JP5673996B2 - 好熱性微生物の形質転換方法 - Google Patents
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(1)メチル化DNAの調製に用いる宿主として、形質転換の対象とする好熱性微生物由来のDNAメチル化酵素またはこれと同一の活性を有する酵素の遺伝子を発現し、これらの酵素以外のDNAメチル化酵素の遺伝子を発現しない宿主を作製する工程、および
(2)工程(1)で得られた宿主に任意のDNAを導入して、形質転換体を調製する工程
を含む。
プラスミドpACYCDuet−1(Novagen社製)のp15A複製起点(p15Aori)およびクロラムフェニコール耐性遺伝子(Cmr)を含む領域をPCR法(プライマー1F:配列番号1およびプライマー1R:配列番号2)により増幅した。得られた増幅断片を制限酵素BglIIで消化し、DNA ligaseを用いて自己環化させた。得られたプラスミドをpIR101と命名した。
プラスミドpRK2013(D. H. Figurskiら、Proc. Natl. Acad. Sci. USA、1979年、第76巻、p. 1648-1652)に含まれるoriT領域をPCR法(プライマー16F:配列番号31およびプライマー16R:配列番号32)により増幅した。得られた増幅断片を制限酵素EcoRIで消化し、プラスミドpSTE33(I. Narumiら、Biotechnol. Lett.、1993年、第15巻、p. 815-820)およびpUCG18(M. P. Taylorら、Plasmid、2008年、第60巻、p. 45-52)の制限酵素EcoRI部位にそれぞれ挿入した。得られたプラスミドをそれぞれpSTE33T(図1(b))およびpUCG18T(図1(c))と命名した。
大腸菌TOP10株(Invitrogen社製)のゲノムDNAを鋳型としてdam遺伝子の上流領域(プライマー30F:配列番号58およびプライマー30R:配列番号59)および下流領域(プライマー31F:配列番号60およびプライマー31R:配列番号61)をそれぞれPCR法により増幅した。大腸菌ER1821株(New England BioLab社製)のゲノムDNAを鋳型としてmetB遺伝子を含む領域をPCR法(プライマー32F:配列番号62およびプライマー32R:配列番号63)により増幅した。得られた上流領域の断片を制限酵素HindIIIおよびSphIで消化し、pUC19の制限酵素HindIII−SphI部位間に挿入した。次いで、得られたプラスミドの制限酵素SphI−XbaI部位間に、上記で得られたmetB遺伝子を含む領域の断片を制限酵素SphIおよびNotIで消化し、上記で得られた下流領域の断片を制限酵素NotIおよびXbaIで消化し、これらを直列に連結して挿入した。得られたプラスミドをpΔDamと命名した。
pΔDamを鋳型としてdam遺伝子欠失用DNA断片をPCR法(プライマー30Fおよび31R)により増幅した。得られたDNA断片に混入する鋳型DNA(pΔDam)を制限酵素DpnIで消化した。得られたDNA断片をQIAquick PCR Purification Kit(Qiagen社製)を用いて精製し、大腸菌ER1793株(New England BioLab社製)に電気穿孔法により導入した。菌体を滅菌水で洗浄し、MM1最少固体培地(0.6%(w/v)Na2HPO4、0.3%(w/v)KH2PO4、0.05%(w/v)NaCl、0.01%(w/v)チアミン、1mM MgSO4、0.1mM CaCl2、33μM FeCl3、0.004%(w/v)L−トリプトファン、0.002%(w/v)L−ヒスチジン、0.2%(w/v)D−グルコース、1.5%(w/v)寒天末)に塗布し、37℃にて2日間培養した。生育したコロニーの中からアンピシリン感受性株をスクリーニングして、大腸菌IR21株を得た。IR21株のdam遺伝子が欠失していることは、PCR解析および制限酵素マッピングにより確認した。IR21株の遺伝子型は以下のとおりである:F- fhuA2 Δ(lacZ)r1 glnV44 e14-(McrA-) trp-31 his-1 rpsL104(StrR) xyl-4 mtl-2 metB1 Δ(mcrC-mrr)114::IS10 Δdam::metB。
大腸菌を12.5μg/mLのクロラムフェニコールを含有するLB液体培地で37℃にて24時間培養し、ゲノムDNAを常法に従い抽出した。C. W. Gehrkeら、J. Chromatog.、1984年、第301巻、p. 199-219に記載の方法に従い、ゲノムDNAをモノデオキシヌクレオシドにまで分解し、逆相HPLCを用いてその組成を分析した。実施例4と同様にして、大腸菌IR27株にpIR207を電気穿孔法で導入して得られた大腸菌(以下、このようにして得られた大腸菌を「大腸菌IR27[pIR207]」のように記載することがある)のゲノムDNAからは、既知のいかなるメチル化核酸(5−メチルデオキシシチジン、5mdC;N−6−メトルデオキシアデノシン、6mdA;N−4−メチルデオキシシチジン、4mdC)も検出されなかった。大腸菌IR27[pIR399]のゲノムDNAからは、有意な6mdAが検出された。そのモル比率は全デオキシアデノシンの0.08%であった。大腸菌IR27[pIR401]およびIR27[pIR408]のゲノムDNAからも、有意な6mdAが検出された。そのモル比率は、それぞれ全デオキシアデノシンの0.10%および0.21%であった。以上の結果から、pIR399、pIR401およびpIR408にクローン化したジオバチラス・カウストフィラスHTA426株由来のI型メチル化酵素遺伝子群は、大腸菌中で機能的に発現し、宿主大腸菌のDNAを異種メチル化することが示された。
(接合伝達法)
GKP08遺伝子が原因となるN−6−メチル化は、大腸菌におけるDamメチル化に包括されることから、核酸供与体となる大腸菌として、特記のない限りBR24派生株を用いた。適切な抗生物質(25μg/mLカナマイシン、6.5μg/mLテトラサイクリン、12.5μg/mLクロラムフェノコール、25μg/mLアンピシリン)を含有するLB液体培地で核酸供与体を37℃にて一晩前培養し、回収した菌体を、抗生物質を含まないLB液体培地で洗浄した。菌体を光学濁度(OD600)が約0.1になるように新しいLB液体培地に接種し、光学濁度が0.5になるまで37℃にて振盪培養した。核酸受容体となるジオバチラス・カウストフィラスHTA426株はLB液体培地で55℃にて一晩前培養した。得られた培養液を0.1%(v/v)となるように新しいLB液体培地に接種し、55〜60℃にて、OD600が0.5になるまで培養した。得られたジオバチラス・カウストフィラス培養液は室温まで冷却した。ジオバチラス・カウストフィラス培養液(9mL)と核酸供与体培養液(1mL)とを混合し、菌体を吸引ろ過により膜フィルター(0.22μm)上に濃縮した。得られた膜フィルターを、菌体回収面がLB固体培地表面に接するように、LB固体培地上に静置した(37℃、一晩)。次いで、膜フィルター上の菌体をLB液体培地に懸濁し、5μg/mLカナマイシンを含有するLB固体培地に塗布し、60℃にて一晩培養し、生育したコロニーを形質転換体として得た。
ジオバチラス・カウストフィラスHTA426株をpUCG18Tの核酸受容体とし、大腸菌BR397[pUCG18T]、BR398[pUCG18T]、BR399[pUCG18T]、BR401[pUCG18T]およびBR408[pUCG18T]をpUCG18Tの核酸供与体とした接合伝達を行った。接合伝達後のジオバチラス・カウストフィラス菌体をLB固体培地および5μg/mLのカナマイシンを含有するLB固体培地にそれぞれ塗布し、60℃にて一晩培養し、生育したコロニー数から接合伝達効率を算出した。結果を以下の表1に示す。
ジオバチラス・カウストフィラスHTA426株を核酸受容体とし、大腸菌BR408[pΔGK1155−1]を核酸供与体とした接合伝達により、ジオバチラス・カウストフィラスHTA426株にpΔGK1155−1を導入した。接合伝達後の菌体を5μg/mLのカナマイシンを含有するLB固体培地上に塗布し、60℃にて一晩培養した。生育したコロニーをMM3最少固体培地(0.03%(w/v)K2SO4、0.25%(w/v)Na2HPO4・12H2O、0.1%(w/v)NH4Cl、0.0003%(w/v)MnCl2・4H2O、0.0005%(w/v)CaCl2・2H2O、0.0007%(w/v)FeCl3・6H2O、0.00004%(w/v)ZnSO4・7H2O、0.000001%(w/v)H3BO3、0.000005%(w/v)CoCl2・6H2O、0.00002%(w/v)CuSO4・5H2O、0.000001%(w/v)NiCl2・6H2O、0.000025%(w/v)エチレンジアミン四酢酸塩、1%(w/v)D−グルコース、0.1%(w/v)カザミノ酸、10mMトリス(ヒドロキシメチル)アミノメタン−HCl緩衝液、pH7.5、0.04%(w/v)MgSO4・7H2O、2%(w/v)寒天末、10μg/mLウラシル)に移し、ウラシル要求性株をスクリーニングした。得られたウラシル要求性株の1つを、MK27株と命名した。MK27株のGK1155遺伝子はTK101遺伝子の挿入により欠失(ΔGK1155::TK101)していることをPCR解析により確認した(図2)。
ジオバチラス・カウストフィラスHTA426株を核酸受容体とし、大腸菌BR408[pΔGK1155−2]を核酸供与体とした接合伝達により、ジオバチラス・カウストフィラスHTA426株にpΔGK1155−2を導入した。接合伝達後の菌体を5μg/mLのカナマイシンを含有するLB固体培地上に塗布し、60℃にて一晩培養した。生育したコロニーの1つをLB液体培地100mLに接種し、60℃にて一晩振盪培養した。得られた培養液の一部(10μl)を新しいLB液体培地100mLに接種し、引き続き60℃にて一晩振盪培養した。同様の操作をさらに2回繰り返した後、培養液の一部をLB固体培地に塗布し、60℃にて一晩培養した。生育したコロニー約1000個をLB固体培地および5μg/mLのカナマイシンを含有するLB液体培地に接種し、カナマイシン感受性株をスクリーニングした。得られた8株のカナマイシン感受性株をMM3最少固体培地および10μg/mLのウラシルを含有するMM3最少固体培地に塗布し、ウラシル要求性株をスクリーニングした。得られた4株のウラシル要求性株のうち1クローンをジオバチラス・カウストフィラスMK54株と命名した。MK54株のGK1155遺伝子はin−frame欠失(ΔGK1155)していることをPCR解析により確認した(図3)。
ジオバチラス・カウストフィラスHTA426株を核酸受容体とし、大腸菌BR408[pGAM15−BSamyE]を核酸供与体とした接合伝達により、ジオバチラス・カウストフィラスHTA426株にpGAM15−BSamyEを導入した。得られた形質転換体の1つをMK42株と命名した。MK42株のゲノムにpGAM15−BSamyE由来の発現カセット(sigAプロモーターとその下流のamyE遺伝子)が組み込まれていることをPCR解析により確認した。MK42株を1%(w/v)可溶性デンプンを含むLB固体培地に塗布し、60℃にて一晩培養した。培地中の未分解デンプンをヨウ素・よう化カリウム液(ナカライテスク)で染色することで、α−アミラーゼ活性の有無を定性的に評価した。
ジオバチラス・カウストフィラスHTA426株を核酸受容体とし、大腸菌BR408[pGAM15−bgaB]を核酸供与体とした接合伝達により、ジオバチラス・カウストフィラスHTA426株にpGAM15−bgaBを導入した。得られた形質転換体の1つをMK39株と命名した。MK39株のゲノムにpGAM15−bgaB由来の発現カセット(sigAプロモーターとその下流のbgaB遺伝子)が組み込まれていることをPCR解析により確認した。MK39株を200μg/mLの5−ブロモ−4−クロロ−3−インドリル−β−D−ガラクトピラノシドを含有するLB固体培地に塗布し、60℃にて一晩培養した。コロニーが青色を呈色するか否かでβ−ガラクトシダーゼ活性の有無を定性的に評価した。
ジオバチラス・カウストフィラスHTA426株を核酸受容体とし、大腸菌BR408[pGAM31−bgaB]を核酸供与体とした接合伝達により、ジオバチラス・カウストフィラスHTA426株にpGAM31−bgaBを導入した。得られた形質転換体の1つをMK61株と命名した。MK61株のゲノムにpGAM31−bgaB由来の発現カセット(GK0704プロモーターとその下流のbgaB遺伝子)が組み込まれていることをPCR解析により確認した。MK61株をMM3最少液体培地、1%(w/v)D−グルコースを含有するMM3最少液体培地、1%(w/v)マルトースを含有するMM3最少液体培地、1%(w/v)可溶性デンプンを含有するMM3最少液体培地、1%(w/v)ミオ−イノシトールを含有するMM3最少液体培地、1%(w/v)D−キシロースを含有するMM3最少液体培地、1%(w/v)L−アラビノースを含有するMM3最少液体培地、および1%(w/v)キシロオリゴ糖を含有するMM3最少液体培地にそれぞれ接種し、60℃にて48時間培養した。実施例10と同様にして、得られた菌体から粗酵素抽出液を調製し、粗酵素抽出液中のβ−ガラクトシダーゼ活性を測定した。Bio-Rad Protein Assay kit(Bio-Rad社製)を用いて粗酵素抽出液中の総タンパク質量を測定した。その際に、ウシ血清アルブミンを標準タンパク質として用いた。総タンパク質量あたりのβ−ガラクトシダーゼ活性を比活性として求めた。結果を表3に示す。
Claims (7)
- 好熱性微生物の形質転換方法であって、
該好熱性微生物とは異なる種の宿主において、該好熱性微生物由来のDNAメチル化酵素またはこれと同一の活性を有する酵素によってメチル化DNAを調製する工程、および
該メチル化DNAを該好熱性微生物に導入する工程
を含み、
該宿主が、メチル化酵素遺伝子dcmを欠失するがメチル化酵素Damまたはこれと同一の活性を有する酵素が存在する大腸菌であり、かつ該好熱性微生物由来のDNAメチル化酵素またはこれと同一の活性を有する酵素を発現する、方法。 - 制限酵素が、前記宿主中に存在しない、請求項1に記載の方法。
- 前記メチル化DNAを調製する工程が、
(1)前記メチル化酵素遺伝子dcmを欠失するがメチル化酵素Damまたはこれと同一の活性を有する酵素が存在する大腸菌であり、かつ前記好熱性微生物由来のDNAメチル化酵素またはこれと同一の活性を有する酵素の遺伝子を発現する宿主を作製する工程、および
(2)該工程(1)で得られた宿主に任意のDNAを導入して、形質転換体を調製する工程
を含む、請求項1または2に記載の方法。 - 前記工程(1)において、前記宿主が、制限酵素の遺伝子を発現しない、請求項3に記載の方法。
- 前記メチル化DNAを前記好熱性微生物に導入する工程において、該メチル化DNAを接合伝達法により導入する、請求項1から4のいずれかの項に記載の方法。
- 前記好熱性微生物が、ジオバチラス属細菌である、請求項1から5のいずれかの項に記載の方法。
- 前記ジオバチラス属細菌が、ジオバチラス・カウストフィラスである、請求項6に記載の方法。
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