 방정식을 이용하여 측정될 것이다: N = (4R/W)2. 이론 단면 또는 N은 피크의 형태로부터 계산된다. R은 최대 피크의 보유 시간 또는 부피이며, W는 R과 동일한 유닛으로 표현되는 피크 폭이다. 예비 분리에 있어서, N 값은 1000 이하일 수 있으나, 더욱 중요한 관계는 분리능이다. 인접 피크 사이의 분리능은 다음과 같다: Rs = 2(VR ,2 - VR,1)/(W1 + W2). 상기 방정식을 이용하여, 각 용질 보유 부피는 하기로 나타낸다: VR = Vm + KVS. Vm은 소멸되며 하기를 제공한다: R = 2(K2 - K1)Vs/(W1 + W2).
분리도는 Vs 및 K간의 차이에 비례한다. 역류 크로마토그래피의 전형적인 높은 Vs로부터, 높은 분리도는 N<1000으로 가능하다. 분리도는 등용매 용출로 평가되며 (구배 없이), 이는 역류 크로마토그래피의 경우에 해당하며, 용매계의 조성에 의해 조절될 수 있다.
전형적으로, 샘플을 적은 부피 (코일 전체 부피의 1/10을 넘치 않음)의 두 상중에 용해시키고, 고정상이 미리 충전된 코일에 로딩하였다. 원심분리를 시작하고, 이동상을 예를 들어, 2ml/min으로 펌핑하였다. 유출물을 이동 하부상에 있어서는 유동 세포를 통해 상향으로, 이동 상부상에 있어서는 하향으로 UV 검출기를 통해 통과시켰다. 크로마토그래피는 분별물이 수집되는 동안 2 내지 3개의 칼럼 부피에 대해 런닝된다. 회전이 중단되면, 내용물을 질소 또는 헬륨 가스로 펌핑시키거나 배출시키고, 분별물을 계속 수집하였다. 필요에 따라, 매우 늦게 용출되는 화합물에 있어서, 이동상은 다른 이동상의 유입을 변화시키고, 화합물을 고정 상으로서 다른 상을 통해 용출되도록 변화시켰다. 런닝 사이에, 튜빙의 코일을 (1) 물로 린싱시키고, (2) 아세톤으로 린싱시키고, (3) 코일을 질소 스트림으로 건조시킴으로써 세척하였다. 수집된 분별물은 분별물의 분취물에 대한 단백질 검정에 의해 분석하여 해당 단백질 또는 펩티드의 용출 프로필을 측정하였다. 단백질 또는 펩티드는 수집된 분별물에 대한 질량 스펙트로포미터를 수행하여 확인될 수 있다. HPLC 또는 PAGE에 의해 분석된 것으로서 순수한 화합물을 함유하는 분별물은 풀링되고 건조될 수 있다.
초기 언급된 바와 같이, K는 C u /C l 로서 정의된다. 표 3에 도시된 각 펩티드에 있어서, 실험치 K (K exp )를 고정상의 농도 (C s )를 이동상 농도 (C m )로 나누어서 계산하였다. 순서대로 용출된 3개 펩티드가 예측되며, 예측된 K 및 K exp 값은 비교적 서로 관련이 있다.
펩티드는 이들 각각의 K 값으로부터 예측되는 것으로서 용출되었다 (표 3). 데이타는 나선형 튜브 지지체 로터가 이론적 예측치에 근접하며, 비교적 큰 크기의 분자가 신규한 로터를 사용하여 효과적으로 분리될 수 있음을 보여준다.
실시예 3
본 실시예는 3차원 프린팅 및 레이저 소결을 이용하여 구성된 플라스틱 나선형 튜브 지지체의, 소분자 (MW<500의 분자로서 규정됨) 혼합물을 분리하는 능력을 설명한다. 소분자 화합물 아스피린, 살리실산, 살리신 및 나린게닌을 물중의 2차-부탄올-1% TFA 1:1 (v/v) 용액으로 구성된 용매계에 로딩하였다. 그 후, 로딩된 혼합물을 1ml/min의 유속으로 나선형 튜브 지지체중에서 800rpm하에 원심분리하였다. 분별물을 50개 분별물이 수집될 때 까지 2분 간격으로 수집하였다. 50번째 분별물이 수집된 후, 내용물을 배출시켰다.
모두 4개의 소분자를 분리하고, 단지 아스피린과 나린게닌이 이들 용출물중에서 부분적으로 중복되었다. 용출 순서는 분자의 K 값에 기초한 예측된 순서에 부합된다. 고정상 보유도는 69%로 높았다. 데이타는 소분자 분리에 있어서 증가된 나선형 튜브 지지체의 유용성을 입증해준다. 디자인은 산업적 공정을 위해 용이하게 대규모화될 수 있거나 질량 스펙트로미터에 대한 분석적 적용을 위해 소규모화될 수 있다.
실시예 4
해당 장치를 사용하여 단백질 또는 다른 대분자를 분리하였다. 본 실시예에서, 나선형 튜브 지지체를 상기 기술된 바와 같이 제조하고, 마우스 유테로글로빈을 정제하는데 사용하였다. 마우스 유테로글로빈은 70kDa의 MW를 가지며, 일반적으로 다이머로서 존재한다; 그러나, 용액중에서, 모노머 형태의 단백질이 축적될 수 있다. 나선형 튜브 지지체에서 분리를 수행하여 유테로글로빈 다이머로부터 유테로글로빈 모노머를 분리하였다. 이는 HPLC를 사용하여 K 값을 측정함으로써 수행한 후, 나선형 튜브 지지체 장치를 사용하여 역류 크로마토그래피를 사용하여 단백질을 분리하였다. PAGE 분석은 단백질 모노머 및 다이머의 성공적 분리를 입증하고, HPLC의 정량적 방법을 이용하여 각각의 K 값을 측정하였다. 피크의 높이는 31.5min에서 모노머를 나타내며, 32.8min에서 다이머를 나타낸다. HPLC 보유 시간을 각각 측정하고, 비율은 하부 상의 농도에 대한 상부 상의 농도에 대한 차이 값을 제공한다. 두개의 단백질 피크는 PEG (1000) 12.5%-K2HPO4 12.5%중에서 4.0 및 6.9의 K 값으로 계산되었다. 차이 K 값은 두개의 종이 하나 또는 다른 이동상으로 분리될 수 있음을 의미한다. 수치 값이 2를 넘기 때문에, 분석물은 코일중에 장시간 동안 유지될 것이며, 궁금적으로는, 약 4 내지 7개의 칼럼 부피로 용출된다. 결론적으로, 2개 칼럼 부피에 대해 런닝이 수행되며, 칼럼 내용물이 배출되고 분석되었다.
하부 (이동) 상은 예측된 부피의 단백질 출현을 보여주며, 실험으로부터 수집된 선택된 분별물의 부피는 PAGE에 의해 시험하였다. PAGE는 유테로글로빈 모노머 및 다이머의 분리를 보여주며, 따라서, 장치 및 본 장치를 이용한 방법이 단백질과 같은 큰 생물학적 물질의 분리에 성공적임을 입증해준다. 출발 물질의 PAGE 런닝은 각각 약 5kDa 및 14.5kDa에서 런닝되는 마우스 유테로글로빈 모노머 및 다이머의 존재를 보여주였다.
실시예 5
본 실시예는 개선된 장치의 능력 및 대분자를 분리하는데 상기 장치를 이용하는 방법을 추가로 입증해준다. 본 실시예에서, 31mg의 리소자임 (14.4kDa) 및 24mg의 미오글로빈 (17.7kDa)을 혼합하고, 역류 크로마토그래피 장치 및 청구된 사용 방법을 이용하여 분리하였다. 12.5% PEG (MW 1000):12.5% K2HPO4로 이루어진 비변성 2-상 수성 용매계는 폴리에틸렌 풍부 상부 상 및 인산염 완충제 풍부 하부 상에 제공하였다. 하부 상은 1ml/min의 유속에서 이동상으로서 이용하였다. UV 검출은 약 40ml의 용매 용출을 보여주며, 이는 고정상 보유도가 70%임을 나타내며, 이어서, 베이스라인인 2개의 단백질 피크가 분리되었다. 도 4A는 본 특정 실시예에 대한 UV 흡수 (그래프에서 전압과 동일) 그래프이다. 도 4B는 100 분 피크 (레인 3-5 참조) 및 200분 피크 (레인 7-9 참조)의 PAGE 분석이다. 레인 10 및 11은 각각 리소자임 또는 미오글로빈을 나타내는 대조군이다. 데이타는 역류 크로마토그래피 장치 및 큰 생물학적 물질의 혼합물 정제에 있어서 이의 사용 방법의 다용성을 입증한다. 미오글로빈 및 리소자임에 대한 K 값은 각각 0.38 및 1.35이며, 이는 용출 순서에 상응한다.
실시예 6
본원에 기술된 역규 크로마토그래피 방법 및 장치의 또 다른 이점은 많은 화학적 또는 생물학적 물질을 분리하는데 다양한 용매계를 사용할 수 있다는 점이다. 본 실시예에서, 본 방법 및 장치는 미정제 용해물로부터 단백질을 분리하는데 이용될 수 있다. 종래 발명은 역류 크로마토그래피를 수행하기 위해서는 세포 용해 후 다른 준비 단계 (예를 들어, 원심분리)가 필요하였다. 청구된 나선형 튜브 지지체 장치 및 방법을 이용하여, 다른 크로마토그래피 또는 준비 단계 없이 E.coli중에 발현된 융합 단백질을 세포 용해 후 분리하였다. 이전 실시예에 기술된 PEG 용매계를 사용하였다. 표적 융합 단백질을 대량의 숙주 세포 단백질 및 기타 세포 불순물로부터 분리시키고, 충분히 정제하였으며, 이는 특정 프로테아제로 분해되어 융합 단백질로부터 표적 단백질을 방출시킬 수 있다. 분해된 융합 단백질 또는 펩티드를 다시 적합한 용매계로 본 장치를 이용하여 정제하여, 단백질 생성물, 출발 융합 단배질 및 프로테아제로부터 융합 태그를 분리하였다.
실시예 7
본 실시예는 미정제 용해물로부터 융합 단백질인 토신 2-인슐린 A (Tosyn 2-Insuline)의 분리를 추가로 설명해준다. 토신 2-인슐린 A 융합 단백질을 갖는 박테리아를 4L의 슈퍼브로스 (SuperBroth)에서 성장시켰다. 펠렛팅된 박테리아 세포는 무게가 87g이며, 이를 20mM Na2HPO4, 0.5M NaCl (pH 7.2) 435mL중에 현탁시켰다. 현탁물을 10-15Kpsi에서 아베스틴 에멀시플렉스-C5 (Avestin Emulsiflex-C5) 균질기를 통해 2회 런닝시켰다. 용액을 19,000xg에서 30분 동안 4℃에서 원심분리하였다. 현탁물 일부를 후속 분석을 위해 -20℃에서 저장하였다. 표적 융합 단백질은 약 10kDa의 MW를 갖는다.
나선형 역류 크로마토그래피에 대한 용매계는 하기를 조합함으로써 제조하였다: 1L 삼각 플라스크중의 75g PEG 1000, 75g K2KPO4 및 450g의 물 (12.5% PEG: 12.5% 염 용매계). 용액을 화합물이 완전히 용해될 때 까지 교반하였다. 그 후, 용액을 500ml 유리 분리 깔대기로 옮기고, 여기서 용액을 약 240ml의 상부 상 및 300ml의 하부 상으로 분리하였다. 토신 2-인슐린 A를 함유하는 미정제 용해질을 9g의 해동된 용해질 (상기 언급된 균질화로부터), 1.5g의 PEG 1000 및 1.5g K2KPO4를 조합시킴으로써 제조하였다. 화합물을 용해시킨 후, 샘플을 1000 x g에서 5분 동안 원심분리하였다. 상부 상의 깨끗한 부분 및 하부 상의 깨끗한 부분을 나선형 튜브 지지 장치로의 주입을 위한 샘플 루프로 혼합하였다. 어두운 침전물이 뒤에 남겨졌다. 12.5% PEG: 12.5% 염 용매계는 실제적 양의 세포 부스러기 및 숙주 세포 단백질 및 DNA를 제거하는 역할을 한다.
나선형 튜브 지지 장치를 유성형 원심분리기에 위치시키고, 튜빙을 상부 상으로 충전시켰다. 샘플을 830rpm으로 원심분리하고, 1ml/min으로 유동시키고, 샘플을 유동 라인에 주입하였다. 하부 상은 반시계방향 회전으로 내부 말단부로 용출시켰다. 분별물을 매 2분마다 수집하였다. 용매 선단 또는 나선형 튜브 지지 장치로부터 방출된 상부 상은 44.5ml이거나 분별물 20이다. 런닝시 고정상 보유도는 67%이다. 분별물 161에서, 원심분리를 중단하였다. 나선형 튜브 지지 장치에 남아있는 내용물을 헬륨 가압에 의해 배출시키고, 분별물을 수집하였다.
흡수 스펙트로포토미터에 의해 측정된 피크를 기초로 하여, 특정 분별물을 HPLC 및 PAGE 분석 처리하였다. PAGE에 따르면, 분별물 30은 저 MW의 많은 밴드를 가지며, 분별물 181 및 182는 가장 작은 단백질로 보이는 10kDa 표적 단백질을 포함하는 많은 고 MW 단백질을 가졌다. 초기 분별물 177 내지 174는 더 적은 양의 단백질을 가졌다. 토신 2-인슐린 A 융합 단백질을 처음 큰 피크에서 많은 단백질로부터 분리하였다. PAGE에 의해, UV 피크가 더 높음에도 불구하고, 후속 용출 단백질의 양은 첫번째 용출 분획물로부터의 단백질보다 더 높은 것으로 보인다.
상기 분리에서, 표적 단백질은 나선형 튜브 지지 장치에서 고도로 유지되며, 단백질이 더욱 잘 용해될지를 관찰하기 위해서는 역 모드로 용출하기로 결정하였다. 동일한 용매계 및 동일한 샘플을 준비하였으나, 나선형 튜브 지지 장치는 하부 상으로 충전시켰다. 원심분리를 시작하고, 상부 상을 유동시켰다. 상부 상을 외부 말단으로 펌핑시키고, 시계반대 방향으로 회전시켰다. 용매 선단은 분별물 31에서 나타났으며, 고정상에 대한 보유도는 59%이었다. 다른 런닝에서 보유된 단백질을 용매 선단 후에 용출시키고, 2개의 주요 피크에서 전개시켰다. 매우 높은 UV 흡수 분별물이 마지막의 것이었다. PAGE는 표적 단백질이 다른 단백질과 함께 분별물 35에 존재하며, 분별물 40, 50 및 55 또한, 저농도로 단백질이 존재함을 보여주었다.
분리시 용매계에서 더 높은 MW PEG가 갖는 효과를 관찰하기 위해, 용매계 및 샘플을 더 높은 MW PEG (MW 3350)으로 제조한다는 것을 제외하고는 상기와 동일한 공정을 수행하였다. 용매 선단은 분별물 39에서 나타났으며, 고정상 보유도 50%에 있어서 67ml의 방출 부피를 갖는다. PAGE는 표적 단백질이 분별물 44에서 상기 높은 MW 단백질 보다 현저하게 더 높은 농도로 존재함을 보여주었다 (분별물 52, 56 및 112와 비교할 경우). 분별물 52 내지 56은 표적 단백질 및 단지 하나의 다른 유의 단백질을 가졌다. 분별물 112는 많은 다양한 단백질을 가지며, 표적 단백질로부터 제거되었다. 이러한 결과는 융합 단백질로부터 더 많은 불순물이 제거되는 것으로 보인다.
요약하면, 폴리머 용매계의 도구는 (1) 폴리머의 MW와 관련된 조성물, (2) 수성 염의 pH, 및 (3) 정제하고자 하는 엔티티 (entity)의 분할 계수를 최적화하기 위해 첨가될 수 있는 기타 함유물에 의해 변화될 수 있다. 용매계는 상부 또는 하부 이동상 가해져서 불순물을 최대로 분리할 수 있다. 따라서, 본 발명은 엔티티 예컨대, 거대분자 예컨대, 생체분자를 분리하고 정제하기 위한 다용도의 방법을 제공한다.
1% TFA/이차-부탄올 용매계로의 나선형 튜브 지지 장치 (PC, Inc. 타입)에서의 SF 측정
용출 모드 유속 (1ml/min), 800rpm 고정상 보유도 % 회전 방향
L-i-T (T에서 H) 73.6% CCW
L-i-H (H에서 T) 58.6% CW
U-o-H 64.8% CCW
U-o-T 55.7% CW
하부상 내부 말단 헤드 ("L-i-H"), 하부상 내부 말단 테일 ("L-i-T"), 상부상 외부 말단 헤드 ("U-o-H") 및 상부상 외부 말단 테일 ("U-o-T"). "H" 및 "T"는 각각 헤드 및 테일을 나타낸다. CW는 시계방향이며, CCW는 반시계방향이다.
용매계 조성
유속 (1ml/min), 800rpm		 용출 모드 고정상 보유도 %
TPAS - 12.5% PEG (MW = 1000):12.5% K2HPO4 (모두 물중의 중량) L-i-T
U-o-H		 70.5%
59.3%
TPAS - 12.5% PEG (MW = 3350):12.5% K2HPO4 L-i-T
U-o-H		 72%
49.9%
TPAS - 16% PEG (MW=8000):6.25% K2HPO4:6.25% KH2PO4, 유속 0.5ml/min L-i-T 80%
n-부탄올/0.1M K2HPO4, KH2PO4 (1:1) L-i-H 70%
ID 번호 펩티드 서열 K = C u /C l 용출 시작시 용적 K exp = C s /C m
6877 18-머 0.29 48ml 0.33
7131 20-머 0.91 104ml 1.22
507 14-머 2.4 164ml 2.17
본원에 언급된 모든 문헌은 그 전체가 본원에 참조로서 인용되었다.
도면과 도면에 대한 아래의 설명은 본 발명을 예시하는 다양한 실시예를 서술하는 비제한적인 예들이다.
도 1은 개선된 나선형 튜빙 지지체의 단면도.
도 2a는 나선형 튜빙 지지체의 상부와 하부상에 기어와 베어링 블럭이 조립된 로터의 측면도.
도 2b는 나선형 튜빙 지지체의 저면도.
도 3은 상부가 없는 나선형 튜빙 지지체의 클로즈-업된 도면.
도 4a는 역류 크로마토그래피를 사용해서 분리된 리소자임(lysozyme)과 미오그로빈(myoglobin)을 포함하는 단백질의 혼합물용 추출 프로화일.
도 4b는 두 개의 단백질의 성공적인 분리를 도시하는 도 4a로부터 선택된 PAGE 분석을 나타내는 도면.

Claims (35)

  1. 하나 이상의 나선형 튜브 지지체를 포함하며, 상기 나선형 튜브 지지체는,
    1) 다수의 인터위브된 (interweaved) 나선형 채널을 포함하는 하나 이상의 제 1 표면;
    2) 상기 나선형 채널에 연결되는 하나 이상의 튜빙 (tubing) 접근 포트 (access port); 및
    3) 하나 이상의 방사형 채널을 포함하는 역류 크로마토그래피 장치.
  2. 제 1항에 있어서, 상기 방사형 채널은 만곡 형성되는 것을 특징으로 하는 역류 크로마토그래피 장치.
  3. 제 1항에 있어서, 상기 방사형 채널내의 정위에 튜빙을 고정시키기 위한 하나 이상의 돌출부 (protrusion)를 추가로 포함하는 역류 크로마토그래피 장치.
  4. 제 1항에 있어서, 웨이트 (weights)가 위치할 수 있는 하나 이상의 공간을 추가로 포함하는 역류 크로마토그래피 장치.
  5. 제 1항에 있어서, 압축 스크류 유니온 (screw union)을 고정시키기 위한 하나 이상의 스냅 락 (snap lock)을 추가로 포함하는 역류 크로마토그래피 장치.
  6. 제 1항에 있어서, 하나 이상의 압축 스크류 유니온을 추가로 포함하는 역류 크로마토그래피 장치.
  7. 제 1항에 있어서, 튜빙을 고정시키기 위한 하나 이상의 루프를 추가로 포함하는 역류 크로마토그래피 장치.
  8. 제 1항에 있어서, 하나 이상의 리테이너 지지체 (retainer support)를 추가로 포함하는 역류 크로마토그래피 장치.
  9. 제 1항에 있어서, 상기 제 1 표면에 대한 상단에 해당하는 제 2 표면을 추가로 포함하는 역류 크로마토그래피 장치.
  10. 제 9항에 있어서, 상기 제 2 표면이 하나 이상의 튜빙 접근 포트를 추가로 포함하는 역류 크로마토그래피 장치.
  11. 제 9항에 있어서, 상기 제 2 표면이 웨이트가 위치할 수 있는 하나 이상의 공간을 추가로 포함하는 역류 크로마토그래피 장치.
  12. 제 9항에 있어서, 상기 제 1 표면이 하나 이상의 락킹 메카니즘에 의해 상기 제 2 표면에 부착되는 역류 크로마토그래피 장치.
  13. 제 9항에 있어서, 상기 제 2 표면이 튜빙을 고정시키기 위한 하나 이상의 루프를 추가로 포함하는 역류 크로마토그래피 장치.
  14. 제 9항에 있어서, 상기 제 2 표면이 압축 스크류 유니온을 고정시키기 위한 하나 이상의 스냅 락을 추가로 포함하는 역류 크로마토그래피 장치.
  15. 제 9항에 있어서, 상기 제 2 표면이 하나 이상의 리테이너 지지체를 추가로 포함하는 역류 크로마토그래피 장치.
  16. 다수의 인터위브된 나선형 채널을 포함하는 제 1 표면; 하나 이상의 튜빙 접근 포트; 및 방사형 채널을 형성시키는 단계를 포함하는, 역류 크로마토그래피 장치를 제작하는 방법.
  17. 제 16항에 있어서, 상기 제 1 표면이 나일론 폴리머, 플라스틱, 폴리테트라플루오로에틸렌, 폴리비닐 클로라이드, 폴리스티렌, 폴리아미드 PA-220, 포토폴리머, 아크릴계 포토폴리머, 3D 프린팅 물질, 모노머 분말, 및 금속 또는 금속 복합물을 포함하는 미립자로 구성된 군으로부터 선택된 하나 이상의 물질로부터 형성되는 역류 크로마토그래피 장치를 제작하는 방법.
  18. 제 16항에 있어서, 상기 형성 공정이 레이저 소결, 자외선 방사, 사출성형, 프로토타이핑, 드릴링 및 머시닝 (machining)으로 구성된 군으로부터 선택된 공정인 역류 크로마토그래피 장치를 제작하는 방법.
  19. 제 16항에 있어서, 상기 방사형 채널은 만곡 형성되는 것을 특징으로 하는 역류 크로마토그래피 장치를 제작하는 방법.
  20. 제 16항에 있어서, 상기 제 1 표면이 웨이트가 위치할 수 있는 공간, 튜빙을 고정하기 위한 루프, 리테이너 지지체, 스냅 락 또는 이의 조합을 추가로 포함하는 역류 크로마토그래피 장치를 제작하는 방법.
  21. 제 16항에 있어서, 상기 장치가 상기 제 1 표면에 대한 상단에 해당하는 제 2 표면을 형성시키는 단계를 추가로 포함하는 역류 크로마토그래피 장치를 제작하는 방법.
  22. 제 21항에 있어서, 상기 제 2 표면이 나일론 폴리머, 플라스틱, 폴리테트라플루오로에틸렌, 폴리비닐 클로라이드, 폴리스티렌, 폴리아미드 PA-220, 포토폴리머, 아크릴계 포토폴리머, 3D 프린팅 물질, 모노머 분말, 및 금속 또는 금속 복합물을 포함하는 미립자로 구성된 군으로부터 선택된 하나 이상의 물질로부터 형성되는 역류 크로마토그래피 장치를 제작하는 방법.
  23. 제 21항에 있어서, 상기 형성 공정이 레이저 소결, 자외선 방사, 사출성형, 프로토타이핑, 드릴링 및 머시닝으로 구성된 군으로부터 선택된 공정인 역류 크로마토그래피 장치를 제작하는 방법.
  24. 제 21항에 있어서, 상기 제 2 표면이 튜빙 접근 포트, 웨이트가 위치할 수 있는 공간, 상기 제 2 표면을 상기 제 1 표면에 부착시키기 위한 락킹 메카니즘 또는 이의 조합을 추가로 포함하는 역류 크로마토그래피 장치를 제작하는 방법.
  25. 제 24항에 있어서, 상기 락킹 메카니즘이 래치 (latch), 볼트, 스냅, 클립, 스크류, 노치 (notch), 샤프트가 통과하여 위치할 수 있는 중앙 공간 및 반대면을 부착시키기 위한 쓰레드 (thread)로 구성된 군으로부터 선택된 역류 크로마토그래피 장치를 제작하는 방법.
  26. 제 21항에 있어서, 상기 제 2 표면이 루프, 스냅 락, 리테이너 지지체 또는 이의 조합을 추가로 포함하는 역류 크로마토그래피 장치를 제작하는 방법.
  27. 하나 이상의 물질을 분리하기 위한 역류 크로마토그래피 장치를 이용하는 방법으로서,
    인터위브된 나선형 채널 및 방사형 채널을 포함하는 상기 장치에서 유입구를 통해 로터 (rotor)내로 튜빙을 유도하는 단계;
    상기 튜빙을 상기 인터위브된 방사형 채널 및 그 후, 상기 로터내의 유출구를 통해 유도하는 단계;
    상기 하나 이상의 물질을 함유하는 시험 샘플을 제공하는 단계;
    용매계를 제공하는 단계;
    상기 시험 샘플을 상기 용매계에 로딩하는 단계;
    상기 조합된 시험 샘플과 용매계를 상기 튜빙을 통해 상기 장치에 위치시키는 단계; 및
    상기 장치내의 상기 로터를 회전시켜 상기 하나 이상의 물질을 분리하는 단계를 포함하는 역류 크로마토그래피 장치를 이용하는 방법.
  28. 제 27항에 있어서, 상기 튜빙이 불균일 내면을 갖는 역류 크로마토그래피 장치를 이용하는 방법.
  29. 제 27항에 있어서, 상기 방사형 채널은 만곡 형성되는 것을 특징으로 하는 역류 크로마토그래피 장치를 이용하는 방법.
  30. 제 27항에 있어서, 상기 장치가 튜빙을 정위에 고정시키기 위해 상기 방사형 채널내에 하나 이상의 돌출부를 추가로 포함하는 역류 크로마토그래피 장치를 이용하는 방법.
  31. 제 27항에 있어서, 상기 장치가 웨이트가 위치할 수 있는 공간, 스냅 락, 압축 스크류 유니온, 루프, 리테이너 지지체 또는 이의 조합을 추가로 포함하는 역류 크로마토그래피 장치를 이용하는 방법.
  32. 제 27항에 있어서, 상기 장치가, 제 1 표면에 대한 상단에 해당하는 제 2 표면을 추가로 포함하는 역류 크로마토그래피 장치를 이용하는 방법.
  33. 제 32항에 있어서, 상기 제 2 표면이 튜빙 접근 포트, 웨이트가 위치할 수 있는 공간, 락킹 메카니즘, 루프, 스냅 락, 리테이너 지지체 또는 이의 조합을 추가로 포함하는 역류 크로마토그래피 장치를 이용하는 방법.
  34. 제 27항에 있어서, 상기 회전이 유성형의 회전인 것을 특징으로 하는 역류 크로마토그래피 장치를 이용하는 방법.
  35. 제 27항에 있어서, 상기 용매계가 2-상 수성 폴리에틸렌 및 염 용액; 2-상 고알코올 (heavy alcohol) 수용액; 폴리에틸렌 글리콜; K2HPO4 용액; 및 이차-부탄올-트리플루오로아세트산 용액으로 구성된 군으로부터 선택되는 역류 크로마토그래피 장치를 이용하는 방법.
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