JP5661988B2

JP5661988B2 - ムスカリンレセプター活性化剤及びペプチド

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Publication number: JP5661988B2
Application number: JP2008044641A
Authority: JP
Inventors: 宏幸小見; 武田　茂樹; 茂樹武田
Original assignee: Peptide Door Co Ltd
Current assignee: Peptide Door Co Ltd
Priority date: 2008-02-26
Filing date: 2008-02-26
Publication date: 2015-01-28
Anticipated expiration: 2028-02-26
Also published as: JP2009201379A

Description

本発明は、ムスカリンレセプター活性化剤、及び、その有効成分として用いることのできる新規ペプチドに関する。

ムスカリンレセプターは７回膜貫通型受容体タンパク質（ＧＰＣＲ；Ｇタンパク質共役型受容体）ファミリーに属するタンパク質である。ムスカリンレセプターはＭ１〜Ｍ５までのサブタイプの存在が知られている。ムスカリンレセプターの構造は非常に似ているため、リガンド選択性に乏しく全てのサブタイプが同じリガンドやアゴニスト、アンタゴニストを結合するという特徴があり、例えば、リガンドであるアセチルコリンの結合特異性は無い。従って、ムスカリンレセプターに作用する治療薬においてもその特異性を持たせることは非常に困難である。

ムスカリンレセプターは、脳、自律神経系、心臓、平滑筋、血管内皮、外分泌腺等生体内では多岐に渡る臓器に発現が確認されている。ムスカリンレセプター作動薬（アゴニスト）は、各種疾患の治療薬として使用されており、例えば、セビメリン（Ｍ３に対するアゴニスト）がシェーグレン症候群患者の口腔乾燥症状改善薬として、カルバコール又はピロカルピン（Ｍ３に対する作動薬）が緑内障治療薬として、それぞれ、使用されている。

ムスカリンレセプターに対するペプチド性アゴニストとしては、例えば、配列番号４１で表されるアミノ酸配列からなるムスカリン様毒素（Muscarinic Toxin）３（Ｍ４に対するアゴニスト）（非特許文献１）、類似配列からなるムスカリン様毒素α（非特許文献２）、ムスカリン様毒素１（非特許文献３）、ムスカリン様毒素７（非特許文献４）が公知である。

「フェブス・レターズ（FEBS letters）」，（オランダ），１９９４年，３５２巻，９１頁「ヨーロピアン・ジャーナル・オブ・バイオケミストリー（European journal of biochemistry）」，（英国），１９９５年，２３４巻，５７９頁「トキシコン（Toxicon）」，（英国），１９９５年，３３巻，３９９頁「ライフ・サイエンシーズ（Life sciences）」，（英国），１９９７年，６０巻，１０６９頁

本発明の課題は、ムスカリンレセプター作動薬として使用可能な新規のペプチドを提供することにある。

前記課題は、本発明による、配列番号２１（ＸＸＸＰ；１番目のＸ＝Ｗ，Ｒ、２番目のＸ＝Ｙ，Ｈ，Ｒ、３番目のＸ＝Ｔ，Ｒ，Ｉ）で表されるアミノ酸配列、若しくは、前記アミノ酸配列において１又は数個のアミノ酸が欠失、置換、及び／又は付加されたアミノ酸配列を含み、且つ、ムスカリンレセプター活性化作用を示すペプチド、又はその誘導体を有効成分として含む、ムスカリンレセプター活性化剤により解決することができる。

本発明のムスカリンレセプター活性化剤の好ましい態様によれば、前記有効成分が、配列番号２２（ＸＸＸＸＰ；１番目のＸ＝Ｔ，Ｌ，Ｈ，Ｆ，Ｓ、２番目のＸ＝Ｗ，Ｒ、３番目のＸ＝Ｙ，Ｈ，Ｒ、４番目のＸ＝Ｔ，Ｒ，Ｉ）で表されるアミノ酸配列、若しくは、前記アミノ酸配列において１又は数個のアミノ酸が欠失、置換、及び／又は付加されたアミノ酸配列を含み、且つ、ムスカリンレセプター活性化作用を示すペプチド、又はその誘導体である。
本発明のムスカリンレセプター活性化剤の別の好ましい態様によれば、前記有効成分が、配列番号２３（ＸＸＸＸＸＰ；１番目のＸ＝Ｙ，Ｆ、２番目のＸ＝Ｔ，Ｌ，Ｈ，Ｆ，Ｓ、３番目のＸ＝Ｗ，Ｒ、４番目のＸ＝Ｙ，Ｈ，Ｒ、５番目のＸ＝Ｔ，Ｒ，Ｉ）で表されるアミノ酸配列、若しくは、前記アミノ酸配列において１又は数個のアミノ酸が欠失、置換、及び／又は付加されたアミノ酸配列を含み、且つ、ムスカリンレセプター活性化作用を示すペプチド、又はその誘導体である。

本発明のムスカリンレセプター活性化剤の更に別の好ましい態様によれば、配列番号２２又は２３で表されるアミノ酸配列が、
ＹＴＷＹＴＰ（配列番号８）、
ＹＳＷＹＴＰ（配列番号１５）、
ＨＷＨＴＰ（配列番号１９）、又は
ＹＨＲＨＴＰ（配列番号２０）
である。
本発明のムスカリンレセプター活性化剤の更に別の好ましい態様によれば、配列番号２１における１番目のアミノ酸Ｘ、配列番号２２における２番目のアミノ酸Ｘ、又は配列番号２３における３番目のアミノ酸Ｘが、Ｗである。

また、本発明は、配列番号２１〜２３のいずれか１つで表されるアミノ酸配列、若しくは、前記アミノ酸配列において１又は数個のアミノ酸が欠失、置換、及び／又は付加されたアミノ酸配列を含み、構成アミノ酸数が１００以下である、ペプチド、又はその誘導体に関する。
更に、本発明は、前記ペプチドをコードするポリヌクレオチド、及び前記ポリヌクレオチドを含む発現ベクターに関する。

本発明によれば、新規のムスカリンレセプター活性化剤を提供することができる。本発明のムスカリンレセプター活性化剤において有効成分として用いることのできるペプチド又はその誘導体それ自体も新規化合物であり、ムスカリンレセプターに対する活性化作用を有する。本発明のムスカリンレセプター活性化剤は、例えば、緑内障、シェーグレン症候群の治療に用いることができる。

本発明のムスカリンレセプター活性化剤は、有効成分として、配列番号２１で表されるアミノ酸配列、若しくは、前記アミノ酸配列において１又は数個のアミノ酸が欠失、置換、及び／又は付加されたアミノ酸配列を含み、且つ、ムスカリンレセプター活性化作用を示すペプチド、あるいはその誘導体を含む。

以下、本発明において有効成分として用いることのできる前記ペプチド及びそれらの誘導体を総称して「ムスカリンレセプター活性化ペプチド」と称する。なお、本明細書における用語「ペプチド」には、オリゴペプチド及びポリペプチドの両方が含まれる。

本明細書において「ムスカリンレセプター活性化作用」とは、ムスカリンレセプターに結合してアゴニスト活性を示す作用を意味する。前記ムスカリンレセプターには、各種哺乳動物、例えば、ヒト、ウマ、ヒツジ、ウサギ、モルモット、ヤギ、ネコ、イヌ、ウシ、ブタ、マウス等由来のムスカリンレセプターが含まれ、特に好ましくはヒトムスカリンレセプターである。また、前記ムスカリンレセプターには、ムスカリンレセプターの各種サブタイプ、すなわち、Ｍ１〜Ｍ５が含まれ、特に好ましくはＭ２である。

或るペプチドがムスカリンレセプター活性化作用を有するか否かは、公知方法により容易に判定することができる。例えば、ムスカリンレセプターを適当な担体（例えば、ＥＬＩＳＡプレート又はビーズ担体）に固定化し、前記ムスカリンレセプターへの結合の有無を分析する方法（例えば、後述の実施例１参照）、あるいは、ムスカリンレセプターとＧｉとの融合ポリペプチドを調製し、標識ＧＴＰの前記融合ポリペプチドへの取り込み量を測定する方法（例えば、後述の実施例２又は３参照）により、或るペプチドがムスカリンレセプター活性化作用を有するか否かを容易に判定することができる。

本発明において、ムスカリンレセプター活性化ペプチドを構成するアミノ酸残基数は、ムスカリンレセプター活性化作用を示す限り、特に限定されるものではないが、例えば、４〜１００個、好ましくは４〜５０個、より好ましくは４〜３０個、更に好ましくは４〜２０個、更に好ましくは４〜１２個、特に好ましくは４〜６個である。前記アミノ酸配列は、それ単独でムスカリンレセプター活性化作用を示すアミノ酸配列（基本配列）のみからなることもできるし、その繰り返し配列からなることもできる。繰り返し配列からなる場合には、１種類の基本配列のみの繰り返し配列であることもできるし、２種類以上の基本配列の組合せであることもできる。

本明細書において、「配列番号Ｘ（例えば、配列番号２１〜２３）で表されるアミノ酸配列、あるいは、前記アミノ酸配列において１又は数個のアミノ酸が欠失、置換、及び／又は付加されたアミノ酸配列を含み、且つ、ムスカリンレセプター活性化作用を示すペプチド」には、例えば、
配列番号Ｘで表されるアミノ酸配列からなるペプチド；
配列番号Ｘで表されるアミノ酸配列のＮ末端及び／又はＣ末端に、適当なアミノ酸配列が付加されたアミノ酸配列からなり、且つムスカリンレセプター活性化作用を示すペプチド；又は
配列番号Ｘで表されるアミノ酸配列において１又は数個のアミノ酸が欠失、置換、及び／又は付加されたアミノ酸配列を含み、且つ、ムスカリンレセプター活性化作用を示すペプチド
が含まれる。

配列番号２１で表されるアミノ酸配列は、
ＸＸＸＰ（配列番号２１）
［配列中、１番目のアミノ酸ＸはＷ，Ｒ（好ましくはＷ）であり、２番目のアミノ酸ＸはＹ，Ｈ，Ｒであり、３番目のアミノ酸ＸはＴ，Ｒ，Ｉ（好ましくはＴ）である］
である。

配列番号２１で表されるアミノ酸配列を含む配列としては、例えば、
ＸＸＸＸＰ（配列番号２２）
［配列中、１番目のアミノ酸ＸはＴ，Ｌ，Ｈ，Ｆ，Ｓであり、２番目のアミノ酸ＸはＷ，Ｒ（好ましくはＷ）であり、３番目のアミノ酸ＸはＹ，Ｈ，Ｒであり、４番目のアミノ酸ＸはＴ，Ｒ，Ｉ（好ましくはＴ）である］
ＸＸＸＸＸＰ（配列番号２３）
［配列中、１番目のアミノ酸ＸはＹ，Ｆ（好ましくはＹ）であり、２番目のアミノ酸ＸはＴ，Ｌ，Ｈ，Ｆ，Ｓであり、３番目のアミノ酸ＸはＷ，Ｒ（好ましくはＷ）であり、４番目のアミノ酸ＸはＹ，Ｈ，Ｒであり、５番目のアミノ酸ＸはＴ，Ｒ，Ｉ（好ましくはＴ）である］
を挙げることができる。

配列番号２１〜２３で表されるアミノ酸配列としては、例えば、
ＹＴＷＹＴＰ（配列番号８；配列番号１の第３〜８番のアミノ酸からなる配列）
ＹＬＷＨＴＰ（配列番号９；配列番号２の第３〜８番のアミノ酸からなる配列）
ＹＨＷＨＴＰ（配列番号１０；配列番号３の第１〜６番のアミノ酸からなる配列）
ＹＴＷＨＴＰ（配列番号１１；配列番号４の第１〜６番のアミノ酸からなる配列）
ＹＨＷＨＲＰ（配列番号１２；配列番号５の第１〜６番のアミノ酸からなる配列）
ＦＦＷＨＴＰ（配列番号１３；配列番号６の第７〜１２番のアミノ酸からなる配列）
ＦＦＷＲＴＰ（配列番号１４；配列番号７の第５〜１０番のアミノ酸からなる配列）
ＹＳＷＹＴＰ（配列番号１５）
ＹＬＷＨＩＰ（配列番号１７）
ＨＷＨＴＰ（配列番号１９）
ＹＨＲＨＴＰ（配列番号２０）
を挙げることができる。

「配列番号Ｘで表されるアミノ酸配列のＮ末端及び／又はＣ末端（好ましくはＣ末端）に、適当なアミノ酸配列が付加されたアミノ酸配列からなり、且つムスカリンレセプター活性化作用を示すペプチド」において、Ｎ末端及び／又はＣ末端に付加することができる前記アミノ酸配列としては、例えば、リンカー配列、マーカー配列、ポリペプチド配列、又は別のムスカリンレセプター活性化ペプチド配列を挙げることができる。

前記リンカー配列としては、例えば、ペプチドを担体に担持させるための配列、例えば、チオール基を有するアミノ酸［例えば、システイン（Ｌ体システイン又はＤ体システイン）又はホモシステイン）又はアミノ基と反応しない官能基（例えば、マレイミド基）を側鎖に有するアミノ酸１個からなるリンカー配列、あるいは、少なくとも一方の末端が、チオール基を有するアミノ酸又はアミノ基と反応しない官能基を有するアミノ酸であるリンカー配列を挙げることができる。

前記マーカー配列としては、例えば、ペプチドの発現の確認、細胞内局在の確認、あるいは、精製等を容易に行なうための配列を用いることができ、例えば、ＦＬＡＧタグ、ヘキサ−ヒスチジン・タグ、ヘマグルチニン・タグ、又はｍｙｃエピトープなどを挙げることができる。

前記ポリペプチド配列としては、例えば、精製用ポリペプチド［例えば、グルタチオンＳ−トランスフェラーゼ（ＧＳＴ）の全部又は一部］、検出用ポリペプチド［例えば、ヘムアグルチニン又はβ−ガラクトシダーゼαペプチド（ＬａｃＺ α）の全部又は一部］、又は発現用ポリペプチド（例えば、シグナル配列）などを挙げることができる。

「配列番号Ｘで表されるアミノ酸配列において１又は数個のアミノ酸が欠失、置換、及び／又は付加されたアミノ酸配列を含み、且つ、ムスカリンレセプター活性化作用を示すペプチド」において、欠失、置換、及び／又は付加することのできるアミノ酸の個数は、好ましくは１〜１０個、より好ましくは１〜８個、更に好ましくは１〜６個、更に好ましくは１〜４個、更に好ましくは１〜３個、更に好ましくは１又は２個、特に好ましくは１個である。

本明細書において、ペプチドの機能を維持するために置換されるアミノ酸は、置換前のアミノ酸と似た性質を有するアミノ酸であることが好ましい。例えば、以下に示すような各グループに属するアミノ酸は、そのグループ内で互いに似た性質を有するアミノ酸である。これらのアミノ酸をグループ内の他のアミノ酸に置換しても、タンパク質の本質的な機能は損なわれないことが多い。このようなアミノ酸の置換は、保存的置換と呼ばれ、ポリペプチドの機能を保持しつつアミノ酸配列を変換するための手法として公知である。
非極性アミノ酸：Gly、Ala、Val、Leu、Ile、Pro、Met、Phe、及びTrp
中性アミノ酸：Ser、Thr、Cys、Tyr、Asn、及びGln
酸性アミノ酸：Asp及びGlu
塩基性アミノ酸：Lys、Arg、及びHis

本発明において有効成分として用いることのできる「配列番号２１〜２３で表されるアミノ酸配列、あるいは、前記アミノ酸配列において１又は数個のアミノ酸が欠失、置換、及び／又は付加されたアミノ酸配列を含み、且つ、ムスカリンレセプター活性化作用を示すペプチドの誘導体」は、前記ペプチドの誘導体であって、且つ、ムスカリンレセプター活性化作用を示す限り、特に限定されるものではない。このような誘導体としては、例えば、ペプチドの安定性を向上させる各種修飾を施したペプチド誘導体を挙げることができる。前記修飾としては、例えば、Ｌ体アミノ酸のＤ体化（例えば、Ｎ末端アミノ酸のＤ体化、Ｃ末端アミノ酸のＤ体化、Ｎ末端及びＣ末端以外のアミノ酸のＤ体化）、Ｎ末アミノ基のアセチル化、Ｃ末端カルボキシル基のアミド化、天然型アミノ酸の（性質の類似した）非天然型アミノ酸への置換、又はこれらの組合せを挙げることができる。

本発明によるムスカリンレセプター活性化剤の有効成分であるムスカリンレセプター活性化ペプチドは、ムスカリンレセプター活性化作用を有するため、本発明のムスカリンレセプター活性化剤は、例えば、医薬（例えば、緑内障、シェーグレン症候群の治療剤）の用途に使用することができる。

本発明のムスカリンレセプター活性化剤を医薬として使用する場合には、例えば、ペプチドそれ自体を単独で、あるいは、所望により薬剤学的若しくは獣医学的に許容することのできる通常の担体又は希釈剤と共に、動物、好ましくは哺乳動物（特にはヒト）に投与することができる。また、この場合、ペプチドに代えて、ペプチドをコードするポリヌクレオチド（好ましくは、前記ポリヌクレオチドを含む発現ベクター）を用いることもできる［例えば、Gene Ther., Development of safe and efficient novel nonviral gene transfer using ultrasound: enhancement of transfection efficiency of naked plasmid DNA in skeletal muscle., 2002 Mar;9(6):372-80］。

以下、実施例によって本発明を具体的に説明するが、これらは本発明の範囲を限定するものではない。

《実施例１：ファージディスプレイ法によるムスカリンレセプター２（Ｍ２）結合ペプチドのスクリーニング》
（１）Ｍ２とＧｉ１ａとの融合ポリペプチドを含む細胞膜画分の調製
本実施例では、特開２００５−３２５０５５号公報の実施例１に記載のヒトｈＧＰＣＲ４４−Ｇｉα融合ポリペプチドを含む細胞膜画分の調製方法に準じて、ヒトＭ２（Gene Accession Number NM_000739）のＣ末端とヒトＧｉ１ａサブユニット（Gene Accession Number NM_002069）のＮ末端とを連結したムスカリンＭ２−Ｇｉ１ａ融合ポリペプチドを、昆虫細胞Ｓｆ９において産生させた後、細胞膜画分を回収することにより、前記融合ポリペプチドを含有する細胞膜画分を調製した。

具体的には、ヒトＭ２遺伝子とヒトＧｉ１ａサブユニット遺伝子との融合遺伝子（Ｍ２−Ｇｉ１ａ融合遺伝子）を、組み換え体バキュロウイルス作製用のベクターｐＦＡＳＴＢａｃ１（インビトロジェン製）のマルチクローニングサイトに挿入し、作成されたベクターを用いて、バキュロウイルスのゲノムをバクミド（Ｂａｃｍｉｄ）として保持する大腸菌ＤＨ１０Ｂａｃ（インビトロジェン製）を形質転換し、Ｍ２−Ｇｉ１ａ融合遺伝子が挿入されたバクミドを単離した。単離された組み換え体バクミド（バキュロウイルスゲノム）を昆虫細胞Ｓｆ９（インビトロジェン製）にトランスフェクションし、Ｍ２−Ｇｉ１ａ融合遺伝子をもつ組み換え体バキュロウイルスを得た。この組み換え体ウイルスを新鮮なＳｆ９細胞に感染させ、培養後、細胞を回収し、細胞を破砕後、更に、細胞膜画分を回収することにより、Ｍ２−Ｇｉ１ａ融合ポリペプチドを含有する細胞膜画分を取得した。なお、前記の形質転換、バクミド単離、トランスフェクション、及び感染は、添付のプロトコールに従って実施した。

（２）ペプチド呈示ファージライブラリーからのＭ２結合ペプチドのスクリーニング
続いて、得られた細胞膜画分を使用し、ファージディスプレイ法により、ヒトＭ２に結合性を有するペプチドのスクリーニングを行った。
具体的な操作は、特開２００５−３２５０５５号公報の実施例２に記載のスクリーニング方法に準じて実施した。また、ファージディスプレイ法で用いるライブラリーとして、Ｍ１３ファージの表面のマイナータンパク質ｐIIIのＮ末端にペプチドがランダムに呈示されるライブラリー（呈示されるランダムアミノ酸数が７個又は１２個のペプチドライブラリー）を、Smith, G. P., Science, 288, 1315-1317（1985）、J. K. Scott and G. P. Smith, Science, 249, 386-390(1990)の記載に基づいて作製した。また、ファージライブラリーのターゲット（Ｍ２）に対する結合性は、ＥＬＩＳＡ（enzyme-linked immunosorbent assay）により判定した。

スクリーニングの結果、ヒトＭ２に結合性を示すアミノ酸配列として、下記に示す配列番号１〜配列番号７で表される７種類のアミノ酸配列が得られた。
ＮＡＹＴＷＹＴＰＥＶＬＳ（配列番号１；１２アミノ酸）
ＴＳＹＬＷＨＴＰＡＥＶＰ（配列番号２；１２アミノ酸）
ＹＨＷＨＴＰＥ（配列番号３；７アミノ酸）
ＹＴＷＨＴＰＶ（配列番号４；７アミノ酸）
ＹＨＷＨＲＰＰ（配列番号５；７アミノ酸）
ＨＳＴＱＮＴＦＦＷＨＴＰ（配列番号６；１２アミノ酸）
ＳＨＳＥＦＦＷＲＴＰＬＰ（配列番号７；１２アミノ酸）

これらの配列の中で相同性の高い上記下線部の各配列に関して、ＢＬＡＳＴ（Basic local alignment search tool）による相同性検索を実施したところ、７０％以上の相同性を有する配列として、公知タンパク質のアミノ酸配列から下記の相同配列が得られた。なお、相同配列中の下線部は、不一致のアミノ酸を示す。また、スペースの下線部「」は、Ｎ末端又はＣ末端の配列であるため、該当するアミノ酸が存在しないことを意味する。
［１］ＹＴＷＹＴＰ（配列番号８；配列番号１の第３〜８番）
８３％ＹＳＷＹＴＰトマト（Lycopersicon esculentum）アルデヒドオキシダーゼ［配列番号１５］
８３％ＹＴＷＹＴシロイヌナズナ（Arabidopsis thaliana）ＣＫＩ１（CYTOKININ-INDEPENDENT 1）［配列番号１６］
［２］ＹＬＷＨＴＰ（配列番号９；配列番号２の第３〜８番）
８３％ＹＬＷＨＩＰシロイヌナズナ（Arabidopsis thaliana）エクソストシンファミリータンパク質（exostosin family protein）［配列番号１７］
８３％ＹＬＷＨＴイネ（Oryza sativa）発現タンパク質（expressed protein）［配列番号１８］
［３］ＹＨＷＨＴＰ配列番号１０；配列番号３の第１〜６番）
８３％ＨＷＨＴＰニコチアナ（Nicotiana langsdorffii）ネクタリンIII（nectarin III）等［配列番号１９］
８３％ＹＨＲＨＴＰイネ（Oryza sativa）ホメオドメイン転写因子（homeodomain transcription factor）等［配列番号２０］

《実施例２：１２ＡＡペプチド（配列番号１）のアゴニスト活性の確認》
実施例１で得られた７種類のアミノ酸配列の内、配列番号１で表されるアミノ酸配列からなるペプチド（以下、１２ＡＡペプチドと称する）を合成し、Ｍ２に対するアゴニスト活性を確認した。
前記アゴニスト活性は、表１に示す反応条件下で、ユーロピウム標識ＧＴＰ（ＧＴＰ−Ｅｕ）のＭ２−Ｇｉ１ａ融合ポリペプチドへの取り込み量を、時間分解蛍光測定法で測定することにより評価した。なお、１２ＡＡペプチドの濃度は、４段階（１ｎｍｏｌ／Ｌ、１００ｎｍｏｌ／Ｌ、１０μｍｏｌ／Ｌ、１ｍｍｏｌ／Ｌ）で実施した。

［表１］
１０ｍｍｏｌ／ＬＭｇＣｌ_２
１０μｍｏｌ／ＬＧＤＰ
１０００μｇ／ｍＬサポニン
５０ｍｍｏｌ／ＬＨＥＰＥＳ
Ｍ２−Ｇｉ１ａ融合ポリペプチド含有Ｓｆ９細胞膜
所定濃度（４段階）１２ＡＡペプチド
１００ｎｍｏｌ／ＬＧＴＰ−Ｅｕ
総容量１１０μＬ／ウェル

結果を図１に示す。図１の縦軸は、蛍光強度（単位：カウント）である。
図１から明らかなとおり、１２ＡＡペプチドの濃度の増加に伴って、Ｍ２−Ｇｉ１ａ融合ポリペプチドへのＧＴＰ−Ｅｕの取り込み量が増加しており、１２ＡＡペプチドがＭ２に対するアゴニスト活性を有することが確認された。

《実施例３：６ＡＡペプチド（配列番号１の第３〜８番）のアゴニスト活性の確認》
本実施例では、配列番号１における第３〜８番のアミノ酸からなる配列のペプチド（以下、６ＡＡペプチドと称する）を合成し、Ｍ２に対するアゴニスト活性を確認した。
本実施例は、ペプチド呈示ファージの代わりに前記合成ペプチドを用いること以外は、特開２００５−３２５０５５号公報の実施例３に記載の活性測定方法に準じて実施した。具体的には、表２に示す反応条件下で、３０℃にて３０分間反応させた後、［^３５Ｓ］ＧＴＰγＳのＭ２−Ｇｉ１ａ融合ポリペプチドへの取り込み量を測定することにより評価した。なお、カルバコールはムスカリンレセプターの公知アゴニストであり、６ＡＡペプチドの濃度は、８段階（１０^−２〜１０^−９ｍｏｌ／Ｌ）で実施した。

［表２］
２０ｍｍｏｌ／ＬＨＥＰＥＳ緩衝液（ｐＨ７．０）
１ｍｍｏｌ／ＬＥＤＴＡ
１６０ｍｍｏｌ／ＬＮａＣｌ
１ｍｍｏｌ／Ｌジチオスレイトール（ＤＴＴ）
１０ｍｍｏｌ／ＬＭｇＣｌ_２
１μｍｏｌ／ＬＧＤＰ
１ｍｍｏｌ／Ｌカルバコール
０．２ｍｇ／ｍＬＭ２−Ｇｉ１ａ融合ポリペプチド含有Ｓｆ９細胞膜
所定濃度（８段階）６ＡＡペプチド
１００ｐｍｏｌ／Ｌ［ ^３５Ｓ］ＧＴＰγＳ
総容量１００μＬ

結果を図２に示す。
図２から明らかなとおり、６ＡＡペプチドの濃度の増加に伴って、Ｍ２−Ｇｉ１ａ融合ポリペプチドへの［^３５Ｓ］ＧＴＰγＳの取り込み量が増加しており、６ＡＡペプチドがＭ２に対するアゴニスト活性を有することが確認された。

本発明のムスカリンレセプター活性化剤は、例えば、緑内障、シェーグレン症候群等の治療に適用することができる。

配列表の配列番号１〜１４、２１〜２３の配列で表される各アミノ酸配列は、Ｍ２結合ペプチドである。
配列表の配列番号２１の配列で表されるアミノ酸配列において、１番目のアミノ酸「Xaa」はＷ，Ｒであり、２番目のアミノ酸「Xaa」はＹ，Ｈ，Ｒであり、３番目のアミノ酸「Xaa」はＴ，Ｒ，Ｉである。
配列表の配列番号２２の配列で表されるアミノ酸配列において、１番目のアミノ酸「Xaa」はＴ，Ｌ，Ｈ，Ｆ，Ｓであり、２番目のアミノ酸「Xaa」はＷ，Ｒであり、３番目のアミノ酸「Xaa」はＹ，Ｈ，Ｒであり、４番目のアミノ酸「Xaa」はＴ，Ｒ，Ｉである。
配列表の配列番号２３の配列で表されるアミノ酸配列において、１番目のアミノ酸「Xaa」はＹ，Ｆであり、２番目のアミノ酸「Xaa」はＴ，Ｌ，Ｈ，Ｆ，Ｓであり、３番目のアミノ酸「Xaa」はＷ，Ｒであり、４番目のアミノ酸「Xaa」はＹ，Ｈ，Ｒであり、５番目のアミノ酸「Xaa」はＴ，Ｒ，Ｉである。

１２ＡＡペプチド（配列番号１）の濃度を変化させた場合の、Ｍ２−Ｇｉ１ａ融合ポリペプチドへのＧＴＰ−Ｅｕの取り込み量の変化を示すグラフである。公知アゴニスト（カルバコール）存在下において、６ＡＡペプチド（配列番号１の第３〜８番）の濃度を変化させた場合の、Ｍ２−Ｇｉ１ａ融合ポリペプチドへの［^３５Ｓ］ＧＴＰγＳの取り込み量の変化を示すグラフである。

Claims

配列番号１、８、又は１５で表されるアミノ酸配列を含み、且つ、ムスカリンレセプター活性化作用を示すペプチド、又はその誘導体（但し、ムスカリンレセプター活性化作用を示し、且つ、ペプチドの安定性を向上させる修飾を施した誘導体であって、前記修飾が、Ｌ体アミノ酸のＤ体化、Ｎ末アミノ基のアセチル化、Ｃ末端カルボキシル基のアミド化、天然型アミノ酸から、性質の類似した非天然型アミノ酸への置換、又はこれらの組合せである、前記誘導体に限る）であり、前記ペプチドを構成するアミノ酸残基数の上限が３０個である、ムスカリンレセプター活性化剤。
配列番号１、８、又は１５で表されるアミノ酸配列からなるペプチド、又はその誘導体（但し、ムスカリンレセプター活性化作用を示し、且つ、ペプチドの安定性を向上させる修飾を施した誘導体であって、前記修飾が、Ｌ体アミノ酸のＤ体化、Ｎ末アミノ基のアセチル化、Ｃ末端カルボキシル基のアミド化、天然型アミノ酸から、性質の類似した非天然型アミノ酸への置換、又はこれらの組合せである、前記誘導体に限る）。
請求項２に記載のペプチドをコードするポリヌクレオチド。
請求項３に記載のポリヌクレオチドを含む発現ベクター。