JP5683967B2 - 蛍光ソルバトクロミック色素 - Google Patents
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Description
この発明は、溶媒の極性により発光波長が変わるケイ光ソルバトクロミック(solvatochromic)色素に関し、より詳細には、細胞を染色することができ、その細胞の環境により発光波長が変わるケイ光ソルバトクロミック色素に関する。
ケイ光ソルバトクロミック色素は、分子周辺の溶媒極性によって色の変わる色素であり、現在主に生体分子（特に脂質分子）のダイナミクスをケイ光顕微鏡でリアルタイムに高感度観測するためのプローブとして用いられている。それらの変色機構は特定の化学種との接触を必要としないので、他のケイ光色素では難しい抗原抗体反応や一塩基多型の識別が高感度にできる。
このケイ光ソルバトクロミック色素として、NBD、dansyl、prodan、Dapoxylなどがある。その中で最も性能が優れているのはDapoxylで、ソルバトクロミック色素としては珍しく長波長領域（370nm付近）に光励起が可能な吸収バンドがあり、ストークスシフトも大きく、ケイ光の量子収率も高い（非特許文献１）。
本発明者は、励起波長を更に長波長化する解決法として、既にチオフェン等を母骨格とした中性型ケイ光ソルバトクロミック色素を開発し、ブルーダイオードレーザーで効率よく励起できることを確認している（特許文献１）。
一方、本発明のケイ光ソルバトクロミック色素に近似の構造を有するカチオン性蛍光色素DASPMIは市販されており、ミトコンドリアの細胞膜挙動の観察に主に用いられている（特許文献２, 非特許文献２）。
このケイ光ソルバトクロミック色素として、NBD、dansyl、prodan、Dapoxylなどがある。その中で最も性能が優れているのはDapoxylで、ソルバトクロミック色素としては珍しく長波長領域（370nm付近）に光励起が可能な吸収バンドがあり、ストークスシフトも大きく、ケイ光の量子収率も高い（非特許文献１）。
本発明者は、励起波長を更に長波長化する解決法として、既にチオフェン等を母骨格とした中性型ケイ光ソルバトクロミック色素を開発し、ブルーダイオードレーザーで効率よく励起できることを確認している（特許文献１）。
一方、本発明のケイ光ソルバトクロミック色素に近似の構造を有するカチオン性蛍光色素DASPMIは市販されており、ミトコンドリアの細胞膜挙動の観察に主に用いられている（特許文献２, 非特許文献２）。
Photochemistry and Photobiology, 1997, 66(4): 424-43
Biochimica et Biophysica Acta, 1976, 423: 1-14
従来のケイ光ソルバトクロミック色素（特許文献１）は、脂溶性が非常に高いため、細胞膜の疎水性コアなどに局在し、親水性表面もしくは極性溶媒中では使用しにくい弱点があった。さらに、細胞等の生体組織に悪影響を及ぼさないために、ケイ光顕微鏡の光源として、ブルーダイオードレーザー（405 nm）よりも長波長の汎用的な光源であるアルゴンレーザー（488 nm）で効率よく励起できることが望まれる。
一方、DASPMI（非特許文献２）は、ミトコンドリアの活性に応じて発光強度が大きく変化するものの発光波長は変わらないため、レシオメトリー測定などの定量性の高い測定に応用することができない。
そこで、本発明は、（１）親水性表面もしくは極性溶媒中で使用しやすいようにイオン性の末端を持ち（２）汎用的なアルゴンレーザー（488 nm）で効率よく励起でき（３）極性の変化によって発光波長がシフトし、（４）細胞等の生体組織を効果的に染色できる新規カチオン型ケイ光ソルバトクロミック色素を提供することを目的とする。
一方、DASPMI（非特許文献２）は、ミトコンドリアの活性に応じて発光強度が大きく変化するものの発光波長は変わらないため、レシオメトリー測定などの定量性の高い測定に応用することができない。
そこで、本発明は、（１）親水性表面もしくは極性溶媒中で使用しやすいようにイオン性の末端を持ち（２）汎用的なアルゴンレーザー（488 nm）で効率よく励起でき（３）極性の変化によって発光波長がシフトし、（４）細胞等の生体組織を効果的に染色できる新規カチオン型ケイ光ソルバトクロミック色素を提供することを目的とする。
ミトコンドリアの細胞膜挙動の観察に用いられているカチオン性蛍光色素であるDASPMI（特許文献２, 非特許文献２）は下式で表わされ、そのピリジニウム基は、カチオン性の置換基であって非常に強い電子吸引基である。
ミトコンドリアの細胞膜中では、このピリジニウム基が膜表面に局在化し、蛍光強度が膜電位に対し敏感に応答する。
そこで、本発明者は、優れた発光波長応答性を示す中性型ケイ光ソルバトクロミック色素（特許文献１）の電子吸引基にこのピリジニウム基を導入して蛍光ソルバトクロミック色素を合成したところ、この蛍光ソルバトクロミック色素が親水性表面の極性変化によって大きくケイ光波長が変化し、またカチオン型に改変した蛍光ソルバトクロミック色素が細胞膜を染色し、その挙動の観察に用いることができることを見出し、本発明を完成させるに至った。
そこで、本発明者は、優れた発光波長応答性を示す中性型ケイ光ソルバトクロミック色素（特許文献１）の電子吸引基にこのピリジニウム基を導入して蛍光ソルバトクロミック色素を合成したところ、この蛍光ソルバトクロミック色素が親水性表面の極性変化によって大きくケイ光波長が変化し、またカチオン型に改変した蛍光ソルバトクロミック色素が細胞膜を染色し、その挙動の観察に用いることができることを見出し、本発明を完成させるに至った。
即ち、本発明は、下式
（式中、Ｘは酸素原子（−Ｏ−）又は硫黄原子（−Ｓ−）を表し、
ｍは１〜４の整数を表し、
Ｙは、それぞれ独立し、その少なくとも一つは、−Ｎ＝を表し、残余は−ＣＲ９＝を表し、
Ｒ９は、水素原子、炭素数１〜４のアルキル基、又は他分子と結合可能な結合基を表し、
Ｒ１及びＲ２は、それぞれ独立して、水素原子、ハロゲン原子、１級又は２級のアミノ基、又は炭素数が１〜４のアルキル基を表し、
Ｒ３及びＲ４は、それぞれ同じであっても異なってもよく、水素原子、アルコキシ基、アシルアミノ基、アルキル基、ハロゲン置換アルキル基、アミノ基、ヒドロキシ基又はハロゲン原子を表し、但し、Ｒ３及びＲ４はそれぞれが結合する炭素原子と共同して芳香族若しくはエーテル結合を含んでもよい脂肪族の５、６又は８員環を形成してもよく、
Ｒ５及びＲ６は、それぞれ同じであっても異なってもよく、水素原子又はアルキル基を表し、
Ｒ７及びＲ８は、それぞれ同じであっても異なってもよく、水素原子、又は置換基を有していてもよいアルキル基を表し、但し、Ｒ５及びＲ７はそれぞれが結合する炭素原子及び窒素原子と共同して芳香族若しくは脂肪族の５員環又は６員環を形成してもよく、Ｒ６及びＲ８はそれぞれが結合する炭素原子及び窒素原子と共同して芳香族若しくは脂肪族の５員環又は６員環を形成してもよい。）で表されるケイ光ソルバトクロミック色素である。
ｍは１〜４の整数を表し、
Ｙは、それぞれ独立し、その少なくとも一つは、−Ｎ＝を表し、残余は−ＣＲ９＝を表し、
Ｒ９は、水素原子、炭素数１〜４のアルキル基、又は他分子と結合可能な結合基を表し、
Ｒ１及びＲ２は、それぞれ独立して、水素原子、ハロゲン原子、１級又は２級のアミノ基、又は炭素数が１〜４のアルキル基を表し、
Ｒ３及びＲ４は、それぞれ同じであっても異なってもよく、水素原子、アルコキシ基、アシルアミノ基、アルキル基、ハロゲン置換アルキル基、アミノ基、ヒドロキシ基又はハロゲン原子を表し、但し、Ｒ３及びＲ４はそれぞれが結合する炭素原子と共同して芳香族若しくはエーテル結合を含んでもよい脂肪族の５、６又は８員環を形成してもよく、
Ｒ５及びＲ６は、それぞれ同じであっても異なってもよく、水素原子又はアルキル基を表し、
Ｒ７及びＲ８は、それぞれ同じであっても異なってもよく、水素原子、又は置換基を有していてもよいアルキル基を表し、但し、Ｒ５及びＲ７はそれぞれが結合する炭素原子及び窒素原子と共同して芳香族若しくは脂肪族の５員環又は６員環を形成してもよく、Ｒ６及びＲ８はそれぞれが結合する炭素原子及び窒素原子と共同して芳香族若しくは脂肪族の５員環又は６員環を形成してもよい。）で表されるケイ光ソルバトクロミック色素である。
また本発明は、このケイ光ソルバトクロミック色素にカチオンを導入したカチオン型ケイ光ソルバトクロミック色素（上式において、Ｙは、それぞれ独立し、その少なくとも一つが、−Ｎ（＋）Ｒ１０＝ Ｚ（−）を表し、残余は−ＣＲ９＝を表す(式中、Ｒ９は、上記と同様に定義され、Ｒ１０は、水素原子、炭素数１〜４のアルキル基、又は他分子と結合可能な結合基を表し、Ｚは、１価のアニオン種を表す。）カチオン型ケイ光ソルバトクロミック色素である。
このカチオン型ケイ光ソルバトクロミック色素は、細胞用（特に、細胞膜用）染色剤として利用することができる。
従って、また本発明は、このカチオン型ケイ光ソルバトクロミック色素から成る細胞用染色剤である。
更に、本発明は、このケイ光ソルバトクロミック色素を水系溶媒に溶解又は分散させた細胞用染色液である。
また、本発明は、このカチオン型ケイ光ソルバトクロミック色素を血清に溶解させた細胞染色液である。
また、本発明は、このカチオン型ケイ光ソルバトクロミック色素で染色された細胞である。
このカチオン型ケイ光ソルバトクロミック色素は、細胞用（特に、細胞膜用）染色剤として利用することができる。
従って、また本発明は、このカチオン型ケイ光ソルバトクロミック色素から成る細胞用染色剤である。
更に、本発明は、このケイ光ソルバトクロミック色素を水系溶媒に溶解又は分散させた細胞用染色液である。
また、本発明は、このカチオン型ケイ光ソルバトクロミック色素を血清に溶解させた細胞染色液である。
また、本発明は、このカチオン型ケイ光ソルバトクロミック色素で染色された細胞である。
本発明の化合物は、溶媒の極性により発光波長が変わるケイ光ソルバトクロミック(solvatochromic)性を示す新規なケイ光ソルバトクロミック色素である。
このケイ光ソルバトクロミック色素はさらに、本発明のカチオン型ケイ光ソルバトクロミック色素を合成するための中間体として有用である。
本発明のカチオン型ケイ光ソルバトクロミック色素は、細胞（特に、細胞膜）を染色し、かつその細胞の環境により発光波長が変わるため、細胞観察用の染色剤として有用である。
さらに、本発明のカチオン型ケイ光ソルバトクロミック色素の電子吸引基であるピリジニウム基等の含窒素複素環はイオン性であるため、電子供与基側に水酸基などの極性基を導入することで、アルコールなどの極性溶媒に溶解させることが容易となる。
このケイ光ソルバトクロミック色素はさらに、本発明のカチオン型ケイ光ソルバトクロミック色素を合成するための中間体として有用である。
本発明のカチオン型ケイ光ソルバトクロミック色素は、細胞（特に、細胞膜）を染色し、かつその細胞の環境により発光波長が変わるため、細胞観察用の染色剤として有用である。
さらに、本発明のカチオン型ケイ光ソルバトクロミック色素の電子吸引基であるピリジニウム基等の含窒素複素環はイオン性であるため、電子供与基側に水酸基などの極性基を導入することで、アルコールなどの極性溶媒に溶解させることが容易となる。
本発明で用いるケイ光ソルバトクロミック色素（以下単に「色素」ともいう。）は下式で表される。
Ｘは酸素原子（−Ｏ−）又は硫黄原子（−Ｓ−）を表す。
色素母骨格として、チオフェン骨格又はフラン骨格を用意して、鈴木−宮浦クロスカップリング法で電子供与部位及び電子吸引部位を連結することにより、電子吸引部位としてスルホン酸を持つチオフェン誘導体やフラン誘導体を容易に合成することができる。
また、色素母骨格として、複数のチオフェン骨格又はフラン骨格を含んでもよく、ｍは１〜４、好ましくは１又は２の整数を表す。
色素母骨格として、チオフェン骨格又はフラン骨格を用意して、鈴木−宮浦クロスカップリング法で電子供与部位及び電子吸引部位を連結することにより、電子吸引部位としてスルホン酸を持つチオフェン誘導体やフラン誘導体を容易に合成することができる。
また、色素母骨格として、複数のチオフェン骨格又はフラン骨格を含んでもよく、ｍは１〜４、好ましくは１又は２の整数を表す。
Ｙは、それぞれ独立し、その少なくとも一つは、−Ｎ＝を表し、残余は−ＣＲ９＝を表す。
Ｒ９は、水素原子、炭素数１〜４のアルキル基、又は他分子と結合可能な結合基を表す。
このアルキル基としては、メチル基、エチル基、プロピル基、ブチル基が挙げられる。
他分子と結合可能な結合基としては、ハロゲン原子（フッ素原子、塩素原子、臭素原子、ヨウ素原子）、アミノ基、水酸基、カルボキシル基、アルデヒド基、ビニル基、エチニル基、スルホン酸基若しくはマレイミド基、又はこれらの末端を持つアルキル基が挙げられる。このアルキル基は、好ましく炭素数が１〜２０のアルキル基であり、さらに好ましくは直鎖である。
Ｒ９は、水素原子、炭素数１〜４のアルキル基、又は他分子と結合可能な結合基を表す。
このアルキル基としては、メチル基、エチル基、プロピル基、ブチル基が挙げられる。
他分子と結合可能な結合基としては、ハロゲン原子（フッ素原子、塩素原子、臭素原子、ヨウ素原子）、アミノ基、水酸基、カルボキシル基、アルデヒド基、ビニル基、エチニル基、スルホン酸基若しくはマレイミド基、又はこれらの末端を持つアルキル基が挙げられる。このアルキル基は、好ましく炭素数が１〜２０のアルキル基であり、さらに好ましくは直鎖である。
Ｒ１及びＲ２は、それぞれ独立して、水素原子、ハロゲン原子、１級又は２級のアミノ基、又は炭素数が１〜４のアルキル基を表し、好ましくは水素原子、メチル基、塩素原子、フッ素原子で、より好ましくは水素原子である。
Ｒ３及びＲ４は、それぞれ同じであっても異なってもよく、水素原子、アルコキシ基、アシルアミノ基、アルキル基、ハロゲン置換アルキル基、アミノ基、ヒドロキシ基又はハロゲン原子を表す。このアルコキシ基、アシルアミノ基及びアルキル基の炭素数はそれぞれ好ましくは１〜２０、より好ましくは１〜４である。また、ハロゲン原子は、好ましくは、塩素原子又はフッ素原子である。
Ｒ３及びＲ４としては電子供与基が好ましい。このような電子供与基としては、例えば、アルコキシ基、アシルアミノ基、アルキル基、アミノ基又はヒドロキシ基、好ましくは、アルコキシ基、アルキル基又はヒドロキシ基が挙げられる。
また、Ｒ３及びＲ４はそれぞれが結合する炭素原子と共同して芳香族若しくはエーテル結合を含んでもよい脂肪族の５、６又は８員環を形成してもよい。例えば、同一のチオフェン環又はフラン環上のＲ３及びＲ４は、共同して芳香族若しくはエーテル結合（−Ｏ−）を含んでもよい脂肪族の５員環又は６員環を形成してもよいし、更に、ｍが２以上の場合、あるチオフェン環又はフラン環上のＲ３又はＲ４は、隣接するチオフェン環又はフラン環上のＲ３又はＲ４と共同して、芳香族若しくはエーテル結合（−Ｏ−）を含んでもよい脂肪族の５、６又は８員環を形成してもよい。
Ｒ３及びＲ４としては電子供与基が好ましい。このような電子供与基としては、例えば、アルコキシ基、アシルアミノ基、アルキル基、アミノ基又はヒドロキシ基、好ましくは、アルコキシ基、アルキル基又はヒドロキシ基が挙げられる。
また、Ｒ３及びＲ４はそれぞれが結合する炭素原子と共同して芳香族若しくはエーテル結合を含んでもよい脂肪族の５、６又は８員環を形成してもよい。例えば、同一のチオフェン環又はフラン環上のＲ３及びＲ４は、共同して芳香族若しくはエーテル結合（−Ｏ−）を含んでもよい脂肪族の５員環又は６員環を形成してもよいし、更に、ｍが２以上の場合、あるチオフェン環又はフラン環上のＲ３又はＲ４は、隣接するチオフェン環又はフラン環上のＲ３又はＲ４と共同して、芳香族若しくはエーテル結合（−Ｏ−）を含んでもよい脂肪族の５、６又は８員環を形成してもよい。
Ｒ５及びＲ６は、それぞれ同じであっても異なってもよく、水素原子又はアルキル基を表す。このアルキル基は好ましくは炭素数が１〜４のアルキル基である。
Ｒ７及びＲ８は、それぞれ同じであっても異なってもよく、水素原子、又は置換基を有していてもよいアルキル基を表す。このアルキル基は好ましくは炭素数が３〜７のアルキル基であり、細胞膜を構成する脂質と類似した構造であるため直鎖（即ち、−ＣｎＨ２ｎ＋１で表わされる。ｎは例えば３〜７である。）であることが好ましい。置換基としては水酸基、アミノ基、チオール基、スルホン酸基などが挙げられる。
但し、Ｒ５及びＲ７はそれぞれが結合する炭素原子及び窒素原子と共同して窒素原子を含む芳香族若しくは脂肪族の５員環又は６員環を形成してもよく、Ｒ６及びＲ８はそれぞれが結合する炭素原子及び窒素原子と共同して窒素原子を含む芳香族若しくは脂肪族の５員環又は６員環を形成してもよい。
Ｒ７及びＲ８は、それぞれ同じであっても異なってもよく、水素原子、又は置換基を有していてもよいアルキル基を表す。このアルキル基は好ましくは炭素数が３〜７のアルキル基であり、細胞膜を構成する脂質と類似した構造であるため直鎖（即ち、−ＣｎＨ２ｎ＋１で表わされる。ｎは例えば３〜７である。）であることが好ましい。置換基としては水酸基、アミノ基、チオール基、スルホン酸基などが挙げられる。
但し、Ｒ５及びＲ７はそれぞれが結合する炭素原子及び窒素原子と共同して窒素原子を含む芳香族若しくは脂肪族の５員環又は６員環を形成してもよく、Ｒ６及びＲ８はそれぞれが結合する炭素原子及び窒素原子と共同して窒素原子を含む芳香族若しくは脂肪族の５員環又は６員環を形成してもよい。
この本願発明の色素に更にアニオン（Ｚ−）を付加して、カチオン型ケイ光ソルバトクロミック色素とすることができる。このアニオンは色素の電子求引部の窒素原子をカチオンにすることにより結合するので、窒素原子の位置により３箇所をカチオンとすることができる。
この場合、上記化学式（化１）のＹのうち少なくとも一つは、−Ｎ（＋）Ｒ１０＝ Ｚ（−）を表し、残余は−ＣＲ９＝を表す。
Ｒ１０は、水素原子、炭化水素基、他分子と結合可能な結合基、又は他分子と結合可能な結合基が結合した炭化水素基、好ましくは水素原子又は炭化水素基を表す。この炭化水素基は、好ましくはアルキル基であり、より好ましくは炭素数１〜４のアルキル基である。他分子と結合可能な結合基としては、ビニル基、エポキシ基、アミノ基、ヒドロキシ基、カルボキシ基、アルデヒド基、イソシアネート基、イソチオシアネート基、リン酸基、チオール基、マレイミド基、Ｎ−ヒドロキシスクシンイミド基及びビニルスルホン基などが挙げられる。
下式に窒素原子がカチオンとなった場合のカチオン型色素の構造を示す。このうち、吸収極大波長がアルゴンレーザーの波長に近く、蛍光の輝度も高いため（１）の構造の色素が好ましい。
この場合、上記化学式（化１）のＹのうち少なくとも一つは、−Ｎ（＋）Ｒ１０＝ Ｚ（−）を表し、残余は−ＣＲ９＝を表す。
Ｒ１０は、水素原子、炭化水素基、他分子と結合可能な結合基、又は他分子と結合可能な結合基が結合した炭化水素基、好ましくは水素原子又は炭化水素基を表す。この炭化水素基は、好ましくはアルキル基であり、より好ましくは炭素数１〜４のアルキル基である。他分子と結合可能な結合基としては、ビニル基、エポキシ基、アミノ基、ヒドロキシ基、カルボキシ基、アルデヒド基、イソシアネート基、イソチオシアネート基、リン酸基、チオール基、マレイミド基、Ｎ−ヒドロキシスクシンイミド基及びビニルスルホン基などが挙げられる。
下式に窒素原子がカチオンとなった場合のカチオン型色素の構造を示す。このうち、吸収極大波長がアルゴンレーザーの波長に近く、蛍光の輝度も高いため（１）の構造の色素が好ましい。
Ｚは、１価のアニオン種を表す。この１価のアニオン種としては、フッ素アニオン、塩素アニオン、臭素アニオン、ヨウ素アニオン、テトラフルオロボレートアニオン、ヘキサフルオロホスフェートアニオン、酢酸アニオン、トリフルオロ酢酸アニオン、硫酸アニオン、硫酸水素アニオン、メタン硫酸アニオン、トリフルオロメタン硫酸アニオン、過塩素酸アニオン、ヘキサクロロアンチモネートアニオンビス（トリフルオロメタンスルホニル）イミドアニオン、及びＮ−トリフルオロメタンスルホニル−Ｎ−トリフルオロメタンアセチルイミドアニオンが挙げられる。
このように、カチオンを導入する方法としては、溶媒中で、化学式[化１]又は[化２]で表わされる化合物（ただし、Ｙが、その少なくとも一つは、−Ｎ＝を表し、残余は−ＣＲ９＝を表す。）と、１価アニオン種（臭素、ヨウ素、トリフルオロメタン硫酸など）とアルキル基とから成る化合物とを、０℃〜溶媒の還流温度の間の温度で反応させる方法が挙げられる。また、このようにして一旦カチオンを導入した化合物のアニオン（化学式[化１]又は[化２]のＺ）を、陰イオン交換樹脂を用いて任意の他の１価アニオンに交換することができる。
このように、カチオンを導入する方法としては、溶媒中で、化学式[化１]又は[化２]で表わされる化合物（ただし、Ｙが、その少なくとも一つは、−Ｎ＝を表し、残余は−ＣＲ９＝を表す。）と、１価アニオン種（臭素、ヨウ素、トリフルオロメタン硫酸など）とアルキル基とから成る化合物とを、０℃〜溶媒の還流温度の間の温度で反応させる方法が挙げられる。また、このようにして一旦カチオンを導入した化合物のアニオン（化学式[化１]又は[化２]のＺ）を、陰イオン交換樹脂を用いて任意の他の１価アニオンに交換することができる。
このようなカチオン型の色素は有機溶媒や水系媒体に容易に溶解又は分散でき、色素を有機溶媒や水系媒体に溶解又は分散させた染色液として使用することにより、培養液中の細胞などを染色することができる。
このカチオン型色素は有機溶媒には容易に溶解する。しかしこのカチオン型色素は純水に溶解させることは難しい。そのため水系媒体を用い、さらに好ましくは、水系溶媒中に乳化作用を持つ物質や包接能を持つ物質を介在させることによって、当該カチオン型色素を水系溶媒に溶解又は分散させることができる。
このような有機溶媒としては、トルエンなどの炭化水素系溶剤、塩化メチレンやクロロホルムなどのハロゲン系溶剤、１，４−ジオキサンやテトラヒドロフランなどのエーテル系溶剤、酢酸エチルなどのエステル系溶媒、アセトンなどのケトン系溶媒、ジメチルホルムアミド、ジメチルスルホキシドなどいずれも使用することができる。
水系溶媒としては、水とアルコールやアセトニトリルとの混合溶液が挙げられるが、各種細胞培養液、各種血清なども用いることができる。
乳化作用を持つ物質としては、界面活性剤、脂質、サポニン、ペプチド、胆汁酸などが挙げられる。包接能を持つ物質としては、クラウンエーテル、シクロデキストリン、カリックスアレン、核酸などが挙げられる。溶媒中のこれらの物質の濃度は通常１０−５〜１０−２Ｍ程度である。
有機媒体はそれ自体が細胞に対する毒性があることから、水系媒体に溶解又は分散した染色液の使用が好ましい。
このカチオン型色素は有機溶媒には容易に溶解する。しかしこのカチオン型色素は純水に溶解させることは難しい。そのため水系媒体を用い、さらに好ましくは、水系溶媒中に乳化作用を持つ物質や包接能を持つ物質を介在させることによって、当該カチオン型色素を水系溶媒に溶解又は分散させることができる。
このような有機溶媒としては、トルエンなどの炭化水素系溶剤、塩化メチレンやクロロホルムなどのハロゲン系溶剤、１，４−ジオキサンやテトラヒドロフランなどのエーテル系溶剤、酢酸エチルなどのエステル系溶媒、アセトンなどのケトン系溶媒、ジメチルホルムアミド、ジメチルスルホキシドなどいずれも使用することができる。
水系溶媒としては、水とアルコールやアセトニトリルとの混合溶液が挙げられるが、各種細胞培養液、各種血清なども用いることができる。
乳化作用を持つ物質としては、界面活性剤、脂質、サポニン、ペプチド、胆汁酸などが挙げられる。包接能を持つ物質としては、クラウンエーテル、シクロデキストリン、カリックスアレン、核酸などが挙げられる。溶媒中のこれらの物質の濃度は通常１０−５〜１０−２Ｍ程度である。
有機媒体はそれ自体が細胞に対する毒性があることから、水系媒体に溶解又は分散した染色液の使用が好ましい。
このような色素複合体では、色素の周辺の極性変化を知ることができるため、例えば、以下のような用途に用いることができる。
（１）バイオイメージング用ケイ光色素の分野で、生体膜プローブとして有用である。即ち、アルキル鎖などの脂質分子に連結し、局所的な環境に応答してケイ光色が変化する分子膜プローブに利用することができる。化学式[化１]又は[化２]で表わされる化合物のＲ７又はＲ８に長鎖アルキルなどの脂溶性置換基を導入し、化学式[化１]又は[化２]のＹにアルキル基や末端にスルホン酸などの酸性末端を持つアルキル基を導入することにより、それぞれカチオン型、双性イオン型の生体膜プローブを得ることができる。この分子は、親水環境では長波長、疎水環境では短波長のケイ光を発するため、細菌細胞膜の検出−抗菌作用の評価−ドラッグデリバリーシステムの評価など生体膜ダイナミクスの高感度リアルタイム計測に用いることができる。
（１）バイオイメージング用ケイ光色素の分野で、生体膜プローブとして有用である。即ち、アルキル鎖などの脂質分子に連結し、局所的な環境に応答してケイ光色が変化する分子膜プローブに利用することができる。化学式[化１]又は[化２]で表わされる化合物のＲ７又はＲ８に長鎖アルキルなどの脂溶性置換基を導入し、化学式[化１]又は[化２]のＹにアルキル基や末端にスルホン酸などの酸性末端を持つアルキル基を導入することにより、それぞれカチオン型、双性イオン型の生体膜プローブを得ることができる。この分子は、親水環境では長波長、疎水環境では短波長のケイ光を発するため、細菌細胞膜の検出−抗菌作用の評価−ドラッグデリバリーシステムの評価など生体膜ダイナミクスの高感度リアルタイム計測に用いることができる。
（２）イムノアッセイ（免疫測定法）の分野で、抗原−抗体反応の高感度検出に有用である。即ち、抗原又は抗体の特定のアミノ酸残基にラベル化して、抗原抗体反応を高感度かつ高定量的に測定できるプローブ（例えば、化学式[化１]又は[化２]のＹに末端マレイミド基を有するアルキル基を導入した化合物）として利用することができる。抗原抗体認識部位の近傍の特定のアミノ酸部位にラベル化することができれば、反応前はタンパク表面に露出しているので長波長の、反応後は疎水場に取り込まれるので短波長のケイ光を発すると考えられる。ケイ光ソルバトクロミック色素は、特定の置換基の認識を必要としないので、さまざまな抗原抗体反応に汎用的に用いることができる。また、ケイ光ソルバトクロミック色素は、複数波長のケイ光を発するので、波長の強度比を算出することにより抗原抗体反応を高定量的に検出することができる。
（３）一塩基多型の検出においては、特定部位の塩基配列をケイ光色で高感度に識別するプローブとして利用できる。例えば、ピリジン原料に、核酸中の塩基から適切なスペーサー（例えば、メチレン鎖）を介して末端にハロゲン原子を持つ誘導体を反応させると、塩基の近傍をケイ光ラベル化することができる。既法により核酸アミダイトを合成し、固相合成により任意の塩基配列に組み込んだ核酸ポリマーを合成する。この任意の配列に、完全に相補的な核酸ポリマーをハイブリタイゼーションすれば、疎水場が形成されるのでケイ光は短波長であるが、塩基対のミスマッチが色素の近傍に存在すれば親水性が増すのでケイ光が長波長になり、塩基配列の識別がケイ光色によって高感度に識別できる。
なお、これらの用途に於て、本願発明の色素は、吸収波長が長波長であるため、励起光によるタンパク質やＤＮＡの光損傷を避けられるため、従来の色素よりも有利である。
なお、これらの用途に於て、本願発明の色素は、吸収波長が長波長であるため、励起光によるタンパク質やＤＮＡの光損傷を避けられるため、従来の色素よりも有利である。
（４）本願発明の色素は細胞を染色することができるので、細胞の状態を知ることができるし、例えば、幹細胞の分化を追跡することができる。また異なる細胞を識別することができる。本願発明の色素により染色することのできる細胞に特に制限はないが、例えば、原核細胞（バクテリア）、植物細胞、生殖細胞、体細胞（幹細胞、脂肪細胞、肝細胞、白血球、赤血球、血小板）、癌細胞等が挙げられる。
以下、実施例にて本発明を例証するが本発明を限定することを意図するものではない。
合成例１
本合成例では、N，N−ジヘキシル-4-(5-(ピリジン-4-イル)チオフェン-2-イル)アニリン（化合物３）、N,N-ジヘキシル-4-(5-(ピリジン-2-イル)チオフェン-2-イル)アニリン（化合物４）、及び、N,N-ジヘキシル-4-(5-(ピリミジン-2-イル)チオフェン-2-イル)アニリン（化合物５）を合成した。合成経路を図１に示す。
4‐ヨードアニリン（東京化成工業株式会社製）(6.00 g, 27.4 mmol)、1‐ヨードヘキサン（シグマアルドリッチジャパン株式会社製）(17.4 g, 82.2 mmol)をDMF 17.9 mL とHMPA 9.50 mL の混合溶媒に溶解した後、炭酸カリウム (7.56 g, 54.8 mmol)を加え、90℃で22時間攪拌した。放冷後、酢酸エチルを加え、白色沈殿をろ過して除いた。ろ液を酢酸エチルで薄め、脱イオン水で２回、飽和炭酸水素ナトリウム水溶液で１回、飽和食塩水で１回洗浄し、有機層を無水硫酸ナトリウムで乾燥した。溶媒を留去した後、中圧分取液体クロマトグラフにて精製し、無色透明オイル（化合物１）(9.24 g, 23.9 mmol, 87 %)を得た。以下、得られた化合物１（N,N-ジヘキシル-4-ヨードアニリン）の分析結果を示す。
1H-NMR (400 MHz, CDCl3, TMS, rt) δ 7.41 (2H, ｄ, J = 8.6 Hz), 6.40 (2H, d, J = 8.8 Hz), 3.21 (4H, t, J = 7.9 Hz), 1.54 (4H, brs), 1.31 (12H, brs), 0.90 (6H, t, J = 6.7 Hz)
合成例１
本合成例では、N，N−ジヘキシル-4-(5-(ピリジン-4-イル)チオフェン-2-イル)アニリン（化合物３）、N,N-ジヘキシル-4-(5-(ピリジン-2-イル)チオフェン-2-イル)アニリン（化合物４）、及び、N,N-ジヘキシル-4-(5-(ピリミジン-2-イル)チオフェン-2-イル)アニリン（化合物５）を合成した。合成経路を図１に示す。
4‐ヨードアニリン（東京化成工業株式会社製）(6.00 g, 27.4 mmol)、1‐ヨードヘキサン（シグマアルドリッチジャパン株式会社製）(17.4 g, 82.2 mmol)をDMF 17.9 mL とHMPA 9.50 mL の混合溶媒に溶解した後、炭酸カリウム (7.56 g, 54.8 mmol)を加え、90℃で22時間攪拌した。放冷後、酢酸エチルを加え、白色沈殿をろ過して除いた。ろ液を酢酸エチルで薄め、脱イオン水で２回、飽和炭酸水素ナトリウム水溶液で１回、飽和食塩水で１回洗浄し、有機層を無水硫酸ナトリウムで乾燥した。溶媒を留去した後、中圧分取液体クロマトグラフにて精製し、無色透明オイル（化合物１）(9.24 g, 23.9 mmol, 87 %)を得た。以下、得られた化合物１（N,N-ジヘキシル-4-ヨードアニリン）の分析結果を示す。
1H-NMR (400 MHz, CDCl3, TMS, rt) δ 7.41 (2H, ｄ, J = 8.6 Hz), 6.40 (2H, d, J = 8.8 Hz), 3.21 (4H, t, J = 7.9 Hz), 1.54 (4H, brs), 1.31 (12H, brs), 0.90 (6H, t, J = 6.7 Hz)
2-クロロピリミジン（シグマアルドリッチジャパン株式会社製）（3.68 g, 32.0 mmol）に、氷冷したヨウ化水素酸（和光純薬工業株式会社製）（14.7 mL, 57 %）をゆっくり加え、0℃で50分間攪拌した。反応液に氷冷した炭酸ナトリウム水溶液を中性になるまで加えた後、亜硫酸ナトリウム水溶液を加えた。生成物をジエチルエーテルで抽出し、飽和食塩水で１回洗浄した後、有機層を無水硫酸ナトリウムで乾燥した。溶媒を留去し、残った淡黄色オイルを沸騰したヘキサンに溶解した後、放冷し、無色針状結晶（化合物２）（3.62 g, 17.6 mmol, 55 %）を得た。以下、得られた化合物２（2-ヨードピリミジン）の分析結果を示す。
1H-NMR (400 MHz, CDCl3, TMS, rt) δ 8.47 (2H, d, J = 4.8 Hz), 7.32 (1H, t, J = 4.9 Hz)
1H-NMR (400 MHz, CDCl3, TMS, rt) δ 8.47 (2H, d, J = 4.8 Hz), 7.32 (1H, t, J = 4.9 Hz)
4-ブロモピリジン塩酸塩（和光純薬工業株式会社製）(1.67 g, 8.61 mmol)、2,5-チオフェンジボロン酸（和光純薬工業株式会社製）（4.44 g, 25.8 mmol）、炭酸ナトリウム（和光純薬工業株式会社製）（7.30 g, 68.9 mmol）、テトラキス（トリフェニルホスフィン）パラジウム（0）（和光純薬工業株式会社製）（299 mg, 0.259 mmol）をトルエン75 mLとメタノール25 mLの混合溶媒に溶解し、真空脱気と窒素置換を３回繰り返した後、70 ℃で30分攪拌した。放冷後、上記で得た化合物１を加え、再び真空脱気と窒素置換を３回繰り返した後、70 ℃で9時間攪拌した。放冷後、反応液を酢酸エチルで希釈後、脱イオン水で3回、飽和食塩水で１回洗浄し、有機層を無水硫酸ナトリウムで乾燥した。溶媒を留去した後、中圧分取液体クロマトグラフにて精製し、黄色粉末（化合物３）（1.09 g, 2.59 mmol, 30%）を得た。以下に合成した化合物３（N，N−ジヘキシル-4-(5-(ピリジン-4-イル)チオフェン-2-イル)アニリン）の分析結果を示す。
1H-NMR (400 MHz, CDCl3, TMS, rt) δ 8.56-8.54 (2H, m), 7.49-7.43 (5H, m), 7.13 (1H, d, J = 3.8 Hz), 6.65-6.63 (2H, d, J = 9.0 Hz), 3.30 (4H, t, J = 7.7 Hz), 1.61 (4H, brs), 1.34 (12H, brs), 0.92 (6H, t, J = 6.8 Hz)
1H-NMR (400 MHz, CDCl3, TMS, rt) δ 8.56-8.54 (2H, m), 7.49-7.43 (5H, m), 7.13 (1H, d, J = 3.8 Hz), 6.65-6.63 (2H, d, J = 9.0 Hz), 3.30 (4H, t, J = 7.7 Hz), 1.61 (4H, brs), 1.34 (12H, brs), 0.92 (6H, t, J = 6.8 Hz)
2-ヨードピリジン（東京化成工業株式会社製）(200 mg, 0.976 mmol)、2,5-チオフェンジボロン酸（和光純薬工業株式会社製）（420 mg, 2.44 mmol）、炭酸ナトリウム（和光純薬工業株式会社製）（311 mg, 2.93 mmol）、テトラキス（トリフェニルホスフィン）パラジウム（0）（和光純薬工業株式会社製）（33.9 mg, 0.0293 mmol）をトルエン5 mLとメタノール5 mLの混合溶媒に溶解し、真空脱気と窒素置換を３回繰り返した後、80℃で30分攪拌した。放冷後、上記で得た化合物１を加え、再び真空脱気と窒素置換を３回繰り返した後、80 ℃で7時間攪拌した。放冷後、反応液を酢酸エチルで希釈後、脱イオン水で1回、飽和食塩水で１回洗浄し、有機層を無水硫酸ナトリウムで乾燥した。溶媒を留去した後、中圧分取液体クロマトグラフにて精製し、黄色固体（化合物４）（99.2 mg, 0.236 mmol, 24%）を得た。以下に合成した化合物４（N,N-ジヘキシル-4-(5-(ピリジン-2-イル)チオフェン-2-イル)アニリン）の分析結果を示す。
1H-NMR (400 MHz, CDCl3, TMS, rt) δ 8.55 (1H, brd, J = 4.5 Hz), 7.67-7.61 (2H, m), 7.53-7.50 (3H, m), 7.14-7.08 (2H, m), 6.64 (2H, d, J = 8.6 Hz) 3.29 (4H, t, J = 7.5 Hz), 1.60 (4H, brs), 1.33 (12H, brs), 0.91 (6H, t, J = 6.3 Hz)
1H-NMR (400 MHz, CDCl3, TMS, rt) δ 8.55 (1H, brd, J = 4.5 Hz), 7.67-7.61 (2H, m), 7.53-7.50 (3H, m), 7.14-7.08 (2H, m), 6.64 (2H, d, J = 8.6 Hz) 3.29 (4H, t, J = 7.5 Hz), 1.60 (4H, brs), 1.33 (12H, brs), 0.91 (6H, t, J = 6.3 Hz)
上記で得た化合物２ (200 mg, 0.971 mmol)、2,5-チオフェンジボロン酸（和光純薬工業株式会社製）（501 mg, 2.91 mmol）、炭酸ナトリウム（和光純薬工業株式会社製）（309 mg, 2.91 mmol）、テトラキス（トリフェニルホスフィン）パラジウム（0）（和光純薬工業株式会社製）（33.7 mg, 0.0292 mmol）をトルエン10 mLとメタノール10 mLの混合溶媒に溶解し、真空脱気と窒素置換を３回繰り返した後、60 ℃で30分攪拌した。放冷後、上記で得た化合物１を加え、再び真空脱気と窒素置換を３回繰り返した後、60 ℃で4時間攪拌した。放冷後、反応液を酢酸エチルで希釈後、脱イオン水で1回、飽和食塩水で１回洗浄し、有機層を無水硫酸ナトリウムで乾燥した。溶媒を留去した後、中圧分取液体クロマトグラフにて精製し、黄色固体（化合物５）（191 mg, 0.453 mmol, 47%）を得た。以下に合成した化合物５（N,N-ジヘキシル-4-(5-(ピリミジン-2-イル)チオフェン-2-イル)アニリン）の分析結果を示す。
1H-NMR (400 MHz, CDCl3, TMS, rt) δ 8.67 (2H, d, J = 4.9 Hz), 7.92 (1H, d, J = 3.9 Hz), 7.53 (2H, brd, J = 8.8 Hz), 7.18 (1H, d, J = 3.8 Hz), 7.03 (1H, t, J = 4.9 Hz), 6.64 (2H, brd, J = 8.8 Hz), 3.29 (4H, t, J = 7.7 Hz), 1.60 (4H, brs), 1.33 (12H, brs), 0.91 (6H, t, J = 6.5 Hz)
1H-NMR (400 MHz, CDCl3, TMS, rt) δ 8.67 (2H, d, J = 4.9 Hz), 7.92 (1H, d, J = 3.9 Hz), 7.53 (2H, brd, J = 8.8 Hz), 7.18 (1H, d, J = 3.8 Hz), 7.03 (1H, t, J = 4.9 Hz), 6.64 (2H, brd, J = 8.8 Hz), 3.29 (4H, t, J = 7.7 Hz), 1.60 (4H, brs), 1.33 (12H, brs), 0.91 (6H, t, J = 6.5 Hz)
合成例２
本合成例では、4−(5−(4−(ジヘキシルアミノ)フェニル)チオフェン-2-イル)-1-メチルピリジニウム ヨージド（化合物６）、4-(5-(4-(ジヘキシルアミノ)フェニル)チオフェン-2-イル)-1-メチルピリジニウム テトラフルオロボレート（化合物７）、4-(5-(4-(ジヘキシルアミノ)フェニル)チオフェン-2-イル)-1-メチルピリジニウム ヘキサフルオロホスフェート（化合物８）、4-(5-(4-(ジヘキシルアミノ)フェニル)チオフェン-2-イル)-1-メチルピリジニウム トリフロオロメタンスルホネート（化合物９）、4-(5-(4-(ジヘキシルアミノ)フェニル)チオフェン-2-イル)-1-メチルピリジニウム メタンスルホネート（化合物１０）、及び、4-(5-(4-(ジヘキシルアミノ)フェニル)チオフェン-2-イル)-1-メチルピリジニウム 4-メチルベンゼンスルホネート（化合物１１）を合成した。合成経路を図２に示す。
本合成例では、4−(5−(4−(ジヘキシルアミノ)フェニル)チオフェン-2-イル)-1-メチルピリジニウム ヨージド（化合物６）、4-(5-(4-(ジヘキシルアミノ)フェニル)チオフェン-2-イル)-1-メチルピリジニウム テトラフルオロボレート（化合物７）、4-(5-(4-(ジヘキシルアミノ)フェニル)チオフェン-2-イル)-1-メチルピリジニウム ヘキサフルオロホスフェート（化合物８）、4-(5-(4-(ジヘキシルアミノ)フェニル)チオフェン-2-イル)-1-メチルピリジニウム トリフロオロメタンスルホネート（化合物９）、4-(5-(4-(ジヘキシルアミノ)フェニル)チオフェン-2-イル)-1-メチルピリジニウム メタンスルホネート（化合物１０）、及び、4-(5-(4-(ジヘキシルアミノ)フェニル)チオフェン-2-イル)-1-メチルピリジニウム 4-メチルベンゼンスルホネート（化合物１１）を合成した。合成経路を図２に示す。
合成例１で得た化合物３（47.4 mg, 0.113 mmol）を塩化メチレン 2.0 mLに溶解し、ヨウ化メチル（関東化学株式会社製）（702μL, 11.3 mmol）を加え、1.5時間加熱還流した。放冷後、溶媒及び、ヨウ化メチルを留去し、暗赤色固体（化合物６）（62.9 mg, 0.112 mmol, 99 %）を得た。以下、得られた化合物６（4-(5-(4-(ジヘキシルアミノ)フェニル)チオフェン-2-イル)-1-メチルピリジニウム ヨージド）の分析結果を示す。
1H-NMR (400 MHz, CDCl3, TMS, rt) δ 8.85 (2H, d, J = 6.8 Hz), 7.88 (2H, d, J = 7.0 Hz), 7.80 (1H, d, J = 4.2 Hz), 7.50 (2H, d, J = 8.8 Hz), 7.25 (1H, d, J = 4.0 Hz), 6.63 (2H, d, J = 8.9 Hz), 4.47 (3H, s), 3.32 (4H, t, 7.8 Hz), 1.60 (4H, brs), 1.34 (12H, brs), 0.92 (6H, t, J = 6.7 Hz)
1H-NMR (400 MHz, CDCl3, TMS, rt) δ 8.85 (2H, d, J = 6.8 Hz), 7.88 (2H, d, J = 7.0 Hz), 7.80 (1H, d, J = 4.2 Hz), 7.50 (2H, d, J = 8.8 Hz), 7.25 (1H, d, J = 4.0 Hz), 6.63 (2H, d, J = 8.9 Hz), 4.47 (3H, s), 3.32 (4H, t, 7.8 Hz), 1.60 (4H, brs), 1.34 (12H, brs), 0.92 (6H, t, J = 6.7 Hz)
合成例１で得た化合物３（100 mg, 0.238 mmol）を塩化メチレン 4.0 mLに溶解し、氷冷したテトラフルオロホウ酸トリメチルオキソニウム（和光純薬工業株式会社製）（52.8 mg, 0.357 mmol）の塩化メチレン溶液（0.357 M）にゆっくり加え、0℃で1時間攪拌した。反応液を塩化メチレンで希釈し、脱イオン水、飽和食塩水で洗浄し、有機層を無水硫酸ナトリウムで乾燥した。溶媒を留去した後、中圧分取液体クロマトグラフにて精製し、暗赤色固体（化合物７）（124 mg, 0.238 mmol, quant.）を得た。以下、得られた化合物７（4-(5-(4-(ジヘキシルアミノ)フェニル)チオフェン-2-イル)-1-メチルピリジニウム テトラフルオロボレート）の分析結果を示す。
1H-NMR (400 MHz, CDCl3, TMS, rt) δ 8.83 (2H, d, J = 6.8 Hz), 7.82 (2H, d, J = 6.8 Hz), 7.76 (1H, d, J = 4.2 Hz), 7.48 (2H, d, J = 8.9 Hz), 7.23 (1H, d, J = 4.2 Hz), 6.62 (2H, d, J = 8.9 Hz), 4.31 (3H, s), 3.31 (4H, t, 7.7 Hz), 1.61 (4H, brs), 1.34 (12H, brs), 0.92 (6H, t, J = 6.6 Hz) ; HRMS (ESI) calcd. for C28H39N2S [M]+ 435.2828, found 435.2834; MS (ESI) calcd. for BF4 [M]- 87.0035, found 87.0162.
1H-NMR (400 MHz, CDCl3, TMS, rt) δ 8.83 (2H, d, J = 6.8 Hz), 7.82 (2H, d, J = 6.8 Hz), 7.76 (1H, d, J = 4.2 Hz), 7.48 (2H, d, J = 8.9 Hz), 7.23 (1H, d, J = 4.2 Hz), 6.62 (2H, d, J = 8.9 Hz), 4.31 (3H, s), 3.31 (4H, t, 7.7 Hz), 1.61 (4H, brs), 1.34 (12H, brs), 0.92 (6H, t, J = 6.6 Hz) ; HRMS (ESI) calcd. for C28H39N2S [M]+ 435.2828, found 435.2834; MS (ESI) calcd. for BF4 [M]- 87.0035, found 87.0162.
合成例１で得た化合物３（30.3 mg, 0.0720 mmol）を塩化メチレン 1.0 mLに溶解し、ヨウ化メチル（関東化学株式会社製）（224μL, 3.60 mmol）を加え、2時間加熱還流した。放冷後、溶媒及び、ヨウ化メチルを留去した。得られた暗赤色固体を塩化メチレン 1.0 mLに溶解し、アンモニウムヘキサフルオロホスフェート（関東化学株式会社製）（58.9 mg, 0.360 mmol）を加え、室温で48時間攪拌した。反応液を塩化メチレンで希釈し、脱イオン水、飽和食塩水で洗浄し、有機層を無水硫酸ナトリウムで乾燥した。溶媒を留去した後、中圧分取液体クロマトグラフにて精製し、深赤色固体（化合物８）（41.8 mg, 0.0720 mmol, quant.）を得た。以下、得られた化合物８（4-(5-(4-(ジヘキシルアミノ)フェニル)チオフェン-2-イル)-1-メチルピリジニウム ヘキサフルオロホスフェート）の分析結果を示す。
1H-NMR (400 MHz, CDCl3, TMS, rt) δ 8.81 (2H, d, J = 7.2 Hz), 7.81 (2H, d, J = 7.2 Hz), 7.76 (1H, d, J = 4.2 Hz), 7.50 (2H, d, J = 9.0 Hz), 7.24 (1H, d, J = 3.6 Hz), 6.63 (2H, d, J = 8.9 Hz), 4.24 (3H, s), 3.32 (4H, t, 7.7 Hz), 1.60 (4H, brs), 1.33 (12H, brs), 0.92 (6H, t, J = 7.0 Hz) ; HRMS (ESI) calcd. for C28H39N2S [M]+ 435.2828, found 435.2834; MS (ESI) calcd. for F6P [M]- 144.9642, found 144.9544.
1H-NMR (400 MHz, CDCl3, TMS, rt) δ 8.81 (2H, d, J = 7.2 Hz), 7.81 (2H, d, J = 7.2 Hz), 7.76 (1H, d, J = 4.2 Hz), 7.50 (2H, d, J = 9.0 Hz), 7.24 (1H, d, J = 3.6 Hz), 6.63 (2H, d, J = 8.9 Hz), 4.24 (3H, s), 3.32 (4H, t, 7.7 Hz), 1.60 (4H, brs), 1.33 (12H, brs), 0.92 (6H, t, J = 7.0 Hz) ; HRMS (ESI) calcd. for C28H39N2S [M]+ 435.2828, found 435.2834; MS (ESI) calcd. for F6P [M]- 144.9642, found 144.9544.
合成例１で得た化合物３（50.2 mg, 0.119 mmol）を塩化メチレン 2.00 mLに溶解し、メタンスルホン酸メチル（シグマアルドリッチジャパン株式会社製）（320μL, 3.78 mmol）を数回にわけて加え、室温で30時間攪拌した。溶媒を留去した後、中圧分取液体クロマトグラフにて精製し、暗赤色固体（化合物９）（61.2 mg, 0.115 mmol, 97 %）を得た。以下、得られた化合物９（4-(5-(4-(ジヘキシルアミノ)フェニル)チオフェン-2-イル)-1-メチルピリジニウム メタンスルホネート）の分析結果を示す。
1H-NMR (400 MHz, CDCl3, TMS, rt) δ 8.82 (2H, d, J = 7.0 Hz), 7.83 (2H, d, J = 7.0 Hz), 7.72 (1H, d, J = 4.2 Hz), 7.38 (2H, d, J = 9.0 Hz), 7.10 (1H, d, J = 4.1 Hz), 6.55 (2H, d, J = 9.0 Hz), 4.32 (3H, s), 3.27 (4H, t, 7.7 Hz), 2.82 (3H, s), 1.58 (4H, brs), 1.32 (12H, brs), 0.91 (6H, t, J = 6.8 Hz)
1H-NMR (400 MHz, CDCl3, TMS, rt) δ 8.82 (2H, d, J = 7.0 Hz), 7.83 (2H, d, J = 7.0 Hz), 7.72 (1H, d, J = 4.2 Hz), 7.38 (2H, d, J = 9.0 Hz), 7.10 (1H, d, J = 4.1 Hz), 6.55 (2H, d, J = 9.0 Hz), 4.32 (3H, s), 3.27 (4H, t, 7.7 Hz), 2.82 (3H, s), 1.58 (4H, brs), 1.32 (12H, brs), 0.91 (6H, t, J = 6.8 Hz)
合成例１で得た化合物３（36.0 mg, 0.0855 mmol）を塩化メチレン2.0 mLに溶解し、氷冷した後、トリフルオロメタンスルホン酸メチル（東京化成工業株式会社製）（11.7μL, 0.103mmol）をゆっくり加え、0℃で1時間攪拌した。溶媒を留去した後、中圧分取液体クロマトグラフにて精製し、赤紫色固体（化合物１０）（50.0 mg, 0.0855 mmol, quant.）を得た。以下、得られた化合物１０（4-(5-(4-(ジヘキシルアミノ)フェニル)チオフェン-2-イル)-1-メチルピリジニウム トリフロオロメタンスルホネート）の分析結果を示す。
1H-NMR (400 MHz, CDCl3, TMS, rt) δ 8.51 (2H, d, J = 7.0 Hz), 7.84 (2H, d, J = 7.2 Hz), 7.79 (1H, d, J = 4.2 Hz), 7.51 (2H, d, J = 8.9 Hz), 7.26 (1H, brs), 6.63 (2H, d, J = 9.0 Hz), 4.32 (3H, s), 3.32 (4H, t, 7.7 Hz), 1.60 (4H, brs), 1.34 (12H, brs), 0.92 (6H, t, J = 6.5 Hz) ; HRMS (ESI) calcd. for C28H39N2S [M]+ 435.2828, found 435.2834; MS (ESI) calcd. for CF3O3S [M]- 148.9526, found 148.9414.
1H-NMR (400 MHz, CDCl3, TMS, rt) δ 8.51 (2H, d, J = 7.0 Hz), 7.84 (2H, d, J = 7.2 Hz), 7.79 (1H, d, J = 4.2 Hz), 7.51 (2H, d, J = 8.9 Hz), 7.26 (1H, brs), 6.63 (2H, d, J = 9.0 Hz), 4.32 (3H, s), 3.32 (4H, t, 7.7 Hz), 1.60 (4H, brs), 1.34 (12H, brs), 0.92 (6H, t, J = 6.5 Hz) ; HRMS (ESI) calcd. for C28H39N2S [M]+ 435.2828, found 435.2834; MS (ESI) calcd. for CF3O3S [M]- 148.9526, found 148.9414.
合成例１で得た化合物３（49.4 mg, 0.117 mmol）を塩化メチレン 2.0 mLに溶解し、氷冷した後、p-トルエンスルホン酸メチル（シグマアルドリッチジャパン株式会社製）（371μL, 2.45 mmol）を数回にわけて加え、室温で50時間攪拌した。溶媒を留去した後、中圧分取液体クロマトグラフにて精製し、暗赤色固体（化合物１１）（33.8 mg, 0.0557 mmol, 48 %）を得た。以下、得られた化合物１１（4-(5-(4-(ジヘキシルアミノ)フェニル)チオフェン-2-イル)-1-メチルピリジニウム 4-メチルベンゼンスルホネート）の分析結果を示す。
1H-NMR (400 MHz, CDCl3, TMS, rt) δ 8.77 (2H, d, J = 6.3 Hz), 7.82-7.78 (4H, m), 7.72 (1H, d, J = 3.8 Hz), 7.43 (2H, d, J = 8.4 Hz), 7.14-7.12 (3H, m), 6.59 (2H, d, J = 8.7 Hz), 4.35 (3H, s), 3.30 (4H, t, 7.5 Hz), 2.31 (3H, s), 1.60 (4H, brs), 1.34 (12H, brs), 0.92 (6H, m)
1H-NMR (400 MHz, CDCl3, TMS, rt) δ 8.77 (2H, d, J = 6.3 Hz), 7.82-7.78 (4H, m), 7.72 (1H, d, J = 3.8 Hz), 7.43 (2H, d, J = 8.4 Hz), 7.14-7.12 (3H, m), 6.59 (2H, d, J = 8.7 Hz), 4.35 (3H, s), 3.30 (4H, t, 7.5 Hz), 2.31 (3H, s), 1.60 (4H, brs), 1.34 (12H, brs), 0.92 (6H, m)
合成例３
本合成例では、細胞毒性低減に効果のあるオリゴエチレングリコール部位を導入した4-(5-(4-(ジヘキシルアミノ)フェニル)チオフェン-2-イル)-1-(2,5,8,11,14-ペンタオキサヘキサデカン-16-イル)ピリジニウム ヨージド（化合物１２）、及び、末端に重合部位を持つ1-アリル-4-(5-(4-(ジヘキシルアミノ)フェニル)チオフェン-2-イル)ピリジニウム ヨージド（化合物１３）を合成した。合成経路を図３に示す。
トリフェニルホスフィン（和光純薬工業株式会社製）（624 mg, 2.38 mmol）、イミダゾール（和光純薬工業株式会社製）（162 mg, 2.38 mmol）を塩化メチレン20.0 mLに溶解し、氷冷した後、ヨウ素（和光純薬工業株式会社製）（605 mg, 2.38 mmol）を加え、0℃で5分攪拌した。これにペンタエチレングリコール モノメチルエーテル（東京化成工業株式会社製）（500 mg, 1.98 mmol）の塩化メチレン溶液（0.198 M）をゆっくり加え、室温で6時間攪拌した。亜硫酸ナトリウム水溶液を加え、生成物を酢酸エチルで抽出し、脱イオン水、飽和食塩水で各一回ずつ洗浄した後、有機層を無水硫酸ナトリウムで乾燥した。溶媒を留去した後、シリカゲルカラムクロマトグラフィーにて精製して、無色透明オイル（化合物１４）(547 mg, 1.51 mmol, 76 %)を得た。以下、得られた化合物１４（16-ヨード-2,5,8,11,14-ペンタオキサヘキサデカン）の分析結果を示す。
1H-NMR (400 MHz, CDCl3, TMS, rt) δ 3.76 (2H, t, J = 6.9 Hz), 3.66-3.64 (14H, m), 3.56-3.54 (2H, m), 3.38 (3H, s), 3.26 (2H, t, J = 6.9 Hz)
本合成例では、細胞毒性低減に効果のあるオリゴエチレングリコール部位を導入した4-(5-(4-(ジヘキシルアミノ)フェニル)チオフェン-2-イル)-1-(2,5,8,11,14-ペンタオキサヘキサデカン-16-イル)ピリジニウム ヨージド（化合物１２）、及び、末端に重合部位を持つ1-アリル-4-(5-(4-(ジヘキシルアミノ)フェニル)チオフェン-2-イル)ピリジニウム ヨージド（化合物１３）を合成した。合成経路を図３に示す。
トリフェニルホスフィン（和光純薬工業株式会社製）（624 mg, 2.38 mmol）、イミダゾール（和光純薬工業株式会社製）（162 mg, 2.38 mmol）を塩化メチレン20.0 mLに溶解し、氷冷した後、ヨウ素（和光純薬工業株式会社製）（605 mg, 2.38 mmol）を加え、0℃で5分攪拌した。これにペンタエチレングリコール モノメチルエーテル（東京化成工業株式会社製）（500 mg, 1.98 mmol）の塩化メチレン溶液（0.198 M）をゆっくり加え、室温で6時間攪拌した。亜硫酸ナトリウム水溶液を加え、生成物を酢酸エチルで抽出し、脱イオン水、飽和食塩水で各一回ずつ洗浄した後、有機層を無水硫酸ナトリウムで乾燥した。溶媒を留去した後、シリカゲルカラムクロマトグラフィーにて精製して、無色透明オイル（化合物１４）(547 mg, 1.51 mmol, 76 %)を得た。以下、得られた化合物１４（16-ヨード-2,5,8,11,14-ペンタオキサヘキサデカン）の分析結果を示す。
1H-NMR (400 MHz, CDCl3, TMS, rt) δ 3.76 (2H, t, J = 6.9 Hz), 3.66-3.64 (14H, m), 3.56-3.54 (2H, m), 3.38 (3H, s), 3.26 (2H, t, J = 6.9 Hz)
合成例１で得た化合物３（25.5 mg, 0.0606 mmol）を塩化メチレン3.0 mLに溶解し、上記で得た化合物１４（547 mg, 1.51 mmol）を数回にわけて加え、44時間加熱還流した。放冷後、溶媒を留去し、シリカゲルカラムクロマトグラフィーにて精製して、暗赤色オイル（化合物１２）（45.4 mg, 0.0580 mmol, 96 %）を得た。以下、得られた化合物１２（4-(5-(4-(ジヘキシルアミノ)フェニル)チオフェン-2-イル)-1-(2,5,8,11,14-ペンタオキサヘキサデカン-16-イル)ピリジニウム ヨージド）の分析結果を示す。
1H-NMR (400 MHz, CDCl3, TMS, rt) δ 9.10 (2H, d, J = 6.8 Hz), 7.89 (2H, d, J = 6.9 Hz), 7.82 (1H, d, J = 4.1 Hz), 7.50 (2H, d, J = 8.8 Hz), 7.26-7.25 (1H, m), 6.63 (2H, d, J = 8.9 Hz), 4.94 (2H, t, J = 4.1 Hz), 4.04 (2H, t, J = 4.2 Hz), 3.66-3.49 (12H, m), 3.33-3.29 (7H, m), 1.60 (4H, brs), 1.33 (12H, brs), 0.91 (6H, t, J = 6.4 Hz)
1H-NMR (400 MHz, CDCl3, TMS, rt) δ 9.10 (2H, d, J = 6.8 Hz), 7.89 (2H, d, J = 6.9 Hz), 7.82 (1H, d, J = 4.1 Hz), 7.50 (2H, d, J = 8.8 Hz), 7.26-7.25 (1H, m), 6.63 (2H, d, J = 8.9 Hz), 4.94 (2H, t, J = 4.1 Hz), 4.04 (2H, t, J = 4.2 Hz), 3.66-3.49 (12H, m), 3.33-3.29 (7H, m), 1.60 (4H, brs), 1.33 (12H, brs), 0.91 (6H, t, J = 6.4 Hz)
合成例１で得た化合物３（28.8 mg, 0.0684 mmol）を塩化メチレン0.50 mLに溶解し、ヨウ化アリル（シグマアルドリッチジャパン株式会社製）（500μL, 5.48 mmol）を加え、35℃で30分間攪拌した。放冷後、溶媒を留去し、シリカゲルカラムクロマトグラフィーにて精製して、暗赤色固体（化合物１３）（31.6 mg, 0.0684 mmol, quant.）を得た。以下、得られた化合物１３（1-アリル-4-(5-(4-(ジヘキシルアミノ)フェニル)チオフェン-2-イル)ピリジニウム ヨージド）の分析結果を示す。
1H-NMR (400 MHz, CDCl3, TMS, rt) δ 8.89 (2H, d, J = 7.1 Hz), 7.89 (2H, d, J = 7.1 Hz), 7.81 (1H, d, J = 4.2 Hz), 7.51 (2H, d, J = 8.9 Hz), 7.27-7.23 (1H, m), 6.63 (2H, d, J = 9.0 Hz), 6.17-6.07 (1H, m), 5.63-5.54 (2H, m), 5.37 (2H, d, J = 6.4 Hz), 3.32 (4H, t, J = 7.7 Hz), 1.60 (4H, brs), 1.33 (12H, brs), 0.92 (6H, t, J = 6.8 Hz)
1H-NMR (400 MHz, CDCl3, TMS, rt) δ 8.89 (2H, d, J = 7.1 Hz), 7.89 (2H, d, J = 7.1 Hz), 7.81 (1H, d, J = 4.2 Hz), 7.51 (2H, d, J = 8.9 Hz), 7.27-7.23 (1H, m), 6.63 (2H, d, J = 9.0 Hz), 6.17-6.07 (1H, m), 5.63-5.54 (2H, m), 5.37 (2H, d, J = 6.4 Hz), 3.32 (4H, t, J = 7.7 Hz), 1.60 (4H, brs), 1.33 (12H, brs), 0.92 (6H, t, J = 6.8 Hz)
合成例４
本合成例では、重合部位を持ち、なおかつ、電子供与部位に水酸基を導入して極性溶媒への溶解性を向上させた1-アリル-4-(5-(4-(ビス(2-ヒドロキシエチル)アミノ)フェニル)チオフェン-2-イル)ピリジニウム ヨージド（化合物１５）を合成した。合成経路を図４に示す。
2,2'-(フェニルイミノ)ジエタノール（関東化学株式会社製）（905 mg, 5.00 mmol）をピリジン 30.0 mL とジオキサン 30.0 mL の混合溶媒に溶解し、氷冷した後、ヨウ素（和光純薬工業株式会社製）（3.81 g, 15.0 mmol）を加え、0℃で1.5時間攪拌した。氷冷浴をはずし、30分攪拌した後、再び氷冷し、亜硫酸ナトリウム水溶液を加えた。生成物を酢酸エチルで抽出し、脱イオン水、飽和食塩水で各一回ずつ洗浄した後、有機層を無水硫酸ナトリウムで乾燥した。溶媒を留去した後、中圧分取液体クロマトグラフにて精製して、白色固体（化合物１６）(1.38 g, 4.50 mmol, 90 %)を得た。以下、得られた化合物１６（2,2'-(4-ヨードフェニルアザネジイル)ジエタノール）の分析結果を示す。
1H-NMR (400 MHz, CDCl3, TMS, rt) δ 7.48-7.44 (2H, m), 6.51-6.48 (2H, m), 3.86 (4H, t, J = 4.9 Hz), 3.57 (4H, t, J = 4.9 Hz), 2.77 (2H, m)
本合成例では、重合部位を持ち、なおかつ、電子供与部位に水酸基を導入して極性溶媒への溶解性を向上させた1-アリル-4-(5-(4-(ビス(2-ヒドロキシエチル)アミノ)フェニル)チオフェン-2-イル)ピリジニウム ヨージド（化合物１５）を合成した。合成経路を図４に示す。
2,2'-(フェニルイミノ)ジエタノール（関東化学株式会社製）（905 mg, 5.00 mmol）をピリジン 30.0 mL とジオキサン 30.0 mL の混合溶媒に溶解し、氷冷した後、ヨウ素（和光純薬工業株式会社製）（3.81 g, 15.0 mmol）を加え、0℃で1.5時間攪拌した。氷冷浴をはずし、30分攪拌した後、再び氷冷し、亜硫酸ナトリウム水溶液を加えた。生成物を酢酸エチルで抽出し、脱イオン水、飽和食塩水で各一回ずつ洗浄した後、有機層を無水硫酸ナトリウムで乾燥した。溶媒を留去した後、中圧分取液体クロマトグラフにて精製して、白色固体（化合物１６）(1.38 g, 4.50 mmol, 90 %)を得た。以下、得られた化合物１６（2,2'-(4-ヨードフェニルアザネジイル)ジエタノール）の分析結果を示す。
1H-NMR (400 MHz, CDCl3, TMS, rt) δ 7.48-7.44 (2H, m), 6.51-6.48 (2H, m), 3.86 (4H, t, J = 4.9 Hz), 3.57 (4H, t, J = 4.9 Hz), 2.77 (2H, m)
4-ブロモピリジン塩酸塩（和光純薬工業株式会社製）(150 mg, 0.773 mmol)、2,5-チオフェンジボロン酸（和光純薬工業株式会社製）（399 mg, 2.32 mmol）、炭酸ナトリウム（和光純薬工業株式会社製）（328 mg, 3.09 mmol）、テトラキス（トリフェニルホスフィン）パラジウム（0）（和光純薬工業株式会社製）（26.9 mg, 0.0232 mmol）をトルエン5 mLとメタノール5 mLの混合溶媒に溶解し、真空脱気と窒素置換を３回繰り返した後、70℃で20分攪拌した。放冷後、上記で得た化合物１６を加え、再び真空脱気と窒素置換を３回繰り返した後、70℃で5時間攪拌した。放冷後、反応液を酢酸エチルと塩化メチレンで希釈後、脱イオン水で１回、飽和食塩水で１回洗浄し、有機層を無水硫酸ナトリウムで乾燥した。溶媒を留去した後、中圧分取液体クロマトグラフにて精製し、橙色粉末（化合物１７）（25.9 mg, 0.0762 mmol, 10%）を得た。以下、得られた化合物１７（2,2'-(4-(5-(ピリジン-4-イル)チオフェン-2-イル)フェニルアザネジイル)ジエタノール）の分析結果を示す。
1H-NMR (400 MHz, CDCl3, TMS, rt) δ 8.47-8.46 (2H, m), 7.65-7.64 (3H, m), 7.53 (2H, d, J = 8.8 Hz), 7.25 (1H, d, J = 3.9 Hz), 6.80 (2H, d, J = 8.9 Hz), 3.76 (4H, t, J = 5.9 Hz), 3.60 (4H, t, J = 5.9 Hz)
1H-NMR (400 MHz, CDCl3, TMS, rt) δ 8.47-8.46 (2H, m), 7.65-7.64 (3H, m), 7.53 (2H, d, J = 8.8 Hz), 7.25 (1H, d, J = 3.9 Hz), 6.80 (2H, d, J = 8.9 Hz), 3.76 (4H, t, J = 5.9 Hz), 3.60 (4H, t, J = 5.9 Hz)
上記で得た化合物１７（12.1 mg, 0.0356 mmol）を塩化メチレン 1.0 mLに溶解し、ヨウ化アリル（シグマアルドリッチジャパン株式会社製）（500μL, 5.48 mmol）を加え、8時間加熱還流した。放冷後、溶媒及びヨウ化アリルを留去し、暗赤色固体（化合物１５）（17.2 mg, 0.0339 mmol, 95 %）を得た。以下、得られた化合物１５（1-アリル-4-(5-(4-(ビス(2-ヒドロキシエチル)アミノ)フェニル)チオフェン-2-イル)ピリジニウム ヨージド）の分析結果を示す。
1H-NMR (400 MHz, CDCl3, TMS, rt) δ 8.63 (2H, d, J = 7.0 Hz), 8.13 (2H, d, J = 7.0 Hz), 8.06 (1H, d, J = 4.1 Hz), 7.60 (2H, d, J = 8.8 Hz), 7.44 (2H, d, J = 4.2 Hz), 6.83 (2H, d, J = 8.9 Hz), 6.22-6.12 (1H, m), 5.54-5.48 (2H, m), 5.09 (2H, d, J = 6.2 Hz), 3.77 (4H, t, J = 5.9 Hz), 3.63 (4H, t, J = 5.9 Hz)
1H-NMR (400 MHz, CDCl3, TMS, rt) δ 8.63 (2H, d, J = 7.0 Hz), 8.13 (2H, d, J = 7.0 Hz), 8.06 (1H, d, J = 4.1 Hz), 7.60 (2H, d, J = 8.8 Hz), 7.44 (2H, d, J = 4.2 Hz), 6.83 (2H, d, J = 8.9 Hz), 6.22-6.12 (1H, m), 5.54-5.48 (2H, m), 5.09 (2H, d, J = 6.2 Hz), 3.77 (4H, t, J = 5.9 Hz), 3.63 (4H, t, J = 5.9 Hz)
合成例５
この合成例では、化学式（化１）のＲ７及びＲ８のアルキル鎖の長さの影響を調べるために、化合物３と１０に加えて、下記６種のピリジン誘導体を新規に合成した。
この合成例では、化学式（化１）のＲ７及びＲ８のアルキル鎖の長さの影響を調べるために、化合物３と１０に加えて、下記６種のピリジン誘導体を新規に合成した。
化合物３の合成と同様の方法で、N,N-ジヘキシル-4-ヨードアニリンの代わりにN,N-ジエチル-4-ヨードアニリン１ 248 mg （0.9 mmol）を用いて合成し、黄色粉末で31 mg（収率34%）を得た。以下合成した化合物１８（N，N−ジエチル-4-(5-(ピリジン-4-イル)チオフェン-2-イル)ベンゼンアミン）の分析結果を示す。
1H-NMR (300 MHz, CDCl3, TMS, rt) δ 8.57-8.55 (m, 2H), 7.49-7.43 (m, 5H), 7.15 (d, 1H, J = 3.8 Hz), 6.69 (d, 2H, J = 9.0 Hz), 3.50 -3.36 (m, 4H), 1.19 (t, 6H, J = 7.0 Hz); 13C-NMR (75 MHz, CDCl3, TMS, rt) δ 150.6, 148.1, 142.1, 137.6, 127.5, 126.8, 122.0, 121.3, 119.6, 112.0, 44.8, 13.0; ESI-HRMS (m/z) calcd for C19H20N2S: 308.1347; found: 309.1423 [M-H]+
1H-NMR (300 MHz, CDCl3, TMS, rt) δ 8.57-8.55 (m, 2H), 7.49-7.43 (m, 5H), 7.15 (d, 1H, J = 3.8 Hz), 6.69 (d, 2H, J = 9.0 Hz), 3.50 -3.36 (m, 4H), 1.19 (t, 6H, J = 7.0 Hz); 13C-NMR (75 MHz, CDCl3, TMS, rt) δ 150.6, 148.1, 142.1, 137.6, 127.5, 126.8, 122.0, 121.3, 119.6, 112.0, 44.8, 13.0; ESI-HRMS (m/z) calcd for C19H20N2S: 308.1347; found: 309.1423 [M-H]+
化合物３の合成と同様の方法で、N,N-ジヘキシル-4-ヨードアニリンの代わりにN,N-ジブチル-4-ヨードアニリン 298 mg （0.9 mmol）を用いて合成し、黄色粉末で44 mg（収率40%）を得た。以下合成した化合物１９（N，N−ジブチル-4-(5-(ピリジン-4-イル)チオフェン-2-イル)ベンゼンアミン）の分析結果を示す。
1H-NMR (300 MHz, CDCl3, TMS, rt) δ 8.56-8.52 (m, 2H), 7.50-7.43 (m, 5H), 7.13 (d, 1H, J = 3.9 Hz), 6.64 (d, 2H, J = 8.9 Hz), 3.30 (t, 4H, J = 7.9 Hz), 1.65-1.53 (m, 4H), 1.44-1.29 (m, 4H), 0.97 (t, 6H, J = 7.3 Hz); 13C-NMR (75 MHz, CDCl3, TMS, rt) δ 150.2, 147.8, 141.8, 137.2, 127.0, 126.4, 120.8, 120.5, 120.6, 119.2, 111.7, 50.8, 29.5, 20.4, 14.0; ESI-HRMS (m/z) calcd for C23H28N2S: 364.1973; found: 365.2049 [M-H]+
1H-NMR (300 MHz, CDCl3, TMS, rt) δ 8.56-8.52 (m, 2H), 7.50-7.43 (m, 5H), 7.13 (d, 1H, J = 3.9 Hz), 6.64 (d, 2H, J = 8.9 Hz), 3.30 (t, 4H, J = 7.9 Hz), 1.65-1.53 (m, 4H), 1.44-1.29 (m, 4H), 0.97 (t, 6H, J = 7.3 Hz); 13C-NMR (75 MHz, CDCl3, TMS, rt) δ 150.2, 147.8, 141.8, 137.2, 127.0, 126.4, 120.8, 120.5, 120.6, 119.2, 111.7, 50.8, 29.5, 20.4, 14.0; ESI-HRMS (m/z) calcd for C23H28N2S: 364.1973; found: 365.2049 [M-H]+
化合物３の合成と同様の方法で、N,N-ジヘキシル-4-ヨードアニリンの代わりにN,N-ジオクチル-4-ヨードアニリン 399 mg （0.9 mmol）を用いて合成し、黄色粉末で94 mg（収率67%）を得た。以下合成した化合物２０（N，N−ジオクチル-4-(5-(ピリジン-4-イル)チオフェン-2-イル)ベンゼンアミン）の分析結果を示す。
1H-NMR (300 MHz, CDCl3, TMS, rt) δ 8.58 (d, 2H, J = 9.0 Hz), 7.51?7.45 (m, 5H), 7.15 (d, 1H, J = 3.9 Hz), 6.66 (d, 2H, J = 9.0 Hz), 3.31 (t, 4H, J = 7.4 Hz), 1.61 (brs, 4H), 1.33-1.27 (m, 20H), 0.89 (t, 6H, J = 6.4 Hz); 13C-NMR (75 MHz, CDCl3, TMS, rt) δ 149.6, 148.2, 142.3, 136.9, 127.2, 126.7, 121.5, 120.6, 119.3, 111.7, 51.1, 31.9, 29.4, 27.2, 22.7, 14.2; ESI-HRMS (m/z) calcd for C31H44N2S: 476.3225; found: 477.3301 [M-H]+
1H-NMR (300 MHz, CDCl3, TMS, rt) δ 8.58 (d, 2H, J = 9.0 Hz), 7.51?7.45 (m, 5H), 7.15 (d, 1H, J = 3.9 Hz), 6.66 (d, 2H, J = 9.0 Hz), 3.31 (t, 4H, J = 7.4 Hz), 1.61 (brs, 4H), 1.33-1.27 (m, 20H), 0.89 (t, 6H, J = 6.4 Hz); 13C-NMR (75 MHz, CDCl3, TMS, rt) δ 149.6, 148.2, 142.3, 136.9, 127.2, 126.7, 121.5, 120.6, 119.3, 111.7, 51.1, 31.9, 29.4, 27.2, 22.7, 14.2; ESI-HRMS (m/z) calcd for C31H44N2S: 476.3225; found: 477.3301 [M-H]+
化合物１０の合成と同様の方法で、化合物３の代わりに化合物１８を20 mg（0.06 mmol）用いて合成し、当量の赤色固体（化合物２１）を得た。以下合成した化合物２１（4-(5-(4-(ジエチルアミノ)フェニル)チオフェン-2-イル)-1-メチルピリジニウム トリフルオロメタンスルホネート）の分析結果を示す。
1H-NMR (300 MHz, CDCl3, TMS, rt) δ 8.44 (d, 2H, J = 6.9 Hz), 7.74 (d, 2H, J = 7.0 Hz), 7.69 (d, 1H, J = 4.1 Hz), 7.42 (d, 2H, J = 8.9 Hz), 7.13 (d, 1H, J = 4.1 Hz), 6.60 (d, 2H, J = 8.9 Hz), 4.17 (s, 3H), 3.37 (q, 4H, J = 7.0 Hz), 1.18 (t, 6H, J = 7.0 Hz); 13C-NMR (75 MHz, CDCl3, TMS, rt) δ 155.7, 149.2, 148.9, 144.6, 134.0, 133.9, 132.2, 128.1, 127.9, 123.5, 123.3, 121.3, 121.1, 119.5, 111.9, 44.9, 13.0, 12.9; ESI-HRMS (m/z) calcd for C21H23F3N2O3S2: 472.5436; found: 323.1577 [M-CF3O3S]+
1H-NMR (300 MHz, CDCl3, TMS, rt) δ 8.44 (d, 2H, J = 6.9 Hz), 7.74 (d, 2H, J = 7.0 Hz), 7.69 (d, 1H, J = 4.1 Hz), 7.42 (d, 2H, J = 8.9 Hz), 7.13 (d, 1H, J = 4.1 Hz), 6.60 (d, 2H, J = 8.9 Hz), 4.17 (s, 3H), 3.37 (q, 4H, J = 7.0 Hz), 1.18 (t, 6H, J = 7.0 Hz); 13C-NMR (75 MHz, CDCl3, TMS, rt) δ 155.7, 149.2, 148.9, 144.6, 134.0, 133.9, 132.2, 128.1, 127.9, 123.5, 123.3, 121.3, 121.1, 119.5, 111.9, 44.9, 13.0, 12.9; ESI-HRMS (m/z) calcd for C21H23F3N2O3S2: 472.5436; found: 323.1577 [M-CF3O3S]+
化合物１０の合成と同様の方法で、化合物３の代わりに化合物１９を103 mg（0.28 mmol）用いて合成し、当量の赤色固体（化合物２２）を得た。以下合成した化合物２２（4-(5-(4-(ジブチルアミノ)フェニル)チオフェン-2-イル)-1-メチルピリジニウム トリフルオロメタンスルホネート）の分析結果を示す。
1H-NMR (300 MHz, CDCl3, TMS, rt) δ 8.48 (d, 2H, J = 6.4 Hz), 7.78 (d, 2H, J = 6.2 Hz), 7.72 (d, 1H, J = 4.1 Hz), 7.43 (d, 2H, J = 8.3 Hz), 7.16 (d, 1H, J = 3.6 Hz), 6.60 (d, 2H, J = 8.5 Hz), 4.21 (s, 3H), 3.29 (t, 4H, J = 7.4 Hz), 1.89-1.52 (m, 4H), 1.44-1.25 (m, 4H), 0.97 (t, 6H, J = 7.1 Hz); 13C-NMR (75 MHz, CDCl3, TMS, rt) δ 160.0, 149.6, 149.0, 144.6, 134.0, 139.9, 132.2, 128.0, 127.9, 123.3, 123.2, 121.3, 121.1, 119.5, 111.9, 51.2, 29.8, 20.7, 14.3; ESI-HRMS (m/z) calcd for C25H31F3N2O3S2: 528.6504; found: 379.2207 [M-CF3O3S]+
1H-NMR (300 MHz, CDCl3, TMS, rt) δ 8.48 (d, 2H, J = 6.4 Hz), 7.78 (d, 2H, J = 6.2 Hz), 7.72 (d, 1H, J = 4.1 Hz), 7.43 (d, 2H, J = 8.3 Hz), 7.16 (d, 1H, J = 3.6 Hz), 6.60 (d, 2H, J = 8.5 Hz), 4.21 (s, 3H), 3.29 (t, 4H, J = 7.4 Hz), 1.89-1.52 (m, 4H), 1.44-1.25 (m, 4H), 0.97 (t, 6H, J = 7.1 Hz); 13C-NMR (75 MHz, CDCl3, TMS, rt) δ 160.0, 149.6, 149.0, 144.6, 134.0, 139.9, 132.2, 128.0, 127.9, 123.3, 123.2, 121.3, 121.1, 119.5, 111.9, 51.2, 29.8, 20.7, 14.3; ESI-HRMS (m/z) calcd for C25H31F3N2O3S2: 528.6504; found: 379.2207 [M-CF3O3S]+
化合物１０の合成と同様の方法で、化合物３の代わりに化合物２０を140 mg（0.29 mmol）用いて合成し、当量の赤色固体（化合物２３）を得た。以下合成した化合物２３（4-(5-(4-(ジオクチルアミノ)フェニル)チオフェン-2-イル)-1-メチルピリジニウム トリフルオロメタンスルホネート）の分析結果を示す。
1H-NMR (300 MHz, CDCl3, TMS, rt) δ 8.51 (d, 2H, J = 7.0 Hz), 7.80 (d, 2H, J = 7.1 Hz), 7.74 (d, 1H, J = 4.2 Hz), 7.45 (d, 2H, J = 8.9 Hz), 7.18 (d, 1H, J = 4.2 Hz), 6.60 (d, 2H, J = 9.0 Hz), 4.23 (s, 3H), 3.29 (t, 4H, J = 7.3 Hz), 1.59 (brs, 4H), 1.33-1.28 (m, 20H), 0.89 (t, 6H, J = 6.5 Hz); 13C NMR (75 MHz, CDCl3, TMSrt) δ 156.1, 149.6, 149.1, 144.7, 134.2, 134.1, 132.2, 128.1, 128.0, 123.9, 121.3, 121.2, 119.5, 111.9, 51.5, 32.2, 29.9, 29.7, 27.7, 27.5, 14.6; ESI-HRMS (m/z) calcd for C33H47F3N2O3S2: 640.8625; found: 491.3462 [M-CF3O3S]+
1H-NMR (300 MHz, CDCl3, TMS, rt) δ 8.51 (d, 2H, J = 7.0 Hz), 7.80 (d, 2H, J = 7.1 Hz), 7.74 (d, 1H, J = 4.2 Hz), 7.45 (d, 2H, J = 8.9 Hz), 7.18 (d, 1H, J = 4.2 Hz), 6.60 (d, 2H, J = 9.0 Hz), 4.23 (s, 3H), 3.29 (t, 4H, J = 7.3 Hz), 1.59 (brs, 4H), 1.33-1.28 (m, 20H), 0.89 (t, 6H, J = 6.5 Hz); 13C NMR (75 MHz, CDCl3, TMSrt) δ 156.1, 149.6, 149.1, 144.7, 134.2, 134.1, 132.2, 128.1, 128.0, 123.9, 121.3, 121.2, 119.5, 111.9, 51.5, 32.2, 29.9, 29.7, 27.7, 27.5, 14.6; ESI-HRMS (m/z) calcd for C33H47F3N2O3S2: 640.8625; found: 491.3462 [M-CF3O3S]+
合成例６
合成例１で得たN，N−ジヘキシル-4-(5-(ピリジン-4-イル)チオフェン-2-イル)ベンゼンアミン（化合物４）（31.5 mg, 0.0748 mmol）を塩化メチレン 1.0 mLに溶かし、ヨウ化メチル（関東化学株式会社製）（1.5 mL, 24.2 mmol）を加え、24時間加熱還流した。放冷後、溶媒及び、ヨウ化メチルを留去し、中圧分取液体クロマトグラフにて精製し、暗赤色固体（化合物２４）（14.8 mg, 0.0263 mmol, 35 %）を得た。以下合成した化合物２４（2-(5-(4-(ジヘキシルアミノ)フェニル)チオフェン-2-イル)-1-アミノピリジニウム ヨージド、下式）の分析結果を示す。
1H-NMR (400 MHz, CDCl3, TMS, rt) δ 9.52 (1H, ｍ), 8.40 (1H, ｍ), 8.02 (1H,ｍ), 7.92 (1H, ｍ), 7.72 (1H, d, J = 4.0 Hz), 7.47 (2H, d, J = 8.9), 7.27 (1H, d, J = 4.0 Hz), 6.63 (2H, d, J = 8.9 Hz), 4.66 (3H, s), 3.30 (4H, m ), 1.60 (4H, m), 1.32 (12H, m), 0.91 (6H, m).
合成例１で得たN，N−ジヘキシル-4-(5-(ピリジン-4-イル)チオフェン-2-イル)ベンゼンアミン（化合物４）（31.5 mg, 0.0748 mmol）を塩化メチレン 1.0 mLに溶かし、ヨウ化メチル（関東化学株式会社製）（1.5 mL, 24.2 mmol）を加え、24時間加熱還流した。放冷後、溶媒及び、ヨウ化メチルを留去し、中圧分取液体クロマトグラフにて精製し、暗赤色固体（化合物２４）（14.8 mg, 0.0263 mmol, 35 %）を得た。以下合成した化合物２４（2-(5-(4-(ジヘキシルアミノ)フェニル)チオフェン-2-イル)-1-アミノピリジニウム ヨージド、下式）の分析結果を示す。
実施例１
本実施例では、合成例１〜２で得たチオフェン誘導体（化合物３〜６）を極性の異なる様々な溶媒に溶解し、吸収及びケイ光スペクトルを測定した。
なお、各溶媒の溶媒極性ET(30) (kcal/mol)は、吸光型ソルバトクロミック色素である下式のベタイン色素を溶媒に溶解し、その極大吸収波長λ（nm）を式 ET(30) = 28591 / λ に代入して得た。
これらチオフェン誘導体を、０．７〜１．２×１０−５Ｍの濃度でスペクトル測定用標準溶媒（和光純薬工業社製）の溶液を調製し可視紫外分光光度計（日本分光株式会社製V-560 UV/VIS Spectrophotometer）で測定した。極大吸収波長(nm)を表２に、極大吸収波長におけるモル吸光係数（mol-1cm-1）を表３に示す。表中の番号は化合物の番号を示す。
本実施例では、合成例１〜２で得たチオフェン誘導体（化合物３〜６）を極性の異なる様々な溶媒に溶解し、吸収及びケイ光スペクトルを測定した。
なお、各溶媒の溶媒極性ET(30) (kcal/mol)は、吸光型ソルバトクロミック色素である下式のベタイン色素を溶媒に溶解し、その極大吸収波長λ（nm）を式 ET(30) = 28591 / λ に代入して得た。
次に、これらチオフェン誘導体のケイ光スペクトルを測定した。蛍光スペクトルは、吸収スペクトルと同じサンプルを用いて、ケイ光分光光度計（日立製作所製F-4500）で測定した。
ケイ光発光極大波長(nm)を表４に示す。表中の番号は化合物の番号を示す。
この実験により、化合物３〜６（チオフェン誘導体）は、優れたケイ光ソルバトクロミック特性を有することが分かった。特に、電子供与基をピリジニウムとした化合物６は、化合物３〜５に比べ、吸収波長及び発光波長が大幅に長波長化している。その結果、汎用性の高いアルゴンレーザー（488 nm）での効率的な励起が可能である。
ケイ光発光極大波長(nm)を表４に示す。表中の番号は化合物の番号を示す。
実施例２
本実施例では、化合物６を、異なるｐＨを持つ合成洗剤水溶液に溶解して、蛍光を測定した。
３つの試験管に、ぞれぞれ合成例２で得た化合物６を0.1 gを入れ、それぞれ10 mLの脱イオン水と弱酸性ビオレ（花王株式会社製）、COOP Kソフト（株式会社コープグリーン製）又はマイペット（花王株式会社製）の液体洗剤を１滴加え、超音波を照射して化合物６を溶解させた水溶液を得た。これらの溶液にフルカラーLEDフラッシュライト（Anteya Technology Corporation 社製、MFL143-FB）により青色光（450ｎｍ）を照射すると、弱酸性（ｐＨ＝５）でオレンジ色、中性（ｐＨ＝６）で赤色、弱アルカリ性（ｐＨ＝８）で朱色の蛍光が観察された。洗剤ミセルに取り込まれた化合物６が、ミセル表面の電荷に応答して蛍光波長を大きく変えることが分かった。
本実施例では、化合物６を、異なるｐＨを持つ合成洗剤水溶液に溶解して、蛍光を測定した。
３つの試験管に、ぞれぞれ合成例２で得た化合物６を0.1 gを入れ、それぞれ10 mLの脱イオン水と弱酸性ビオレ（花王株式会社製）、COOP Kソフト（株式会社コープグリーン製）又はマイペット（花王株式会社製）の液体洗剤を１滴加え、超音波を照射して化合物６を溶解させた水溶液を得た。これらの溶液にフルカラーLEDフラッシュライト（Anteya Technology Corporation 社製、MFL143-FB）により青色光（450ｎｍ）を照射すると、弱酸性（ｐＨ＝５）でオレンジ色、中性（ｐＨ＝６）で赤色、弱アルカリ性（ｐＨ＝８）で朱色の蛍光が観察された。洗剤ミセルに取り込まれた化合物６が、ミセル表面の電荷に応答して蛍光波長を大きく変えることが分かった。
実施例３
0.1〜1 mgの化合物１０に、1〜10 mgの卵黄由来ホスファチジルコリン(Lecithin)、β−シクロデキストリン、Triton X-100、臭化セチルトリメチルアンモニウム（CTAB）、ドデシル硫酸ナトリウム（SDS）をそれぞれ添加して、脱イオン水５mLを注いだ後、超音波を20秒間照射した。その上澄み液に、488 nmの光を照射し、発光をケイ光分光光度計（日立製作所製F-4500）で測定した。結果を図５に示す。図５から色素（化合物１０）は局所環境に敏感に蛍光波長応答することが分かる。
0.1〜1 mgの化合物１０に、1〜10 mgの卵黄由来ホスファチジルコリン(Lecithin)、β−シクロデキストリン、Triton X-100、臭化セチルトリメチルアンモニウム（CTAB）、ドデシル硫酸ナトリウム（SDS）をそれぞれ添加して、脱イオン水５mLを注いだ後、超音波を20秒間照射した。その上澄み液に、488 nmの光を照射し、発光をケイ光分光光度計（日立製作所製F-4500）で測定した。結果を図５に示す。図５から色素（化合物１０）は局所環境に敏感に蛍光波長応答することが分かる。
実施例４
0.1〜1 mgの化合物２４に、1〜10 mgの卵黄由来ホスファチジルコリン(Lecithin)、β−シクロデキストリン、Triton X-100、臭化セチルトリメチルアンモニウム（CTAB）、ドデシル硫酸ナトリウム（SDS）をそれぞれ添加して、脱イオン水５mLを注いだ後、超音波を20秒間照射した。この上澄み液に、450 nmの光を照射し、発光をケイ光分光光度計（日立製作所製F-4500）で測定した。結果を図６に示す。
化合物２４も化合物１０と同様に局所環境に蛍光波長応答している。しかし、化合物２４の蛍光波長応答は、化合物１０と比べると、添加剤の種類による発光波長の変化が小さく、また添加剤がCTABの時には蛍光強度が小さかった。
0.1〜1 mgの化合物２４に、1〜10 mgの卵黄由来ホスファチジルコリン(Lecithin)、β−シクロデキストリン、Triton X-100、臭化セチルトリメチルアンモニウム（CTAB）、ドデシル硫酸ナトリウム（SDS）をそれぞれ添加して、脱イオン水５mLを注いだ後、超音波を20秒間照射した。この上澄み液に、450 nmの光を照射し、発光をケイ光分光光度計（日立製作所製F-4500）で測定した。結果を図６に示す。
化合物２４も化合物１０と同様に局所環境に蛍光波長応答している。しかし、化合物２４の蛍光波長応答は、化合物１０と比べると、添加剤の種類による発光波長の変化が小さく、また添加剤がCTABの時には蛍光強度が小さかった。
実施例５
本実施例では、化合物７を、ヒト培養大腸癌細胞T84に導入して蛍光顕微鏡像を観測した。
ガラスボトムディッシュ(35 mm, MATSUNAMI)で２〜４日間培養 (37℃, 5%CO2)してサブコンフレント状態のヒト培養大腸癌細胞Ｔ８４（細胞株−微生物株−遺伝子バンク(ATCC)番号CCL-248、住商ファーマインターナショナル株式会社製）をリン酸緩衝生理食塩水で洗浄した後、2 x10-5 Mの化合物７のDMSO溶液100μlを細胞近傍に滴下し、室温で５分反応させた。リン酸緩衝生理食塩水で再度洗浄後、ただちにリン酸緩衝生理食塩水中で共焦点レーザー顕微鏡 (Carl Zeiss製LSM510META)を用いてアルゴンレーザー（488 nm）で励起して観察した。得られた蛍光顕微鏡像を図７に示す。
図７で明らかなように、大腸癌細胞T84の細胞膜は化合物７によって染色され、図８に示されるように、各部位の環境によって560〜640nmのさまざまな波長の蛍光が観測された。化合物７が細胞膜のわずかな環境変化を蛍光波長で検出できるプローブであることが明らかとなった。蛍光標識された細胞は、室温下で静置すると少なくとも数時間以上にわたり蛍光を維持した。また、本実験条件下での適正な共焦点レーザー顕微鏡観測では、化合物７はレーザーによる退色をほとんど認められなかった。
本実施例では、化合物７を、ヒト培養大腸癌細胞T84に導入して蛍光顕微鏡像を観測した。
ガラスボトムディッシュ(35 mm, MATSUNAMI)で２〜４日間培養 (37℃, 5%CO2)してサブコンフレント状態のヒト培養大腸癌細胞Ｔ８４（細胞株−微生物株−遺伝子バンク(ATCC)番号CCL-248、住商ファーマインターナショナル株式会社製）をリン酸緩衝生理食塩水で洗浄した後、2 x10-5 Mの化合物７のDMSO溶液100μlを細胞近傍に滴下し、室温で５分反応させた。リン酸緩衝生理食塩水で再度洗浄後、ただちにリン酸緩衝生理食塩水中で共焦点レーザー顕微鏡 (Carl Zeiss製LSM510META)を用いてアルゴンレーザー（488 nm）で励起して観察した。得られた蛍光顕微鏡像を図７に示す。
図７で明らかなように、大腸癌細胞T84の細胞膜は化合物７によって染色され、図８に示されるように、各部位の環境によって560〜640nmのさまざまな波長の蛍光が観測された。化合物７が細胞膜のわずかな環境変化を蛍光波長で検出できるプローブであることが明らかとなった。蛍光標識された細胞は、室温下で静置すると少なくとも数時間以上にわたり蛍光を維持した。また、本実験条件下での適正な共焦点レーザー顕微鏡観測では、化合物７はレーザーによる退色をほとんど認められなかった。
実施例６
本実施例では、化学式（化１）のＲ７及びＲ８のアルキル鎖の長さの影響を調べるために、表１に示すピリジニウム誘導体でマクロファージ細胞を染色して、細胞染色の違いを比較した。
数 μｇの各ピリジニウム誘導体（化合物１０、２１〜２３）を、仔ウシ血清とD-MEM基礎培地を1：9の割合で混合した液体培地10 mLにそれぞれ加え、一晩冷蔵庫に静置し溶解させた。翌日、上清5 mLをとり孔径0.2 μmの滅菌メンブランフィルターを通して細胞染色液とした。
マクロファージ細胞（ATCC社のRAW264）を、仔ウシ血清とD-MEM基礎培地を1:9の割合で混合した液体培地を用いて、CellSeed社のHydroCellディッシュにて浮遊させた。
このRAW264細胞が接着しているガラスボトムディッシュから培地を除去し、各染色液を0.2 mLずつ入れて37℃のCO2インキュベーター内にて15分静置し、細胞を染色した。その後に染色液を除去し、仔ウシ血清とD-MEM基礎培地を1：9の割合で混合した液体培地を用いて3回培地を交換した。染色した細胞は、共焦点レーザー顕微鏡（Carl Zeiss 社製 LSM510 META）を用いてアルゴンレーザー（488 nm）で励起し、ラムダモードにて蛍光観察をした。結果を蛍光顕微鏡像（図９）に示す。
化合物２１で染色した場合（１）は、細胞全体が蛍光染色されているが、細胞膜や細胞内小器官の識別が困難である。化合物２２および化合物１０で染色した場合（（２）と（３））は、細胞膜とミトコンドリアが選択的に染色され、蛍光波長の違いによりそれらを明確に識別することができる。一方、化合物２３で染色した場合（４）は、細胞全体が蛍光染色されているが、蛍光強度が低く、かつ染色の程度にムラがある。
この結果から、化学式（化１）のＲ７及びＲ８のアルキル鎖の炭素数が特に３〜７の場合に、細胞の部位を高感度で識別することができることが分かる。
本実施例では、化学式（化１）のＲ７及びＲ８のアルキル鎖の長さの影響を調べるために、表１に示すピリジニウム誘導体でマクロファージ細胞を染色して、細胞染色の違いを比較した。
数 μｇの各ピリジニウム誘導体（化合物１０、２１〜２３）を、仔ウシ血清とD-MEM基礎培地を1：9の割合で混合した液体培地10 mLにそれぞれ加え、一晩冷蔵庫に静置し溶解させた。翌日、上清5 mLをとり孔径0.2 μmの滅菌メンブランフィルターを通して細胞染色液とした。
マクロファージ細胞（ATCC社のRAW264）を、仔ウシ血清とD-MEM基礎培地を1:9の割合で混合した液体培地を用いて、CellSeed社のHydroCellディッシュにて浮遊させた。
このRAW264細胞が接着しているガラスボトムディッシュから培地を除去し、各染色液を0.2 mLずつ入れて37℃のCO2インキュベーター内にて15分静置し、細胞を染色した。その後に染色液を除去し、仔ウシ血清とD-MEM基礎培地を1：9の割合で混合した液体培地を用いて3回培地を交換した。染色した細胞は、共焦点レーザー顕微鏡（Carl Zeiss 社製 LSM510 META）を用いてアルゴンレーザー（488 nm）で励起し、ラムダモードにて蛍光観察をした。結果を蛍光顕微鏡像（図９）に示す。
化合物２１で染色した場合（１）は、細胞全体が蛍光染色されているが、細胞膜や細胞内小器官の識別が困難である。化合物２２および化合物１０で染色した場合（（２）と（３））は、細胞膜とミトコンドリアが選択的に染色され、蛍光波長の違いによりそれらを明確に識別することができる。一方、化合物２３で染色した場合（４）は、細胞全体が蛍光染色されているが、蛍光強度が低く、かつ染色の程度にムラがある。
この結果から、化学式（化１）のＲ７及びＲ８のアルキル鎖の炭素数が特に３〜７の場合に、細胞の部位を高感度で識別することができることが分かる。
実施例７
本実施例では、化合物１０を用いてヒト胎児腎由来細胞HEK293細胞を染色した時の色素の局在及び発光波長を蛍光顕微鏡で観察した。
数 μｇの化合物１０を、仔ウシ血清とD-MEM基礎培地を1：9の割合で混合した液体培地10 mLにそれぞれ加え、一晩冷蔵庫に静置し溶解させた。翌日、上清5 mLをとり孔径0.2 μmの滅菌メンブランフィルターを通して細胞染色液とした。
ヒト胎児腎由来細胞HEK293細胞（理研セルバンク社製）を、ウシ胎児血清とD-MEM基礎培地を1:9の割合で混合した液体培地を用いて、5 mLの培養フラスコにて培養した。これをガラスボトムディッシュに播種した。
このHEK293細胞が接着しているガラスボトムディッシュから培地を除去し、各染色液を0.2 mLずつ入れて37℃のCO2インキュベーター内にて15分静置し、細胞を染色した。その後に染色液を除去し、ウシ胎児血清とD-MEM基礎培地を1：9の割合で混合した液体培地を用いて3回培地を交換した。染色した細胞は、共焦点レーザー顕微鏡（Carl Zeiss 社製 LSM510 META）を用いてアルゴンレーザー（488 nm）で励起し、ラムダモードにて蛍光観察をした。
結果を図１０に示す。細胞膜（図中１）とミトコンドリア（図中２）とで発光色が異なる。
このことは、細胞の種類によってミトコンドリアの含有量が異なるので、本発明の色素で異なる細胞を染色した場合には、その発光強度により識別することができることを示す。
本実施例では、化合物１０を用いてヒト胎児腎由来細胞HEK293細胞を染色した時の色素の局在及び発光波長を蛍光顕微鏡で観察した。
数 μｇの化合物１０を、仔ウシ血清とD-MEM基礎培地を1：9の割合で混合した液体培地10 mLにそれぞれ加え、一晩冷蔵庫に静置し溶解させた。翌日、上清5 mLをとり孔径0.2 μmの滅菌メンブランフィルターを通して細胞染色液とした。
ヒト胎児腎由来細胞HEK293細胞（理研セルバンク社製）を、ウシ胎児血清とD-MEM基礎培地を1:9の割合で混合した液体培地を用いて、5 mLの培養フラスコにて培養した。これをガラスボトムディッシュに播種した。
このHEK293細胞が接着しているガラスボトムディッシュから培地を除去し、各染色液を0.2 mLずつ入れて37℃のCO2インキュベーター内にて15分静置し、細胞を染色した。その後に染色液を除去し、ウシ胎児血清とD-MEM基礎培地を1：9の割合で混合した液体培地を用いて3回培地を交換した。染色した細胞は、共焦点レーザー顕微鏡（Carl Zeiss 社製 LSM510 META）を用いてアルゴンレーザー（488 nm）で励起し、ラムダモードにて蛍光観察をした。
結果を図１０に示す。細胞膜（図中１）とミトコンドリア（図中２）とで発光色が異なる。
このことは、細胞の種類によってミトコンドリアの含有量が異なるので、本発明の色素で異なる細胞を染色した場合には、その発光強度により識別することができることを示す。
比較例１
本比較例では、化合物７の代わりに特許文献１（特開2008-291210）に記載の下式化合物を用いて、実施例５と同様にヒト培養大腸癌細胞T84の蛍光顕微鏡像を観測した。
得られた蛍光顕微鏡像とその蛍光スペクトルを図１１に示す。本比較例の場合は、汎用的な蛍光顕微鏡には搭載されていないブルーダイオードレーザー（405 nm）で励起しなければ、蛍光像を得ることができなかった。また、図１１左図に示されるように、細胞膜が選択的に蛍光標識されるものの、細胞の部位による蛍光波長の変化はほとんど観測されなかった。
本比較例では、化合物７の代わりに特許文献１（特開2008-291210）に記載の下式化合物を用いて、実施例５と同様にヒト培養大腸癌細胞T84の蛍光顕微鏡像を観測した。
Claims (10)
- 下式
ｍは１を表し、
Ｙは、それぞれ独立し、その少なくとも一つは、以下の式
Ｒ１及びＲ２は、水素原子を表し、
Ｒ３及びＲ４は、水素原子を表し、
Ｒ５及びＲ６は、水素原子を表し、
Ｒ７及びＲ８は、それぞれ同じであっても異なってもよく、水素原子、又は置換基を有していてもよいアルキル基を表し、但し、Ｒ５及びＲ７はそれぞれが結合する炭素原子及び窒素原子と共同して芳香族若しくは脂肪族の５員環又は６員環を形成してもよく、Ｒ６及びＲ８はそれぞれが結合する炭素原子及び窒素原子と共同して芳香族若しくは脂肪族の５員環又は６員環を形成してもよい。）で表されるケイ光ソルバトクロミック色素であって、
ここで、前記他分子と結合可能な結合基が、以下の群：ハロゲン原子、アミノ基、水酸基、カルボキシル基、アルデヒド基、ビニル基、エチニル基、スルホン酸基、もしくはマレイミド基、又はこれらの基を末端に有するアルキル基、から選択される結合基であり、
ここで、前記置換基が、以下の群：水酸基、アミノ基、チオール基、及び／又はスルホン酸基、から選択される基であるケイ光ソルバトクロミック色素。 - Ｒ７及びＲ８が、それぞれ同じであっても異なってもよく、炭素数が３〜７のアルキル基である請求項１に記載のケイ光ソルバトクロミック色素。
- 請求項１又は請求項２に記載のケイ光ソルバトクロミック色素から成る細胞用染色剤。
- 請求項１又は請求項２に記載のケイ光ソルバトクロミック色素を水系溶媒に溶解又は分散させた細胞用染色液。
- 請求項１又は請求項２に記載のケイ光ソルバトクロミック色素を血清に溶解させた細胞染色液。
- 請求項１又は請求項２に記載のケイ光ソルバトクロミック色素で染色された細胞。
- 下式
ｍは１を表し、
Ｙは、それぞれ独立し、その少なくとも一つは、−Ｎ＝を表し、残余は−ＣＲ９＝を表し、
Ｒ９は、水素原子、炭素数１〜４のアルキル基、又は他分子と結合可能な結合基を表し、
Ｒ１及びＲ２は、水素原子を表し、
Ｒ３及びＲ４は、水素原子を表し、
Ｒ５及びＲ６は、水素原子を表し、
Ｒ７及びＲ８は、それぞれ同じであっても異なってもよく、水素原子、又は置換基を有していてもよいアルキル基を表し、但し、Ｒ５及びＲ７はそれぞれが結合する炭素原子及び窒素原子と共同して芳香族若しくは脂肪族の５員環又は６員環を形成してもよく、Ｒ６及びＲ８はそれぞれが結合する炭素原子及び窒素原子と共同して芳香族若しくは脂肪族の５員環又は６員環を形成してもよい。）で表される化合物を、その化合物の周囲の極性により発光波長が変わるケイ光ソルバトクロミック色素として使用する方法であって、
ここで、前記他分子と結合可能な結合基が以下の群：ハロゲン原子、アミノ基、水酸基、カルボキシル基、アルデヒド基、ビニル基、エチニル基、スルホン酸基、もしくはマレイミド基、又はこれらの基を末端に有するアルキル基、から選択される結合基であり、
ここで、前記置換基が、以下の群：水酸基、アミノ基、チオール基、及び／又はスルホン酸基、から選択される基である方法。 - Ｒ７及びＲ８が、それぞれ同じであっても異なってもよく、炭素数が３〜７のアルキル基である請求項７に記載の方法。
- 下式
ｍは１を表し、
Ｙは、それぞれ独立し、その少なくとも一つは、以下の式
Ｒ１及びＲ２は、水素原子を表し、
Ｒ３及びＲ４は、水素原子を表し、
Ｒ５及びＲ６は、水素原子を表し、
Ｒ７及びＲ８は、それぞれ同じであっても異なってもよく、水素原子、又は置換基を有していてもよいアルキル基を表し、但し、Ｒ５及びＲ７はそれぞれが結合する炭素原子及び窒素原子と共同して芳香族若しくは脂肪族の５員環又は６員環を形成してもよく、Ｒ６及びＲ８はそれぞれが結合する炭素原子及び窒素原子と共同して芳香族若しくは脂肪族の５員環又は６員環を形成してもよい。）で表される化合物を、その化合物の周囲の極性により発光波長が変わるケイ光ソルバトクロミック色素として使用する方法であって、
ここで、前記他分子と結合可能な結合基が以下の群：ハロゲン原子、アミノ基、水酸基、カルボキシル基、アルデヒド基、ビニル基、エチニル基、スルホン酸基、もしくはマレイミド基、又はこれらの基を末端に有するアルキル基、から選択される結合基であり、
ここで、前記置換基が、以下の群：水酸基、アミノ基、チオール基、及び／又はスルホン酸基、から選択される基である方法。 - Ｒ７及びＲ８が、それぞれ同じであっても異なってもよく、炭素数が３〜７のアルキル基である請求項９に記載の方法。
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