JP5646174B2 - 心臓不整脈のリスクマネージメント用の遺伝マーカー - Google Patents

心臓不整脈のリスクマネージメント用の遺伝マーカー Download PDF

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Description

本発明は、一定の遺伝マーカーが、心臓不整脈、具体的には、心房細動および心房粗動、および脳卒中に関連していることを示した発見に関する。
心臓不整脈は、心臓の電気的活性が不規則である、または正常よりも遅いまたは速い一群の医学的状態である。若干の不整脈は、生命を危うくするし、しかも心停止または突然死を引き起こすことがありうる。その他は、脳卒中を含めた他の悪化性症状または疾患を引き起こす、またはその素因を与える。細動は、重症の形の不整脈であり、この場合、心筋は、収縮性細胞の機能の統一性の欠如ゆえに、不規則なまたは震動性の運動を示す。細動は、心房（心房細動（ＡＦ）または心房粗動（ＡＦＩ））または心室（心室細動（ＶＦ））の形をとることがありうる。
心房細動（ＡＦ）は、二つの上部心臓小室（心房）を包含する異常な心臓律動（心臓不整脈）である。正常な心臓の心拍動は、洞房結節によって心房内に生じる電気が、心臓を介して拡散し且つ心筋の収縮および血液のポンプ輸送を引き起こした後に開始する。ＡＦの場合、洞房結節の規則的な電気的インパルスは、不規則な心拍動を生じる無秩序で急速な電気的インパルスで置き換えられる。
心房細動は、最も一般的な心臓不整脈である。心房細動を発生するリスクは、年齢とともに増加する、すなわち、ＡＦは、８０代の個体の４パーセントに影響する。ある個体は、ＡＦと正常律動とを自発的に交互にすることがありうるし（発作性心房細動）、または正常律動へ復帰することなく、優性の心臓律動としてＡＦを続けることがありうる（慢性心房細動）。心房細動は、しばしば、無症候であるが、動悸、失神、胸痛または心不全さえもの症状を生じることがありうる。これら症状は、心房細動が、速すぎるかまたは遅すぎる心拍数を生じる場合、特に一般的である。更に、心房の迷走運動は、心臓から脳および他の部位へと移行することがありうる血餅のリスクを増加させる血流停滞（うっ血）をもたらす。したがって、ＡＦは、心房細動の最も恐ろしい合併症である脳卒中についての重要なリスクファクターである。
心房細動の症状は、心拍数を遅くする投薬で処置することができる。いくつかの投薬、並びに電気的除細動は、ＡＦを正常な心臓律動へと変換するのに用いることができる。外科的およびカテーテルによる療法も、一定の個体の心房細動を予防するのに用いることができる。ＡＦを有する人々は、しばしば、ワルファリンなどの血液希釈薬を与えられて、脳卒中から身を守っている。
心房細動についての二つまたはそれを超える確認エピソードを有する患者はいずれも、再発性心房細動を有すると云われる。これは、更に、療法を伴うことなくエピソードが終わった時点に基づいて、発作性および持続性に分類される。心房細動は、それが７日以内に、最も一般的には、２４時間以内に自発的に終わった時に、発作性であると云われる。持続性または慢性心房細動は、数日間を超えて確定したＡＦである。発作性と、慢性または確定したＡＦとの違いは、再発性エピソードの履歴および現在のＡＦエピソードの持続期間に基づく（Levy S., J Cardiovasc Electrophysiol. 8 Suppl, S78-82(1998)）。
孤立性心房細動（ＬＡＦ）は、心肺疾患の臨床的または心エコー検査知見の不存在下の心房細動として定義される。
心房細動は、通常は、急速心拍数かまたは塞栓形成に関連した症状を伴う。急速且つ不規則な心拍数は、動悸、運動不耐性として知覚され、そして時々、アンギナおよび息切れまたは浮腫のうっ血性症状を生じることがありうる。時々、不整脈は、脳卒中または一過性脳虚血発作（ＴＩＡ）の発症で確認されるであろう。心房細動は、若干の場合、無症候でありうるので、常用身体検査または心電図（ＥＣＧ／ＥＫＧ）でそれを確認することは一般的でない。発作性心房細動は、エピソード性の不整脈発生であるので、診断し難いかもしれない。エピソードは、睡眠でまたは運動で生じることがありうるし、そしてそれらエピソード性状は、診断のために長期のＥＣＧ監視（例えば、Holter モニター）を必要とすることがありうる。
心房細動は、不規則な心拍動が疑われる時はいつでも常套的に行われる調査である心電図で診断される。特徴的知見には、Ｐ波の不存在、定位置での未組織の電気的活性、および心室へのインパルスの不規則伝導によるＲ−Ｒ間隔の不規則性が含まれる。発作性ＡＦが疑われる場合、エピソードは、Holter 監視（２４時間またはそれを超える連続ＥＣＧ記録）の使用で実証することができる。
多くの場合のＡＦには、明確な原因がないが、それは、いろいろな他の問題の結果でありうる（下を参照されたい）。したがって、腎機能および電解質、更には、甲状腺刺激ホルモンおよび血球算定を、常套的に決定する。一般的には、胸部Ｘ線が行われる。胸痛に関連した急性発症ＡＦの場合、心臓トロポニンまたは心筋損傷の他のマーカーを指示することができる。抗凝固投薬を開始することができるように、通常は、凝固研究（ＩＮＲ／ａＰＴＴ）を行う。経食道心エコー図を示して、いずれかの心臓内血栓を確認することができる（Fuster V., et al., Circulation.;104, 2118-2150(2001)）。
心房粗動（ＡＦＩ）は、心房における異常な急速心臓律動を特徴とする。心房粗動を示す患者は、一般的には、心房細動も経験するし、逆もまた同じである（Waldo, A., Progr Cardiovasc Disease, 48:41-56(2005)）。機械的および生物学的には、ＡＦおよびＡＦＩは、したがって、極めて関係があると考えられる。
ＡＦ（およびＡＦＩ）は、いくつかの心臓原因に関連しているが、それ以外にも正常な心臓で生じることがありうる。既知の関連には、高血圧、僧帽弁狭窄（例えば、リウマチ性心疾患または僧帽弁逸脱による）、僧帽弁逆流、心臓外科手術、冠状動脈疾患、肥大型心筋症、過剰アルコール消費（「痛飲」または「ホリデイハート」）、甲状腺機能亢進症、通常は大食すること（「過食」）による迷走神経の刺激過度、肺病理（肺炎、肺癌、肺塞栓症、サルコイドーシスなど）、心膜炎、強い情緒不安および先天性心疾患が含まれる。
心臓の正常な電気伝導系は、洞房結節（ＳＡ結節）によって生じるインパルスを、心筋層（心臓の筋肉）に伝え且つそれを刺激することを可能にする。心筋層は、それが刺激された時に収縮する。心臓の有効な収縮を可能にし、それによって血液を身体にポンプ輸送させるのは、心筋層の規則刺激である。心房細動の場合、心臓の律動的収縮を与えるために洞結節によって生じる規則的インパルスは、より大きい心房組織部位によって生じる急速のランダムに生じた放電によって圧倒される。心房内の組織化された電気的インパルスは、心房収縮を生じ；このようなインパルスの欠如は、心房細動の場合のように、特に、心房付属器においてうっ血性血流を生じ、そして凝固の素因を与える。心房からの血餅の駆逐は、塞栓を生じるが、生じる損傷は、循環がどこでそれを捕まえるかに関係している。脳への塞栓は、心房細動の最も恐ろしい合併症である脳卒中を生じるが、塞栓は、腸管膜循環（腹部臓器に供給する循環）または指に入って、臓器特異的損傷を生じることもありうる。
心房細動の処置は、二つの主要目的によって指示される、すなわち、（ｉ）一時的循環不安定性を予防する；（ii）脳卒中を予防する。前者を達成する最も一般的な方法には、速度および律動制御が含まれるが、通常は、抗凝固が、後者に望まれる方法である（Prystowsky E.N., Am J Cardiol.; 85, 3D-11D(2000); van Walraven C, et al., Jama. 288, 2441-2448(2002)）。速度制御のための、すなわち、心拍数を減少させる一般的な方法には、β遮断薬（例えば、メトトプロロール（metotprolol））、強心配糖体（例えば、ジゴキシン）およびカルシウムチャンネル遮断薬（例えば、ベラパミル）が含まれる。これら投薬は全て、心房からのパルスの発生および心房から心室への伝導を遅らせることによって働く。一般的に用いられる他の薬物には、キニジン、フレカイニド、プロパフェノン、ジソピラミド、ソタロール（sotalol）およびアミオダロン（amiodarone）が含まれる。律動制御は、電気的除細動によって、すなわち、ＤＣ電気ショックを加えることによって、または化学的除細動により、アミオダロン（amiodarione）、プロパフェノンおよびフレカイニドなどの薬物を用いて達成することができる。
脳卒中の予防処置には、抗凝固薬が含まれる。抗凝固薬の代表的な例は、Dalteparin（例えば、Fragmin）、Danaparoid（例えば、Orgaran）、Ｅnoxaparin（例えば、Lovenox）、Heparin（各種）、Tinzaparin（例えば、Innohep）、Warfarin（例えば、Coumadin）である。孤立性心房細動を有する若干の患者は、時々、アスピリンまたはクロピドグレル（clopidogrel）で処置される。アスピリンおよびクロピドグレルは、一緒に用いた場合に有効であるが、その組合せは、依然として、ワルファリンに劣るということが示されている（Connolly S., et al. Lancet.;367,1903-1912(2006)）。（２）新しい抗凝固薬ジメラガトラン（ximelagatran）は、ワルファリンと等しい効力で、ワルファリンに関連した難しい監視方法を伴うことなく、そしてより少ないと考えられる有害な出血性イベントで、脳卒中を予防することが分かった。残念ながら、ジメラガトランおよび他の類似の抗凝固薬（一般的には、直接トロンビン阻害剤と称される）は、今なお広く認可される必要がある。
ワルファリンでの抗凝固を誰が受けるべきおよび受けるべきでないかを決定することは、簡単ではない。ＣＨＡＤＳ２スコアは、脳卒中のリスク（したがって、誰が抗凝固を受けるべきか）を決定する最良の妥当な方法である。ＵＫ ＮＩＣＥガイドラインは、その代わりに、アルゴリズムアプローチを選択している。根本的な問題は、患者が、年間２％未満である脳卒中のリスクを有する場合、ワルファリンを摂取することに関連したリスクは、脳卒中になるリスクより重要であるということである（Gage B.F. et al. Stroke 29, 1083-1091(1998)）。
心房細動は、時々、処置で制御することができる。しかしながら、心房細動の自然傾向は、慢性状態になることである。慢性ＡＦは、増加した死亡リスクをもたらす。心房細動を有する患者は、脳卒中について有意に増加した可能性がある。
心房細動は、高齢者の間で一般的である。先進諸国において、心房細動の患者数は、増大する年配者集団ゆえに、次の５０年間に増加すると考えられる（Go A.S. et al., Jama., 285, 2371-2375(2001)）（３）。Framingham 研究において、ＡＦ発生の生涯リスクは、４０歳以上の男女の４人に１人である。ＡＦの生涯リスクは高い（６人に１人）。National Hospital Discharge Survey (1996-2001) からのデータによれば、初期入院診断としてＡＦを包含した場合について、４５％の患者が男性であり、そして男性の平均年齢は６６．８歳で、女性は７４．６歳であったということが判明した。入院についての人種的内訳は、７１．２％が白人、５．６％が黒人、２％が他の人種であることが判明し、２０％は特定されなかった。更に、アフリカ系アメリカ人患者は、平均すると、他の人種よりはるかに若かった。男性の発病率は、１５〜４４歳の患者の２０．５８／１００，０００人／年〜８５歳以上の患者の１２０３／１００，０００人／年であった。１９９６〜２００１年に、初回に挙げられた診断としてのＡＦでの入院は、３４％増加した。
脳卒中は、一般的な且つ重症の疾患である。米国では毎年、６００，０００人を超える個体が脳卒中に罹患し、そして１６０，０００人を超える個体が、脳卒中に関連した原因により死亡している（Sacco, R.L. et al., Stroke 28, 1507-17(1997)）。更に、米国では毎年、３００，０００人を超える個体が、軽症の形の脳卒中である一過性脳虚血発作で受診している。西欧諸国において、脳卒中は、重症の能力障害の主因および三番目の主な死因である（Bonita, R., Lancet 339, 342-4(1992)）。４０歳に達した人の生涯リスクは、１０％を超える。
脳卒中の臨床的表現型は、複雑であるが、虚血性（８０〜９０％を占める）および出血性脳卒中（１０〜２０％）へと大まかに分けられる（Caplan, L.R. Caplan's Stroke: A Clinical Approach, 1-556 (Butterworth-Heinemann, 2000)）。更に、虚血性脳卒中は、通常は、総および内頸動脈のアテローム硬化性関与による大型血管閉塞性疾患（頸動脈脳卒中と称される）；脳内の小型終動脈の非アテローム硬化性狭窄であると考えられる小型血管閉塞性疾患；および通常は、心房細動または虚血性（アテローム硬化性）心疾患を背景とする心臓に由来する血餅による心原性脳卒中へと細分される（Adams, H.P., Jr. et al., Stroke 24, 35-41(1993)）。したがって、脳卒中は、一つの疾患ではないが、病原性機構の違いを反映する不均一な障害群であると考えられる（Alberts, M.J. Genetics of Cerebrovascular Disease, 386 (Futura Publishing Company, Inc., New York, 1999); Hassan, A. & Markus, H.S. Brain 123, 1784-812(2000)）。しかしながら、全ての形の脳卒中は、高血圧症、糖尿病、高脂血症および喫煙などのリスクファクターを共有している（Sacco, R.L. et al., Stroke 28, 1507-17(1997); Leys, D. et al., J. Neurol. 249, 507-17(2002)）。脳卒中の家族歴も、独立したリスクファクターであり、環境因子と相互作用することがありうる遺伝因子の存在を示唆する（Hassan, A. & Markus, H.S. Brain 123, 1784-812(2000); Brass, L.M. & Alberts, M.J. Baillieres Clin. Neurol. 4, 221-45(1995)）。
脳卒中の一般的な形の遺伝的決定因子は、依然としてほとんど知られていない。ＣＡＤＡＳＩＬ（皮質下梗塞および白質脳炎を伴う脳性常染色体優性動脈症）の場合の Notch ３遺伝子（Tournier-Lasserve, E. et al., Nat. Genet. 3, 256-9(1993); Joutel, A. et al., Nature 383, 707-10(1996)）、アミロイドーシスを伴うアイスランド型の遺伝性脳出血の場合の Cystatin Ｃ（Palsdottir, A. et al., Lancet 2, 603-4(1988)）、オランダ型の遺伝性脳出血の場合のＡＰＰ（Levy, E. et al., Science 248, 1124-6(1990)）および遺伝性海綿状血管腫を有する患者のＫＲＩＴ１遺伝子（Gunel, M. et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 92, 6620-4(1995); Sahoo, T. et al., Hum. Mol. Genet. 8, 2325-33(1999)）などの、希なメンデル形の脳卒中を引き起こす特異的遺伝子の突然変異例がある。これら希な形の脳卒中で、アテローム性動脈硬化症を背景として生じるものはなく、したがって、それら該当する遺伝子は、アテローム性動脈硬化症でしばしば生じる一般的な形の脳卒中において役割を果たしているとは考えられない。
脳卒中を予防する戦略を開発することは、医療システムにとって極めて重要である。いったん脳卒中が起こると、その脳卒中に影響される血管によって血液供給されているかなりの部分の脳において不可逆的細胞死が起こる。残念ながら、死んでいるニューロンは、生き返ることも、幹細胞集団から交換されることもできない。
Levy S., J Cardiovasc Electrophysiol. 8 Suppl, S78-82(1998) Fuster V., et al., Circulation.;104, 2118-2150(2001) Waldo, A., Progr Cardiovasc Disease, 48:41-56(2005) Prystowsky E.N., Am J Cardiol.; 85, 3D-11D(2000) van Walraven C, et al., Jama. 288, 2441-2448(2002) Connolly S., et al. Lancet.;367,1903-1912(2006)（２） Gage B.F. et al. Stroke 29, 1083-1091(1998) Go A.S. et al., Jama., 285, 2371-2375(2001)（３） Sacco, R.L. et al., Stroke 28, 1507-17(1997) Bonita, R., Lancet 339, 342-4(1992) Caplan, L.R. Caplan's Stroke: A Clinical Approach, 1-556 (Butterworth-Heinemann, 2000) Adams, H.P., Jr. et al., Stroke 24, 35-41(1993) Alberts, M.J. Genetics of Cerebrovascular Disease, 386 (Futura Publishing Company, Inc., New York, 1999) Hassan, A. & Markus, H.S. Brain 123, 1784-812(2000) Leys, D. et al., J. Neurol. 249, 507-17(2002) Brass, L.M. & Alberts, M.J. Baillieres Clin. Neurol. 4, 221-45(1995) Tournier-Lasserve, E. et al., Nat. Genet. 3, 256-9(1993) Joutel, A. et al., Nature 383, 707-10(1996) Palsdottir, A. et al., Lancet 2, 603-4(1988) Levy, E. et al., Science 248, 1124-6(1990) Gunel, M. et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 92, 6620-4(1995) Sahoo, T. et al., Hum. Mol. Genet. 8, 2325-33(1999)
したがって、まず第一に、脳卒中が起こるのを妨げる要求が存在する。本発明者は、脳卒中リスクを増加させる（上に挙げられた）一定の臨床的リスクファクターを既に承知しているが、より正確に脳卒中リスクを定義するために、脳卒中に関与する遺伝因子を定義する未だ満たされていない医学的要求が存在する。更に、素因を与える対立遺伝子が、一般的な集団において共通していて且つそれらの存在に基づいて疾患を予測する特異性が低い場合、疾患状態の傾向の有意義な予測のために、保護遺伝子座などの追加の遺伝子座が要求される。更に、既往脳卒中または一過性脳虚血発作に罹患した個体において、初回の脳卒中または追加の脳卒中を予防する治療薬への大きな要求が存在する。
ＡＦは、脳卒中への独立したリスクファクターであり、リスクを約５倍増加させる。ＡＦに起因する脳卒中のリスクは、年齢とともに増加する。ＡＦは、全ての脳卒中の約１５〜２０％に関与している。ＡＦは、更に、脳卒中再発および脳卒中重症度への独立したリスクファクターである。最近の報告では、ＡＦを有していたが、抗凝固薬で処置されなかった人々が、再発性脳卒中について２．１倍のリスク増加および再発性重症脳卒中について２．４倍のリスク増加を有していたことが分かった。ＡＦによる脳卒中を有していた人々は、他の原因による脳卒中を有していた人々と比較して、寝たきりになる可能性が２．２３倍と報告された。
ＡＦおよび脳卒中への増加した素因をもたらす感受性因子の理解への要求が存在する。ＡＦについてのリスク負担（at-risk）変異体の識別は、例えば、どの個体が、ＡＦおよび引き続きの脳卒中について特に高いリスクがあるかを評価するのに有用でありうる。更に、予防的処置は、ＡＦに罹患している個体およびＡＦおよび／または脳卒中についてのリスク負担感受性変異体の保有者である個体に投与することができる。最後に、ＡＦおよび／または脳卒中についてのリスク負担変異体の識別は、薬物療法への新しい標的の識別、更には、新規な治療的処置の開発をもたらすことができる。
本発明は、一定の遺伝マーカーが、心臓不整脈、具体的には、心房細動および心房粗動、および脳卒中に関連していることが分かったという発見に関する。この発見は、感受性の診断および／または決定の方法および手順、関連変異体の遺伝子型決定方法、治療薬への応答を予測する方法、予後を予測する方法、処置の進行を監視する方法、およびこのような方法に用いるためのシステムおよびキットに関して本明細書中に記載のいろいろな方法、手順、装置、媒体およびキットで利用することができる。
本発明の一つの側面は、ヒト個体の心臓不整脈または脳卒中への感受性を決定する方法であって、その個体からの核酸試料中の少なくとも一つの多型性マーカーの少なくとも一つの対立遺伝子の存在または不存在を決定することを含み、ここにおいて、少なくとも一つの多型性マーカーは、表５に示される多型性マーカーおよびそれと連鎖不平衡のマーカーより選択され、ここにおいて、少なくとも一つの対立遺伝子の存在または不存在の決定が、個体の心臓不整脈または脳卒中への感受性を示している方法に関する。一つの態様において、少なくとも一つの多型性マーカーは、本明細書中のＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：５０に示されるＬＤブロックＣ０４中に位置する。別の態様において、少なくとも一つの多型性マーカーは、表９に示されるマーカーおよびそれと連鎖不平衡のマーカーより選択される。一つの態様において、少なくとも一つのマーカーは、マーカーｒｓ２２２０４２７（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１）およびマーカーｒｓ１００３３４６４（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４１）、およびそれと連鎖不平衡のマーカーより選択される。別の態様において、少なくとも一つの多型性マーカーは、表１９に示されるマーカーより選択される。一つの態様において、その方法は、個体における少なくとも二つの多型性マーカーを含む少なくとも一つのハプロタイプを評価する工程を更に含む。
別の側面において、本発明は、ヒト個体の心臓不整脈または脳卒中への感受性を決定する方法であって、少なくとも一つの多型性マーカー中の少なくとも一つのリスク負担対立遺伝子が、その個体に由来する遺伝子型データセット中に存在するかどうかを決定することを含み、ここにおいて、少なくとも一つの多型性マーカーは、表５に示されるマーカーおよびそれと連鎖不平衡のマーカーより選択され、そしてここにおいて、少なくとも一つのリスク負担対立遺伝子の存在の決定が、個体の心臓不整脈または脳卒中への増加した感受性を示している方法に関する。
遺伝子型データセットは、一つの態様において、マーカー同一性についての情報、および少なくとも一つの多型性マーカーのための個体の対立遺伝子状態、すなわち、そのマーカーのための個体が有する二つの対立遺伝子の同一性についての情報および／またはある個体が、少なくとも一つの多型性マーカーのための具体的なリスク負担対立遺伝子の保有者であるかどうかについての情報を含む。遺伝子型データセットは、二つまたはそれを超えるマーカー、三つまたはそれを超えるマーカー、五つまたはそれを超えるマーカー、百またはそれを超えるマーカー等を含めた一つまたはそれを超えるマーカーについての対立遺伝子情報を含んでいてよい。若干の態様において、遺伝子型データセットは、何十万ものマーカーまたは百万またはそれを超えるマーカーさえも含めた個体の全ゲノム評価からの遺伝子型情報を含む。
本発明は、別の側面において、ヒト個体からの核酸を分析して、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：５０に示される配列を含むゲノム配列に関連した少なくとも一つの多型性マーカーの少なくとも一つの対立遺伝子またはハプロタイプの存在または不存在を決定する工程；および少なくとも一つのマーカーまたはハプロタイプの存在または不存在から、その個体の心臓不整脈または脳卒中の遺伝的指標の状態を決定する工程を含む手順に関する。したがって、個体の遺伝子型および／またはハプロタイプ状態は、その個体における心房細動および心房粗動を含めた心臓不整脈、更には、脳卒中の指標として用いられる。
本発明は、更に、ヒト個体の心臓不整脈または脳卒中への感受性を評価する方法であって、ヒト集団における心臓不整脈または脳卒中の増加した発生と相関しているＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：５０中の少なくとも一つの多型性マーカーまたはハプロタイプについて、その個体からの核酸をスクリーニングすることを含み；ここにおいて、核酸中の少なくとも一つの多型のリスク負担マーカー対立遺伝子またはリスク負担ハプロタイプの存在の決定が、その個体を、心臓不整脈および／または脳卒中への高い感受性を有すると識別し、そしてここにおいて、核酸中の少なくとも一つのリスク負担マーカー対立遺伝子またはリスク負担ハプロタイプの不存在が、その個体を、高い感受性を有していないと識別する方法に関する。
本発明の手順または方法は、一つの態様において、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：５０に示されるＬＤブロックＣ０４の相接する核酸フラグメントまたはその補体を含む少なくとも一つの多型性マーカーまたはハプロタイプを必要とし、ここにおいて、そのフラグメントは、５００ヌクレオチド未満のサイズであり、そしてＬＤブロックＣ０４の相補的（complimentary）セグメントに特異的にハイブリッド形成する。一つの態様において、そのフラグメントは、１５ヌクレオチドより大で且つ４００ヌクレオチド未満のサイズであり、そしてここにおいて、フラグメントは、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：５０に示されるＬＤブロックＣ０４の相補的（complimentary）セグメントに特異的にハイブリッド形成する。
別の態様において、多型性マーカーまたはハプロタイプによって与えられる感受性は、減少した感受性である、すなわち、本発明のマーカーおよびハプロタイプは、心房細動および心房粗動を含めた心臓不整脈および／または脳卒中を個体が発生する減少したリスクを与える。一つのこのような態様において、減少した感受性は、０．８未満のオッズ比（ＯＲ）または相対リスク（ＲＲ）を特徴とする。別の態様において、減少した感受性は、０．７未満のオッズ比（ＯＲ）を特徴とする。別の態様において、減少した感受性は、０．６未満のＯＲまたはＲＲを特徴とする。別の態様において、減少した感受性は、０．５未満のＯＲまたはＲＲを特徴とする。他の態様は、０．９、０．８５、０．７５、０．６５、０．５５等の値を含めたＯＲまたはＲＲの他の値に関する。
本発明の別の側面は、ヒト個体の心臓不整脈および／または脳卒中に関連した症状への感受性を評価する場合に用いるためのマーカーの識別方法であって、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：５０中の少なくとも一つの多型性マーカー、またはＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：５０中の少なくとも一つのマーカーと連鎖不平衡の少なくとも一つの多型性マーカーを含み、心臓不整脈および／または脳卒中と診断された個体の試料の遺伝子型状態および対照個体の試料の遺伝子型状態を決定し、ここにおいて、対照試料中の少なくとも一つの対立遺伝子の頻度と比較したところ、心臓不整脈および／または脳卒中と診断された個体の少なくとも一つの多型における少なくとも一つの対立遺伝子の頻度の有意差が、心臓不整脈および／または脳卒中への感受性を評価するのに有用である少なくとも一つの多型を示している方法に関する。一つの態様において、対照試料中の少なくとも一つの対立遺伝子の頻度と比較したところ、心臓不整脈および／または脳卒中と診断された個体の少なくとも一つの多型における少なくとも一つの対立遺伝子の頻度の増加は、心臓不整脈への増加した感受性を評価するのに有用である少なくとも一つの多型を示している。別の態様において、対照試料中の少なくとも一つの対立遺伝子の頻度と比較したところ、心臓不整脈および／または脳卒中と診断された個体の少なくとも一つの多型における少なくとも一つの対立遺伝子の頻度の減少は、心臓不整脈および／または脳卒中への減少した感受性またはそれに対する防御を評価するのに有用である少なくとも一つの多型を示している。好ましい態様において、頻度の有意差は、統計的尺度を特徴とする。一つの態様において、統計的尺度は、Ｐ値である。具体的な態様において、有意のＰ値は、０．０５未満、０．０１未満、０．００１未満、０．０００１未満、０．００００１未満、０．０００００１未満、０．００００００１未満または０．０００００００１未満である。他の態様において、有意差は、具体的な信頼区間（ＣＥ）値でのオッズ比（ＯＲ）または相対リスク（ＲＲ）を特徴とする。
別の側面において、本発明は、ヒト個体から得られた核酸試料の遺伝子型決定方法であって、試料中の心臓不整脈および／または脳卒中の増加したリスクを予測する少なくとも一つの多型性マーカーの少なくとも一つの対立遺伝子の存在または不存在を決定することを含み、ここにおいて、少なくとも一つのマーカーは、表５に示されるマーカーおよびそれと連鎖不平衡のマーカーより選択され、そしてここにおいて、少なくとも一つの多型性マーカーの少なくとも一つの対立遺伝子の存在または不存在の決定が、その個体の心臓不整脈および／または脳卒中の増加したリスクを予測している方法に関する。一つの態様において、遺伝子型決定は、対立遺伝子特異的プローブハイブリダイゼーション、対立遺伝子特異的プライマー伸長、対立遺伝子特異的増幅、核酸配列決定、５’−エキソヌクレアーゼ消化、分子標識検定（molecular beacon assay）、オリゴヌクレオチド連結検定、サイズ分析および一本鎖コンホメーション分析より選択される方法を用いて行う。好ましい態様において、その方法は、対立遺伝子特異的プローブハイブリダイゼーションを含む。遺伝子型決定方法は、好ましくは、少なくとも一つの多型性マーカーを含む核酸のセグメントを、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）により、その少なくとも一つの多型性マーカーに隣接するヌクレオチドプライマー対を用いて増幅させることを含む。好ましい遺伝子型決定方法において、次の工程：
１．核酸のコピーと、検出オリゴヌクレオチドプローブおよびエンハンサーオリゴヌクレオチドプローブとを、そのオリゴヌクレオチドプローブと核酸との特異的ハイブリダイゼーション条件下で接触させ；ここにおいて、
（ａ）検出オリゴヌクレオチドプローブは、５〜１００ヌクレオチド長さであり、そして少なくとも一つの多型性部位を含むＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：５０によってヌクレオチド配列が与えられている核酸の第一セグメントに特異的にハイブリッド形成し；
（ｂ）検出オリゴヌクレオチドプローブは、その３’末端に検出可能標識およびその５’末端にクエンチング部分を含み；
（ｃ）エンハンサーオリゴヌクレオチドは、５〜１００ヌクレオチド長さであり、そして双方のオリゴヌクレオチドが核酸にハイブリッド形成した時に、エンハンサーオリゴヌクレオチドが、検出オリゴヌクレオチドプローブに相対して３’に位置するように、オリゴヌクレオチドプローブに相対して５’であるヌクレオチド配列の第二セグメントに相補的であり；そして
（ｄ）オリゴヌクレオチドプローブおよびエンハンサーオリゴヌクレオチドプローブが双方とも核酸にハイブリッド形成した時に、それらオリゴヌクレオチド間に単一塩基ギャップが存在するように、第一セグメントと第二セグメントとの間に単一塩基ギャップが存在し；
２．検出プローブが核酸にハイブリッド形成した時に、検出プローブの３’末端から検出可能標識を切断するエンドヌクレアーゼで核酸を処理して、フリーの検出可能標識を放出させ；そして
フリーの検出可能標識を測定することを行い、ここにおいて、フリーの検出可能標識の存在は、検出プローブが、核酸の第一セグメントに特異的にハイブリッド形成するということを示し、そして多型性部位の配列を検出プローブの補体として示す。
本発明のもう一つの側面は、ヒト個体の心臓不整脈または脳卒中への感受性を決定する方法であって、個体から得られた核酸試料中の少なくとも一つの多型性マーカーの少なくとも一つの対立遺伝子の同一性を決定することを含み、ここにおいて、少なくとも一つのマーカーは、ＰＩＴＸ２遺伝子に関連したマーカーの群より選択され、ここにおいて、少なくとも一つの対立遺伝子の存在が、その個体の心臓不整脈または脳卒中への感受性を示している方法に関する。
本発明の若干の態様は、心房細動、心房粗動または脳卒中についての少なくとも一つの追加のバイオマーカーを評価する追加の工程であって、それらマーカーからの遺伝情報を組み合わせることで、心房細動、心房粗動または脳卒中についてのリスクアセスメントを与える追加の工程に関する。若干のこれら態様において、バイオマーカーは、遺伝的マーカーまたはハプロタイプ、すなわち、心房細動、心房粗動または脳卒中の増加したまたは減少したリスクに関係していることが示されたまたは関係していると考えられる遺伝的リスクファクターである。他の態様において、バイオマーカーは、タンパク質バイオマーカーである。そのタンパク質バイオマーカーは、若干の態様において、フィブリンＤダイマー、プロトロンビン活性化フラグメント１．２（Ｆ１．２）、トロンビン・アンチトロンビンIII複合体（ＴＡＴ）、フィブリノペプチドＡ（ＦＰＡ）、リポタンパク質結合ホスホリパーゼＡ２（ｌｐ−ＰＬＡ２）、βトロンボグロブリン、血小板因子４、Ｐ−セレクチン、フォンビルブラント因子、ナトリウム利尿促進（pro-natriuretic）ペプチド（ＢＮＰ）、マトリックスメタロプロテイナーゼ−９（ＭＭＰ−９）、ＰＡＲＫ７、ヌクレオシド二リン酸キナーゼ（ＮＤＫＡ）、τ、ニューロン特異的エノラーゼ、Ｂ型神経栄養増殖因子、アストログリアタンパク質Ｓ−１００ｂ、グリア線維酸性タンパク質、Ｃ反応性タンパク質、血清アミロイドＡ、マトリックスメタロプロテイナーゼ−９、血管および細胞内細胞接着分子、腫瘍壊死因子α、およびインターロイキン−１、−６および−８を含めたインターロイキンより選択される。一つの態様において、少なくとも一つのバイオマーカーには、前駆細胞が含まれる。具体的な態様において、二つ以上のバイオマーカーを決定する。好ましい態様において、バイオマーカーは、個体からの血漿中で測定する。他の態様は、更に、個体の心房細動、心房粗動または脳卒中のリスクアセスメント、診断または予後を判断する非遺伝情報を組み合わせることに関する。非遺伝情報は、年齢、疾患発症時の年齢、性別、民族、既往症診断、例えば、心臓不整脈（cardiag arrhythmia）（例えば、心房細動）および脳卒中の診断、個体の病歴、疾患の家族歴、生化学的測定値および臨床的測定値（例えば、血圧、血清脂質レベル）を含むことがありうる。いろいろな遺伝的マーカー、または非遺伝的マーカーを加えた遺伝的マーカーからのこのような組合せ情報の分析は、当業者に知られている方法によって可能である。一つの態様において、分析は、ロジスティック回帰によって全リスクを計算して行う。
本発明は、更に、ヒト個体の脳卒中について増加した感受性を診断する方法であって、（ａ）その個体が、心房細動、心房粗動または一過性脳虚血発作に関連した症状を経験しているかどうかを決定し；（ｂ）その個体からの核酸試料が、表５に示されるマーカーおよびそれと連鎖不平衡のマーカーより選択される少なくとも一つの多型性マーカーのリスク負担対立遺伝子の少なくとも一つのコピーを含むかどうかを決定する工程を含み；ここにおいて、心房細動、心房粗動および／または一過性脳虚血発作に関連した症状の存在、およびリスク負担対立遺伝子の少なくとも一つのコピーの存在が、脳卒中について増加した感受性を示している方法に関する。
本発明は、一つの側面において、心臓不整脈および／または脳卒中に関連した症状を予防するおよび／または改善する治療薬への応答の確率について個体を評価する方法であって、個体から得られた核酸試料中の少なくとも一つの多型性マーカーの少なくとも一つの対立遺伝子の存在または不存在を決定することを含み、ここにおいて、少なくとも一つの多型性マーカーは、表９に示されるマーカーおよびそれと連鎖不平衡のマーカーより選択され、ここにおいて、少なくとも一つのマーカーの少なくとも一つの対立遺伝子の存在の決定が、心臓不整脈および／または脳卒中のための治療薬への正の応答の確率を示している方法に関する。
一つの態様において、治療薬は、抗凝固薬、抗不整脈薬、心拍数制御薬、心臓除細動薬または心臓律動制御薬である。別の態様において、治療薬は、ワルファリン、ヘパリン、低分子量ヘパリン、第Ｘａ因子阻害剤およびトロンビン阻害剤、ナトリウムチャンネル遮断薬、β遮断薬、カリウムチャンネル遮断薬およびカルシウムチャンネル遮断薬より選択される。
別の態様において、治療薬は、ワルファリン（warfaring）、ジメラガトラン（ximelagatran）、ヘパリン、エノキサパリン、ダルテパリン（dalteparin）、チンザパリン（tinzaparin）、アルデパリン（ardeparin）、ナドロパリン（nadroparin）、レビパリン（reviparin）、フォンダパリヌクス（fondaparinux）、イドラパリヌクス（idraparinux）、レピルジン（lepirudin）、ビバリルジン（bivalirudin）、アルガトロバン（argatroban）、ダナパロイド（danaparoid）、ジソピラミド、モリシジン（moricizine）、プロカインアミド、キニジン、リドカイン、メキシレチン、トカイニド、フェニトイン、エンカイニド、フレカイニド、プロパフェノン、アジマリン、シベンゾリン（cibenzoline）、デタジミウム（detajmium）、エスモロール（esmolol）、プロプラノロール、メトプロロール、アルプレノロール、アテノロール、カルベディロール、ビソプロロール（bisoprolol）、アセブトロール、ナドロール、ピンドロール（pindololol）、ラベタロール、オクスプレノトール（oxprenotol）、ペンブトロール、チモロール、ベタキソロール、カルテロール（cartelol）、ソタロール（sotalol）、レボブノロール、アミオダロン（amiodarone）、アジミリド（azimilide）、ブレチリウム、ドフェチリド（dofetilide）、テジサミル（tedisamil）、イブチリド（ibutilide）、セマチリド（sematilide）、Ｎ−アセチルプロカインアミド、ニフェカラント塩酸塩（nifekalant hydrochloride）、ベルナカラント（vernakalant）、アンバシリド（ambasilide）、ベラパミル、ミベフラジル（mibefradil）、ジルチアゼム、ジゴキシン、アデノシン、イブチリド、アミオダロン、プロカインアミド、プロファフェノン（profafenone）およびフレカイニドより選択される。
本発明のまた別の側面は、心臓不整脈および／または脳卒中と診断された個体の予後を予測する方法であって、個体から得られた核酸試料中の少なくとも一つの多型性マーカーの少なくとも一つの対立遺伝子の存在または不存在を決定することを含み、ここにおいて、少なくとも一つの多型性マーカーは、表９に示されるマーカーおよびそれと連鎖不平衡のマーカーより選択され、ここにおいて、少なくとも一つの対立遺伝子の存在の決定が、その個体の心臓不整脈および／または脳卒中の一層悪い予後を示している方法に関する。
心臓不整脈および／または脳卒中のための処置を受けている個体の処置の進行を監視する方法も、本発明の範囲内であり、それら方法は、個体から得られた核酸試料中の少なくとも一つの多型性マーカーの少なくとも一つの対立遺伝子の存在または不存在を決定することを含み、ここにおいて、少なくとも一つの多型性マーカーは、表９に示されるマーカーおよびそれと連鎖不平衡のマーカーより選択され、ここにおいて、少なくとも一つの対立遺伝子の存在の決定は、その個体の処置結果を示している。
本発明の具体的な態様において、例えば、本発明のいろいろな方法、使用、手順、装置およびキットにおいて、心臓不整脈表現型は、更に、心房細動または心房粗動であると特性決定される。本発明者は、本明細書中に記載のＡＦリスク負担変異体によって与えられるリスクが、発症年齢が早い個体について、発症年齢が遅い個体の場合よりも大きいということを確かめた。したがって、一つの態様において、心房細動または心房粗動は、８０歳未満の個体における発症年齢を更に特徴とする。別の態様において、心房細動または心房粗動は、７０歳未満の個体における発症年齢を更に特徴とする。また別の態様において、心房細動または心房粗動は、６０歳未満の個体における発症年齢を更に特徴とする。他の年齢画分も、本発明の別の態様において可能であるし且つ考えられ、７５歳未満、６５歳未満および５５歳未満の年齢画分が含まれるが、これに制限されるわけではない。更に、５５歳、６０歳、６５歳、７０歳、７５歳または８０歳より上の発症時または診断時年齢も、疾患の診断または症状または発症が起こる年齢範囲と同様に、考えられるし且つ本発明の範囲内であり、５０〜８０歳、５５〜７５歳、６０〜８０歳、６５〜７５歳等が含まれるが、これに制限されるわけではない。
本発明の一定の態様において、脳卒中は、更に、虚血性脳卒中として特性決定される。他の態様において、脳卒中表現型は、大動脈アテローム性動脈硬化症（ＬＡＡ）、心臓塞栓性（cardioembolic）脳卒中（ＣＥＳ）および小型血管疾患（ＳＶＤ）という虚血性脳卒中部分表現型の一つまたはそれを超えるものとして特性決定することができる。
本発明の具体的な態様において、連鎖不平衡（ＬＤ）は、特定の定量的画分によって定義される。本明細書中に詳細に記載のように、連鎖不平衡は、ｒ２および｜Ｄ’｜などの尺度によって定量的に決定することができる。結果として、本発明の一定の態様は、ｒ２および／または｜Ｄ’｜の具体的な値によって特定されるある一定範囲内の尺度による連鎖不平衡のマーカーに関する。一つのこのような態様において、ＬＤは、０．１より大のｒ２の数値を特徴とする。別の態様において、ＬＤは、０．１より大のｒ２の数値を特徴とする。別の態様において、ＬＤは、０．５より大のｒ２の数値を特徴とする。また別の態様において、ＬＤは、０．８より大のｒ２の数値を特徴とする。ｒ２の他の分画値も、本明細書中に更に詳細に記載のように考えられる。一定の態様において、ＬＤは、ｒ２および／または｜Ｄ’｜の一定の分画値を特徴とする。一つのこのような態様において、ＬＤは、０．２および０．８よりそれぞれ大のｒ２および／または｜Ｄ’｜の値を特徴とする。ＬＤのこれらおよび他の尺度の他の組合せおよび並べ替えは、本発明を実施するのに可能であるし、そして更に、考えられるし且つ本発明の範囲内である。
本発明の手順、使用または方法は、若干の態様において、心臓不整脈または脳卒中を発生する増加したリスクがあると確認された個体に、心臓不整脈または脳卒中を処置するまたは予防するのに、または心臓不整脈または脳卒中に関連した症状を予防するのに有効な少なくとも一つの治療薬を含む組成物を投与する工程を更に含む。したがって、本発明は、ある個体が、具体的な処置モジュールに適しているかどうかを決定するのに用いることができる。
本明細書中に記載のいろいろな方法および手順で用いるためのキットも、本発明の範囲内である。したがって、一つの側面において、本発明は、ヒト個体の心臓不整脈および／または脳卒中への感受性を評価するキットであって、個体のゲノム中において少なくとも一つの多型性マーカーの少なくとも一つの対立遺伝子を選択的に検出する試薬を含み、ここにおいて、多型性マーカーは、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：５０に配列が示されているセグメント内の多型性マーカーおよびそれと連鎖不平衡のマーカーから成る群より選択され、そしてここにおいて、少なくとも一つの対立遺伝子の存在が、心臓不整脈および／または脳卒中への感受性を示しているキットに関する。
一つの態様において、少なくとも一つの多型性マーカーは、表５に示されるマーカーより選択される。別の態様において、少なくとも一つの多型性マーカーは、表９に示されるマーカーおよびそれと連鎖不平衡のマーカーの群より選択される。別の態様において、少なくとも一つの多型性マーカーは、マーカーｒｓ２２２０４２７（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１）およびｒｓ１００３３４６４（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４１）、およびそれと連鎖不平衡のマーカーより選択される。一つの好ましい態様において、少なくとも一つの多型性マーカーは、表１９に示されるマーカーより選択される。別の好ましい態様において、少なくとも一つの多型性マーカーは、Ｄ４Ｓ４０６（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４５）、ｒｓ２６３４０７３（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３３）、ｒｓ２２００７３３（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２８）、ｒｓ２２２０４２７（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１）、ｒｓ１００３３４６４（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４１）およびｒｓ１３１４３３０８（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：５１）より選択される。一つの態様において、試薬は、少なくとも一つの多型性マーカーを含む個体のゲノムのフラグメントにハイブリッド形成する少なくとも一つの相接するオリゴヌクレオチド、緩衝剤および検出可能標識を含む。
別の態様において、試薬は、対象から得られたゲノム核酸セグメントの対向鎖にハイブリッド形成する少なくとも一対のオリゴヌクレオチドを含み、ここにおいて、各々のオリゴヌクレオチドプライマー対は、一つの多型性マーカーを包含する個体のゲノムのフラグメントを選択的に増幅させるように設計されていて、そしてここにおいて、そのフラグメントは、少なくとも３０塩基対サイズである。少なくとも一つのオリゴヌクレオチドは、好ましい態様において、個体のゲノムに完全に相補的である。一つの態様において、オリゴヌクレオチドは、約１８〜約５０ヌクレオチド長さである。別の態様において、オリゴヌクレオチドは、２０〜３０ヌクレオチド長さである。一つの好ましい態様において、キットは、
ａ．５〜１００ヌクレオチド長さである検出オリゴヌクレオチドプローブ；
ｂ．５〜１００ヌクレオチド長さであるエンハンサーオリゴヌクレオチドプローブ；および
ｃ．エンドヌクレアーゼ酵素
を含み；ここにおいて、検出オリゴヌクレオチドプローブは、少なくとも一つの多型性部位を含むＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２によってヌクレオチド配列が与えられている核酸の第一セグメントに特異的にハイブリッド形成し；ここにおいて、検出オリゴヌクレオチドプローブは、その３’末端に検出可能標識およびその５’末端にクエンチング部分を含み；ここにおいて、エンハンサーオリゴヌクレオチドは、５〜１００ヌクレオチド長さであり、そして双方のオリゴヌクレオチドが核酸にハイブリッド形成した時に、エンハンサーオリゴヌクレオチドは、検出オリゴヌクレオチドプローブに相対して３’に位置するように、オリゴヌクレオチドプローブに相対して５’であるヌクレオチド配列の第二セグメントに相補的であり；ここにおいて、オリゴヌクレオチドプローブおよびエンハンサーオリゴヌクレオチドプローブが双方とも核酸にハイブリッド形成した時に、それらオリゴヌクレオチド間に単一塩基ギャップが存在するように、第一セグメントと第二セグメントとの間に単一塩基ギャップが存在し；そしてここにおいて、エンドヌクレアーゼで核酸を処理することは、検出プローブが核酸にハイブリッド形成した時に、検出プローブの３’末端から検出可能標識を切断して、フリーの検出可能標識を放出するであろう。
心臓不整脈（例えば、ＡＦおよび心房粗動）および脳卒中のリスクを予測するものとして本明細書中に記載の多型性マーカーは、診断用マーカーとして有用である。側面において、本発明は、したがって、ヒト個体の心臓不整脈および／または脳卒中への感受性を診断するおよび／または評価するための診断用試薬の製造におけるオリゴヌクレオチドプローブの使用であって、ここにおいて、プローブは、少なくとも一つの多型性部位を含むＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：５０によってヌクレオチド配列が与えられている核酸のセグメントにハイブリッド形成し、ここにおいて、フラグメントは、１５〜５００ヌクレオチド長さである使用に関する。
一つのこのような態様において、多型性部位は、表５に示される多型性マーカーおよびそれと連鎖不平衡の多型性より選択される。別の態様において、少なくとも一つの多型性マーカーは、Ｄ４Ｓ４０６（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４５）、ｒｓ２６３４０７３（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３３）、ｒｓ２２００７３３（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２８）、ｒｓ２２２０４２７（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１）、ｒｓ１００３３４６４（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４１）およびｒｓ１３１４３３０８（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：５１）より選択される。
本明細書中に記載の疾患関連マーカーについての情報を蓄積する計算機読み取り可能媒体も、本発明の範囲内である。一つのこのような側面において、本発明は、計算機読み取り可能媒体であって、少なくとも一つの多型性マーカーのアイデンティファイアー；心房細動、心房粗動および／または脳卒中と診断された複数の個体における少なくとも一つの多型性マーカーの少なくとも一つの対立遺伝子の頻度の指標；および複数の基準個体における少なくとも一つの多型性マーカーの少なくとも一つの対立遺伝子の頻度の指標が蓄積されていて；ここにおいて、少なくとも一つの多型性マーカーは、表５に示される多型性マーカーおよびそれと連鎖不平衡の多型性より選択される計算機読み取り可能媒体に関する。好ましい態様において、少なくとも一つの多型性マーカーは、Ｄ４Ｓ４０６（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４５）、ｒｓ２６３４０７３（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３３）、ｒｓ２２００７３３（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２８）、ｒｓ２２２０４２７（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１）、ｒｓ１００３３４６４（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４１）およびｒｓ１３１４３３０８（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：５１）より選択される。
本発明は、更に、ヒト個体の心臓不整脈および／または脳卒中についての遺伝的指標を決定する装置であって、計算機読み取り可能メモリー；および計算機読み取り可能メモリーに蓄積されるルーチンを含み；ここにおいて、そのルーチンは、表５に示されるマーカーおよびそれと連鎖不平衡のマーカーより選択される少なくとも一つの多型性マーカーに関して、少なくとも一人のヒト個体の遺伝子型および／またはハプロタイプデータを分析し、そしてそのマーカーおよび／またはハプロタイプデータに基づく出力を生じるプロセッサーで実行されるように適応していて、ここにおいて、その出力は、少なくとも一つのマーカーまたはハプロタイプのリスク尺度を、ヒト個体の心臓不整脈および／または脳卒中の遺伝的指標として含む装置に関する。好ましい態様において、ルーチンは、心臓不整脈および／または脳卒中と診断された複数の個体における少なくとも一つの多型性マーカーの少なくとも一つの対立遺伝子および／または少なくとも一つのハプロタイプの頻度の指標、および複数の基準個体における少なくとも一つの多型性マーカーの少なくとも一つの対立遺伝子または少なくとも一つのハプロタイプの頻度の指標を決定し、そしてそれに基づく少なくとも一つの対立遺伝子および／またはハプロタイプのリスク尺度を計算することを更に含み；そしてここにおいて、個体のリスク尺度は、心房細動、心房粗動および／または脳卒中と診断された複数の個体の少なくとも一つのマーカーおよび／またはハプロタイプ情報について計算されたリスクへの、個体の少なくとも一つのマーカーおよび／またはハプロタイプ状態の比較に基づいて計算する。一定の態様において、リスク尺度は、本明細書中に更に詳細に記載のように、オッズ比（ＯＲ）または相対リスク（ＲＲ）を特徴とする。
本発明において発見された、記載のように心臓不整脈および脳卒中の感受性を予測するものとしての多型性マーカー、並びにそれと連鎖不平衡のマーカーは全て、本発明のいろいろな側面を実施するのに有用である。したがって、特定の多型性マーカーは、本発明者により、心臓不整脈（例えば、心房細動および心房粗動）および脳卒中への染色体４上の特定の領域の関連を検出するのに用いられたが、それらマーカーと強い連鎖不平衡のマーカーを評価することは、等しく有用である。結果として、本発明の方法、使用、キット、手順、装置および媒体の一つの態様において、本発明の方法または手順に有用な少なくとも一つの多型性マーカーまたはハプロタイプは、表５（例えば、表５Ａおよび表５Ｂ）に示されるマーカーおよびそれと連鎖不平衡のマーカーの少なくとも一つを含む。別の態様において、少なくとも一つの多型性マーカーまたはハプロタイプは、表９に示されるマーカーおよびそれと連鎖不平衡のマーカーの少なくとも一つを含む。一つの態様において、少なくとも一つの多型性マーカーまたはハプロタイプは、表５に示されるマーカーの少なくとも一つを含む。別の態様において、少なくとも一つの多型性マーカーまたはハプロタイプは、表９に示されるマーカーの少なくとも一つを含む。別の態様において、少なくとも一つの多型性マーカーは、表４に示されるマーカーより選択される。一つの態様において、少なくとも一つのマーカーは、マーカーｒｓ２２２０４２７（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１）およびマーカーｒｓ１００３３４６４（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４１）、およびそれと連鎖不平衡のマーカーより選択される。別の態様において、少なくとも一つの多型性マーカーは、表１９に示されるマーカーより選択される。
一つの態様において、少なくとも一つのマーカーまたはハプロタイプは、マーカーＤ４Ｓ４０６（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４５）、ｒｓ２７２３２９６（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３５）、ｒｓ１６９９７１６８（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３６）、ｒｓ２７２３３１６（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３７）、ｒｓ６４１９１７８（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３８）、ｒｓ１４４８８１７（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３９）、ｒｓ２６３４０７３（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３３）、ｒｓ２２００７３３（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２８）、ｒｓ２２２０４２７（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１）、ｒｓ１３１０５８７８（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４０）、ｒｓ１００３３４６４（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４１）、ｒｓ１３１４１１９０（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４２）、ｒｓ３８５３４４４（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４３）およびｒｓ４５７６０７７（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４４）の少なくとも一つを含む。別の態様において、少なくとも一つのマーカーまたはハプロタイプは、マーカーＤ４Ｓ４０６（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４５）、ｒｓ２６３４０７３（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３３）、ｒｓ２２００７３３（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２８）、ｒｓ２２２０４２７（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１）、ｒｓ１００３３４６４（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４１）およびｒｓ１３１４３３０８（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：５１）の少なくとも一つを含む。また別の態様において、少なくとも一つのマーカーは、ｒｓ１００３３４６４、ｒｓ２２００７３３、ｒｓ１３１４３３０８およびｒｓ２２２０４２７、およびそれと連鎖不平衡のマーカーより選択される。
もう一つの態様において、マーカーＤ４Ｓ４０６の対立遺伝子−２、−４および／または−８、マーカーｒｓ２７２３２９６の対立遺伝子Ｇ、マーカーｒｓ１６９９７１６８の対立遺伝子Ｔ、マーカーｒｓ２７２３３１６の対立遺伝子Ｔ、マーカーｒｓ６４１９１７８の対立遺伝子Ａ、マーカーｒｓ１４４８８１７の対立遺伝子Ｇ、マーカーｒｓ２６３４０７３の対立遺伝子Ａ、マーカーｒｓ２２００７３３の対立遺伝子Ｔ、マーカーｒｓ２２２０４２７の対立遺伝子Ｔ、マーカーｒｓ１３１０５８７８の対立遺伝子Ｃ、マーカーｒｓ１００３３４６４の対立遺伝子Ｔ、マーカーｒｓ１３１４１１９０の対立遺伝子Ａ、マーカーｒｓ３８５３４４４の対立遺伝子Ａ、および／またはマーカーｒｓ４５７６０７７の対立遺伝子Ｔの存在は、個体の心臓不整脈または脳卒中への増加した感受性を示している。
本発明の具体的な態様において、リスク負担変異体（すなわち、多型性マーカー（例えば、ＳＮＰ）における特定の対立遺伝子、または特定のハプロタイプ）によって与えられる感受性は、増加した感受性である、すなわち、本発明のマーカーおよびハプロタイプは、心房細動および心房粗動を含めた心臓不整脈および脳卒中を個体が発生する増加したリスクを与える。感受性は、典型的に、尺度オッズ比（ＯＲ）、または或いは、相対リスク（ＲＲ）を特徴とする。一つの態様において、増加した感受性は、少なくとも１．３のオッズ比（ＯＲ）を特徴とする。別の態様において、増加した感受性は、少なくとも１．４のオッズ比（ＯＲ）を特徴とする。別の態様において、増加した感受性は、少なくとも１．５のオッズ比（ＯＲ）を特徴とする。別の態様において、増加した感受性は、少なくとも１．６のオッズ比（ＯＲ）または相対リスク（ＲＲ）を特徴とする。また別の態様において、増加した感受性は、少なくとも１．８のオッズ比（ＯＲ）または相対リスク（ＲＲ）を特徴とする。他の態様は、１．２５、１．３５、１．４５、１．５５等の値を含めたＯＲの他の値またはＲＲの比較しうる値に関する。
本発明の一定の態様は、特定の民族または家系の個体に関する。一つのこのような態様において、ヒト個体は、黒色アフリカ民族、アジア民族、コーカサス民族、ヒスパニック民族およびアラビア民族より選択される家系を有する。具体的な態様において、民族は、自己報告される。他の態様において、家系は、特定の民族特異的遺伝マーカーの評価によって決定される。
本発明の前述のおよび他の目的、特徴および利点は、本発明の好ましい態様についての次の更に具体的な説明から明らかであろう。
図１は、ＣＥＰＨ集団についての本発明の変異体を含む領域の連鎖不平衡（ＬＤ）のプロットを示す（HapMap データ）。ＬＤブロックＣ０４（染色体４、ＮＣＢＩ Build ３５上の１１１，９５４，８１１〜１１２，１０４，２５０位）を、図面上に黒四角で示す。そのプロットは、ＬＤの二つの尺度、すなわち、図１の左上部分のＤ’および図の右下部分のｒ２を示す。 図２は、ＬＤブロック内の関連領域におけるハプロタイプ構造の概略図を示す。暗色（左）円の面積は、アイスランド型ハプロタイプのハプロタイプ頻度に比例し、明色（右）円の面積は、香港型のハプロタイプ頻度に比例する。グラフの中央に示される中間ハプロタイプは、二つの集団のどちらにも、もはや確実に存在しない（その推定頻度は、遺伝子型決定誤差から区別不能である０．２％未満である）。 図３は、ｒｓ２２００７３３およびｒｓ１００３３４６４の２００ｋｂゲノム隣接部の概観である。それは、予測されるＥＳＴ、ＣＥＵ ＨａｐＭａｐ試料中の同等ＳＮＰの主な三クラスの位置およびいろいろな民族ＨａｐＭａｐ試料中の領域のＬＤ構造の概観を包含する。 図４は、ヒト心臓および大動脈におけるＰＩＴＸ２発現のノーザンブロット分析を示す。ＰＩＴＸ２ ｃＤＮＡクローンＨＵ３＿ｐ９８３Ｅ０３２７Ｄを、プローブとして用い、そして左心房および大動脈においてそれぞれ、１．８ｋｂ、２ｋｂおよび３ｋｂの転写物および２．２ｋｂおよび３ｋｂの転写物を検出した。レーン１：胎児心臓、レーン２：心臓全体、レーン３：大動脈、レーン４：心尖、レーン５：左心房、レーン６：右心房、レーン７：左心室、レーン８：右心室。ブロットを、ＰＩＴＸ２ ｃＤＮＡクローン（ＨＵ３＿ｐ９８３Ｅ０３２７Ｄ）でプローブした。
本発明の好ましい態様の説明を続ける。
定義
次の用語は、本文中において、次に示される意味を有するものである。
本明細書中に記載の心房細動（ＡＦ）は、確定された医学判定基準にしたがって一般的に定義されるＡＦを意味する。ＡＦは、クラス１４８のＩＣＤ−１０およびクラス４２７．３のＩＣＤ−９で分類される。
本明細書中に記載の心房粗動（ＡＦＩ）は、確定された医学判定基準にしたがって一般的に定義されるＡＦＩを意味する。ＡｆＩは、ＩＣＤ−１０クラス１４８およびクラス４２７．３のＩＣＤ−９で分類される。
本明細書中に記載の、時々、「マーカー」と称される「多型性マーカー」は、ゲノム多型性部位を意味する。各々の多型性マーカーは、特定の対立遺伝子に特有の少なくとも二つの配列変異をその多型性部位に有する。したがって、多型性マーカーへの遺伝的関連とは、その特定の多型性マーカーの少なくとも一つの特定の対立遺伝子に関連があるということを意味する。そのマーカーは、ＳＮＰ、マイクロサテライト、挿入、欠失、重複および転座を含めた、ゲノム中で見出されるいずれかの変異タイプのいずれの対立遺伝子も含むことができる。
「対立遺伝子」は、染色体上のある与えられた遺伝子座（位置）のヌクレオチド配列を意味する。したがって、多型性マーカー対立遺伝子は、染色体上のマーカーの組成（配列）を意味する。ある個体からのゲノムＤＮＡは、いずれか与えられた多型性マーカーについて、各々の染色体上のマーカーの各々のコピーを代表する二つの対立遺伝子を含有する。
ある集団（自然集団かまたは合成集団、例えば、合成分子のライブラリー）において二つ以上の配列が可能であるヌクレオチド位置を、本明細書中において「多型性部位」と称する。
「一塩基多型（Single Nucleotide Polymorphism）」または「ＳＮＰ」は、ゲノム中の特定の位置における一つのヌクレオチドが、種のメンバー間でまたはある個体の対合染色体間で異なる場合に存在するＤＮＡ配列変異である。大部分のＳＮＰ多型は、二つの対立遺伝子を有する。各々の個体は、この場合、その多型の一つの対立遺伝子についてホモ接合性である（すなわち、個体の染色体コピーは双方とも、ＳＮＰ位置に同じヌクレオチドを有する）かまたは、その個体はヘテロ接合性である（すなわち、個体の二つの姉妹染色体は、異なったヌクレオチドを含有する）。本明細書中で報告されるＳＮＰ命名は、National Center for Biotechnological Information（ＮＣＢＩ）によって独特のＳＮＰ各々に帰属する公式 Reference ＳＮＰ（ｒｓ）ＩＤ識別タグを意味する。
本明細書中に記載の「変異体」は、基準ＤＮＡとは異なるＤＮＡのセグメントを意味する。本明細書中に記載の「マーカー」または「多型性マーカー」は、変異体である。基準とは異なる対立遺伝子を、「変異体」対立遺伝子と称する。
「マイクロサテライト」は、２〜８ヌクレオチド長さである小さい多重塩基反復配列（ＣＡ反復配列など）を特定の部位に有する多型性マーカーであり、この場合、反復配列長さ数は、一般的な集団において異なる。「インデル（indel）」は、典型的に、僅か数ヌクレオチド長さである小さい挿入または欠失を含む多型の一般的な形である。
本明細書中に記載の「ハプロタイプ」は、ゲノムＤＮＡのセグメントであって、そのセグメントに沿って配置された特定の対立遺伝子組合せを特徴とするゲノムＤＮＡのセグメントを意味する。ヒトなどの二倍体生物について、ハプロタイプは、各々の多型性マーカーまたは遺伝子座の対立遺伝子の対の一方のメンバーを含む。一定の態様において、ハプロタイプは、二つまたはそれを超える対立遺伝子、三つまたはそれを超える対立遺伝子、四つまたはそれを超える対立遺伝子、または五つまたはそれを超える対立遺伝子を含むことができる。
本明細書中に記載の「感受性」という用語は、増加した感受性および減少した感受性双方を包含する。したがって、本発明の具体的な多型性マーカーおよび／またはハプロタイプは、１より大の相対リスク（ＲＲ）またはオッズ比（ＯＲ）を特徴とするような、心房細動または脳卒中の増加した感受性（すなわち、増加したリスク）に特有でありうる。或いは、本発明のマーカーおよび／またはハプロタイプは、１未満の相対リスクを特徴とするような、心房細動または脳卒中の減少した感受性（すなわち、減少したリスク）に特有である。
「核酸試料」は、核酸を含有する個体から得られた試料である。一定の態様、すなわち、特定の多型性マーカーおよび／またはハプロタイプの検出において、核酸試料は、ゲノムＤＮＡを含む。このような核酸試料は、血液試料、羊水試料、脳脊髄液試料、または皮膚、筋肉、頬または結膜粘膜、胎盤、胃腸管または他の器官からの組織試料として含まれる、ゲノムＤＮＡを含有するいずれかの源から得ることができる。
「心房細動および／または脳卒中治療薬」という用語は、本明細書中に更に詳細に記載の、心房細動（ＡＦ）、心房粗動（ＡＦＩ）または脳卒中に関連した症状を改善するまたは予防するのに用いることができる物質を意味する。
本明細書中に記載の「心臓不整脈（例えば、心房細動または心房粗動）および／または脳卒中に関連した核酸」という用語は、心臓不整脈、例えば、心房細動（ＡＦ）、心房粗動（ＡＦＩ）または脳卒中に関連していることが判明した核酸を意味する。これには、本明細書中に記載のマーカーおよびハプロタイプ、およびそれと強い連鎖不平衡（ＬＤ）のマーカーおよびハプロタイプが含まれるが、これに制限されるわけではない。一つの態様において、心房細動、心房粗動または脳卒中に関連した核酸は、心房細動および脳卒中に関連していることが判明したＬＤブロックＣ０４を意味する。別の態様において、心房細動、心房粗動または脳卒中に関連した核酸は、ＰＩＴＸ２遺伝子を意味する。
本明細書中に記載の「ＬＤブロックＣ０４」という用語は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：５０に示されるゲノム配列を含む、ＮＣＢＩ（National Center for Biotechnological Information）Build ３５の染色体４上の１１１，９５４，８１１〜１１２，１０４，２５０位の連鎖不平衡（ＬＤ）ブロックを意味する。
本明細書中に記載の「フラグメント」という用語は、核酸またはタンパク質配列のセグメントを意味する。フラグメントは、それらの基準点より小さいサイズを有する、すなわち、１０００ヌクレオチドサイズである基準核酸分子のフラグメントは、１０００ヌクレオチドサイズより小さい。本発明の核酸フラグメントは、それらの基準ヌクレオチドでかまたはそのヌクレオチドフラグメントの実用性で定義される上限を伴って、一般的には、５ヌクレオチドより大のサイズであり、典型的には、１５ヌクレオチドより大のサイズである。例えば、本発明の若干の態様において、ハイブリダイゼーションプローブとして有用なヌクレオチドフラグメントは、１５ヌクレオチドより大で且つ約５００ヌクレオチド未満のサイズである。他のサイズ範囲は、本発明の他のヌクレオチドフラグメントおよびタンパク質またはペプチドフラグメントに当てはまるであろう。
本明細書中に記載の「ＰＩＴＸ２」という用語は、染色体４ｑ２５上の対合様ホメオドメイン転写因子２遺伝子を意味する。この遺伝子は、下垂体ホメオボックス２（ＰＴＸ２）、リーグビコイド（rieg bicoid）関連ホメオボックス転写因子１（ＲＩＥＧ１）、ソルルシン（solurshin）およびａｌｌ−１応答遺伝子１（ＡＲＰ１）とも称される。
本発明は、ヒトゲノムの染色体４ｑ２５上の一定の多型性マーカーが、心臓不整脈および脳卒中に関連していることが判明したという知見に関する。本発明の具体的な態様において、染色体４ｑ２５にある多型性マーカーは、心臓不整脈、心房細動（ＡＦ）および心房粗動（ＡＦＩ）および脳卒中に関連している。これら知見は、本明細書中に更に詳細に記載の、診断方法および治療方法、使用、キットおよびシステムの開発について重要性および不測の関連性を有する。
ＡＦへの感受性を与える遺伝子変異体についてのゲノム幅走査において、染色体４ｑ２５上のいくつかのマーカーは、ＡＦに関連していることが判明した。最も有意の関連は、マーカーｒｓ２２２０４２７およびｒｓ２２２０７３３について判明したが、その双方とも、ＡＦについて１０−９に近いｐ値（表２）および脳卒中へのより小さいが、名目上は有意の関連（表３）を生じた。大多数のマーカーは、マイクロサテライトマーカーＤ４Ｓ４０６（表１）および多数のＳＮＰマーカー（表４）を含めたこれらマーカーの完全な代用物として識別された。
それら結果の更なる推考は、関連シグナルが、遺伝的には、ｒｓ２２００７３３およびｒｓ１００３３４６４のマーカー（表７）およびそれらマーカーと連鎖不平衡のマーカー（表９に挙げられているＳＮＰマーカーが含まれるが、これに制限されるわけではない）に集中すると考えられるということを示した。
アイスランド人集団における初めの知見は、独立したアイスランドＡＦ／ＡＦＩコホート、スウェーデンＡＦコホートおよび米国ＡＦコホートにおいて繰り返された（表７）。アイスランド人試料と組み合わせた場合、ｒｓ２２００７３３への関連は、明白であったし（ＯＲ＝１．７２、Ｐ＝３．３ｘ１０−４１）、そしてｒｓ１００３３４６４の有意性は、ゲノム幅有意性の閾値を十分に超えていた（ＯＲ＝１．３９、Ｐ＝６．９ｘ１０−１１）。増殖性モデルを仮定すると、組み合わされた二つの変異体の人口寄与リスク（ＰＡＲ）は、ヨーロッパ家系集団において約２０％である。更に、その関連は、香港からの中国ＡＦコホートにおいて繰り返された（表７）。
本発明者は、更に、アイスランド人試料についてのＡＦ／ＡＦＩの診断時年齢が、ｒｓ２２００７３３およびｒｓ１００３３４６４という二つのＳＮＰと相関するということを発見した。したがって、診断は、ｒｓ２２００７３３のＴ対立遺伝子につき２．２８年早く、そしてｒｓ１００３３４６４のＴ対立遺伝子につき１．１０年早く行われる（同時Ｐ＝１．２９ｘ１０−６）。この作用は、より若い年齢で診断された者において最強である二つの変異体の関連によって現れるが、８０歳に達した後に診断された者でさえ、リスクは有意のままである（表８）。同様の発症時年齢作用は、米国コホートにおいて認められる（表８）。
本発明者は、更に、それら変異体とＡＦＩとの間に強い関連を認めたが、それは、ＡＦの場合よりもなお一層強いと考えられる。これは、ＡＦＩの診断を有するアイスランド人患者サブセット（Ｎ＝１１６）への関連によって示される（ｒｓ２２００７３３についてＯＲ＝２．６０、９５％信頼区間（ＣＩ）＝１．８３〜３．６８、Ｐ＝７．５ｘ１０−８、ｒｓ１００３３４６４についてＯＲ＝１．９４、９５％ＣＩ＝１．２６〜３．００、Ｐ＝０．００２８）。実際に、ｒｓ２２００７３３について、これら明確なＡＦＩ症例のＯＲは、ＡＦ表現型を有する症例の場合より有意に高いし（Ｐ＝０．００２６）、そしてｒｓ１００３３４６４については、ほぼ有意に高い（Ｐ＝０．０８４）。これらは、ＡＦおよびＡＦＩ双方が、ｒｓ２２００７３３およびｒｓ１００３３４６４というＳＮＰへの関連によって示される有意の遺伝的リスクファクターを有するという結果になる。
本発明者は、更に、ＡＦ／ＡＦＩに関連している変異体が、脳卒中、具体的には、虚血性脳卒中にも関連したということを確かめた（表２１）。マーカーｒｓ２２００７３３は、虚血性脳卒中においておよび虚血性脳卒中（ＩＳ）部分表現型心臓塞栓性脳卒中（ＣＥＳ）において有意に繰り返した。このマーカーおよびマーカーｒｓ１００３３４６４は双方とも、追加のアイスランドＩＳ症例および対照（全１，９４３例／２５，７０８対照）および４組の大規模ＩＳ症例／対照複製セット（４，２９４例／３，７０９対照）を遺伝子型決定後に、ＡＦが初期原因であるＣＥＳに最も強く関連していることが判明した（ｒｓ２２００７３３：ＯＲ＝１．５３、Ｐ＝１．５ｘ１０−１２；ｒｓ１００３３４６４：ＯＲ＝１．２７、Ｐ＝５．９ｘ１０−４）（表２１）。
ｒｓ２２００７３３およびｒｓ１００３３４６４を含有するＬＤブロックに存在する遺伝子は知られていない（図３）。そのＬＤブロックは、一つのスプライシングされたＥＳＴ（ＤＡ７２５６３１）および二つの単エクソンＥＳＴ（ＤＢ３２４３６４およびＡＦ１７０９１）を含有する。いろいろな組織からのｃＤＮＡライブラリーのＲＴ−ＰＣＲは、これらＥＳＴの発現を検出しなかった（表１６）。隣接する上流ＬＤブロック中に位置するＰＩＴＸ２遺伝子は、リスク変異体に最も近い遺伝子である。ＰＩＴＸ２遺伝子を含有するＬＤブロック中のいくつかのマーカーは、表１８に示されるように、ＡＦおよびＡＦＩへの関連を示すマーカーに相関する。したがって、ＰＩＴＸ２遺伝子中の変異体が、根本的な原因変異体であるという可能性がある。或いは、本明細書中に記載の本発明の変異体は、ＰＩＴＸ２の機能、安定性、発現、翻訳後修飾、スプライシング、メッセージ安定性に影響する、または他の手段により、心房細動、心房粗動および／または脳卒中に関連した症状の素因を与えるように遺伝子に影響するという可能性がある。この遺伝子によってコードされたタンパク質である対合様ホメオドメイン転写因子２は、それが、心臓の非対称的形態形成を支配することによって心臓発生に重要な役割を果たすことが知られているので、ＡＦ／ＡＦＩについての興味深い候補である（Franco, D., Trends Cardiovasc Med 13:157-63(2003)）。更に、マウスノックアウトモデルにおいて、Ｐｉｔｘ２は、左心房における洞房結節形成のデフォルト経路を抑制することが分かった。血液および脂肪組織などの容易に利用できる組織全てにおいて、ＰＩＴＸ２のｍＲＮＡ発現は極めて少なくて、遺伝子型と発現レベルとの間の相関の研究を妨げている。ＰＩＴＸ２の上流の次の遺伝子は、血管内皮におけるアンギオテンシンIIの分解に関与するアミノペプチダーゼであるＥＮＰＥＰである。この遺伝子は、より広範囲に発現されるが、ＡＦに関連した変異体は、血液または脂肪組織におけるその発現に相関を示さなかった。他の注釈付き遺伝子で、関連変異体の上流４００ｋｂ領域〜下流１．５Ｍｂ領域の範囲内に位置するものはない。
マーカーおよびハプロタイプの評価
集団内のゲノム配列は、個体が比較される時に同一ではない。むしろ、ゲノムは、そのゲノム中の多くの場所において個体間の配列変動を示す。配列中のこのような変異は、一般的に、多型と称され、そして各々のゲノム中には多数のこのような部位が存在する。例えば、ヒトゲノムは、平均して５００塩基対毎に生じる配列変異を示す。最も一般的な配列変異体は、ゲノム中の一つの塩基位置での塩基変異から成り、そしてこのような配列変異体または多型は、一般的に、一塩基多型（「ＳＮＰ」）と称される。これらＳＮＰは、一つの突然変異イベントで生じたと考えられ、したがって、通常は、各々のＳＮＰ部位に可能性がある二つの可能な対立遺伝子、すなわち、元の対立遺伝子および突然変異した対立遺伝子が存在する。自然の遺伝的浮動、そしておそらくは更に、選択的圧力のゆえに、元の突然変異は、いずれか与えられた集団においてその対立遺伝子の特定頻度を特徴とする多型を生じた。ヒトゲノム中では、マイクロサテライト、挿入、欠失、逆位およびコピー数変異を含めた多数の他のタイプの配列変異体が見出される。多型性マイクロサテライトは、小さい多重塩基反復配列（ＣＡ反復配列、相補鎖上のＴＧなど）を特定の部位に有し、この場合、反復配列長さ数は、一般的な集団において異なる。一般的に、多型性部位に関する配列の変型は各々、多型性部位の特異的対立遺伝子である。これら配列変異体は全て、多型と称することができ、問題の配列変異体に特有の特異的多型性部位に存在する。一般的に、多型は、いずれか多数の特異的対立遺伝子を含むことができる。したがって、本発明の一つの態様において、多型は、いずれか与えられた集団における二つまたはそれを超える対立遺伝子の存在を特徴とする。別の態様において、多型は、三つまたはそれを超える対立遺伝子の存在を特徴とする。他の態様において、多型は、四つまたはそれを超える対立遺伝子、五つまたはそれを超える対立遺伝子、六つまたはそれを超える対立遺伝子、七つまたはそれを超える対立遺伝子、九つまたはそれを超える対立遺伝子、または十またはそれを超える対立遺伝子を特徴とする。このような多型は全て、本発明の方法およびキットで利用することができ、したがって、本発明の範囲内である。
若干の場合、多型性部位におけるいろいろな対立遺伝子を、基準対立遺伝子を選択することなく論及する。或いは、特定の多型性部位について、基準配列を論及することができる。基準対立遺伝子は、時々、「野生型」対立遺伝子と称されるが、それは、通常は、最初の配列決定された対立遺伝子としてかまたは、「非罹患」個体（例えば、形質または疾患表現型を示さない個体）からの対立遺伝子として選択される。
本明細書中で論じられるＳＮＰマーカーの対立遺伝子は、それらが、用いられるＳＮＰ検定において多型性部位に存在するので、Ａ、Ｃ、ＧまたはＴという塩基を意味する。本明細書中で用いられるＳＮＰの対立遺伝子コードは、次のように、１＝Ａ、２＝Ｃ、３＝Ｇ、４＝Ｔである。しかしながら、当業者は、対向ＤＮＡ鎖を検定するまたは読み取ることにより、各々の場合に、相補的対立遺伝子を測定することができるということを理解するであろう。したがって、Ａ／Ｇ多型を特徴とする多型性部位（多型性マーカー）について、用いられる検定は、可能な二つの塩基、すなわち、ＡおよびＧの一方または双方の存在を特異的に検出するように設計することができる。或いは、ＤＮＡ鋳型上の対向鎖を検出するように設計される検定を設計することにより、相補的塩基ＴおよびＣの存在を測定することができる。定量的には（例えば、相対リスクに関して）、どちらのＤＮＡ鎖（＋鎖または−鎖）の測定からも、同一結果が得られると考えられる。
典型的に、基準配列は、特定の配列について論じられる。基準とは異なる対立遺伝子は、時々、「変異体」対立遺伝子と称される。本明細書中で用いられる変異体配列は、基準配列とは異なるが、それ以外には実質的に同様である配列を意味する。本明細書中に記載の多型性遺伝マーカーにおける対立遺伝子は、変異体である。更に別の変異体には、ポリペプチドに影響する変化が含まれうる。基準ヌクレオチド配列と比較した場合の配列差には、一つのヌクレオチドまたは二つ以上のヌクレオチドの挿入または欠失であって、フレームシフトを生じるもの；少なくとも一つのヌクレオチドの変化であって、エンコードされたアミノ酸の変化を生じるもの；少なくとも一つのヌクレオチドの変化であって、未成熟停止コドンの生成を生じるもの；いくつかのヌクレオチドの欠失であって、それらヌクレオチドでエンコードされた一つまたはそれを超えるアミノ酸の欠失を生じるもの；一つまたはいくつかのヌクレオチドの、不等組換えまたは遺伝子変換によるなどの挿入であって、読み枠のコーディング配列の中断を生じるもの；全部または一部分の配列の重複；またはヌクレオチド配列の転位が含まれうる。このような配列変化は、核酸によってエンコードされたポリペプチドを変化させることがありうる。例えば、核酸配列中の変化が、フレームシフトを引き起こす場合、そのフレームシフトは、エンコードされたアミノ酸の変化を生じることがありうるし、および／または未成熟停止コドンの生成を生じて、短縮されたポリペプチドの生成を引き起こすことがありうる。或いは、疾患または形質に関連した多型は、一つまたはそれを超えるヌクレオチドの同義的変化（すなわち、アミノ酸配列の変化を生じない変化）でありうる。このような多型は、例えば、スプライス部位を変化させ、ｍＲＮＡの安定性または輸送に影響し、またはそれ以外には、エンコードされたポリペプチドの転写または翻訳に影響することがありうる。増幅または欠失などの構造変化が体細胞レベルで起こる可能性を増加させることも、ＤＮＡを変化させることがありうる。基準ヌクレオチド配列によってエンコードされたポリペプチドは、特定の基準アミノ酸配列を含む「基準」ポリペプチドであり、そして変異体対立遺伝子によってエンコードされたポリペプチドは、変異体アミノ酸配列を含む「変異体」ポリペプチドと称される。配列または基準配列は、二本鎖ＤＮＡの（＋）かまたは（−）方向を示すことができる。このような配列は、当業者に周知であるように、互いの逆補体であるような関係である。
ハプロタイプは、ＤＮＡのセグメントであって、そのセグメントに沿って配置された特定の対立遺伝子組合せを特徴とするＤＮＡのセグメントを意味する。ヒトなどの二倍体生物について、ハプロタイプは、各々の多型性マーカーまたは遺伝子座の対立遺伝子の対の一方のメンバーを含む。一定の態様において、ハプロタイプは、二つまたはそれを超える対立遺伝子、三つまたはそれを超える対立遺伝子、四つまたはそれを超える対立遺伝子、または五つまたはそれを超える対立遺伝子を含むことができ、各々の対立遺伝子は、セグメントに沿った特異的多型性マーカーに該当する。ハプロタイプは、多型性部位に特定の対立遺伝子を有するいろいろな多型性マーカーの組合せ、例えば、ＳＮＰおよびマイクロサテライトを含むことができる。したがって、ハプロタイプは、いろいろな遺伝マーカーにおける対立遺伝子の組合せを含む。
特異的多型性マーカーおよび／またはハプロタイプを検出することは、多型性部位における配列を検出することについて当該技術分野において知られている方法によって達成することができる。例えば、蛍光による技法（Chen, X. et al., Genome Res. 9(5): 492-98(1999)）のような、ＳＮＰおよび／またはマイクロサテライトマーカーの存在について遺伝子型決定する標準的な技法を、ＰＣＲ、ＬＣＲ、Nested ＰＣＲおよび他の核酸増幅の技法を利用して用いることができる。ＳＮＰ遺伝子型決定に利用可能な具体的な方法には、ＴａｑＭａｎ遺伝子型決定検定およびＳＮＰｌｅｘプラットホーム（Applied Biosystems）、質量分析（例えば、Sequenom からのＭａｓｓＡＲＲＡＹシステム）、ミニ配列決定法、リアルタイムＰＣＲ、Ｂｉｏ−Ｐｌｅｘシステム（BioRad）、ＣＥＱおよびＳＮＰｓｔｒｅａｍシステム（Beckman）、Molecular Inversion Probe アレイ技術（例えば、Affymetrix GeneChip）および BeadArray Technologies（例えば、Illumina GoldenGate and Infinium 検定）が含まれるが、これに制限されるわけではない。当業者に利用可能なこれらまたは他の方法により、マイクロサテライト、ＳＮＰまたは他のタイプの多型性マーカーを含めた多型性マーカーにおける一つまたはそれを超える対立遺伝子を識別することができる。
本明細書中に記載の一定の方法において、研究中のいずれか特定の疾患または形質について増加した感受性（すなわち、増加したリスク）がある個体は、その疾患または形質について増加した感受性を与える一つまたはそれを超える多型性マーカーにおける少なくとも一つの特異的対立遺伝子またはハプロタイプが識別されている（すなわち、リスク負担マーカー対立遺伝子またはハプロタイプ）個体である。一つの側面において、そのリスク負担マーカーまたはハプロタイプは、疾患または形質について有意に増加したリスク（または感受性）を与えるものである。一つの態様において、マーカーまたはハプロタイプに関連した有意性は、相対リスク（ＲＲ）によって測定される。別の態様において、マーカーまたはハプロタイプに関連した有意性は、オッズ比（ＯＲ）によって測定される。もう一つの態様において、有意性は、百分率で測定される。一つの態様において、有意の増加したリスクは、少なくとも１．２、少なくとも１．３、少なくとも１．４、少なくとも１．５、少なくとも１．６、少なくとも１．７、１．８、少なくとも１．９、少なくとも２．０、少なくとも２．５、少なくとも３．０、少なくとも４．０および少なくとも５．０が含まれるがこれに制限されるわけではない、少なくとも１．２のリスク（相対リスクおよび／またはオッズ比）として測定される。具体的な態様において、少なくとも１．２のリスク（相対リスクおよび／またはオッズ比）が有意である。別の具体的な態様において、少なくとも１．３のリスクが有意である。また別の態様において、少なくとも１．４のリスクが有意である。もう一つの態様において、少なくとも約１．５の相対リスクが有意である。別の追加の態様において、リスクの有意の増加は、有意である少なくとも約１．７である。しかしながら、他の画分、例えば、少なくとも１．１５、１．２５、１．３５等々も考えられ、そしてこのような画分も、本発明の範囲内である。他の態様において、リスクの有意の増加は、約２５％、３０％、３５％、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、１００％、１５０％、２００％、３００％および５００％が含まれるがこれに制限されるわけではない、少なくとも約２０％である。一つの具体的な態様において、リスクの有意の増加は、少なくとも２０％である。他の態様において、リスクの有意の増加は、少なくとも３０％、少なくとも４０％、少なくとも５０％、少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも９０％および少なくとも１００％である。しかしながら、当業者が本発明を特性決定するのに適すると考えられる他の画分または範囲が、更に考えられ、そしてそれらも、本発明の範囲内である。
本発明のリスク負担多型性マーカーまたはハプロタイプは、少なくとも一つのマーカーまたはハプロタイプの少なくとも一つの対立遺伝子が、疾患または形質（例えば、心臓不整脈または脳卒中）についてリスクがある（罹患した）個体において、比較群（対照）におけるその存在頻度と比較して、一層頻繁に存在するものであり、そしてここにおいて、マーカーまたはハプロタイプの存在は、疾患または形質への感受性を示している。対照群は、一つの態様において、集団試料、すなわち、一般的な集団からの無作為試料であってよい。別の態様において、対照群は、疾患のない個体群で代表される。このような疾患のない対照は、一つの態様において、一つまたはそれを超える特定の疾患関連症状の不存在を特徴することができる。別の態様において、疾患のない対照群は、一つまたはそれを超える疾患特異的リスクファクターの不存在を特徴する。このようなリスクファクターは、一つの態様において、少なくとも一つの環境リスクファクターである。代表的な環境因子は、特定の疾患または形質を発生するリスクに影響することが知られているまたは影響すると考えられる天然産物、鉱物または他の化学薬品である。他の環境リスクファクターは、飲食習慣、主な地理的居住場所および職業的リスクファクターが含まれるがこれに制限されるわけではない、ライフスタイルに関係したリスクファクターである。別の態様において、リスクファクターは、少なくとも一つの遺伝的リスクファクターである。
簡単な相関試験の一例としては、２ｘ２表での Fisher 正確検定が考えられる。ある染色体コホートを仮定すると、２ｘ２表は、マーカーまたはハプロタイプの双方を包含する、マーカーまたはハプロタイプの一方を包含するが他方を包含しない、そしてマーカーまたはハプロタイプのどちらも包含しない染色体の数から構築される。
本発明の他の態様において、疾患または形質について減少した感受性（すなわち、減少したリスク）がある個体は、その疾患または形質について減少した感受性を与える一つまたはそれを超える多型性マーカーまたはハプロタイプにおける少なくとも一つの特異的対立遺伝子が識別されている個体である。減少したリスクを与えるマーカー対立遺伝子および／またはハプロタイプは、保護的であるとも云われる。一つの側面において、保護的マーカーまたはハプロタイプは、疾患または形質について有意に減少したリスク（または感受性）を与えるものである。一つの態様において、有意に減少したリスクは、０．９未満、０．８未満、０．７未満、０．６未満、０．５未満、０．４未満、０．３未満、０．２未満および０．１未満が含まれるがこれに制限されるわけではない、０．９未満の相対リスクとして測定される。一つの具体的な態様において、有意に減少したリスクは、０．７未満である。別の態様において、有意に減少したリスクは、０．５未満である。また別の態様において、有意に減少したリスクは、０．３未満である。別の態様において、リスク（または感受性）の減少は、少なくとも２５％、少なくとも３０％、少なくとも３５％、少なくとも４０％、少なくとも４５％、少なくとも５０％、少なくとも５５％、少なくとも６０％、少なくとも６５％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％および少なくとも９８％が含まれるがこれに制限されるわけではない、少なくとも２０％である。一つの具体的な態様において、リスクの有意の減少は、少なくとも約３０％である。別の態様において、リスクの有意の減少は、少なくとも約５０％である。別の態様において、リスクの減少は、少なくとも約７０％である。しかしながら、当業者が本発明を特性決定するのに適すると考えられる他の画分または範囲が、更に考えられ、そしてそれらも、本発明の範囲内である。
当業者は、研究されている集団中に存在する二つの対立遺伝子を含むマーカーについて、そして一方の対立遺伝子が、その集団中のある形質または疾患を有する個体群において、対照と比較して増加した頻度で見出される場合、そのマーカーのもう一方の対立遺伝子は、その形質または疾患を有する個体群において、対照と比較して減少した頻度で見出されるであろうということを理解するであろう。このような場合、そのマーカーの一方の対立遺伝子（その形質または疾患を有する個体群において増加した頻度で見出されるもの）は、リスク負担対立遺伝子であろうが、もう一方の対立遺伝子は、保護的対立遺伝子であろう。
連鎖不平衡
各々の染色体対について、各々の部分イベント中に平均して１回生じる自然の組換え現象は、配列（および結果による生物学的機能）の変異を自然が与える一つの方法である。組換えは、ゲノム中で無作為に生じることはないということが発見されたが；むしろ、組換え率の頻度には、大きな変異が存在して、高い組換え頻度（組換えホットスポットとも称される）の小領域および低い組換え頻度の一層大きい領域を生じ、それらは、一般的に、連鎖不平衡（ＬＤ）ブロックと称される（Myers, S. et al., Biochem Soc Trans 34:526-530(2006); Jeffreys, A.J., et al., Nature Genet 29:217-222(2001); May, C.A., et al., Nature Genet 31:272-275(2002)）。
連鎖不平衡（ＬＤ）は、二つの遺伝要素の無作為でない類別を意味する。例えば、特定の遺伝要素（例えば、多型性マーカーの対立遺伝子、またはハプロタイプ）が、ある集団において０．２５（２５％）の頻度で生じ、そして別の要素が、０．２５（２５％）の頻度で生じる場合、双方の要素を有するヒトの予測発生率は、１．２５（１２．５％）であり、それら要素の無作為分布が考えられる。しかしながら、それら二つの要素が、０．１２５より高い頻度で一緒に生じることが発見される場合、それら要素は、それらの独立した発生頻度（例えば、対立遺伝子またはハプロタイプ頻度）が予測すると考えられるものより高い比率で一緒に遺伝する傾向があるので、それらは連鎖不平衡にあると云われる。大まかに云えば、ＬＤは、概して、二つの要素の間の組換えイベントの頻度と相関する。対立遺伝子またはハプロタイプ頻度は、ある集団において、集団中の個体を遺伝子型決定し且つその集団中の各々の対立遺伝子またはハプロタイプの発生頻度を決定することによって決定することができる。ヒト集団などの二倍体集団について、個体は、典型的に、各々の遺伝要素（例えば、マーカー、ハプロタイプまたは遺伝子）について二つの対立遺伝子を有するであろう。
連鎖不平衡（ＬＤ）の強さを評価するために、多数のいろいろな尺度が考えられた。大部分は、二重対立遺伝子部位の対の間の関連強さを捕捉する。ＬＤについての二つの重要な対に関する（pairwise）尺度は、ｒ２（時々、Δ２で表す）および｜Ｄ’｜である。双方の尺度は、０（不平衡なし）〜１（「完全」不平衡）であるが、それらの解釈は、僅かに異なる。｜Ｄ’｜は、ちょうど二つまたは三つの可能なハプロタイプが存在する場合、それが１であり、そして四つの可能なハプロタイプが全て存在する場合、それが＜１であるように定義される。したがって、＜１である｜Ｄ’｜の値は、二つの部位の間に歴史的組換えが生じていたたかもしれないということを示している（反復突然変異も、｜Ｄ’｜を＜１とすることがありうるが、一塩基多型（ＳＮＰ）について、これは、通常は、組換えよりも少ないであろうと考えられる）。ｒ２という尺度は、二つの部位の間の統計的相関を示し、そして二つのハプロタイプだけが存在する場合、１の値をとる。
ｒ２という尺度は、感受性遺伝子座とＳＮＰとの間の関連を検出するのに必要とされるｒ２と試料サイズとの間に、簡単な逆の関係が存在するので、おそらくは、関連地図作製に最も適切な尺度である。これら尺度は、対の部位について定義されるが、若干の用途には、多数の多型性部位を含有する領域全体にわたって、強いＬＤがどのようにあるかという決定が望まれると考えられる（例えば、ＬＤの強さは、遺伝子座の中でまたは集団で有意に異なるかどうか、またはある領域において、特定のモデルの下で予測されるよりも大きいまたは小さいＬＤが存在するかどうかを調べること）。ある領域にわたってＬＤを測定することは、簡単ではないが、一つのアプローチは、集団遺伝学において開発されたｒという尺度を用いることである。大まかに云えば、ｒは、ある特定の集団モデルの下で、データ中に認められるＬＤを生じるのにどれだけの組換えが必要と考えられるかを測定する。このタイプの方法は、ＬＤデータが、組換えホットスポットの存在について証拠を提供するかどうかを決定する問題への統計的に厳密なアプローチを与えることもできると考えられる。本明細書中に記載の方法および手順について、有意のｒ２値は、少なくとも０．１、０．１５、０．２、０．２５、０．３、０．３５、０．４、０．４５、０．５、０．５５、０．６、０．６５、０．７、０．７５、０．８、０．８５、０．９、０．９１、０．９２、０．９３、０．９４、０．９５、０．９６、０．９７、０．９８、０．９９または１．０などの、少なくとも０．１でありうる。一つの好ましい態様において、有意のｒ２値は、少なくとも０．２でありうる。或いは、本明細書中に記載の連鎖不平衡は、０．３、０．４、０．５、０．６、０．７、０．８、０．８５、０．９、０．９５、０．９６、０．９７、０．９８、０．９９などの、少なくとも０．２の｜Ｄ’｜値を特徴とする連鎖不平衡を意味する。したがって、連鎖不平衡は、異なったマーカーの対立遺伝子の間の相関を示す。それは、相関係数または｜Ｄ’｜（１．０までのｒ２および１．０までの｜Ｄ’｜）によって測定される。連鎖不平衡は、本明細書中に記載のように、単一ヒト集団において決定することができるし、またはそれは、二つ以上のヒト集団からの個体を含む試料の集合において決定することができる。本発明の一つの態様において、ＬＤは、定義のように（http://www.hapmap.org）、一つまたはそれを超えるＨａｐＭａｐ集団（コーカサス人、アフリカ人、日本人、中国人）からの試料において決定することができる。一つのこのような態様において、ＬＤは、ＨａｐＭａｐ試料のＣＥＵ集団において決定される。別の態様において、ＬＤは、ＹＲＩ集団において決定される。また別の態様において、ＬＤは、アイスランド人集団からの試料において決定される。
ゲノム中の全ての多型が、集団レベルで同一であった場合、関連研究においてそれらを一つずつ研究する必要があると考えられる。しかしながら、多型間の連鎖不平衡ゆえに、密に連鎖した多型は強く相関していて、それは、有意の関連を観察する関連研究において研究する必要がある多型の数を減少させる。ＬＤの別の結果は、多くの多型が、これら多型が強く相関しているという事実ゆえに、関連シグナルを与えることができるということである。
ゲノムＬＤ地図は、ゲノムに沿って作成されたが、このようなＬＤ地図は、疾患−遺伝子地図作製用の骨格として役立つと考えられた（Risch, N. & Merkiangas, K, Science 273:1516-1517(1996); Maniatis, N., et al., Proc Natl Acad Sci USA 99:2228-2233(2002); Reich, DE et al, Nature 411:199-204(2001)）。
現在、ヒトゲノムの多くの部分は、いくつかの一般的なハプロタイプを含有する別々のハプロタイプブロックの系列に入れることができるということが確かめられている；これらブロックについて、連鎖不平衡データは、組換えを示す証拠をほとんど与えない（例えば、Wall., J.D. and Pritchard, J.K., Nature Reviews Genetics 4:587-597(2003); Daly, M. et al., Nature Genet. 29:229-232(2001); Gabriel, S.B. et al., Science 296:2225-2229(2002); Patil, N. et al., Science 294:1719-1723(2001); Dawson, E. et al., Nature 418:544-548(2002); Phillips, M.S. et al., Nature Genet. 33:382-387(2003) を参照されたい）。
これらハプロタイプブロックを定義するための二つの主な方法が存在する：ブロックは、限られたハプロタイプ多様性を有するＤＮＡの領域として（例えば、Daly, M. et al., Nature Genet. 29:229-232(2001); Patil, N. et al., Science 294:1719-1723(2001); Dawson, E. et al., Nature 418:544-548(2002); Zhang, K. et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 99:7335-7339(2002) を参照されたい）、または連鎖不平衡を用いて識別される、広範囲の歴史的組換えを有するトランジション区域間の領域として（例えば、Gabriel, S.B. et al., Science 296:2225-2229(2002); Phillips, M.S. et al., Nature Genet. 33:382-387(2003); Wang, N. et al., Am. J. Hum. Genet. 71:1227-1234(2002); Stumpf, M.P., and Goldstein, D.B., Curr. Biol. 13:1-8(2003) を参照されたい）定義することができる。より最近になって、ヒトゲノムに沿った組換え率および該当するホットスポットの微細規模地図が作成された（Myers, S., et al., Science 310:321-32324(2005); Myers, S. et al., Biochem Soc Trans 34:526530(2006)）。その地図は、ホットスポットでは１０〜６０ｃＭ／Ｍｂ程度に高いが、介在領域では０に一層近い組換え率で、ゲノムに沿った組換えの極めて大きい変異を示し、それは、したがって、限られたハプロタイプ多様性および高ＬＤの領域を示している。その地図は、したがって、ハプロタイプブロック／ＬＤブロックを、組換えホットスポットが隣接した領域として定義するのに用いることができる。本明細書中で用いられる「ハプロタイプブロック」または「ＬＤブロック」という用語は、上記の特徴のいずれか、またはこのような領域を定義するのに当業者が用いる他の別の方法によって定義されるブロックを包含する。
ハプロタイプブロックは、単一のマーカー、または複数のマーカーを含むハプロタイプを用いて、表現型とハプロタイプ状態との間の関連を地図作製するのに用いることができる。主なハプロタイプは、各々のハプロタイプブロック中で識別することができ、そして次に、一組の「標識用（tagging）」ＳＮＰまたはマーカー（ハプロタイプの中で区別するのに必要な最小セットのＳＮＰまたはマーカー）を、引き続き識別することができる。次に、これら標識用ＳＮＰまたはマーカーは、表現型とハプロタイプとの間の関連を識別するために、個体の群からの試料の評価に用いることができる。所望ならば、隣接するハプロタイプブロックを、それらハプロタイプブロックの中に連鎖不平衡が存在することもありうるので、同時に評価することができる。
したがって、ゲノム中の多型性マーカーへのいずれか与えられた認められる関連について、ゲノム中の追加のマーカーも関連を示すと考えられるということが明らかになった。これは、組換え率の大きな変異によって認められるように、ゲノムに沿ったＬＤの不均一分布の自然の結果である。したがって、関連を検出するのに用いられるマーカーは、ある意味で、一定の疾患または形質に関連しているゲノム領域（すなわち、ハプロタイプブロックまたはＬＤブロック）のための「タグ（tags）」であり、そしてそのままで、本発明の方法およびキットに用いるのに有用である。一つまたはそれを超える原因となる（機能的）変異体または突然変異は、疾患または形質に関連していることが判明した領域内に存在することがありうる。このような変異体は、関連を検出するのに用いられる標識用マーカーについて認められるよりも高い相対リスク（ＲＲ）またはオッズ比（ＯＲ）を与えることがありうる。したがって、本発明は、本明細書中に記載の疾患への関連を検出するのに用いられるマーカー、並びに、それらマーカーと連鎖不平衡のマーカーに関する。したがって、本発明の一定の態様において、本明細書中に記載のような、本発明のマーカーおよび／またはハプロタイプとＬＤにあるマーカーは、代用マーカーとして用いることができる。それら代用マーカーは、一つの態様において、本明細書中に記載の疾患に関連していることが初期に判明したマーカーまたはハプロタイプの場合よりも小さい相対リスク（ＲＲ）および／またはオッズ比（ＯＲ）値を有する。他の態様において、それら代用マーカーは、本明細書中に記載の疾患に関連していることが初期に判明したマーカーについて初期に決定された値よりも大きいＲＲまたはＯＲ値を有する。このような態様の一例は、本明細書中に記載の変異体などの、疾患に関連していることが初期に判明した更に一般的な変異体（＞１０％の集団頻度）とＬＤの希なまたは比較的希な（＞１０％の対立遺伝子集団頻度）変異体であると考えられる。本明細書中に記載の、本発明者によって発見された関連を検出するためのこのようなマーカーを識別し且つ用いることは、当業者に周知の常套法によって行うことができ、したがって、本発明の範囲内である。
本明細書中において心臓不整脈（例えば、心房細動および心房粗動）および脳卒中に関連していることが示されたマーカーと連鎖不平衡の一定の多型性マーカーは、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：５０に示される配列によって本明細書中に定義のＬＤブロックＣ０４の物理的境界の外部に位置するということが可能である。これは、問題の領域中の歴史的組換え率の結果であり、それが、ブロック内のマーカーとＬＤのブロックの外部の残留マーカーで、強いＬＤ（ＬＤブロック）領域をもたらしたかもしれない。このようなマーカーも、本明細書中において心臓不整脈および脳卒中に関連していることが示されたマーカーとの遺伝的関係によって本発明を実施するのに有用であるので、それらも、本発明の範囲内である。このようなマーカーの例を、表１８に示す（ｒｓ７６６８３２２（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４６）、ｒｓ２１９７８１５（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４７）、ｒｓ６８３１６２３（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４８）、ｒｓ２５９１１０（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４９））。
ハプロタイプ頻度の決定
患者群および対照群におけるハプロタイプの頻度は、期待値最大化アルゴリズム（Dempster A. et al., J. R. Stat. Soc. B, 39:1-38(1977)）を用いて算定することができる。紛失遺伝子型およびその相での不明確を取り扱うことができるこのアルゴリズムの実行を用いることができる。帰無仮説の下では、患者および対照は、同一頻度を有すると仮定される。尤度アプローチを用いて、別の仮説を調べるが、その場合、本明細書中に記載のマーカーを包含しうるリスク負担ハプロタイプ候補は、患者の場合に、対照よりも高い頻度を有することが可能であるが、他のハプロタイプの頻度の比率は、双方の群で同じであると仮定される。尤度は、双方の仮説の下で別々に最大化され、そして該当する１−ｄｆ尤度比統計値を用いて、統計的有意性を評価する。
リスク負担および保護的マーカーおよびハプロタイプを連鎖領域内で探すには、例えば、遺伝子型決定されたマーカーの可能な組合せ全ての関連を研究するが、但し、それらマーカーは、実際的領域にわたっているという条件付きである。組合せの患者群および対照群は、元の患者群および対照群と等しいサイズで、二つの組に無作為に分けることができる。次に、マーカーおよびハプロタイプの分析を繰り返し、そして記録された最も有意のｐ値を決定する。この無作為化スキームを、例えば、１００回を超えて繰り返して、ｐ値の経験的分布を構築することができる。好ましい態様において、＜０．０５のｐ値は、有意のマーカーおよび／またはハプロタイプ関連を示している。
ハプロタイプ分析
ハプロタイプ分析への一つの一般的なアプローチは、ＮＥｓｔｅｄ ＭＯｄｅｌｓ（Gretarsdottir S., et al., Nat. Genet. 35:131-38(2003)）に適用された尤度に基づく推測を用いることを必要とする。その方法は、多数の多型性マーカー、ＳＮＰおよびマイクロサテライトについて可能であるＮＥＭＯプログラムで実行される。その方法およびソフトウェアは、異なったリスクを与えるハプロタイプ群を識別することが目的である症例対照研究のために具体的に設計される。それは、ＬＤ構造を研究するための手段でもある。ＮＥＭＯの場合、最尤推定値、尤度比およびｐ値は、ＥＭアルゴリズムを採用して、それを紛失データ問題として処理する観測データについて直接的に計算される。
相の不明確および紛失遺伝子型による情報損失を捕捉した観測データについて直接的に計算される尤度に基づく尤度比検定が、有効なｐ値を与えるのに信頼されうるとしても、不完全である情報ゆえにどれだけの情報が失われたかを知ることは、なお興味深いと考えられる。ハプロタイプ分析についての情報尺度は、Nicolae and Kong（Technical Report 537, Department of Statistics, University of Statistics, Nuiversity of Chicago; Biometrics, 60(2):368-75(2004)）に、連鎖分析について定義の情報尺度の自然伸長として記載され、そしてＮＥＭＯにおいて実行される。
ある疾患への単一マーカー関連について、Fisher 正確検定を用いて、個々の対立遺伝子各々の両側ｐ値を計算することができる。通常は、全てのｐ値は、具体的に示されない限り、多重比較用に未調整で示される。それら示される頻度（マイクロサテライト、ＳＮＰおよびハプロタイプについて）は、保有者頻度に対向する対立遺伝子頻度である。連鎖分析のために家族として補充された患者の関係性による何らかの偏りを最小限にするために、一親等および二親等は、患者リストから排除することができる。更に、その検定は、患者間のいずれか残っている関係性について補正する関連のために、Risch, N. & Teng, J.（Genome Res., 8:1273-1288(1988)）に記載の分散調整手順、兄弟姉妹についてＤＮＡプールすること（同書中）を拡大することによって反復することができるので、それは、一般的な家族関係に適用することができ、そして調整済みおよび未調整双方のｐ値を比較のために与えることができる。それら差は、概して、期待されるように極めて小さい。多重検定について補正された単一マーカー関連の有意性を評価するために、本発明者は、同じ遺伝子型データを用いて無作為化検定を行うことができる。患者および対照のコホートは、無作為化することができ、そして関連分析を多数回（例えば、５００，０００回まで）やり直し、そしてｐ値は、若干のマーカー対立遺伝子について、元の患者および対照コホートを用いて本発明者が認めたｐ値より低いまたはそれに等しいｐ値を生じた反復の分数である。
単一マーカーおよびハプロタイプ双方の分析について、相対リスク（ＲＲ）および人口寄与リスク（ＰＡＲ）は、増殖性モデル（ハプロタイプ相対リスクモデル）（Terwilliger, J.D. & Ott, J., Hum. Hered. 42:337-46(1992) および Falk, C.T. & Rubinstein, P, Ann. Hum. Genet. 51(Pt 3):227-33(1987)）、すなわち、一人につき二つの対立遺伝子／ハプロタイプのリスクが倍増する（carries multiply）ということを仮定して計算することができる。例えば、ＲＲが、ａに相対するＡのリスクである場合、ヒトホモ接合体ＡＡのリスクは、ヘテロ接合体ＡａのそれのＲＲ倍、そしてホモ接合体ａａのそれのＲＲ２倍であろう。その増殖性モデルは、分析および計算を簡単にする適切な性質を有する、すなわち、ハプロタイプは、罹患集団内で、更には、対照集団内で独立している、すなわち、Hardy−Weinberg 平衡にある。結果として、罹患集団および対照集団各々のハプロタイプ計数は、多項分布を有するが、別の仮説の下では異なったハプロタイプ頻度を有する。具体的には、二つのハプロタイプｈｉおよびｈｊについて、リスク（ｈｉ）／リスク（ｈｊ）＝（ｆｉ／ｐｉ）／（ｆｊ／ｐｊ）であり、式中、ｆおよびｐは、それぞれ、罹患集団の頻度および対照集団の頻度を示す。実際のモデルが増殖性でない場合、若干の能力損失が存在するが、その損失は、極端な場合を除いて、緩和である傾向がある。最も重要なことに、ｐ値は、ゼロ仮説に関して計算されるので、それらは常に有効である。
ＮＥＭＯを用いた連鎖不平衡
マーカー対の間のＬＤは、Ｄ’およびｒ２の標準的な定義を用いて計算することができる（Lewontin, R., Genetics 49:49-67(1964); Hill, W.G. & Robertson, A. Theor. Appl. Genet. 22:226-231(1968)）。ＮＥＭＯを用いると、二つのマーカー対立遺伝子組合せの頻度は、最大尤度によって算定され、そして連鎖平衡からの偏差は、尤度比検定によって評価される。Ｄ’およびｒ２の定義は、周辺対立遺伝子確率によって秤量される二つのマーカーの可能な対立遺伝子組合せ全てについてのそれら値を平均することによってマイクロサテライトを包含するように拡大される。全てのマーカー組合せをプロットして、特定の領域のＬＤ構造を解明する場合、本発明者は、左上隅にＤ’および右下隅にｐ値をプロットする。それらＬＤプロットにおいて、マーカーは、所望ならば、それらの物理的場所によるよりもむしろ、等距離にプロットすることができる。
リスクアセスメントおよび診断
本明細書中に記載のように、一定の多型性マーカーおよびこのようなマーカーを含むハプロタイプは、心臓不整脈（例えば、心房細動または心房粗動）または脳卒中のリスクアセスメントに有用であることが判明している。リスクアセスメントは、心臓不整脈（例えば、心房細動または心房粗動）または脳卒中への感受性を診断するためのマーカーの使用を必要とすることがありうる。多型性マーカーの具体的な対立遺伝子は、心臓不整脈（例えば、心房細動または心房粗動）または脳卒中を有する個体において、心臓不整脈（例えば、心房細動または心房粗動）または脳卒中の診断を伴わない個体の場合よりも頻繁に見出される。したがって、これらマーカー対立遺伝子は、ある個体において、心臓不整脈（例えば、心房細動または心房粗動）および／または脳卒中を検出するための予測値、または心臓不整脈（例えば、心房細動または心房粗動）または脳卒中への感受性を有する。本発明のマーカーなどの、リスク負担マーカーを含むハプロタイプブロックまたはＬＤブロック内の標識用マーカーは、ハプロタイプブロックまたはＬＤブロック内の他のマーカーおよび／またはハプロタイプの代用物として用いることができる。１に等しいｒ２値を有するマーカーは、リスク負担変異体の完全な代用物である、すなわち、一つのマーカーの遺伝子型は、他のものの遺伝子型を完璧に予測する。１より小さいｒ２値を有するマーカーも、リスク負担変異体の代用物でありうるし、または或いは、リスク負担変異体と同程度に高いまたはおそらくはそれよりなお一層高い相対リスク値を有する変異体でありうる。識別されるリスク負担変異体は、それ自体機能的変異体でなくてよいが、この場合、実際の機能的変異体と連鎖不平衡にある。本発明は、本明細書中に開示のマーカーのこのような代用マーカーの評価を包含する。このようなマーカーは、当業者に周知のように、注釈を付けられ、地図作製され、そして公的データベース中に挙げられている、または或いは、ある個体群において、本発明のマーカーによって識別された領域または領域の一部分を配列決定することによって容易に識別され、そして得られた配列群において多型を識別することができる。結果として、当業者は、容易に、しかも過度の実験を伴うことなく、本明細書中に記載のマーカーおよび／またはハプロタイプと連鎖不平衡の遺伝子型代用マーカーを識別することができる。検出されたリスク負担変異体とＬＤにある標識用または代用マーカーも、ある個体において、心臓不整脈（例えば、心房細動または心房粗動）および／または脳卒中への関連を検出するための予測値、または心臓不整脈（例えば、心房細動または心房粗動）または脳卒中への感受性を有する。本発明のマーカーとＬＤにあるこれら標識用または代用マーカーは、これらが、同様に、心臓不整脈（例えば、心房細動または心房粗動）および／または脳卒中への感受性を検出するための予測値を有するので、ハプロタイプの中で区別される他のマーカーを包含することもできる。
本発明のマーカーおよびハプロタイプ、例えば、表５および表９に示されるマーカー並びにそれと連鎖不平衡のマーカーは、単独でかまたは組合せで、リスクアセスメントおよび診断の目的に有用でありうる。したがって、個々のマーカーによるリスクの増加が、比較的大きくない、すなわち、１０〜３０％程度である場合でも、その関連は、有意の関連性を有することがありうる。したがって、比較的一般的な変異体は、全体リスクへの有意の寄与を有することがありうる（人口寄与リスクは高い）、またはマーカー組合せは、それらマーカーの組合せリスクに基づいて、疾患を発生する有意の組み合わせリスクがある個体群を定義するのに用いることができる。
したがって、本発明の一つの態様において、複数の変異体（マーカーおよび／またはハプロタイプ）は、全体リスクアセスメントに用いられる。これら変異体は、一つの態様において、本明細書中に開示の変異体より選択される。他の態様は、心臓不整脈（例えば、心房細動または心房粗動）および／または脳卒中への感受性を診断するのに有用であることが知られている他の変異体との組合せでの本発明の変異体の使用を包含する。このような態様において、複数のマーカーおよび／またはハプロタイプの遺伝子型状態は、ある個体において決定され、そしてその個体の状態を、関連変異体の集団頻度、または年齢対合対象および性別対合対象などの臨床的健康対照における変異体の頻度と比較する。多変量分析または同時リスク分析などの、当該技術分野において知られている方法は、引き続き、多重遺伝子座における遺伝子型状態に基づいて与えられる全体リスクを決定するのに用いることができる。このような分析に基づくリスクアセスメントは、引き続き、本明細書中に記載の本発明の方法およびキットに用いることができる。
上に記載のように、ヒトゲノムのハプロタイプブロック構造は、ある疾患または形質に元々関連した変異体と連鎖不平衡にある大多数の変異体（マーカーおよび／またはハプロタイプ）を、その疾患または形質への関連を評価するための代用マーカーとして用いることができるという作用を有する。このような代用マーカーの数は、その領域中の歴史的組換え率、領域中の突然変異頻度（すなわち、領域中の多型性部位またはマーカーの数）、および領域中のＬＤの程度（ＬＤブロックのサイズ）などの因子に依存するであろう。これらマーカーは、通常は、本明細書中に記載の方法を用いてまたは当業者に知られている他の方法によって定義される問題のＬＤブロックまたはハプロタイプブロックの物理的境界内に位置する。しかしながら、時々、マーカーおよびハプロタイプの関連は、定義のハプロタイプブロックの物理的境界を超えて伸長することが判明している。このようなマーカーおよび／またはハプロタイプは、それらの場合、定義のハプロタイプブロック内に物理的に存在するマーカーおよび／またはハプロタイプの代用マーカーおよび／またはハプロタイプとして用いることもできる。結果として、本発明のマーカーおよびハプロタイプとＬＤにある（典型的に、０．３より大のｒ２を含めた、更に、０．４より大のｒ２も含めた、０．２より大のｒ２などの、０．１より大のｒ２を特徴とする）マーカーおよびハプロタイプも、それらが、定義のハプロタイプブロックの境界を越えて位置しているとしても、本発明の範囲内である。これには、本明細書中（例えば、表５および表９）に記載されているマーカーが含まれるが、表５および表９に示されている一つまたはそれを超えるマーカーと強いＬＤにある（０．１または０．２より大のｒ２および／または｜Ｄ’｜＞０．８を特徴とする）他のマーカーも含まれてよい。
本明細書中に記載のＳＮＰマーカーについて、患者において過剰であることが判明した対立遺伝子への対向対立遺伝子（リスク負担対立遺伝子）は、心臓不整脈（例えば、心房細動または心房粗動）および／または脳卒中の患者において減少した頻度で見出される。ＬＤにあるおよび／またはこのようなマーカーを含むこれらマーカーおよびハプロタイプは、したがって、心臓不整脈（例えば、心房細動または心房粗動）および／または脳卒中について保護的である、すなわち、それらは、心臓不整脈（例えば、心房細動または心房粗動）および／または脳卒中を発生するこれらマーカーおよび／またはハプロタイプを有する個体の減少したリスクまたは感受性を与える。
一定のハプロタイプを含めた本発明の一定の変異体は、若干の場合、いろいろな遺伝的マーカー、例えば、ＳＮＰおよびマイクロサテライトの組合せを含む。ハプロタイプを検出することは、多型性部位の配列を検出するための当該技術分野において知られているおよび／または本明細書中に記載の方法によって達成することができる。更に、一定のハプロタイプまたはマーカーセットと疾患表現型との間の相関は、標準的な技法を用いて示すことができる。相関についての簡単な試験の代表的な例は、２ｘ２表での Fisher 正確検定であると考えられる。
具体的な態様において、心臓不整脈（例えば、心房細動または心房粗動）および／または脳卒中に関連していることが判明したマーカーまたはハプロタイプ（例えば、表５（表５Ａおよび表５Ｂ）、表９および／または表１９に示されているマーカー、およびそれと連鎖不平衡のマーカー）は、心臓不整脈（例えば、心房細動または心房粗動）および／または脳卒中のリスクがある（罹患した）個体において、健康個体（対照）におけるその存在頻度と比較して、より頻繁に存在するものであり、ここにおいて、マーカー対立遺伝子またはハプロタイプの存在は、心臓不整脈（例えば、心房細動または心房粗動）および／または脳卒中、または心臓不整脈（例えば、心房細動または心房粗動）および／または脳卒中への感受性を示している。他の態様において、心臓不整脈（例えば、心房細動または心房粗動）および／または脳卒中に関連していることが判明した一つまたはそれを超えるマーカーと連鎖不平衡のリスク負担マーカー（例えば、表５Ａおよび表５Ｂに示されているマーカー対立遺伝子およびそれと連鎖不平衡のマーカー）は、心臓不整脈（例えば、心房細動または心房粗動）および／または脳卒中のリスクがある（罹患した）個体において、健康個体（対照）におけるそれらの存在頻度と比較して、より頻繁に存在する標識用マーカーであり、ここにおいて、それら標識用マーカーの存在は、心臓不整脈（例えば、心房細動または心房粗動）および／または脳卒中への増加した感受性を示している。もう一つの態様において、心臓不整脈（例えば、心房細動または心房粗動）および／または脳卒中に関連していることが判明した一つまたはそれを超えるマーカーと連鎖不平衡のリスク負担マーカー対立遺伝子（すなわち、増加した感受性を与える）（例えば、表５Ａおよび表５Ｂに示されているマーカー対立遺伝子およびそれと連鎖不平衡のマーカー）は、心臓不整脈（例えば、心房細動または心房粗動）および／または脳卒中のリスクがある個体において、健康個体（対照）におけるそれらの存在頻度と比較して、より頻繁に存在する一つまたはそれを超える対立遺伝子を含むマーカーであり、ここにおいて、それらマーカーの存在は、心臓不整脈（例えば、心房細動または心房粗動）および／または脳卒中への増加した感受性を示している。
研究集団
一般的な意味で、本発明の方法およびキットは、いずれかの源、すなわち、いずれかの個体からのゲノムＤＮＡを含有する試料から利用することができる。好ましい態様において、個体はヒト個体である。その個体は、成人、小児または胎児でありうる。本発明は、更に、標的集団のメンバーである個体においてマーカーおよび／またはハプロタイプを評価するために与えられる。このような標的集団は、一つの態様において、他の遺伝因子、バイオマーカー、生物物理的パラメーター（例えば、体重、ＢＭＤ、血圧）、または全身健康状態および／またはライフスタイルパラメーター（例えば、疾患または関連疾患の履歴、既往症診断、疾患の家族歴）に基づいて、疾患を発生するリスクがある個体の集団または群である。
本発明は、４０歳を超える、４５歳を超える、または５０歳、５５歳、６０歳、６５歳、７０歳、７５歳、８０歳または８５歳を超える個体などの、具体的な年齢部分群からの個体を包含する態様に与えられる。本発明の他の態様は、８０歳未満、７５歳未満、または７０歳、６５歳、６０歳、５５歳、５０歳、４５歳、４０歳、３５歳または３０歳未満などの８５歳未満の個体などの他の年齢群に関する。他の態様は、上に記載のいずれかの年齢範囲内の疾患発症時年齢を有する個体に関する。更に、一定の態様において、４５歳を超えるが６０歳未満の発症時年齢などの、ある年齢範囲が適切でありうると考えられる。しかしながら、上に示される年齢値によって一括される全ての年齢範囲を含めた他の年齢範囲も考えられる。
他の態様は、特定の年齢または年齢範囲に疾患発症時年齢を有する個体に関した。したがって、素因を与える遺伝的および非遺伝的因子は、ある個体が疾患を発生する年齢で影響することがありうるということが知られている。心臓不整脈および脳卒中を含めた心臓血管疾患について、一般的なリスクファクターは、ある個体がその疾患を発生するかどうかに、およびその年齢で影響することがありうる。したがって、本発明の若干の態様は、一定の年齢範囲内の心臓不整脈（例えば、心房細動および／または心房粗動）または脳卒中の発症時年齢または診断時年齢に関する。一つの態様において、心臓不整脈（例えば、心房細動および／または心房粗動）または脳卒中を発生するリスクがある個体は、４０歳を超える発症時年齢または診断時年齢を有する。他の態様において、それら個体は、４５歳を超える、または５０歳、５５歳、６０歳、６５歳、７０歳、７５歳、８０歳または８５歳を超える発症時年齢または診断時年齢を有する。本発明の他の態様は、８０歳未満、７５歳未満、または７０歳、６５歳、６０歳、５５歳、５０歳、４５歳、４０歳、３５歳または３０歳未満などの８５歳未満の発症時年齢または診断時年齢を有する個体に関する。他の好ましい態様は、８０歳未満で心房細動または心房粗動または脳卒中と診断された個体を包含する。別の好ましい態様は、７０歳未満で心房細動または心房粗動または脳卒中と診断された個体に関する。別の好ましい態様は、６０歳未満で心房細動または心房粗動または脳卒中と診断された個体に関する。また別の好ましい態様は、５０歳未満で心房細動または心房粗動または脳卒中と診断された個体に関する。他の態様は、上に記載の具体的な年齢範囲内の疾患発症時年齢を有する個体に関する。更に、一定の態様において、４５歳を超えるが６０歳未満の発症時年齢、６０歳を超えるが７０歳未満の発症時年齢、７０歳を超えるが８０歳未満の発症時年齢、または６０歳を超えるが８０歳未満の発症時年齢などの、ある年齢範囲が適切でありうると考えられる。しかしながら、上に示される年齢値によって一括される全ての年齢範囲を含めた他の年齢範囲も考えられる。
本発明は、更に、男性または女性両方の性別の個体に関する。それは、更に、バンツー族（Bantu）、マンデンク（Mandenk）、ヨルバ族（Yoruba）、サン（San）、ムブチ（Mbuti）、ピグミー族（Pygmy）、オルカディアン（Orcadian）、アディゲル（Adygel）、ロシア人、サルディニア人（Sardinian）、トスカナ人（Tuscan）、モザバイト（Mozabite）、ベドウィン（Bedouin）、ドルーズ（Druze）、パレスチナ人（Palestinian）、バルーチ族（Balochi）、ブラーフィー族（Brahui）、マクラニ（Makrani）、シンド（Sindhi）、アフガニスタン人（Pathan）、ブルショー（Burusho）、ハザラ（Hazara）、ウィグル（Uygur）、カラシュ（Kalash）、漢（Han）、ダイ（Dai）、ドール（Daur）、ヘツェン（Hezhen）、ラフ（Lahu）、ミアオ（Miao）、オロケン（Oroqen）、シー（She）、ツジア（Tujia）、ツ（Tu）、ジボ（Xibo）、ジー（Yi）、モンゴル人（Mongolan）、ナクシ（Naxi）、カンボジア人（Cambodian）、日本人、ヤクート族（Yakut）、メラネシア人（Melanesian）、パプア人（Papuan）、カリチアナン（Karitianan）、スルイ（Surui）、コルンビアン（Colmbian）、マヤ族（Maya）およびピマ族（Pima）が含まれるがこれに制限されるわけではない一つまたはれそを超えるヒト集団からであるヒト対象に関する態様に与えられる。本発明は、更に、ヨーロッパ集団、アメリカ集団、ユーラシア集団、アジア集団、中央／南アジア集団、東アジア集団、中東集団、アフリカ集団、ヒスパニック集団およびオセアニア集団に関する。ヨーロッパ集団には、スウェーデン人、ノルウェー人、フィンランド人、ロシア人、デンマーク人、アイスランド人、アイルランド人、ケルト人、イングランド人、スコットランド人、オランダ人、ベルギー人、フランス人、ドイツ人、スペイン人、ポルトガル人、イタリア人、ポーランド人、ブルガリア人、スラブ人、セルビア人、ボスニア人、チェコ人（Chech）、ギリシア人およびトルコ人集団が含まれるが、これに制限されるわけではない。
一つの態様において、本発明は、アフリカ系またはリネージの人々を含む集団などの黒色アフリカ人家系を包含する集団に関する。黒色アフリカ人家系は、黒色人種のメンバーであるまたはニグロ人種のメンバーである、アフリカ系アメリカ人、アメリカニグロ、黒色アメリカ人として自己報告することによって決定されてよい。例えば、アフリカ系アメリカ人または黒色アメリカ人は、北アメリカに在住し且つアフリカからのいずれかの黒色人種群に起源を有する人々である。別の例において、自己報告による黒色アフリカ人家系の人々は、黒色アフリカ人家系の少なくとも一人の親または黒色アフリカ人家系の少なくとも一人の祖父母を有していてよい。
個々の対象の人種的寄与は、遺伝分析によって決定することもできる。家系の遺伝分析は、Smith et al.（Am J Hum Genet 74, 1001-13(2004)）に示されているものなどの未連鎖マイクロサテライトマーカーを用いて行うことができる。
一定の態様において、本発明は、上に記載のような具体的な集団において識別されたマーカーおよび／またはハプロタイプに関する。当業者は、連鎖不平衡（ＬＤ）の尺度が、異なった集団に適用された場合に異なった結果を生じることがありうるということを理解するであろう。これは、異なったヒト集団の異なった集団履歴、更には、特定のゲノム領域中にＬＤの違いをもたらしていることがありうる異なった選択的圧力のためである。更に、一定のマーカー、例えば、ＳＮＰマーカーは、一つの集団において多型性であるが、別の場合は多型性でないということが、当業者に周知である。当業者は、しかしながら、いずれか与えられたヒト集団において利用可能な且つ本明細書中に本発明を実施するように示されている方法を適用するであろう。これには、特定の集団内に最強の関連を生じるマーカーを識別するように、本発明のＬＤ領域における多型性マーカーの評価が含まれてよい。したがって、本発明のリスク負担変異体は、いろいろなヒト集団において異なったハプロタイプ背景で且つ異なった頻度で存在してよい。しかしながら、当該技術分野において知られている方法および本発明のマーカーを利用すると、本発明は、いずれか与えられたヒト集団において実施することができる。
遺伝子診断の有用性
当業者は、本明細書中に記載の変異体が、概して、それら自体では、心臓不整脈（例えば、心房細動または心房粗動）および／または脳卒中を発生するであろう個体の絶対的識別を与えないということを認め且つ理解するであろう。本明細書中に記載の変異体は、しかしながら、本発明のリスク負担または保護的変異体を有する個体が、心臓不整脈（例えば、心房細動および／または心房粗動）または脳卒中に関連した症状を発生するであろう増加したおよび／または減少した尤度を示す。この情報は、しかしながら、下に更に詳細に概説されるように、それを用いて、例えば、初期段階で予防的測定を開始する、症状の進行および／または出現を監視する規則的な身体および／または精神検査を行う、または初期段階で処置を適用することができるように、問題の状態を識別する検査を規則的間隔で予定することができるので、それ自体、極めて貴重である。
心臓不整脈（例えば、心房細動または心房粗動）および／または脳卒中を発生するリスクを与える遺伝子変異体についての知見は、その疾患を発生する増加したリスクを有する個体（すなわち、リスク負担変異体の保有者）と、その疾患を発生する減少したリスクを有する個体（すなわち、保護的変異体の保有者）とを区別する遺伝子診断を適用する機会を与える。遺伝子診断の中心価値は、上述の群の双方に属する個体について、心臓不整脈（例えば、心房細動または心房粗動）および／または脳卒中、または心臓不整脈（例えば、心房細動または心房粗動）および／または脳卒中への素因を初期段階で診断し、そして最も適当な処置を適用することができるように心臓不整脈（例えば、心房細動または心房粗動）および／または脳卒中の予後について臨床医に情報を与えることができるという可能性である。
心臓不整脈（例えば、心房細動または心房粗動）および／または脳卒中の家族歴を有する個体およびリスク負担変異体の保有者は、遺伝的リスクファクターの存在、または一つまたはそれを超えるリスクファクターの保有者であるという増加したリスクの証拠についての知見が、心臓不整脈（例えば、心房細動または心房粗動）および／または脳卒中に関係した心臓血管疾患への既知の環境リスクファクターを免れるまたは最小限にすることによって、健康者ライフスタイルを実行する動機を増加させることができるので、遺伝子診断から利益を得ることができる。心臓不整脈（例えば、心房細動または心房粗動）および／または脳卒中の患者の遺伝子診断は、更に、疾患の主な原因についての有効な情報を与えることができるし、そして各々の個体に最良の処置選択肢および投薬を選択する場合に臨床医を助けることができる。
本発明は、更に、ある個体が、心臓不整脈（例えば、心房細動または心房粗動）および／または脳卒中を発生するリスクがあるかどうかを決定することを含めた、心臓不整脈（例えば、心房細動または心房粗動）および／または脳卒中のリスクアセスメントに関する。本発明の多型性マーカーは、心臓不整脈（例えば、心房細動または心房粗動）および／または脳卒中への個体のリスクアセスメントについて、単独でまたは組合せで、更には、他の遺伝的リスクファクターまたはバイオマーカーを含めた他の因子との組合せで用いることができる。心臓血管疾患のリスクを発生することに対して個体の素因に影響することが知られている多数の因子は、心臓不整脈（例えば、心房細動または心房粗動）および／または脳卒中への感受性因子であり且つ当業者に知られていて、しかもこのような評価に利用することができる。これらには、年齢、性別、喫煙状態、身体活動、ウエスト・ヒップ周囲比、心臓不整脈（例えば、心房細動または心房粗動）および／または脳卒中の家族歴、既往の心臓不整脈（例えば、心房細動または心房粗動）および／または脳卒中、肥満症、高トリグリセリド血症、低ＨＤＬコレステロール、高血圧症、高血圧、コレステロールレベル、ＨＤＬコレステロール、ＬＤＬコレステロール、トリグリセリド、アポリポタンパク質ＡＩおよびＢレベル、フィブリノーゲン、フェリチン、Ｃ反応性タンパク質およびロイコトリエンのレベルが含まれるが、これに制限されるわけではない。心房細動／心房粗動および脳卒中に関連していた具体的なバイオマーカーは、Allard et al.（Clin Chem 51:2043-2051(2005)）および Becker（J Thromb Thrombolys 19:71-75(2005)）に論じられている。これらには、フィブリンＤダイマー、プロトロンビン活性化フラグメント１．２（Ｆ１．２）、トロンビン・アンチトロンビンIII複合体（ＴＡＴ）、フィブリノペプチドＡ（ＦＰＡ）、リポタンパク質結合ホスホリパーゼＡ２（ｌｐ−ＰＬＡ２）、βトロンボグロブリン、血小板因子４、Ｐ−セレクチン、フォンビルブラント因子、ナトリウム利尿促進（pro-natriuretic）ペプチド（ＢＮＰ）、マトリックスメタロプロテイナーゼ−９（ＭＭＰ−９）、ＰＡＲＫ７、ヌクレオシド二リン酸キナーゼ（ＮＤＫＡ）、τ、ニューロン特異的エノラーゼ、Ｂ型神経栄養増殖因子、アストログリアタンパク質Ｓ−１００ｂ、グリア線維酸性タンパク質、Ｃ反応性タンパク質、血清アミロイドＡ、マトリックスメタロプロテイナーゼ−９、血管および細胞内細胞接着分子、腫瘍壊死因子α、およびインターロイキン−１、−６および−８を含めたインターロイキンが含まれるが、これに制限されるわけではない。循環性前駆細胞も、ＡＦの有用なバイオマーカーであるとして包含された。具体的な態様において、二つ以上のバイオマーカーを、ある個体について決定し、そして本明細書中に記載の少なくとも一つの多型性マーカーの決定結果と組み合わせる。好ましくは、バイオマーカーは、個体からの血漿または血清中で測定する。或いは、バイオマーカーは、測定可能な量のバイオマーカーを含有する他の適する組織中で決定され、そしてこのような態様も、本発明の範囲内である。
当該技術分野において知られている方法は、多変量分析またはロジスティック回帰を含めた全体リスクアセスメントに用いることができる。
心房細動は、個々の患者および全体としての健康管理システム双方に極めて有意の疾患である。それは、永続的状態でありうるが、発作性および再発性であってもよく、その場合、それは、診断するのが極めて難しいことがありうる。心房細動および心房粗動の最も破壊的合併症は、消耗性脳卒中の発生である。重要なことに、脳卒中のリスクは、永続的および発作性の心房細動の場合に等しい。ワルファリン抗凝固での療法は、心房細動の成立における脳卒中の最初のまたは追加のエピソードのリスクを有意に減少させることができるということが繰り返し示された。したがって、ワルファリンでの抗凝固は、心房細動を有するほとんど全ての患者について、彼らが永続的タイプを有するにせよ発作性タイプを有するにせよ、脳卒中予防に標準的な療法である。ワルファリンを強く推奨されない唯一の患者は、低リスクと考えられる６５歳より若い患者である、すなわち、彼らは、高血圧症も、冠状動脈疾患も、脳卒中または一過性脳虚血発作の既往歴も、そして糖尿病もないことを含めた、器質性心疾患を有していない。この群は、脳卒中のリスクが一層低く、アスピリンでの脳卒中予防が推奨される。
発作性心房細動の性質ゆえに、診断することは極めて難しいことがありうる。患者が、動悸、胸痛、息切れ、めまい、心不全、一過性脳虚血発作、またはなお脳卒中などの疾患関連症状のために治療を求めている場合、正常な心臓律動は、既に回復していて、不整脈の診断が妨げられることがありうる。これらの場合、しばしば、その状態を診断することを試みて、心臓律動監視を適用する。心臓律動は、一般的に、２４〜４８時間継続して監視する。残念ながら、心房細動エピソードは、予測不能であり、しばしば、このアプローチで見落とされる。不整脈を診断し、推奨される療法を設定し、そして可能ならば、消耗性の最初のまたは再発の脳卒中を予防する機会は、患者への破壊的結果で失われることがありうる。長期の且つ一層複雑な心臓律動監視測定は、利用可能であり、そして時々、心房細動の疑いが極めて強い場合に適用される。これら検査は高価であり、現行アプローチでの診断収率は、しばしば低いので、それらは、この徴候に控えめに用いられる。これら状況において、遺伝子診断での追加のリスク層別化は、極めて有用でありうる。問題の個体が、リスク負担かまたは保護的遺伝子変異体を有するということを理解することは、診断および／または処置の意思決定への極めて貴重な貢献でありうる。この方法は、若干の場合、不必要な検査および療法を免れることができるし、そして他の場合、より積極的な診断アプローチの助けを借りて、不整脈を診断することができる、および／または適切な療法を開始し且つ後の疾患合併症を減少させることができる。
発明の方法
心臓不整脈（例えば、心房細動または心房粗動）および／または脳卒中のリスクアセスメントの方法は、本明細書中に記載され且つ本発明によって包含される。本発明は、更に、心臓不整脈（例えば、心房細動または心房粗動）および／または脳卒中の治療薬への応答の確率について個体を評価する方法、更には、心臓不整脈（例えば、心房細動または心房粗動）および／または脳卒中を有する患者を処置する治療薬の有効性を予測する方法を包含する。心臓不整脈（例えば、心房細動または心房粗動）および／または脳卒中への感受性を検出するための対象からの試料を検定するキットも、本発明によって包含される。
発明の診断検定およびスクリーニング検定
一定の態様において、本発明は、心臓不整脈（例えば、心房細動または心房粗動）および／または脳卒中、または心臓不整脈（例えば、心房細動または心房粗動）および／または脳卒中への感受性を診断するまたはその診断を助ける方法であって、心臓不整脈（例えば、心房細動または心房粗動）および／または脳卒中の対象または心臓不整脈（例えば、心房細動または心房粗動）および／または脳卒中に感受性である対象において一層頻繁に出現する遺伝的マーカーにおける特定の対立遺伝子を検出することによる方法に関する。具体的な態様において、本発明は、心臓不整脈（例えば、心房細動または心房粗動）および／または脳卒中への感受性を診断する方法であって、少なくとも一つの多型性マーカー（例えば、本明細書中に記載のマーカー）の少なくとも一つの対立遺伝子を検出することによる方法である。本発明は、特定のマーカーまたはハプロタイプの特定の対立遺伝子の検出が、心臓不整脈（例えば、心房細動または心房粗動）および／または脳卒中への感受性を示している方法を記載する。このような予後または予測検定は、心臓不整脈（例えば、心房細動または心房粗動）および／または脳卒中の症状発症前の対象の予防的処置を決定するのに用いることもできる。
本発明は、若干の態様において、診断、例えば、医療専門家によって行われる診断の臨床適用方法であって、遺伝的リスク変異体の評価または決定、およびそれらの解釈を包含してよい方法に関する。他の態様において、本発明は、門外漢または非医療専門家によって行われるリスクアセスメント（または診断）の方法に関する。Molecular Inversion Probe アレイ技術（例えば、Affymetrix GeneChip）および BeadArray Technologies（例えば、Illumina GoldenGate and Infinium 検定）などの、ＳＮＰマーカーの高効率遺伝子型決定を含めた遺伝子型決定技術における最近の技術的進歩は、個体が、大多数の変異体について同時にまたは１００万個のＳＮＰまで評価された彼ら自身のゲノムを有することを可能にした。その個体に利用可能にされる得られた遺伝子型情報は、いろいろなＳＮＰに関連した疾患または形質リスクについての公的科学文献からの情報と比較することができる。本明細書中に記載の疾患関連対立遺伝子の診断用途は、したがって、保健専門家が、臨床試験の結果に基づいてかまたは、ＳＮＰ遺伝子型決定によるＳＮＰの評価を行うための個体提供サービスを含めた門外漢または非医療専門家が、個々のＳＮＰ基準でかまたはアレイ技術などの大規模高効率方法によって行うことができる。言い換えると、遺伝的リスクに基づく感受性の診断または評価は、保健専門家、遺伝カウンセラー、遺伝子型サービスプロバイダーによって、または門外漢によって、彼／彼女の遺伝子型についての情報およびいろいろなリスクファクターに関する公報に基づいて行うことができる。本文脈中において、「診断すること」および「感受性を診断する」という用語は、上述のものを含めた、いずれか利用可能な診断方法に関する意味である。
更に、一定の他の態様において、本発明は、心臓不整脈（例えば、心房細動または心房粗動）および／または脳卒中への減少した感受性を診断するまたはその診断を助ける方法であって、心臓不整脈（例えば、心房細動または心房粗動）および／または脳卒中の患者において、一般的な集団中の心臓不整脈（例えば、心房細動または心房粗動）および／または脳卒中と診断されていない個体の場合よりも頻繁に出現することが少ない特定の遺伝的マーカー対立遺伝子またはハプロタイプを検出することによる方法に関する。
本明細書中に記載され且つ例示されるように、特定のマーカー対立遺伝子またはハプロタイプ（例えば、表５（表５Ａおよび表５Ｂ）に示されているマーカーおよびハプロタイプおよびそれと連鎖不平衡のマーカー、例えば、表４および／または表９に示されているマーカー、それと連鎖不平衡のマーカー、例えば、表１９に示されているマーカー）は、心臓不整脈（例えば、心房細動または心房粗動）および／または脳卒中に関連している。一つの態様において、そのマーカー対立遺伝子またはハプロタイプは、心臓不整脈（例えば、心房細動または心房粗動）および／または脳卒中への有意のリスクまたは感受性を与えるものである。別の態様において、本発明は、ヒト個体の心臓不整脈（例えば、心房細動または心房粗動）および／または脳卒中への感受性を診断する方法であって、その個体から得られた核酸試料中の少なくとも一つの多型性マーカーの少なくとも一つの対立遺伝子の存在または不存在を決定することを含み、ここにおいて、少なくとも一つの多型性マーカーは、表５Ａおよび表５Ｂに示される多型性マーカーおよびそれと連鎖不平衡のマーカーから成る群より選択される方法に関する。別の態様において、本発明は、ヒト個体の心臓不整脈（例えば、心房細動または心房粗動）および／または脳卒中への感受性を診断する方法であって、表５Ａおよび表５Ｂに示される少なくとも一つのマーカー対立遺伝子またはハプロタイプまたはそれと連鎖不平衡のマーカーについてスクリーニングすることによる方法に関する。別の態様において、マーカー対立遺伝子またはハプロタイプは、心臓不整脈（例えば、心房細動または心房粗動）および／または脳卒中を有する（罹患した）対象、またはそれに感受性である対象において、健康対象（集団対照などの対照）におけるその存在頻度と比較して、より頻繁に存在する。一定の態様において、少なくとも一つのマーカー対立遺伝子またはハプロタイプの関連の有意性は、＜０．０５のｐ値を特徴とする。他の態様において、関連の有意性は、＜０．０１、＜０．００１、＜０．０００１、＜０．００００１、＜０．０００００１、＜０．００００００１、＜０．０００００００１または＜０．００００００００１などの一層小さいｐ値を特徴とする。
これら態様において、少なくとも一つのマーカー対立遺伝子またはハプロタイプの存在は、心臓不整脈（例えば、心房細動または心房粗動）および／または脳卒中への感受性を示している。これら診断方法は、心臓不整脈（例えば、心房細動または心房粗動）および／または脳卒中に関連している少なくとも一つのマーカー対立遺伝子またはハプロタイプの存在または不存在を検出することを包含する。本明細書中に記載のハプロタイプには、いろいろな遺伝的マーカー（例えば、ＳＮＰ、マイクロサテライト）における対立遺伝子の組合せが含まれる。特定のハプロタイプを構成する特定の遺伝的マーカー対立遺伝子の検出は、本明細書中に記載のおよび／または当該技術分野において知られているいろいろな方法によって行うことができる。例えば、遺伝的マーカーは、核酸レベルで（例えば、直接ヌクレオチド配列決定によってまたは当業者に知られている他の手段によって）、またはその遺伝的マーカーが、心臓不整脈（例えば、心房細動または心房粗動）および／または脳卒中に関連した核酸によってエンコードされたタンパク質のコーディング配列に影響する場合、アミノ酸レベルで（例えば、タンパク質配列決定によってまたはこのようなタンパク質を認識する抗体を用いたイムノアッセイによって）検出することができる。本発明のマーカー対立遺伝子またはハプロタイプは、心臓不整脈（例えば、心房細動または心房粗動）および／または脳卒中に関連したゲノムＤＮＡ配列のフラグメントに該当する。このようなフラグメントは、問題の多型性マーカーまたはハプロタイプのＤＮＡ配列を包含するが、そのマーカーまたはハプロタイプと強いＬＤ（連鎖不平衡）のＤＮＡセグメントを包含してもよい。一つの態様において、このようなセグメントは、０．２より大のｒ２および／または｜Ｄ’｜＞０．８の値によって決定されるマーカーまたはハプロタイプとＬＤのセグメントを含む。
一つの態様において、心臓不整脈（例えば、心房細動または心房粗動）および／または脳卒中への感受性の診断は、サザン分析、ノーザン分析および／または in situ ハイブリダイゼーションなどのハイブリダイゼーション方法を用いて達成することができる（全ての補遺を含めた Current Protocols in Molecular Biology, Ausubel, F. et al., eds., John Wiley & Sons を参照されたい）。ゲノムＤＮＡ、ＲＮＡまたはｃＤＮＡの試験対象または個体からの生物学的試料（「試験試料」）は、心臓不整脈（例えば、心房細動または心房粗動）および／または脳卒中を有する、それに感受性であるまたはその素因があると疑われる対象（「試験対象」）から得られる。その対象は、成人、小児または胎児でありうる。試験試料は、血液試料、羊水試料、脳脊髄液試料、または皮膚、筋肉、頬または結膜粘膜、胎盤、胃腸管または他の器官からの組織試料などの、ゲノムＤＮＡを含有するいずれかの源から得ることができる。胎児細胞または組織からのＤＮＡの試験試料は、羊水穿刺または絨毛採取によるなどの適当な方法によって得ることができる。次に、そのＤＮＡ、ＲＮＡまたはｃＤＮＡ試料を調べる。特異的マーカー対立遺伝子の存在は、その特定の対立遺伝子に特異的な核酸プローブの配列特異的ハイブリダイゼーションによって示すことができる。特異的マーカー対立遺伝子または特異的ハプロタイプより多くの存在は、ある特定の対立遺伝子に各々特異的であるいくつかの配列特異的核酸プローブを用いることによって示すことができる。一つの態様において、ハプロタイプは、その特異的ハプロタイプに特異的である（すなわち、そのハプロタイプに特有の特異的マーカー対立遺伝子を含むＤＮＡ鎖に特異的にハイブリッド形成する）単一核酸プローブによって示すことができる。配列特異的プローブは、ゲノムＤＮＡ、ＲＮＡまたはｃＤＮＡにハイブリッド形成するように支配することができる。本明細書中で用いられる「核酸プローブ」は、相補的配列にハイブリッド形成するＤＮＡプローブまたはＲＮＡプローブでありうる。当業者は、このようなプローブを、ある特定の対立遺伝子が、試験試料からのゲノム配列中に存在する場合にのみ、配列特異的ハイブリダイゼーションが生じるように設計する方法を承知していると考えられる。
心臓不整脈（例えば、心房細動または心房粗動）および／または脳卒中への感受性を診断するために、ハイブリダイゼーション試料は、ゲノムＤＮＡ試料などの、心房細動および／または脳卒中に関連した核酸を含有する試験試料と、少なくとも一つの核酸プローブとを接触させることによって形成する。ｍＲＮＡまたはゲノムＤＮＡを検出するプローブの非制限例は、本明細書中に記載のｍＲＮＡまたはゲノムＤＮＡ配列にハイブリッド形成することができる標識した核酸プローブである。その核酸プローブは、例えば、適当なｍＲＮＡまたはゲノムＤＮＡにストリンジェント条件下で特異的にハイブリッド形成するのに十分である少なくとも１５、３０、５０、１００、２５０または５００ヌクレオチド長さのオリゴヌクレオチドなどの完全長核酸分子またはその一部分でありうる。そのヌクレオチド酸プローブは、５００ヌクレオチド、４００ヌクレオチド、３００ヌクレオチド、２００ヌクレオチドまたは１００ヌクレオチドまでを含めた、１０００ヌクレオチドまたはそれを超えるまでの長さであってよい。一定の態様は、１５〜１０００ヌクレオチド長さであるヌクレオチドプローブを包含する。他の態様は、１５〜５００ヌクレオチド長さ、または１５〜４００ヌクレオチド長さ、または２０〜４００ヌクレオチド長さであるヌクレオチドプローブの使用に関する。当業者に周知のように、本発明のヌクレオチドプローブの他のサイズ範囲が考えられる。一つの態様において、核酸プローブは、本明細書中に記載の、場合により、本明細書中に記載のマーカーの少なくとも一つの対立遺伝子または本明細書中に記載の少なくとも一つのハプロタイプを含む、ＬＤブロックＣ０４のヌクレオチド配列の全部または一部分を含むことができるし、またはそのプローブは、このような配列の相補的配列でありうる。具体的な態様において、核酸プローブは、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：５０に示される、または本明細書中に記載の、場合により、本明細書中に記載のマーカーの少なくとも一つの対立遺伝子、または一つの多型性マーカーまたは本明細書中に記載の少なくとも一つの多型性マーカーを含むハプロタイプの少なくとも一つの対立遺伝子を含む、ＬＤブロックＣ０４のヌクレオチド配列の一部分であるし、またはそのプローブは、このような配列の相補的配列でありうる。本発明の診断検定に用いる他の適するプローブは、本明細書中に記載されている。ハイブリダイゼーションは、当業者に周知の方法によって行うことができる（例えば、全ての補遺を含めた Current Protocols in Molecular Biology, Ausubel, F. et al., eds., John Wiley & Sons を参照されたい）。一つの態様において、ハイブリダイゼーションは、特異的ハイブリダイゼーション、すなわち、ミスマッチを含まないハイブリダイゼーション（正確ハイブリダイゼーション）を意味する。一つの態様において、特異的ハイブリダイゼーションのハイブリダイゼーション条件は、高ストリンジェンシーである。
特異的ハイブリダイゼーションは、存在する場合、標準的な方法を用いて検出される。特異的ハイブリダイゼーションが、試験試料中の核酸プローブと核酸との間に生じる場合、その試料は、核酸プローブ中に存在するヌクレオチドに相補的である対立遺伝子を含有する。その方法は、本発明のいずれかのマーカー、または本発明のハプロタイプを構成するマーカーについて繰り返すことができるし、または多数のプローブを同時に用いて、二つ以上のマーカー対立遺伝子を一度に検出することができる。更に、特定のハプロタイプの二つ以上のマーカー対立遺伝子を含有する単一プローブ（例えば、特定のハプロタイプを構成する２、３、４、５または全部のマーカーに相補的な対立遺伝子を含有するプローブ）を設計することは可能である。試料中のハプロタイプの特定のマーカーの検出は、その試料源が、特定のハプロタイプ（例えば、あるハプロタイプ）を有し、したがって、心臓不整脈（例えば、心房細動または心房粗動）および／または脳卒中に感受性であるということを示している。
別のハイブリダイゼーション方法において、ノーザン分析（Current Protocols in Molecular Biology, Ausubel, F. et al., eds., John Wiley & Sons, 上記を参照されたい）を用いて、心臓不整脈（例えば、心房細動または心房粗動）および／または脳卒中に関連した多型の存在を識別する。ノーザン分析には、ＲＮＡの試験試料を、適当な手段によって対象から入手する。本明細書中に記載のように、対象からのＲＮＡへの核酸プローブの特異的ハイブリダイゼーションは、そのプローブに相補的な特定の対立遺伝子を示している。核酸プローブの使用の代表的な例については、例えば、米国特許第５，２８８，６１１号および第４，８５１，３３０号を参照されたい。
更に、または或いは、ペプチド核酸（ＰＮＡ）プローブを、本明細書中に記載のハイブリダイゼーション方法において、核酸プローブに加えてまたはその代わりに用いることができる。ＰＮＡは、Ｎ−（２−アミノエチル）グリシン単位などのペプチド様無機主鎖を有する、グリシン窒素にメチレンカルボニルリンカーによって結合した有機塩基（Ａ、Ｇ、Ｃ、ＴまたはＵ）を含むＤＮＡ模擬体である（例えば、Nielsen, P., et al., Bioconjug. Chem. 5:3-7(1994) を参照されたい）。ＰＮＡプローブは、心臓不整脈（例えば、心房細動または心房粗動）および／または脳卒中に関連している一つまたはそれを超えるマーカー対立遺伝子またはハプロタイプを含有すると疑われる試料中の分子に特異的にハイブリッド形成するように設計することができる。ＰＮＡプローブのハイブリダイゼーションは、したがって、心臓不整脈（例えば、心房細動または心房粗動）および／または脳卒中、または心臓不整脈（例えば、心房細動または心房粗動）および／または脳卒中への感受性に診断的である。
本発明の一つの態様において、対象から得られたゲノムＤＮＡ含有試験試料を集め、そしてポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）を用いて、本発明の一つまたはそれを超えるマーカーまたはハプロタイプを含むフラグメントを増幅させる。本明細書中に記載のように、心臓不整脈（例えば、心房細動または心房粗動）および／または脳卒中に関連した特定のマーカー対立遺伝子またはハプロタイプの識別は、いろいろな方法（例えば、配列分析、制限消化による分析、特異的ハイブリダイゼーション、一本鎖高次構造多型検定（ＳＳＣＰ）、電気泳動分析等）を用いて達成することができる。別の態様において、診断は、発現分析により、定量的ＰＣＲ（動力学的熱サイクリング）を用いて行われる。この技法は、例えば、ＴａｑＭａｎ（登録商標）（Applied Biosystems, Foster City, CA）などの商業的に入手可能な技術を利用することができる。その技法は、心臓不整脈（例えば、心房細動または心房粗動）および／または脳卒中に関連した核酸によってエンコードされているポリペプチドまたは一つまたは複数のスプライシング変異体の発現または組成の変化の存在を評価することができる。更に、一つまたは複数の変異体の発現は、物理的にまたは機能的に異なった状態として定量することができる。
本発明の別の方法において、制限消化による分析を用いて、特定の対立遺伝子を、その対立遺伝子が、基準配列に相対して成分部位の生成または脱離を生じる場合に検出することができる。制限断片長多型（ＲＦＬＰ）分析は、例えば、Current Protocols in Molecular Biology, 上記のように行うことができる。関係のあるＤＮＡフラグメントの消化パターンは、試料中の特定の対立遺伝子の存在または不存在を示す。
配列分析も、心臓不整脈（例えば、心房細動または心房粗動）および／または脳卒中に関連した特異的対立遺伝子またはハプロタイプ（例えば、表５（表５Ａおよび表５Ｂ）、表９および／または表１９の多型性マーカー）を検出するのに用いることができる。したがって、一つの態様において、特定のマーカー対立遺伝子またはハプロタイプの存在または不存在の決定は、対象または個体から得られたＤＮＡまたはＲＮＡの試験試料の配列分析を含む。ＰＣＲまたは他の適当な方法を用いて、心臓不整脈（例えば、心房細動または心房粗動）および／または脳卒中に関連した核酸の一部分を増幅させることができ、そして次に、特異的対立遺伝子の存在を、試料中のゲノムＤＮＡの多型性部位（またはハプロタイプ中の多数の多型性部位）を配列決定することによって直接的に検出することができる。
対立遺伝子特異的オリゴヌクレオチドを用いても、心臓不整脈（例えば、心房細動または心房粗動）および／または脳卒中に関連した核酸中の特定の対立遺伝子（例えば、表５（表５Ａおよび表５Ｂ）、表９および／または表１９の多型性マーカー）の存在を、対立遺伝子特異的オリゴヌクレオチド（ＡＳＯ）プローブでの、増幅されたオリゴヌクレオチドのドットブロットハイブリダイゼーションの使用によって検出することができる（例えば、Saiki, R. et al., Nature, 324:163-166(1986) を参照されたい）。「対立遺伝子特異的オリゴヌクレオチド」（本明細書中において「対立遺伝子特異的オリゴヌクレオチドプローブ」とも称される）は、約１０〜５００塩基対、約１５〜４００塩基対、約１５〜２００塩基対、約１５〜１００塩基対、約１５〜５０塩基対または約１５〜３０塩基対のオリゴヌクレオチドであって、心臓不整脈（例えば、心房細動または心房粗動）および／または脳卒中に関連した核酸に特異的にハイブリッド形成するし、しかも多型性部位に特異的対立遺伝子（例えば、本明細書中に記載のマーカーまたはハプロタイプ）を含有するものである。心臓不整脈（例えば、心房細動または心房粗動）および／または脳卒中に関連した一つまたはそれを超える特定の核酸に特異的である対立遺伝子特異的オリゴヌクレオチドプローブは、標準的な方法を用いて製造することができる（例えば、Current Protocols in Molecular Biology, 上記を参照されたい）。ＰＣＲを用いて、所望の領域を増幅させることができる。増幅された領域を含有するＤＮＡは、標準的な方法（例えば、Current Protocols in Molecular Biology, 上記を参照されたい）を用いてドットブロッティングすることができ、そしてそのブロットを、オリゴヌクレオチドプローブと接触させることができる。次に、増幅された領域へのプローブの特異的ハイブリダイゼーションの存在を検出することができる。対象からのＤＮＡへの対立遺伝子特異的オリゴヌクレオチドプローブの特異的ハイブリダイゼーションは、心臓不整脈（例えば、心房細動または心房粗動）および／または脳卒中に関連した多型性部位の特異的対立遺伝子を示している（例えば、Gibbs, R. et al., Nucleic Acids Res., 17:2437-2448(1989) およびＷＯ９３／２２４５６号を参照されたい）。
施錠（locked）核酸（ＬＮＡ）のような類似体の付加で、プライマーおよびプローブのサイズは、８塩基程度の少数に減少させることができる。ＬＮＡは、フラノース環の２’位および４’位が、Ｏ−メチレン（オキシ−ＬＮＡ）、Ｓ−メチレン（チオ−ＬＮＡ）またはアミノメチレン（アミノ−ＬＮＡ）部分によって接合している新規なクラスの二環式ＤＮＡ類似体である。これらＬＮＡ変異体の全てに共通するのは、相補的核酸に対する親和性であり、それは、ＤＮＡ類似体について報告される断然最高のものである。例えば、具体的な全てのオキシ−ＬＮＡノナマーは、相補的ＤＮＡまたはＲＮＡとの複合体の場合、それぞれ、該当するＤＮＡノナマーについてＤＮＡおよびＲＮＡ双方の２８℃に対立するものとして、６４℃および７４℃の融解温度（Ｔｍ）を有することが分かった。Ｔｍの実質的増加は、ＬＮＡモノマーを、標準的なＤＮＡまたはＲＮＡモノマーとの組合せで用いた場合にも得られる。プライマーおよびプローブについて、ＬＮＡモノマーが包含される場所（例えば、３’末端、５’末端または中央）に依存して、Ｔｍは、かなり増加しうると考えられる。
別の態様において、対象からの標的核酸配列セグメントに相補的であるオリゴヌクレオチドプローブのアレイを用いて、心臓不整脈（例えば、心房細動または心房粗動）および／または脳卒中に関連した核酸中の多型（例えば、表５Ａおよび表５Ｂの多型性マーカーおよびそれと連鎖不平衡のマーカー）を識別することができる。例えば、オリゴヌクレオチドアレイを用いることができる。オリゴヌクレオチドアレイは、典型的に、異なった既知の場所の基質の表面に共役している複数の異なったオリゴヌクレオチドプローブを含む。これらオリゴヌクレオチドアレイは、「GenechipsＴＭ」としても記載され、一般的には、当該技術分野において記載された（例えば、米国特許第５，１４３，８５４号、ＰＣＴ特許公開ＷＯ９０／１５０７０号および同９２／１００９２号を参照されたい）。これらアレイは、概して、写真平版法および固相オリゴヌクレオチド合成法の組合せを包含する機械的合成法または光支配合成法（light directed synthesis methods）を用いて、または当業者に知られている他の方法によって製造することができる（例えば、本明細書中に各々の内容がそのまま援用される、Fodor, S. et al., Science, 251:767-773(1991); Pirrung et al., 米国特許第５，１４３，８５４号（公開ＰＣＴ出願ＷＯ９２／１５０７０号も参照されたい）；および Fodor, S. et al., 公開ＰＣＴ出願ＷＯ９２／１００９２号および米国特許第５，４２４，１８６号を参照されたい）。機械的合成法を用いたこれらアレイの合成技術は、例えば、本明細書中にその内容がそのまま援用される米国特許第５，３８４，２６１号に記載されている。別の例において、直線状アレイを利用することができる。多型の検出用のオリゴヌクレオチドアレイの使用についての更なる説明は、例えば、本明細書中に双方の内容がそのまま援用される米国特許第５，８５８，６５９号および第５，８３７，８３２号に見出されうる。
当業者に利用可能である核酸分析の他の方法は、心臓不整脈（例えば、心房細動または心房粗動）および／または脳卒中に関連した多型性部位の特定の対立遺伝子（例えば、表５（表５Ａおよび表５Ｂ）、表９および／または表１９の多型性マーカー）を検出するのに用いることができる。代表的な方法には、例えば、直接手動配列決定（Church and Gilbert, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 81:1991-1995(1988); Sanger, F., et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 74:5463-5467(1997); Beavis, et al., 米国特許第５，２８８，６４４号）；自動蛍光配列決定；一本鎖高次構造多型検定（ＳＳＣＰ）；クランプ変性ゲル電気泳動（clamped denaturating gel electrophoresis）（ＣＤＧＥ）；変性剤濃度勾配ゲル電気泳動（ＤＧＧＥ）（Sheffield, V., et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 86:232-236(1989)）；移動度シフト分析（Orita, M., et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 86:2766-2770(1989)）；制限酵素分析（Flavell, R., et al., Cell, 15:25-41(1978); Geever, R., et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 78:5081-5085(1981)）；ヘテロ二本鎖分析；化学的ミスマッチ切断（ＣＭＣ）（Cotton, R., et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 85:4397-4401(1985)）；ＲＮアーゼプロテクション検定（Myers, R., et al., Science, 230:1242-1246(1985)）；大腸菌（E.coli）ｍｕｔＳタンパク質などのヌクレオチドミスマッチを認識するポリペプチドの使用；および対立遺伝子特異的ＰＣＲが含まれる。
本発明の別の態様において、心臓不整脈（例えば、心房細動または心房粗動）および／または脳卒中、または心臓不整脈（例えば、心房細動または心房粗動）および／または脳卒中への感受性の診断は、心臓不整脈（例えば、心房細動または心房粗動）および／または脳卒中に関連した核酸によってエンコードされたポリペプチドの発現および／または組成を、本発明の一つまたは複数の遺伝的マーカーまたは一つまたは複数のハプロタイプが、そのポリペプチドの組成または発現の変化を生じる場合に、調べることによって行うことができる。したがって、心臓不整脈（例えば、心房細動または心房粗動）および／または脳卒中への感受性の診断は、これらポリペプチドの一つ、または心臓不整脈（例えば、心房細動または心房粗動）および／または脳卒中に関連した核酸によってエンコードされた別のポリペプチドの発現および／または組成を、本発明の遺伝的マーカーまたはハプロタイプが、そのポリペプチドの組成または発現の変化を生じる場合に、調べることによって行うことができる。心臓不整脈（例えば、心房細動または心房粗動）および／または脳卒中への関連を示す本発明のハプロタイプおよびマーカーは、一つまたはそれを超えるこれら近くの遺伝子（例えば、ＰＩＴＸ２遺伝子）へのそれらの作用によって役割を果たすことができる。これら遺伝子に影響する可能な機構には、例えば、転写への作用、ＲＮＡスプライシングへの作用、別のスプライス形のｍＲＮＡの相対量の変化、ＲＮＡ安定性への作用、核から細胞質への輸送への作用、および翻訳の効率および正確度への作用が含まれる。
したがって、別の態様において、心臓不整脈（例えば、心房細動または心房粗動）および／または脳卒中への関連を示す本発明の変異体（マーカーまたはハプロタイプ）は、近くの遺伝子の発現に影響する。遺伝子発現に影響する調節要素は、遺伝子のプロモーター領域から１０分の１キロベースまたは１００分の１キロベースさえも離れて位置していてよい。本発明の少なくとも一つの多型性マーカーの少なくとも一つの対立遺伝子の存在または不存在を検定することにより、したがって、このような近くの遺伝子の発現レベルを評価することが可能である。したがって、本発明のマーカーまたはハプロタイプの検出は、心臓不整脈（例えば、心房細動または心房粗動）および／または脳卒中に連鎖している一つまたはそれを超える遺伝子の発現を評価するのに用いることができる。
タンパク質発現レベルを検出するには、固相酵素免疫検定法（ＥＬＩＳＡ）、ウェスタンブロット、免疫沈降法および免疫蛍光法を含めた、いろいろな方法を用いることができる。対象からの試験試料を、心臓不整脈（例えば、心房細動または心房粗動）および／または脳卒中に関連した核酸によってエンコードされたポリペプチドの発現の変化および／または組成の変化の存在について評価する。心臓不整脈（例えば、心房細動または心房粗動）および／または脳卒中に関連した核酸によってエンコードされたポリペプチドの発現の変化は、例えば、定量的ポリペプチド発現（すなわち、生じたポリペプチドの量）の変化でありうる。心臓不整脈（例えば、心房細動または心房粗動）および／または脳卒中に関連した核酸によってエンコードされたポリペプチドの組成の変化は、定性的ポリペプチド発現（例えば、突然変異ポリペプチドまたは異なったスプライシング変異体の発現）の変化である。一つの態様において、心臓不整脈（例えば、心房細動または心房粗動）および／または脳卒中への感受性の診断は、心臓不整脈（例えば、心房細動または心房粗動）および／または脳卒中に関連した核酸によってエンコードされた特定のスプライシング変異体、または特定のパターンのスプライシング変異体を検出することによって行われる。
このような（定量的および定性的）変化は、両方とも存在することもありうる。本明細書中で用いられるポリペプチド発現または組成の「変化」は、対照試料中のポリペプチドの発現または組成と比較したところの、試験試料中の発現または組成の変化を意味する。対照試料は、試験試料に相当する（例えば、同じタイプの細胞に由来する）試料であり、心臓不整脈（例えば、心房細動または心房粗動）および／または脳卒中に罹患していない、および／またはそれへの感受性を有していない対象に由来する。一つの態様において、対照試料は、本明細書中に記載のマーカー対立遺伝子またはハプロタイプを有していない対象に由来する。同様に、対照試料と比較したところの、試験試料中の一つまたはそれを超える異なったスプライシング変異体の存在、または試験試料中の有意に異なった量の異なったスプライシング変異体の存在は、心臓不整脈（例えば、心房細動または心房粗動）および／または脳卒中への感受性を示すことができる。対照試料と比較したところの、試験試料中のポリペプチドの発現または組成の変化は、対立遺伝子が、対照試料中の基準に相対してスプライス部位を変化させる場合、特異的対立遺伝子を示すことができる。核酸によってエンコードされたポリペプチドの発現または組成を調べるいろいろな手段は、分光法、比色法、電気泳動、等電点電気泳動、およびイムノブロッティングなどの免疫検定（例えば、David et al., 米国特許第４，３７６，１１０号）を含めて、当業者に知られているし且つ用いることができる（例えば、Current Protocols in Molecular Biology, 上記、特に１０章を参照されたい）。
例えば、一つの態様において、心臓不整脈（例えば、心房細動または心房粗動）および／または脳卒中に関連した核酸によってエンコードされたポリペプチドに結合することができる抗体（例えば、検出可能な標識を含む抗体）を用いることができる。抗体は、多クローン性または単クローン性でありうる。無傷の抗体またはそのフラグメント（例えば、Ｆｖ、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ’）２）を用いることができる。プローブまたは抗体に関して「標識した（labeled）」という用語は、検出可能な物質をプローブまたは抗体に共役させること（すなわち、物理的に連結すること）によるプローブまたは抗体の直接的標識付け、並びに、直接的に標識される別の試薬との反応性によるプローブまたは抗体の間接的標識付けを包含する意味である。間接的標識付けの例には、標識した二次抗体（例えば、蛍光標識した二次抗体）を用いた一次抗体の検出、および蛍光標識したストレプトアビジンでそれを検出することができるようなビオチンでのＤＮＡプローブの末端標識付けが含まれる。
この方法の一つの態様において、試験試料中の心臓不整脈（例えば、心房細動または心房粗動）および／または脳卒中に関連した核酸によってエンコードされたポリペプチドのレベルまたは量を、対照試料中のポリペプチドのレベルまたは量と比較する。その差が統計的に有意であるような、対照試料中のポリペプチドのレベルまたは量より高いまたは低い試験試料中のポリペプチドのレベルまたは量は、核酸によってエンコードされたポリペプチドの発現の変化を示し、そして発現の差を生じるのに関与する特定の対立遺伝子またはハプロタイプについて診断的である。或いは、試験試料中のポリペプチドの組成を、対照試料中のポリペプチドの組成と比較する。別の態様において、ポリペプチドのレベルまたは量および組成は、双方とも、試験試料中および対照試料中で評価することができる。
別の態様において、心臓不整脈（例えば、心房細動または心房粗動）および／または脳卒中への感受性の診断は、本発明の少なくとも一つのマーカーまたはハプロタイプ（例えば、表５Ａおよび表５Ｂに示されるマーカーの関連対立遺伝子、およびそれと連鎖不平衡のマーカー）を検出することにより、追加のタンパク質に基づく、ＲＮＡに基づく、またはＤＮＡに基づく検定との組合せで行われる。本発明の方法は、更に、対象の家族歴およびリスクファクター（例えば、環境リスクファクター、ライフスタイルファクター）の分析との組合せで用いることができる。
キット
本発明の方法および手順に有用なキットは、例えば、ハイブリダイゼーションプローブ；制限酵素（例えば、ＲＦＬＰ分析用）；対立遺伝子特異的オリゴヌクレオチド；本明細書中に記載の本発明の核酸によってエンコードされた変化したポリペプチド（例えば、本発明の少なくとも一つの多型性マーカーおよび／またはハプロタイプを含むゲノムセグメント）に、または本明細書中に記載の本発明の核酸によってエンコードされた変化していない（天然）ポリペプチドに結合する抗体；心臓不整脈（例えば、心房細動または心房粗動）および／または脳卒中に関連した核酸の増幅手段；心臓不整脈（例えば、心房細動または心房粗動）および／または脳卒中に関連した核酸の核酸配列を分析する手段；心臓不整脈（例えば、心房細動または心房粗動）および／または脳卒中に関連した核酸によってエンコードされたポリペプチドのアミノ酸配列を分析する手段等を含めた、本明細書中に記載のいずれかの方法に有用な成分を含む。それらキットは、例えば、必要な緩衝剤；本発明の核酸を増幅させる核酸プライマー（例えば、本明細書中に記載の一つまたはそれを超える多型性マーカー）；およびこのようなプライマーおよび必要な酵素（例えば、ＤＮＡポリメラーゼ）を用いて増幅されたフラグメントの対立遺伝子特異的検出のための試薬を包含することができる。更に、キットは、本発明の方法との組合せで用いられる検定のための試薬、例えば、心臓不整脈（例えば、心房細動または心房粗動）および／または脳卒中診断検定で用いるための試薬を与えることができる。
一つの態様において、本発明は、対象からの試料を検定して、対象における心臓不整脈（例えば、心房細動または心房粗動）および／または脳卒中、または心臓不整脈（例えば、心房細動または心房粗動）および／または脳卒中への感受性の存在を検出するためのキットであり、ここにおいて、そのキットは、個体のゲノム中の本発明の少なくとも一つの多型の少なくとも一つの対立遺伝子を選択的に検出するのに必要な試薬を含む。具体的な態様において、それら試薬は、本発明の少なくとも一つの多型を含む個体のゲノムのフラグメントにハイブリッド形成する少なくとも一つの相接するオリゴヌクレオチドを含む。別の態様において、それら試薬は、対象から得られたゲノムセグメントの対向鎖にハイブリッド形成する少なくとも一対のオリゴヌクレオチドを含み、ここにおいて、各々のオリゴヌクレオチドプライマー対は、少なくとも一つの多型を包含する個体のゲノムのフラグメントを選択的に増幅させるように設計され、ここにおいて、その多型は、表５Ａおよび表５Ｂに示される多型およびそれと連鎖不平衡の多型性マーカーから成る群より選択される。また別の態様において、そのフラグメントは、少なくとも２０塩基対サイズである。このようなオリゴヌクレオチドまたは核酸（例えば、オリゴヌクレオチドプライマー）は、心臓不整脈（例えば、心房細動または心房粗動）および／または脳卒中を示している核酸配列フランキング多型（例えば、ＳＮＰまたはマイクロサテライト）の一部分を用いて設計することができる。別の態様において、そのキットは、心臓不整脈（例えば、心房細動または心房粗動）および／または脳卒中に関連した一つまたはそれを超える特異的多型性マーカーまたはハプロタイプの対立遺伝子特異的検出が可能な一つまたはそれを超える標識した核酸；およびその標識の検出のための試薬を含む。適する標識には、例えば、放射性同位体、蛍光標識、酵素標識、酵素補因子標識、磁気標識、スピン標識、エピトープ標識が含まれる。
具体的な態様において、キットの試薬で検出される多型性マーカーまたはハプロタイプは、表５Ａおよび表５Ｂのマーカーから成る群より選択される一つまたはそれを超えるマーカー、二つまたはそれを超えるマーカー、三つまたはそれを超えるマーカー、四つまたはそれを超えるマーカー、または五つまたはそれを超えるマーカーを含む。別の態様において、検出されるマーカーまたはハプロタイプは、表５Ａおよび表５Ｂに示されるマーカーを含む。別の態様において、検出されるマーカーまたはハプロタイプは、表４および表９に示されるマーカーを含む。別の態様において、検出されるマーカーまたはハプロタイプは、０．２より大のｒ２の値によって定義される強い連鎖不平衡のマーカーの群〜表５Ａおよび表５Ｂに示されるマーカーから成るマーカーの少なくとも一つ群の、少なくとも一つのマーカーを含む。別の態様において、検出されるマーカーまたはハプロタイプは、０．２より大のｒ２の値によって定義される強い連鎖不平衡のマーカー〜表４および表９に示されるマーカーから成るマーカーの少なくとも一つの群の、少なくとも一つのマーカーを含む。別の態様において、検出されるマーカーまたはハプロタイプは、マーカーｒｓ２２２０４２７（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１）またはマーカーｒｓ１００３３４６４（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４１）、またはそれと連鎖不平衡のマーカーを含む。別の態様において、検出されるマーカーまたはハプロタイプは、表１９に示されるマーカーの少なくとも一つを含む。別の態様において、検出されるマーカーまたはハプロタイプは、マーカーＤ４Ｓ４０６（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４５）、ｒｓ２６３４０７３（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３３）、ｒｓ２２００７３３（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２８）、ｒｓ２２２０４２７（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１）、ｒｓ１００３３４６４（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４１）およびｒｓ１３１４３３０８（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：５１）、およびそれと連鎖不平衡のマーカーを含む。また別の態様において、そのマーカーまたはハプロタイプは、マーカーＤ４Ｓ４０６中のリスク負担対立遺伝子−２、−４および／または−８、マーカーｒｓ２６３４０７３の対立遺伝子Ａ、マーカーｒｓ２２００７３３の対立遺伝子Ｔ、マーカーｒｓ２２２０４２７の対立遺伝子Ｔ、マーカーｒｓ１００３３４６４の対立遺伝子Ｔ、および／またはマーカーｒｓ１３１４３３０８の対立遺伝子Ｇを含む。一つのこのような態様において、連鎖不平衡は、０．１より大のｒ２の値によって定義される。別のこのような態様において、連鎖不平衡は、０．２より大のｒ２の値によって定義される。
一つの好ましい態様において、本発明のマーカーを検出するキットは、検出されるＳＮＰ多型を含有する鋳型ＤＮＡのセグメントにハイブリッド形成する検出オリゴヌクレオチドプローブ；エンハンサーオリゴヌクレオチドプローブ；およびエンドヌクレアーゼを含む。上に説明されるように、検出オリゴヌクレオチドプローブは、その３’末端に蛍光部分または基およびその５’末端に消光剤を含み、そしてエンハンサーオリゴヌクレオチドは、Kutyavin et al.（Nucleic Acid Res. 34:e128(2006)）に記載のように用いられる。蛍光部分は、Gig Harbor Green または Yakima Yellow、または他の適する蛍光部分でありうる。検出プローブは、検出されるＳＮＰ多型を包含する短いヌクレオチド配列にハイブリッド形成するように設計される。好ましくは、ＳＮＰは、末端残基〜検出プローブの３’末端から−６残基のどこにでもある。エンハンサーは、検出プローブに相対して３’のＤＮＡ鋳型にハイブリッド形成する短いオリゴヌクレオチドプローブである。それらプローブは、検出プローブとエンハンサーヌクレオチドプローブとの間に、その双方が鋳型に結合された時に単一ヌクレオチドギャップが存在するように設計される。そのギャップは、エンドヌクレアーゼIVなどのエンドヌクレアーゼによって認識される合成の非塩基性部位を生じる。その酵素は、完全相補的検出プローブから染料を切断するが、ミスマッチを含有する検出プローブを切断することはできない。したがって、放出された蛍光部分の蛍光を測定することにより、検出プローブのヌクレオチド配列によって定義される特定の対立遺伝子の存在の評価を行うことができる。
検出プローブは、いずれか適するサイズを有することができるが、好ましくは、そのプローブは、比較的短い。一つの態様において、そのプローブは、５〜１００ヌクレオチド長さである。別の態様において、プローブは、１０〜５０ヌクレオチド長さであり、そして別の態様において、プローブは、１２〜３０ヌクレオチド長さである。プローブの他の長さは可能であり、平均的な当業者の技術の範囲内である。
好ましい態様において、ＳＮＰ多型を含有するＤＮＡ鋳型を、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）により、検出前に増幅させるが、このような増幅用のプライマーは、試薬キット中に包含される。このような態様において、増幅されたＤＮＡは、検出プローブおよびエンハンサープローブの鋳型として役立つ。
検出プローブ、エンハンサープローブ、および／またはＰＣＲによる鋳型の増幅に用いられるプライマーの一定の態様は、修飾Ａおよび修飾Ｇを含めた修飾塩基の使用を包含する。修飾塩基の使用は、鋳型ＤＮＡへのヌクレオチド分子（プローブおよび／またはプライマー）の融解温度を調整するために、例えば、３個の水素結合をその相補的Ｔへ形成する能力を有する修飾Ａを用いることができる、低百分率のＧまたはＣ塩基を含有する領域の融解温度を増加させるために、または高百分率のＧまたはＣ塩基を含有する領域の融解温度を、例えば、二本鎖ＤＮＡ分子中において２個の水素結合だけをそれらの相補的Ｃ塩基へ形成する修飾Ｇ塩基を用いることによって減少させるために有用でありうる。好ましい態様において、修飾塩基は、検出ヌクレオチドプローブの設計に用いられる。当業者に知られているいずれの修飾塩基も、これら方法で選択することができ、そして適する塩基の選択は、本明細書中の内容および当業者に知られている市販元から入手可能な既知の塩基に基づいて、十分に当業者の範囲内である。
一つのこのような態様において、マーカーまたはハプロタイプの存在は、心房細動および／または脳卒中への感受性（増加した感受性または減少した感受性）を示している。別の態様において、マーカーまたはハプロタイプの存在は、心房細動および／または脳卒中治療薬への応答を示している。別の態様において、マーカーまたはハプロタイプの存在は、心房細動および／または脳卒中の予後を示している。また別の態様において、マーカーまたはハプロタイプの存在は、心房細動および／または脳卒中処置の進行を示している。このような処置には、外科手術、投薬または他の手段（例えば、ライフスタイル変更）による介入が含まれてよい。
治療薬
本発明の変異体（例えば、本発明のマーカーおよび／またはハプロタイプ、例えば、表５Ａおよび表５Ｂおよび／または表１９に示されるマーカー）は、心臓不整脈（例えば、心房細動または心房粗動）および／または脳卒中のための新規な治療的標的を識別するのに用いることができる。例えば、心臓不整脈（例えば、心房細動または心房粗動）および／または脳卒中に関連した変異体（マーカーおよび／またはハプロタイプ）を含有する、またはそれと連鎖不平衡の遺伝子またはそれらの産物、更には、これら変異体遺伝子またはそれらの産物によって直接的にまたは間接的に調節されるまたはそれと相互作用する遺伝子またはそれらの産物は、心臓不整脈（例えば、心房細動または心房粗動）および／または脳卒中を処置する、または心臓不整脈（例えば、心房細動または心房粗動）および／または脳卒中に関連した症状の発症を予防するまたは遅らせる治療薬の開発の標的とすることができる。治療薬は、例えば、標的遺伝子またはそれらの遺伝子産物の機能および／またはレベルをモジュレーションすることができる非タンパク質および非核酸の低分子、タンパク質、ペプチド、タンパク質フラグメント、核酸（ＤＮＡ、ＲＮＡ）、ＰＮＡ（ペプチド核酸）、またはそれらの誘導体または模擬体の一つまたはそれを超えるものを含んでいてよい。
本発明の核酸および／または変異体、またはそれらの相補的配列を含む核酸は、アンチセンスコンストラクトとして用いられて、細胞、組織または器官における遺伝子発現を制御することができる。アンチセンス技法に関連した方法は、当熟練者に周知であり、AntisenseDrug Technology: Principles, Strategies, and Applications, Crooke, ed., Marcel Dekker Inc., New York (2001) に記載され且つ概説されている。概して、アンチセンス核酸分子は、遺伝子によって発現されるｍＲＮＡの領域に相補的であるように設計されるので、そのアンチセンス分子は、ｍＲＮＡにハイブリッド形成し、したがって、ｍＲＮＡのタンパク質への翻訳をブロックする。いくつかのクラスのアンチセンスオリゴヌクレオチドが、当業者に知られていて、クリーバー（cleavers）およびブロッカー（blockers）が含まれる。前者は、標的ＲＮＡ部位に結合し、細胞内ヌクレアーゼ（例えば、ＲｎａｓｅＨまたはＲｎａｓｅＬ）を活性化し、それが、標的ＲＮＡを切断する。ブロッカーは、標的ＲＮＡに結合し、リボソームの立体障害によってタンパク質翻訳を阻害する。ブロッカーの例には、核酸、モルホリノ化合物、施錠核酸およびメチルホスホネートが含まれる（Thompson, Drug Discovery Today, 7:912-917(2002)）。アンチセンスオリゴヌクレオチドは、治療薬として直接的に有用であるし、そして更に、例えば、遺伝子ノックアウトまたは遺伝子ノックダウン実験によって遺伝子機能を決定し且つ確認するのに有用である。アンチセンス技術は、更に、Lavery et al., Curr. Opin. Drug Discov. Devel. 6:561-569(2003), Stephens et al., Curr. Opin. Mol. Ther. 5:118-122(2003), Kurreck, Eur. J. Biochem. 270:1628-44(2003), Dias et al., Mol. Cancer Ter. 1:347-55(2002), Chen, Methods Mol. Med. 75:621-636(2003), Wang et al., Curr. Cancer Drug Targets 1:177-96(2001) および Bennett, Antisense Nucleic Acid Drug. Dev. 12:215-24(2002) に記載されている。
本明細書中に記載の変異体は、特定の変異体に特異的であるアンチセンス試薬の選択および設計に用いることができる。本明細書中に記載の変異体についての情報を用いると、本発明の一つまたはそれを超える変異体を含有するｍＲＮＡ分子を特異的に標的とするアンチセンスオリゴヌクレオチドまたは他のアンチセンス分子を設計することができる。この方式で、本発明の一つまたはそれを超える変異体（マーカーおよび／またはハプロタイプ）を含有するｍＲＮＡ分子の発現を、阻害するまたはブロックすることができる。一つの態様において、アンチセンス分子は、標的核酸の特定の対立遺伝子形（すなわち、一つまたはいくつかの変異体（対立遺伝子および／またはハプロタイプ））を特異的に結合するように設計され、それによって、この特異的対立遺伝子またはハプロタイプに由来する産物の翻訳を阻害するが、それは、標的核酸分子の特定の多型性部位にある他のまたは別の変異体を結合することはない。
アンチセンス分子は、遺伝子発現を、したがって、タンパク質発現を阻害するように、ｍＲＮＡを失活させるのに用いることができるので、それら分子は、心臓不整脈（例えば、心房細動または心房粗動）および／または脳卒中などの疾患または障害を処置するのに用いることができる。その方法は、翻訳されるｍＲＮＡの能力を減衰させるｍＲＮＡ中の一つまたはそれを超える領域に相補的なヌクレオチド配列を含有するリボザイムによる切断を包含することができる。このようなｍＲＮＡ領域には、例えば、タンパク質コーディング領域、具体的には、触媒活性に該当するタンパク質コーディング領域、基質および／またはリガンド結合部位、またはタンパク質の他の機能性ドメインが含まれる。
ＲＮＡ干渉（ＲＮＡｉ）の現象は、C. elegans（Fire et al., Nature 391:806-11(1998)）のその最初の発見以来、この１０年間、活発に研究されてきたが、近年、ヒト疾患の処置におけるその可能性のある使用が、活発に追求されている（Kim & Rossi, Nature Rev. Genet. 8:173-204(2007) に概説される）。ＲＮＡ干渉（ＲＮＡｉ）は、遺伝子サイレンシングとも称され、二本鎖ＲＮＡ分子（ｄｓＲＮＡ）を用いて特定の遺伝子を止めることに基づく。細胞中において、細胞質二本鎖ＲＮＡ分子（ｄｓＲＮＡ）は、細胞複合体によってプロセシングされて、低分子干渉性ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）になる。そのｓｉＲＮＡは、標的ｍＲＮＡ上の特異的部位へのタンパク質−ＲＮＡ複合体のターゲッティングを導いて、ｍＲＮＡの切断をもたらす（Thompson, Drug Discovery Today, 7:912-917(2002)）。ｓｉＲＮＡ分子は、典型的に、約２０、２１、２２または２３ヌクレオチド長さである。したがって、本発明の一つの側面は、単離された核酸分子、およびＲＮＡ干渉のための、すなわち、低分子干渉性ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）としてのそれら分子の使用に関する。一つの態様において、それら単離された核酸分子は、１８〜２６ヌクレオチド長さ、好ましくは、１９〜２５ヌクレオチド長さ、より好ましくは、２０〜２４ヌクレオチド長さ、そしてより好ましくは、２１、２２または２３ヌクレオチド長さである。
ＲＮＡｉに媒介される遺伝子サイレンシングの別の経路は、内因的にエンコードされた一次ミクロＲＮＡ（ｐｒｉ−ｍｉＲＮＡ）転写物において生じ、それは、細胞中でプロセシングされて、前駆体ｍｉＲＮＡ（ｐｒｅ−ｍｉＲＮＡ）を生じる。これらｍｉＲＮＡ分子は、核から細胞質へと輸出され、そこで、それらはプロセシングされて、成熟ｍｉＲＮＡ分子（ｍｉＲＮＡ）を生じ、それが、ｍＲＮＡの３’未翻訳領域の標的部位を認識することによる翻訳阻害、およびＰ体をプロセシングすることによる引き続きのｍＲＮＡ分解を支配する（Kim & Rossi, Nature Rev. Genet. 8:173-204(2007) に概説される）。
ＲＮＡｉの臨床的用途には、合成ｓｉＲＮＡ二重らせんの包含が含まれるが、それは、好ましくは、約２０〜２３ヌクレオチドサイズであり、そして好ましくは、２個のヌクレオチドの３’オーバーラップを有する。遺伝子発現のノックダウンは、標的ｍＲＮＡの配列特異的設計によって確かめられる。このような分子の最適な設計および合成のためのいくつかの市販部位は、当業者に知られている。
他の用途は、より長いｓｉＲＮＡ分子（典型的に、２５〜３０ヌクレオチド長さ、好ましくは、約２７ヌクレオチド）、更には、低分子ヘアピンＲＮＡ（ｓｈＲＮＡ；典型的には、約２９ヌクレオチド長さ）を与える。後者は、Amarzguioui et al.（FEBS Lett. 579:5974-81(2005)）に記載のように、天然に発現される。化学合成ｓｉＲＮＡおよびｓｈＲＮＡは、in vivo プロセシングの基質であり、そして若干の場合、より短い設計よりも強力な遺伝子サイレンシングを与える（Kim et al., Nature Biotechnol. 23:222-226(2005); Siolas et al., Nature Biotechnol. 23:227-231(2005)）。概して、ｓｉＲＮＡは、それらの細胞内濃度が、引き続きの細胞分裂によって希釈されるので、遺伝子発現の一時的サイレンシングを与える。対照的に、発現されたｓｈＲＮＡは、標的転写物の長期の安定なノックダウンを、ｓｈＲＮＡの転写が起こる限りの間媒介する（Marques et al., Nature Biotechnol. 23:559-565(2006); Brummelkamp et al., Science 296:550-553(2002)）。
ｓｉＲＮＡ、ｍｉＲＮＡおよびｓｈＲＮＡを含めたＲＮＡｉ分子は、配列依存方式で働くので、本発明の変異体（例えば、ＬＤブロックＣ０４に関連したマーカーおよびハプロタイプ、例えば、表５Ａおよび表５Ｂに示されるマーカー）は、特異的対立遺伝子および／またはハプロタイプ（例えば、本発明の対立遺伝子および／またはハプロタイプ）を含む特異的核酸分子を認識するが、他の対立遺伝子またはハプロタイプを含む核酸分子を認識しないＲＮＡｉ試薬を設計するのに用いることができる。これらＲＮＡｉ試薬は、したがって、標的核酸分子を認識し且つ破壊することができる。アンチセンス試薬の場合のように、ＲＮＡｉ試薬は、治療薬として（すなわち、疾患関連遺伝子または疾患関連遺伝子変異体を止めるのに）有用でありうるが、遺伝子機能を（例えば、遺伝子ノックアウトまたは遺伝子ノックダウン実験によって）特性決定し且つ確認するのにも有用でありうる。
ＲＮＡｉの送達は、当業者に知られている一定範囲の方法によって行うことができる。非ウイルス送達を利用した方法には、コレステロール、安定な核酸−脂質粒子（ＳＮＡＬＰ）、重鎖抗体フラグメント（Ｆａｂ）、アプタマーおよびナノ粒子が含まれる。ウイルス送達方法には、レンチウイルス、アデノウイルスおよびアデノ随伴ウイルスの使用が含まれる。ｓｉＲＮＡ分子は、若干の態様において、それらの安定性を増加させるように化学修飾される。これには、２’−Ｏ−メチルプリンおよび２’−フルオロピリミジンを含めた、リボースの２’位での修飾が含まれうるが、それは、Ｒｎａｓｅ活性への耐性を与える。他の化学修飾は、可能であるし且つ当業者に知られている。
次の参考文献は、ＲＮＡｉについての更なる要約、およびＲＮＡｉを用いて特異的遺伝子に標的指向する可能性を与える。Kim & Rossi, Nat. Rev. Genet. 8:173-184(2007), Chen & Rajewsky, Nat. Rev. Genet. 8:93-103(2007), Reynolds, et al., Nat. Biotechnol. 22:326-330(2004), Chi et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 100:6343-6346(2003), Vickers et al., J. Biol. Chem. 278:7108-7118(2003), Agami, Curr. Opin. Chem. Biol. 6:829-834(2002), Lavery, et al., Curr. Opin. Drug Discov. Devel. 6:561-569(2003), Shi, Trends Genet. 19:9-12(2003), Shuey et al., Drug Discov. Today 7:1040-46(2002), McManus et al., Nat. rev. Genet. 3:737-747(2002), Xia et al., Nat. Biotechnol. 20:1006-10(2002), Plasterk et al., curr. Opin. Genet. Dev. 10:562-7(2000), Bosher et al., Nat. Cell Biol. 2:E31-6(2000) および Hunter, Curr. Biol. 9:R440-442(1999)。
心臓不整脈（例えば、心房細動または心房粗動）および／または脳卒中を含めた疾患の増加した素因またはその発生リスクをもたらす遺伝的欠損、またはその疾患を引き起こす欠損は、その欠損を有する対象に、その遺伝的欠損部位に一つまたは複数の正常／野生型ヌクレオチドを供給する修復配列を包含する核酸フラグメントを投与することによって、永続的に修正することができる。このような部位特異的修復配列は、対象のゲノムＤＮＡの内因的修復を促進するように機能するＲＮＡ／ＤＮＡオリゴヌクレオチドを包含することができる。修復配列の投与は、アニオンリポソーム中にカプセル封入された、ポリエチレンイミン（polyethelenimine）との複合体などの適当なビヒクル、アデノウイルスベクターなどのウイルスベクター、または投与された核酸の細胞内取込みを促進するのに適する他の医薬組成物によって行うことができる。次に、遺伝的欠損は、キメラオリゴヌクレオチドが、対象のゲノム中への正常配列の包含を誘導して、正常／野生型遺伝子産物の発現をもたらすので、克服することができる。その置換は増殖し、したがって、疾患または状態に関連した症状の永続的修復および軽減を与える。
本発明は、心臓不整脈、例えば、心房細動および心房粗動、および脳卒中を処置するのに用いることができる化合物または物質を識別する方法を提供する。したがって、本発明の変異体は、治療薬の識別および／または開発のための標的として有用である。このような方法は、本発明の変異体（マーカーおよび／またはハプロタイプ）の少なくとも一つを包含する核酸、またはその核酸のエンコードされた産物の活性および／または発現をモジュレーションする物質または化合物の能力を検定することを包含することができる。これは、順次、そのエンコードされた核酸産物の望ましくない活性または発現を阻害するまたは変化させる物質または化合物を識別するのに用いることができる。このような実験を行う検定は、当業者に知られているように、細胞に基づくシステムまたは細胞不含システムで行うことができる。細胞に基づくシステムには、目的の核酸分子を天然に発現する細胞、またはある一定の所望の核酸分子を発現するように遺伝子修飾された組換え細胞が含まれる。
患者における変異体遺伝子発現は、変異体含有核酸配列（例えば、少なくとも一つの変異体を含有するＲＮＡへと転写され、そして順次、タンパク質へと翻訳されうる、本発明の少なくとも一つの変異体を含有する遺伝子）の発現によって、または正常転写物の発現のレベルまたはパターンに影響する変異体、例えば、遺伝子の調節または制御領域の変異体ゆえの、正常／野生型核酸配列の変化した発現によって評価することができる。遺伝子発現の検定には、直接核酸検定（ｍＲＮＡ）、発現されたタンパク質レベルの検定、またはある経路、例えば、シグナル経路に関与する付帯化合物の検定が含まれる。更に、シグナル経路に応答してアップレギュレーションまたはダウンレギュレーションされる遺伝子の発現も、検定することができる。一つの態様は、ルシフェラーゼなどのレポーター遺伝子を、目的の一つまたは複数の遺伝子の調節領域へ機能的に連結することを包含する。
遺伝子発現のモジュレーターは、一つの態様において、細胞を、候補化合物または物質と接触させ、そしてｍＲＮＡの発現が確かめられた時に、識別することができる。候補化合物または物質の存在下におけるｍＲＮＡの発現レベルを、その化合物または物質の不存在下における発現レベルと比較する。この比較に基づいて、心房細動、心房粗動および脳卒中などの障害を処置する候補化合物または物質を、変異体遺伝子の遺伝子発現をモジュレーションするものとして識別することができる。ｍＲＮＡおよびエンコードされたタンパク質の発現が、候補化合物または物質の存在下において、その不存在の場合より統計的に有意に大きい場合、その候補化合物または物質を、核酸の発現の刺激剤またはアップレギュレーターとして識別する。核酸発現またはタンパク質レベルが、候補化合物または物質の存在下において、その不存在の場合より統計的に有意に小さい場合、その候補化合物を、核酸発現の阻害剤またはダウンレギュレーターとして識別する。
本発明は、更に、薬物（化合物および／または物質）スクリーニングによって、遺伝子モジュレーター（すなわち、遺伝子発現の刺激剤および／または阻害剤）として識別された化合物を用いた処置方法を提供する。
本発明のもう一つの側面において、製剤パック（キット）であって、治療薬と、本明細書中に開示の本発明の一つまたはそれを超える変異体について診断検査されたヒトへのその治療薬の投与のための一組の取扱説明書を含むパックを提供する。その治療薬は、低分子薬物、抗体、ペプチド、アンチセンスまたはＲＮＡｉ分子、または他の治療的分子でありうる。一つの態様において、本発明の少なくとも一つの変異体の保有者として識別された個体は、処方用量の治療薬を摂取するように指示される。一つのこのような態様において、本発明の少なくとも一つの変異体のホモ接合保有者として識別された個体は、処方用量の治療薬を摂取するように指示される。別の態様において、本発明の少なくとも一つの変異体の非保有者として識別された個体は、処方用量の治療薬を摂取するように指示される。
治療薬への応答の確率を評価する方法、処置の進行を監視する方法、および処置方法
当該技術分野において知られているように、個体は、特定の療法（例えば、治療薬または治療方法）への異なった応答を有することがありうる。ファーマコジェノミクスは、遺伝的変異（例えば、本発明の変異体（マーカーおよび／またはハプロタイプ））が、変化した薬物素質および／または異常なまたは変化した薬物作用ゆえに、薬物応答にどのように影響するかという問題に取り組んでいる。したがって、異なった応答の根拠は、概して、一部分は確かめることができる。薬物応答に影響する遺伝的変異による臨床結果は、一定の個体（例えば、本発明の遺伝子変異体の保有者または非保有者）に薬物毒性を、または薬物の治療的失敗を生じることがありうる。したがって、本発明の変異体は、治療薬および／または治療方法が身体に働く方式、または身体が治療薬を代謝する方法を決定することがありうる。
したがって、一つの態様において、多型性部位の特定の対立遺伝子またはハプロタイプの存在は、特定の処置様式への異なった、例えば、異なった応答速度を示している。これは、心臓不整脈（例えば、心房細動または心房粗動）および／または脳卒中と診断され且つ本発明の多型性のある一定の対立遺伝子またはハプロタイプ（例えば、本発明のリスク負担および保護的対立遺伝子および／またはハプロタイプ）を有する患者が、その疾患を処置するのに用いられる特定の治療的薬物および／または他の療法により良くまたは一層悪く応答すると考えられるということを意味する。したがって、マーカー対立遺伝子またはハプロタイプの存在または不存在は、何の処置を患者に用いるべきか決定するのを助けうると考えられる。例えば、新たに診断された患者について、本発明のマーカーまたはハプロタイプの存在を（例えば、本明細書中に記載のように、血液試料に由来するＤＮＡを調べることによって）評価することができる。その患者が、マーカー対立遺伝子またはハプロタイプに陽性である（すなわち、そのマーカーの少なくとも一つの特異的対立遺伝子またはハプロタイプが存在する）場合、医師は、一つの具体的な療法を推奨するが、その患者が、マーカーの少なくとも一つの対立遺伝子またはハプロタイプに陰性である場合、異なった過程の療法が推奨されることがありうる（それには、疾患の進行について連続的に監視することを除いて、即時療法を行わないことを推奨することが含まれてよい）。したがって、患者の保有者状態は、特定の処置様式を投与すべきかどうかを決定するのを助けるのに用いられうると考えられる。その価値は、疾患を初期段階で診断すること、最も適当な処置を選択すること、そして最も適当な処置を適用することができるように疾患の予後／攻撃性について臨床医に情報を与えることができるという可能性の範囲内にある。
心房細動および心房粗動の処置は、概して、二つの主な目的：（ｉ）脳卒中を予防するおよび（ii）症状を処置する目的によって指向する。
（ｉ）脳卒中予防
抗凝固は、心房細動の場合の脳卒中予防に選択される療法であり、この不整脈を有する患者の大多数に必要とされる。抗凝固を強く推奨されない唯一の患者は、低リスクと考えられる６５歳より若い患者である、すなわち、彼らは、器質性心疾患も、高血圧症も、脳卒中または一過性脳虚血発作の既往歴も、そして糖尿病も有していない。全体としてのこの群は、脳卒中のリスクが一層低く、概して、アスピリンでの脳卒中予防を推奨される。他の患者全てについて、抗凝固は、その心房細動が永続的であれ、再発性発作性であれ、または再発性持続性であれ、必要とされる。発作性心房細動の初回エピソードを示している患者を、どのように処置すべきかということを一般化することはできないし、しかもその決定は、各々の患者について個別化する必要がある。抗凝固は、更に、心房細動を有する患者が、抗不整脈療法での洞調律（制御された律動）で維持されていると感じている場合でも、このタイプの療法は、脳卒中リスクに影響しないので、必要とされる。
抗凝固薬。抗凝固は、上に詳述のように、心房細動の場合に、心臓塞栓症および脳卒中の予防のために推奨される。最も広く研究されている経口抗凝固薬は、ワルファリンであり、この薬剤は、心房細動の場合に長期経口抗凝固に普遍的に推奨される。ワルファリンは、出血のリスクは別として、ほとんど副作用がないが、療法中に（抗凝固の作用を測定する）血液値を規則的且つ慎重に監視する必要がある。経口抗凝固薬ジメラガトランは、心房細動を有する患者の脳卒中予防に有望であったし、しかもワルファリンのような規則的監視を必要としないという利点を有した。ジメラガトランは、しかしながら、説明されていない肝傷害を引き起こすことが判明したので、２００６年に市場から撤去された。ヘパリンおよび低分子量ヘパリン（例えば、エノキサパリン、ダルテパリン、チンザパリン、アルデパリン、ナドロパリンおよびレビパリン）を含めたいくつかの物質は、静脈内および／または皮下療法に利用可能である。これら薬剤は、抗凝固の急速開始が必要な場合、または経口抗凝固療法を、高リスク患者において、または他の患者では、例えば、一連の手順ゆえに１週間より長期間中断する必要がある場合に推奨される。他の非経口抗凝固薬、例えば、第Ｘａ因子阻害剤フォンダパリヌクスおよびイドラパリヌクス；トロンビン阻害剤レピルジン、ビバリルジンおよびアルガトロバン；並びにダナパロイドは、利用可能であるが、心房細動の療法としては特に推奨されない。
（ii）症状制御。心房細動の症状を制御するのに適用される内科および外科療法は、個々の患者に特注され、しかも投薬、高周波焼灼および／または外科手術での心拍数および／または律動制御から成る。
抗不整脈薬。概して、抗不整脈薬は、心房細動および心房粗動を含めた心臓不整脈に特有である心臓の異常律動を抑制するのに用いられる。抗不整脈薬の一つの分類は、五つの主なカテゴリーの抗不整脈薬を定義している Vaughan Williams 分類である。クラスＩ物質は、急速ナトリウムチャンネル遮断薬であり、遮断の速度論および強さ（strenght）並びにそれらの再分極作用に基づいて下位分類される。クラスＩａには、ジソピラミド、モリシジン、プロカインアミドおよびキニジンが含まれる。クラスＩｂ物質は、リドカイン、メキシレチン、トカイニドおよびフェニトインである。クラスＩｃ物質は、エンカイニド、フレカイニド、プロパフェノン、アジマリン、シベンゾリンおよびデタジミウムである。クラスII物質は、β遮断薬であり、それらは、カテコールアミンの作用をβアドレナリン受容体でブロックする。β遮断薬の例は、エスモロール、プロプラノロール、メトプロロール、アルプレノロール、アテノロール、カルベディロール、ビソプロロール、アセブトロール、ナドロール、ピンドロール、ラベタロール、オクスプレノトール、ペンブトロール、チモロール、ベタキソロール、カルテロール、ソタロールおよびレボブノロールである。クラスIII物質は、混合された性質を有するが、集合的には、カリウムチャンネル遮断薬であり且つ再分極を延長する。このカテゴリーの薬剤は、アミオダロン、アジミリド、ブレチリウム、ドフェチリド、テジサミル、イブチリド、セマチリド、ソタロール、Ｎ−アセチルプロカインアミド、ニフェカラント塩酸塩、ベルナカラントおよびアンバシリドである。クラスIV物質は、カルシウムチャンネル遮断薬であり、それには、ベラパミル、ミベフラジルおよびジルチアゼムが含まれる。最後に、クラスＶは、種々雑多な抗不整脈から成り、それには、ジゴキシンおよびアデノシンが含まれる。
心拍数制御。心拍数制御の維持のための薬理学的処置には、β遮断薬、カルシウムチャンネル遮断薬およびジゴキシンが含まれる。これら薬剤は全て、房室結節を介する電気伝導を遅らせ且つ急速心房細動への心室速度応答を遅らせる。律動制御（下を参照されたい）に主に用いられる若干の抗不整脈薬も、房室結節伝導速度を遅らせ、したがって、心室速度応答を遅らせる。これらには、アミオダロン、ソタロールおよびフレカイニドなどの若干のクラスIIIおよびクラスＩｃ薬剤が含まれる。
心臓除細動。心房細動または心房粗動から洞調律への心臓律動の除細動は、同期直流除細動で電気的に、またはイブチリド、アミオダロン、プロカインアミド、プロファフェノンおよびフレカイニドなどの薬剤で達成することができる。
心臓律動制御
洞調律、すなわち、律動制御の維持に用いられる薬剤には、主に、クラスIII、クラスＩａおよびクラスＩｃからの抗不整脈薬が含まれる。例は、クラスIIIからのソタロール、アミオダロンおよびドフェチリド；クラスＩａからのジソピラミド、プロカインアミドおよびキニジン；およびクラスＩｃからのフレカイニド（flecinide）およびプロパフェノンである。これら抗不整脈薬での処置は、複雑であり、危険でありうるし、しかもこれら薬剤を用いるために特に教育された医師によって管理されるべきである。抗不整脈薬の多くは、重症の副作用を有するので、特定の集団にのみ用いられるべきである。例えば、クラスＩｃ薬剤は、冠状動脈疾患を有する患者に用いられるべきでないし、しかもそれらが、心房細動を抑制することができる場合でも、それらは、実は、心房粗動の急速心室応答を促進することがありうる。クラスＩａ薬剤は、構造性心疾患のない患者において最後の手段として用いることができる。ソタロール（最高のクラスIII抗不整脈薬として）は、具体的には、腎不全を有する患者において、ＱＴ間隔の有意の延長を引き起こし、そして重症の心室性不整脈を促進することがありうる。ソタロールおよびドフェチリド双方、並びにＩａ薬剤は、入院患者を基準として開始して、ＱＴ間隔を監視する必要がある。アミオダロンは、通常は、十分に許容され且つ広く用いられているが、アミオダロンは、長期療法で多くの重症の副作用を有する。
遺伝診断は、処置の選択肢にどのように直接的に影響するか
個体が、発作性心房細動の初回（診断）エピソードを示し、そして自発的に洞調律へと変換するかまたはそのエピソード中への４８時間未満の電気的または化学的除細動を受ける場合、抗凝固療法を開始するまたは開始しない決定は、問題の患者のリスクプロフィールおよび管理している医師の選択に基づいて個別化される。これは、抗凝固療法への患者の委託が、患者生活に重大な影響を有するので、行うのが難しい選択肢でありうる。しばしば、このような状況では、抗凝固を差し控える選択が行われ、そしてこれは、患者にとって全く意義のないことでありうる。もう一方で、患者は、脳卒中を後に発生することがあり、したがって、予防の機会が失われたもしれない。このような状況において、その患者が、リスク負担変異体の保有者であるということを知ることは、極めて有意義であり且つ抗凝固処置の開始を支持することができる。
心房細動と診断されている６５歳未満の個体は、それ以外には、脳卒中へのリスクが低いと考えられる、すなわち、器質性心疾患も、高血圧症も、糖尿病も、そして脳卒中の既往歴も有していないし、概して、脳卒中予防のためだけに、抗凝固ではなくアスピリンで処置される。このような患者が、本明細書中に記載のリスク負担変異体の保有者であると判明した場合、これは、それ以外に推奨されるよりも早期に抗凝固を開始する支持と考えられうる。これは、心房細動からの脳卒中の結果が、破壊的でありうるので、合理的な考慮であると考えられる。
虚血性脳卒中は、概して、疑われる原因に基づいて五つのサブタイプ、すなわち、大動脈アテローム性動脈硬化症；小動脈閉塞症；心臓塞栓症（心房細動による大部分）；他の決定原因の脳卒中；および未決定原因（見出される原因がないかまたは１より大の一見信頼できそうな原因）の脳卒中に分類される。重要なことに、心臓塞栓症による脳卒中は、最も高い再発率を有し、最も多く無能力にするし、そして最低の生存率に関連している。したがって、具体的には、そのサブタイプに基づいて処置が異なるので、脳卒中の主な原因として心房細動を見逃さないことが肝要である。したがって、ある個体が、脳卒中または一過性脳虚血発作と診断され、そして標準的な処理にもかかわらず、一見信頼できそうな原因が識別されない場合、その患者が、リスク負担変異体の保有者であるということを知ることは、極めて有効であり且つ抗凝固処置の開始かまたは、心房細動を診断することを試みる一層積極的な診断検査を支持することができる。
更に、本発明のマーカーは、臨床試験の能力および有効性を増加させるのに用いることができる。したがって、本発明の少なくとも一つのリスク負担変異体の保有者である個体、すなわち、心臓不整脈（例えば、心房細動または心房粗動）および／または脳卒中を発生する増加したリスクを与える少なくとも一つの多型性マーカーの少なくとも一つの対立遺伝子の保有者である個体は、例えば、上に記載のように、特定の処置様式に応答する可能性がありうる。一つの態様において、特定の処置（例えば、低分子薬物）が標的としている経路および／または代謝ネットワーク中の一つまたは複数の遺伝子のリスク負担変異体を有する個体は、その処置への応答個体である可能性がある。別の態様において、ある遺伝子のリスク負担変異体であって、その発現および／または機能が、そのリスク負担変異体によって変化するものを有する個体は、その遺伝子、その発現またはその遺伝子産物を標的とする処置様式の応答個体である可能性がある。この適用は、臨床試験の安全性を改善することができるが、ある臨床試験が、集団のある一定の部分群に限られることがありうる統計的に有意の効力を示すであろう可能性を増大させることもできる。したがって、このような試験の一つの可能な結果は、一定の遺伝子変異体、例えば、本発明のマーカーおよびハプロタイプの保有者が、統計的に有意に、治療薬への正の応答を示す、すなわち、処方される治療薬または薬物を摂取時に、心臓不整脈（例えば、心房細動または心房粗動）および／または脳卒中に関連した症状の軽減を経験する可能性があるということである。
もう一つの側面において、本発明のマーカーおよびハプロタイプは、特定の個体のための薬剤の選択を標的とするのに用いることができる。処置用式、ライフスタイル変更またはその二つの組合せの個人的選択は、本発明のリスク負担変異体の利用によって実現することができる。したがって、本発明の具体的なマーカーのある個体での状態の知見は、本発明のリスク負担変異体によって影響される遺伝子または遺伝子産物を標的とする処置選択肢の選択に有用でありうる。一定の変異体組合せは、処置選択肢の一つの選択に適していることがありうるが、他の遺伝子変異体組合せは、他の処置選択肢を標的とすることがありうる。このような変異体組合せには、臨床的に信頼できる正確度で処置モジュールの選択を決定するのに必要とされる一つの変異体、二つの変異体、三つの変異体、または四つまたはそれを超える変異体が含まれてよい。
計算機実行用途
本発明は、更に、本明細書中に、心臓不整脈（例えば、心房細動および心房粗動）および脳卒中に関連していると記載された多型性マーカーおよびハプロタイプの計算機実行用途に関する。このような用途は、本発明の方法に有用である遺伝子型データを蓄積し、操作し、またはそれ以外に分析するのに有用でありうる。一つの例は、ある個体に由来する遺伝子型情報を、第三者（例えば、その個体）にその遺伝子型情報を与えることができるように、または例えば、その遺伝子型データから、心臓不整脈（例えば、心房細動および心房粗動）および脳卒中への増加した感受性に寄与している遺伝的リスクファクターについての情報とその遺伝子型データを比較することによって情報を得、そしてこのような比較に基づく結果を報告するために、読み取り可能媒体上に蓄積することに関する。
一つのこのような側面は、計算機読み取り可能媒体に関する。概して、このような媒体は、（ｉ）少なくとも一つの多型性マーカーまたはハプロタイプのアイデンティファイアー情報；（ii）心臓不整脈（例えば、心房細動および心房粗動）および／または脳卒中を有する個体における、この少なくとも一つのマーカーの少なくとも一つの対立遺伝子の頻度、またはハプロタイプの頻度の指標；および基準集団における、この少なくとも一つのマーカーの少なくとも一つの対立遺伝子の頻度、またはハプロタイプの頻度の指標を蓄積する容量を有する。基準集団は、疾患のない個体集団でありうる。或いは、基準集団は、一般的な集団からの無作為試料であり、したがって、全体としての集団を代表するものである。頻度指標は、計算される頻度、対立遺伝子および／またはハプロタイプコピーの計数、または特定の媒体に適する実際頻度の規格化されたまたはそれ以外に操作された値であってよい。
個体についての、家系情報、性別についての情報、身体的性質または特徴（身長および体重を含めた）、生化学的測定値（血圧、血中脂質レベル、空腹時グルコースレベル、インスリン応答測定値など）、バイオマーカー結果、または特定の個体の遺伝子型状態の場合に蓄積するまたは操作することが望まれる他の有用な情報などの追加の情報は、媒体上に蓄積することができる。
本発明は、更に、ヒト個体の心臓不整脈（例えば、心房細動および心房粗動）および脳卒中への感受性を決定するのに有用な遺伝子データの決定または操作に適している装置に関する。このような装置は、計算機読み取り可能メモリー；その計算機読み取り可能メモリーに蓄積されるデータを操作するためのルーチン；および遺伝子データの尺度を包含する出力を生じるためのルーチンを包含することができる。このような尺度には、対立遺伝子またはハプロタイプ頻度などの値、遺伝子型計数、性別、年齢、表現型情報、オッズ比（ＯＲ）または相対リスク（ＲＲ）の値、人口寄与リスク（ＰＡＲ）、または元の遺伝子型データの直接統計量であるかまたは遺伝子データに基づく計算に基づいている他の有用な情報が含まれうる。
上記の用途は、全て、心臓不整脈（例えば、心房細動および心房粗動）および脳卒中への感受性を評価する方法に関して更に詳細に記載された本発明のマーカーおよびハプロタイプで実施することができる。したがって、これら用途は、概して、表５、表４、表９および表１９に示されるマーカー、およびそれと連鎖不平衡のマーカーを用いて実施するように変えることができる。一つの態様において、それらマーカーおよびハプロタイプは、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：５０に配列が示されているゲノムセグメント中に存在する。別の態様において、マーカーおよびハプロタイプは、表１９に示されるマーカーより選択される少なくとも一つのマーカーを含む。別の態様において、マーカーおよびハプロタイプは、Ｄ４Ｓ４０６（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４５）、ｒｓ２６３４０７３（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３３）、ｒｓ２２００７３３（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２８）、ｒｓ２２２０４２７（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１）、ｒｓ１００３３４６４（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４１）およびｒｓ１３１４３３０８（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：５１）であって、場合により、それと連鎖不平衡のマーカーを含めたものより選択される少なくとも一つのマーカーを含む。一つのこのような態様において、連鎖不平衡は、０．１より大のｒ２の数値によって定義される。別のこのような態様において、連鎖不平衡は、０．２より大のｒ２の数値によって定義される。別の態様において、マーカーおよびハプロタイプは、マーカーＤ４Ｓ４０６中の対立遺伝子−２、−４および／または−８、マーカーｒｓ２６３４０７３の対立遺伝子Ａ、マーカーｒｓ２２００７３３の対立遺伝子Ｔ、マーカーｒｓ２２２０４２７の対立遺伝子Ｔ、マーカーｒｓ１００３３４６４の対立遺伝子Ｔ、および／またはマーカーｒｓ１３１４３３０８の対立遺伝子Ｇより選択される少なくとも一つの対立遺伝子を含む。
核酸およびポリペプチド
本明細書中に記載の核酸およびポリペプチドは、上に記載のように、本発明の方法およびキットで用いることができる。
本明細書中で用いられる「単離された」核酸分子は、遺伝子またはヌクレオチド配列に普通に隣接している核酸から分離される（ゲノム配列の場合のような）および／または他の転写された配列から完全にまたは部分的に精製された（例えば、ＲＮＡライブラリーの場合のような）ものである。例えば、本発明の単離された核酸は、それが天然に存在してる複雑な細胞環境、または組換え技術によって製造された場合の培地、または化学合成された場合の化学的前駆体または他の化学薬品に関して、実質的に単離することができる。若干の場合、単離された材料は、組成物（例えば、他の物質を含有する粗製抽出物）、緩衝系または試薬配合物の一部分を形成するであろう。他の状況において、その材料は、例えば、ポリアクリルアミドゲル電気泳動（ＰＡＧＥ）またはカラムクロマトグラフィー（例えば、ＨＰＬＣ）によって確かめられる本質的な均一性へと精製することができる。本発明の単離された核酸分子は、存在する全ての高分子種の（モル基準で）少なくとも約５０％、少なくとも約８０％または少なくとも約９０％を含むことができる。ゲノムＤＮＡに関して、「単離された」という用語は、ゲノムＤＮＡが天然に関連している染色体から分離される核酸分子を意味することもありうる。例えば、単離された核酸分子は、その核酸分子が由来する細胞のゲノムＤＮＡ中の核酸分子に隣接している約２５０ｋｂ、２００ｋｂ、１５０ｋｂ、１００ｋｂ、７５ｋｂ、５０ｋｂ、２５ｋｂ、１０ｋｂ、５ｋｂ、４ｋｂ、３ｋｂ、２ｋｂ、１ｋｂ、０．５ｋｂまたは０．１ｋｂ未満のヌクレオチドを含有することができる。
核酸分子は、他のコーディングまたは調節配列に融合することがありうるが、それでもなお、単離状態と考えることができる。したがって、ベクター中に含有される組換えＤＮＡは、本明細書中で用いられる「単離された」という定義に包含される。更に、単離された核酸分子には、異種宿主細胞または異種生物中の組換えＤＮＡ分子、更には、溶液中の部分的にまたは実質的に精製されたＤＮＡ分子が含まれる。「単離された」核酸分子は、更に、本発明のＤＮＡ分子の in vivo および in vitro ＲＮＡ転写物を包含する。単離された核酸分子またはヌクレオチド配列には、化学的にまたは組換え手段によって合成される核酸分子またはヌクレオチド配列が含まれうる。このような単離されたヌクレオチド配列は、例えば、エンコードされたポリペプチドの製造において、相同配列を単離するための（例えば、他の哺乳動物種から）、遺伝子地図作製のための（例えば、染色体での in situ ハイブリダイゼーションによる）、または組織（例えば、ヒト組織）における遺伝子の発現をノーザンブロット分析または他のハイブリダイゼーション技術などによって検出するためのプローブとして有用である。
本発明は、更に、選択的ハイブリダイゼーションのためのような、高ストリンジェンシーハイブリダイゼーション条件下において、本明細書中に記載のヌクレオチド配列にハイブリッド形成する核酸分子（例えば、本明細書中に記載のマーカーまたはハプロタイプに関連した多型性部位を含有するヌクレオチド配列に特異的にハイブリッド形成する核酸分子）に関する。一つの態様において、本発明は、高ストリンジェンシーハイブリダイゼーションおよび洗浄条件下において（例えば、選択的ハイブリダイゼーションのための）、ＬＤブロックＣ０４のヌクレオチド配列（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：５０）を含むヌクレオチド配列にハイブリッド形成する変異体を包含する。このような核酸分子は、対立遺伝子または配列に特異的なハイブリダイゼーションによって（例えば、高ストリンジェンシー条件下において）検出するおよび／または単離することができる。核酸ハイブリダイゼーションのためのストリンジェンシー条件および方法は、当業者に周知である（例えば、本明細書中にそれらの内容がそのまま援用される、Current Protocols in Molecular Biology, Ausubel, F. et al, John Wiley & Sons, (1998), および Krau, M. and Aaronson, S., Methods Eyzymol., 200:546-556(1991) を参照されたい）。
二つのヌクレオチドまたはアミノ酸配列のアイデンティティーパーセントは、最適の比較目的で配列を整列させることによって決定することができる（例えば、最初の配列の配列中にギャップを導入することができる）。次に、該当する位置にあるヌクレオチドまたはアミノ酸を比較するが、その二つの配列間のアイデンティティーパーセントは、それら配列によって共有される同一位置の数の関数である（すなわち、アイデンティティー％＝同一位置＃／全位置＃ｘ１００）。一定の態様において、比較目的で整列された配列の長さは、基準配列の長さの少なくとも３０％、少なくとも４０％、少なくとも５０％、少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも９０％または少なくとも９５％である。それら二つの配列の実際の比較は、周知の方法によって、例えば、数学的アルゴリズムを用いて行うことができる。このような数学的アルゴリズムの非制限例は、Karlin, S. and Altschul, S., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 90:5873-5877(1993) に記載されている。このようなアルゴリズムは、Altschul, S. et al., Nucleic Acids Res., 25:3389-3402(1997) に記載のＮＢＬＡＳＴおよびＢＬＡＳＴＸプログラム（２．０バージョン）中に包含されている。ＢＬＡＳＴおよび Gapped ＢＬＡＳＴプログラムを利用した場合、それぞれのプログラム（例えば、ＮＢＬＡＳＴ）の暗黙値パラメーターを用いることができる。ワールドワイドウェブの ncbi.nlm.nih.gov のウェブサイトを参照されたい。一つの態様において、配列比較のためのパラメーターは、スコア＝１００、波長＝１２で設定することができるし、または変更することができる（例えば、Ｗ＝５またはＷ＝２０）。
他の例には、Myers and Miller のＣＡＢＩＯＳ（１９８９年）、Torellis, A. and Robotti, C., Comput. Appl. Biosci. 10:3-5(1994) に記載のＡＤＶＡＮＣＥおよびＡＤＡＭ；および Pearson, W. and Lipman, D., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 85:2444-48(1988) に記載のＦＡＳＴＡのアルゴリズムが含まれる。別の態様において、二つのアミノ酸配列間のアイデンティティーパーセントは、ＧＣＧソフトウェアパッケージ（Accelrys, Cambridge, UK）のＧＡＰプログラムを用いて得ることができる。
本発明は、更に、ＬＤブロックＣ０４のヌクレオチド配列（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：５０）を含むまたはから成る核酸に、またはＬＤブロックＣ０４のヌクレオチド配列（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：５０）の補体を含むまたはから成るヌクレオチド配列に、高ストリンジェント条件下でハイブリッド形成するフラグメントまたは部分を含有する単離された核酸分子を提供するが、ここにおいて、ヌクレオチド配列は、本明細書中に記載のマーカーおよびハプロタイプ中に含有される少なくとも一つの多型性対立遺伝子を含む。本発明の核酸フラグメントは、少なくとも約１５、少なくとも約１８、２０、２３または２５ヌクレオチドであり、そして３０、４０、５０、１００、２００、５００、１０００、１０，０００ヌクレオチドまたはそれを超える長さでありうる。
本発明の核酸フラグメントは、本明細書中に記載のものなどの検定においてプローブまたはプライマーとして用いられる。「プローブ」または「プライマー」は、核酸分子の相補鎖に塩基特異的方式でハイブリッド形成するオリゴヌクレオチドである。ＤＮＡおよびＲＮＡに加えて、このようなプローブおよびプライマーには、Nielsen, P. et al., Science 254:1497-1500(1991) に記載のようなポリペプチド核酸（ＰＮＡ）が含まれる。プローブまたはプライマーは、核酸分子の少なくとも約１５、典型的には、約２０〜２５、そして一定の態様において、約４０、５０または７５連続したヌクレオチドにハイブリッド形成する一定領域のヌクレオチド配列を含む。一つの態様において、プローブまたはプライマーは、本明細書中に記載の少なくとも一つの多型性マーカーの少なくとも一つの対立遺伝子または少なくとも一つのハプロタイプまたはその補体を含む。具体的な態様において、プローブまたはプライマーは、１００またはそれ未満のヌクレオチド、例えば、一定の態様において、６〜５０ヌクレオチド、または例えば、１２〜３０ヌクレオチドを含むことができる。他の態様において、プローブまたはプライマーは、相接するヌクレオチド配列または相接するヌクレオチド配列の補体と、少なくとも７０％同一、少なくとも８０％同一、少なくとも８５％同一、少なくとも９０％同一、または少なくとも９５％同一である。別の態様において、プローブまたはプライマーは、相接するヌクレオチド配列にまたは相接するヌクレオチド配列の補体に、選択的にハイブリッド形成することができる。しばしば、プローブまたはプライマーは、更に、標識、例えば、放射性同位体、蛍光標識、酵素標識、酵素補因子標識、磁気標識、スピン標識、エピトープ標識を含む。
上記のものなどの本発明の核酸分子は、当業者に周知の標準的な分子生物学技法を用いて識別し且つ単離することができる。増幅されたＤＮＡは、標識（例えば、放射性標識）することができ、そしてプローブとして、ヒト細胞に由来するｃＤＮＡライブラリーをスクリーニングするのに用いることができる。そのｃＤＮＡは、ｍＲＮＡに由来し且つ適するベクター中に含有させることができる。該当するクローンは、単離することができ、in vivo 切除後にＤＮＡを得ることができ、そしてクローン化されたインサートを、どちらかまたは双方の配向で、適当な分子量のポリペプチドをエンコードしている正しい読み枠を識別する技術認識されている方法によって配列決定することができる。これらまたは類似の方法を用いると、ポリペプチドおよびそのポリペプチドをエンコードしているＤＮＡを、単離し、配列決定し、そして更に特性決定することができる。
概して、本発明の単離された核酸配列は、サザンゲル上の分子量マーカーとして、および関連遺伝子位置の地図作製のために標識される染色体マーカーとして用いることができる。その核酸配列は、更に、患者の内因性ＤＮＡ配列と比較して、心臓不整脈（例えば、心房細動または心房粗動）および／または脳卒中、または心臓不整脈（例えば、心房細動または心房粗動）および／または脳卒中への感受性を識別するのに用いることができるし、そしてプローブとして、関連ＤＮＡ配列をハイブリッド形成させ且つ発見するように、または試料から既知の配列を差引くように（例えば、差引きハイブリダイゼーション）用いることができる。核酸配列は、更に、遺伝子フィンガープリンティングのためのプライマーを得るのに、免疫感作技法を用いて抗ポリペプチド抗体を上昇させるのに、および／または抗原として、抗ＤＮＡ抗体を上昇させるまたは免疫応答を引き出すのに用いることができる。
抗体
遺伝子産物の一つの形を特異的に結合するが、他の形の遺伝子産物には結合しない多クローン性抗体および／または単クローン性抗体を、更に提供する。一つまたは複数の多型性部位を含有する変異体かまたは基準遺伝子産物の一部分を結合する抗体も提供する。本明細書中で用いられる「抗体」という用語は、免疫グロブリン分子および免疫グロブリン分子の免疫学的に活性な部分、すなわち、抗原を特異的に結合する抗原結合部位を含有する分子を意味する。本発明のポリペプチドに特異的に結合する分子は、そのポリペプチドまたはそのフラグメントには結合するが、そのポリペプチドを天然に含有する試料、例えば、生体試料中の他の分子を実質的に結合しない分子である。免疫グロブリン分子の免疫学的に活性な部分の例には、ペプシンなどの酵素で抗体を処理することによって生じることができるＦ（ａｂ）およびＦ（ａｂ’）２フラグメントが含まれる。本発明は、本発明のポリペプチドに結合する多クローン性抗体および単クローン性抗体を提供する。本明細書中で用いられる「単クローン性抗体」または「単クローン性抗体組成物」は、本発明のポリペプチドの特定のエピトープと免疫反応することができる抗原結合部位の一つの種だけを含有する抗体分子の集団を意味する。したがって、単クローン性抗体組成物は、典型的に、それと免疫反応する本発明の特定のポリペプチドに単一結合親和性を示す。
多クローン性抗体は、上記のように、適する対象を、所望の免疫原、例えば、本発明のポリペプチドまたはそのフラグメントで免疫感作することによって製造することができる。免疫感作された対象における抗体力価は、固定化ポリペプチドを用いた固相酵素免疫検定法（ＥＬＩＳＡ）などでの標準的な技法によって経時監視することができる。所望ならば、ポリペプチドに対して向けられた抗体分子を、哺乳動物から（例えば、血液から）単離し、そして更に、プロテインＡクロマトグラフィーなどのなどの周知の技法によって精製して、ＩｇＧ画分を得ることができる。免疫感作後の適当な時点で、例えば、抗体力価が最高になった時に、抗体生産性細胞を、対象から得且つ用いて、Kohler and Milstein, Nature 256:495-497(1975) によって初めに記載されたハイブリドーマ技法；ヒトＢ細胞ハイブリドーマ技法（Kozbor et al., Immunol. Today 4:72(1983)）；ＥＢＶ−ハイブリドーマ技法（Cole et al., Monoclonal Antibodies and Cancer Therapy, Alan R. Liss, 1985, Inc., pp.77-96）；たはトリオーマ（trioma）技法などの標準的な技法によって単クローン性抗体を製造することができる。ハイブリドーマを製造する技術は、周知である（概して、Current Protocols in Immunology (1994) Coligan et al., (eds.) John wiley & Sons, Inc., New York, NY を参照されたい）。簡単にいうと、不死細胞系（典型的に、骨髄腫）を、上記のような免疫源で免疫疫感作された哺乳動物からのリンパ球（典型的に、脾臓細胞）に融合させ、そして得られたハイブリドーマ細胞の培養物上澄みをスクリーニングして、本発明のポリペプチドを結合する単クローン性抗体を生産するハイブリドーマを識別する。
リンパ球および不死化細胞系を融合するのに用いられる多数の周知のプロトコルはいずれも、本発明のポリペプチドへの単クローン性抗体を生じる目的に適用することができる（例えば、Current Protocols in Immunology, 上記；Galfre et al., Nature 266:55052(1977); R.H. Kenneth, in Monoclonal Antibodies: A New Dimension In Biological Analyses, Plenum Publishing Corp., New York, New York (1980); および Lerner, Yale J. Biol. Med. 54:387-402(1981) を参照されたい）。更に、普通の熟練者は、有用でもあると考えられるこのような方法の多くの変法が存在するということを理解するであろう。
単クローン性抗体分泌性ハイブリドーマを製造することとは別に、本発明のポリペプチドへの単クローン性抗体は、組換えコンビナトリアル免疫グロブリンライブラリー（例えば、抗体ファージ展示ライブラリー）を、そのポリペプチドでスクリーニングすることによって識別し且つ単離し、それによって、ポリペプチドを結合する免疫グロブリンライブラリーメンバーを単離することができる。ファージ展示ライブラリーを生じ且つスクリーニングするキットは、商業的に入手可能である（例えば、the Pharmacia Recombinant Phage Antibody System, Catalog No. 27-9400-01; および Stratagene SurfZAPTM Phage Display Kit, Catalog No. 240612）。更に、抗体展示ライブラリーを生じ且つスクリーニングする場合に特に用いやすい方法および試薬の例は、例えば、米国特許第５，２２３，４０９号；ＰＣＴ公開ＷＯ９２／１８６１９号；ＰＣＴ公開ＷＯ９１／１７２７１号；ＰＣＴ公開ＷＯ９２／２０７９１号；ＰＣＴ公開ＷＯ９２／１５６７９号；ＰＣＴ公開ＷＯ９３／０１２８８号；ＰＣＴ公開ＷＯ９２／０１０４７号；ＰＣＴ公開ＷＯ９２／０９６９０号；ＰＣＴ公開ＷＯ９０／０２８０９号；Fuchs et al., Bio/Technology 9:1370-1372(1991); Hay et al., Hum. Antibod. Hybridomas 3:81-85(1992); Huse et al., Science 246: 1275-1281(1989); および Griffiths et al., EMBO J. 12:725-734(1993) に見出されうる。
更に、キメラおよびヒト化単クローン性抗体などの、ヒトおよび非ヒト双方の部分を含む組換え抗体は、標準的な組換えＤＮＡ技法を用いて製造することができ、本発明の範囲内である。このようなキメラおよびヒト化単クローン性抗体は、当該技術分野において知られている組換えＤＮＡ技法によって生じることができる。
概して、本発明の抗体（例えば、単クローン性抗体）は、アフィニティークロマトグラフィーまたは免疫沈降などの標準的な技法によって本発明のポリペプチドを単離するのに用いることができる。ポリペプチド特異的抗体は、細胞からの天然のポリペプチドの精製および宿主細胞中で発現される組換え生産されたポリペプチドの精製を容易にすることができる。更に、本発明のポリペプチドに特異的な抗体は、ポリペプチドの存在量および発現パターンを評価するために、（例えば、細胞溶解産物、細胞上澄みまたは組織試料中の）そのポリペプチドを検出するのに用いることができる。抗体は、診断用に用いられて、例えば、臨床試験手順の一部分として、例えば、一定の処置方式の効力を決定するために、組織中のタンパク質レベルを監視することができる。抗体は、検出可能な物質にカップリングされて、その検出を容易にすることができる。検出可能な物質の例には、いろいろな酵素、補欠分子族、蛍光物質、発光物質、生物発光物質および放射性物質が含まれる。適する酵素の例には、西洋ワサビペルオキシダーゼ、アルカリ性ホスファターゼ、β−ガラクトシダーゼまたはアセチルコリンエステラーゼが含まれ；適する補欠分子族複合体の例には、ストレプトアビジン／ビオチンおよびアビジン／ビオチンが含まれ；適する蛍光物質の例には、ウンベリフェロン、フルオレセイン、フルオレセインイソチオシアネート、ローダミン、ジクロロトリアジニルアミンフルオレセイン、ダンシルクロリドまたはフィコエリトリンが含まれ；発光物質の例には、ルミノールが含まれ；生物発光物質の例には、ルシフェラーゼ、ルシフェリンおよびエクオリン（aequorin）が含まれ；そして適する放射性物質の例には、１２５Ｉ、１３１Ｉ、３５Ｓまたは３Ｈが含まれる。
抗体は、薬理ゲノム科学分析においても有用でありうる。このような態様において、本発明の少なくとも一つの多型性マーカーを含有する核酸によってエンコードされている変異タンパク質などの、本発明による核酸によってエンコードされた変異タンパク質に対する抗体は、改変された処置様式を必要とする個体を識別するのに用いることができる。
抗体は、更に、疾患の活性状態などの疾患状態において、またはタンパク質の機能に関係した疾患、具体的には、心臓不整脈（例えば、心房細動または心房粗動）および／または脳卒中への素因を有する個体において、変異タンパク質の発現を評価するのに有用である。本明細書中に記載の少なくとも一つの多型性マーカーまたはハプロタイプを含む核酸によってエンコードされている本発明の変異タンパク質に特異的な抗体は、その変異タンパク質の存在についてスクリーニングするのに、例えば、変異タンパク質の存在によって示される心臓不整脈（例えば、心房細動または心房粗動）および／または脳卒中への素因についてスクリーニングするのに用いることができる。
抗体は、他の方法で用いることができる。したがって、抗体は、本発明の変異タンパク質などのタンパク質を評価するための診断手段として、電気泳動移動度、等電点、トリプシンまたは他のプロテアーゼ消化による分析とともに、または当業者に知られている他の物理的検定に用いるために有用である。抗体は、更に、組織型判定に用いることができる。一つのこのような態様において、特異的変異タンパク質は、特定の組織タイプにおける発現と相関していて、そして次に、その変異タンパク質に特異的な抗体は、その特定の組織タイプを識別するのに用いることができる。
変異タンパク質を含めたタンパク質の細胞下局在化も、抗体を用いて決定することができ、しかもいろいろな組織の細胞中のタンパク質の異常な細胞下局在化を評価するのに適用することができる。このような使用は、遺伝子診断に適用することができるが、具体的な処置様式を監視する場合にも適用することができる。処置が、変異タンパク質の発現レベルまたは存在、または変異タンパク質の異常な組織分布または発生発現を修正することを目指している場合、変異タンパク質またはそのフラグメントに特異的な抗体は、治療的効力を監視するのに用いることができる。
抗体は、更に、変異タンパク質機能を、例えば、変異タンパク質の結合分子またはパートナーへの結合をブロックすることによって阻害するのに有用である。このような使用は、処置が、変異タンパク質の機能を阻害することを包含している治療的な場合にも適用することができる。抗体は、例えば、タンパク質の結合をブロックまたは競合的に阻害し、それによって、タンパク質の活性をモジュレーションする（すなわち、それに作用するまたは拮抗する）のに用いることができる。抗体は、特定の機能に必要な部位を含有する特異的タンパク質フラグメントに対して、または細胞または細胞膜に関連している無傷のタンパク質に対して製造することができる。in vivo 投与について、抗体は、放射性核種、酵素、免疫原性エピトープ、または細菌毒素（ジフテリア、またはリシンなどの植物毒素）を含めた細胞傷害性薬などの追加の治療的ペイロード（payload）と連結していてよい。抗体またはそのフラグメントの in vivo 半減期は、ポリエチレングリコールへの共役によるペグ化（pegylation）によって増加させることができる。
本発明は、更に、本明細書中に記載の方法で抗体を用いるためのキットに関する。これには、試験試料中の変異タンパク質の存在を検出するキットが含まれるが、これに制限されるわけではない。他の好ましい態様は、生体試料中の変異タンパク質を検出するための標識されたまたは標識可能な抗体などの抗体および化合物または物質；試料中の変異タンパク質の量または存在および／または不存在を決定する手段；および試料中の変異タンパク質の量を標準と比較する手段；更には、キットの使用のための取扱説明書を含む。
本発明を、ここで、次の非制限実施例によって例示する。
実施例１．染色体４上における心房細動のリスク負担変異体の識別。
次は、ＳＮＰマーカーの単一点分析によって心房細動および脳卒中に関連していることが判明した感受性因子の識別についての説明を含む。
方法。研究は、Data Protection Commission of Iceland およびNational Bioethics Committee によって認可された。
アイスランド人ＡＦコホート。患者は全て、１９８７年〜２００３年に、アイスランド、レイキャクビクにある Landspitali University Hospital においてＡＦと診断した。診断は、Ｐ波がないし且つ不規則Ｒ−Ｒ間隔を不規則に示す１２リード心電計で確認した。ＥＣＧは全て、心臓病専門医が手動で読み取った。
アイスランド人脳卒中コホート。脳卒中コホートは、Iceland および Icelandic Heart Association の二つの主要な病院から得た。出血性脳卒中の患者は、全患者の６％であった（アミロイドーシスを伴うアイスランド型の遺伝性脳出血の患者およびクモ膜下出血の患者を除外した）。虚血性脳卒中は、全患者の６７％を占め、ＴＩＡは２７％を占めた。この研究における脳卒中サブタイプの分布は、他のコーカサス集団において報告されたものに類似している（Mohr, J.P., et al., Neurology, 28:754-762(1978); L. R. Caplan, In Stroke, A Clinical Approach (Butterworth-Heinemann, Stoneham, MA, ed 3, (1993)）。
遺伝子型決定。心房細動（ＡＦ）と診断された４３７人のアイスランド人個体および７４０６人集団対照のゲノム幅走査を、単一チップで約３１７，０００の一塩基多型（ＳＮＰ）を検定するための Illumina 製の Infinium HumanHap ３００ＳＮＰチップ（Illumina, San Diego, CA, USA）を用いて行った。他の症例−対照コホートの複製についてのＳＮＰ遺伝子型決定は、Centaurus プラットフォーム（Nanogen）を用いて行った。全３４７人の脳卒中と診断された個体および７４９７人の対照も、心房細動に関連していると判明したＬＤブロックの範囲内のＳＮＰについて実施した。
関連分析の統計的方法。心房細動または脳卒中への単一マーカー関連について、本発明者は、尤度比検定を用いて、各々の対立遺伝子について両側ｐ値を計算した。本発明者は、増殖性モデルを仮定して、相対リスク（ＲＲ）および人口寄与リスク（ＰＡＲ）を計算した（C. T. Falk, P. Rubinstein, Ann Hum Genet 51(Pt 3), 227(1987); J. D. Terwilliger, J. Ott, Hum Hered 42, 337(1992)）。ＣＥＰＨコーカサス人ＨａｐＭａｐデータについて、本発明者は、Ｄ’（R. C. Lewontin, Genetics 50, 757(1964)）およびＲ２（W. G. Hill, A. Robertson, Genetics 60, 615(Nov, 1968)）の標準的な定義を用いて、ＳＮＰの対間のＬＤを計算した。全てのＳＮＰ組合せをプロットして、特定の領域のＬＤ構造を解明する場合、本発明者は、左上隅にＤ’および右下隅にｐ値をプロットした。本発明者が与えるそれらＬＤプロットにおいて、マーカーは、それらの物理的位置にしたがうよるよりもむしろ、等距離にプロットされている。
結果
ゲノム幅関連研究
本発明者は、４３７人のアイスランド人心房細動患者および７４０６人集団対照個体を、Illumina ３３０Ｋチップを用いて、首尾良く遺伝子型決定した。関連分析は、単一ＳＮＰについて行った。最も有意の関連は、１０−９に近いｐ値を双方とも生じるマーカーｒｓ２２２０４２７およびｒｓ２２２０７３３について判明した。ｒｓ２２２０４２７の値は、実施試験数を補正後に有意である、すなわち、その関連は、ゲノム幅レベルで有意である。
影響される個体には、見かけ上過剰のホモ接合体が存在する。本発明者は、増殖性モデル（Ｐ＝０．００２）および劣性モデル（Ｐ＝０．００１）双方を却下する。最も適合しているモデルは、ヘテロ接合保有者に１．４６およびホモ接合保有者に５．１７のリスクを与える。この完全モデルを無関連のゼロモデルと比較した（未補正の）Ｐ値は、５．４３ｅ−１１である。これらデータは、リスク負担対立遺伝子の二つのコピーを有する個体が、簡単な増殖性モデルに基づいて期待されるよりも大きいリスクがあるということを示している。
全ての遺伝子型について発症時年齢モデルを適合すると、４．８４ｅ−５のＰ値を生じる。ヘテロ接合体は、非保有者よりも１．４０９０年早く発症すると推定され、ホモ接合保有者は、非保有者よりも９．６１２６年早く発症すると推定される。これは、発症時年齢の有意の作用を示している、すなわち、リスク負担変異体を有する個体は、リスク負担対立遺伝子の非保有者である個体よりも若い年齢でＡＦを発生する有意のリスクがある。
ｒｓ２２２０４２７の付近のマーカーを調査して、本発明者は、マイクロサテライトマーカーＤ４Ｓ４０６を、ｒｓ２２２０４２７の代用マーカーとして用いることができるということを認めた。具体的には、対立遺伝子−２、−４および−８（ＣＥＰＨ基準に関して）は、ハプロタイプ頻度に基づいてＳＮＰを標識するのに十分であることが判明した。
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したがって、ｒｓ２２２０４２７ではなく、Ｄ４Ｓ４０６マーカーについて型決定された個体について、−２、−４および−８対立遺伝子を入れることは、ＳＮＰの対立遺伝子４の頻度の極めて良好な推定値をもたらす。本発明者は、１２６９症例および６９，０７０対照を含んで成るアイスランド人ＡＦ複製コホートを、この様式で分析した。それら結果は、その関連が、２．９４ｅ−１４のｐ値および１．５３の相対リスク（増殖性モデル）を伴うという点で、極めて劇的である。したがって、本発明者の初期知見は、独立したアイスランド人コホートにおいて繰り返された。
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実施例２．ＡＦリスク変異体の特性決定
次は、染色体４ｑ２５上の心房細動のリスクを与える変異体の識別についての更なる説明を含む。
心房細動（ＡＦ）は、ヒトにおいて最も一般的な持続性心臓不整脈であり、心房の無秩序電気活性を特徴とする１。それは、８０歳を超えた個体の１０分の１に影響を与え、有意の罹病率を生じ、そして死亡率の独立した予兆である２。最近の研究は、ＡＦへの遺伝的寄与の証拠を与えた３−５。カリウムチャンネル遺伝子の突然変異は、家族性ＡＦに関連していたが６−１０、全てのＡＦ症例の僅か一部分しか説明しない１１，１２。本発明者は、ゲノム幅関連走査を行った後、ヨーロッパ系の三集団および香港からの中国人集団における複製研究を行ったが、ＡＦへの染色体４ｑ２５上の二つの配列変異体の間の強い関連を見出している。ヨーロッパ系個体の約３５％は、少なくとも一つの変異体を有し、そしてＡＦのリスクは、コピーにつき１．７２および１．３９だけ増加する。より強い変異体への関連は、中国人集団において繰り返されたが、その場合、それは、７５％の個体によって保有され、そしてＡＦのリスクは、コピーにつき１．４２だけ増加する。より強い関連は、典型的な心房粗動（ＡＦＩ）を有する個体で認められた。変異体は双方とも、心臓の左右非対称に不可欠な役割を果たしていることが知られているＰＩＴＸ２に隣接している１３−１５。本発明者は、ゲノム幅関連研究を、Illumina ＨＡｐ３００ BeadChip を用いて、ＡＦおよび／またはＡＦＩを有するアイスランド人集団について行った。本発明者の品質判定基準を満たす３１６，５１５のＳＮＰを、アイスランドからの５５０人の患者および４，４７６人の対照の試料において、ＡＦ／ＡＦＩへの関連について別個に調べた。染色体４ｑ２５上の単一連鎖不平衡（ＬＤ）ブロック内に全て位置している三つの強く相関したＳＮＰは、調べられた３１６，５１５のＳＮＰを考慮後に、ゲノム幅で有意であることが判明した次の僅かなＳＮＰであった（Ｐ＜０．０５／３１６，５１５＝１．５８ｘ１０−７）。ｒｓ２２００７３３（ＯＲ＝１．７５；Ｐ＝１．６ｘ１０−１０）、ｒｓ２２２０４２７（ＯＲ＝１．７５；Ｐ＝１．９ｘ１０−１０）およびｒｓ２６３４０７３（ＯＲ＝１．６０；Ｐ＝２．１ｘ１０−９）。アイスランド人集団に基づくこれら結果および全ての他の結果は、個体の血縁関係について調整した。二つの最も有意のＳＮＰであるｒｓ２２００７３３およびｒｓ２２２０４２７は、ＣＥＰＨ ＣＥＵ ＨａｐＭａｐ１６データセットにおいて互いに完全な代理であり且つアイスランド人データセット中において互いに完全な代理であるように近縁であり（Ｄ’＝１，ｒ２＝０．９９９）、したがって、ｒｓ２２００７３３だけを、次の考察で論及する。ｒｓ２６３４０７３のｒｓ２２００７３３への相関は、アイスランド人データセット中で更に弱い（Ｄ’＝０．９５，ｒ２＝０．６０５）。最初の三つのＳＮＰの付近の Illumina Ｈａｐ３００ＳＮＰおよびｒｓ２２００７３３への関連の状態調節についての更なる研究で、新しいＳＮＰであるｒｓ１００３３４６４への関連を識別した（ＯＲ＝１．４２；Ｐ＝０．００２４）。ｒｓ２２００７３３およびｒｓ１００３３４６４への関連を考慮後、ｒｓ２６３４０７３への関連は、もはや有意ではなかった（Ｐ＝０．３０）。これ以後、表７に示されたものを含めた、ｒｓ２２００７３３Ｔおよびｒｓ１００３３４６４Ｔについての関連結果は全て、各々のＳＮＰの主要対立遺伝子への別々の比較よりもむしろ、二つのリスク負担対立遺伝子をどちらも有していない野生型ハプロタイプへの比較に基づく。具体的には、ｒｓ２２００７３３Ｔおよびｒｓ１００３３４６４Ｔのオッズ比を、各々条件付きで計算機処理するが、それらは、野生型と比較した各々の変異体の推定相対リスクとして解釈されうると考えられる。リスク負担対立遺伝子であるｒｓ２２００７３３のＴおよびｒｓ１００３３４６４のＴは、アイスランドの場合、それぞれ、１２．０５％および８．５３％の推定集団対立遺伝子頻度を有し、アイスランドデータセット中でも、ＣＥＵ ＨａｐＭａｐデータセット中でも、同じ染色体上に一緒に認められることは決してない。第三のＳＮＰであるｒｓ１３１４３３０８は、ｒｓ２２００７３３のＴ対立遺伝子かまたはｒｓ１００３３４６４のＴ対立遺伝子を有する染色体に完全に該当する微少対立遺伝子を有するものであり、ＣＥＵ ＨａｐＭａｐデータセットによって識別した。図２は、関連領域の鍵ＳＮＰにわたるハプロタイプ構造を示す。ＣＥＵ ＨａｐＭａｐ試料中のこれら三つの鍵ＳＮＰ各々の完全な代理（すなわち、完全な代用物、標識用ＳＮＰへｒ２＝１．０）であるＳＮＰセットを、表９に与え、相対的な場所を図３に示す。本発明者は、指名されたＳＮＰが、ＳＮＰによって定義されるハプロタイプを代表していると考えるべきであり、それらは、同等であり且つ主に便宜上選択されているということを強調する。
二つのＳＮＰと同じＬＤブロック中に位置するマイクロサテライトマーカーＤ４Ｓ４０６を識別した。アイスランドの場合、Ｄ４Ｓ４０６の四つの最短対立遺伝子の内の三つ（−８、−４および−２）は、一緒になって、ｒｓ２２００７３３のＴ対立遺伝子のほぼ完全な代用物を形成し（Ｄ’＝０．９９５，ｒ２＝０．９８）、そして残り二つの最短対立遺伝子（−６および０）は、ｒｓ１００３３４６４のＴ対立遺伝子の十分な代用物を形成する（Ｄ’＝０．９８５，ｒ２＝０．７５）（表１０）。Ｄ４Ｓ４０６の残りの（より長い）対立遺伝子で、短い対立遺伝子の作用を考慮後にＡＦ／ＡＦＩに関連しているものはない。アイスランドの場合の最初の知見の複製について、ＳＮＰ遺伝子型が入手不能であった場合、Ｄ４Ｓ４０６遺伝子型を用いて情報を与えた。
本発明者の最初の発見を繰り返すことを試みて、本発明者は、２，２５１人のＡＦ／ＡＦＩ患者および１３，２３８人の対照から成る追加のアイスランド人試料を分析した（表７）。双方のＳＮＰのＡＦ／ＡＦＩへの関連は、これら試料において繰り返したが（ｒｓ２２００７３３について、ＯＲ＝１．６４、Ｐ＝２．７ｘ１０−２３、ｒｓ１００３３４６４について、ＯＲ＝１．４０、Ｐ＝８．２ｘ１０−８）、双方とも、組合せアイスランド試料においてゲノム幅有意性を達成する（ｒｓ２２００７３３について、ＯＲ＝１．６８、Ｐ＝１．９ｘ１０−３０、ｒｓ１００３３４６４について、ＯＲ＝１．３８、Ｐ＝９．４ｘ１０−９）。本発明者は、更に、４０４の追加のＡＦ症例および２，０３６の追加の対照における本発明者のシグナルの周囲の領域中の１８のＨａｐ３００ Illumina ＳＮＰ全てを型決定した。これらＳＮＰで、ｒｓ２２００７３３およびｒｓ１００３３４６４への関連を考慮後に有意のままであったものはなかった（表１１）。
本発明者の結果を繰り返すことを更に試みて、本発明者は、これら変異体のＡＦへの関連について、ヨーロッパ家系の二つの集団；１４３の症例および７３８の対照から成るスウェーデンからの一つ；および６３６の症例および８０４の対照から成る米国（U.S.）からのもう一つにおいて調べた（表７）。ｒｓ２２００７３３への関連は、双方の集団で強く繰り返した（スウェーデンの場合、ＯＲ＝２．０１、Ｐ＝０．０００２７、米国の場合、ＯＲ＝１．８４、Ｐ＝９．８ｘ１０−１０）。ｒｓ１００３３４６４への関連は、弱いが、それにもかかわらず、スウェーデン集団で繰り返し（ＯＲ＝１．６５、Ｐ＝０．００８７）、そして米国集団ではほぼ有意であった（ＯＲ＝１．３０、Ｐ＝０．０５２）。アイスランド試料と組み合わせた場合、ｒｓ２２００７３３への関連は明白であったし（ＯＲ＝１．７２、Ｐ＝３．３ｘ１０−４１）、そしてｒｓ１００３３４６４の有意性は、ゲノム幅有意性の閾値を十分に超えた（ＯＲ＝１．３９、Ｐ＝６．９ｘ１０−１１）。増殖性モデルを仮定すると、組合せの二つの変異体の人口寄与リスク（ＰＡＲ）は、ヨーロッパ家系集団の約２０％である。
最後に、本発明者は、３３３の症例および２，８３６の対照から成る香港からの中国人集団でこれらシグナルを繰り返すことを試みた。ｒｓ２２００７３３Ｔへの関連は、有意に繰り返したが（ＯＲ＝１．４２、Ｐ＝０．０００６４）、ｒｓ１００３３４６４Ｔへの関連は、有意ではなかったが、正しい方向であった（ＯＲ＝１．０８、Ｐ＝０．５５）（表７）。興味深いことに、ｒｓ２２００７３３のＴ対立遺伝子は、中国の場合（対照の対立遺伝子頻度：０．５２８）、ヨーロッパ系の場合（対照の対立遺伝子頻度：０．０９８〜０．１３９）よりはるかに大きい頻度であり（図２）、それは、推定リスクが一層小さいとしても、約３５％の更に大きい同時ＰＡＲに反映される。二つの変異体を含有するＬＤブロックは、中国ＣＨＢおよび日本ＪＰＴ ＨａｐＭａｐ試料の場合、ＣＥＵ ＨａｐＭａｐ試料の場合より細分化している（図３）。本発明者は、したがって、ＣＥＵ試料ではｒｓ２２００７３３と完全ＬＤにあるが、ＣＨＢおよびＪＰＴ試料では不完全ＬＤにある香港集団でいくつかのマーカーを分析した（表１２）。これらマーカーは、ｒｓ２２００７３３よりも弱いＡＦへの見掛け上関連を有して、関連を駆動する機能性変異体が、元のｒｓ２２００７３３変異体の周囲の約２０ｋｂ領域に位置し且つＣＨＢおよびＪＰＴ試料中でｒｓ２２００７３３と同等のままであるＳＮＰによって定義されるということを示唆した（図３の赤色）。
初期のアイスランド発見試料について、ｒｓ２２００７３３は、ｒｓ１００３３４６４よりも有意に高いＯＲを有した（Ｐ＝０．０４１）。これは、複製試料において有効であったし、そして全体的に、二つの変異体に関連したリスクには有意差がある（組合せヨーロッパ試料の場合Ｐ＝０．０００１９および香港の場合Ｐ＝０．００９９）。遺伝子型特異的オッズ比を研究した場合、増殖性モデルから離れた若干の偏差は、組合せデータセットで検出可能である（ヨーロッパ試料についてＰ＝０．０１８、表１３を参照されたい）。非保有者に相対するヘテロ接合保有者の推定リスクは、同様であったが、ｒｓ２２００７３３Ｔおよびｒｓ１００３３４６４Ｔのホモ接合保有者は、増殖性モデルによって予測されるよりも、それぞれ、高いおよび低い推定リスクを有した。同様の傾向は、香港試料で認められたが；試料サイズは、このような偏差を、有意性を伴って検出する能力を有するには小さすぎる。組合せヨーロッパ系集団において、ｒｓ２２００７３３Ｔにホモ接合の個体について認められたＯＲは、野生型ハプロタイプにホモ接合の個体と比較したところ、３．６４、そして中国人集団について１．７７であり、これら変異体は、ＡＦのいずれか予測的モデリングの重要な成分であるということが示された。
アイスランド試料についてのＡＦ／ＡＦＩの診断時年齢は、二つのＳＮＰと相関する（診断は、ｒｓ２２００７３３のＴ対立遺伝子につき２．２８年早く、そしてｒｓ１００３３４６４のＴ対立遺伝子につき１．１０年早く行われる。同時Ｐ＝１．２９ｘ１０−６）。診断時年齢の作用も、関連の強さを測定し、同時に、診断時年齢で分類することによって評価した。二つの変異体の関連は、より若い年齢で診断された者で最も強いが、リスクは、８０歳に到達後に診断された者でも、有意のままである（表８）。ＡＦの診断時年齢についての情報は、スウェーデン試料には利用不能であった。米国試料は、二つの主な群、すなわち、単独ＡＦかまたはＡＦおよび高血圧症（ＨＴＮ）を有する一層若い患者、および大部分が出血性および虚血性脳卒中患者である一層年配のＡＦ症例を含んで成った。双方の集団において、より若いＡＦ症例の場合、一層年配の症例の場合よりも、より強い関連に対して明らかな傾向がある。本発明者のデータ分析は、性別による異なった関連を全く示唆しなかった（表８）。
ＡＦＩは、しばしば、ＡＦを伴うが、単独で生じることがありうる１７。興味深いことに、本発明者は、ＡＦＩアイルランド人患者の変異体と小サブセット（Ｎ＝１６）との間の強い関連を認めた（ｒｓ２２００７３３について、ＯＲ＝２．６０、９５％信頼区間（ＣＩ）＝１．８３〜３．６８、Ｐ＝７．５ｘ１０−８、ｒｓ１００３３４６４について、ＯＲ＝１．９４、９５％ＣＩ＝１．２６〜３．００、Ｐ＝０．００２８）。実際に、ｒｓ２２００７３３について、これら明確なＡＦＩ症例のＯＲは、ＡＦ表現型を有する症例の場合よりも有意に高く（Ｐ＝０．００２６）、ｒｓ１００３３４６４についてはほとんど有意に高い（Ｐ＝０．０８４）。本発明者の結果は、これら特質が、遺伝的リスクファクターを共有するが、ＡＦＩは、ＡＦよりも表現型コピー（phenocopies）によってあまり影響されないということを示唆する。
どちらの変異体も、アイスランド試料において、いずれも既知のＡＦリスクファクターである肥満症、高血圧症または心筋梗塞への関連を示さなかった（全ての場合にＯＲ＜１．１が認められる。表１４）。これら負の結果は、新しい変異体が、これら表現型に関連している可能性を除外することはないが、それらは、米国単独ＡＦの場合の高リスクおよび保有者の一層早い発症時年齢と一緒に、新しい変異体が、これら既知のリスクファクターによってＡＦのリスクに影響しないということを示唆している。
ｒｓ２２００７３３およびｒｓ１００３３４６４を含有するＬＤブロック中には、既知の遺伝子産物は存在しない（図３）。そのＬＤブロックは、一つのスプライシングされたＥＳＴ（ＤＡ７２５６３１）および二つの単一エクソンＥＳＴ（ＤＢ３２４３６４およびＡＦ０１７０９１）を含有する。いろいろな組織からのｃＤＮＡライブラリーのＲＴ−ＰＣＲは、これらＥＳＴの発現を検出しなかった（表１６）。隣接する上流ＬＤブロック中に位置するＰＩＴＸ２遺伝子は、リスク変異体に最も近い遺伝子である。ＰＩＴＸ２遺伝子を含有するＬＤブロック中のいくつかのマーカーは、表１８に示されるように、ＡＦおよびＡＦＩへの関連を示すマーカーと相関する。この遺伝子によってエンコードされるタンパク質である対様のホメオドメイン転写因子２は、それが、心臓の非対称形態形成を支配することによって心臓発生に重要な役割を果たすことが知られているので、ＡＦ／ＡＦＩのための興味深い候補である１３。マウスノックアウトモデルの場合、Ｐｉｔｘ２は、左心房における洞房結節形成のための暗黙経路を抑制することが分かった１４，１５。血液および脂肪組織などの容易に接近可能な組織全てにおいて、ＰＩＴＸ２のｍＲＮＡ発現はほとんどなく、遺伝子型と発現レベルとの間の相関の研究を妨げる。ＰＩＴＸ２の上流の次の遺伝子は、血管内皮中のアンギオテンシンIIの分解に関与するアミノペプチダーゼであるＥＮＰＥＰである１８。この遺伝子は、より広範囲に発現されるが、ＡＦに関連した変異体は、血液または脂肪組織でのその発現への相関を示さなかった。他の注釈付き遺伝子で、関連変異体の上流の４００ｋｂ領域および下流の１．５Ｍｂ領域の範囲内に位置するものはない。
要約すると、本発明者は、三つの異なったヨーロッパ系集団においてＡＦと強く関連している染色体４ｑ２５上の二つの変異体を識別した。強い方の変異体は、中国人集団でも十分に繰り返し、その場合、それは、ヨーロッパ系集団の場合よりもはるかに一般的であり且つ高いＰＡＲを有する。この関連は、より若い患者および単独ＡＦの患者では、より強い影響力があるが、より一般的に遭遇する形のＡＦを有する一層年配の患者にも存在する。この関連の機構は未知であるが、本発明者の結果は、ＡＦの分子基盤についての更なる研究の基礎を与える。
方法
対象
アイスランド症例は、１９８７年〜２００５年に国内の二つの大病院でＡＦおよび／またはＡＦＩと診断された全ての患者から成った。スウェーデン症例は、１９９６年〜２００２年に、継続中の遺伝疫学研究である South Stockholm Ischemic Stroke Study の一部として集めた。米国症例は、ＡＦ診断を有する脳卒中患者と、単独ＡＦまたは高血圧症の共存診断を伴うＡＦを有する一層若い連続した（consecutive）患者の混合であった。香港症例は、ＡＦ診断を有する脳卒中および糖尿病の患者の集合であった。ＡＦ診断は、全ての研究集団において１２リード心電計で確認した。
アイスランド対照は、ｄｅＣＯＤＥでの他の遺伝研究に参加した個体から、患者および対照の一親等を除いて、無作為に選択した（表１５）。スウェーデン対照は、血液ドナーからの患者と同じ地域（２００１年）および健康志願者（１９９０年〜１９９４年）から集めた。米国対照は、大規模初期診療からおよび出血性脳卒中研究に参加している患者から集めた。香港対照は、ＡＦ診断を有していない個体であった。
アイスランド研究集団
この研究は、最初は、１９８７年〜２００５年に、アイスランドの唯一の三次紹介医療センターであるレイキャクビクの Landspitali University Hospital、および国内第二の大病院である Akureyri Regional Hospital において、ＡＦおよび／またはＡＦＩ（ＩＣＤ１０診断１４８およびＩＣＤ９診断４２７．３）と診断された、参加に同意する全ての患者を包含した。診断は全て、心臓病専門医が手動で読み取った１２リード心電計（ＥＫＧ）で確認した。全ての症例を、患者が臨床症状を有していたか否かに関わらず、開心術直後だけに診断された症状を除いて包含した。
一組５５０症例を、ゲノム幅ＳＮＰ遺伝子型決定作業の本発明者の品質判定基準にしたがって、Infinium II検定方法および Sentrix HumanHap ３００ BeadChip（Illumina, San Diego, CA, USA）を用いて、首尾良く遺伝子型決定した。この最初の５５０患者群（３７０人男性および１８０人女性）の診断時平均年齢は、７２．５（ＳＤ＝１１．０）歳で、その範囲は、３４．７〜９６．２歳であった。２，２７３人の患者（１，３５９人男性および９１３人女性）の有効群は、７０．５（ＳＤ＝１３．０）の診断時平均年齢を有し、その範囲は、１６．８〜１００．６であった。この研究に用いられたＡＦ／ＡＦＩのない対照（初回ゲノム幅スクリーニング時に平均６１．５（ＳＤ＝１５．８）歳の２，２０１人男性および２，２７５人女性、および有効段階で平均６１．９（ＳＤ＝１８．４）歳の５，６５４人男性および７，５９７人女性）は、アイスランド系統学データベースより無作為に選択された対照、およびｄｅＣＯＤＥでの他の継続中の関連遺伝研究からの個体から成った。ＡＦ／ＡＦＩを有する一親等（兄弟姉妹、親または子）を有する対照または一親等対照は、分析から除外した。
アイスランド人のＭＩ、肥満症および高血圧症集団
ＭＩに罹患した個体を、（ａ）１９８１年〜２００２年にアイスランドで７５歳前にＭＩを有していて、しかもＭＯＮＩＣＡ判定基準９（ＲＥＦ II）を満たしている；または２００３年と２００５年にレイキャビクの主要病院からＭＩ退院診断を得た、１０，０００人を超える個体の登録簿から識別した。その登録簿にある全ての個体のＭＩ診断は、徴候、症状、心電図、心臓酵素および剖検知見に基づく厳密な診断判定基準にしたがう。遺伝子型情報は、平均７２．６（ＳＤ＝１１．７）歳の２，４６２人男性および１，１１４人女性について入手可能であった。体重指数（ＢＭＩ）は、ｄｅＣＯＤＥでの心臓血管性心房細動および／または脳卒中（ＣＶＤ）遺伝学プログラムに参加している個体（ＣＶＤを有する患者か、彼らの一親等かまたは配偶者）について測定した。この研究の目的のために、ＢＭＩ＞３５の対象を、肥満と定義した。遺伝子型情報は、平均５３．２（ＳＤ＝１６．１）歳の５５５人男性および１，０４６人女性について入手可能であった。高血圧患者には、アイスランドの Landspitali University Hospital の高血圧外来診療所を受診したおよび／またはその病院から退院の診断を与えられた患者が含まれた。診断は、彼らが、高血圧症の処置として抗高血圧投薬を得ていたことを確認することによって証明した。遺伝子型情報は、平均７１．５（ＳＤ＝１２．５）歳の１，２９３人男性および１，３２７人女性について入手可能であった。研究は、Data Protection Commission of Iceland およびNational Bioethics Committee of Iceland によって認可された。書面によるインフォームドコンセントは、全ての患者、縁者および対照から得た。
スウェーデン研究集団
スウェーデン、ストックホルムの Karolinska University Hospital の脳卒中部署または脳卒中外来診療所、Huddinge 部署を受診した虚血性脳卒中またはＴＩＡの患者を、１９９６年〜２００２年に、継続中の遺伝疫学研究である South Stockholm Ischemic Stroke Study（ＳＳＩＳＳ）の一部として集めた。その研究は、Bioethics Committee of Karolinska Institutet（Ｄｎｒ２８６／９６および０８／０２）によって認可された。スウェーデン試料のＡＦ診断は、１２リードＥＫＧに基づいた。スウェーデン人ＡＦ症例における男性の比率は、４６．２％で、スウェーデン人ＡＦ症例の脳卒中診断時平均年齢は、７４．４（ＳＤ＝８．７）であった。
この研究に用いられたスウェーデン人対照は、患者と同じ中央スウェーデン地域から集められた、この区域の一般的な集団である、集団に基づく対照である。それら個体は、Karolinska University Hospital の臨床化学部によって、正常基準集団であるように集められた血液ドナー（２００１年に集められた）かまたは健康志願者（１９９０年〜１９９４年に集められた）であった。スウェーデン人対照における男性の比率は、５９．７％で、スウェーデン人対照の参入時平均年齢は、４３．１（ＳＤ＝１２．３）であった。
米国研究集団
米国対象は、１９９８年１月〜２００６年７月の間に、Massachusetts General Hospital（ＭＧＨ）での継続中の症例−対照・コホート研究に登録した。これら研究の全ての側面は、local Institutional Review Board によって認可された。症例−対照研究に登録された対象は、一つの救急病院に収容され、ＣＴまたはＭＲＩで確認された急性虚血性または出血性脳卒中で入院した患者から成った。集められた３２８人の出血性脳卒中患者の内、７８人は、ＡＦと診断され、そしてこの研究の症例として用いたが、残りの２５０人は、対照として用いた。１７０人の虚血性脳卒中患者は、ＡＦ診断を有したので、症例として処理したが、対照として処理された虚血性脳卒中患者はなかった。患者は、原発性クモ膜下出血について、および頭部外傷、腫瘍、血管奇形または血管炎の続発性脳内出血について除外した。６２４人の脳卒中のない対照は、病院管轄域に行われる大規模初期診療（＞１８０００人の患者）、更には、病院の Anticoagulation Management Service から集めた。対照として集められた６５４個体の内の７０人は、ＡＦと診断されたので、この研究の目的の症例とした。対照として用いられた全個体の５０．９％は男性で、彼らの平均年齢は、６７．４（ＳＤ＝１２．３）であった。全ての対象または随伴する情報提供者は、遺伝研究への参加のためのインフォームドコンセントを与え、そして将来を見越して、病歴、投薬、社会歴および家族歴に関して面接した。心房細動の存在または不存在は、将来を見越して、面接によっておよび診療録の検討から証明した。
米国対象の第二部分は、不整脈科へ照会する単独ＡＦまたは高血圧症の共存診断を伴うＡＦを有する連続した患者であって、遺伝研究への参加のための書面によるインフォームドコンセントを与えた患者から成った。包含判定基準は、ＥＫＧで証明されたＡＦおよび６５歳またはそれ未満の年齢であった。除外判定基準は、心エコー検査法によって評価される構造性心房細動および／または脳卒中、リウマチ性心房細動および／または脳卒中、甲状腺機能亢進症、心筋梗塞またはうっ血性心不全であった。各々の患者は、身体検査と、薬歴状態、投薬、症状およびＡＦの開始に可能性のあるトリガーを確認する標定面接を受けた。全ての患者を、１２リードＥＫＧ、心エコー図および実験室研究によって評価した。ＥＫＧおよび心エコー図は、標準的な判定基準を用いて解釈した。
香港研究集団
香港研究集団の対象は全て、香港に在住する南漢民族（Han Chinese）家系を有した。症例は、Prince of Wales Hospital Diabetes Registy２３より選択された２１７個体（男性４９．１％、平均年齢６８．１（ＳＤ＝９．６））および Stroke Registy２４からの１１６対象（男性３０．２％、平均年齢７６．１（ＳＤ＝１０．９））から成った。対象は全て、ＥＫＧで心房細動を有すると診断された。対照は、ＡＦの確証のない２，８３６人の対象から成った。インフォームドコンセントは、各々の参加対象について得た。この研究は、Clinical Research Ethics Committee of the Chinese University of Hong Kong によって認可された。
Illumina ゲノム幅遺伝子型決定
全てのアイスランド人症例および対照試料を、International ＨａｐＭａｐプロジェクトのフェーズＩに由来する３１７５０３のハプロタイプ標識用ＳＮＰを含有する Infinium HumanHap ３００ＳＮＰチップ（Illumina, SanDiego, CA, USA）で検定した。チップで検定されたＳＮＰの内、１６２のＳＮＰは、遺伝子型を生じなかったが、更に１７８のＳＮＰは、９０％より低い収率を有した。４８のＳＮＰは、単形態性で、他の１０７は、ほぼ単形態性であった（すなわち、患者および対照の組合せコホートにおける微少対立遺伝子頻度は、０．００１未満であった）。更に４７５のＳＮＰは、対照の Hardy-Weinberg 平衡から極めて有意の歪みを示した（ｐ＜１ｘ１０−１０）。最後に、少数のマーカー（ｎ＝１８）は、集団内のいくつか異なった継続中のゲノム幅関連研究での具体的な領域および可能なシグナルの研究後に、遺伝子型決定問題を有することを確認した。したがって、本文中に示した最終分析は、３１６，５１５のＳＮＰを利用している。９８％未満のコールレートを有する試料はいずれも、分析から除外した。
単一ＳＮＰおよびマイクロサテライト遺伝子型決定。
ＳＮＰ遺伝子型決定は、Centaurus（Nanogen）プラットフォーム２５によって行った。各々の Centaurus ＳＮＰ検定の品質は、ＣＥＵおよび／またはＹＲＩ ＨａｐＭａｐ試料中の各々の検定を遺伝子型決定し、そしてそれら結果をＨａｐＭａｐデータと比較することによって評価した。＞１．５％のミスマッチ率を有する検定は用いなかったし、そして連鎖不平衡（ＬＤ）試験を、ＬＤであることが知られているマーカーに用いた。
関連分析
全ての参加個体を、ｒｓ２２００７３３、ｒｓ４６１１９９４（ｒｓ２２００７３３の完全な代理）、ｒｓ１３１４３３０８およびｒｓ６８４３０８２（ｒｓ１３１４３３０８の完全な代理）について遺伝子型決定する試みを行った。各々のＳＮＰについて、収率は、どの群でも９０％より高かった。更に、Ｄ４Ｓ４０６マイクロサテライトの遺伝子型は、全てのアイスランド対象およびスウェーデン対象に利用可能であった。遺伝子型決定の場合の冗長性ゆえに、観察された遺伝子型は、本発明者が以前に用いた尤度アプローチによる紛失遺伝子型ゆえの情報損失の量を減少させた２６。これは、表に示された結果が、常に同数の個体に基づいて、有意義な結果比較を可能にしたということを確実にした。ｒｓ１００３３４６４についてのデータは、初期アイスランド型発見試料およびＨａｐＭａｐプロジェクトにおいて直接的にしか利用可能でなかったので、ｒｓ２２００７３３Ｃｒｓ１３１４３３０８Ｔハプロタイプを用いて、このＳＮＰを標識した。この標識付けは、初期発見試料およびＣＥＰＨ ＣＥＵ ＨａｐＭａｐ試料双方で完全であった。
以前に記載の且つＮＥＭＯソフトウェアで実行された尤度手順を、関連分析に用いた。本発明者は、標準的な尤度比統計値を用いて、各々の表現型への対立遺伝子の関連を調べたが、それは、対象が血縁でない場合、帰無仮説の下で、漸近的にカイ二乗分布を１の自由度で有すると考えられた。対立遺伝子特異的ＯＲは、個体の二つの染色体について増殖性モデルを仮定して計算した４。多数の症例−対照群からの結果を、Mandel-Haenszel モデル５を用いて組み合わせたが、この場合、それら群が、異なった対立遺伝子集団頻度、ハプロタイプおよび遺伝子型を有することを許したが、共通の相対リスクを有すると仮定した。いずれの対照群にも、Hardy-Weinberg 平衡（ＨＷＥ）からの有意の偏差はなかった。
表７および表８において、ｒｓ２２００７３３およびｒｓ１００３３４６４双方のＰ値は、どちらのリスク負担対立遺伝子も有していない野生型ｒｓ２２００７３３Ｃ、ｒｓ１３１４３３０８Ｇ、ｒｓ１００３３４６４Ｇハプロタイプとの比較に基づいて計算機処理した。ｒｓ２２００７３３Ｔについて該当する条件的オッズ比は、［ｆ（ｒｓ２２００７３３Ｔ）／ｆ（ＷＴ）］／［ｐ（ｒｓ２２００７３３Ｔ）／ｐ（ＷＴ）］（式中、ＷＴは、野生型ハプロタイプを示し、そしてｆ（・）およびｐ（・）は、それぞれ、症例および対照の頻度を示す）として定義される。増殖性モデルの下で、そして対照を集団対照とみなしうると考えられる場合、この条件的オッズ比は、野生型に対するｒｓ２２００７３３Ｔの相対リスクの適当な推定値である。ｒｓ１３１４３３０８Ｔの条件的オッズ比は、同様に定義され、同様の解釈を有する。
血縁関係およびゲノム対照の相関。
アイスランド症例−対照群における若干のの個体は、互いに血縁であり、前述のカイ二乗検定統計値に、＞１の平均および＞０．６７５の中央値をもたせた２６。本発明者は、前に記載の手順を用いることによってインフレーション（inflation）因子を推定したが、その場合、本発明者は、７３１，１７５人のアイスランド人の系統によって遺伝子型を刺激した３０。３１６，５１５のゲノム幅走査ＳＮＰの遺伝子型が分析可能であった初期発見試料について、本発明者は、更に、ゲノム対照を用い且つ３１６，５１５のカイ二乗統計値の平均を計算することによって、そして前に記載のように３１，３２、３１６，５１５のカイ二乗統計値の中央値を計算機処理し且つそれを０．６７５で割ることによって２６、インフレーション因子を推定した。これら初期試料について、系統学的方法および二つのゲノム対照方法によって推定されるインフレーション因子は、それぞれ、１．０４７、１．０５８および１．０５４の同様のインフレーション因子推定値を与えた。示されたＰ値および信頼区間は、系統学的方法によって推定されるインフレーション因子による調整に基づく。
ｃＤＮＡライブラリーのＰＣＲスクリーニング。
ＬＤブロック中のスプライシングされたＥＳＴ（ＤＡ７２５６３１、ＤＢ３２４３６４およびＡＦ０１７０９１）の発現を確かめるために、本発明者は、商業的に入手可能なｃＤＮＡライブラリーおよびｄｅＣＯＤＥで生じたライブラリーをスクリーニングした。スクリーニングされた市販ライブラリーは、心臓（Clontech−６３９３０４）、大動脈（Clontech−６３９３２５）、骨髄（Clontech ７４１６−１）、精巣（Clontech ７４１４−１）および脳全体（ＢＤ Ｓ０５９８）の Marathon Ready ｃＤＮＡライブラリーであった。更に、ｃＤＮＡライブラリーは、脳全体およびＥＢＶで形質転換されたヒトリンパ芽球様細胞について構築した。全ＲＮＡを、リンパ芽球様細胞系および全血から、それぞれ、Qiagen 製のＲＮｅａｓｙ ＲＮＡ単離キット（Cat. ７５１４４）および全血キットからのＲＮｅａｓｙ ＲＮＡ単離（Cat. ５２３０４）を用いて単離した。ｃＤＮＡライブラリーは、ランダムプライマーを含むHigh Capacity ｃＤＮＡ Archive キット（Applied Biosystems ＰＮ４３２２１７１）を用いてｄｅＣＯＤＥで製造した。
ＰＣＲスクリーニングは、Advantage（登録商標）２ＰＣＲ Enzyme ＲＴ＿ＰＣＲ Systems（Clontech）を製造者取扱説明書にしたがって用い、そして Operon Biotechnolgies 製のＰＣＲプライマーを用いて行った。ＰＣＲ反応は、１０μｌの容量中において３．５μＭの最終濃度の正および逆プライマー（表１６）、２ｍＭ ｄＮＴＰ、１ｘ Advantage ２ＰＣＲ緩衝剤および０．５μｌのｃＤＮＡライブラリーで行った。
ノーザンブロット分析。
市販の多組織ポリＡノーザンブロットは、Clontech（Human Cardiovascular システム、Cat. ６３６８２５）から入手した。
使用プローブ：
（ｉ）ＲＺＰＤ Deutsches Ressourcenzentrum fur Genomforschung GmbH, Germany より入手したＰＩＴＸ２ ｃＤＮＡクローン（ＨＵ３＿ｐ９８３Ｅ０３２７Ｄ）（http://www.rzpd.de/products/genomecube.shtml）（確認済み配列、データは示されていない）；
（ii）ＲＴ−ＰＣＲ実験から得たＥＮＰＥＰ転写物のエクソン１−１２に該当するｃＤＮＡクローン。ＥＮＰＥＰクローンは、次の確認済み配列であった。
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ｃＤＮＡフラグメントは、Megaprime 標識用キット（ＧＥ Healthcare Cat. ＲＰＮ１６０７）および ProbeQuant Ｇ−５０マイクロカラム（ＧＥ Healthcare Cat. ２７−５３３５−０１）を用いた反応から取り出された未包含のヌクレオチドを用いて、［α−３２Ｐ］ｄＣＴＰ（特異的抗体６０００Ｃｉ／ｍｍｏｌ）で放射性標識した。メンブランを、Rapid-hyb 緩衝液（ＧＥ Healthcare Cat. ＲＰＮ１６３５）中で少なくとも３０分間プレハイブリッド形成後、１００〜３００ｎｇの標識ｃＤＮＡプローブとハイブリッド形成させた。ハイブリダイゼーションは、Rapid-hyb 緩衝液中において６５℃で一晩行った。標識プローブを、９５℃で５分間加熱後、プレハイブリダイゼーション溶液中のフルターに加えた。ハイブリダイゼーション後、メンブランを、２ｘＳＳＣ、０．０５％ＳＤＳ中において室温、低ストリンジェンシーで３０〜４０分間洗浄後、２回の高ストリンジェンシー洗浄を、０．１ｘＳＳＣ、０．１％ＳＤＳ中において５０℃で４０分間行った。それらブロットを、直ちに密封し、そして Kodak BioMax ＭＲ Ｘ線フィルム（Cat. ８７１５１８７）に露出した。
ＡＦ領域中の候補調節変異体の調査
ＵＣＳＣブラウザーを用いて、ＳＮＰの位置、およびＡＦに関連したそれらＳＮＰの周囲の１７２．５ｋｂ領域への保存された転写因子結合部位（ＴＦＢＳ）を抽出した（ｈｇ終結（release）１７、染色体４、１１１，９４２，４０１〜１１２，１１４，９０１）。二つのタブレットを相互参照し、そして結合部位に着いたＳＮＰを、ＨａｐＭａｐデータ中のｒｓ２２２０４２７またはｒｓ６８４３０８２とのＬＤについて更に問い合わせした。これは、ヒトゲノムの終結１６、１７および１８について行ったが、それら結果は、ｈｇ１７配位で報告されている。これは、既知の転写因子について保存された結合部位に着く３種類のＳＮＰを生じた（表１７）。この分析は、（ｉ）ＡＦハプロタイプが、十分に配列決定されなかった；（ii）いくつかの候補ＳＮＰが、ＨａｐＭａｐで型決定されないし、しかもそれは、それらがＡＦハプロタイプ上にあるかどうか未知である；（iii）あまり保存されていない領域中の多型が、機能性でありうると考えられるので、機能的候補の一定の試料を検出しているにすぎないことに注目されたい。
３種類のＴＦＢＳの進化論的保存
ＵＣＳＣゲノム中の Multiz 整列を利用することは、これらＳＮＰによって影響される領域の進化論的保存の評価を可能にした。３種類全ての場合に、ＴＦ結合部位のコア部分があるが、影響される位置は、異なった程度に保存される。ｒｓ１２５１００８７によって影響されるＳＯＸ５は、哺乳動物においてあまり保存されないが、（ｒｓ２２２０４２７によって影響される）二番目のものは、顕著に保存される（フクロネズミ（Opossum）を除いて、それは、ニワトリへと全ての種で維持される）。ｒｓ１７０４２１７１突然変異は、ＮＦＡＴ結合部位のコアモチーフＧＧＡＡＡＡ中の最後に位置にある。保存は、Ｇがこの場所に好適であるということを示し、ＧＧＡＡＡＧモチーフを生じる。
遺伝子型とＥＮＰＥＰの発現との間の相関
１，００２個体から、静脈切開により、一晩絶食（午後９時より）後の翌朝午前８〜１０時に採血し、そして２週間以内にＲＮＡを抽出した。ＲＮＡ単離は、RNeasy Midi Kit（QIAGEN GmbH, Hilden, Germany）を用いて行った。皮下脂肪試料（５〜１０ｃｍ３）は、６７３個体から、１０ｍｌのリドカイン−アドレナリン（１％）を用いた局所麻酔後のビキニラインの３ｃｍ切開によって（部位特異的変異を免れるために、常に同じ部位から）取り出した。全ＲＮＡの精製は、RNeasy Mini Kit（QIAGEN GmbH, Hilden, Germany）で行った。
全ＲＮＡの保全性は、Agilent ２１００ Bioanalyzer（Agilent Technologies, Palo Alto, U.S., CA）での分析によって評価した。合計１，７６５の試料の基準プールを含めた各々の標識ＲＮＡ試料を、Agilent Technologies によって製造された Human ２５Ｋアレイにハイブリッド形成させた。アレイ画像を、前に記載のように処理して、バックグラウンドノイズ、単一チャンネル強さおよび関連測定誤差推定値を得た１１。二つの試料間の発現変化を、平均対数（ｌｏｇ１０）発現比率（ＭＬＲ）、すなわち、アレイ上の各々のスポットの二つのチャンネルについてのバックグラウンドで補正された強さ値と比較した発現比率として定量した１２。ハイブリダイゼーションは、標準的なＱＣ法、すなわち、シグナル対ノイズ比、スパイクイン（spike-in）化合物での再現性および正確度、Ｃｙ３対Ｃｙ５強さを比較することによって進行した。
血液（ｒｓ２２００７３３およびｒｓ１００３３４６４について、それぞれ、Ｐ＝０．９０およびＰ＝０．８２）または脂肪組織（ｒｓ２２００７３３およびｒｓ１００３３４６４について、それぞれ、Ｐ＝０．２３およびＰ＝０．３７）において、どちらの関連ＳＮＰも、年齢および性別について調整されたＥＮＰＥＰの発現に相関しなかった。
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参考文献
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実施例３．虚血性脳卒中への染色体４変異体の関連
脳卒中は、西欧社会において一般的な死亡原因および成人能力障害の主な原因である。それは、現在、低所得および中間所得の国々において、集団老齢化および心臓血管疾患の変更可能なリスクファクターの変化ゆえに、主要な健康問題にもなっている１。脳卒中は、一つの疾患ではないが、多数の遺伝的および環境的リスクファクターを有する不均一な障害の群から成る極めて複雑な症候群である２，３。双子、家族歴および動物モデルでの研究４−８は、脳卒中の一般的な形への遺伝的寄与の証拠を与えるが、集団にわたって首尾一貫した結果を示す主なリスク変異体はまだ識別されていない。
脳発作の大部分（＞８０％）を占める虚血性脳卒中（ＩＳ）は、大脳動脈の閉塞をもたらす血栓症または塞栓症によって生じる。いろいろな病態生理学的機構は、ＩＳを引き起こすことがありうるが、最も一般的なものは、大動脈アテローム性動脈硬化症（ＬＡＡ）、心臓塞栓性脳卒中（ＣＥＳ）および小型血管疾患（ＳＶＤ）である９。
方法
研究集団。
アイスランド：アイスランド人脳卒中患者は、１９９３年〜２００６年の間に、レイキャクビクの唯一の大学病院である Landspitali University Hospital において虚血性脳卒中またはＴＩＡと診断された４，０００を超える個体の登録簿から集めた。脳卒中患者は、ｄｅＣＯＤＥでの心臓血管疾患（ＣＶＤ）遺伝プログラムによって、最後の９年間にわたって登録されていた。脳卒中診断は、神経科医によって臨床的に確認された（下を参照されたい）。発見コホートは、１，６６１人の患者を包含したが、４ｑ２５上のＳＮＰを分析する場合、本発明者は、追加の組の２８２人の患者（平均年齢±ＳＤ：７７．２±１１．３歳、女性４５％）を用いた。本発明者は、Decode で研究中の、腹大動脈瘤（２５０）、心房細動（１，１５０）、嗜癖（７５０）、アルツハイマー（３５０）、不安（２００）、喘息（１３００）、ＣＯＰＤ（８５０）、結腸癌（２００）、深部静脈血栓症（５５０）、失読症（２００）、感染症（２５０）、長寿（４００）、肺癌（７５０）、心筋梗塞（２，４００）、片頭痛（１，１００）、末梢動脈疾患（１，２００）、多嚢胞性卵巣症候群（１，２００）、子癇前症（７００）、前立腺癌（４００）、乾癬（７５０）、リウマチ性関節炎（５５０）、レストレスレッグ症候群（３５０）および２型糖尿病（４００）を含めたいろいろな遺伝プログラムから２５，７０８人の対照（平均年齢±ＳＤ：５９．２±２１．１歳、女性５９％）を用いた。
研究は、Data Protection Commission of Iceland（ＤＰＣ）および National Bioethics Committee of Iceland によって認可された。全ての参加者が、インフォームドコンセントを与えた。
スウェーデン：スウェーデン、ストックホルムの Karolinska University Hospital の脳卒中部署または脳卒中外来診療所、Huddinge 部署を受診した虚血性脳卒中のスウェーデン人患者を、１９９６年〜２００２年に、継続中の遺伝疫学研究である South Stockholm Ischemic Stroke Study（ＳＳＩＳＳ）の一部として集めた（平均年齢±ＳＤ：６７．３±１１．８歳、女性４４％）。この研究に用いられたスウェーデン人対照は、患者と同じ中央スウェーデン地域から集められた、この区域の一般的な集団である、集団に基づく対照である。それら個体は、Huddinge または Karolinska University Hospital で集められた血液ドナーかまたは、Clinical Chemistry Department at Karolinska University Hospital によって、正常基準集団であるように集められた健康志願者であった（１９９０年〜１９９４年に集められた）（Huddinge 病院からの対照について、平均年齢±ＳＤ：４６．８±１５．９歳、女性４１％、Karolinska 病院で集められた血液ドナーについての年齢情報は入手不能）。その研究は、Bioethics Committee of Karolinska Institutet によって認可された。
南ドイツ：本明細書中においてドイツ−Ｓと称するドイツ人集団は、２００１年〜２００６年の間に、Department of Neurology, Klinikum Grosshadern, University of Munich, Germany の脳卒中部署で連続的に集められたＩＳ患者から成った（平均年齢±ＳＤ：６５．３±１３．７歳、女性３８％）。対照群は、心臓血管疾患歴のない、年齢および性別が適合した個体から成った（平均年齢±ＳＤ：６２．７±１０．９歳、女性３８％）。これらは、ミュンヘン近くのコミュニティーに基づく疫学プロジェクトであるＫＯＲＡ Ｓ４研究より選択した２３。その研究は、地方倫理委員会によって認可され、そして全ての個体（または縁者または法的後見人）からインフォームドコンセントを得た。
ドイツ、ウェストファーレン地域：ドイツ−Ｗと称する第二のドイツ人集団は、２０００年〜２００３年の間に、国内西部に位置する、地域の Westphalian Stroke Register に参加している病院によって虚血性脳卒中患者を集めた（平均年齢±ＳＤ：７０．４±１２．６歳、女性５３％）。自己報告による脳卒中歴のない集団対照は、同地域で行われた横断的予想集団に基づく Dortmund Health Study２４より得、そして引き続き、症例に頻度を適合させた（平均年齢±ＳＤ：５２．３±１３．７歳、女性５３％）。研究は双方とも、University of Munster の倫理委員会によって認可された。全ての参加者が、インフォームドコンセントを与えた。
英国、ＳＥ−イングランド。心臓血管科を受診したヨーロッパ系の虚血性脳卒中患者を、１９９５年〜２００２年に集めた。症例は全て、一人の経験ある脳卒中神経科医が、初めの画像化を検討して表現型決定した（平均年齢±ＳＤ：６４．６±１２．７歳、女性４１％）。症候性心臓血管疾患のないコミュニティー対照も、地理的に患者と同じ地域から、家庭医リストをサンプリングすることによって集めた。サンプリングは、層別化して、患者群の場合と同様の年齢および性別分布を与えた（平均年齢±ＳＤ：６４．８±８．６歳、女性４１％）。その研究は、地方調査倫理委員会によって認可され、そして全ての参加者からインフォームドコンセントを得た。
表現型決定。虚血性であるが、出血性ではない脳卒中を有する患者のみを、研究に包含した。全ての患者に、臨床的に適切な、コンピュータ連動断層撮影（ＣＴ）および／または磁気共鳴画像法（ＭＲＩ）での脳画像化を含めた診断処理、更には、頸動脈および椎骨動脈の複式超音波検査法、心エコー検査法、ホルター監視、ＭＲ−血管造影法、ＣＴ−血管造影法および血液検査を含めた補助的診断研究を行った。臨床的に確認された一過性脳虚血発作（ＴＩＡ）を有する患者は、アイスランド、ドイツ−Ｓおよびスウェーデンより、虚血性脳卒中群に含めた。患者は、Trial of Org １０１７２ in Acute Stroke Treatment（ＴＯＡＳＴ）２５にしたがって、病因サブタイプに分類した。この分類には、６種類のカテゴリー、すなわち、（１）大動脈閉塞性疾患（大血管疾患）；（２）心臓閉塞症（心臓性脳卒中）；（３）小型血管疾患（小空洞性脳卒中）；（４）他の決定病因；（５）診断努力にもかかわらず病因不明；または（６）二つ以上の病因が含まれる。ＴＯＡＳＴカテゴリー４〜６に分類される患者は、ドイツ−Ｗによる脳卒中集団から除外した。アイスランドの場合、患者は、狭窄が、通常用いられる、すなわち、≧５０％より厳密な判定基準である≧７０％であったとしても、大動脈閉塞性疾患を有すると分類した。アイスランド発見試料および四つの複製試料セットにおける、Trial of Org １０１７２ in Acute Stroke Treatment（ＴＯＡＳＴ）分類システム２５によるサブタイプへの脳卒中患者の分類を、表１に挙げる。
Illumina ゲノム幅遺伝子型決定。全てのアイスランド人症例および対照試料を、International ＨａｐＭａｐプロジェクトのフェーズＩに由来する３１７，５０３の標識用ＳＮＰを含有する Infinium HumanHap ３００ＳＮＰチップ（Illumina）で検定した。チップで検定されたＳＮＰの内、６，６２２のＳＮＰは、それらが、（ｉ）症例または対照において９５％未満のコールレートを示した；（ii）集団において１％未満の微少対立遺伝子頻度を示した；かまたは（iii）対象において Hardy-Weinberg 平衡から有意の歪み（ｐ＜１ｘ１０−１０）を示したという理由で除外した。＜９８％の収率の試料はいずれも、分析から除外した。最終分析では、３１０，８８１のＳＮＰを用いた。
単一ＳＮＰ遺伝子型決定。全１２１のＳＮＰについての単一ＳＮＰ遺伝子型決定は、Centaurus（Nanogen）プラットフォーム２６を用いて、アイスランド、レイキャビクのｄｅＣＯＤＥ遺伝学で行った。各々のＳＮＰ検定の品質は、ＣＥＵ ＨａｐＭａｐ試料の遺伝子型決定を、公的に入手可能なＨａｐＭａｐデータと比較することによって評価した。全てのＳＮＰが、ミスマッチ試験、連鎖不平衡（ＬＤ）試験を合格し、 Hardy-Weinberg 平衡にあった。
関連分析。関連分析には、リスクについての増殖性モデル、すなわち、一人につき二つの対立遺伝子のリスクが倍増する（carries multiply）ということを仮定して、標準的な尤度比統計値を用いて、ｄｅＣＯＤＥで作成されたＮＥＭＯソフトウェアで実行されたように２７、個々の対立遺伝子各々の両側Ｐ値およびオッズ比（ＯＲ）を計算した。マーカーについては、保有者頻度よりもむしろ、対立遺伝子頻度が示される。
染色体４ｑ２５上の遺伝子座において、本発明者は、３種類のＳＮＰ、すなわち、ｒｓ２２００７３３、ｒｓ１００３３４６４およびｒｓ１３１４３３０８を分析した。第三のＳＮＰであるｒｓ１３１４３３０８は、ｒｓ２２００７３３およびｒｓ１００３３４６４双方と高ＬＤにあり（双方についてＤ’＝０．９９）、しかもｒｓ２２００７３３対立遺伝子Ｔかまたはｒｓ１００３３４６４対立遺伝子Ｔを有する染色体に完全に該当する微少対立遺伝子を有する。それを、全ての集団において、Centaurus 検定を用いて遺伝子型決定し、そして Illumina Infinium プラットフォームでｒｓ２２００７３３かまたはｒｓ１００３３４６４の紛失データを有した個体の遺伝子型を推測するのに用いた。表２１および補足の表２２において、リスク対立遺伝子ｒｓ２２００７３３−Ｔおよびｒｓ１００３３４６４−Ｔ双方のＰ値およびＯＲは、どちらのリスク負担対立遺伝子も含有しない野生型ｒｓ２２００７３３対立遺伝子Ｃ、ｒｓ１３１４３３０８対立遺伝子Ｇ、ｒｓ１００３３４６４対立遺伝子Ｇハプロタイプとの比較に基づいて計算機処理した１１。
アイスランド研究群について、Ｐ値は、ゲノム制御方法を用いて、対象の血縁関係および他の可能な集団層別化の調整後に与える１０。カイ二乗統計値のインフレーション因子は、ＩＳ、ＣＥＳ、ＬＡＡまたはＳＶＤ患者群のゲノム幅関連分析について、それぞれ、１．０７、１．０４、１．０６および１．０２であると推定される。４ｑ遺伝子座について型決定された追加の症例および対照について、本発明者は、前に記載の模擬実験を用いてインフレーション因子を推定した２８。得られたインフレーション因子は、ＩＳ、ＣＥＳ、ＣＥＳを除いたＩＳ、ＬＶＤ、ＳＶＤ、その他、不明、および二つ以上の原因の群について、それぞれ、１．０９、１．０３、１．０６、１．０５、１．０１、１．００、１．０１および１．００である。
用いられた対照の大きな数ゆえに、症例および対照の血縁関係を調整後の有効試料サイズは、試験用の２，６９０人のＩＳ患者および２，６９０人の対照に該当する。ＣＥＳ、ＬＡＡおよびＳＶＤ患者の該当する有効試料サイズは、それぞれ、７１０、４１７および４６７である。
多数の症例−対照群からの結果を、Mandel-Haenszel モデルを用いて組み合わせたが、この場合、それら群が、対立遺伝子について異なった集団頻度、ハプロタイプおよび遺伝子型を有することを許したが、共通の相対リスクを有すると仮定した２９。
結果
ＬＤブロックＣ０４領域中の変異体の虚血性脳卒中への関連を調べた。虚血性脳卒中およびそのサブタイプである大動脈アテローム性動脈硬化症（ＬＡＡ）、心臓塞栓性脳卒中（ＣＥＳ）および小型血管疾患（ＳＶＤ）を発生するリスクへの、４ｑ２５上の二つのＡＦリスク変異体ｒｓ２２００７３３およびｒｓ１００３３４６４の寄与を更に調べるために、本発明者は、アイスランド人試料においてマーカーｒｓ２２００７３３およびマーカーｒｓ１００３３４６４を遺伝子型決定し、そして更に、複製目的のために、本発明者は、南ドイツ（１，１８１症例および１，１８９対照、ドイツ−Ｓ）、スウェーデン（１，０３２症例および１，３８７対照）、ドイツのウェストファーレン地域（１，３８８症例および１，１０６対照、ドイツ−Ｗ）および英国（６５４症例／６７６対照、ＵＫ）からのコホートにおいて複製データセットを分析した。それら研究コホートの表現型分類を、表２０に示す。
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アイスランドからの追加の患者（２８２人）および対照（１４，８９３人）も、これら具体的なＳＮＰについて遺伝子型決定した。関連試験は、各々のＳＮＰを野生型ハプロタイプと比較することによって行った（方法を参照されたい）。表２１に示されるように、ｒｓ２２００７３３は、全ての試料セットにおいて増加した虚血性脳卒中リスクを与え、虚血性脳卒中との関連は、組合せＯＲ＝１．２６（Ｐ＝８．８ｘ１０−１１）で極めて有意であった。ｒｓ１００３３４６４については、虚血性脳卒中との関連は有意ではなかった（ＯＲ＝１．０３、Ｐ＝０．４５）。しかしながら、双方のＳＮＰは、心臓塞栓性脳卒中と有意に関連し、そのリスクは、全体としての虚血性脳卒中群の場合より有意に大であった（ｒｓ２２００７３３：ＯＲ＝１．５３、Ｐ＝１．５ｘ１０−１２；ｒｓ１００３３４６４：ＯＲ＝１．２７、Ｐ＝５．９ｘ１０−４）。これは、予想されるように、この部分表現型への心房細動について知られている寄与を示す。虚血性脳卒中群から心臓塞栓性脳卒中の患者を除くことにより、双方のＳＮＰについて認められる作用は、残りの虚血性脳卒中患者において弱かったが、より強い変異体については有意のままであった（ｒｓ２２００７３３：ＯＲ＝１．１８、Ｐ＝１．５ｘ１０−５；ｒｓ１００３３４６４：ＯＲ＝０．９６、Ｐ＝０．３９）。心臓塞栓性脳卒中は別として、大動脈アテローム性動脈硬化症および未決定原因の脳卒中は、ｒｓ２２００７３３との有意の関連を示す唯一の部分表現型であった（表２のＯＲ＝１．２２、Ｐ＝１．５ｘ１０−３、およびＯＲ＝１．１８、Ｐ＝０．０１）。これら結果は、原因不明の脳卒中かまたは大動脈アテローム性動脈硬化症と分類されている有意の部分の脳卒中が、診断未確定の間欠性ＡＦのためでありうるということを示唆している。
Figure 0005646174
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上に論じられたように（実施例２）、ｒｓ２２００７３３およびｒｓ１００３３４６４のリスク対立遺伝子は、心房細動の診断時年齢と有意に相関する。本研究において、同方向の有意でない傾向が、心臓塞栓性脳卒中の診断時年齢について認められ（Ｔ ｒｓ２２００７３３のコピーにつき０．６２歳、Ｐ＝０．３３、およびＴ ｒｓ１００３３４６４のコピーにつき０．２９歳、Ｐ＝０．７１、表２３）、ＡＦへの実測年齢作用は、より弱い作用であるにもかかわらず、心臓塞栓性脳卒中にも当てはまるかもしれないということが示唆された。
Figure 0005646174
考察
１６６１人のアイスランドＩＳ患者および１０８１５人の対照、および引き続きの大規模複製および十分に特性決定されたヨーロッパ虚血性脳卒中症例／対照試料セットについてのこの研究によって、本発明者は、虚血性脳卒中と関連している、ｒｓ２２００７３３で標識された、染色体４ｑ２５上のリスク変異体を識別し且つ有効にした。本研究において、予想されるように、これら変異体は、心房細動の主な合併症である心臓塞栓性脳卒中という部分表現型と最も強く関連していた。心房細動は、しばしば、無症候性または間欠性であり、したがって、脳卒中患者において検出することが難しいことがありうるので、心臓塞栓性脳卒中のない虚血性脳卒中患者に認められるリスクは、おそらくは、心房細動の不顕性、したがって、心臓塞栓性脳卒中のためである。
３０％までの虚血性脳卒中は、心臓塞栓症によって引き起こされるが（５，６）、その大部分が、心房細動の存在を生じる（７，８）。心房細動は、ヒトにおいて最も一般的な持続性心臓不整脈であり、その有病率は、年齢とともに増加して、８０歳を超えたヒトの約１０％に影響を与えている（３，９）。ＡＦは、それ自体、脳卒中の最も強力な独立したリスクファクターの一つであり、そして集団レベルにおいて、ＡＦは、脳卒中リスクの４倍〜５倍の増加に関連している（３，７，８，１０）。更に、心臓塞栓性脳卒中は、概して、重症であり、脳卒中の他のサブタイプの場合よりも大きい能力障害、高い脳卒中再発率および高い死亡率によって反映される（６，１１）。ＡＦのリスクがあるヒトの早期検出は、将来脳卒中に罹患するリスクを減少させるために重要である。ＡＦを有する患者における脳卒中予防への臨床試験は、抗凝固薬（例えば、ワルファリン）が、脳卒中のリスクを実質的に減少させ（７，１２）、しかもアスピリンおよびクロピドグレルなどの抗血小板薬よりもはるかに有効であるということを示した。本発明者の結果は、かなりの脳卒中患者が、診断未確定の心房細動を有し、原因不明の脳卒中としてかまたは大血管脳卒中として分類されるということを強く示唆する。このような患者は、２４〜４８時間の常套の心臓監視処理中に検出されない無症候性の間欠性ＡＦを有することがありうる。これは、更に４〜７日間の外来心臓監視を受けた脳卒中後患者についての二つの研究によって支持される。従来は診断未確定の間欠性ＡＦの比率は、５．６および１４．３％であった（１３，１４）。無症候性または間欠性ＡＦを有する脳卒中患者は、例えば、原因不明の脳卒中または大血管脳卒中とするかわりに誤診されたとしても、このような患者は、ワルファリンの代わりに抗血小板薬を与えられるので、不適切に処置されると考えられる。したがって、ＡＦの３種類のマーカーは、どの患者が、外来患者として長時間の心臓監視によって利益を得る可能性があるかを決定して、ＡＦの存在または不存在を示すのを助けることができる。計画的研究は、これら知見が、脳卒中のより良い予防または処置へと翻訳されることができるかどうかを決定するのに必要である。
参考文献
Figure 0005646174
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Claims (10)

  1. ヒト個体の心臓不整脈または脳卒中への罹病性を決定する方法であって、
    該個体からの核酸試料中の少なくとも一つの多型性マーカーの少なくとも一つの対立遺伝子の存在または不存在を決定することを含み、
    該少なくとも一つの対立遺伝子は、マーカーＤ４Ｓ４０６の対立遺伝子２、４、および／または８、マーカーｒｓ２６３４０７３の対立遺伝子Ａ、マーカーｒｓ２２００７３３の対立遺伝子Ｔ、マーカーｒｓ２２２０４２７の対立遺伝子Ｔ、マーカーｒｓ１００３３４６４の対立遺伝子Ｔ、並びにマーカーｒｓ１３１４３３０８の対立遺伝子Ｇより選択され、そして、
    該少なくとも一つの対立遺伝子の存在が、該個体の心臓不整脈または脳卒中への罹病性を示している、
    前記方法。
  2. ヒト個体の心臓不整脈または脳卒中への罹病性を決定する方法であって、
    少なくとも一つの多型性マーカー中の少なくとも一つのアットリスク（at-risk）対立遺伝子が、該個体に由来する遺伝子型データセット中に存在するかどうかを決定することを含み、
    該少なくとも一つの対立遺伝子は、マーカーＤ４Ｓ４０６の対立遺伝子２、４、および／または８、マーカーｒｓ２６３４０７３の対立遺伝子Ａ、マーカーｒｓ２２００７３３の対立遺伝子Ｔ、マーカーｒｓ２２２０４２７の対立遺伝子Ｔ、マーカーｒｓ１００３３４６４の対立遺伝子Ｔ、並びにマーカーｒｓ１３１４３３０８の対立遺伝子Ｇより選択され、そして、
    該少なくとも一つのアットリスク対立遺伝子の存在が、該個体の心臓不整脈または脳卒中への罹病性の増加を示している、
    前記方法。
  3. ヒト個体の心臓不整脈または脳卒中への罹病性を評価する方法であって、
    ヒト集団における心臓不整脈または脳卒中の発生の増加と相関しているＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：５０中の少なくとも一つの多型性マーカー対立遺伝子について、該個体からの核酸または遺伝子型データセットをスクリーニングすることを含み；
    ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：５０中の少なくとも一つの多型性マーカー対立遺伝子は、マーカーＤ４Ｓ４０６の対立遺伝子２、４、および／または８、マーカーｒｓ２６３４０７３の対立遺伝子Ａ、マーカーｒｓ２２００７３３の対立遺伝子Ｔ、マーカーｒｓ２２２０４２７の対立遺伝子Ｔ、マーカーｒｓ１００３３４６４の対立遺伝子Ｔ、並びにマーカーｒｓ１３１４３３０８の対立遺伝子Ｇから成る群より選択され、
    該少なくとも一つの多型中のアットリスクマーカー対立遺伝子の存在が、該個体について、心臓不整脈および／または脳卒中への高い罹病性を有すると識別し、そして、
    該少なくとも一つのアットリスクマーカー対立遺伝子の不存在が、該個体について、高い罹病性を有していないと識別する、
    前記方法。
  4. ヒト個体の心臓不整脈および／または脳卒中への罹病性を評価するキットであって、
    該個体のゲノム中において少なくとも一つの多型性マーカーの少なくとも一つの対立遺伝子を選択的に検出する試薬を含み、
    該試薬は、少なくとも一つ多型性マーカーを含む個体のゲノムのフラグメントにハイブリッド形成する少なくとも一つの相接するオリゴヌクレオチド、緩衝剤、および検出可能標識を含み、
    該対立遺伝子は、マーカーＤ４Ｓ４０６の対立遺伝子２、４、および／または８、マーカーｒｓ２６３４０７３の対立遺伝子Ａ、マーカーｒｓ２２００７３３の対立遺伝子Ｔ、マーカーｒｓ２２２０４２７の対立遺伝子Ｔ、マーカーｒｓ１００３３４６４の対立遺伝子Ｔ、並びにマーカーｒｓ１３１４３３０８の対立遺伝子Ｇから成る群より選択され、そして、
    該少なくとも一つの対立遺伝子の存在が、心臓不整脈および／または脳卒中への罹病性を示している、
    前記キット。
  5. オリゴヌクレオチドが、約１８〜約５０ヌクレオチドの長さである、請求項４に記載のキット。
  6. ヒト個体の心臓不整脈および／または脳卒中についての遺伝的指標を決定する装置であって、
    計算機読み取り可能メモリー；および
    該計算機読み取り可能メモリーに蓄積されるルーチン
    を含み、
    該ルーチンは、マーカーＤ４Ｓ４０６の対立遺伝子２、４、および／または８、マーカーｒｓ２６３４０７３の対立遺伝子Ａ、マーカーｒｓ２２００７３３の対立遺伝子Ｔ、マーカーｒｓ２２２０４２７の対立遺伝子Ｔ、マーカーｒｓ１００３３４６４の対立遺伝子Ｔ、並びにマーカーｒｓ１３１４３３０８の対立遺伝子Ｇより選択される少なくとも一つの多型性マーカー対立遺伝子に関して、少なくとも一人のヒト個体の遺伝子型および／またはハプロタイプデータを分析し、そして該マーカーまたはハプロタイプデータに基づく出力を生じるプロセッサーで実行されるように適応していて、
    該出力は、少なくとも一つのマーカーまたはハプロタイプのリスク尺度を、ヒト個体の心臓不整脈および／または脳卒中の遺伝的指標として含む、
    前記装置。
  7. 心臓不整脈が心房細動または心房粗動である、請求項１〜３のいずれか１項に記載の方法。
  8. 心臓不整脈が心房細動または心房粗動である、請求項６に記載の装置。
  9. 心房細動または心房粗動が若年期に発症することを特徴とする、請求項７に記載の方法。
  10. 心房細動または心房粗動が若年期に発症することを特徴とする、請求項８に記載の装置。
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